CN101233410A - 用于标记或处理包含目的生物分子特别是核酸的生物样品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于标记生物样品中所包含的目的生物分子的方法，其包括：a)提供反应容器，b)在所述容器的固体支持物上固定能够结合目的生物分子的标记物的捕获分子，c)将生物样品以及目的生物分子的至少一种标记物，和任选地，标记或预标记目的分子所需的任何成分引入所述容器中，d)温育反应容器的内容物，并通过与捕获分子的结合(例如利用重氮基甲基官能团对固体支持物的反应性)来固定未与目的分子反应的标记物，和e)使用经标记的目的分子进行随后的步骤。本发明还用于处理生物样品的方法。本发明优选地在用于纯化核酸的人工或自动化方法中应用。

Description

用于标记或处理包含目的生物分子特别是核酸的生物样品的方法
本发明涉及用于纯化包含已被标记的目的核酸(合成或天然的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))的生物样品的新方法。
术语“合成的RNA或DNA”应当理解为是指通过由人开发的技术例如扩增技术(PCR，然后任选地转录)或转录扩增技术(TMA或NASBA)而获得的RNA或DNA。术语“天然的RNA或DNA”应当理解为是指通过细胞的提取而获得的RNA或DNA，例如信使RNA、核糖体RNA、转运RNA或基因组DNA。
现有技术显示，存在许多用于标记这些核苷酸、寡核苷酸或核酸的方法。寡核苷酸和核酸在下文中都称为多核苷酸。可在合成期间，或者通过整合至少一个经标记的核苷酸来进行标记。
第一种方法包括将标记附着至碱基上，无论碱基是天然的还是经修饰的。第二种方法提出将标记物附着至糖上，同样无论糖是天然的还是经修饰的。第三种方法的目的在于将标记物附着至磷酸上。
特别地，已将在碱基上进行标记用于通过整合直接经标记的核苷酸来标记核酸的方法。
通常在通过化学合成来制备核酸探针的情况下使用在糖上进行标记。
也已将在磷酸上进行标记用于在寡核苷酸的化学合成期间导入官能化的臂和标记物。
事实上，必须进行核苷酸或核苷酸类似物或多核苷酸的标记的本领域技术人员倾向于在碱基或糖上进行该附着，这为他们提供更大的方便和更多的选择。此外，这是出自许多参考文件的研究，例如对于碱基有EP-A-0,329,198、EP-A-0,302,175、EP-A-0,097,373、EP-A-0,063,879、US-A-5,449,767、US-A-5,328,824、WO-A-93/16094、DE-A-3,910,151、EP-A-0,567,841，或对于糖有EP-A-0,286,898。
标记物与磷酸的结合是比包括官能化碱基或糖的技术更复杂的技术，并且使用范围更窄，这特别是由于磷酸的低反应性(参见，例如，Jencks W.P.等人J.Amer.Chem Soc.82，1778-1785，1960)。类似地，在由O’Donnel和McLaughlin发表的涉及将探针导入寡核苷酸片段中的方法的综述(“Reporter groups for the analysis ofnucleic acid structure”，p216-243，在“Bioorganic Chemistry：Nucleic Acids”，Ed Hecht S.M.Oxford University Press，1996中)中，核苷酸之间的磷酸二酯的有效烷基化被认为是不可能的。
本申请者已开发了基于新试剂的标记技术，所述试剂从标记产率的观点来看是有效的，所述试剂就标记的位置来说具有特异性，并且特别是所述试剂不影响参与通过氢键来形成双螺旋的碱基的杂交特性，所述试剂可同时用于DNA和RNA，并且，最终所述试剂使得能够无差别地标记天然的多核苷酸或通过酶促扩增而制备的多核苷酸。
因此，专利申请WO-A-02/090319描述了许多标记物，其满足上述条件并使用重氮基甲基官能团作为用于标记的反应性官能团。重氮基甲基官能团(式-C(N2)-)已被用于磷酸基团的烷基化，但存在一定数量的问题。一方面，重氮基衍生物自身通常是不稳定的，这对于在标记试剂盒中使用这些标记试剂产生了问题，和另一方面，偶联产物是不稳定的，如果经标记的产物的功能是证明任何样品中生物靶分子的存在，那么这是完全无法接受的。最后，具有重氮基甲基官能团的衍生物是不溶于水的，这导致使用两相条件来与仅在水或水性缓冲液中可溶或稳定的生物分子进行偶联，但这些条件减慢了反应速率，从而使偶联效率受到损害。描述于申请WO-A-02/090319中的那个发明的新型标记试剂也解决了这些技术问题。根据一个实施方案，温度稳定性标记试剂具有下式：
Figure S2006800279831D00031
其中：
·R1表示H或烷基、芳基或取代的芳基，
·R2表示可检测的标记物或至少两个通过至少一个多聚体结构相互连接的可检测标记物，
·L是包含线性链接的至少两个共价键的连接臂，n是等于0或1的整数，
·R3和R4相互独立地表示：H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR，其中R＝烷基或芳基，
·A是包含至少一个允许重氮基官能团与芳族环缀合的共价双键的连接臂，u是0至2的整数，优选是0或1，和
·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-。
在由本申请者于2004年3月26日以编号FR04/50600提交的标题为“Réactifs de marquage，procédés de synthèse de tels réactifset procédés de détection de molécules biologiques”的一个新的专利申请中，进一步改进了这些基于重氮基官能团的分子，所述分子仍然是温度稳定的，并且具有下式：
Figure S2006800279831D00032
其中：
·R1表示H或烷基、芳基或取代的芳基，
·R2表示可检测的标记物或至少两个通过至少一个多聚体结构相互连接的可检测标记物，
·L是包含线性链接的至少两个共价键的连接臂，n是等于0或1的整数，
