KR0158430B1

KR0158430B1 - p53 단백질을 이용한 B형 간염 바이러스의 복제 억제방법

Info

Publication number: KR0158430B1
Application number: KR1019940025752A
Authority: KR
Inventors: 이현숙; 윤영대; 문홍모
Original assignee: 허영섭; 재단법인목암생명공학연구소
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1994-10-07
Publication date: 1998-12-01
Also published as: KR960013386A; WO1996011017A1; US5635473A; AU7822994A

Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스의 프리게놈/코어 프로모터의 활성을 억제하므로써 B형 간염 바이러스의 복제를 억제하는 p53 단백질의 B형 간염 바이러스의 복제 억제인자로서의 신규한 용도에 관한 것이다. 야생형 p53은 프리게놈/코어 프로모터의 활성을 억제하며, 이로 인하여 HBV의 복제도 억제된다. 본 발명에서 p53에 의한 HBV 복제 억제는 세포배양액으로 분지되는 표면항원(HBsAg) 및 코어 단백질(HBc/eAg)의 양; 서던블럿(Southerm blot) 분석으로 결정된 HBV의 DNA 양; 노던 블럿(Northern blot) 분석으로 결정된 HBV의 RNA 양으로 확인하였다. 본 발명의 p53 단백질 또는 그의 기능적 등가물은 HBV에 의해 야기되는 급성·만성 간염, 간경화 및 간암 등의 예방에 이용될 수 있을 것이다.

Description

p53 단백질을 이용한 B형 간염 바이러스의 복제 억제방법

제1(a)도는 본 발명에 이용된 리포터 플라스미드의 유전자 지도를 나타낸다.

제1(b)도는 리포터 플라스미드 CpCAT 및 p53 유전자를 발현하는 플라스미드로 형질전환된 Hep G2 세포를 배양하여 CAT 활성을 측정한 결과를 나타내는 사진이다.

제1(c)도는, 리포터 플라스미드 CpCAT 및 p53 유전자를 발현하는 플라스미드로 형질전환된 Hep G2 세포를 배양하여 CAT 활성을 측정한 결과를 나타내는 사진이다.

제1(d)도는, 리포터 플라스미드 CEP-CAT 및 p53 유전자를 발현하는 플라스미드로 형질전환된 Hep G2 세포를 배양하여 CAT 활성을 측정한 결과를 나타내는 사진이다.

제2도는, 리포터 플라스미드 CpCAT 및 p53 유전자를 발현하는 플라스미드로 형질전환된 Hep 3B 세포를 배양하여 CAT 활성을 측정한 결과를 나타내는 사진이다.

제3(a)도는, 발현된 야생형 p53에 의해 B형 간염 바이러스의 표면항원 HBsAg의 생성이 억제됨을 나타내는 그래프이다.

제3(b)도은, 발현된 야생형 p53에 의해 B형 간염 바이러스의 코어 단백질 HBc/eAg의 생성이 억제됨을 나타내는 그래프이다.

제4(a)도는, adw R9 플라스미드 및 pcDNA-p53 플라스미드로 형질전환된 Hep G2 세포의 세포 용혈물에 포함된 DNA를 서던블럿(Southern blot) 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

제4(b)도는, adw R9 플라스미드 및 pcDNA-p53 플라스미드로 형질전환된 Hep G2 세포의 세포 용혈물에 포함된 DNA를 서던블럿(Southern blot) 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

제5(a)도는, adw R9 플라스미드 또는 adw R9 플라스미드 및 pcDNA-p53 플라스미드로 형질전환된 Hep G2 세포 각각으로부터 분리한 총 세포 RNA를 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

제5(b)도는, adw R9 플라스미드 또는 adw R9 플라스미드 및 pcDNA-p53 플라스미드로 형질전환된 Hep G2 세포의 세포 각각의 세포 용혈물을 노던 블럿(Northern blot) 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

제6(a)도는, adw R9 플라스미드 및 리포터 플라스미드 pER-βGAL로 형질전환된 Hep G2 세포를 나타내는 사진이다.

제6(b)도는, adw R9 플라스미드, pcDNA-p53 플라스미드 및 리포터 플라스미드 pER-βGAL로 형질전환된 Hep G2 세포를 나타내는 사진이다.

제7(a)도는, adw R9 플라스미드 및 리포터 플라스미드 pER-βGAL로 형질전환된 Hep G2 세포를 나타내는 사진이다.

제7(b)도는, adw R9 플라스미드, pcDNA-p53 플라스미드 및 리포터 플라스미드 RSV-βGAL로 형질전환된 Hep G2 세포를 나타내는 사진이다.

본 발명은 신규한 B형 간염 바이러스의 복제 억제인자에 관한 것이다.

좀 더 구체적으로, 본 발명은 B형 간염 바이러스의 프리게놈/코어 프로모터의 활성을 억제하는 p53 단백질 및 그를 이용한 B형 간염 바이러스 질환의 억제에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(hepatitis B virus: 이하, 'HBV'라 함)는 급성 및 만성 간염의 직접적인 원인이 되며, 간암의 발생에도 밀접한 관련을 가져, HBV에 감염된 환자의 5 내지 10% 정도는 만성간염 환자로 진전되고, 상당수는 간경화를 통하여 간암 환자로까지 진전되는 것으로 알려져 있다.

