JP3430296B2 - ヒト表皮遺伝子プロモーター - Google Patents
ヒト表皮遺伝子プロモーターInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒトTGエーゼＩ及び非相同蛋白の両者のコ
ントロールされた遺伝子発現のためのヒトタイプＩトラ
ンスグルタミナーゼ（TGエーゼＩ）からのプロモーター
要素に関する。これらのプロモーター要素は、例えばヒ
トの遺伝子治療のためそして皮膚同等物による医薬品の
テストのための遺伝子の組織特異的発現を行わせる。さ
らに、本発明のプロモーター要素は、生理学的条件の
下、又はカルシウム及びレチノイン酸を含む外来性添加
因子の存在下分化調節をもたらすことができる。
ントロールされた遺伝子発現のためのヒトタイプＩトラ
ンスグルタミナーゼ（TGエーゼＩ）からのプロモーター
要素に関する。これらのプロモーター要素は、例えばヒ
トの遺伝子治療のためそして皮膚同等物による医薬品の
テストのための遺伝子の組織特異的発現を行わせる。さ
らに、本発明のプロモーター要素は、生理学的条件の
下、又はカルシウム及びレチノイン酸を含む外来性添加
因子の存在下分化調節をもたらすことができる。
背景技術
トランスグルタミナーゼは、小さい第一級アミンによ
る蛋白のアミノ化、又はε（γ−グルタミル）リジント
ランスペプチド結合の形成による蛋白の橋かけ結合に導
かれるアシル転移反応を触媒化するカルシウム依存性酵
素である。この橋かけ結合の活性は、概して、種々の生
物学的機能を有する大きな化学的、酵素的及び機械的に
抵抗性を有する重合体への可溶性蛋白の共有結合を生ず
る。
る蛋白のアミノ化、又はε（γ−グルタミル）リジント
ランスペプチド結合の形成による蛋白の橋かけ結合に導
かれるアシル転移反応を触媒化するカルシウム依存性酵
素である。この橋かけ結合の活性は、概して、種々の生
物学的機能を有する大きな化学的、酵素的及び機械的に
抵抗性を有する重合体への可溶性蛋白の共有結合を生ず
る。
二三の群のトランスグルタミナーゼが存在し、そして
一群の遺伝子を形成する。XIII因子の「ａ」サブユニッ
ト（XIII a）は、フィブリンを橋かけ結合することによ
り血液凝固形成に参加する。XIII a因子は、血漿及び胎
盤で可溶性蛋白であり、それは又血漿TGエーゼとして知
られている。TGエーゼＩは、ケラチン生成細胞に関する
分化のマーカーであり、そして表皮性ケラチン生成細胞
における角化エンベロープの形成に役割を果たす。TGエ
ーゼＩは、きわだって膜に結合し、そして粒子状TGエー
ゼ、表皮性TGエーゼ、及びTGエーゼＫとして文献に色々
同定されてきた。TGエーゼIIは、細胞質ゾル中のいたる
ところに分布している。TGエーゼIIの生理学的役割は、
十分に理解されていない。この酵素は、又組織TGエー
ゼ、肝TGエーゼ、細胞内TGエーゼ、可溶性TGエーゼ、及
びTGエーゼＣとして知られている。バンド4.2蛋白も、
この蛋白はトランスグルタミナーゼ活性を欠いている
が、TGエーゼ遺伝子の群に属する。
一群の遺伝子を形成する。XIII因子の「ａ」サブユニッ
ト（XIII a）は、フィブリンを橋かけ結合することによ
り血液凝固形成に参加する。XIII a因子は、血漿及び胎
盤で可溶性蛋白であり、それは又血漿TGエーゼとして知
られている。TGエーゼＩは、ケラチン生成細胞に関する
分化のマーカーであり、そして表皮性ケラチン生成細胞
における角化エンベロープの形成に役割を果たす。TGエ
ーゼＩは、きわだって膜に結合し、そして粒子状TGエー
ゼ、表皮性TGエーゼ、及びTGエーゼＫとして文献に色々
同定されてきた。TGエーゼIIは、細胞質ゾル中のいたる
ところに分布している。TGエーゼIIの生理学的役割は、
十分に理解されていない。この酵素は、又組織TGエー
ゼ、肝TGエーゼ、細胞内TGエーゼ、可溶性TGエーゼ、及
びTGエーゼＣとして知られている。バンド4.2蛋白も、