·R3和R4相互独立地表示：H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R＝烷基或芳基，
·A是包含至少一个允许重氮基官能团与芳族环缀合的共价双键的连接臂，u是0至2的整数，优选是0或1，
·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，
·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，
·m是1至10，优选1至3的整数，和
·p是1至10，优选1至3的整数。
此外，为了使该标记过程更有效，还使天然的或合成的多核苷酸片段化也是有利的。这些核酸的大小减少使其更容易接近从而被标记。关于核酸的片段化，在现有技术中描述了许多方法。首先，片段化可以是酶促的，即可使用核酸酶(DNA酶或RNA酶)来进行核酸的片段化。从而产生具有3′-OH、5′-OH、3′-磷酸或5′-磷酸末端的小尺寸片段。
第二，片段化可以是化学的。例如，在DNA的情况下，可实施DNA的脱嘌呤或脱嘧啶，然后所述DNA在碱存在下通过称为“β-消除”的机制片段化。除其他以外，可通过氧化、烷基化、加入自由基的机制来进行DNA片段化。
为了片段化RNA或DNA，如分别在我们的专利US-A-6,376,179和专利申请WO-A-01/44507中所描述的，使用通常与用作化学催化剂的有机分子例如咪唑相结合的金属阳离子。该片段化优选地在碱性介质中进行，并且产生具有3′-磷酸末端的片段。在该情况下，标记物的附着在核酸片段的在切割期间被释放出来的该唯一磷酸上发生。不存在任何特异性，片段化可以在任何类型的核酸上并且随机地进行。事实上，我们的方法使得能够例如制备检测探针。最后，所述磷酸只是核酸和标记物之间的连接臂。
术语“可检测的标记物”表示至少一种能够直接或间接地产生可检测信号的标记物。这些标记物的非限制性列表如下：
·产生可例如通过比色法、荧光或发光进行检测的信号的酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，
·生色团，例如荧光化合物、发光化合物或染料化合物，
·可通过电子显微镜或通过它们的电学性质如电导率、电流分析法、伏安法、阻抗进行检测的电子密集性基团，
·可检测基团，例如其分子的大小足以引起它们的物理和/或化学特性的可检测改变；该检测可通过光学方法例如衍射、表面等离子体共振、表面变化或接触角变化，或通过物理方法例如原子力光谱学、隧道效应来进行，
·放射性分子例如32P、35S或125I。
优选地，为了避免与这些标记物相关的安全问题，所述标记物不是放射性标记物。
例如，标记物可以是具有低位阻的荧光化合物例如荧光素，丹磺酰基，IR类型的生色团(Li-COR Inc，Lincoln NE，USA)，花青苷衍生物例如Cy5和Cy3(Randolph J.B.等人，Nucleic Acids Res.25(14)，p2923-2929，1997)，特别是Cy5衍生物，或者示踪物是具有低位阻的半抗原，例如生物素或松香烷衍生物(参见申请WO-A-00/07982)。术语“低位阻”表示低于2000g/mol的分子量(例如，具有1064g/mol的重量的bis-bioPDAM)。在荧光团的情况下，与激发波长大于450nm优选大于600nm的荧光团一起工作是优选的。
当示踪物是自身不产生信号的半抗原例如生物素时，通过如上述进行标记的抗配体的识别来进行检测。在生物素的情况下，优选使用偶联至荧光化合物例如萤光素、Cy5或藻红蛋白的链霉抗生物素蛋白或抗生物素抗体。在松香烷的情况下，使用专利申请WO-A-00/07982中描述的单克隆抗体。
这是被称为标记前体的物质。术语“标记前体”表示具有至少一个任选地经保护的反应性官能团的化合物，所述反应性官能团不同于重氮基甲基官能团并且可与允许标记物随后附着的所述官能团相容，即在所述方法的任一步骤之后，特别是在使用MnO2进行氧化的步骤之后的附着。特别地，标记前体可包含在上面的化学式中描述的连接臂L。使用标记前体的策略的实例通常与信号扩增的情形相关，但通过使用本领域技术人员熟知的各种不同的保护基团，其他变化形式是可能的。
也可使用间接系统，例如能够与抗配体反应的配体。
配体/抗配体对对于本领域技术人员来说是熟知的，例如下列对就是这样的情况：
·生物素/链霉抗生物素蛋白，
·半抗原/抗体，
·抗原/抗体，
·肽/抗体，
·糖/凝集素，
·多核苷酸/该多核苷酸的互补序列。
在该情况下，配体携带有连接试剂。可通过前面段落中描述的标记物直接检测抗配体，或其自身可通过配体/抗配体来检测。
在某些条件下，这些间接检测系统可通过例如使用多聚体结构来导致信号扩增。该信号扩增技术对于本领域技术人员来说是熟知的，可参考本申请者以前的专利申请FR98/10084或WO-A-95/08000或者参考论文J.Histochem.Cytochem.45：481-491，1997。
术语“多聚体结构”是指由化学或生物合成子的重复单元形成的聚合物。在本发明中可用的此类结构的许多变体是已知的，例如：
·线性聚合物(EP-A-0,561,722，EP-A-0,669,991)，
·支化聚合物(WO-A-01/92361)，
·颗粒(EP-A-0 827 552)，
·树枝状聚合物(US-A-4,507,466；US-A-4,568,737；US-A-6,083,708)，
·多核苷酸，和
·多肽。
间接系统的另一个实例利用配体和抗配体例如甲基甲酮和烷氧基胺之间的特异共价键。该系统的实例描述于专利申请WO-A-00/40590和WO-A-98/05766中。这些间接检测系统在某些条件下可导致信号扩增，关于例如使用聚合体的化学修饰的实例可参考以前的专利申请WO-A-00/07982、WO-A-01/92361和WO-A-95/08000，或关于通过堆叠进行化学扩增的系统可参考申请WO-A-01/44506。
在信号扩增的一个具体方式中，至少两个标记物存在于标记试剂上。