HBV 게놈은 부분적 이중나선으로 이루어진 3.2kb의 환형(circular) DNA로 구성되어 있으며, 코어(core), 중합효소(polymerase), 표면항원(curface antigen), X-유전자 산물(X-gene product)이 전기 게놈으로부터 다음의 4가지 프로모터를 이용하여 합성된다(참조: Ganem, D. and Varmus, H.E., Annu. Rev. Biochem., 56:651-693(1987)): (1) 프리게놈/토어 프로모터(progenomic/core promoter)는 HBV의 모든 유전정보를 갖고 있는 3.6kb mRNA의 합성에 관여한다. 이 RNA는 복제의 중간체이며, 코어와 중합효소의 합성을 위한 주형으로 작용하며(참조: Seeger, C. et al., Science, 231:477-484(1986); Yuh, C. H. et., J. Virol., 66:4073-4084(1992);(2) S 프로모터 및 pre S 프로모터는 2.1kb 및 2.4kb RNA의 합성에 각각 관여하며, 이 RNAs로부터 pre-S1, pre-S2 및 S 단백질이 합성되고; (3) X 프로모터는 0.9kb RNA의 합성에 관여하며, 이로부터 X유전자 산물이 합성된다. 또한, 전기의 4가지 프로모터들의 기능이 2개의 인헨서(enhancer), 즉 인헨서 I(ENI) 및 인헨서 II(ENII)에 의해 조절되므로써, 간 특이적(liver specific) 혹은 분화상태 특이적(differentiation state specific)으로 되는데, 이들 인헨서들은 HNF-1(hepatocyte nuclear factor-1) 결합인자(binding element)와 함께 간세포(hepatocyte)에서의 병변을 야기시키는 주요한 원인이 되기도 한다(참조: Antonucci, T.K. and Rutter, W.J., J. Virol., 63:579-583(1989)).

한편, HBV는 레트로바이러스(retrovirus)와 마찬가지로 HBV 복제시 역전사 효소의 작용이 수반된다는 점에서, 다른 DNA 바이러스와는 복제과정이 상이한 것으로 알려져 있다. HBV가 간세포를 감염하면 가장 먼저 부분적 이중나선partially-double stranded)의 HBV 게놈은 완전한 이중나선(com plete double-stranded)의 DNA로 전환되고, 이를 주형으로하여 프리게놈(pregenome)이라 불리는 3.6kb의 RNA가 합성된다. 이 프리게놈은 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)에 함입된 다음, 역전사효소에 의해 단일사슬의 DNA로 역전사된다(참조: Wang, G.H. and Seeger, C., Cell, 71:663-670(1992); Wang, C.H. and Seeger, C., J. Virol., 67:6507-6512(1993)). 전기 단일 사슬 DNA로의 역전사가 수행된 다음, 중합효소에 의해 두 번째 DNA사슬이 합성되므로, HBV의 게놈인 부분적 이중나선의 환형 DNA가 생성된다(참조: Tiollais, P. et al., Nature, 317:489-495(1985); Ganem, D. and Varmus, H.E., Annu. Rev. Biochem., 56:651-693(1987)).

HBV 만성간염 환자의 상당수가 간암환자로 진전된다는 보고에도 불구하고(참조: Beasley, R.P. et al., Lancet ii, 1129-1133(1981)), HBV가 간암을 야기시키는 정확한 메카니즘은 밝혀지지 않고 있다. 간암환자에게서 숙주세포의 염색체에 삽입(integration)된 HBV의 DNA가 발견되고 있지만, 이는 임의부위(random site)에 삽입되므로, HBV의 DNA 삽입으로 인하여 야기된 유전자 발현의 이상 때문에 간암이 야기되는 것은 아니라고 보고하고 있다(참조: Chen, D.D., Nature, 262:369-370(1993)).

한편, p53 단백질은 포유동물의 세포에 존재하는 53kDa의 종양억제 인자(tumor suppressor)로서, SV40의 대형종양 항원(large tumor antigen)과 공침전(coprecipitation)된 형태로 최초 분리되었다(참조: Lane, D. P. and Crawford, L.V., Nature, 278:261-263(1979); Linzer, D.I.H. and Levine, A.J., Cell, 7:43-52(1979)). 이후, p53의 cDNA 클로닝등 분자 생물학적 연구를 통하여, p53의 세포내에서의 기능 및 생화학적 특성이 규명되기 시작하였다. 또한, p53 유전자는 종양이 야기된 사람의 여러 조직에서 돌연변이 발생율이 가장 높은 유전자로 밝혀졌다(참조: Hollstein, M. et al., Science, 253:49-53(1991)). 분자수준에서의 p53이 종양을 억제하는 기작은 확실하게 밝혀져 있지 않으나, 최근의 보고에 의하면 p53이 유전자의 전사를 조절하여 종양억제의 기능을 하는 것으로 알려져 있다.