この蛋白はトランスグルタミナーゼ活性を欠いている
が、TGエーゼ遺伝子の群に属する。
TGエーゼＩ遺伝子発現は、生体内及び生体外で、末端
で分化するケラチン生成細胞に制限されているように見
える。これらの細胞では、原形質膜の直下の不溶性の保
護的構造即ち細胞エンベロープの形成は、TGエーゼの増
大する橋かけ結合の活性と組み合わされ、次にTGエーゼ
ImRNAの増大するレベルと相関する［Polakowskaら、（1
911）J.Invest.Dermat.96、285−288］。TGエーゼＩ発
現、並びに末端分化は、二三の環境因子により調節さ
れ、その中でCa2+及びレチノイン酸（RA）は最も顕著な
効果を有するものと思われる。それ故、TGエーゼＩは、
ケラチン生成細胞の分化のための好都合なマーカーをも
たらす。
で分化するケラチン生成細胞に制限されているように見
える。これらの細胞では、原形質膜の直下の不溶性の保
護的構造即ち細胞エンベロープの形成は、TGエーゼの増
大する橋かけ結合の活性と組み合わされ、次にTGエーゼ
ImRNAの増大するレベルと相関する［Polakowskaら、（1
911）J.Invest.Dermat.96、285−288］。TGエーゼＩ発
現、並びに末端分化は、二三の環境因子により調節さ
れ、その中でCa2+及びレチノイン酸（RA）は最も顕著な
効果を有するものと思われる。それ故、TGエーゼＩは、
ケラチン生成細胞の分化のための好都合なマーカーをも
たらす。
ヒトTGエーゼＩ遺伝子に関するcDNAクローン及びその
配列は、二三の研究者により報告されている［Kimら、
（1991）J.Biol.Chem.266、536、Phillipsら、（1990）
Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87、9333、Polakowskaら、
（1990）J.Invest.Dermat.94、567、Polakowskaら、（1
991）J.Invest.Dermat.96、285、Schroederら、（199
0）Clin.Res.38、962A、Yamanishiら（1991）Biochem.B
iophys.Res.Comm.175、906］。しかし、その随伴した調
節領域を有するヒトTGエーゼＩに関するゲノム遺伝子
は、現在まで明らかになっておらず、そのため特徴づけ
られていない。
配列は、二三の研究者により報告されている［Kimら、
（1991）J.Biol.Chem.266、536、Phillipsら、（1990）
Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87、9333、Polakowskaら、
（1990）J.Invest.Dermat.94、567、Polakowskaら、（1
991）J.Invest.Dermat.96、285、Schroederら、（199
0）Clin.Res.38、962A、Yamanishiら（1991）Biochem.B
iophys.Res.Comm.175、906］。しかし、その随伴した調
節領域を有するヒトTGエーゼＩに関するゲノム遺伝子
は、現在まで明らかになっておらず、そのため特徴づけ
られていない。
発明の開示
本発明は、ヒトTGエーゼＩゲノムDNAを同定しそして
特性を知ることから生ずる。従って、一度ヒトゲノムDN
Aが分れば、ヒトTGエーゼＩの転写の開始及びコントロ
ールの原因になる調節領域又は要素は、本発明により提
供されるときはっきりことになった。TGエーゼＩが組織
特異的なやり方で、即ち末端で分化するケラチン生成細
胞で発現されるので、その調節領域は、組織特異的発現
ベクターの構築に特に有用であり、さらにカルシウム及
びレチノイン酸に応答するプロモーター要素をもたら
す。その上、本発明の調節要素のそれぞれは、周知のプ
ロモーター又は調節要素と組合わさって有用である。こ