此外，本发明的标记试剂在极性且可与水混溶的溶剂例如DMF、DMSO、CH3CN、THF、DMA(二甲基乙酰胺)、NMP(N-甲基吡咯烷酮)或DME(二甲氧基乙烷)中是可溶的。
优选地，标记试剂在DMSO或水中是可溶的。
术语“可与水混溶的溶剂”表示可以以至少5体积％的比例与水或包含盐的水性缓冲液混溶的溶剂。
术语“生物分子”表示具有至少一个允许其与生物目的靶分子反应的识别位点的化合物。例如，可以提及核酸、抗原、抗体、多肽、蛋白质和半抗原作为生物分子。
术语“核酸”表示至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的链串，其任选地包含至少一个经修饰的核苷酸，例如至少一个包含经修饰的碱基例如肌苷、5-甲基-脱氧胞苷、5-二甲基氨基-脱氧尿苷、脱氧尿苷、2，6-二氨基-嘌呤、5-溴-脱氧尿苷或允许杂交的任何其他经修饰的碱基的核苷酸。该多核苷酸也可在核苷酸间的键例如硫代磷酸酯、H-膦酸酯(H-phosphonates)或烷基膦酸酯的水平上被修饰，或在主链水平上被修饰，例如α-寡核苷酸(FR-A-2 607 507)或PNA(M.Egholm等人，J.Am.Chem.Soc.114，1895-1897，1992)或2′-O-烷基核糖核甘酸。核酸可以是天然的或合成的，通过如下的酶促扩增技术获得的寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖体RNA、信使RNA、转运RNA、核酸：
·PCR(聚合酶链反应)，描述于专利US-A-4,683,195、US-A-4,683,202和US-A-4,800,159中，和其衍生方法RT-PCR(逆转录PCR)，特别是一步形式的RT-PCR，如专利EP-B-0,569,272中所描述的，
·LCR(连接酶链反应)，公开于例如专利申请EP-A-0,201,184中，
·RCR(修复链反应(Repair Chain Reaction))，描述于专利申请WO-A-90/01069中，
·3SR(自动维持序列复制(Self Sustained SequenceReplication))，专利申请WO-A-90/06995，
·NASBA(基于核酸序列的扩增)，专利申请WO-A-91/02818，和
·TMA(转录介导的扩增)，专利US-A-5,399,491。
因而，术语“扩增子”用于表示通过酶促扩增技术产生的核酸。
只要有至少一个磷酸存在于核酸中，就可以以组合的方式采用这些修饰中的每一种。
术语“半抗原”是指非免疫原性化合物，即其自身不能通过产生抗体来促进免疫反应，但能够被通过在已知的条件下免疫动物特别是通过用半抗原-蛋白质缀合物进行免疫而获得的抗体识别。这些化合物通常具有低于3000Da，最常见地低于2000Da的分子量，并且可以例如是糖基化的肽、代谢产物、维生素、激素、前列腺素、毒素或各种药剂、核苷和核苷酸。
术语“纯化步骤”特别地表示微生物的核酸和在纯化核酸之前的裂解步骤中释放的细胞组分之间的分离。这些裂解步骤是熟知的并且，作为示例性的例子，可使用在下列专利申请中描述的裂解方法：
-关于通过超声波处理进行裂解的WO-A-00/60049，
-关于磁力和机械混合裂解的WO-A-00/05338，
-关于电裂解的WO-A-99/53304，和
-关于机械裂解的WO-A-99/15621。
本领域技术人员可以使用其他熟知的裂解方法，例如热或渗透压休克或者使用离液剂如胍盐的处理，特别是在属于本申请者的专利US-A-5,234,809中描述的。
该步骤通常使得能够浓缩核酸。例如，可能使用磁性颗粒(关于该方面，参见本申请者的专利：US-A-4,672,040和US-A-5,750,338)，并因而通过洗涤步骤来纯化结合在这些磁性颗粒上的核酸。如果期望随后扩增所述核酸，那么这种核酸纯化步骤是特别有利的。此类磁性颗粒的一个特别有利的实施方案描述于专利申请WO-A-97/45202和WO-A-99/35500中。
此处使用的术语“固体支持物”，包括在其上可附着分子的所有材料，所述分子携带重氮基甲基官能团或从其衍生的官能团，例如重氮基的降解或重排产物，例如在标记反应期间释放并需要被去除的吖嗪类。任选地经化学修饰的合成材料或天然材料可用作固体支持物：
·特别地，多糖，例如基于纤维素的材料，例如纸、纤维素衍生物例如醋酸纤维素和硝酸纤维素，或葡聚糖，
·特别地，基于苯乙烯类型的单体的，天然纤维例如棉花，和合成纤维例如尼龙；矿物材料例如二氧化硅、石英、玻璃、陶瓷；胶乳；磁性颗粒；金属衍生物；凝胶等。固体支持物可以以玻璃或硅或衍生物制成的微量滴定板、膜、颗粒或几乎平的板的形式存在。这些支持物也可以用可与重氮基官能团或从其衍生的官能团反应的目的阴离子和/或酸基团进行官能化，下文中将对此进行解释。
如上所述，现有技术也描述了携带重氮基官能团的化合物在标记核酸(通过连接在其磷酸基团上)方面，在使它们可被检测(特别是通过读取荧光)方面的用途。在该情况下，所述重氮基化合物携带荧光基团(萤光素，Cy5)或允许与荧光分子共价或非共价结合的基团(生物素、半抗原或反应性官能团的类型)。
现有技术描述了许多与标记过程相关的纯化方法的用途。在这些方法中，可以提及用有机相提取、过滤和凝胶过滤。然而，参考技术是，在导致通过特异性杂交(涉及DNA芯片，还有ELOSA板或快速测试形式)进行检测的过程中，在标记之前或之后，使用粉末形式的二氧化硅、凝胶或磁性颗粒来纯化核酸。标记前的纯化使得能够显著地改善标记产率，标记后的纯化使得能够以决定性的方式改善杂交的产率，并从而改善所述测试的对于良好灵敏度所需的信号/噪声比。这是因为，在标记期间使用的且未反应的过量标记物可显著地影响杂交。二氧化硅上的纯化需要固相的洗涤和洗脱的步骤。因而，三个步骤(结合/洗涤/洗脱)的存在需要液体的转移，这可能是污染、材料损失和通常可适度地自动化的因素。此外，该方法在整个操作过程中需要操作者的干预和使用离液序列高的(刺激性的)盐。