p53은 DNA 결합부위 및 전사의 활성에 관여하는 부위를 가지고 이량체(dimer)라는 점에서, 일반적인 전사인자(transcriptiona1 activator) 및 전사 억제인자(transcriptiona1 repressor)로서의 역할 모두를 하는 것으로 알려져 있다. 전사 활성자로서의 기능을 수행할 경우, p53은 염기서열 특이적(sequence-specific)으로 인헨서에 결합하고 전사에 관여하는 여러 단백질과 상호작용하므로써 전사를 촉진시키는데 반하여, 전사 억제인자로서의 기능을 수행할 경우, p53은 TATA-박스 결합 단백질(참조: Seto, E. et al., Proc. Nat1. Acad. Sci., USA, 89:12028-12032(1992); Truant, R. et al., J. Biol. Chem., 268:2284-2287(1993); Ragimov, N. et al., Oncogene, 8:1183-1193(1993); Martin, D.W. et al., J. Bio1. Chem., 268:13062-13067(1993)) 또는 CCAAT-박스 결합인자(참조: Agoff, S.N. et al., Science, 259:84-87(1993))와 복합체를 형성하여 이들 인자들의 매개에 의한 전사를 억제한다.

p53은 SV40의 대형종양 항원(참조: Lane, D.P. and Crawford, L.V., Nature, 278-261-263(1979); Linzer, D.I.H. and Levine, A.J., Cell, 7:43-52(1979)), 아데노바이러스(adenovirus)의 E1B(참조: Sarnow, P. et al., Cell, 28:387-394(1982)), 파필로마 바이러스(papilloma virus)의 E6(참조: Werness, B.A. et al., Science, 248:76-79(1990)), 엡스타인 바 바이러스(Ebstein barr virus)의 EBNA5(참조: Szekely, L. et al., Proc. Nat1. Acad. Sci., USA, 90:5455-5459(1993)), HBV의 X 유전자 산물(참조: Feitelson, M.A. dt al., Oncogene, 8:1109-1117(1993))에결합하며, 전기 바이러스 단백질들에 의한 p53의 기능 소실이 각 바이러스에 의한 종양발생의 원인이 되는 것으로 추정되고 있다.

한편, SV40 DNA 복제에 있어서, p53은 복제 기원(replication origin)에 결합하거나 T항원과 복합체를 형성하므로써, 복제에 관여하는 T항원의 역할를 방해하는 것으로 보고되고 있다(참조: Bargonetti, J. et al., Cell, 65:1083-1091(1991); Friedman, P.N., et al., Proc. Nat1. Acad. Sci., USA, 87:9275-9279(1990)). 즉, p53에 의한 SV40 복제의 억제에서 볼 수 있듯이, p53은 바이러스 감염에 대한 방어 역할을 할 수 있을 것으로 예측되고 있다.

이에, 본 발명의 발명자들은 p53 단백질이 HBV로부터 야기되는 병변의 예방 및 치료에 유효할 것이라는 가정아래, p53에 의한 코어 프로모터 활성 조절에 대한 연구를 거듭한 결과, p53이 HBV 게놈으로부터 3.6kb 프로게놈 RNA로의 전사를 억제하므로써 HBV 복제를 억제한다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 첫번째 목적은 p53 단백질의 B형 간염 바이러스의 복제 억제인자로서의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 목적은 전기 p53 단백질의 B형 간염 바이러스 질환의 억제에 이용하는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.

본 발명에 이용된 p53 단백질의 발현 플라스미드로는 야생형의 p53을 발현하는 pcDNA-p53과 부위특이적 돌연변이에 의해 유도된 p53을 발현하는 플라스미드 G154V 및 R273L을 이용하였다. 한편, HBV의 유전자를 포함하고 있는 리포터 플라스미드로는 HBV 게놈 전부를 포함하고 있는 CpCAT 및 HBV의 DNA 염기서열 750번부터 1901번까지의 DNA 단편을 함유한 CEP-CAT가 이용되었고, 대조군 리포터 플라스미드로는 pERCAT2가 이용되었다. 한편, 전기 플라스미드의 도입에 이용된 숙주세포로는 Hep G2 세포와 Hep 3B 세포를 이용하였다.

본 발명의 발명자들은 리포터 플라스미드 CpCAT와 pcDNA-p53이 도입된 Hep G2 세포에서의 CAT 활성이 대조군보다 아주 낮음을 확인하였는 바, p53의 하향조절(down regulation)이 프로모터에 특이적임을 알 수 있었다.