れらの組合せは、宿主細胞又は条件の修飾を他のベクタ
ーに応答するようにし、そのため遺伝子発現をコントロ
ールする追加の手段を提供する。これらの組合せは、選
択された細胞のタイプで又は特別なセットの条件下で発
現をコントロールするベクターを選ぶのにより大きなフ
レキシビリティをもたらす。
特性を知ることから生ずる。従って、一度ヒトゲノムDN
Aが分れば、ヒトTGエーゼＩの転写の開始及びコントロ
ールの原因になる調節領域又は要素は、本発明により提
供されるときはっきりことになった。TGエーゼＩが組織
特異的なやり方で、即ち末端で分化するケラチン生成細
胞で発現されるので、その調節領域は、組織特異的発現
ベクターの構築に特に有用であり、さらにカルシウム及
びレチノイン酸に応答するプロモーター要素をもたら
す。その上、本発明の調節要素のそれぞれは、周知のプ
ロモーター又は調節要素と組合わさって有用である。こ
れらの組合せは、宿主細胞又は条件の修飾を他のベクタ
ーに応答するようにし、そのため遺伝子発現をコントロ
ールする追加の手段を提供する。これらの組合せは、選
択された細胞のタイプで又は特別なセットの条件下で発
現をコントロールするベクターを選ぶのにより大きなフ
レキシビリティをもたらす。
ヒトTGエーゼＩプロモーターを同定しそして特性を知
り、さらにこれらの要素をマーカー遺伝子に結合するこ
とにより、発現を調節する他の因子例えば皮膚のための
薬剤及び化粧品が調べられる。さらに、本発明により同
定されるプロモーター調節要素を使用して、皮膚同等物
における外来性遺伝子生成物の発現を導くか又は皮膚同
等物におけるTGエーゼの部分的に変化した発現を導く発
現ベクターが構築できる。皮膚同等物又は人工皮膚は、
特に火傷の患者のための皮膚移植を含みさらに薬剤及び
化粧品並びにこれら製品の個々の成分をテストする多く
の用途を有する組織培養で成長する表皮細胞である。
り、さらにこれらの要素をマーカー遺伝子に結合するこ
とにより、発現を調節する他の因子例えば皮膚のための
薬剤及び化粧品が調べられる。さらに、本発明により同
定されるプロモーター調節要素を使用して、皮膚同等物
における外来性遺伝子生成物の発現を導くか又は皮膚同
等物におけるTGエーゼの部分的に変化した発現を導く発
現ベクターが構築できる。皮膚同等物又は人工皮膚は、
特に火傷の患者のための皮膚移植を含みさらに薬剤及び
化粧品並びにこれら製品の個々の成分をテストする多く
の用途を有する組織培養で成長する表皮細胞である。
従って、本発明は、薬剤及び化粧品の生体外のテスト
をもたらすための皮膚同等物との用途について、そして
皮膚同等物の製造のために細胞特異的なやり方で薬剤を
伝達するか又は表皮の疾患を治療するヒトの遺伝子治療
について特に有用であるヒトTGエーゼＩ遺伝子の転写調
節領域の一つ以上（即ちプロモーター領域の要素）を含
む発現ベクターを提供する。
をもたらすための皮膚同等物との用途について、そして
皮膚同等物の製造のために細胞特異的なやり方で薬剤を
伝達するか又は表皮の疾患を治療するヒトの遺伝子治療
について特に有用であるヒトTGエーゼＩ遺伝子の転写調
節領域の一つ以上（即ちプロモーター領域の要素）を含
む発現ベクターを提供する。
本発明は、ヒトタイプＩトランスグルタミナーゼ（TG
エーゼＩ）遺伝子からの転写調節領域に関する。さらに
特に、本発明は、ヒトタイプＩトランスグルタミナーゼ
遺伝子からの転写調節領域を含む隔離された核酸に関す
る。これらの調節領域は、存在する要素に依存して正又
は負の何れかのやり方で、それにカップリングする任意
の遺伝子の組織特異的発現をコントロールできる。さら
に特に、これらの領域は、少なくとも１種のケラチン生
成細胞特異的調節要素、少なくとも１種のカルシウム応
答調節要素及び／又は少なくとも１種のレチノイン酸応
答調節要素を含み、そしてゲノムヒトTGエーゼＩ遺伝子
に含まれる第二のエキソンの5'末端から約２キロベース