概括地说，关于所有这些具有纯化步骤的标记方法的本质问题在于下列事实，即为了使标记过程真正有效，必需使用过量的标记物以使所有核酸具有被标记的可能性。在经处理的液体溶液中，经标记的核酸以及未反应的标记物的存在意味着该液体样品随后不能用于特异性检测步骤。必需预先除去过量存在的标记物。为此，可以将所述核酸结合至二氧化硅颗粒(任选地包含磁性材料)上以固定经标记的或未标记的核酸，并通过除去不想要的组分来对它们进行洗涤。上面已提到的本申请者的专利US-A-5,234,809允许进行该类型的方法。然而，这产生了在实践者的工作时间和材料方面耗费巨大的额外步骤。
因而，本发明在于利用标记物或标记前体的化学特性，以允许其优先结合目的核酸，并且任选地，如果这样的结合未发生，允许其在固体相上的捕获，而不引起任何洗涤相。此外，对于该纯化过程，刺激性离液剂不是必需的。同样，本发明的方法不需要任何旨在使液体通过固相的泵或离心机类型的额外系统。该过程可能需要磁化或过滤系统，如果纯化相由颗粒(磁性或非磁性的)组成；然而，该装置不是必须的并且可使用完全被动的过程(使标记介质通过固相)。最后，由于使用固相及其简单性(接触、温育、经历杂交)的原因，可容易地使该方法自动化。所述方法可用于使用连续流的系统，从而使得能够简化在“Lab-on-Card”类型或完全集成在单个管中的独立装置(用于利用在芯片上杂交来进行核酸纯化)之中的整合。这意味着污染的风险将减小，并且所使用的消耗品的数目将减少。
为此，根据第一个实施方案，本发明涉及用于标记生物样品中所包含的目的生物分子的方法，其包括：
a)提供反应容器，
b)在所述容器或引入该容器中的固体支持物的所有或部分内表面上固定捕获分子，所述捕获分子能够结合目的生物分子的标记物或标记前体，
c)将生物样品引入所述反应容器中，还引入：
1)目的生物分子的至少一种标记物或标记前体，和
2)任选地，标记或预标记目的生物分子所需的任何成分，
d)温育反应容器的内容物，
e)通过与捕获分子的结合来固定未与目的生物分子反应的标记物或标记前体，和
f)使用经标记的目的生物分子即与所述标记物或标记前体反应的目的生物分子进行随后的步骤。
根据第二个实施方案，本发明还涉及用于处理生物样品的方法，所述生物样品包含目的生物分子和目的生物分子的至少一种标记物或标记前体的混合物，任选地还组合有标记目的生物分子所需的任何成分，所述方法包括：
a)提供反应容器，
b)在所述容器或引入该容器中的固体支持物的所有或部分内表面上固定捕获分子，所述捕获分子能够结合目的生物分子的标记物或标记前体，
c)将生物样品引入所述反应容器中，
d)温育反应容器的内容物，
e)通过与捕获分子的结合来固定未与目的生物分子反应的标记物或标记前体，和
f)使用经标记的目的生物分子即与所述标记物或标记前体反应的目的生物分子进行随后的步骤。
在上述的两种情况中，根据一个优选的实施方案，未与目的生物分子反应的标记物或标记前体与捕获分子的所述结合通过共价键发生。
在一个特定的实施方案中，在上述的步骤a)之前，按照下列步骤中的至少一个步骤处理生物样品：
·从上游的另一个反应容器转移，
·裂解复杂的生物材料，以使目的生物分子可接近和/或可检测，
·捕获或分离目的生物分子，和/或
·处理目的生物分子以使得能够检测它们或改善它们的检测；
该处理可由例如热处理组成。
在另一个特定的实施方案中，在上述步骤f)之后进行至少一个下列的随后步骤：
·转移至下游的另一个反应容器，
·标记经预标记的目的生物分子，
·纯化经标记或经预标记的目的生物分子，和/或
·检测与捕获探针杂交的经标记的目的生物分子。
例如可在与检测分子(例如，核酸探针)杂交或不杂交的情况下，以均相有利地进行目的生物分子的检测。
在所有上述的情况下，可能的是，所述容器或引入该容器中的固体支持物的内表面携带有阴离子和/或酸官能团，并且标记物或标记前体包含重氮基官能团(-N＝N)。
在该最后一个实施方案中，所述容器或引入该容器中的固体支持物的内表面所携带的官能团由羧基和/或磺基官能团组成。
在所有这些情况中，目的生物分子由核酸和/或核酸片段组成。
在该最后一个实施方案中，所述核酸和/或核酸片段由DNA、RNA、DNA-RNA嵌合多聚体组成，所述核酸和/或核酸片段可任选地包含至少一个核苷酸硫代磷酸酯、LNA、2′-O-Me和/或甲基膦酸酯衍生物(dérivéméthylphosphonates)。
在其中目的生物分子是核酸或核酸片段的实施方案中，在上述步骤a)之前，按照下列步骤中的至少一个步骤处理生物样品：
·从上游的另一个反应容器转移，
·裂解生物样品所包含的复杂生物材料，以使核酸可接近，
·从所述复杂的生物材料中提取核酸，
·特异性扩增目的核酸，
·使所述目的核酸或扩增子的片段化，和/或
·转录或逆转录目的核酸，无显著的扩增现象。
仍然在相同的情况下，在上述步骤f)之后进行至少一个下列的随后步骤：
·转移至下游的另一个反应容器，
·标记经预标记的核酸，
·纯化经标记或经预标记的核酸，
·检测与捕获探针杂交的经标记或经预标记的核酸，
·转录或逆转录目的核酸，无显著的扩增现象，和/或
·在使用或不使用检测探针的情况下，均相检测经标记或经预标记的核酸。
根据本发明的另一个实施方案，捕获分子相对于标记物以过量存在，和标记物相对于待标记的目的生物分子以过量存在。
更特别地，捕获分子相对于不与核酸反应的游离标记物以过量存在，和标记物相对于待标记的核酸以过量存在。
为了使得能够检测和/或定量和/或纯化目的核酸，经标记的核酸能够形成与靶充分互补的复合物，从而根据反应条件，特别是温度或反应介质的盐浓度条件，特异性地进行杂交。
另一方面，然而，如果该反应不是特异性的，那么未反应的标记物或游离的标记物保持它们的反应性官能团完整，从而能够随后与自身携带有互补反应性官能团的捕获分子反应。因此，反应性官能团与互补反应性官能团形成共价键，这使得能够固定游离的标记物，从而生物样品只包含与核酸结合的标记物。
附图显示本发明的纯化方法的不同步骤。它们代表了特定的实施方案，并且不能认为其限定了本发明的范围。
图1显示了在其中进行纯化方法的反应容器的横截面视图。该容器包括上部的盖子和下部的主体，该主体被挖空从而产生在其中可进行本发明方法的空间。该空间包括位于左边的允许待处理的生物样品进入的引入通道和位于右边的允许所述经处理的生物样品离开的排出通道。处理或包被容器的内部空间以展示出具有羧基反应性官能团的捕获分子。盖子的内侧空间也可进行所述处理。
