JP2001518788A

JP2001518788A - ヒト肝細胞癌疾病（ｈｃｃ）の予測評価に有用な診断手段、ならびに同手段を用いる診断方法

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Publication number: JP2001518788A
Application number: JP54253398A
Authority: JP
Inventors: アンヌ、ドゥジャン; マリー−アニック、ブュアンディア; パスカル、ピノー; 尚生永井; ピエール、ティオレ
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1998-04-06
Publication date: 2001-10-16
Also published as: US6410724B1; US6265161B1; WO1998045478A2; WO1998045478A3; AU6416198A; US20040076950A1; EP0973941A1; US20020042073A1; CA2286282A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規ポリヌクレオチド、またはヒト肝細胞癌疾病の発生を予測するための診断手段として有用なポリヌクレオチドの新規組み合わせに関する。本発明はまた、その変異が患者における肝細胞癌の発生に関与している癌抑制遺伝子候補にあるポリヌクレオチド、ならびにかかる新規癌抑制遺伝子候補に由来するポリヌクレオチドおよび対応する発現ポリペプチドに向けられる。本発明はまた、診断手段としてこのポリヌクレオチドを用いる診断方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト肝細胞癌疾病（ＨＣＣ）の予測評価に有用な診断手段、ならびに同手段を用いる診断方法本発明は、新規ポリヌクレオチド、またはヒト肝細胞癌疾病の発生を予測するための診断手段として有用なポリヌクレオチドの新規組み合わせに関する。本発明はまた、その変異が患者における肝細胞癌の発生に関与している癌抑制遺伝子候補にあるポリヌクレオチド、ならびにかかる新規癌抑制遺伝子候補に由来するポリヌクレオチドおよび対応する発現ポリペプチドに向けられる。本発明はまた、診断手段としてこのポリヌクレオチドを用いる診断方法に関する。肝細胞癌（ＨＣＣ）は世界中で最も一般的な主要な肝臓癌であって、毎年２５１，０００人の新たな症例が出ており(Bosh et al.，1991)、現在までこの病状は極めて不良な予後を伴っている。疫学的な証拠から、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）が肝臓癌の主な病原体として優勢な役割を果たすことが示されている。他の危険因子としては、Ｃ型肝炎ウイルスの慢性的感染、アルコール濫用、アフラトキシンＢ１のような肝発癌物質への環境的曝露、および数種の遺伝病が挙げられる（Buendia et al.，1995において概説、Bosch et al.，1991;Wogan，1992においても記載）。さらに詳しくは、疫病学的研究はＨＣＣの５０％より多くが慢性的なＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の感染に起因することを示唆している(Bosch e t al.，1991)。しかしながら、好肝細胞性のウイルス病原体の役割および肝臓の発癌を導く分子的事象は、未だわかっていない。ＨＢＶが関与する発癌の初期段階で頻繁に起こる宿主ゲノムにおけるＨＢＶＤＮＡの組み込みの異誘発的な役割は、決定的に確立されているのは希少なケースでしかなく(Dejean et al.，19 86;De The et al.，1987;Wang et al.，1990)、このことはより間接的な形質転換経路を示唆するものである(Matsubara，1991)。慢性ＨＢＶキャリヤーの約８０％において、肝細胞ＤＮＡに組み込まれたウイルスＤＮＡを検出することができる(Chen et al.，1986)。慢性ウイルス性肝炎と肝硬変との共通の特徴は、肝細胞の遺伝子変異に対する感受性を増強する可能性のある慢性的な再生条件と関連した肝臓の持続的な炎症である。ＨＣＣは通常、２０〜５０年間のＨＢＶ慢性感染の後に発症し、しばしば硬変を伴う(Lok et al.，1991)。癌が確立される前の長い潜伏期はそれらが多段階の過程の結果であることを示し、いくつかの研究は通常の遺伝子変異の同定に向けられてきた(Sugimura et al.，1992)。細胞の癌遺伝子の活性化および癌抑制遺伝子の不活性化の双方が関係している(Okuda et al.，1992;Sugimura et al.，1992)。一般に、ヒトの癌の発症は、前癌遺伝子および癌抑制遺伝子の蓄積した変異によって選択的増殖の優位性を獲得した遺伝学的に改変された細胞のクローン拡大に起因する(Weinberg，1991)。癌抑制遺伝子の体細胞における不活性化は通常、遺伝子の１つの対立遺伝子における遺伝子内突然変異によって、また第２の対立遺伝子にわたる染色体領域の欠失によって達成される。突然変異抑制対立遺伝子の同型接合性を導く工程には通常、フランキング染色体領域も含まれる。従って、癌の進行前に異型接合性を示し得る、隣接する染色体部位をマッピングする無名のＤＮＡマーカーは、同型接合性へと平行還元（または異型接合性の欠失(loss of heterozygosity)−ＬＯＨ）を受ける。実際に、特定種由来の細胞で特異的な染色体マーカーのＬＯＨが繰り返して観察されることは、その欠失が癌の病因論に関与している、近くにマッピングされる癌抑制遺伝子の存在を示唆している(Hansen et al.，1987)。突然変異抑制遺伝子の対立遺伝子の劣性作用により、生じる表現型の結果はいずれも、発端後長期間遅れることとなる。これらの対立遺伝子は、それらが一方または他方の細胞における同型接合性への還元に曝されるまで有効に効果的に潜伏している。このように癌抑制遺伝子は、それらの欠失または不活性化が細胞に腫瘍形成増殖脱制御の一方または他方の表現型を呈させる遺伝的要素である。かかる定義には、細胞に導入して不適切にも過剰発現した場合に細胞増殖抑制性または細胞障害性のある遺伝子は除外される。従って、癌抑制遺伝子が作用する領域は以下のように定義される：生化学的にはこれらの遺伝子は抗増殖シグナルの変換器として働き、生物学的にそれらは細胞が細胞周期の進行を停止し、分化し、老化し、または死滅することを可能にする応答機構として働く(Weinberg，1991)。異なる対立遺伝子を識別する多形性ＤＮＡマーカー(polymorphic DNA marker) を用いる染色体解析によって、種々の種の癌において特異的な染色体領域の異型接合性の欠失（ＬＯＨ）が明らかとなり、高頻度のＬＯＨを有する領域のマッピングは腫瘍増殖の負のレギュレーターを同定するために重要である(Call et al. ，1990;Fearon et al.，1990;Friend et al.，1986)。マイクロサテライト多形性マーカーの最近の開発によって、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２およびＤＰＣ４のような数種の癌抑制遺伝子の位置クローニングが可能になっている(Hahn et al.， 1996;Miki et al.，1994;Wooster et al.，1995)。主として、特異的な染色体腕に限定される制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）マーカーまたはマイクロサテライト多形性マーカーのいずれかに頼るこれまでの研究は、肝臓癌におけるＬＯＨの染色体領域の数を規定している。ＨＣＣにおいて最も頻繁に起こる対立遺伝子欠失の１つは、癌抑制遺伝子ｐ５３が位置している染色体１７ｐで見出されている(Fujimori et al.，1991;Murakami et al.，1991;S lagle et al.，1991)。世界において地理的な位置により、ＨＣＣサンプルの中で大きく変化するｐ５３突然変異の頻度、およびコドン２４９でのホットスポット変異が、高レベルの食物アフラトキシンを有し、ＨＢＶ感染が大きく広がっている領域由来のＨＣＣにおいて観察された(Bressac et al.，1991;Buetow et al.，1992;Hsu et al.，1991)。染色体１３ｑ上のＲＢ位置にわたる領域の欠失もまた記載されているが、この場合には、残っている対立遺伝子で低い突然変異率が見出された(Murakami et al.，1991;Wang and Rogler.，1988;Zhang et al. ，1994)。最も頻度の高い染色体腕の欠失は１３ｑ（情報が得られる腫瘍の５３％）において観察される。欠失はＲＢおよびＢＲＣＡ２癌抑制遺伝子を担持する１３ｑ（１３ｑ１２〜ｑ３２）の広い領域を包含していた(Friend et al.，1986 ;Wooster et al.，1995，Zhang et al.，1994)。他の頻度の高いＬＯＨは、１ｐ、４ｑ、５ｑ、６ｑ、８ｐ、１０ｑ、１１ｐ、１６ｐ、１６ｑおよび２２ｑで報告されている(Buetow et al.，1989;De Souza et al.，1995;Emi et al.，1992; Fujimori et al.，1991;Takahashi et al.，1993;Tsuda et al.，1990;Wang and Rogler，1988;Yeh et al.，1994)。これらの領域中の癌抑制遺伝子候補としては、６ｑ２６〜ｑ２７上の６−リン酸マンノース／インスリン様増殖因子II型受容体遺伝子（Ｍ６Ｐ／１ＧＦ２Ｒ）(De Souza et al.，1995)、８ｑ２１〜ｐ２２上のＰＤＧＦ受容体β様癌抑制遺伝子（ＰＲＬＴＳ）(Fujiwara et al.，1995 )および16ｑ２２上のＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子が挙げられる(Slagle et al. ，1993)。 Yeh et al．(1994)はＨＣＣ細胞系および３０個の一次ＨＣＣ組織の遺伝子解析を行った。ＲＦＬＰ実験については８個の多形性ＤＮＡマーカー、および染色体１ｐにおける１２の遺伝子座にわたるマイクロサテライトマーカーも用いて、これらの著者は、主な染色体異常が１ｐ３５〜３６にマッピングされる共通領域を有する染色体１ｐの端部にクラスターとして見られるということを示しており、それはまた神経芽腫および結腸直腸癌ならびに乳癌において異型接合性が頻繁に欠失する領域でもある。 Tsuda et al.(1990)は、この染色体の短腕および長腕の双方の全体に分布した１５個の多形性ＤＮＡマーカーを用いて、７０個の外科的に一部を切り取った腫瘍のＲＦＬＰ分析を行うことによって、染色体１６上の対立遺伝子の欠失を研究した。彼らは、情報が得られる場合（すなわち３６例）の５２％でＬＯＨを検出し、この一般的な対立遺伝子の欠失領域は、ＨＰ遺伝子座（１６ｑ２２．１）とＣＴＲＢ遺伝子座（１６ｑ２２．３〜ｑ２３．２）との間に位置していた。 Fujimori et al.(1991)は、４６例のＨＣＣにおいて４４個のＲＦＬＰマーカーでＬＯＨを調べることによって、ＨＣＣの対立遺伝子型の研究を実行した。Fu jimori et al.が用いたマーカーは５ｐ、８ｐ、９ｐ、１８ｐを除く総ての染色体腕およびｉ型染色体を示した。このように、各染色体腕を、１個だけまたは２個の多形性ＲＦＬＰマーカーでマッピングした。これらの著者は、かなりの割合のＬＯＨが染色体腕５ｑ（情報が得られる９例中４例が欠失［４４％ＬＯＨ］）、１０ｑ（情報が得られる２４例中６例が欠失［２５％ＬＯＨ］）、１１ｐ（情報が得られる１３例中６例が欠失［４６％ＬＯＨ］）、１６ｑ（情報が得られる３３例中１２例が欠失［３６％ＬＯＨ］）および１７ｐ（情報が得られる１１例中５例が欠失［４５％ＬＯＨ］）で起こったことを観察した。 Buetow et al.,(Buetow et al.,1989)は、情報が得られる５例のＨＣＣの総てでアルブミン遺伝子座（４ｑ１１〜ｑ１２）におけるＬＯＨを報告し、癌抑制遺伝子がこの領域に位置することを指摘した。発明者のデータは、染色体４ｑ上のさらに２つの遺伝子座での変異が肝臓の発癌に役割を果たしていることを示唆する。染色体４ｑは増殖因子をコードする遺伝子またはアルブミン、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ３）、フィブリノーゲンおよびＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼなどの肝臓中で優先的に発現される遺伝子を含んでいるので、この領域の欠失は、細胞増殖条件および肝細胞の機能を著しく変異させる可能性がある。 Buetow et al.(1989)は、ＲＦＬＰマーカーのパネルに対して試験した１２個のヒト一次肝臓癌でＬＯＨを研究した。これらの著者は、４ｑ１１〜ｑ１３から４ｑ３２染色体４領域までにわたる１１個のＲＦＬＰマーカーに対して腫瘍組織および非腫瘍組織を分類した。さらに、Buetow et al.は、対立遺伝子の欠失に関して、他の９本の染色体（１、２、６、７、９、１１、１３、１４および１７）上の少なくとも１個のＲＦＬＰマーカーにおいて試験した。その結果から、腫瘍組織では、構造上、染色体４ｑマーカーに対して異型接合性である９個の腫瘍のうち７個（６個の４ｑＲＦＬＰマーカーがBuetow et al.により使用された）が対立遺伝子の欠失を示すということがわかった。７個のサンプルのうちの６個が４ｐおよび４ｑマーカーの双方に対して連鎖して情報を与えた（６個の４ｐＲＦＬＰマーカーを使用した）。対立遺伝子欠失に関して情報が得られる他の染色体のうち、１つの腫瘍が１３ｑにおいて変異を示した。試験された他の８つの染色体は上に位置したＲＦＬＰマーカーでは、他の変異は観察されなかった。これらの著者は、ＨＣＣの病因諭に関与する制御的遺伝子座は４ｑ３２に隣接している可能性があると結論付けた。 Emi et al.(1992)は、ＨＣＣ、結腸直腸癌および肺癌由来の腫瘍組織中の染色体８ｑ上の種々の遺伝子座で高頻度なＬＯＨを認めた。さらに詳しくは、Emi et al.は、第８染色体の短腕に沿って５個の多形性マーカーを有する１２０個のＨＣＣ（うち４６個は、これまでに１９９１年にFujimori et al.によってアレロタイピングされている）組織においてＬＯＨを研究し、同一の染色体間隔、８ｑ２３．１〜８ｑ２１．３内で共通して欠失した領域を定義し、これはＨＣＣに対する、また結腸直腸癌に対する１以上の癌抑制遺伝子がこの領域内に存在する可能性があることを示唆している。注目される領域はただ３個のＲＦＬＰ多形性ＤＮＡマーカー、それぞれＤ８Ｓ２３８、ＭＳＲおよびＤ８Ｓ２２０を用い、Emi et al.によりマッピングされた。これらの著者は、推定される癌抑制遺伝子は８ｐ上に存在する可能性があると結論付けた。 Becker et al.(1996)は、中国人のＨＣＣにおける第８染色体対立遺伝子の状態を調査するために、３７対の正常およびＱｉｄｏｎｇ由来のＨＣＣＤＮＡのパネルを、第８染色体の両腕由来の８個の特異的なＲＦＬＰプローブを用い、腫瘍特異的な対立遺伝子欠失について分析したことを記載した。腫瘍特異的ＬＯＨは短腕上で最も多く、それぞれ８ｐ２３または８ｐ２１（２個のＥＦＬＰ特異的プローブだけを第８染色体の短腕に対して用いた）に関して対立遺伝子が欠失している、情報が得られる患者の７１．４％（１０／１４）および８５％（１７／２０）であることを見出した。第８染色体の長腕からの対立遺伝子の欠失もまた観察され、それぞれ８ｑ２２および８ｑ２４に関して情報が得られるサンプルの３０％（６／２０）および３３．３％（７／２１）であった。１９９６年にBoige et al.は、４８のＨＣＣ群において、ｉ型染色体腕以外の総てにわたる２７５個の高多形性マイクロサテライト遺伝子マーカーを用いて、ＨＣＣにおける対立遺伝子欠失を研究した。彼らは、９個の染色体腕１ｐ、１ｑ、４ｑ、６ｑ、８ｐ、９ｐ、１６ｐ、１６ｑおよび１７ｐにおいて３０％を上回って欠失したことを認め、最も高頻度の染色体腕欠失は８ｐで観察された。前記の科学的な研究で、使用された遺伝子マーカーの数が少ないことによるか、あるいは研究された患者の組織サンプルの数が少ないことにより、ＨＣＣ組織サンプル中には、種々の染色体腕上で起こる種々の遺伝子変異の極めて粗いものであるが初めての位置決定が可能となった。これらの研究において研究された患者の組織サンプルの数が少ないことにより、所定の染色体腕または染色体領域上で遺伝的変化が頻繁に起こることに関して決定的な、または統計的に有意なデータは得られなかった。変異した遺伝子座が同定される精度が低く、その結果これらの研究で用いられた多形性ＤＮＡマーカーが境界をなしている、注目される大きな染色体ＤＮＡ断片によって、当業者はＨＣＣ用の正確な診断手段を設計するのに有用な、好適な技術手段を設計および／または決定することができなかった。