또한, p53에 의한 HBV의 코어 프로모터 활성억제와 관련있는 HBV 게놈 부위를 밝히기 위하여, HBV의 코어 프로모터만을 함유한 CEP-CAT를 리포터 플라스미드로 사용하였는데, 리포터 플라스미드 CEP-CAT와 pcDNA-p53이 도입된 Hep G2 세포에서의 CAT 활성은 대조군보다 매우 낮게 측정되었다. 따라서, p53에 의한 코어 프로모터의 활성 억제와 관련 있는 HBV의 DNA 부위는 염기 서열 750 내지 1901번 까지를 포함하는 1.15kb임을 알 수 있었다. 한편, 전기와 같이 코어 프로모터를 억제하는 p53은 외인성 p53임을 입증하기 위하여, 내인성 p53 유전자를 갖고 있지 않는 Hep 3B 세포를 플라스미드 도입을 위한 숙주세포로 사용하여, CAT활성을 측정한 결과, 리포터 플라스미드 CpCAT와 pcDNA-p53이 도입된 Hep 3B 세포에서의 CAT활성은 대조군보다 매우 낮게 측정되었다. 따라서, p53에 의한 코어 프로모터의 활성 억제는 외인성 p53에 의한 것임을 알 수 있었다.

프리게놈/코어 프로모터로부터 합성되는 프리게놈 RNA는 복제의 중간체로 이용된다는 사실로부터 p53이 프리게놈 RNA양을 감소시키므로써 HBV의 복제를 억제할 것으로 추측되어, 세포 배양액으로 분비되는 HBV의 표면항원(HBsAG) 및 코어 단백질(HBc/eAg)의 양; 서던블럿(Southern blot) 분석으로 결정된 HBV의 DNA 양; 노던 블럿(Northern blot) 분석으로 결정된 HBV의 RNA 양을 측정함으로써, p53에 의하여 HBV의 복제가 억제됨을 확인하였다. 또한, p53이 살아있는 세포의 수를 감소시키거나 혹은 전사체계에의 변이를 초래하여 HBV의 복제를 억제하지 않는다는 것을 확인하였다.

이와 같은 사실로부터, 본 발명의 p53 단백질 또는 그의 기능적 등가물은 야생형 또는 재조합 미생물로부터 발현된 것을 포함하여, B형 간염 바이러스의 복제를 효과적으로 억제할 수 있는 인자로서 이용될 수 있을 것이다. 한편, p53 단백질 또는 그의 기능적 등가물을 유효성분으로 함유하는 HVB복제 억제인자는 직접 간세포에 투여되거나, 혹은 이들을 발현하는 재조합 DNA를 투여하는 등의 여러 가지 방법에 의한 유전자 치료(gene therapy)에 의하여, HBV에 의해 야기되는 급성, 만성 간염의 치료와 간경화 및 간암의 예방에 이용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

플라스미드의 제조

본 발명에 이용된 p53 발현 플라스미드로는 야생형의 p53을 발현하는 pcDNA-p53과 부위특이적 돌연변이에 의해 유도된 p53을 발현하는 플라스미드 G154V 및 R273L을 이용하였다. 플라스미드 pcDNA-p53은 p53 cDNA(참조: Zakut-Houri, R. et al., EMBO. J., 4:1251-1255(1985))에 BamHI 처리하여 얻은 p53의 2.55kb DNA 단편을 pcDNA.1(Invitrogen, USA)의 BamHI 부위에 삽입하므로써 제조되었다. 한편, 전기 2.55kb의 DNA 단편을 M13mp19(New England Biolabs, USA)에 삽입하고 쿤겔(Kunkel)의 방법으로 p53의 아미노산 154번에 해당하는 염기서열 즉 GCT를 GTC로 부위특이적으로 돌연변이시킨 다음(참조; Kunkel, T.A., Proc. Nat1. Acad. Sci., USA, 82:488-492(1985)). 2.55kb의 p53 DNA 단편을 pcDNA.1에 삽입하여 플라스미드 G154V를 제조하였다. 그런다음, p53의 아미노산 273번에 해당하는 염기서열 즉 CGT를 CTT로 부위특이적으로 돌연변이시키고, 2.55kb의 p53 DNA 단편을 pcDNA.1에 삽입하여 플라스미드 R273L을 제조하였다. 플라스미드 G154V 및 R273L의 부위특이적 돌연변이에는 CACCCCCGCCCGTCACCCGCGTC 및 GCTTTGAGGTGCTTGTTTGTGCC 올리고뉴클레오티드를 각각 사용하였다.