如上所述，引入通道允许以箭头指向导入液体生物样品，其包含尤其是核酸和携带有重氮基官能团的标记物。在该图所示的情况下，所述核酸仍未被标记，但也可以将它们预先与标记物接触。
图2显示了与图1相同的视图，其中存在于反应容器的内部空间中的生物样品包含经标记的核酸和游离的标记物，即未与核酸反应的标记物。由于标记物相对于核酸过量存在，因而所有这些核酸将被标记，相反的情况是存在许多游离的标记物。
图3仍然与图1和2相同，但注意到，在一段时间后，即，通常，在bis-BioPDAM的情况下，在至少10分钟后(但在1小时内)，大部分游离的标记物结合至存在于容器的内部空间中的羧基反应性官能团。术语“大部分”表示游离的标记物被捕获从而使它们低于抑制浓度(低于2mM)。很明显，这些反应性官能团相对于未与核酸反应的游离标记物过量存在。
图4仍然与图1至3相同。如上所述，排出通道允许经处理的液体生物样品按该图右方的箭头指向排出，所述生物样品尤其包含经标记的核酸，但没有游离的标记物。
图5显示了N，N′-双(13-生物素酰基氨基-4，7，10-三十三烷基)-5-(重氮基甲基)间苯二酰胺分子的结构式，为有助于理解本说明书所述分子在后面也称作“bis-BioPDAM”。
最后，图6显示示了N，N′-双(13-生物素酰基氨基-4，7，10-三十三烷基)-5-(二甲氧基甲基)间苯二酰胺分子的结构式，为有助于理解本说明书所述分子在后面也称作“缩醛”。
实施例1：RT-PCR扩增产物的标记和在羧基颗粒上的纯化，然后在DNA 芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)上的分析
在本实施例中，游离标记物的结合不直接发生在固体支持物上，但其使得能够通过测试标记物与磁性颗粒的反应性来检查本发明的构思的有效性。
A-PCR Influenza B
在称为“Influenza B”的模型上进行本实验。
该名称表示通过RT-PCR从B型流感病毒RNA的190个碱基的基因片段序列产生的扩增子。
关于抽取物制备、病毒RNA提取、它们的扩增和引物序列的情况描述于论文“Effectiveness of Reverse Transcription-PCR，VirusIsolation，and Enzyme-linked Immunosorbent Assay for diagnosisof Influenza  A Virus Infection in different Age Groups”，Steininger C.等人，J.Clin.Microbiol.(2002)；40(6)，2051-2056。
采用Titan One Tube RT-PCR System试剂盒(Roche DiagnosticCorporation，Basle，Switzerland，参考号：11 855 476 001)，用0.2mM每种脱氧核糖核苷酸、0.3μM引物和0.4μl酶，使用病毒RNA制备物(每次扩增103个拷贝)作为起始模板来进行RT-PCR。
RT-PCR的循环参数如下：60℃下进行30分钟以进行逆转录反应，然后按照下列方案进行40个循环：94℃20秒，随后，50℃30秒，最后，72℃30秒，然后在4℃下直至热循环仪停止工作。
从上述RT-PCR中产生的扩增子以后称为“PCR Influenza B”。
B-均相标记(参照方案)
将均相标记用作相对本发明的参照或“对照”技术。
使用足以允许DNA的充分标记但低于阈值(从该阈值开始，游离标记物将影响杂交)的标记物终浓度(2mM)来进行该方案。
将5μl体积的PCR Influenza B与5μl在二甲亚砜(下文中称为“DMSO”)中稀释至6mM的N，N′-双(13-生物素酰基氨基-4，7，10-三十三烷基)-5-(重氮基甲基)间苯二酰胺(在下文中称为“bis-BioPDAM”，参见图5)和5μl H2O混合，然后在80℃下温育10分钟。
然后采用供应商的方案将反应介质与DNA芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)接触以进行杂交步骤。所使用的DNA芯片被设计用于分析在RT-PCR期间扩增的区域。由A.Troesch等人：“Mycobacterium species identification and rifampin resistancetesting with high-density DNA probe arrays”J.Clin.Microbiol.(1999)，37，49-55描述了杂交实方案的说明和用于结果分析的技术的说明。
使用由GenechipInstrument system和Genechip InformationSystem(Affymetrix，Santa Clara，CA)所提供的读取系统和软件，在标记和杂交后读取在DNA芯片表面上发射出的荧光，以及产生关于信号强度和同源性百分比的数据。
该读取系统提供了以RFU(“相对荧光单位”)表示的信号和本底噪声强度。相对于参照序列(相应于通过测序获得的经扩增的靶序列)来给出同源性百分比。
在结果表中集中了关于信号(I)、本底噪声(B)的中位强度以及同源性百分比(％同源性)的结果。
一般地，认为高于90％的同源性百分比是令人满意的结果，尽管通常寻找高于95％的结果。高强度和低本底噪声(高的I/B比)是在所述设置中所找到的第二个结果。
C-在抑制性标记物浓度下的均相标记(对照)
在本实验中，使用更高的标记物bis-BioPDAM终浓度(5mM)。该浓度在不存在纯化的情况下影响杂交，但当该相同的反应介质被有效纯化时，该浓度使得能够获得更强的信号(由于更高的标记物产率)。
将5μl体积的PCR Influenza B与5μl bis-BioPDAM(在DMSO中稀释至15mM)和5μl H2O混合，然后在80℃下温育10分钟。
然后，照上面的段落B中所描述的方案，将反应介质与芯片接触以进行杂交和检测。
D-在二氧化硅膜上进行纯化的情况下的均相标记(对照)