なぜならば、これらのＤＮＡ断片はいずれも、先行技術において十分に適切であることが示されておらず、疾病との厳密な相関性を扱うための因果的情報をもたらすとは考えられなかったからである。その結果、それらによって当業者はＨＣＣが発生中に、頻繁に変異していることが観察された健常組織の染色体に由来する特異的なＤＮＡ断片をクローニングすることができなかった。ヒトにおける他の固形腫瘍と同様に一次肝臓癌は、おそらくは、癌遺伝子および癌抑制遺伝子を含む遺伝的学事象のカスケードを通して起こり、その結果ゲノムの安定性が低下して結局は悪性の表現型を導く。本発明に従って用いられる、対立遺伝子の不安定に対して１２０個の肝細胞癌ゲノムを正確かつ完全に走査させる方法は、肝臓癌の発生に関与している候補遺伝子を位置決定するために決定的な価値を有する。本発明者は、染色体１ｐ、４ｑ、６ｑ、８ｐ、１３ｑ、１６ｐ、１６ｑおよび１７ｐの特定領域で対立遺伝子の用量における高頻度の変異を検出した。さらに、本発明者は、染色体腕１ｑ、２ｑ、９ｐ、９ｑ、１４ｑおよび１７ｑ上で高率のＬＯＨを示す遺伝子座を新たに同定したことを記載する。これらの領域の遺伝子変異は、乳癌、小細胞肺癌、前立腺癌、腎細胞癌、悪性黒色腫または髄膜炎をはじめとする多くの他の悪性腫瘍において認められ、広範囲の癌に関与している癌抑制遺伝子がＨＣＣの進行に影響を及ぼしていることを示唆するものである(C ox et al.，1995;Hearly et al.，1995;Ranford et al.，1995;Takahashi et al .，1995;Takira et al.，1995)。本発明者のデータによって、８ｐ２１〜ｐ２３マーカーと比較してより高頻度のＬＯＨを示す８ｐ２１〜ｐ２３よりもよりテロメアよりの遺伝子座がＨＣＣに対する第２の癌抑制遺伝子候補を含んでいるらしいということを指摘する。第４染色体の長腕上で、本発明者は４ｑ１２、４ｑ２２〜ｑ２４および４ｑ３５においてＬＯＨの３個の非隣接領域を定義した。４ｑでの染色体変異は、それらがＨＣＣで優勢な特性を表すので大いに診断上の価値がある。さらに、本発明者らは、６ｑの広域にわたるマーカーを用いて高頻度なＬＯＨを見出した（表３、データは示されていない）。本発明者らはまた、表２および４に示されたマーカーを用いて高頻度なＬＯＨを見出し、ゆえに当業者が注目される種々の同定された遺伝子座、特に８ｐ２１〜８ｐ２３、１ｐ３５〜ｐ３６、１６ｑ２３〜ｑ２４、１４ｑ３２、４ｑおよび６ｑ上にあるＨＣＣ関連癌抑制遺伝子の存在および特徴を決定することが可能になる。隣接する非腫瘍肝臓の組織学的分析とＬＯＨとの相関によって、組み合わされた染色体領域（１ｐ、６ｑ、８ｐおよび１３ｑ）での欠失の頻度が肝硬変上に現れているＨＣＣよりも慢性肝炎病害上に現れるＨＣＣで、かなり高いということが明らかになった。ここで、再生圧力下で肝細胞が対立遺伝子変異を蓄積する場合に、いくつかの組み合わさった染色体腕欠失が悪性へ向かう「近道」を構築する可能性があることが示されている。本発明者らは、ＨＣＣ患者の癌肝臓組織サンプルにおいて変異した異なる染色体領域を正確に位置決定するために、多形性マイクロサテライトマーカーの高密度パネルを現在使用している。それゆえ、本発明者らは非ｉ型ヒト常染色体を通じて一様に分布した２５６の高多形性マイクロサテライトマーカーを用いて１２０のＨＣＣサンプルの系統的なスクリーニングを行った。これはマイクロサテライトマーカーを用いたヒトＨＣＣにおけるゲノム変異の最初の大規模な分析である。データによってそれぞれの染色体変化の相対頻度の厳密な評価と正確な位置決定が可能になる。このように本発明は、（この後で定義される）注目される特異的な染色体座に位置するＤＮＡマーカーを、肝細胞癌（ＨＣＣ）の予後を可能にする診断手段として使用することに関する。本発明者らは今、高頻度で遺伝子変異を受ける非常に小さい染色体領域を正確に同定したので、本発明により包含されるＤＮＡマーカーは、注目されるこれらの特異的染色体座にわたる公的に入手可能な手段、すなわち：１）マイクロサテライトＤＮＡマーカー；２）ＲＦＬＰマーカー（通常は特異的オリゴヌクレオチドプローブによって構成）；３）ＶＮＴＲマーカー（種々の数のタンデム反復）、これはまた各ＶＮＴＲの内部において多数のコピーで繰り返されている約２０個のヌクレオチドの<<Ａｌｕ>>型の配列である<<ミニサテライト>>と名付けられ、ＰＣＲ反応またはサザンブロットハイブリダイゼーションのいずれかによって検出される；４）ＳＴＳマーカー（単純タグ配列）、これは１対の特異的オリゴヌクレオチドプライマーによって増幅させることができる独特のゲノム配列であり、一般に多型性ではない；５）ＥＳＴ（発現配列タグ）、これはｍＲＮＡに転写され、それを１対のオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅させることができるの総てを含む。上記１）〜４）群のＤＮＡマーカーの配列ならびにそれらの各々に対するオリゴヌクレオチド検出手段の配列は、電子データベース、特に以下のアドレス：<< http://www.nebi.nlm.nih.gov>>のインターネット・ワールドワイドウェブ上で自由に公的に入手できる。本発明はまた、多型性マイクロサテライトＤＮＡマーカーを肝細胞癌（ＨＣＣ）の予後を可能にする診断手段として使用することに関する。本発明はまた、かかるマイクロサテライトＤＮＡマーカーを用いる診断方法、ならびにこれらの多型性ＤＮＡマーカーおよび本発明の診断方法を実施するために必要な試薬を含んでなる診断キットに向けられる。以下、図面を参照して本発明をさらに具体的に説明するが、その範囲がいかなるようにもこれらの図面に記載された特定の具体例に限定されるものではない。図１：ＬＯＨの存在に関する一次ＨＣＣのマイクロサテライト解析。（Ａ）腫瘍Ｔ５３、Ｔ６１、Ｔ３２およびＴ４８における対立遺伝子の欠失、付随する腫瘍Ｔ５８における増減、および腫瘍Ｔ２０における１個の対立遺伝子の強度の増加を示す種々の染色体座での対立遺伝子の不均衡についての代表的なオートラジオグラム。（Ｂ）ＬＯＨが見られない場合の代表的な情報が得られた例（左）および情報が得られなかった例（右）。１番上の数字は、用いたマイクロサテライト。ＴおよびＮはそれぞれ、ＨＣＣから単離したＤＮＡおよび隣接する非腫瘍対応物。サンプル番号は各オートラジオグラムの下に記されている。矢印は、腫瘍サンプル中で欠失した対立遺伝子。アステリスクは、１つの腫瘍対立遺伝子の増強されたシグナル強度を示す。図２：ＨＣＣのアレロタイピングにおいて有意なパーセンテージのＬＯＨを示す染色体８ｐ領域でのマイクロサテライトマーカーの詳細な分析。横軸：マーカーの名称、異なるマーカーは染色体８ｐ上の以下のそれらの相対的位置を表している。縦軸：対立遺伝子の不均衡のパーセンテージ（ＬＯＨ／情報が得られた例ｘ１００）。図３：ＨＣＣのアレロタイピングにおいて有意なパーセンテージのＬＯＨを示す染色体１ｐ３５〜ｐ３６領域でのマイクロサテライトマーカーの詳細な分析。横軸：マーカーの名称、異なるマーカーは染色体１ｐ上の以下のそれらの相対的位置を表している。縦軸：対立遺伝子の不均衡のパーセンテージ（ＬＯＨ／情報が得られた例ｘ１００）。図４：ＨＣＣのアレロタイピングにおいて有意なパーセンテージのＬＯＨを示す染色体１６ｑ２３〜ｑ２４領域でのマイクロサテライトマーカーの詳細な分析。横軸：マーカーの名称、異なるマーカーは染色体１６ｑ上の以下のそれらの相対的位置を表している。縦軸：対立遺伝子の不均衡のパーセンテージ（ＬＯＨ／情報が得られた例ｘ１００）。図５：ＨＣＣのアレロタイピングにおいて有意なパーセンテージのＬＯＨを示す染色体１４ｑ３２領域でのマイクロサテライトマーカーの詳細な分析。横軸：マーカーの名称、異なるマーカーは染色体１４ｑ上の以下のそれらの相対的位置を表している。縦軸：対立遺伝子の不均衡のパーセンテージ（ＬＯＨ／情報が得られた例ｘ１００）。図６：ＨＣＣのアレロタイピングにおいて有意なパーセンテージのＬＯＨを示す染色体４ｑ３５〜ｑ３６領域でのマイクロサテライトマーカーの詳細な分析。横軸：マーカーの名称、異なるマーカーは染色体４ｑ上の以下のそれらの相対的位置を表している。縦軸：対立遺伝子の不均衡のパーセンテージ（ＬＯＨ／情報が得られた例ｘ１００）。すでに前記したように、本発明者らは今、高頻度で遺伝子変異を受ける非常に小さい染色体領域を正確に同定したということによって、当業者が、本発明の注目される特異的な染色体座を検出する、当技術分野に含まれる公的に入手可能なＤＮＡマーカーのいずれを用いても、本発明の診断方法を実施することが可能にとなるし、または注目される対応する染色対座における癌抑制遺伝子をクローニングすることが可能となる。さらに詳しくは、本発明により包含されるＤＮＡマーカーは注目されるこれらの特異的染色体座にわたる公的に入手可能な手段、すなわち：１）マイクロサテライトＤＮＡマーカー；２）ＲＦＬＰマーカー（通常は特異的オリゴヌクレオチドプローブによって構成）；３）ＶＮＴＲマーカー（種々の数のタンデム反復）、これはまた各ＶＮＴＲの内部において多数のコピーで繰り返されている約２０個のヌクレオチドの<<Ａｌｕ>>型の配列である<<ミニサテライト>>と名付けられ、ＰＣＲ反応またはサザンブロットハイブリダイゼーションのいずれかによって検出される；４）ＳＴＳマーカー（単純タグ配列）、これは１対の特異的オリゴヌクレオチドプライマーによって増幅させることができる独特のゲノム配列であり、一般に多型性ではない；５）ＥＳＴ（発現配列タグ）、これはｍＲＮＡに転写され、それを１対のオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅させることができるの総てを覆う。上記１）〜４）群のＤＮＡマーカーの配列ならびにそれらの各々に対するオリゴヌクレオチド検出手段の配列は、電子データベース、特に以下のアドレス：<< http://www.nebi.nlm.nih.gov>>のインターネット・ワールドワイドウェブ上で自由に公的に入手できる。本発明の目的は、患者における肝細胞癌の予兆診断用組成物であって、以下の染色体領域：ａ）１ｐ；ｂ）１ｑ；ｃ）２ｑ；ｄ）４ｑ；ｅ）６ｐ；ｆ）７ｐ；ｇ）７ｑ；ｈ）８ｐ；ｉ）８ｑ；ｊ）９ｐ；ｋ）９ｑ；ｌ）１０ｑ；ｍ）１３ｑ；ｎ）１４ｑ；ｏ）１６ｐ；ｐ）１６ｑ；ｑ）１７ｐ；ｒ）１７ｑに位置するＤＮＡマーカーを含有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなり、そのＤＮＡマーカーが、注目されるこれらの特異的染色体座にわたっている公的に入手可能なマーカー、すなわち１）マイクロサテライトＤＮＡマーカー；２）ＲＦＬＰマーカー；３）ＶＮＴＲマーカー（種々の数のタンデム反復）；４）ＳＴＳマーカー（単純タグ配列）；５）ＥＳＴ（発現配列タグ）のいずれかである組成物にある。本発明のもう１つの目的は、患者における肝細胞癌の予兆診断用組成物であって、好ましくは以下の染色体領域：ａ）８ｐ２３；ｂ）８ｐ１２２；ｃ）８ｐ２１；ｄ）１ｐ３５〜ｐ３６；ｅ）１６ｑ２３〜ｑ２４；ｆ）１４ｑ３２およびｇ）４ｑ３５〜ｑ３６に位置するＤＮＡマーカーを含有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなり、そのＤＮＡマーカーが、注目されるこれらの特異的染色体座にわたっている公的に入手可能なマーカー、すなわちマイクロサテライトＤＮＡマーカー、すなわち１）マイクロサテライトＤＮＡマーカー；２）ＲＦＬＰマーカー；３）ＶＮＴＲマーカー（種々の数のタンデム反復）；４）ＳＴＳマーカー（単純タグ配列）；５）ＥＳＴ（発現配列タグ）のいずれかである組成物にある。本発明は、肝細胞癌（ＨＣＣ）の予後を可能とする診断手段としての、多形性マイクロサテライトマーカーの使用に関する。ヒトの各染色体対におけるマイクロサテライトＤＮＡマーカーを用いる種々の遺伝子座の位置決定の概要は、１９９６年にDib C．et alによって記載されている。全マイクロサテライトＤＮＡマーカーの全配列、ならびにこれらのマイクロサテライトＤＮＡマーカーを用いて作製されたアンプリコンの全配列は電子データベース(Genbank，STSBank)で、さらに詳しくは下記アドレス：<<http.//www.g enethon.fr>>のインターネットワールドワイドウェブで自由に公的に入手できる。本発明はまた、かかるマイクロサテライトＤＮＡマーカーを用いる診断方法、ならびにこれらの多形性ＤＮＡマーカーと、本発明の診断方法を実施するために必要な試薬を含んでなる診断キットに向けられる。前記ですでに議論したように、ＨＣＣ中で高頻度で変異しているＤＮＡ断片は、癌組織においてそれらが変異している場合には、もはや発現されない癌抑制遺伝子を保有しているということが強く考えられる。本発明者により実現された新しい染色体地図の精度により、今や、ＨＣＣ組織サンプルに見られる変異した染色体領域に対応する野生型ＤＮＡ断片のクローニングを達成し、これらのＤＮＡ断片により保有されている癌抑制遺伝子の候補を同定および配列決定し、次いで注目されるこれらクローン化遺伝子の診断分野での、また治療学、特に遺伝子治療の領域での使用を期待することができる。本発明に従い使用される多形性マイクロサテライトＤＮＡマーカーの各々は、既知の長さのシチジン−アデニン（５’−．．．ＣＡＣＡ．．．−３’）配列の重合体によって構成されている多形性の高いマイクロサテライトゲノムＤＮＡセグメントのそれぞれ５’末端および３’末端をフランクしているゲノムＤＮＡ配列と相補的な配列を有する１対の特異的プライマーからなる。多形性マイクロサテライトＤＮＡマーカーを用いて、マイクロサテライトＤＮＡセグメントが増幅され、次いでこれは、例えば、材料および方法の節に記載されるように、尿素の存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動で、その特異的な長さにより同定される。本発明の診断方法およびキットに、ならびに本発明の注目されるＤＮＡ断片により保有されている癌抑制遺伝子をクローニングするために用いられる好ましい多形性マイクロサテライトＤＮＡマーカーは、表１、２および４に示されている。本発明の特殊な具体例では、本発明の診断およびクローニング法に好ましく使用される多形性マイクロサテライトＤＮＡマーカーは、よく変異を受ける染色体領域、すなわち本発明者らによりＬＯＨのパーセンテージが２０％より高いことが見出された染色体領域と特異的にハイブリダイズするものである。さらに好ましくは、本発明の診断およびクローニング法に使用される特異的な多形性マーカーは、ＬＯＨパーセンテージが３０％より高いもの、最も好ましくはＬＯＨパーセンテージが３５％より高いものである。表２および４では、有意なＬＯＨのパーセンテージにあるマイクロサテライトマーカの遺伝子座の概要を示している。本発明に従い使用されるマイクロサテライトＤＮＡマーカーの名称は、特にＧｅｎｅｔｈｏｎ組織(Evry，France)が、それらの増幅を可能とする特異的なプライマー対を定義した科学的な慣例名であり、これら各プライマーはまた対応するマイクロサテライトＤＮＡマーカーを検出するための特異的プローブとしても有用である。本発明は、以下のマイクロサテライトマーカー：ａ）１ｐ：Ｄ１Ｓ２４３、Ｄ１Ｓ２１４、Ｄ１Ｓ２２８、Ｄ１Ｓ１９９、Ｄ１Ｓ２５５、Ｄ１Ｓ４７６、Ｄ１Ｓ１９８、Ｄ１Ｓ２０７、Ｄ１Ｓ２４８、Ｄ１Ｓ４３６、Ｄ１Ｓ２６４４、Ｄ１Ｓ２８４３、Ｄ１Ｓ４７８、Ｄ１Ｓ２８２８、Ｄ１Ｓ２９０２、Ｄ１Ｓ２４７およびＤ１Ｓ２５５；ｂ）１ｑ：Ｄ１Ｓ３０５、Ｄ１Ｓ１９６、Ｄ１Ｓ２３８、Ｄ１Ｓ２４９、Ｄ１Ｓ２２９、Ｄ１Ｓ２３５およびＤ１Ｓ３０４；ｃ）２ｑ：Ｄ２Ｓ１１３、Ｄ２Ｓ３４７、Ｄ２Ｓ１５１、Ｄ２Ｓ２９４、Ｄ２Ｓ３１１、Ｄ２Ｓ１４３、Ｄ２Ｓ１５９、Ｄ２Ｓ３３６およびＤ２Ｓ１２５；ｄ）４ｑ：Ｄ４Ｓ３９２、Ｄ４Ｓ１５３８、Ｄ４Ｓ１５７８、Ｄ４Ｓ４０６、Ｄ４Ｓ４３０、Ｄ４Ｓ４２２、Ｄ４Ｓ１５４８、Ｄ４Ｓ１５９７、Ｄ４Ｓ４０８、Ｄ４Ｓ４２６、Ｄ４Ｓ３０４２、Ｄ４Ｓ２９２２、Ｄ４Ｓ４００、Ｄ４Ｓ３９５、Ｄ４Ｓ１５３４、Ｄ４Ｓ２９２９、Ｄ４Ｓ２４６０、Ｄ４Ｓ１５７２、Ｄ４Ｓ１５６４、Ｄ４Ｓ２９４５、Ｄ４Ｓ１６１６、Ｄ４Ｓ２９３７、Ｄ４Ｓ１６１３およびＤ４Ｓ４２７；ｅ）６ｐ：Ｄ６Ｓ３４４、Ｄ６Ｓ３０５、Ｄ６Ｓ２６０、Ｄ６Ｓ２７６、Ｄ６Ｓ４２６およびＤ６Ｓ２９４；ｆ）７ｐ：Ｄ７Ｓ５３１、Ｄ７Ｓ６６４、Ｄ７Ｓ４９３、Ｄ７Ｓ４８４、およびＤ７Ｓ５１９；ｇ）７ｑ：Ｄ７Ｓ６６９、Ｄ７Ｓ６５７、Ｄ７Ｓ４８６、Ｄ７Ｓ４９５、Ｄ７Ｓ４８３およびＤ７Ｓ５５０；ｈ）８ｐ：Ｄ８Ｓ２７７、Ｄ８Ｓ５５０、Ｄ８Ｓ２８２、Ｄ８Ｓ２８３およびＤ８Ｓ２６０、Ｄ８Ｓ２６４、Ｄ８Ｓ２６２、Ｄ８Ｓ１１４０、Ｄ８Ｓ５１８、Ｄ８Ｓ１０９９、Ｄ８Ｓ１７４２、Ｄ８Ｓ５６１、Ｄ８Ｓ１８１９、Ｄ８Ｓ１４６９、Ｄ８Ｓ１７２１、Ｄ８Ｓ５５２、Ｄ８Ｓ１７３１、Ｄ８Ｓ２６１、Ｄ８Ｓ１７５２、Ｄ８Ｓ１７７１、Ｄ８Ｓ１８２０、Ｄ８Ｓ５３２及びＤ８Ｓ２８５；ｉ）８ｑ：Ｄ８Ｓ２７３、Ｄ８Ｓ２８１、Ｄ８Ｓ２６３およびＤ８Ｓ２７２；ｊ）９ｐ：Ｄ９Ｓ２８８、Ｄ９Ｓ１５６、Ｄ９Ｓ１６１およびＤ９Ｓ２７３；ｋ）９ｑ：Ｄ９Ｓ１５３、Ｄ９Ｓ２７７、Ｄ９Ｓ１９５、Ｄ９Ｓ１６４およびＤ９Ｓ１５８；ｌ）１０ｑ：Ｄ１０Ｓ５８９、Ｄ１０Ｓ１８５、Ｄ１０Ｓ５９７、Ｄ１０Ｓ５８７およびＤ１０Ｓ２１２；ｍ）１３ｑ：Ｄ１３Ｓ１７５、Ｄ１３Ｓ１７１、Ｄ１３Ｓ２８４、Ｄ１３Ｓ１７０、Ｄ１３Ｓ１５８、Ｄ１３Ｓ２８５およびＤ１３Ｓ２８６；ｎ）１４ｑ：Ｄ１４Ｓ２６１、Ｄ１４Ｓ７５、Ｄ１４Ｓ６３、Ｄ１４Ｓ７４、Ｄ１４Ｓ２９２、Ｄ１４Ｓ８１、Ｄ１４Ｓ２８０、Ｄ１４Ｓ９９５、Ｄ１４Ｓ９７７、Ｄ１４Ｓ１０６２およびＤ１４Ｓ２６５；ｏ）１６ｐ：Ｄ１６Ｓ５２１、Ｄ１６Ｓ４０７、Ｄ１６Ｓ４２０およびＤ１６Ｓ４１１；ｐ）１６ｑ：Ｄ１６Ｓ４０８、Ｄ１６Ｓ５１８、Ｄ１６Ｓ４２２およびＤ１６Ｓ５２０、Ｄ１６Ｓ５０７、Ｄ１６Ｓ３０９８、Ｄ１６Ｓ５０５、Ｄ１６Ｓ５１１、Ｄ１６Ｓ４２２およびＤ１６Ｓ４０２；ｑ）１７ｐ：Ｄ１７Ｓ９２６、Ｄ１７Ｓ７８６およびＤ１７Ｓ９５３；ｒ）１７ｑ：Ｄ１７Ｓ９３３、Ｄ１７Ｓ７８７、Ｄ１７Ｓ９４９、Ｄ１７Ｓ７８４およびＤ１７Ｓ９２８の中から選択される少なくとも１つのマイクロサテライトＤＮＡマーカーのプライマー対からなる２つの核酸分子のうち少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなる、肝細胞癌の予兆診断用組成物に関する。