또한, HBV의 유전자를 포함하고 있는 리포터 플라스미드로는 CpCAT 및 CEP-CAT가 이용되었으며, 대조군 리포터 플라스미드로는 pERCAT2가 이용되었다. pERCAT2(참조: Johnson, A.C. et al., J. Biol. Chem., 263:5693-5699(1988))는 EGF(epidermal growth factor)-리셉터 프로모터에 의해 전사가 조절되는 클로람페니콜 아세틸 전이효소(chloramphenicol acetyl transferase: 이하, 'CAT'라 함) 유전자를 포함하고 있다. 루시퍼라제 리포터 유전자에 연결된 HBV 코어 프로모터를 함유하고 있는 플라스미드 CpLUC(참조: Raney, A.K. et al., J. Virol., 64:2360-2368(1990))에 HindIII 처리하여 3.2kb의 HBV 게놈을 얻었다. 플라스미드 pGEM7Z(+)(Promega, USA)에 CAT 유전자를 삽입하여 제조한 pGEMCAT의 HindIII 부위에 전기에서 얻은 3.2kb의 DNA 단편을 삽입하여 플라스미드 CpCAT를 제조하였다. 한편, adr 4 타입의 HBV DNA에 DraI 및 Bg1II를 처리하여 얻은 1151bp DNA 단편 즉, DNA 염기서열 750번부터 1901번까지의 DNA 단편을 pGEMCAT의 KpnI 및 XbalI 부위에 삽입하여 플라스미드 CEP-CAT를 제조하였다. 제1(a)도에 리포터 플라스미드의 유전자 지도를 나타내었는데, 제1(a)도에서, 화살표는 pre S(PS), S, X 및 코어(C) 프로모터로 부터의 전사방향을 각각 나타내며, 뉴클레오티드 서열의 번호는 와인-홉슨(Wain-Hobson)와 티올라이스(Tiollais)의 염기서열 순서체계에 따라 지정되었다(참조: Wain-Hobson, S. and Tiollais, P., in Genetics Maps, 1984). 제1(a)도에서 보듯이, CpCAT는 프리게놈/코어 프로모터에 의해 발현이 조절되는 CAT 유전자 및 HBV 게놈 전부를 포함하고 있으며, CEP-CAT는 CAT 유전자의 상위(upstream)에 위치한 1151bp의 코어 프로모터와 간 특이적 인헨서인 인헨서 I, II를 함유하고 있음을 알 수 있다.

[실시예 2]

숙주세포로의 플라스미드 도입

Hep G2 세포(ATCC HB8065)와 Hep 3B 세포(ATCC HB8064)가 숙주세포로 이용되었다.

5㎍의 리포터 플라스미드와 3㎍의 p53 발현 플라스미드(effector plasmid)를 샘부룩(Sambrook) 등에 의한 DEAE-덱스트란 방법으로 Hep G2 세포로 도입하였다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989): 플라스미드 도입 하루 전에, 직경이 60㎜인 플레이트에 2×10⁵개의 숙주세포를 넣고, 1일이 경과하면 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 두 번 세척하고, 0.4㎎/ml의 DEAE-덱스트란 및 적절한 양의 DNA 칵테일로 처리하였다. 그런 다음, 0.1mM 클로로킨 이인산용액(chloroquine diphosphate)을 가하여 70%의 습도가 유지되는 37℃의 CO₂배양기에서 3시간 배양하고, 10% DMSO(dimethyl sulfoxide)로 쇼크를 주었다. 이렇게 플라스미드가 도입된 세포를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: 이하, 'FBS'라 함)이 함유된 DMEM배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 40시간동안 배양하였다.

Hep 3B 세포를 전기의 CO₂배양기에서 24시간 동안 공침전물(coprecipitates)과 함께 배양하고, 15% 글리세롤로 쇼크를 주는 것을 제외하고는, 샘부룩(Sambrook) 등의 인산화 칼슘 공침전법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989)을 이용하여 Hep 3B 세포에 플라스미드를 도입시켰다. 또한, 이렇게 플라스미드가 도입된 세포를 20% FBS가 함유된 DMEM배지에서 40시간동안 배양한 다음, CAT 활성을 분석하였다.

[실시예 3]

p53에 의한 프리게놈/코어 프로모터의 활성 억제 확인

외인성 p53(exogeneous p53)의 발현은 CAT 활성을 분석하여 조사하였다. CAT 활성은 이미 공지된 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ne Ed., 1989)에 약간의 변형을 가한 방법으로 측정하였다: 즉, 실시예 2에서 제조된 플라스미드가 도입된 세포를 PBS로 두 번 세척하고, 1.4ml의 TNE완충용액(150mM NaCl 및 1mM EDTA를 함유한 40mM Tris 완충용액(pH 7.8))에 현탁시킨 다음, 원심분리하여 얻은 침전물을 100μl의 250mM Tris 완충용액(pH 7.8)에 재현탁시켜 4번의 동결 및 융해로 세포를 파괴하였다. 그런 다음, 원심분리하여 얻은 상등액 50μl에 [¹⁴C]-클로람페니콜을 가하여 37℃에서 2시간 반응시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 95:5(v/v)의 클로로포름/메탄올의 전개용매를 사용하여 추출물을 TLC(thin layer chromatography)로 분석하였다. 1번 실험에 동일한 플라스미드가 도입된 세포를 2번 사용하였으며, 이러한 실험을 적어도 3번 이상 시행하여 얻은 결과의 평균값을 제1(b), 1(c) 및 1(d)도에 나타내었다.

제1(b)도에서 보듯이, 리포터 플라스미드 CpCAT와 pcDNA-p53이 도입된 Hep G2 세포에서의 CAT 활성은 대조군의 3%에 해당함을 알 수 있으며; 리포터 플라스미드 CpCAT와 R273L 혹은 G154V이 도입된 Hep G2 세포에서의 CAT 활성은 각각 대조군의 16% 및 83%임을 알 수 있어, 야생형의 p53이 HBV의 코어 프로모터에 특이적으로 작용함을 알 수 있었다. 한편, 전기와 같은 p53의 코어 프로모터 하향조절(down-regulation)과는 달리, 대조군 리포터 pERCAT2와 pcDNA-p53로 형질전환된 Hep G2 세포에서는 CAT 활성이 대조군의 18배 이상으로 증가된 것으로 나타났는데, 이러한 결과로부터 p53의 하향조절은 프로모터에 특이적임을 추측할 수 있었다.