在本实验中，使用由QIAgen GmbH(Hilden，Germany)销售的包含二氧化硅膜的核酸纯化柱。该技术构成了参照方法。在该情况下，使用更高的bis-BioPDAM终浓度(5mM)来进行标记方案，该标记物浓度在不存在有效纯化的情况下影响芯片上的杂交。
将5μl体积的PCR Influenza B与5μl bis-BioPDAM(在DMSO中稀释至15mM)和5μl H2O混合，然后在80℃下温育10分钟。
然后，采用供应商推荐的方案，使用QIAQuick试剂盒(QIAgen GmbH，Hilden，Germany.参考号：28 306)来纯化反应介质，然后按照在已描述的段落B中所述的方案将该反应介质与DNA芯片接触以进行杂交。
E-在羧基颗粒上进行纯化的情况下的均相标记(本发明)
在本实验中，用羧基固相(本发明)来纯化通过使用更高的bis-BioPDAM终浓度(5mM)而获得的标记产物。5mM的标记物浓度在不存在有效纯化步骤的情况下影响杂交。因此，这是选择用于研究纯化效能的浓度。
将5μl体积的PCR Influenza B与5μl bis-BioPDAM(在DMSO中稀释至15mM)和5μl H2O混合，然后在80℃下温育10分钟。
然后，使用2.5mg标准的Carboxyl-Adembeads(参考号：0213，Ademtech，Pessac，France，在下文中称为“羧基颗粒”)在环境温度下温育反应介质10分钟，然后通过使反应介质磁化来分离颗粒，按照上文中在段落B中所述的方案将反应介质与DNA芯片接触以进行杂交。
F-结果和结论：
在下面的表1中给出了关于同源性百分比、信号强度(I)和本底噪声(B)的结果：
表1：使用本发明方案的方法与不进行纯化或在二氧化硅膜上进行纯化的对照相比的比较研究
标记方法     ％同源性     I     B     I/B
B-均相标记(参照)     93.1     1699     308     5.5
C-在影响杂交的标记物浓度(5mM)下的均相标记(对照)     47.5     135     339     0.3
D-在二氧化硅膜上进行纯化的情况下的均相标记(对照)     97.9     5905     297     19.9
E-在羧基颗粒上进行纯化的情况下的均相标记(本发明)     97.9     8167     434     18.7
结果表示为同源性百分比、信号强度(I)和本底噪声(B)。
总之，使用参照方法获得的结果基本上与采用在二氧化硅膜上纯化而获得的结果相同。此外，观察到，使用“羧基纯化”而获得的结果在强度(I)方面比不进行纯化或采用在二氧化硅膜上纯化而获得的结果更好。芯片上信号的增强使得能够获得更可靠的测试，减少对局部影响本底噪声的因素(例如芯片上的尘埃、沉积物)的依赖。此外，纯化方案的运作的便利明显地使操作过程更轻松。
实施例2：标记，和经标记并且被所述标记物的非反应性等价物污染 的RT-PCR扩增产物在羧基颗粒上的纯化
本实施例用于证明，固体支持物和标记分子之间形成的键完全是标记物的共价捕获的结果而不是其在所述支持物上吸附的结果。
A-目的
在本实验中，用bis-BioPDAM的合成中间产物N，N′-双(13-生物素酰基氨基-4，7，10-三十三烷基)-5-(二甲氧基甲基)间苯二酰胺(在下文中称为“缩醛”，图6)污染经纯化的标记产物。该反应物不具有重氮基甲基官能团，从而不能与羧基官能团反应。
在另一方面，其具有bis-BioPDAM的结构的完整性，因而当观察到的纯化现象是非特异性吸附现象，而不是牵涉特定性结合的现象时，可以以与bis-BioPDAM相似的方式吸附至表面。
所述缩醛以与bis-bioPDAM相同的方式影响核酸的杂交，这使得能够判断其消除的性质。
B-实验
将5μl体积的PCR Influenza B与5μl bis-BioPDAM(在DMSO中稀释至15mM)和5μl H2O混合，然后在80℃下温育10分钟。然后，采用供应商的方案，使用QIAQuick试剂盒(QIAgen GmbH，Hilden，Germany.参考号：28 306)来纯化反应介质。
为了具有足以进行几个对照实验的经纯化的产物的体积，对已经历RT-PCR扩增的样品的几个等份平行进行该制备。混合纯化产物以消除由所述样品的制备引起的变化。
然后按下列方法处理15μl(相应于在通过混合物的二氧化硅膜纯化进行纯化后获得的洗脱物的体积)的级分：
a)如实施例1/B中所描述的，在Affymetrix芯片上进行直接杂交(对照)。
b)加入5mM缩醛，然后如实施例1/B中所描述的，在Affymetrix芯片上进行杂交(通过缩醛进行抑制的对照)。
c)如实施例1/E中所描述的，于环境温度下在羧基颗粒上进行10分钟的纯化，然后如实施例1/B中所描述的，在Affymetrix芯片上进行杂交(颗粒对标记产物的作用的对照)。
d)加入5mM缩醛，然后如实施例1/E中所描述的，于环境温度下在羧基颗粒上进行10分钟的纯化，并如实施例1/B中所描述的，在Affymetrix芯片上进行杂交(颗粒对缩醛的作用的对照)。
C-结果和结论
在下面的表2中给出了关于同源性百分比、信号强度(I)和本底噪声(B)的结果：
表2：在不能与羧基官能团反应的抑制化合物存在的情况(B和D)下，使用本发明方案的方法(C和D)与不使用本发明方案的两个对照(A和B)相比的比较研究
标记方法     ％同源性     I   B   I/B
A-参照     93.1     1699   308   5.5
B-通过缩醛进行抑制的对照     39.5     127   260   0.5
C-羧基颗粒对标记物的作用的对照     97.4     1911   302   6.3
D-羧基颗粒对缩醛的作用的对照     50.0     525   369   1.4
结果也表示为同源性百分比、信号强度(I)和本底噪声(B)。
总之，无论是否存在使用羧基颗粒的预处理(D)，缩醛衍生物影响核酸的杂交(B和D)。该结果表明，在与羧基官能团的反应不存在的情况下，缩醛不能反应。因此，不存在通过吸附而引起缩醛化合物的显著消除。因而可得出这样的结论：导致形成共价键的重氮基甲基-羧酸反应是参与反应介质的纯化的主要机制。