（kb）上流に延在するDNAに位置する。
エーゼＩ）遺伝子からの転写調節領域に関する。さらに
特に、本発明は、ヒトタイプＩトランスグルタミナーゼ
遺伝子からの転写調節領域を含む隔離された核酸に関す
る。これらの調節領域は、存在する要素に依存して正又
は負の何れかのやり方で、それにカップリングする任意
の遺伝子の組織特異的発現をコントロールできる。さら
に特に、これらの領域は、少なくとも１種のケラチン生
成細胞特異的調節要素、少なくとも１種のカルシウム応
答調節要素及び／又は少なくとも１種のレチノイン酸応
答調節要素を含み、そしてゲノムヒトTGエーゼＩ遺伝子
に含まれる第二のエキソンの5'末端から約２キロベース
（kb）上流に延在するDNAに位置する。
本発明の他の態様は、遺伝子生成物をエンコードする
DNAに操作可能に結合した本発明の調節領域を有する複
製可能な発現ベクター並びにこれらベクターを含み宿主
細胞を提供する。これらの遺伝子生成物は、TGエーゼ
Ｉ、ケラチン生成細胞特異的遺伝子例えばケラチン、マ
ーカー遺伝子又は外来性遺伝子生成物である。
DNAに操作可能に結合した本発明の調節領域を有する複
製可能な発現ベクター並びにこれらベクターを含み宿主
細胞を提供する。これらの遺伝子生成物は、TGエーゼ
Ｉ、ケラチン生成細胞特異的遺伝子例えばケラチン、マ
ーカー遺伝子又は外来性遺伝子生成物である。
本発明のさらに他の態様は、ケラチン生成細胞特異的
調節要素のコントロールの下遺伝子生成物を発現するの
に十分な時間及び条件下、本発明の発現ベクターの１種
を含むケラチン生成細胞を培養することにより、遺伝子
生成物のケラチン生成細胞特異的発現を行う方法を提供
する。この方法は、人工皮膚（皮膚同等物）例えばケラ
チン生成細胞でのマーカー遺伝子の発現に対する薬剤及
び化粧品の効果をテストするために、適切なコントロー
ルにより実施できる。
調節要素のコントロールの下遺伝子生成物を発現するの
に十分な時間及び条件下、本発明の発現ベクターの１種
を含むケラチン生成細胞を培養することにより、遺伝子
生成物のケラチン生成細胞特異的発現を行う方法を提供
する。この方法は、人工皮膚（皮膚同等物）例えばケラ
チン生成細胞でのマーカー遺伝子の発現に対する薬剤及
び化粧品の効果をテストするために、適切なコントロー
ルにより実施できる。
本発明の他の態様は、治療的量で遺伝子生成物の組織
特異的発現を行うことの可能な発現ベクターをヒトに投
与することにより、表皮の疾患を治療するためのヒト遺
伝子治療又は薬剤伝達の方法を提供し、その際、該発現
ベクターは、遺伝子生成物をエンコードするDNAに操作
可能に結合したヒトタイプＩトランスグルタミナーゼ遺
伝子からの転写調節領域を有する。
特異的発現を行うことの可能な発現ベクターをヒトに投
与することにより、表皮の疾患を治療するためのヒト遺
伝子治療又は薬剤伝達の方法を提供し、その際、該発現
ベクターは、遺伝子生成物をエンコードするDNAに操作
可能に結合したヒトタイプＩトランスグルタミナーゼ遺
伝子からの転写調節領域を有する。
本発明のさらに他の態様は、本発明の発現ベクターの
１種によりヒト皮膚同等物を形質転換し、患者に適用す
るのに十分な皮膚同等物を生成するのに有効な時間及び
条件下で、形質転換した皮膚同等物を培養し、患者に形
質転換した皮膚同等物の塊を適用し、そして必要に応じ
遺伝子生成物の発現を誘発し、それにより薬剤を伝達す
るか又は所望の表皮の治療に行うことにより、薬剤を表
皮に伝達するか又は表皮の疾患を治療するためのヒト遺
伝子治療を行う方法を提供する。
１種によりヒト皮膚同等物を形質転換し、患者に適用す
るのに十分な皮膚同等物を生成するのに有効な時間及び
条件下で、形質転換した皮膚同等物を培養し、患者に形
質転換した皮膚同等物の塊を適用し、そして必要に応じ
遺伝子生成物の発現を誘発し、それにより薬剤を伝達す
るか又は所望の表皮の治療に行うことにより、薬剤を表