이어, 전기와 같은 p53의 코어 프로모터 활성 억제가 p53이 세포주기(cell cycle)를 정지시키므로써 일어나는 현상인지를 확인하기 위하여, 플라스미드를 도입하고 15시간이 경과한 다음에 CAT 활성을 측정하였다(참조: 제1(c)도). 제1(c)도에서 보듯이, 리포터 플라스미드 CpCAT와 pcDNA-p53이 도입된 Hep G2 세포에서의 CAT 활성은 대조군의 30%에 해당함을 알 수 있으며: 리포터 플라스미드 CpCAT와 R273L 및 G154V가 도입된 Hep G2세포에서의 CAT 활성은 각각 대조군의 40% 및 100%임을 알 수 있어, p53에 의한 코어 프로모터의 활성 억제는 세포주기중의 초기단계에서도 일어나며, 세포생장을 정지시키므로써 HBV의 코어 프로모터 활성을 억제시키는 것이 아님을 알 수 있었다.

또한, HBV의 코어 프로모터만을 함유한 CEP-CAT를 리포터 플라스미드로 사용하여 p53에 의한 HBV의 코어 프로모터 활성 억제를 야기시키는 HBV 게놈 부위를 밝혔다(참조: 제1(d)도). 제1(d)도에서 보듯이, 리포터 플라스미드 CEP-CAT와 pcDNA-p53이 도입된 Hep G2 세포에서의 CAT 활성은 대조군의 6%에 해당함을 알 수 있으며: 리포터 플라스미드 CEP-CAT와 R273L 및 G154V가 도입된 Hep G2세포에서의 CAT 활성은 각각 대조군의 10% 및 40%임을 알 수 있어, p53에 의한 코어 프로모터의 활성 억제와 관련있는 HBV의 DNA 부위는 염기서열 750 내지 1901번 까지를 포함하는 1.15kb임을 알 수 있었다.

한편, Hep G2 세포는 내인성 p53 유전자를 가지고 있으므로, 외인성 p53과 밀접한 관련을 가진 내인성 p53에 의해 전기의 결과가 나타났다고 볼 수도 있으므로, p53 유전자를 갖고 있지 않는 Hep 3B 세포를 플라스미드 도입을 위한 숙주세포로 사용하여, CAT활성을 측정하였다(참조: 제2도).

제2도에서 보듯이, 리포터 프라스미드 CpCAT와 pcDNA-p53이 도입된 Hep 3B 세포에서의 CAT활성은 대조군의 5%에 해당함을 알 수 있으며; 리포터 플라스미드 CpCAT와 R273L 및 G154V가 도입된 Hep 3B 세포에서의 CAT 활성은 각각 대조군의 45% 및 86%임을 알 수 있어, p53에 의한 코어 프로모터의 활성 억제는 외인성 p53에 의한 것임을 알 수 있었다.

[실시예 4]

p53에 의한 HBV의 복제 억제 확인(Ⅰ)

p53이 프리게놈/코어 프로모터의 활성을 억제한다는 사실을 토대로, p53이 프리게놈 RNA 양을 감소시키므로써 HBV의 복제를 억제시키는지를 확인하였다. HBV DNA 단량체(monomer)의 하단에 또 다른 HBV DNA 단량체의 상단이 연결된 DNA 이량체(dimer)를 포함하고 있는 플라스미드 adw R9(참조: Blum, B.E. et al., J. Virol., 66:1223-1227(1992))와 p53 발현 플라스미드를 Hep G2 세포로 도입하였다. p53에 위한 HBV 복제 억제는 세포배양액으로 분비되는 표면항원(HBsAg) 및 코어 단백질(HBc/eAg)의 양을 블럼(Blum) 등의 방법에 따라 분석하므로써 확인하였다. 플라스미드가 도입된 Hep G2 세포의 배양액 1ml을 1:50으로 희석한 다음, Genedia-S. M.(녹십자, 대한민국)을 이용하여 표면항원(HBsAg)의 양을 측정하였고; 플라스미드가 도입된 Hep G2 세포의 배양액 1ml을 1:10으로 희석한 다음, Abott HBc/e진단 키드(Abott Diagnostic Systems, USA)를 이용하여 코어 단백질(HBc/eAg)의 양을 측정하였다(참조: 제3(a)도 및 제3(b)도).