本発明の診断用組成物は、群ａ）〜ｒ）のマイクロサテライトＤＮＡマーカーのプライマー対からなる核酸分子の中から選択される、好ましくは少なくとも２つのポリヌクレオチド（ただし、これらポリヌクレオチドはＤＮＡマーカーを定義する同じプライマー対に属さない）を含んでなる。表２に示されているマーカーのうち、本発明に従い使用される最も好ましいマーカーは以下の通りである：Ｄ４Ｓ４２６（４ｑ３５；４０％ＬＯＨ）、Ｄ６Ｓ３０５（６ｑ２７；３６％ＬＯＨ）、Ｄ７Ｓ４９３（７ｐ１５；３０％ＬＯＨ）、Ｄ８Ｓ２７７（８ｐ２３；４２％ＬＯＨ）、Ｄ１３Ｓ２８４（１３ｑ１４；３０％ＬＯＨ）、Ｄ１７Ｓ７８６（１７ｐ１３；３３％ＬＯＨ）。また本発明者らが、本発明の日付の前にＨＣＣの発生とは決して関与していなかった遺伝子座における有意なＬＯＨパーセンテージを検出した際に、本発明に従い使用される他の好ましい多形性ＤＮＡマーカーはまた以下の通りである：Ｄ１Ｓ２３８（１ｑ２２−ｑ２３；２０％ＬＯＨ）、Ｄ１Ｓ２３５（１ｑ４２−ｑ４３；２４％ＬＯＨ）、Ｄ２Ｓ３３６（２ｑ−ｑ３７；２９％ＬＯＨ）、Ｄ２Ｓ１２５（２ｑ３６−ｑ３７；２０％ＬＯＨ）、Ｄ７Ｓ４９５（７ｑ３３−ｑ３４；２０％ＬＯＨ）、Ｄ８Ｓ２６３（８ｐ２３−ｑ２４；２３％ＬＯＨ）、Ｄ９Ｓ２７３（９ｐ１２−ｐ１４；２１％ＬＯＨ）、Ｄ９Ｓ１６４（９ｑ３４−ｑｔｅｒ；２０％ＬＯＨ）、Ｄ１４Ｓ８１（１４ｑ３２；２３％ＬＯＨ）およびＤ１７Ｓ９２８（１７ｑ２４−ｑｔｅｒ；２１％ＬＯＨ）。さらに発明者らは、遺伝子地図上で互いに０．２５〜１センチモルガン（ｃＭ）以上離れていないものである多形性マーカーを用いて、４つの染色体領域をさらに厳密に定義した。これらの非常に正確なマッピングは、以下の染色体領域に関して図２〜５に示されている：ａ）染色体８ｐ領域（図２および表４）；ｂ）染色体１ｐ３５〜３６領域（図３および表４）；ｃ）染色体１４ｑ３２領域（図４および表４）；ｄ）染色体１６ｑ２３〜ｑ２４領域（図５および表４）；ｅ）染色体４ｑ３５〜ｑ３６領域（図６および表４）。本発明の目的のためには、以下の８ｐマーカーが有用である：Ｄ８Ｓ２６４、Ｄ８Ｓ２６２、Ｄ８Ｓ５１８、Ｄ８Ｓ１７４２、Ｄ８Ｓ２７７、Ｄ８Ｓ８１９、Ｄ８Ｓ１７２１、Ｄ８Ｓ１７３１、Ｄ８Ｓ１７５２。染色体８ｐ領域に関して（図２も参照）、発明者らは今、非常に高いパーセンテージのＬＯＨが観察される、少なくとも４つの染色体領域を検出した。ＬＯＨの第１のピークは、Ｄ８Ｓ１７４２多形性マーカーを用いて８ｐ２３で見られる（情報が得られた５４例で５３％ＬＯＨ）。マーカーＤ８Ｓ２６２とＤ８Ｓ１８１９の間に含まれる領域（約２ｃＭの長さ）は、癌抑制遺伝子を担持する可能性が高い。このように、この特異的な領域は本発明のさらに好ましい領域である。ＬＯＨの第２のピークは、Ｄ８Ｓ１４６９多形性マーカーを用いて８ｐ２２で見られる（情報が得られた４０例で５０％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第３のピークは、Ｄ８Ｓ１７３１多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた５２例で３８％ＬＯＨ）。最後に、ＬＯＨの第４のピークは、Ｄ８Ｓ１７５２多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた６２例で３９％ＬＯＨ）。結論として、本発明の診断およびクローニング法に使用される好ましいマーカーの中にまた、以下の多形性ＤＮＡマーカーＤ８Ｓ１７４２、Ｄ８Ｓ１４６９、Ｄ８Ｓ１７３１およびＤ８Ｓ１７５２もある。本発明の目的のためには、以下の８ｐマーカーが有用である：Ｄ１Ｓ４３６、Ｄ１Ｓ２６４４、Ｄ１Ｓ１９９、Ｄ１Ｓ４７８、Ｄ１Ｓ２８２８、Ｄ１Ｓ２４７およびＤ１Ｓ２５５。染色体１ｐ３５〜ｐ３６領域（図３も参照）に関して、発明者らは今、非常に高いパーセンテージのＬＯＨが観察される少なくとも６つの領域を検出した。ＬＯＨの第１のピークは、Ｄ１Ｓ２６４４多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた３０例で５０％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第２のピークは、Ｄ１Ｓ１９９多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた５０例で５０％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第３のピークは、Ｄ１Ｓ４７８多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた２８例で６４％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第４のピークは、Ｄ１Ｓ２８２８多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた９例で６７％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第５のピークは、Ｄ１Ｓ２４７多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた３１例で５５％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第６のピークは、Ｄ１Ｓ２５５多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた５０例で４８％ＬＯＨ）。結論として、本発明の診断およびクローニング法に使用される好ましいマーカーの中にはまた、以下の多形性ＤＮＡマーカーＤ１Ｓ２６４４、Ｄ１Ｓ１９９、Ｄ１Ｓ４７８、Ｄ１Ｓ２８２８、Ｄ１Ｓ２４７およびＤ１Ｓ２５５もある。染色体１４ｑ３２領域（図４も参照）に関して、発明者らは今、非常に高いパーセンテージのＬＯＨが観察される少なくとも５つの領域を検出した。ＬＯＨの第１のピークは、Ｄ１４Ｓ２８０多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた１０例で５０％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第２のピークは、Ｄ１４Ｓ９９５多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた１４例で３６％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第３のピークは、Ｄ１４Ｓ８１多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた２８例で５７％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第４のピークは、Ｄ１４Ｓ２６５多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた１２例で５８％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第５のピークは、Ｄ１４Ｓ２９２多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた１７例で３５％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第６のピークは、Ｄ１Ｓ２５５多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた５０例で４８％ＬＯＨ）。結論として、本発明の診断およびクローニング法に使用される好ましいマーカーの中にはまた、以下の多形性ＤＮＡマーカーＤ１４Ｓ２８０、Ｄ１４Ｓ９９５、Ｄ１４Ｓ８１、Ｄ１４Ｓ２６５およびＤ１４Ｓ２９２もある。１６ｑ２３〜ｑ２４染色体領域（図５も参照）に関して、発明者らは今、非常に高いパーセンテージのＬＯＨが観察される少なくとも５つの領域を検出した。ＬＯＨの第１のピークは、Ｄ１６Ｓ３０９８多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた１５例で６７％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第２のピークは、Ｄ１６Ｓ５０５多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた１５例で８７％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第３のピークは、Ｄ１６Ｓ５１１多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた１４例で８６％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第４のピークは、Ｄ１６Ｓ４２２多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた２５例で８４％ＬＯＨ）。ＬＯＨの第５のピークは、Ｄ１６Ｓ４０２多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた１９例で６３％ＬＯＨ）。結論として、本発明の診断およびクローニング法に使用される好ましいマーカーの中にはまた、以下の多形性ＤＮＡマーカーＤ１６Ｓ３０９８、Ｄ１６Ｓ５０５、Ｄ１６Ｓ５１１、Ｄ１６Ｓ４２２およびＤ１６Ｓ４０２もある。４ｑ３５〜ｑ３６染色体領域（図６も参照）に関して、発明者らは今、非常に高いパーセンテージのＬＯＨが観察されるいくつかの領域を検出した。ＬＯＨの第１のピークは、Ｄ４Ｓ４００多形性マーカーを用いた場合に見られる（情報が得られた９例で７８％ＬＯＨ）。大きな領域は高頻度でＬＯＨ発生を受けると決定付けられ、この領域はＤ４Ｓ１５７２とＤ４Ｓ２９３７多形性ＤＮＡマーカーの間に物理的に含まれている。結論として、本発明の診断およびクローニング法に使用される好ましいマーカーの中にはまた、以下の多形性ＤＮＡマーカーＤ４Ｓ４００、Ｄ４Ｓ１５６４、Ｄ４Ｓ１６１６およびＤ４Ｓ２９３７もある。本発明の診断方法および診断キットの１つの好ましい具体例では、これらの方法およびキットは表２または表４の、少なくとも２つの多形性ＤＮＡマーカーの組み合わせ、好ましくは２〜１０個の多形性マーカーの範囲の多形性マーカー数の組み合わせ、より好ましくは２〜５個の多形性マーカーの範囲の多形性マーカー数の組み合わせ、最も好ましくは２〜４個の多形性マーカーの範囲の多形性マーカー数の組み合わせ、理想的には３個の多形性ＤＮＡマーカーを含んでなる。本発明に従い使用される多形性マーカーの組み合わせは、それらが、発明者らによりＨＣＣにおいて最も高いパーセンテージが見出されたマーカーの中から選択されるように選ばれることが好ましい。本発明のマイクロサテライトマーカーの組み合わせの好ましい具体例では、各組み合わせは、表２および３に示された染色体領域の各々について、少なくとも１つのマーカーを含んでなる。マイクロサテライトＤＮＡマーカーの各組み合わせは、表４に示された染色体領域の各々について、例えば以下の染色体領域：８ｐ、１ｐ３５〜ｐ３６、１６ｑ２３〜ｑ２４、４ｑ３５〜ｑ３６および１４ｑ３２の各々について、少なくとも１つのＤＮＡマーカーを含んでなることがより好ましい。さらに明示すれば、この組み合わせは、以下の８ｐサブ領域：８ｐ２３、８ｐ２２および８ｐ２１の各々について、少なくとも１つのマーカーを含んでなることが好ましい。マイクロサテライトＤＮＡマーカーの最も好ましい組み合わせは、以下の群１）〜４）：１）８ｐ：Ｄ８Ｓ２６４、Ｄ８Ｓ２６２、Ｄ８Ｓ５１８、Ｄ８Ｓ１７４２、Ｄ８Ｓ２７７、Ｄ８Ｓ８１９、Ｄ８Ｓ１７２１、Ｄ８Ｓ１７３１、Ｄ８Ｓ１７５２ ; ２）１ｐ３５〜ｐ３６：Ｄ１Ｓ４３６、Ｄ１Ｓ２６４４、Ｄ１Ｓ１９９、Ｄ１Ｓ４７８、Ｄ１Ｓ２８２８、Ｄ１Ｓ２４７およびＤ１Ｓ２５５；３）１６ｑ２３〜ｑ２４：Ｄ１６Ｓ３０９８、Ｄ１６Ｓ５０５、Ｄ１６Ｓ５１１、Ｄ１６Ｓ４２２およびＤ１６Ｓ４０２；４）１４ｑ３２：Ｄ１４Ｓ２８０、Ｄ１４Ｓ８１およびＤ１４Ｓ２６５；５）４ｑ３５〜ｑ３６：Ｄ４Ｓ４００、Ｄ４Ｓ２５７２、Ｄ４Ｓ１５６４、Ｄ４Ｓ２９４５、Ｄ４Ｓ１６１６およびＤ４Ｓ２９３７の各々の中で選択される少なくとも１つのＤＮＡマーカーを含んでなる。このように本発明のもう１つの目的は、前記の組み合わせのマイクロサテライト多形性ＤＮＡマーカーを使用するまたは含んでなる、診断方法および診断用組成物にある。前記の組み合わせのＤＮＡマーカーを含んでなる診断用組成物の１つの好ましい具体例では、各群の中で単一のＤＮＡマーカーが選択される。本発明はまた、本発明の診断用組成物、ならびに診断試験を実施するために必要である好適な試薬を含んでなる診断キットに関する。本明細書に記載された結果により、発明者らは、ＨＣＣの場合に本発明に従い使用される多形性ＤＮＡマーカーを用いて増幅させた種々の染色体座における特異的な変異間に相関があることを発見することができた。さらに厳密には、発明者らは、１ｐと１３ｑ、１ｐと８ｐ、ならびに６ｑと１３ｑの両腕に付随して同定されるＬＯＨの頻度が、肝硬変（ＬＣ）よりも慢性肝炎病変（ＣＨ）から生じた腫瘍で有意に高く、前記の組み合わせにおいてＬＯＨを示すＣＨ対ＬＣを伴うＨＣＣ数がそれぞれ１５対５、１６対６、および１４対３であることを認めた。結論として、当業者が肝硬変を伴うＨＣＣと慢性肝炎病変を伴うＨＣＣとを識別するのを助けるには、ＬＯＨの相関が決定付けられたマーカーの特異な組み合わせを含んでなる診断用組成物が有用である。このように、肝硬変を伴うＨＣＣと慢性肝炎病変を伴うＨＣＣとを識別するのに有用である本発明の診断方法および診断用組成物の１つの特殊な具体例では、多形性ＤＮＡマーカーは組み合わせて用いることが好ましい。この特殊な具体例の目的のために、本発明はまた、以下の群ａ）〜ｃ）：ａ）Ｄ１Ｓ２４３、Ｄ１Ｓ２１４、Ｄ１Ｓ２２８、Ｄ１Ｓ１９９、Ｄ１Ｓ２５５、Ｄ１Ｓ４７６、Ｄ１Ｓ１９８、Ｄ１Ｓ２０７およびＤ１Ｓ２４８の中から選択される１ｐのマーカーと、Ｄ１３Ｓ１７５、Ｄ１３Ｓ１７１、Ｄ１３Ｓ２８４、Ｄ１３Ｓ１７０、Ｄ１３Ｓ１５８、Ｄ１３Ｓ２８５およびＤ１３Ｓ２８６の中から選択される１３ｑのマーカー；ｂ）Ｄ１Ｓ２４３、Ｄ１Ｓ２１４、Ｄ１Ｓ２２８、Ｄ１Ｓ１９９、Ｄ１Ｓ２１５５、Ｄ１Ｓ４７６、Ｄ１Ｓ１９８、Ｄ１Ｓ２０７およびＤ１Ｓ２４８の中から選択される１ｐのマーカーと、Ｄ８Ｓ２６４、Ｄ８Ｓ２６２、Ｄ８Ｓ５１８、ＤＤ８Ｓ１７４２、Ｄ８Ｓ２７７、Ｄ８Ｓ１８１９、Ｄ８Ｓ１７２１、Ｄ８Ｓ１７３１およびＤ８Ｓ１７５２の中から選択される８ｐのマーカー；ｃ）Ｄ６Ｓ４６２、Ｄ６Ｓ２６１、Ｄ６Ｓ２９２、Ｄ６Ｓ２９０、Ｄ６Ｓ３０５、Ｄ６Ｓ４４６およびＤ６Ｓ２８１の中から選択される６ｑのマーカーと、Ｄ１３Ｓ１７５、Ｄ１３Ｓ１７１、Ｄ１３Ｓ２８４、Ｄ１３Ｓ１７０、Ｄ１３Ｓ１５８、Ｄ１３Ｓ２８５及びＤ１３Ｓ２８６の中から選択される１３ｑのマーカーの各々の中で選択される少なくとも１つのＤＮＡマーカーを含んでなる診断用組成物に向けられる。発明者らはまた、同じ初期癌のわずかな変異のうちであるがＴ１として分類される小ＨＣＣで生じた１ｐおよび１ｑにおける高頻度ＬＯＨが、２ｑ、６ｑ、７ｑ、８ｑ、１４ｑ、１６ｐｑおよび１７ｐｑにおいて見られることを発見した（１０腫瘍の０〜１）。他方、発明者らは、非侵襲性腫瘍に対し、肝転移または門脈侵襲を伴う侵襲性腫瘍において、しばしば１６ｐと１７ｐで対立遺伝子の不均衡が見られることを発見した。これらの観察により、発明者らは、初期として、または侵襲性癌の段階としてのＨＣＣ癌の分類を可能にする有用な診断手段を提供するために、本発明の診断方法およびキットの特殊な具体例を構想するに至った。本発明の診断方法およびキットのこの特殊な具体例では、初期癌で優先的に起こる遺伝子変異と、侵襲性癌の段階で優先的に起こる遺伝子変異とを識別するために、表１および２の多形性ＤＮＡマーカーの特異的な組み合わせが使用される。