皮に伝達するか又は表皮の疾患を治療するためのヒト遺
伝子治療を行う方法を提供する。
図面の簡単な説明
図１は、３種のゲノムクローンEMBL−Ｂ、EMBL−Ｋ、
EMBL−Ｎ、並びに15エキソン及び14イントロンを含むヒ
トTGエーゼＩ遺伝子のゲノム編成の間の関係を示す。頂
部の細線は、３種のクローンのBamH I制限マップを示
す。エキソンマップ（中心）は、イントロン（太線、ア
ラビア数字）及びエキソン（ボックス、ロマン数字）の
分布を示す。5'−及び3'−未翻訳領域は、開いたボック
スにより指示される。
EMBL−Ｎ、並びに15エキソン及び14イントロンを含むヒ
トTGエーゼＩ遺伝子のゲノム編成の間の関係を示す。頂
部の細線は、３種のクローンのBamH I制限マップを示
す。エキソンマップ（中心）は、イントロン（太線、ア
ラビア数字）及びエキソン（ボックス、ロマン数字）の
分布を示す。5'−及び3'−未翻訳領域は、開いたボック
スにより指示される。
図２は、K3及びK5のプローブの位置とともに配列され
たヒトTGエーゼＩ遺伝子に関するゲノムクローンの領域
を示す。領域Ａ−Ｄに関する配列のストラテジーは、図
の下の部分で示される。
たヒトTGエーゼＩ遺伝子に関するゲノムクローンの領域
を示す。領域Ａ−Ｄに関する配列のストラテジーは、図
の下の部分で示される。
図３は、ヒトTGエーゼＩ遺伝子（上半分）及びプロモ
ーター活性について分析された種々の突然変異体（下半
分）の5'−調節領域からの1270塩基対（bp）の制限マッ
プを示す。突然変異体について、実線は、CATコンスト
ラクトに存在するDNAのフラグメントを示す（詳細につ
いては実施例参照）。
ーター活性について分析された種々の突然変異体（下半
分）の5'−調節領域からの1270塩基対（bp）の制限マッ
プを示す。突然変異体について、実線は、CATコンスト
ラクトに存在するDNAのフラグメントを示す（詳細につ
いては実施例参照）。
図４は、SV40プロモーター及びエンハンサー要素のコ
ントロールの下のクロラムフェニコールアセチル転移酵
素（CAT）遺伝子を含むプラスミドpSV2−catを示す。こ
のプラスミドは、CAT発現のための正のコントロールと
して働いた。
ントロールの下のクロラムフェニコールアセチル転移酵
素（CAT）遺伝子を含むプラスミドpSV2−catを示す。こ
のプラスミドは、CAT発現のための正のコントロールと
して働いた。
図５は、SV40プロモーター及びエンハンサー要素を欠
くpSV2−catの修飾バージョンであるプラスミドpBLCAT
−３を示す。このプラスミドは、CAT発現に関する負の
コントロール、並びに実施例４に記載された欠失突然変
異体に関する親プラスミドとして働いた。
くpSV2−catの修飾バージョンであるプラスミドpBLCAT
−３を示す。このプラスミドは、CAT発現に関する負の
コントロール、並びに実施例４に記載された欠失突然変
異体に関する親プラスミドとして働いた。
発明の実施するための最良の形態
本発明は、ヒトタイプＩトランスグルタミナーゼ（TG
エーゼＩ）遺伝子からの転写調節領域に関する。これら
の調節領域、又はプロモーター要素は、それにカップリ
ングする任意のコーディング配列の組織特異的発現をコ
ントロールすることができる。その上、発現は、プロモ
ーター要素の選択に応じて正又は負の何れかのやり方で
コントロールできる。さらに特に、これらのプロモータ
ー要素は、少なくとも１種のケラチン生成細胞特異的調
節要素、少なくとも１種のカルシウム（Ca）応答調節要
素及び／又は少なくとも１種のレチノイン酸（RA）応答
調節要素を含み、そしてゲノムヒトTGエーゼＩ遺伝子に
含まれる第二のエキソンの5'末端から約２キロベース
（kb）上流に延在するDNAに位置する。
エーゼＩ）遺伝子からの転写調節領域に関する。これら
の調節領域、又はプロモーター要素は、それにカップリ