实施例3：标记，和经标记的RT-PCR扩增产物在羧基膜上的纯化
A-目的
在本实验中，使用携带有羧基官能团的膜(Biodyne C，参考号S60314，Pall Gelman Sciences，New York，USA，在下文中称为Biodyne C)来纯化用5mM的bis-BioPDAM终浓度获得的标记产物。5mM的标记物浓度在不存在有效纯化步骤的情况下影响杂交。因此，这是选择用于研究纯化效能的浓度。
B-实验
将5μl体积的PCR InfluenzaB与5μl bis-BioPDAM(在DMSO中稀释至15mM)和5μl H2O混合，然后在80℃下温育10分钟。以一式两份进行本实验，然后将标记产物混合并分成两份等体积，以限制由于该操作方案中的可变性而引起的可能不利的影响。然后使用6mm2的Biodyne C在环境温度下温育反应介质10分钟(b)，或让其在环境温度下放置(参照a)，然后按照实施例1/B中所述的方案将经如此处理的该介质与DNA芯片接触以进行杂交步骤。
C-结果和结论
在下面的表3中给出了关于同源性百分比、信号强度(I)和本底噪声(B)的结果：
表3：使用本发明方案的方法(b)与不使用本发明方案的参照(a)相比的比较研究
标记方法     ％同源性   I   B     I/B
a-参照     94.7   4252   564     7.5
b-羧基膜纯化     94.7   23811   2174     11.0
结果再次表示为同源性百分比、信号强度(I)和本底噪声(B)。
总之，携带有羧基官能团的Biodyne C膜使得能够以与使用磁性颗粒相同的性质来纯化样品。
实施例4：标记，和使用羧酸聚合物进行的经标记的RT-PCR扩增产物 的纯化
A-目的
在本实验中，使用携带有羧基官能团的聚合物(聚丙烯酸钠盐，标准28’000，参考号81124，Fluka，Buchs，Switzerland；在下文中称为APA)来纯化使用5mM的bis-BioPDAM终浓度而获得的标记产物。如上所述，5mM的标记物浓度在不存在有效纯化步骤的情况下影响杂交。
B-PCR Myco 16S
在称为“Myco 16S”的模型上进行本实验，其表示通过PCR从编码结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的16S核糖体RNA的基因的180个碱基的片段序列产生的扩增子。
由A.Troesch等人：“Mycobacterium species identificationand rifampin resistance testing with high-density DNA probearrays”J.Clin.Microbiol.(1999)，37，49-55提供了分枝杆菌的培养、提取的条件以及扩增引物。
采用FastStart High Fidelity PCR System试剂盒(RocheDiagnostic Corporation，Basle，Switzerland，参考号：03 553 426001)，用0.2mM每种脱氧核糖核苷酸、0.3μM引物和0.4μl酶，使用基因组DNA制备物(每次PCR 103个拷贝)作为起始模板来进行PCR。
PCR的循环参数如下：95℃下进行4分钟，然后按照下列方案进行35个扩增循环：95℃30秒，随后55℃30秒，最后，72℃30秒。最后，在4℃下保持直至热循环仪停止，以避免扩增产物在环境温度下的可能的降解。
在下文中将上述的包含PCR产生的扩增子的溶液称作“PCR 16S”。
C-实验
将5μl体积的PCR 16S与5μl bis-BioPDAM(在DMSO中稀释至2.5mM)和15μl H2O混合，然后在80℃下温育10分钟。以一式两份进行本实验，然后将标记产物混合并分成两份等体积以限制由于该操作方案中的可变性而引起的可能不利的影响。
然后，将反应介质在环境温度下温育10分钟(a)，或用在真空中干燥产生的10μl 20％APA的溶液的沉淀进行温育(b)，然后按照实施例1/B中所述的方案将其与DNA芯片接触以进行杂交步骤。
D-结果和结论
在下面的表4中给出了关于同源性百分比、信号强度(I)和本底噪声(B)的结果：
表4：使用本发明方案的方法(b)与不使用本发明方案的参照(a)相比的比较研究
标记方法     ％同源性   I   B   I/B
a-参照     97.9   2313   525   4.4
b-使用APA的纯化     94.4   8091   928   8.7
总之，具有羧基官能团的聚合物使得能够获得与使用磁性颗粒进行的纯化相当的样品纯化。
实施例5：标记，和使用磺酸聚合物进行的经标记并且被所述标记物 的非反应性等价物污染的RT-PCR扩增产物的纯化
A-目的
在本实验中，使用携带有磺基官能团的聚合物(参考号29 256-7，Sigma-Aldrich，Saint-Louis；MI，USA，在下文中称为Nafion)来纯化使用5mM的bis-BioPDAM终浓度而获得的标记产物。
B-实验
将5μl体积的PCR 16S与5μl bis-BioPDAM(在DMSO中稀释至2.5mM)和15μl H2O混合，然后在80℃下温育10分钟。以一式两份进行本实验，然后将标记产物混合并分成两份等体积以限制由于该操作方案中的可变性而引起的可能不利的影响。
然后温育反应介质：
·在环境温度下温育10分钟(a)，或
·用在真空中干燥产生的10μl 5％Nafion甲醇溶液的沉淀进行温育(b)，
然后按照实施例1/B中所述的方案将其与DNA芯片接触以进行杂交步骤。
C-结果和结论
在下面的表5中给出了关于同源性百分比、信号强度(I)和本底噪声(B)的结果：
表5：使用本发明方案的方法(b)与不使用本发明方案的参照(a)相比的比较研究
 标记方法     ％同源性     I     B     I/B
 a-参照     97.9     2313     525     4.4
 b-使用Nafion的纯化     97.2     8887     1002     8.9
结果再次表示为同源性百分比、信号强度(I)和本底噪声(B)。