このように、マイクロサテライトＤＮＡマーカーの組み合わせを含んでなる診断用組成物も本発明の一部であり、各々の組み合わせは以下の群：ａ）Ｄ１６Ｓ５２１、Ｄ１６Ｓ４０７、Ｄ１６Ｓ４２０およびＤ１６Ｓ４１１の中から選択される１６ｐのマイクロサテライトマーカー；ｂ）Ｄ１７Ｓ９２６、Ｄ１７Ｓ７８６およびＤ１７Ｓ９５３の中から選択される１７ｐのマイクロサテライトマーカーの総ての中で選択される少なくとも１つのＤＮＡマーカーを含有し、前記診断用組成物を用いるＬＯＨの発生が侵襲性の癌の診断には有用であり、かつ、これらの診断用組成物を用いた場合にＬＯＨが存在しないことは、初期癌診断か、またはＨＣＣが存在しないかのいずれかに対する強い支持を意味することが理解されるであろう。本発明はまた、発明者らにより定義された注目される遺伝子座に位置するマーカー［（１）マイクロサテライトＤＮＡマーカー；２）ＲＦＬＰマーカー；３）ＶＮＴＲマーカー（種々の数のタンデム反復）；４）ＳＴＳマーカー（単純タグ配列）；５）ＥＳＴ（発現配列タグ）］を用いて、患者においてＨＣＣまたはＨＣＣ素因を検出するための診断方法に関する。さらに詳しくは、本発明の診断方法は、表２および４のマイクロサテライトマーカー、ならびに前記の本発明の診断用組成物を用いることである。かかる診断方法は、注目される染色対座における対立遺伝子変異の検出を可能とするあらゆる方法を包含する。本発明の好ましい診断方法は、本明細書で使用される１つのＤＮＡマーカーを用いて増幅させた特定の遺伝子座で、または少なくとも２つのマイクロサテライトＤＮＡマーカーの組み合わせ、特には本発明の診断用組成物中に含まれる組み合わせを用いて増幅させたいくつかの特異な遺伝子座で異型接合性の低下（ＬＯＨ）を検出することを可能にする方法である。ＬＯＨの検出を可能にするかかる診断方法は、以下の工程：ａ）第１の組織サンプルが患者の肝臓とは異なる器官に由来し、第２の組織サンプルが患者由来の２種の組織サンプルが肝臓に由来する、２種のサンプルを患者から調製し、ｂ）ハイブリダイゼーションに利用可能な、工程ａ）の組織サンプルの細胞に含まれるゲノムＤＮＡを作製し；ｃ）表２および４に示されたマーカーの中かから選択される少なくとも１つのマイクロサテライトＤＮＡマーカー、または本発明のＤＮＡマーカーの組み合わせを含有する組成物を用いて工程ｂ）のゲノムＤＮＡを増幅させ；ｄ）得られた工程ｃ）の、第１および第２の組織サンプルにそれぞれ由来する増幅産物を比較することにより現れた変化を検出することを含んでなる。前記診断方法の好ましい１つの増幅および検出についての詳細は、材料および方法の節に十分に記載されている。本発明の前記診断方法の好ましい具体例では、工程ｄ）では、オリゴヌクレオチドプローブ（検出手段）として工程ｃ）の増幅手段をなす少なくとも１つのプライマーを使用し、このプローブは選択的に放射性標識または非放射性標識されている。ＨＣＣ中、高頻度の遺伝子変異に関して今、特異的な染色体の小領域がマッピングされるという本発明者らの発見により、当業者はＨＣＣの場合に変異した癌抑制遺伝子を同定およびクローニングすることが可能となる。発明者らは今、高頻度で遺伝子変異を受ける染色体領域、特に対立遺伝子の不均衡を厳密にマッピングし、使用される異なるＤＮＡマーカー間の距離は、互いに最も離れているマーカーについては２センチモルガン（ｃＭ）からであり、互いに最も近いマーカーについては０．２５ｃＭであり、一般に１ｃＭはおよそ１０００キロベース＋／−２０％を表すと解釈される。このように、最も近いマーカーに関しては、特に８ｐ領域においては、それらはゲノム上で０．２５ｃＭ未満しか離れておらず、言い換えれば、それらは２５０キロベース、特に８ｐ２１、８ｐ２２および８ｐ２３に位置するマイクロサテライトマーカーに関しては、約１００ｋｂしか離れていないこともある。本発明の２つのＤＮＡマーカーの染色体位置の間に位置する癌抑制遺伝子候補を単離するために、まず、注目される遺伝子座の間のゲノムＤＮＡにわたっていることが知られている少なくとも１つの酵母人工染色体（ＹＡＣ）クローンを単離することで始める。ＹＡＣライブラリーはＧｅｎｅｔｈｏｎ(Evry，France)で公的に入手できる。８ｐ領域に対しては、以下のＹＡＣが使用される：８５２ｄ１０（少なくともＤ８Ｓ５１８〜ＡＦＭ２４９ＷＡ９マイクロサテライトＤＮＡマーカー位置を含む染色体領域にわたる）、７８７ｃ１１（Ｄ８Ｓ２６４〜ＷＩ −９７５６）、８４２ｂ１１（Ｄ８Ｓ５１８〜ＡＦＭ２４９ＷＡ９）、７４５ａ３（ＡＦＭＢ３２２ＺＨ９〜ＡＦＭ２４９ＷＡ９）、８３２ｇ１２（ＡＦＭＢ３２２ＦＨ９〜ＷＩ−９７５６）、８０７ａ１（Ｄ８Ｓ５１８〜ＡＦＭ２４９ＷＡ９）、７６５ｃ４（Ｄ８Ｓ５１８〜ＡＦＭ２４９ＷＡ９）、９２０ｈ７（Ｄ８Ｓ５１８〜ＡＦＭ２４９ＷＡ９）、７６４ｃ７（ＷＩ−３８２３〜Ｄ８Ｓ１７０６）、７９２ａ６（Ｄ８Ｓ２７７〜ＷＩ−８３２７）、８７９ｆ１１（Ｄ８Ｓ５６１〜ＷＩ−８３２７）、９１０ｄ３（Ｄ８Ｓ５６１〜Ｄ８Ｓ１８１９）、９１０ｆ１２（Ｄ８Ｓ５６１〜ＷＩ−３８２３）、９６７ｃ１１（Ｄ８Ｓ２７７〜ＷＩ−８３２７）、９１８ｃ６（Ｄ８Ｓ５６１〜Ｄ８Ｓ１８１９）、および８５６ｄ８（Ｄ８Ｓ５６１〜Ｄ８Ｓ１８１９）。前記のマーカーは、８ｐ領域、８ｐ２３〜８ｐ２１に配置された以下のマイクロサテライトＤＮＡマーカー間に、以下の順で含まれている：ＮＩＢ９、ＷＩ− ６６４１、ＷＩ−４２５０、Ｄ８Ｓ５０４、ＷＩ−５４１１、ＸＩ−１９８６、Ｄ８Ｓ２６４、Ｄ８Ｓ２６２、Ｄ８Ｓ１８２４、Ｄ８Ｓ２０１、ＡＦＭＢ３２２ＺＨ９、Ｄ８Ｓ５１８、ＷＩ−９７５６、ＡＦＭ２４９ＷＡ９、Ｄ８Ｓ５６１、Ｄ８Ｓ２７７、ＷＩ−３８２３、Ｄ８Ｓ１８１９、Ｄ８Ｓ１７０６およびＷＩ− ８３２７。本発明に従い決定された注目される領域に含まれる癌抑制遺伝子候補のクローニング方法の事例としては、８ｐ２３領域に位置する癌抑制遺伝子候補のクローニング方法が示される。８ｐ２３ゲノムＤＮＡにわたるＹＡＣクローンからコスミドライブラリーを構築する。例えば、コスミドライブラリーは、１９９０年にShimizu et alによって記載された技術に従い構築される。便宜には、コスミドベクターｐＷＥＸ１５ (Wahi et al.，1987)があり、その独特なＢａｍＨＩ部位がクレノウ酵素により埋められ、オリゴヌクレオチドリンカー（５’ＣＣＴＣＧＣＧＡＧＧ−３’）を用いて、独特なＸｈｏＩ部位に変換されている。次いでｐＷＥＸ１５をＸｈｏＩで消化し、５’末端に５’−ＴＣ−３’を残してクレノウ酵素のよりｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを部分的に満たす。注目されるＹＡＣクローンから単離したゲノムＤＮＡを好適な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで部分的に消化し、スクロース密度勾配遠心分離により分画して、小ＤＮＡ断片（３０〜１００ｋｂ）を得る。次いで断片化したＤＮＡを、５’末端に５’−ＧＡ−３’を残して、クレノウ酵素によりｄＡＴＰおよびｄＧＴＰで部分的に満たす。標準的な方法によって、０．５μｇのベクターと、１〜２μｇ、好ましくは１．２μｇのゲノムＤＮＡを用い、連結反応を行い、in vitroパッケージング・エクストラクト(Stratabeneにより市販されているGigapack Gold)を用いてパッケージングする。次いで、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレートに、１０コロニー／ｃｍ²の密度でコスミドクローンを広げ、ヒトＤＮＡ挿入配列を含有するクローンを、プローブとして³²Ｐ標識ヒトゲノムＤＮＡを用いるコロニーハイブリダイゼーションにより選択する。陽性クローンをピックアップし、９６穴マイクロタイタープレート中でインキュベートし、−７０℃で保存した。選択されたこれらのクローンを標準的な手法で精製する。コスミドライブラリーの調製に関する技術的な詳細は総て、Yamakawa et al．(1991)により記載されており、この文献の材料および方法の節は、引用することにより本明細書の一部とされる。前記で選択されたコスミドのコンティグマップを構築するために、５ｎｇの各コスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはＥｃｏＲＩで消化し、１．０％アガロースゲル上で電気泳動し、次いで各コスミドをプローブとして用いてサザンブロッティングに付す。コスミド挿入配列に存在する反復配列によって生じるバックグラウンドシグナルを抑えるために、ハイブリダイゼーションを開始する前に、過剰な全ヒトＤＮＡと各標識プローブをプレハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションパターンに基づき、これらのコスミドクローンのコンティグマップを作製する。次いで、Buckler et al．(1991)による記載のように、エキソン増幅を行う。なお、この文献の材料および方法の節は引用することにより本明細書の一部とされる。便宜には、コスミドＤＮＡの断片をプラスミドベクター、ｐＳＰＬ１中にサブクローン化し、エレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞へトランスフェクトする。それらのトランスフェクション体の細胞質ＲＮＡから逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ産物を単離し、サザンハイブリダイゼーションによって、適当なコスミドクローンに起源するものであることを確認する。選択されたコスミドクローンのエキソンを増幅させて転写可能な配列を探した後、エキソン様配列を単離し、次いでこのエキソン様配列をプローブとして用いてｃＤＮＡライブラリー、好ましくは胎児または成人肝臓由来のｃＤＮＡライブラリー（例えば、Gibco/BRLまたはClonetechにより市販されている成人肝臓ｃＤＮＡライブラリー）をスクリーニングする。次いで、Clontech labs(Palo Alto，CA)から入手したマルチティッシュブロットを用いてノーザンブロット解析を行う。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５ｘデンハートの溶液、６ｘＳＳＣおよび１％サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で、製造業者の推奨に従って行う。ｃＤＮＡ挿入配列の制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ）切断産物をプローブとして用いる。その後、フィルターを５０℃にて２０分間、０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄する。このようにして選択されたｃＤＮＡクローンを用いて、肝細胞癌から単離したＤＮＡのパネルを、選択されたｃＤＮＡクローンの少なくとも１つをプローブとして用いてサザンブロット解析により、候補配列における体細胞再配列に関して調べる。かかるｃＤＮＡクローンを用いる蛍光in situハイブリダイゼーションにより、ＨＣＣ腫瘍のＤＮＡにおける体細胞再配列の検出が可能となる。ＨＣＣＤＮＡと対応する正常型ＤＮＡのハイブリダイゼーションパターンを比較することにより、候補ｃＤＮＡの再配列が体細胞における現象として起こったことが示されよう。さらなる工程は、コードされる癌抑制遺伝子候補の構造解析を可能にするであろう胎児または成人肝臓ｃＤＮＡライブラリーから得られた選択ｃＤＮＡクローンの配列決定と、その配列の、ＧｅｎｂａｎｋまたはＥＭＢＬデータベースなどの遺伝子データベースに集められている他の遺伝子配列との比較にある。本発明はまた、患者におけるＨＣＣの発生に関与する癌抑制遺伝子のポリヌクレオチドを単離および／または精製する方法であって、ａ）選択されたＹＡＣクローンからコスミドライブラリーを構築し；ｂ）プローブである標識したヒトゲノムＤＮＡとのコロニーハイブリダイゼーションによって注目されるコスミドクローンを選択し；ｃ）精製、選択されたコスミドクローンのコンティグマップを作製し；ｄ）エキソン増幅反応を実施し、好適なベクターに逆転写ＲＮＡ断片を挿入し ; ｅ）工程ｄ）の挿入配列を好適なヒトｃＤＮＡライブラリー、好ましくは胎児または成人肝臓ｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズ可能なｃＤＮＡクローンを選択し；ｆ）選択されたｃＤＮＡクローン挿入配列の配列を決定し、コーディング配列を同定する工程を含んでなる方法に向けられる。本発明はまた、前記方法により得られた、患者におけるＨＣＣの発生に関与する癌抑制遺伝子のポリヌクレオチドに関する。本発明のもう１つの課題は、制限酵素切断または化学合成によって得られた癌抑制遺伝子のポリヌクレオチドの断片にある。次いで、得られた変異体のポリヌクレオチド配列および／またはそれらの前記断片は、患者（健常者または癌患者）における突然変異を検出するための特異的オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーとして使用され、かくして与えられた患者のＨＣＣに対する素因の診断が可能となる。本明細書の前記で定義したヌクレオチドプローブまたはプライマーは少なくとも８個のヌクレオチドの長さを有すれば都合がよく、これは選択された癌抑制遺伝子候補と特異的にハイブリダイズすることが可能であると決定付けられた最小の長さである。一般に、このヌクレオチドプローブは、８〜１０００個のヌクレオチド、好ましくは８〜２００のヌクレオチドの範囲のヌクレオチド長を有し、最も好ましくはヌクレオチド断片は少なくとも１２個のヌクレオチド、特には選択された癌抑制遺伝子候補のいずれかの２０個の保存的ヌクレオチドの長さを有する。これらヌクレオチド断片は、増幅反応で使用されるプライマーとして、または核酸プローブとして使用してもよい。このように、選択される癌抑制遺伝子候補のポリヌクレオチドまたはかかるポリヌクレオチドから得られる核酸断片を使用して、特に後に記載する増幅反応などの増幅反応用のヌクレオチドプライマーを選択する。ＰＣＲは米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている。増幅された断片はアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、またはキャピラリー電気泳動によって、またはクロマトグラフィー技術（ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー）によって同定され得る。増幅の特異性は、核酸プローブとして、選択される癌抑制遺伝子候補のポリヌクレオチド、その断片、これらのポリヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドまたはその断片を用いる分子ハイブリダイゼーション、またはそれらの増幅産物自体により保証され得る。増幅されたヌクレオチド断片は、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出するために、また選択される癌抑制遺伝子候補における変異を検出するためにハイブリダイゼーション反応に使用されるプローブとして使用される。本明細書にて前記で定義した増幅核酸断片（《アンプリコン》）もまた本発明の一部である。これらのプローブおよびアンプリコンは、例えば米国特許第４，５８１，３３３号(Kourilsky et al.,)に記載されたもののような酵素、または蛍光性化合物を用いて放射性または非放射性標識され得る。プライマーもまたオリゴヌクレオチドプローブとして、特に本発明のポリヌクレオチドの存在を検出するために使用され得る。また、核酸増幅に関連する他の技術も使用してよく、一般にＰＣＲ技術が好ましい。鎖置換増幅（ＳＤＡ）技術(Walker et al.，1992)とは、制限酵素がその認識部位（ヘミリン酸チオエート形態）で鎖の１つを切断する能力、および制限酵素により生じる３’ＯＨ末端から新しい鎖の合成を開始するＤＮＡポリメラーゼの特性および下流に位置している予め合成した鎖を置換するこのＤＮＡポリメラーゼの特性に基づく等温増幅技術である。ＳＤＡ法は主要な２つの工程を含んでなる：ａ）ｄＣＴＰ−α−Ｓの存在下で、好適な酵素により切断され得る制限部位によりフランクされるＤＮＡの合成。ｂ）酵素切断、鎖置換および置換した鎖の複写により、それ自体修飾されるこれらＤＮＡの指数関数的増幅。アッセイに関して厳密な感度を達成するために、切断工程、鎖置換および複写を十分な回数繰り返す。ＳＤＡ技術は、現在、一般にバチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus s tearothermophilus )由来のエンドヌクレアーゼ（ＢＳＯＢＩ）、およびバチルス・クラドテナックス(Bacillus cladotenax)から単離された、いずれの５’→３ ’エキソヌクレアーゼ活性もないＤＮＡポリメラーゼ断片（ｅｘｏ−Ｂｃａ）［＝ｅｘｏ−ｍｉｎｕｓ−Ｂｃａ］を用いて実施されるが、最初は制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｃＩＩを用いて実現した。