제3(a)도에서 보듯이, adw R9 플라스미드만이 도입된 Hep G2 세포의 배양액에서는 플라스미드 도입 하루 만에는 HBsAg가 관찰되지 않았으나, 이틀부터 배양액으로 분비되는 HBsAg의 양이 계속 증가하였다. 그러나, adw R9 플라스미드와 pcDNA-p53이 도입된 Hep G2 세포의 배양액에서 관찰되는 HBsAg의 양은 플라스미드 도입 후 3일째에 95% 감소하였다. pcDNA-p53 대신에 R273L이나 G154V를 이용하여 전기를 실험을 하였을 때, HBsAg 양의 감소 정도는 R273L의 경우 40%, G154V의 경우는 10%이었으며, R273L에 의한 감소 효과가 G154V의 경우보다 크게 나타났으므로, HBsAg 양의 감소는 야생형 p53에 특이적임을 알 수 있었다. 한편, 제3(b)도에서 보듯이, HBc/eAg 양을 측정한 결과, adw R9 플라스미드와 pcDNA-p53이 도입된 Hep G2 세포의 배양액에서 관찰되는 HBc/eAg의 양은 플라스미드 도입 후 3일째에 80% 감소하였다. pcDNA-p53 대신에 R273L이나 G154V를 이용하였을 때, HBc/eAg 양의 감소 정도는 R273L의 경우 30%, G154V의 경우는 10%이었으며, R273L에 의한 감소효과가 G154V의 경우보다 크게 나타났다.

[실시예 5]

p53에 의한 HBV의 복제 억제 확인(Ⅱ)

p53에 의한 HBV 복제 억제를 좀 더 구체적으로 알아보기 위하여, 플라스미드가 도입된 세포의 세포 용혈물과 배양액을 서던블럿(Southern blot) 분석하여 HBV의 DNA 양을 결정하였다.

세포 용혈물에서의 DNA 분석을 위하여, 우선 플라스미드 도입 후 3일 배양한 세포를 수득하고 저장완충용액(hypotonic buffer: 100mM NaCl, 1mM EDTA 및 0.5% NP-40을 함유한 20mM Tris 완충용액(pH 7.5)에 현탁시켰다. 균질화시킨 다음, 10mM MgCl₂및 23U/mM DNase 1을 첨가하고 37℃에서 3시간 반응시키고, 5,000rpm에서 1시간 원심분리하여 얻은 상등액을 TNE에 용해된 30% 수크로스 용액에 주입하여 4℃, 35,000rpm에서 12시간 원심분리하였다. 이렇게 수득한 침전물을 25mM EDTA, 300mM NaCl, 2% SDS 및 400㎍/ml 단백질 분해효소 K를 함유한 200mM Tris 완충용액(pH 7.8)에 재현탁시켜 56℃에서 3시간 반응시켰다. 그런 다음, 페놀/클로로포름으로 두 번 추출하고 에탄올로 침전시켜 DNA를 분리하였다. 세포 배양액내의 DNA 분석을 위하여, 세포 배양액으로 분비된 바이러스 입자(virus particle)를 농축하고 TNE에 용해된 30% 수크로스 용액에 점적한 다음, 전기 세포 용혈물로 부터의 DNA 분리방법과 동일한 방법을 사용하였다.

직경이 60㎜인 플레이트 1개에서 배양된 세포의 용혈물 및 배양액으로부터 분리된 DNA를 1.5% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 다음,³²P가 표지된 adw R9를 프로브로 하여 서던 블럿하였다(참조: 제4(a)도 및 제4(b)도). 제4(a)도는 세포 용혈물로부터 분리한 DNA를 서던 블럿 분석한 결과이고, 제4(b)도는 세포 배양액으로부터 분리한 DNA를 서던 블럿 분석한 결과이다. 제4(a)도 및 제4(b)도에서, 레인 'adw R9'는 adw R9만이 도입된 세포의 용혈물 및 배양액에 존재하는 HBV의 DNA 양을 나타내고, 레인 'adw R9 + p53'은 adw R9와 pcDNA-p53이 도입된 세포의 용혈물 및 배양액에 존재하는 HBV DNA 양을 나타낸다. 제4(a)도 및 제4(b)도에서 보듯이, pcDNA-p53이 도입된 세포의 용혈물과 배양액에 존재하는 HBV DNA 양은 daw R9만이 도입된 세포의 경우보다 90% 이상 감소하였다. 따라서, 본 실험으로 p53은 HBV의 복제를 억제함을 알 수 있었다.

[실시예 6]

p53에 의한 HBV의 복제 억제 확인(Ⅲ)

p53에 의한 HBV 복제 억제를 좀 더 구체적으로 알아보기 위하여, 플라스미드가 도입된 세포의 용혈물과 배양액을 노던블럿(Northern blot) 분석하여 HBV의 RNA 양을 결정하였다.

adw R9만이 도입된 세포 혹은 adw R9와 pcDNA-p53이 도입된 세포로부터 총 RNA를 다음과 같이 분리하였다: 플라스미드가 도입된 세포를 6M 구아니딘 이소티오시아네이트(guanidine isothiocyanate), 0.5% 사코실(Sarcosyl) 및 1mM 2-머캡토에탄올을 함유한 용액에 균질화시킨 다음, 1mM EDTA이 포함된 5.7M CsCl 3ml에 주입하고 20℃, 65,000rpm에서 24시간 원심분리하였다. 침전된 RNA를 RNase가 제거된 증류수에 재현탁시키고, 0.3MNaCl을 포함한 에탄올 용액으로 RNA를 침전시켰다.