总之，具有磺基官能团的聚合物使得能够获得与使用磁性颗粒而获得的纯化相当的样品纯化。
总结论：
根据我们的发明的方法基于，利用重氮基甲基官能团对酸(特别是羧基官能团)的反应性来在标记步骤后捕获过量的标记物。该反应性对于本领域技术人员来说是已知的。例如，可提及4-(重氮基甲基)苯氧基甲基-聚苯乙烯(参考号17338，Fluka，Buchs，Switzerland)，其用于通过它们的羧基键来共价结合蛋白质。在核酸捕获实验的情况中，本申请者使用了该树脂。在标记后的纯化过程中利用重氮基甲基官能团对固体支持物的反应性的想法至今是不为人所知的。
所述反应基于在标记步骤后重氮基官能团的反应性的保留。该反应性的保留一点也不明显，因为在最初的标记步骤期间一部分官能团可能在反应介质中被水解。相当一部分的未与核酸反应的标记物仍然具有反应性，并且在固相上的固定以足以允许样品杂交的产率来进行，这是令人吃惊的结果。
重氮基官能团与羧基官能团的高反应性使得能够在环境温度下在限制在数分钟内的一段时间之内进行反应。基于共价结合的该方法与等同的技术相比是个创新。
因为标记分子在固体支持物或可溶性聚合物上以共价方式隔离，因此不需在纯化后进行洗涤。洗涤步骤的取消与现有的纯化方法相比是个创新。
因为作为本发明的主题的方法基于化学反应，因此其比过滤、相排除纯化(purification par exclusion de phase)或在固体支持物上的吸附更具特异性和选择性。由于吸收而导致的生物样品的损失的风险被降低。
最后，可容易地将纯化支持物整合入消耗品中，无论该消耗品是试管(在手工方法的情况下)还是用于自动化方案的卡类型的组件。

Claims (13)

1.用于标记生物样品中所包含的目的生物分子的方法，其包括：
a)提供反应容器，
b)在所述容器或引入该容器中的固体支持物的所有或部分内表面上固定捕获分子，所述捕获分子能够结合目的生物分子的标记物或标记前体，
c)将生物样品引入所述反应容器中，还引入：
1)目的生物分子的至少一种标记物或标记前体，和
2)任选地，标记或预标记目的生物分子所需的任何成分，
d)温育反应容器的内容物，
e)通过与捕获分子的结合来固定未与目的生物分子反应的标记物或标记前体，和
f)使用经标记的目的生物分子即与所述标记物或标记前体反应的目的生物分子进行随后的步骤。
2.用于处理生物样品的方法，所述生物样品包含目的生物分子和目的生物分子的至少一种标记物或标记前体的混合物，任选地还组合有标记目的生物分子所需的任何成分，所述方法包括：
a)提供反应容器，
b)在所述容器或引入该容器中的固体支持物的所有或部分内表面上固定捕获分子，所述捕获分子能够结合目的生物分子的标记物或标记前体，
c)将生物样品引入所述反应容器中，
d)温育反应容器的内容物，
e)通过与捕获分子的结合来固定未与目的生物分子反应的标记物或标记前体，未与目的生物分子反应的标记物或标记前体与捕获分子的所述结合通过共价键发生，和
f)使用经标记的目的生物分子即与所述标记物或标记前体反应的目的生物分子进行随后的步骤。
3.权利要求1的方法，其特征在于，未与目的生物样品反应的标记物或标记前体与捕获分子的所述结合通过共价键发生。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于，在步骤a)之前，按照下列步骤中的至少一个步骤处理生物样品：
·从上游的另一个反应容器转移，
·裂解复杂的生物材料，以使目的生物分子可接近和/或可检测，
·捕获或分离目的生物分子，和/或
·处理目的生物分子以使得能够检测它们或改善它们的检测。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于，在步骤f)之后进行至少一个下列的随后步骤：
·转移至下游的另一个反应容器，
·标记经预标记的目的生物分子，
·纯化经标记或经预标记的目的生物分子，和/或
·检测与捕获探针杂交的经标记的目的生物分子。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于，所述容器或引入该容器中的固体支持物的内表面携带有阴离子和/或酸官能团，并且标记物或标记前体包含重氮基官能团(-N＝N)。
7.权利要求6的方法，其特征在于，所述容器或引入该容器中的固体支持物的内表面所携带的官能团由羧基和/或磺基官能团组成。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于，目的生物分子由核酸和/或核酸片段组成。
9.权利要求8的方法，其特征在于，所述核酸和/或核酸片段由DNA、RNA、DNA-RNA嵌合多聚体组成，所述核酸和/或核酸片段可任选地包含至少一个核苷酸硫代磷酸酯、LNA、2′-O-Me和/或甲基膦酸酯衍生物。
10.权利要求8或9中任一项的方法，其特征在于，在权利要求1或2中所定义的步骤a)之前，按照下列步骤中的至少一个步骤处理生物样品：
·从上游的另一个反应容器转移，
·裂解生物样品所包含的复杂生物材料，以使核酸可接近，
·从所述复杂的生物材料中提取核酸，
·特异性扩增目的核酸，
·使所述目的核酸或扩增子的片段化，和/或
·转录或逆转录目的核酸，无显著的扩增现象。
11.权利要求8至10中任一项的方法，其特征在于，在权利要求1或2中所定义的步骤f)之后进行至少一个下列的随后步骤：
·转移至下游的另一个反应容器，
·标记经预标记的核酸，
·纯化经标记或经预标记的核酸，
·检测与捕获探针杂交的经标记或经预标记的核酸，
·转录或逆转录目的核酸，无显著的扩增现象，和/或
·在使用或不使用检测探针的情况下，均相检测经标记或经预标记的核酸。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其特征在于，捕获分子相对于标记物以过量存在，和标记物相对于待标记的目的生物分子以过量存在。
13.权利要求12的方法，其特征在于，捕获分子相对于不与核酸反应的游离标记物以过量存在，和标记物相对于待标记的核酸以过量存在。
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