両酵素は６０℃で取り扱うことができ、その系が今、ｄＵＴＰの使用およびＵＤＧによる浄化が可能となるよう最適化される。この技術を使用する場合、Spargo et al.，1996、により記載されるように、６０℃で１５分間のインキュベーション後の標的ＤＮＡの世代時間は２６秒であり、増幅速度は１０¹⁰である。ＳＤＡ増幅技術は、ＰＣＲ（温度調節装置を備えた１つの水浴装置が必要）を行うより容易であり、他の増幅方法より迅速である。このように、本発明のもう１つの目的は、ＳＤＡ技術によるＤＮＡまたはＲＮＡ増幅方法における本発明の核酸断片（プライマー）を使用することである。ＳＤＡを実施するため、２対のプライマー、すなわち注目される標的ポリヌクレオチドに特異的な配列にある１対の外部プライマー（Ｂ１，Ｂ２）および制限エンドヌクレアーゼ、例えば酵素ＢＳＯＢＩにより認識される部位を持つ融合オリゴヌクレオチドにある１対の内部プライマー（Ｓ１，Ｓ２）を使用する。ＳＤＡ増幅反応における本発明のヌクレオチドプローブおよびプライマーの使用について例示する具体例としては、標的ポリヌクレオチドに非特異的であり、ＨｉｎｃＩＩまたはＢＳＯＢＩに対する制限部位を有する配列を、各々の選択される癌抑制遺伝子候補に特異的なプライマーの５’末端に付加する。ＢｓｏＢＩにより認識される制限部位を含むかかる付加配列は、有利には、次の配列ＧＣＡＴＣＧＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＴＣＧＧＧＴであり、そのヌクレオチドは酵素ＢｓｏＢＩの認識部位に相当し、太字で表した。かくして、ＳＤＡ増幅の実施に有用なプライマーは、前記に記載される本発明のいずれのプライマーからでも設計でき、本発明の一部となる。かかるプライマーによりＳＤＡを行うための操作条件は、Spargo et al.，in 1996において記載される。さらに特に、ＢｓｏＢＩ制限部位を含むよう設計された本発明のプライマーでＳＤＡ増幅反応を行う場合、次の条件を使用する：ＢｓｏＢＩ／ｅｘｏＢｃａ［＝ｅｘｏ−ｍｉｎｕｓ−Ｂｃａ］ＳＤＡ反応は、最終濃度９．５ｍＭＭｇＣｌ₂、各１．４ｍＭｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰ−α−Ｓ、１００μｇ／ｍｌアセチル化ウシ血清アルブミン、１０ｎｇ／ｍｌヒト胎盤ＤＮＡ、３５ｍＭＫ₂ＨＰＯ₄ｐＨ７．６、０．５μＭプライマーＳ１_BsoBIおよびＢ２_BsoBI、０．５μＭプライマーＢ１_BsoBIおよびＢ２_BsoBI 、３．２Ｕ／μｌＢｓｏＢＩ酵素、０．１６Ｕ／μｌｅｘｏＢｃａ［＝ｅｘｏ−ｍｉｎｕｓ−Ｂｃａ］酵素、３ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１１ｍＭＮａＣｌ、０．３ｍＭＤＴＴ、４ｍＭＫＣｌ、４％グリセロール，０．００８ｍＭＥＤＴＡ、および種々の量の標的ＤＮＡを含有する５０μｌ容量で行う。ＢｓｏＢＩおよびｅｘｏＢｃａの添加に先立ち、不十分な反応物（３５μｌ）を９５ ℃で３分間加熱し、標的ＤＮＡを変性させ、次いで６０℃で３分間プライマーをアニールする。ＢｓｏＢＩ（４０ユニット／μｌ）４μｌ、ｅｘｏＢｃａ（２２ユニット／μｌ）０．３６μｌおよび酵素希釈緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、）１０．６μｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ）からなる酵素混合物１５μｌの添加に続き、この反応物を６０℃で１５分間インキュベートする。熱湯浴で５分間加熱することにより、増幅を終了させる。酵素添加後、直ちに熱湯浴でサンプルを加熱し、非ＳＤＡサンプルを作製する。Continental Laboratory Productsのエアゾル耐性チップを使用し、予め増幅させた生成物によるＳＤＡ反応物の汚染を軽減する。選択される癌抑制遺伝子候補のポリヌクレオチドおよび前記に記載のそれらの断片、特に本発明のプライマーは：ＴＡＳ（翻訳を基にした増幅系）、Kwoh et al.，in 1989により記載；ＳＲ（自己継続配列複製）、Guatelli et al.，in 1990により記載；ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）、Kievitis et al.，in 1991により記載 ; ＴＭＡ（翻訳介在増幅）などの種々の標的核酸増幅方法を実施するための技術として有用である。選択される癌抑制遺伝子候補のポリヌクレオチドおよび前記に記載のそれらの断片、特に本発明のプライマーは：ＬＣＲ（リガーゼ鎖反応）、Landegren et al.，in 1988により記載、また、熱安定性リガーゼを使用するBarany et al.，in 1991により改良；ＲＣＲ（修復鎖反応）、Segev et al.，in 1992により記載；ＣＰＲ（サイクリングプローブ反応）、Duck et al.，in 1990により記載；Ｑ−βレプリカーゼ反応、Miele et al.，in 1983により記載、また、Chu et al.，in 1986、Lizardi et al.，in 1988およびBurg et al.およびStone et al. ，in 1996により改良などのプローブとして使用される核酸の増幅または修飾のための技術としてもまた有用である。検出されるべき標的ポリヌクレオチドがＲＮＡ、例えばｍＲＮＡである場合、生物学的サンプルに含まれるＲＮＡからｃＤＮＡを得るために、増幅反応の前に逆転写酵素が使用されよう。その後生成したｃＤＮＡは本発明の増幅工程または検出工程で使用されるプライマーまたはプローブに対する核酸標的として使用する。本発明のヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドは、ヒトゲノムのＨＣＣの発生に関連するヌクレオチド配列の存在または不在の検出に対して特異的である。本発明の《特異的プローブ》とは、選択される癌抑制遺伝子候補の１つのポリヌクレオチドとハイブリダイズし、無関係な配列とはハイブリダイズしないいずれのオリゴヌクレオチドをも意味する。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは少なくとも８ヌクレオチドの長さが好ましく、８〜３００の間のヌクレオチドを含んでなる長さがさらに好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは特に、ストリンジェントな条件下で選択される癌抑制遺伝子候補のうちの１つポリヌクレオチドの総てまたは一部を含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡ分子とハイブリダイズする。例示的具体例のように、特に本発明のポリヌクレオチドを検出するために用いられるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は都合よくは以下の通りである：ハイブリダイゼーション工程は６ｘＳＳＣ緩衝液、５ｘデンハートの溶液、０．５％ＳＤＳおよびサケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌの存在下で実施する。ハイブリダイゼーション工程の後、４回の洗浄工程を行う：好ましくは２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ緩衝液中、６５℃にて、５分間２回の洗浄；好ましくは２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ緩衝液中、６５℃にて、３０分間１回の洗浄；好ましくは０．１ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ緩衝液中、６５℃にて、１０分間１回の洗浄。本発明の非標識ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは直接プローブとして使用してよい。しかしながら、やはり、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、一般に放射性元素（³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ、¹²⁵Ｉ）で、または非同位体分子（例えば、ビオチン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン、５−ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン）により標識して、多くの使用に有用なプローブを作製する。核酸断片の非放射性標識の例は、最新の仏国特許第７８１０９７５号において、またはSanchez-Pescador et al.，1988により記載される。後者の場合、他の標識化技術、最新の仏国特許第２，４２２，９５６号および同第２，５１８，７５５号に記載されるものなどを使用してもよい。ハイブリダイゼーション工程は様々な方法で行ってよい(Matthews et al.，1988)。より一般的な方法は、基質（ニトロセルロース、ナイロン、ポリスチレン）上に生物学的サンプルから抽出した核酸を固定化し、さらに規定の条件で、標的核酸をプローブとともにインキュベートすることである。ハイブリダイゼーション工程に続き、過剰量の特異プローブを除去し、形成されたハイブリッド分子を適当な方法（放射性、蛍光性、または酵素活性測定）により検出する。本発明のプローブは、それらがシグナル増幅させるような構造特性を有していることが有利であり、かかる構造特性としては、例えばUrdea et al.，1991により、または欧州特許Ｎ°ＥＰ−０２２５，８０７(Chiron)号において記載されるものような分枝ＤＮＡプローブのそれがある。本発明のプローブのもう１つの有利な具体例において、後者は《キャプチャープローブ》として用いられる、これを目的に、基質上に固定化され、生物学的サンプルに含まれる標的核酸を捕捉する。捕捉された標的核酸は、次いでキャプチャープローブにより認識される配列と異なる標的核酸の配列を認識する２番目のプローブを用いて検出される。本発明のプローブまたはプライマーとして有用なオリゴヌクレオチド断片は、制限酵素による、選択された癌抑制遺伝子候補のポリヌクレオチドの切断により作製してよく、当業者はSambrook et al.，1989に記載される手法を指標とする。多くとも２００ヌクレオチド（またはこれらの分子が二本鎖である場合、２００ｂｐ）の本発明の核酸の適当なもう１つの調製工程は次の工程：１９８６年に記載されたβ−シアンエチルホスホラミダイトの自動化法を用いてＤＮＡを合成し；かくして得られた核酸を適当なベクター中へクローン化し；本発明の適当なプローブをハイブリダイズさせることによって核酸を精製することを含んでなる。２００ヌクレオチド以上（またはこれらの分子が二本鎖である場合、２００ｂｐ）の長さを有する本発明の核酸を作製する化学的方法は次の工程：各末端に種々の制限部位を有する化学合成オリゴヌクレオチドを組み込み、かくして得られた核酸を適当なベクター中へクローン化し；本発明の適当なプローブをハイブリダイズさせることによって核酸を精製することを含んでなる。前記の核酸をコーディング配列として用いて本発明のポリペプチドを作製する場合、それらの配列が作製されるべきポリペプチドのアミノ酸配列と（適当なリーディングフレーム内で）確実に適合することが重要である。本発明のオリゴヌクレオチドプローブはまた、基質上に固定化されたプローブのマトリックスライブラリー、１またはいくつかの塩基のシフトで配置される所与の長さを持つ各プローブの配列、両者、標的核酸の別個の配列に相補的である前記マトリックスライブラリーの各プローブを含んでなる検出装置に用いてもよい。所望により、マトリックスの基質は電子供与体として作用できる物質であってよく、ハイブリダイゼーションが起こったマトリックスの位置を検出し、次いで電子装置により測定する。プローブのかかるマトリックスライブラリーおよび標的核酸の特異的検出法は、欧州特許ＥＰ−０７１３，０１６号(Affymax techn ologies)および米国特許第５，２０２，２３１号(Dnnanac)に記載される。オリゴヌクレオチドプローブマトリックスを使用し、選択された癌抑制遺伝子候補に起こる変異の検出をすることは有利であると考えられる。この特殊な目的のため、プローブは特に、それらのハイブリダイゼーションを既知の変異（欠失、１またはいくつかのヌクレオチドの置換の挿入のいずれかによる）を保有する遺伝子へとするヌクレオチド配列を有するよう設計される。既知の変異とは、同定、選択された癌抑制遺伝子候補上の変異を意味する。選択された癌抑制遺伝子候補上の変異の検出に使用されるもう１つの技術は高密度ＤＮＡアレイの使用である。高密度ＤＮＡアレイの単位要素を構成する各オリゴヌクレオチドプローブは、選択された癌抑制遺伝子候補ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの特異的部分配列と対合するよう設計される。かくして、標的遺伝子の部分配列に相補的なオリゴヌクレオチドからなるアレイは、野生遺伝子による標的配列の同一性の決定し、その量の測定し、さらに標的遺伝子と選択された癌抑制遺伝子候補の参照野生型遺伝子配列との間の差を検出するために使用される。かかる１つの設計において、４Ｌ配置アレイと称され、４種のプローブ（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）の１組、好ましくは１５ヌクレオチドオリゴマーにより満たされる。４種のプローブの各組において、完全な補体は誤対合プローブより強くハイブリダイズするであろう。それゆえ、長さＬの核酸標的は、４Ｌプローブ、既知の野生参照配列において可能性のある総ての変異を含む全プローブ組を含む配置アレイにより変異が走査される。１５量体プローブ組の配置アレイのハイブリダイゼーションシグナルは、標的配列中の１つの塩基の交換により混乱する。結果として、変異位置をフランクするプローブに対するシグナルまたは《フットプリント》の特徴的な低下がある。この技術はChee et al.，in 1996により記載されている。本発明のもう１つの目的は：本発明の核酸プローブまたはプライマーによる生物学的サンプルに含まれるＤＮＡ（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）またはＲＮＡ間のハイブリッド形成；本発明の１対のプライマー使用により得られる増幅核酸断片による生物学的サンプルに含まれるＤＮＡ（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）またはＲＮＡ間のハイブリッド形成；により得られるハイブリッド分子である。本発明のｃＤＮＡとは、Sambrook et al.，in 1989により記載されるような逆転写酵素活性を有する酵素の存在下でＲＮＡ分子をインキュベートすることにより得られるＤＮＡ分子を意味する。本発明はまた、前記の教示により、それらが少なくとも１つの核酸を含むことを特徴とする組換えプラスミドのファミリーに関する。有利な具体例によれば、組換えプラスミドは選択される癌抑制遺伝子候補のポリヌクレオチドまたはその核酸断片を含んでなる。本発明のもう１つの目的は、核酸配列のクローニング、発現または挿入のための適当なベクターであって、所望により本発明のポリペプチドの発現をさせる調節エレメントの制御下に、その複製に必要ではない部位で前記の核酸を含んでなることを特徴とするベクターである。使用される特定のベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ＰＡＣ（ＰＩ誘導人工染色体）およびＹＡＣ（酵母人工染色体）がある。プラスミドとして、ｐＵＣベクターが好ましい。本発明のもう１つの目的は、ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含有する生物学的サンプルにおいて、ＨＣＣに関連する遺伝子異常を検出する方法であって、ａ）生物学的サンプルを、本発明の１対のオリゴヌクレオチド断片と接触させ（ここで、サンプル中に含まれるＤＮＡは所望により、ハイブリダイゼーションに利用できるよう作製されており、かつ、これらオリゴヌクレオチド断片と生物学的サンプル中に含まれるＤＮＡとのハイブリダイゼーションが可能な条件下である）；ｂ）ＤＮＡを増幅させ；ｃ）増幅産物を明らかにし；ｄ）所望により適当な方法で突然変異または欠失を検出する工程を含んでなる方法にある。前記の方法の工程ｄ）は、一本鎖多形性技術（ＳＳＣＰ）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、またはＰＣＴ特許公報第ＷＯ−９５／０７３６１号に記載されるＦＡＭＡ技術である。