총 30㎍의 RNA를 2.2M 포름알데히드 변성 겔에 주입하여 전기영동하고 염색한 결과, 각 레인에 주입된 총 RNA 양이 동일한 것으로 나타났다(참조: 제5(a)도). HBV의 RNA양은³²P가 표지된 adw DNA를 프로브로 하여 노던 블럿 방법으로 분석하였다(참조 : 제5(b)도). 제5(a)도 및 제 제5(b)도에서, 레인 'adw R9'는 adw R9만이 도입된 세포에 존재하는 HBV의 RNA 양을 나타내고, 레인 'adw R9+p53'은 adw R9와 pcDNA-p53이 도입된 세포에 존재하는 HBV의 RNA 양을 나타낸다. 제5(b)도에서 보듯이, adw R9와 pcDNA-p53이 도입된 세포에서 분리한 HBV의 RNA 양은 adw R9만이 도입된 세포의 경우보다 95% 이상 감소하였으며, 2.4kb RNA 및 2.1kb RNA 뿐만 아니라 3.6kb 프리게놈 RNA가 탐지되었다.

이상의 실시예 3, 4, 5 및 6의 결과로부터, 야생형 p53단백질이 프리게놈/코어 프로모터의 하향조절로 HBV의 복제를 억제함을 알 수 있었다.

[실시예 7]

p53의 표적 특이성(target specificity) 확인

p53이 살아있는 세포의 수를 감소시키거나 혹은 전사체계에 변이를 초래하므로써 HBV의 복제를 억제하는 것이 아니라는 사실을 리포터로 β-갈락토시다제(β-galactosidase)를 이용하여 밝히기로 하였다.

pERCAT2에 XhoI을 처리하여 얻은 2.2kb DNA 단편을 pNASS-β(Clonetech., USA)에 삽입하여 EGF-리셉터 프로모터의 조절하에 있는 β-갈락토시다제 유전자를 포함하는 pER-βGAL을 제조하였다. pER-βGAL을 adw R9 +/- pcDNA-p53과 함께 Hep G2 세포로 도입하여 3일이 경과한 다음, 공지된 조직화학적 방법으로 염색하고(참보: Sanes, J.R. et al., Embo. J., 5:3133-3142(1986)), 5㎟의 면적 내에 있는 푸른색으로 염색된 세포 수를 헤아렸다. 제6(a)도는 Hep G2 세포대조군이며, 제6(b)도는 pcDNA-p53이 도입된 세포를 나타낸다. 또한, RSV(Rous sarcoma virus) 프로모터(참조: Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:6453(1982))의 조절하에 있는 β-갈락토시다제 유전자를 포함하고 있는 RSV-βGAL을 adw R9 +/- pcDNA-p53과 함께 Hep G2 세포로 도입하여 3일이 경과한 다음, 조직화학적 방법으로 염색하였다. 제7(a)도는 Hep G2 세포대조군이며, 제7(b)도는 pcDNA-p53이 도입된 세포를 나타낸다. 제6(b)도 및 제7(b)도에서 보듯이, pcDNA-p53이 도입된 세포나 도입되지 않은 세포나 푸른색으로 염색된 세포의 수는 동일 한 것으로 보아, p53은 생존해 있는 플라스미드가 도입된 세포의 수를 감소시키지 않음을 확인할 수 있다. 아울러, 현미경으로 플라스미드가 도입된 Hep G2 세포를 관찰한 결과, pcDNA-p53이 도입된 세포나 도입되지 않은 세포 모두의 형태의 변화가 없음을 확인하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 HBV의 프리게놈/코어 프리모터의 활성을 억제하는 p53 단백질을 제공한다. 본 발명의 p53단백질 또는 그의 기능적 등가물은 HBV의 복제를 유전자 수준에서 억제하므로, 직접 간세포에 투여하거나 유전자 치료를 포함한 여러 가지 방법에 의하여 HBV에 의해 야기되는 급성 간염 및 만성 간염 등 질환의 치료와 간경화 및 간암의 예방에 이용될 수 있을 것이다.

Claims

p53 단백질을 이용하여 인간을 제외한 포유동물의 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus)의 복제를 억제하는 방법.
제1항에 있어서, p53 단백질은 인간으로부터 기원한 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, p53 단백질은 재조합 미생물로부터 발현된 것을 특징으로 하는 방법.
야생형 p53 단백질의 아미노산 154번에 해당하는 염기서열 GCT를 GTC로 부위특이적으로 돌연변이시킨 p53 단백질의 변형체를 이용하여 인간을 제외한 포유동물의 B형 간염 바이러스의 복제를 억제하는 방법.
야생형 p53 단백질의 아미노산 273번에 해당하는 염기서열 CGT를 CTT로 부위특이적으로 돌연변이시킨 p53 단백질의 변형체를 이용하여 인간을 제외한 포유동물의 B형 간염 바이러스의 복제를 억제하는 방법.