本発明のもう１つの目的は、ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含有する生物学的サンプルにおいて、ＨＣＣに関連する遺伝子異常を検出する方法であって、ａ）生物学的サンプルを、本発明のオリゴヌクレオチドプローブと接触させ（ここで、サンプル中に含まれるＤＮＡは所望により、ハイブリダイゼーションに利用できるよう作製されており、かつ、これらプライマーと生物学的サンプル中に含まれるＤＮＡとのハイブリダイゼーションが可能な条件下である）；ｂ）オリゴヌクレオチドプローブと生物学的サンプル中に含まれるＤＮＡとの間で形成されたハイブリッドを検出する工程を含んでなる方法にある。本発明はまた、ＤＮＡを含有する生物学的サンプルにおいて、ＨＣＣに関連する遺伝子異常を検出する方法であって、ａ）支持体に固定化された本発明の第１のオリゴヌクレオチドプローブを、サンプル中に含まれる、所望によりハイブリダイゼーションに利用できるよう作製されたＤＮＡと、これらプライマーと生物学的サンプル中に含まれるＤＮＡとのハイブリダイゼーションが可能な条件下で接触させ；ｂ）所望により固定化された第１のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしなかった生物学的サンプルに含まれるＤＮＡを除去した後に、固定化された第１のオリゴヌクレオチドプローブと生物学的サンプル中に含まれるＤＮＡとの間で形成されたハイブリッドを、本発明の第２のオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、この第２のプローブが、固定化された第１のプローブがハイブリダイズする配列とは異なる配列とハイブリダイズする工程を含んでなる方法にある。本発明のもう１つの目的は、試験すべき二本鎖ＤＮＡ調製物に含まれるヌクレオチド配列における塩基置換または塩基欠失の存在および位置を検出することにより、ＤＮＡを含有する生物学的サンプルにおいてＨＣＣに関連する遺伝子異常を検出する方法であって、ａ）一方の腕に試験すべきＤＮＡのヌクレオチド配列を、他方の腕に既知配列のＤＮＡのヌクレオチド配列を含む領域を特異的に増幅させ（ここで、既知配列のＤＮＡは本発明のポリヌクレオチドである）、ｂ）これらのＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖を異なる蛍光またはその他の非同位元素標識で標識し；ｃ）増幅させたＤＮＡをハイブリダイズさせ；ｄ）既知配列のＤＮＡと試験すべきＤＮＡとの間で形成されたヘテロ二重らせんを、ＤＮＡ鎖の誤対合部分の切断によって明らかにする工程を含んでなる方法にある。かかる誤対合の位置決定技術は、ＰＣＴ公報第ＷＯ−９５／０７３６１号においてMco et al.，1991により記載されている。本発明はまた、生物学的サンプルにおいて、ＨＣＣに関連する遺伝子異常を検出する診断キットであって、以下の構成要素：ａ）請求項２０記載の１対のオリゴヌクレオチド；ｂ）ＤＮＡ増幅を行うために必要な試薬；ｃ）増幅した断片の長さを決定するか、または突然変異を検出することを可能にする成分を含んでなるキットに関する。同定された癌抑制遺伝子候補の配列は、例えば一本鎖多形性技術（ＳＳＣＰ）により、ＨＣＣ腫瘍細胞における体細胞変異について、さらにスクリーニングされる。ＳＳＣＰ解析は、例えばRolfs et al.(1992)の教示に従って、好適な特異的オリゴヌクレオチドプライマーを設計した後、コーディング領域に相当する、同定された癌抑制遺伝子候補の決定されたエキソンの各０のＰＣＲ増幅に実施される。この特定の目的のため、ＰＣＲ反応は、ゲノムＤＮＡ１００ｎｇ、各プライマー１μＭ、ｄＮＴＰ２５μＭ、２μＣｉの〔α³²Ｐ〕ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、および０．２５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ＢｏｅｈｒｕｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を含有する５μｌ溶液で行う。ＰＣＲ産物は、ＳＳＣＰ解析による変異バンドを広げるものであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）のＨｉｎｃＩＩＩ部位へクローン化され、得られた個々のクローンを調査する。両鎖はＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用いるジデオキシ鎖−終結法により配列決定する。癌抑制遺伝子候補のクローニング、同定および変異検出手法に関するあらゆる技術的詳細は、Fujiwara et al.(1991)およびまたDe Souza et al.(1995)により十分に記載され、これらの論文の材料および方法の節は引用することにより本名最初の一部とされる。一般に本発明者らにより同定された注目される染色体遺伝子座、または決定された癌抑制遺伝子候補の特異的配列のいずれかにおける遺伝子変異（挿入、欠失、置換）の発生を検出する他の技術は、本明細書で前記した通りである。選択された癌抑制遺伝子候補における変異が１以上の塩基の欠失または挿入である場合、バンドシフトアッセイを行うことにより、変異部位を含む遺伝子の小セグメントをＰＣＲにより増幅し、変異した対立遺伝子はその移動の変化のため、ゲル電気泳動により検出される。１ｂｐの差の分離には、ＰＣＲ産物への放射性標識の組み込み、それに次ぐ大型変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動およびオートラジオグラフ法が必要である。２塩基以上の差は非変性ポリアクリルアミドゲルで分析され、ＤＮＡ断片は臭化エチジウムによる染色によって検出される(Sambrook et al.，1989)。選択された癌抑制遺伝子候補における変異分析のもう１つの技術は、変異が配列の制限部位の欠失、または作出によるいずれかで起こる場合に使用される制限部位分析(Halliassos et al.，1989、この技術内容は引用することにより本明細書の一部とされる)である。両場合において、変異が存在するのであれば、変異領域由来のＰＣＲ産物の適当な制限酵素による消化によって、異なるサイズの断片が生じるであろう。選択された癌抑制遺伝子候補における変異を検出する３番目の好適な手法は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセイ、すなわちＰＣＲ生成物をナイロンまたはニトロセルロース膜にスポットし、次いでこれを正常または変異配列のいずれかに相当する約１８塩基の放射性標識したオリゴヌクレオチド配列とともインキュベートする技術である(Conner et al.，1983;Saiki et al.，1986;Saik i et al.，1989)。インキュベーションに使用される溶液の温度および塩濃度を慎重に調節すれば、短いオリゴヌクレオチドプローブは、それらの正確な相補的配列に結合する（試薬濃度の決定に関してはRolfs et al.，1992を参照）。オリゴヌクレオチドプローブはまた、ビオチンなどの非放射性タグで標識してもよい (Saiki et al.，1986)。対立遺伝子特異的プライミング技術もまた、選択された癌抑制遺伝子候補における遺伝子的変化の検出に非常に有用である。この技術は正常または変異配列の対立遺伝子特異的プライミングに影響を及ぼすＰＣＲプライミング工程の特異性を利用する(Newton et al.，1989;Ferrie et al.，1992)。対立遺伝子特異的プライマーは、３’末端が変異部位に正確に位置するよう設計される。対立遺伝子特異的プライマーの３’末端の配列がこの位置でサンプルＤＮＡの配列と対合するだけであれば、ＰＣＲ増幅はこのプライマーと《通常のプライマー》の間、変異のもう一方の側からある程度離れたところでで起こる。選択された癌抑制遺伝子候補における変異の特異的配列が未知である場合には、様々な方法が使用され(Dianzani et al.，1993;Grompe et al.，1993により概説)、入手可能なもののうち特殊な方法は、スクリーニングしようとする遺伝子の大きさおよび複雑性、ならびに要求される感受性の程度により選択決定される。一本鎖多形性はすでに前記に記載した、さらにこの技術を行うための追跡手法に関する技術的詳細はまた、Orrta et al.(1989)、Orita et al.(1989a)、Yap e t al.(1993)、Hayashi et al.(1993)により記載された研究に見られる。ヘテロ二重らせん解析法は、１個のヌクレオチドによって互いに異なる配列を有する２種の一本鎖ＤＮＡ分子間のハイブリッドのコンホメーションが変化するという観察に基づくものであり、これは非変性ゲル上での電気泳動の移動性の低下として検出される。便宜には、ＰＣＲ後のヘテロ二重らせんの形成はブライド (bride)変性工程、それに次ぐ室温で徐々に冷却することにより促進される。次いでＤＮＡをポリアクリルアミドゲルまたはＨｙｄｒｏｌｉｎｋ(AT Biochem)のいずれかの非変性ゲルで電気泳動に付し、臭化エチジウムで染色する。使用される特異的な手法に関する技術的詳細は、Keen et al.(1991)、White et al.(1992 )およびSoto et al.(1992)により記載されている。選択された癌抑制遺伝子候補に起こる変異は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、すなわちＤＮＡ断片を高温で漸増濃度の変性剤を含むポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動に付す場合、ある点では部分的にまたは完全に変性するようになるといことを活用する技術により検出される。この結果、その電気泳動の移動性に明白な低下をもたらす。この方法の感度は、ＰＣＲ間のＧＣに富んだ配列（《ＧＣクランプ配列》）のＤＮＡ断片末端への結合により高められ、次いでそれは最終の融解ドメインとして働くことが好ましい。６００ｂｐまでの変異は、ＤＧＧＥ法を用いて迅速に検出される。この特殊な手法は、Grompe et al.(19 93)、Fischer et al.(1983)、Sheffield et al.(1989)により記載されている。化学的切断法（ＣＣＭ）およびかかる方法の極めて有効な改良法、すなわちＦＡＭＡもまた使用される。ＣＣＭは、化学物質による修飾に対するヘテロ二重らせんにおける誤対合塩基の感受性に基づいている。試験サンプル由来のＤＮＡおよび放射性標識した対照を混合し、変性させ、さらにヘテロ二重らせんを形成させる。ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムとのインキュベーションの結果、それぞれ誤対合したシトシンまたはチミンが修飾され、次いでそれらをピペリジンで切断する。その後、誤対合により生じた切断産物を電気泳動およびオートラジオグラフ法により検出する(Cotton et al.，1988;Montandon et al.，198 9;Saleeba et al.，1992;Haris et al.，1994)．現在ではタンパク質は、発現ベクター、プラスミド、ファージまたはファージミドなどの使用による遺伝子工学技術によって容易に大量生産される。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入して、注目されるポリペプチドをin vitroで生産する。本発明はまた、本発明の癌抑制遺伝子候補によりコードされるポリペプチドを産生する方法であって、ａ）所望により、本発明に記載の１対のプライマーを用いて、所望のポリペプチドをコードする核酸を増幅させ（ＳＤＡ、ＴＡＳ、３ＳＲＮＡＳＢＡ、ＴＭＡなどによる）；ｂ）注目される核酸を適当なベクターに挿入し；ｃ）工程ｂ）のベクターで予め形質転換またはトランスフェクトした細胞宿主を適当な培地で培養し；ｄ）このようにしてコンディショニングした培地を回収するするか、または例えば超音波処理もしくは浸透圧ショックにより細胞宿主を溶解させ；ｅ）この培地から、または得られた宿主細胞溶解物のペレットから、かくして産生された注目されるポリペプチドを分離または精製し；ｆ）産生された注目されるポリペプチドを同定する工程を含んでなる方法に関する。本発明の癌抑制遺伝子候補に対してコードされるポリペプチドは、当業者に十分公知の慣例のタンパク質配列決定法を用いてそれらの配列を決定する前に、選択された癌抑制遺伝子候補のポリペプチドのうち１つのポリペプチドに向けられたポリクロナールまたはモノクロナール抗体を予め固定化したイムノアフィニティクロマトグラフィーカラムに結合させることにより同定され得る。前記の抗体は、Kohler and Milstein in 1975に記載される技術に従い、ハイブリドーマから作製してもよい。ポリクロナール抗体は哺乳類、特にマウス、ウサギの、免疫アジュバントと組み合わせた本発明のペプチドで免疫化することにより、さらにまた抗原として使用されたペプチドを予め固定化したアフィニティクロマトグラフィーカラムで、免疫動物の血清に含まれる特異的抗体を精製することにより作製してもよい。イムノアフィニティクロマトグラフィーカラムを調製し、使用するための技術は、例えばBird et al．in 1984により記載されている。癌抑制遺伝子候補にコードされるタンパク質に対して生成した抗体を調製するための好ましい具体例は本明細書に記載されている。便宜には、注目されるポリペプチドを、Gregory and Milstein in 1967によって記載されるベンジジン−ビス−ジアゾ化法を用いて卵アルブミン(Calbiochem)に結合させる。なお、１分子の卵白アルブミンに対するポリペプチド残基の比率は５：１とする。初回の注入の２ヶ月後、結合したポリペプチド０．５ｍｇを動物に注入し、２回目の注入後２および４ヶ月の間に同ポリペプチド０．５ｍｇの３回目の注入を行う。抗血清は結合ポリペプチドの３回目の注入の後、２および４週の間に回収する。所望により、前記のアフィニティクロマトグラフィーカラムで精製する。注入は複数箇所の皮内注入が好ましく、一般に１０箇所で注入を行う。本発明のポリペプチドはまた、化学合成の慣例法により、均質な溶液中でまたは固相のいずれかで調製され得る。かかる化学的ポリペプチド合成技術の例示的具体例としては、それはHoubenweyl in 1974により記載される均質溶液法が挙げられる。本発明の発現ベクターで使用される好適なプロモーター領域は、異種遺伝子が発現される必要がある細胞宿主を考慮して選択する。細菌プロモーターはＬａｃＩ、ＬａｃＺ、Ｔ３またはＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、またはバキュロウイルス由来のｐ１０タンパク質プロモーター(Kit Novagen)(Smith et al.，19 83;O'Reilly et al.，1992)、ラムダＰ_Rプロモーター、またはtrcプロモーターが好ましい。真核生物宿主の異種遺伝子の発現のための好ましいプロモーターには、ＣＭＶ早期プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０由来の早期または後期プロモーター、あるレトロウイルスのＬＴＲ領域、またマウスメタロチオネインＩプロモーターがある。前記のプロモーターの中から所定のプロモーターを選択することは、遺伝子工学技術分野におけるその知識、またSambrook et al.in 1989の著述、またはFull er et al．in 1996により記載される手法を指針に、十分に当業者の能力の範囲内にある。一般に本発明に従い使用される好適な発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミドまたはファージミドが挙げられる。前記の癌抑制遺伝子候補によりコードされるタンパク質またはそれらのペプチド断片の発現のための好適な発現ベクターには、昆虫細胞および昆虫細胞系統で増殖させ得るバキュロウイルスベクターがある。特に好適な宿主ベクター系としては、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodopttera frugiperda)由来のＳＦ９細胞系統(ATCC N°CRL 1711)をトランスフェクトするため使用されるｐＶＬ１３９２／１３９３バキュロウイルス転移ベクター(Pharmigen)がある。バキュロウイルス発現系において前記の癌抑制遺伝子候補によりコードされるタンパク質またはそれらのペプチド断片の発現のための他の好適な発現ベクターとしては、ｐＵＣ８主鎖のｐｏｌ遺伝子の特異的発現エレメントを含む多数のクローニング部位（ＭＣＳ）を有するバキュロウイルス発現ベクターであるプラスミドがある。これらのプラスミドは２つのサブグループに分けられ、すなわち一方はメリチン遺伝子のシグナル配列とのＮ末端融合の構築が可能なベクターｐＶＬＭｅｌＭｙｃ-(Chai et al.，1993;Vlasak et al.，1983)であり、他方はpol およびｃ−Ｍｙｃタグの最初の１２のアミノ酸とのＮ末端融合が可能なベクターｐＶＬＰｏｌＭｙｃ-である。発現させるべき遺伝子はＭＣＳ中へクローン化でき、その結果、ベクターによりコードされるｍｅｌ−ｍｙｃまたはｐｏｌ−ｍｙｃのいずれかとのＮ末端融合が生じる。マウス異種タンパク質（５ＨＴ_5Aセロトニン受容体）を発現するかかる多用途ベクターの使用例は、特にLenhardt et al ．in 1996により記載されている。前記の工程を実施するための好適なもう１つのベクターは、ワクシニアウイルスベクターである。この特殊な具体例では、トランスフェクションおよび培養工程にＢＳＣ−４０またはＬｏＶｏを使用する。他の特定の発現ベクターとしては以下のものがある：ａ）細菌ベクター：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＨＮ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（総てStratageneによって市販されている）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０，ｐＲＩＴＳ（総てPharmaciaによって市販されている）バキュロウイルス導入ベクターｐＶＬ１３９２／１３９３(Pharmingen)；ｐＱＥ −３０(QIAexpress)。ｂ）真核細胞ベクター：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（総てStratageneによって市販されている）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（総てPharmaciaによって市販されている）。前記の総てのベクターは、本発明の癌抑制遺伝子候補を発現させるために、細胞宿主を形質転換またはトランスフェクトするのに有用である。本発明の細胞宿主は、そのゲノムまたは遺伝学的背景（染色体、プラスミドを含む）が、本発明の異種ポリヌクレオチド遺伝子配列により改変されることを特徴とする。本発明の発現ベクターの受容体として用いられる好適な細胞宿主としては、以下のものがある：ａ）原核細胞：大腸菌（Escherichia coli）株（すなわち、ＤＨ５−α株）または枯草菌（Bacillus subtilus）ｂ）真核細胞宿主：ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣＮ°ＣＣＬ２；Ｎ°ＣＣＬ２．１；Ｎ°ＣＣＬ２．２）、Ｃｖ１細胞（ＡＴＣＣＮ°ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣＮ°ＣＲＬ１６５０；Ｎ°ＣＲＬ１６５１）、Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣＮ °ＣＲＬ１７１１）本発明の組換えタンパク質、ペプチドまたは多量体ペプチドの精製は、ニッケルまたは銅アフィニティークロマトグラフィーカラムを通すことにより実行してよい。ニッケルクロマトグラフィーカラムはＮｉ−ＮＴＡ樹脂を含有してよい(P orath et al.,1975)。本発明の遺伝子工学法により製造されたペプチドは、本発明の、癌抑制遺伝子候補のタンパク質産物に向けられるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を予め固定化したイムノアフィニティークロマトグラフィーカラムへの結合により同定すればよい。以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、その範囲は実施例に記載されている特定の具体例にいかなるようにも限定されるものではない。実施例１．材料および方法Ａ．患者およびＤＮＡの調製生まれが地理学的に異なる、外科手術を受けた経験のある患者から、１２０の一次ＨＣＣおよび隣接する非癌性肝臓組織を得た。凍結した組織を粉砕し、高分子量のゲノムＤＮＡを前記の方法で単離した(Nagai et al.,1994)。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の組み込みは、³²Ｐ−標識ＨＢＶＤＮＡプローブを用いるサザンブロッティングにより調べた。ＨＢｓＡｇの存在は、標準固相ラジオイムノアッセイ(Abbott Laboratories)を用いて分析した。血清抗−ＨＣＶＡｂは、酵素結合免イムノソルベントアッセイにより測定した。ＴＮＭ分類法を適用して各腫瘍の腫瘍段階を決定した(Hennanek and Sobin,1987)。Ｂ．マイクロサテライト反復増幅解析Ｇｅｎｅｔｈｏｎヒト遺伝子連鎖地図１９９３−１９９４(Gyapay et al.，19 94)のコレクション由来の「パネルＡマーカー」として設計された、１９５の選択されたプライマー対を用いるＰＣＲ法により、合計１２０のＨＣＣをＬＯＨについてアッセイした。増幅、ゲル分析および（ＣＡ）ｎオリゴプローブとのハイブリダイゼーションの各工程は、(Vignal et al.,1993)に記載された大スケールのプロトコールに従って行った。ＰＣＲは、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各プライマー、１．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ、１単位のＴａｑポリメラーゼ、および１倍のＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ９）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．０１％ゼラチン）を含有する最終反応容量５０ｍｌ中で行った。種々の試薬の分配は、ＨａｍｉｌｔｏｎＡＴおよびロボット装置(Hamilton，Switzerland)を用いて行った。９６℃にて５分の最初の変性工程直後にのみＴａｑポリメラーゼを加える「ホットスタート」法を用いた。増幅は変性（９４℃、４０秒間）およびアニーリング（５５℃、３０秒間）の３５回周期で行った。最終サイクルの最後に、完全に伸長させるために、サンプルを７２℃で２分間インキュベートした。同じ個体由来の６〜８個の異なるマーカー産物が共沈した。次いで各共沈物を５ｍｌのＴＥに溶解し、１０ｍｌの脱イオン化ホルムアミドおよびキシレンシアノールブルーと５０％スクロースを含有する２．５ｍｌの装填混合物と混合した。サンプルは、８．３Ｍ尿素中の６％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いで、キャピラリーブロッティングによりナイロン膜上に転移させた。それらの産物のサイズが重複しない２〜３の異なるプライマーを選択し、³²Ｐ末端標識し、ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。膜は、標準法を用いて、４２℃にて連続的に数回ハイブリダイズさせた。Ｃ．異型接合性の欠失の評価腫瘍ＤＮＡから増幅させた各対立遺伝子のシグナル強度を、その相当する正常対ＤＮＡと比較した。２人の校閲者(H.N.,P.P.)がオートラジオグラムを視覚的に評価した。Ａ１を表す代表的なオートラジオグラムの例を図１に例示する。Ａ１症例の大多数において、発明者らは、対立遺伝子欠失と一致する、正常ＤＮＡと比較して腫瘍ＤＮＡ中の１つの対立遺伝子の強度の顕著な低下を観察した（図１Ａ）。腫瘍ＤＮＡトラック上の１つのバンドの完全な欠失は、まれにしか観察されず、腫瘍サンプル中の正常、非実質細胞の存在を反映しているようである。腫瘍ＤＮＡ中のマイクロサテライト異常のさほど重要でない形態は、１つの対立遺伝子のシグナル強度の増加に伴う対立遺伝子不均衡であり（図１Ａ，Ｔ９７）、対立遺伝子の獲得により説明されるであろう(Kuroki et al.,1995;Yeh et al. ,1994)。腫瘍の量と、ＰＣＲ反応のための匹敵する正常ＤＮＡの量は、反復ＰＣＲ実験により調整されたが、発明者らはＨＣＣ中の所定の対立遺伝子の用量変化をしっかりと排除できなかったのは、対立遺伝子欠失のためではなくむしろ遺伝子増幅のためであった。このようにして発明者らは、対立遺伝子の増減を含む対立遺伝子不均衡を異型接合性の低下（ＬＯＨ）を象徴する値としてみなした。同型接合性は、「情報が得られない」ものとした（図１Ｂ）。Ｄ．統計学的分析臨床病理学的特性および観察されたＬＯＨ間の関係は、Ｘ²テストを用いて評価した。統計学的有意性のレベルは、ｐ＜０．０５とした。実施例１：ＨＣＣのアレロタイピング発明者らは、１２０のＨＣＣおよび隣接する非腫瘍性肝臓組織から単離したＤＮＡを、対立遺伝子不均衡について調べた。血清試験により、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）マーカーについて試験した１１６人の患者のうち８３人が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対して陽性であり、Ｃ型肝炎ウイルスマーカーについて分析した４２人の患者のうち、ＨＢｓＡｇに対してもまた陽性であった４人を含む１９人がＨＣＶＡｂ陽性であった。ＨＢＶＤＮＡ組み込みが、３３のＨＣＣサンプルにおいて認められた（ＨＢｓＡｇ陽性患者のうちの３１人、およびＨＢｓＡｇ陰性の患者のうち２人）。対立遺伝子不均衡は、高多型性ＣＡマイクロサテライトをフランクするプライマー対を用いるＰＣＲによりアッセイした。発明者らは、３９の非−ｉ型常染色体腕をマッピングし、距離の総計が平均マーカー距離２０ｃＭ（範囲、１５〜２０ｃＭ）に匹敵する１７１の間隔を含み、３４３２ｃＭにわたる、１９５の代表的マーカー（表１）パネルを選択した。マイクロサテライトマーカーの平均の同型接合性は２７％であり、文献中(Gyapay et al.,1994)のその値と類似している。平均して、分析した１２０例のうち７３例の腫瘍から情報が得られた。情報が得られた腫瘍／正常ペアにおける腫瘍ＤＮＡと正常ＤＮＡとの間の相対的な対立遺伝子強度比の相違を、異型接合性の欠失と評価した（材料および方法参照）。ＬＯＨが影響する多数の染色体座は、分析したほとんどの腫瘍において観察され、ＬＯＨを呈している遺伝子座数の１腫瘍あたりの平均数は１２．８であった（範囲、０〜３９）。ただひ１つの腫瘍のみが、試験した１９５のマーカーに対していずれの遺伝学的変化も示さず、この症例においてはかなりの量の非腫瘍性のＤＮＡが、腫瘍ＤＮＡにおける対立遺伝子の変化を検出する能力を不明瞭にしていることを示唆している。情報が得られる腫瘍におけるＬＯＨの割合は０〜４２％であり、平均は１２．１±８．４％であった（平均±ＳＤ）。ＬＯＨの有意な割合は、平均（背景）ＬＯＨの割合＋ＳＤ（２０％）以上の値となるように任意に選択した。３つのマーカー、Ｄ２Ｓ２９４、Ｄ１０Ｓ２４９およびＤ２Ｓ１７１は、それぞれ７０、７９および９５例の情報が得られるＨＣＣのいずれにおいてもＬＯＨを示さなかった。２６の明確な染色体領域に相当する総計３３個のマーカーは、腫瘍の２０％以上においてＬＯＨを検出した。その結果の要約は表２に示した。それらのうち、ＬＯＨの最も高い割合は、染色体アーム上の特定の遺伝子座２ｑ３６−ｑ３７（２９％）、４ｑ３５（４０％）、６ｑ２７（３６％）、７ｐ１５（３０％）、８ｐ２３（４２％）、１３ｑ１２−ｑ１３（３０〜３２％）、１６ｑ２３〜ｑ２４（２８％）および１７ｐ１３（３３％）において認められた。遺伝子座８ｐ２３のＤ８Ｓ２７７において、９７例の情報が得られるＨＣＣ中に頻度４２％で検出されたＬＯＨが、発明者らの実験の中で最も頻度の高い遺伝学的変化に相当した。発明者らの分析で影響を受けているのが見出された多くの染色体サブ領域が、染色体アーム１ｐ、４ｑ、６ｑ、８ｐ、１０ｑ、１３ｑ、１６ｐ、１６ｑ、１７ｐについてはすでに報告されている(Buetow et al.，1989;De Souza et al.，19 95;Emi et al.,1992;Fujimori et al.,1991;Tsuda et al.,1990;Wang and Rogle r,1988;Yeh et al.,1994)。これに加えて、発明者らは、以前の実験においては全く関与が認められなかった遺伝子座中、とりわけ１ｑ２２〜ｑ２３、１ｑ４２〜４３、２ｑ３６〜ｑ３７、７ｐ１５〜ｐ２２、７ｑ３３〜ｑ３４、８ｑ２３〜ｑ２４、９ｐ１２〜ｐ１４、９ｑ３４〜ｑｔｅｒ、１４ｑ３２および１７ｑ２４〜ｑｔｅｒにＬＯＨを検出した。発明者らはＬＯＨに関して２つの非連続的に有意な領域を１ｐ上（１ｐ２１〜ｐ２２およびｐ３６）、および３つの領域を４ｑ上（４ｑ１２〜ｑ２１、ｑ２２〜ｑ２４およびｑ３５）に明らかにすることができ、これは、染色体１および４上のいくつかの遺伝子が遺伝学的変化の標的である可能性を示している。８ｐおよび１３ｑ上では３つの隣接するマーカーの広領域にわたり、高頻度のＬＯＨが見出され（８ｐに対してはＤ８Ｓ２７７、Ｄ８Ｓ５５０およびＤ８Ｓ２８２、１３ｑに対してはＤ１３Ｓ１７１、１３Ｓ２８４、およびＤ１３Ｓ１７０）これは、これらの領域に１以上の腫瘍サプレッサー遺伝子が存在することを示唆している。実施例２：個々の被験者における遺伝学的変化染色体腕および臨床病理学的データマーカーは、各染色体上に等しい間隔で分布するため、染色体腕あたりのＬＯＨ頻度を分析した（表３）。染色体腕あたりのＬＯＨの平均の割合は２４．９± １２７％であった。分析した合計１２０例のＨＣＣ中１１９例が、それぞれの３９染色体アーム上の少なくとも１つの遺伝子座から情報が得られた。情報が得られたＨＣＣの症例では、対立遺伝子の変化は２５％（平均）以上の頻度で、１ｐ（５１％）、１ｑ（４４％）、２ｑ（３５％）、４ｑ（５２％）、６ｑ（４８％）、７ｐ（２８％）、７ｑ（２８％）、８ｐ（４０％）、８ｑ（２６％）、９ｐ（３３％）、９ｑ（４３％）、１０ｑ（２５％）、１３ｑ（５３％）、１４ｑ（３４％）、１６ｐ（３６％）、１６ｐ（３６％）、１６ｑ（３１％）、１７ｐ（３４％）および１７ｑ（３１％）上で起こっている。最も高頻度のマイクロサテライト異常（□３１％）を示す染色体腕のうち、８つ（１ｐ、４ｑ、６ｑ、８ｐ、１３ｑ１６ｐ、１６ｑおよび１７ｐ）が従前の実験と関係があり(Buetow et a l.,1989;Emi et al.,1992;Fujimori et al.,1991;Tsuda et al.,1990;Wang and Rogler,1988;Yeh et al.,1994)、６つ（１ｑ、２ｑ、９ｐ、９ｑ、１４ｑおよび１７ｑ）が、癌抑制遺伝子の探索のための新しい候補として現れた。次いで発明者らは、腫瘍の臨床病理学的特性とＬＯＨの間の、可能性のある相関の探索に興味を持った。それぞれの被験者の遺伝子座においてＬＯＨを示すサンプル数が制限されているため、また、利用可能な臨床病理学的パラメーターが統計学的に有意な値を与えることができないため、発明者らは各染色体腕のレベルの分析を行った。その結果は表３に要約されている。いずれの染色体腕変化も、肝炎ウイルス感染のための陽性血清マーカー（ＨＢｓＡｇまたはＨＣＶＡｂ）と統計学的に相関しなかった。ＬＯＨと腫瘍段階との間の関係は、初期腫瘍の数が少ないために統計学的に評価することはできなかったが、Ｔ１と分類された小さなＨＣＣにおいて、１ｐおよび１ｑ上のＬＯＨの頻度が高い傾向が認められた（それぞれ１０個の腫瘍中、４個および５個）。これに対し、この腫瘍段階において、２ｑ、６ｑ、７ｑ、８ｑ、１４ｑ、１６ｐｑおよび１７ｐｑ上にはほとんど変化は認められなかった（１０個の腫瘍中、０ないし１個）。１６ｐおよび１７ｐにおける対立遺伝子不均衡は、非侵襲性腫瘍に比べて、肝臓内への転移または門脈静脈に浸潤する侵襲性の腫瘍において、それぞれ比較的高頻度に出現した（３−４／１２ｖｓ１／１３腫瘍）。隣接する非腫瘍性肝臓対応物の病理学的情報は、６６例から得られ、そのうち３５例は慢性肝炎（ＣＨ）、残り（３１例）は肝硬変の病変を示した。特定の染色体腕上の遺伝学的変化と、非腫瘍性肝臓の病理学的病期との間に、統計学的に有意な相関は認められなかった。しかしながら、１ｐおよび１３ｑ、１ｐおよび８ｐならびに６ｑおよび１３ｑの双方の腕において付随して認められたＬＯＨ頻度は、ＬＣよりもＣＨから生じる腫瘍において有意に高かった（前記の組み合わせにおいて、ＬＯＨを示すＣＨｖｓＬＣにおけるＨＣＣの数は、それぞれ１６ｖｓ．５、１６ｖｓ．６、および１４ｖｓ．３であった）。結論ヒトの癌においてしばしば検出される遺伝学的変化には、染色体腕の領域の増幅が含まれる。これまでに、肝臓癌において８ｑ２４の広い領域(Fujiwara et a l.,1993)、および染色体１ｐの遠位部(Kuroki et al.,1995;Yeh et al.,1994)の増殖が報告されている。発明者らの最近のＨＣＣの比較ゲノムハイブリダイゼーション分析より、８ｑ２２−２４、１ｑ１１−２５において、またより狭い範囲では、染色体６ｐおよび１７ｑ(Marchio et al.,1997)染色体領域のコピー数の頻度が増していることがわかった。これらのデータより、本試験において記載された遺伝子座における対立遺伝子の不均衡は、領域的増幅も包含することを示唆する。明細書の教示から明らかなように、本発明は１つのまたはいくつかの前記の詳細な具体例の範囲に制限されるものではない；本発明はまた、本発明の主題または範囲から逸脱することなく、当業者により実施できるあらゆる変法もまた包含する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者マリー−アニック、ブュアンディアフランス国ル、ペルー、アンパス、エミーリ、３ビス (72)発明者パスカル、ピノーフランス国パリ、リュ、ド、ポマール、11 (72)発明者永井尚生神奈川県川崎市中原区小杉町１―396 (72)発明者ピエール、ティオレフランス国パリ、リュ、ド、ラ、グランシエール、16

Claims

【特許請求の範囲】１．患者における肝細胞癌の予兆診断用組成物であって、以下の染色体領域 : ａ）１ｐ；ｂ）１ｑ；ｃ）２ｑ；ｄ）４ｑ；ｅ）６ｐ；ｆ）７ｐ；ｇ）７ｑ；ｈ）８ｐ；ｉ）８ｑ；ｊ）９ｐ；ｋ）９ｑ；ｌ）１０ｑ；ｍ）１３ｑ；ｎ）１４ｑ；ｏ）１６ｐ；ｐ）１６ｑ；ｑ）１７ｐ；ｒ）１７ｑに位置するＤＮＡマーカーを含有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなり、そのＤＮＡマーカーが、注目されるこれらの特異的染色体座にわたっている公的に入手可能なマーカー、すなわち１）マイクロサテライトＤＮＡマーカー；２）ＲＦＬＰマーカー；３）ＶＮＴＲマーカー（種々の数のタンデム反復）；４）ＳＴＳマーカー（単純タグ配列）；５）ＥＳＴ（発現配列タグ）のいずれかである組成物。２．好ましくは以下の染色体領域：ａ）８ｐ２３；ｂ）８ｐ１２２；ｃ）８ｐ２１；ｄ）１ｐ３５〜ｐ３６；ｅ）１６ｑ２３〜ｑ２４；ｆ）１４ｑ３２およびｇ）４ｑ３５〜ｑ３６に位置するＤＮＡマーカーを含有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなり、そのＤＮＡマーカーが、注目されるこれらの特異的染色体座にわたっている公的に入手可能なマーカー、すなわち１）マイクロサテライトＤＮＡマーカー；２）ＲＦＬＰマーカー；３）ＶＮＴＲマーカー（種々の数のタンデム反復）；４）ＳＴＳマーカー（単純タグ配列）；５）ＥＳＴ（発現配列タグ）のいずれかである、請求項１記載の組成物。３．以下のマイクロサテライトＤＮＡマーカー：ａ）１ｐ：Ｄ１Ｓ２４３、Ｄ１Ｓ２１４、Ｄ１Ｓ２２８、Ｄ１Ｓ１９９、Ｄ１Ｓ２５５、Ｄ１Ｓ４７６、Ｄ１Ｓ１９８、Ｄ１Ｓ２０７、Ｄ１Ｓ２４８、Ｄ１Ｓ４３６、Ｄ１Ｓ２６４４、Ｄ１Ｓ２８４３、Ｄ１Ｓ４７８、Ｄ１Ｓ２８２８、Ｄ１Ｓ２９０２、Ｄ１Ｓ２４７およびＤ１Ｓ２５５；ｂ）１ｑ：Ｄ１Ｓ３０５、Ｄ１Ｓ１９６、Ｄ１Ｓ２３８、Ｄ１Ｓ２４９、Ｄ１Ｓ２２９、Ｄ１Ｓ２３５およびＤ１Ｓ３０４；ｃ）２ｑ：Ｄ２Ｓ１１３、Ｄ２Ｓ３４７、Ｄ２Ｓ１５１、Ｄ２Ｓ２９４、Ｄ２Ｓ３１１、Ｄ２Ｓ１４３、Ｄ２Ｓ１５９、Ｄ２Ｓ３３６およびＤ２Ｓ１２５；ｄ）４ｑ：Ｄ４Ｓ３９２、Ｄ４Ｓ１５３８、Ｄ４Ｓ１５７８、Ｄ４Ｓ４０６、Ｄ４Ｓ４３０、Ｄ４Ｓ４２２、Ｄ４Ｓ１５４８、Ｄ４Ｓ１５９７、Ｄ４Ｓ４０８、Ｄ４Ｓ４２６、Ｄ４Ｓ３０４２、Ｄ４Ｓ２９２２、Ｄ４Ｓ４００、Ｄ４Ｓ３９５、Ｄ４Ｓ１５３４、Ｄ４Ｓ２９２９、Ｄ４Ｓ２４６０、Ｄ４Ｓ１５７２、Ｄ４Ｓ１５６４、Ｄ４Ｓ２９４５、Ｄ４Ｓ１６１６、Ｄ４Ｓ２９３７、Ｄ４Ｓ１６１３およびＤ４Ｓ４２７；ｅ）６ｐ：Ｄ６Ｓ３４４、Ｄ６Ｓ３０５、Ｄ６Ｓ２６０、Ｄ６Ｓ２７６、Ｄ６Ｓ４２６およびＤ６Ｓ２９４；ｆ）７ｐ：Ｄ７Ｓ５３１、Ｄ７Ｓ６６４、Ｄ７Ｓ４９３、Ｄ７Ｓ４８４、およびＤ７Ｓ５１９；ｇ）７ｑ：Ｄ７Ｓ６６９、Ｄ７Ｓ６５７、Ｄ７Ｓ４８６、Ｄ７Ｓ４９５、Ｄ７Ｓ４８３およびＤ７Ｓ５５０；ｈ）８ｐ：Ｄ８Ｓ２７７、Ｄ８Ｓ５５０、Ｄ８Ｓ２８２、Ｄ８Ｓ２８３およびＤ８Ｓ２６０、Ｄ８Ｓ２６４、Ｄ８Ｓ２６２、Ｄ８Ｓ１１４０、Ｄ８Ｓ５１８、Ｄ８Ｓ１０９９、Ｄ８Ｓ１７４２、Ｄ８Ｓ５６１、Ｄ８Ｓ１８１９、Ｄ８Ｓ１４６９、Ｄ８Ｓ１７２１、Ｄ８Ｓ５５２、Ｄ８Ｓ１７３１、Ｄ８Ｓ２６１、Ｄ８Ｓ１７５２、Ｄ８Ｓ１７７１、Ｄ８Ｓ１８２０、Ｄ８Ｓ５３２及びＤ８Ｓ２８５；ｉ）８ｑ：Ｄ８Ｓ２７３、Ｄ８Ｓ２８１、Ｄ８Ｓ２６３およびＤ８Ｓ２７２；ｊ）９ｐ：Ｄ９Ｓ２８８、Ｄ９Ｓ１５６、Ｄ９Ｓ１６１およびＤ９Ｓ２７３；ｋ）９ｑ：Ｄ９Ｓ１５３、Ｄ９Ｓ２７７、Ｄ９Ｓ１９５、Ｄ９Ｓ１６４およびＤ９Ｓ１５８；ｌ）１０ｑ：Ｄ１０Ｓ５８９、Ｄ１０Ｓ１８５、Ｄ１０Ｓ５９７、Ｄ１０Ｓ５８７およびＤ１０Ｓ２１２；ｍ）１３ｑ：Ｄ１３Ｓ１７５、Ｄ１３Ｓ１７１、Ｄ１３Ｓ２８４、Ｄ１３Ｓ１７０、Ｄ１３Ｓ１５８、Ｄ１３Ｓ２８５およびＤ１３Ｓ２８６；ｎ）１４ｑ：Ｄ１４Ｓ２６１、Ｄ１４Ｓ７５、Ｄ１４Ｓ６３、Ｄ１４Ｓ７４、Ｄ１４Ｓ２９２、Ｄ１４Ｓ８１、Ｄ１４Ｓ２８０、Ｄ１４Ｓ９９５、Ｄ１４Ｓ９７７、Ｄ１４Ｓ１０６２およびＤ１４Ｓ２６５；ｏ）１６ｐ：Ｄ１６Ｓ５２１、Ｄ１６Ｓ４０７、Ｄ１６Ｓ４２０およびＤ１６Ｓ４１１；ｐ）１６ｑ：Ｄ１６Ｓ４０８、Ｄ１６Ｓ５１８、Ｄ１６Ｓ４２２およびＤ１６Ｓ５２０、Ｄ１６Ｓ５０７、Ｄ１６Ｓ３０９８、Ｄ１６Ｓ５０５、Ｄ１６Ｓ５１１、Ｄ１６Ｓ４２２およびＤ１６Ｓ４０２；ｑ）１７ｐ：Ｄ１７Ｓ９２６、Ｄ１７Ｓ７８６およびＤ１７Ｓ９５３；ｒ）１７ｑ：Ｄ１７Ｓ９３３、Ｄ１７Ｓ７８７、Ｄ１７Ｓ９４９、Ｄ１７Ｓ７８４およびＤ１７Ｓ９２８の中から選択される少なくとも１つのマイクロサテライトＤＮＡマーカーのプライマー対からなる２つの核酸分子のうち少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１または２記載の診断用組成物。４．群ａ）〜ｒ）のマイクロサテライトＤＮＡマーカーのプライマー対からなる核酸分子の中から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチド（ただし、このポリヌクレオチドはこのＤＮＡマーカーを定義する同じプライマー対に属さない）を含んでなる、請求項３記載の診断用組成物。５．ポリヌクレオチド分子が、以下のマイクロサテライトＤＮＡマーカー：Ｄ４Ｓ４２６、Ｄ６Ｓ３０５、Ｄ７Ｓ４９３、Ｄ８Ｓ２７７、Ｄ１３Ｓ２８４およびＤ１７Ｓ７８６の中から選択される、請求項３または４記載の診断用組成物。６．ポリヌクレオチド分子が、以下のマイクロサテライトＤＮＡマーカー：Ｄ１Ｓ２３８、Ｄ１Ｓ２３５、Ｄ２Ｓ３３６、Ｄ２Ｓ１２５、Ｄ７Ｓ４９５、Ｄ８Ｓ２６３、Ｄ９Ｓ２７３、Ｄ９Ｓ１６４、Ｄ１４Ｓ８１およびＤ１７Ｓ９２８の中から選択される、請求項３または４記載の診断用組成物。７．ポリヌクレオチド分子が、以下のマイクロサテライトＤＮＡマーカー：Ｄ８Ｓ１７４２、Ｄ８Ｓ１４６９、Ｄ８Ｓ１７３１、Ｄ８Ｓ１７５２、Ｄ１Ｓ２６４４、Ｄ１Ｓ１９９、Ｄ１Ｓ４７８、Ｄ１Ｓ２８２８、Ｄ１Ｓ２４７、Ｄ１Ｓ２５５、Ｄ１４Ｓ２８０、Ｄ１４Ｓ９９５、Ｄ１４Ｓ８１、Ｄ１４Ｓ２６５、Ｄ１４Ｓ２９２、Ｄ１６Ｓ３０９８、Ｄ１６Ｓ５０５、Ｄ１６Ｓ５１１、Ｄ１６Ｓ４２２およびＤ１６Ｓ４０２の中から選択される、請求項３または４記載の診断用組成物。８．ポリヌクレオチド分子が、以下のマイクロサテライトＤＮＡマーカー：Ｄ８Ｓ２６４、Ｄ８Ｓ２６２、Ｄ８Ｓ５１８、Ｄ８Ｓ１７４２、Ｄ８Ｓ２７７Ｄ８Ｓ１８１９、Ｄ８Ｓ１７２１、Ｄ８Ｓ１７３１およびＤ８Ｓ１７５２の中から選択される、請求項３または４記載の診断用組成物。９．ポリヌクレオチド分子が、以下のマイクロサテライトＤＮＡマーカー：Ｄ１Ｓ４３６、Ｄ１Ｓ２６４４、Ｄ１Ｓ１９９、Ｄ１Ｓ４７８、Ｄ１Ｓ２８２８、Ｄ１Ｓ２４７およびＤ１Ｓ２５５の中から選択される、請求項３または４記載の診断用組成物。１０．ポリヌクレオチド分子が、以下のマイクロサテライトＤＮＡマーカー : Ｄ１６Ｓ３０９８、Ｄ１６Ｓ５０５、Ｄ１６Ｓ５１１、Ｄ１６Ｓ４２２およびＤ１６Ｓ４０２の中から選択される、請求項３または４記載の診断用組成物。１１．ポリヌクレオチド分子が、以下のマイクロサテライトＤＮＡマーカー : Ｄ１４Ｓ２８０、Ｄ１４Ｓ８１、Ｄ１４Ｓ９５５、Ｄ１４Ｓ２９２およびＤ１４Ｓ２６５の中から選択される、請求項３または４記載の診断用組成物。１２．ポリヌクレオチド分子が、以下のマイクロサテライトＤＮＡマーカー : Ｄ４Ｓ４００、Ｄ４Ｓ１５７２、Ｄ４Ｓ１５６４、Ｄ４Ｓ２９４５、Ｄ４Ｓ１６１６およびＤ４Ｓ２９３７の中から選択される、請求項３または４記載の診断用組成物。１３．ＤＮＡマーカーの中から選択されるポリヌクレオチド分子が、以下の組み合わせ：ａ）Ｄ１Ｓ２４３、Ｄ１Ｓ２１４、Ｄ１Ｓ２２８、Ｄ１Ｓ１９９、Ｄ１Ｓ２５５、Ｄ１Ｓ４７６、Ｄ１Ｓ１９８、Ｄ１Ｓ２０７およびＤ１Ｓ２４８の中から選択される１ｐのマーカーと、Ｄ１３Ｓ１７５、Ｄ１３Ｓ１７１、Ｄ１３Ｓ２８４、Ｄ１３Ｓ１７０、Ｄ１３Ｓ１５８、Ｄ１３Ｓ２８５およびＤ１３Ｓ２８６の中から選択される１３ｑのマーカー；ｂ）Ｄ１Ｓ２４３、Ｄ１Ｓ２１４、Ｄ１Ｓ２２８、Ｄ１Ｓ１９９、Ｄ１Ｓ２１５５、Ｄ１Ｓ４７６、Ｄ１Ｓ１９８、Ｄ１Ｓ２０７およびＤ１Ｓ２４８の中から選択される１ｐのマーカーと、Ｄ８Ｓ２６４、Ｄ８Ｓ２６２、Ｄ８Ｓ５１８、ＤＤ８Ｓ１７４２、Ｄ８Ｓ２７７、Ｄ８Ｓ１８１９、Ｄ８Ｓ１７２１、Ｄ８Ｓ１７３１およびＤ８Ｓ１７５２の中から選択される８ｐのマーカー；ｃ）Ｄ６Ｓ４６２、Ｄ６Ｓ２６１、Ｄ６Ｓ２９２、Ｄ６Ｓ２９０、Ｄ６Ｓ３０５、Ｄ６Ｓ４４６およびＤ６Ｓ２８１の中から選択される６ｑのマーカーと、Ｄ１３Ｓ１７５、Ｄ１３Ｓ１７１、Ｄ１３Ｓ２８４、Ｄ１３Ｓ１７０、Ｄ１３Ｓ１５８、Ｄ１３Ｓ２８５およびＤ１３Ｓ２８６の中から選択される１３ｑのマーカーで使用される、請求項３または４記載の診断用組成物。１４．ＤＮＡマーカーの中から選択されるポリヌクレオチド分子が、以下の組み合わせ：ａ）Ｄ１６Ｓ５２１、Ｄ１６Ｓ４０７、Ｄ１６Ｓ４２０およびＤ１６Ｓ４１１の中から選択される１６ｐのマイクロサテライトマーカー；ｂ）Ｄ１７Ｓ９２６、Ｄ１７Ｓ７８６およびＤ１７Ｓ９５３の中から選択される１７ｑのマイクロサテライトマーカーで使用される、請求項３または４記載の診断用組成物。１５．患者におけるＨＣＣの予後の診断方法であって、以下の工程：ａ）第１の組織サンプルが患者の肝臓とは異なる器官に由来し、第２の組織サンプルが患者由来の２種の組織サンプルが肝臓に由来する、２種のサンプルを患者から調製し、ｂ）所望により、ハイブリダイゼーションに利用可能な、工程ａ）の組織サンプルの細胞に含まれるゲノムＤＮＡを作製し；ｃ）請求項３の群ａ）〜ｒ）のマーカーの中から選択される少なくとも１つのマイクロサテライトＤＮＡマーカー、またはそのＤＮＡマーカーの組み合わせを含有する組成物を用いて工程ｂ）のゲノムＤＮＡを増幅させ；ｄ）得られた工程ｃ）の、第１および第２の組織サンプルにそれぞれ由来する増幅産物を比較することにより現れた変化を検出することを含んでなる方法。１６．工程ｄ）において、オリゴヌクレオチドプローブ（検出手段）として、工程ｃ）の増幅手段からなるプライマーを少なくとも１つ使用し、このプローブが選択的に放射性または非放射性標識されている、請求項１４記載の診断方法。１７．患者におけるＨＣＣの発生に関与する癌抑制遺伝子のポリヌクレオチドを単離および／または精製する方法であって、ａ）選択されたＹＡＣクローンからコスミドライブラリーを構築し；ｂ）プローブである標識したヒトゲノムＤＮＡとのコロニーハイブリダイゼーションによって注目されるコスミドクローンを選択し；ｃ）精製、選択されたコスミドクローンのコンティグマップを作製し；ｄ）エキソン増幅反応を実施し、好適なベクターに逆転写ＲＮＡ断片を挿入し ; ｅ）工程ｄ）の挿入配列を好適なヒトｃＤＮＡライブラリー、好ましくは胎児または成人肝臓ｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズ可能なｃＤＮＡクローンを選択し；ｆ）選択されたｃＤＮＡクローン挿入配列の配列を決定し、コーディング配列を同定する工程を含んでなる方法。１８．請求項１７の方法によって得られる、患者におけるＨＣＣの発生に関与する癌抑制遺伝子のポリヌクレオチド。１９．制限酵素切断または化学合成によって得られる、請求項１８記載のポリヌクレオチド断片。２０．オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーである、請求項１８または１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド断片。２１．請求項２０記載の１対のポリヌクレオチドを用いて増幅されたポリヌクレオチド。２２．ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含有する生物学的サンプルにおいて、ＨＣＣに関連する遺伝子異常を検出する方法であって、ａ）生物学的サンプルを、請求項２０記載の１対のオリゴヌクレオチド断片と接触させ（ここで、サンプル中に含まれるＤＮＡは所望により、ハイブリダイゼーションに利用できるよう作製されており、かつ、これらオリゴヌクレオチド断片と生物学的サンプル中に含まれるＤＮＡとのハイブリダイゼーションが可能な条件下である）；ｂ）ＤＮＡを増幅させ；ｃ）増幅産物を明らかにし；ｄ）所望により適当な方法で突然変異または欠失を検出する工程を含んでなる方法。２３．工程ｄ）が以下：一本鎖多形現象、バンドシフトアッセイ、制限部位解析、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセイ、対立遺伝子特異的プライミング、ヘテロ二重らせん解析、変性ゲル電気泳動、化学切断法、蛍光活性化誤対合解析の中から選択される検出方法である、請求項２２記載の方法。２４．ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含有する生物学的サンプルにおいて、ＨＣＣに関連する遺伝子異常を検出する方法であって、ａ）生物学的サンプルを、請求項２０記載のオリゴヌクレオチドプローブと接触させ（ここで、サンプル中に含まれるＤＮＡは所望により、ハイブリダイゼーションに利用できるよう作製されており、かつこれらプライマーと生物学的サンプル中に含まれるＤＮＡとのハイブリダイゼーションが可能な条件下である）；ｂ）オリゴヌクレオチドプローブと生物学的サンプル中に含まれるＤＮＡとの間で形成されたハイブリッドを検出する工程を含んでなる方法。２５．ＤＮＡを含有する生物学的サンプルにおいて、ＨＣＣに関連する遺伝子異常を検出する方法であって、ａ）支持体に固定化された請求項２０記載の第１のオリゴヌクレオチドプローブを、サンプル中に含まれる、所望によりハイブリダイゼーションに利用できるよう作製されたＤＮＡと、これらプライマーと生物学的サンプル中に含まれるＤＮＡとのハイブリダイゼーションが可能な条件下で接触させ；ｂ）所望により固定化された第１のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしなかった生物学的サンプルに含まれるＤＮＡを除去した後に、固定化された第１のオリゴヌクレオチドプローブと生物学的サンプル中に含まれるＤＮＡとの間で形成されたハイブリッドを、請求項２０記載の第２のオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、この第２のプローブが、固定化された第１のプローブがハイブリダイズする配列とは異なる配列とハイブリダイズする工程を含んでなる方法。２６．試験すべき二本鎖ＤＮＡ調製物に含まれるヌクレオチド配列における塩基置換または塩基欠失の存在および位置を検出することにより、ＤＮＡを含有する生物学的サンプルにおいてＨＣＣに関連する遺伝子異常を検出する方法であって、ａ）一方の腕に試験すべきＤＮＡのヌクレオチド配列を、他方の腕に既知配列のＤＮＡのヌクレオチド配列を含む領域を特異的に増幅させ（ここで、既知配列のＤＮＡは本発明のポリヌクレオチドである）、ｂ）これらのＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖を異なる蛍光またはその他の非同位元素標識で標識し；ｃ）増幅させたＤＮＡをハイブリダイズさせ；ｄ）既知配列のＤＮＡと試験すべきＤＮＡとの間で形成されたヘテロ二重らせんを、ＤＮＡ鎖の誤対合部分の切断によって明らかにする工程を含んでなる方法。２７．生物学的サンプルにおいて、ＨＣＣに関連する遺伝子異常を検出する診断キットであって、以下の構成要素：ａ）請求項２０記載の１対のオリゴヌクレオチド；ｂ）ＤＮＡ増幅を行うために必要な試薬；ｃ）増幅した断片の長さを決定するか、または突然変異を検出することを可能にする成分を含んでなるキット。２８．請求項１８記載の癌抑制遺伝子候補によりコードされるポリペプチドを産生する方法であって、ａ）所望により、本発明に記載の１対のプライマーを用いて、所望のポリペプチドをコードする核酸を増幅させ（ＳＤＡ、ＴＡＳ、３ＳＲＮＡＳＢＡ、ＴＭＡなどによる）；ｂ）注目される核酸を適当なベクターに挿入し；ｃ）工程ｂ）のベクターで予め形質転換またはトランスフェクトした細胞宿主を適当な培地で培養し；ｄ）このようにしてコンディショニングした培地を回収するするか、または例えば超音波処理もしくは浸透圧ショックにより細胞宿主を溶解させ；ｅ）この培地から、または得られた宿主細胞溶解物のペレットから、かくして産生された注目されるポリペプチドを分離または精製し；ｆ）産生された注目されるポリペプチドを同定する工程を含んでなる方法。