ングする任意のコーディング配列の組織特異的発現をコ
ントロールすることができる。その上、発現は、プロモ
ーター要素の選択に応じて正又は負の何れかのやり方で
コントロールできる。さらに特に、これらのプロモータ
ー要素は、少なくとも１種のケラチン生成細胞特異的調
節要素、少なくとも１種のカルシウム（Ca）応答調節要
素及び／又は少なくとも１種のレチノイン酸（RA）応答
調節要素を含み、そしてゲノムヒトTGエーゼＩ遺伝子に
含まれる第二のエキソンの5'末端から約２キロベース
（kb）上流に延在するDNAに位置する。
本発明のために使用される一般的な手法、特にゲノム
ライブラリーを調製しそしてプロープし、クローンを配
列し、欠失分析を行い、発現ベクターを構築し、細胞を
形質転換し、培養で細胞を成長させるなどの手法は、当
業者に周知であり、そしてこれらの手法を記述している
実験室のマニュアルは入手可能である。従って、本発明
は、他に指示していない限り、当業者の技能の内にある
分子生物学、微生物学、細胞培養及び組換えDNAの従来
の手法を使用する。有用な実験室のマニュアルは、Samb
rookら、（1989）Molecular Cloning、Ａ Laboratory
Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory
Press、Cold Spring Harbor、NY及びMillerら、（1
987）Gene Transfer Vectors for Mammalian Cell
s、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold
Spring Harbor、NYを含む。
ライブラリーを調製しそしてプロープし、クローンを配
列し、欠失分析を行い、発現ベクターを構築し、細胞を
形質転換し、培養で細胞を成長させるなどの手法は、当
業者に周知であり、そしてこれらの手法を記述している
実験室のマニュアルは入手可能である。従って、本発明
は、他に指示していない限り、当業者の技能の内にある
分子生物学、微生物学、細胞培養及び組換えDNAの従来
の手法を使用する。有用な実験室のマニュアルは、Samb
rookら、（1989）Molecular Cloning、Ａ Laboratory
Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory
Press、Cold Spring Harbor、NY及びMillerら、（1
987）Gene Transfer Vectors for Mammalian Cell
s、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold
Spring Harbor、NYを含む。
以下の一般的な規定は、本発明に適用される。本発明
の種々の態様に関するさらに詳しい規定もここに提供さ
れる。
の種々の態様に関するさらに詳しい規定もここに提供さ
れる。
ここに使用される用語「ポリヌクレオチド」又は「核
酸」は、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドの
何れかの任意の長さのヌクレオチドの重合体の形に関す
る。この用語は、分子の一次構造にのみ関する。それ
故、この用語は、二本鎖及び一本鎖のDNA、並びに二本
鎖及び一本鎖のRNAを含む。それは、又周知のタイプの
修飾、例えば、当業者により知られているラベル、メチ
レーション、「キャップ」、アナログによる天然のヌク
レオチドの１種又はそれ以上の置換、インターヌクレオ
チド修飾例えば未荷電結合（例えばメチルホスホネー
ト、ホスホトリエステル、ホスルホアミデート、カルバ
メートなど）及び荷電結合（例えばホスホロチオエー
ト、ホスホロジチオエートなど）によるもの、インター
カレーター（例えばアクリジン、プソラレンなど）によ
るもの、キレート剤（例えば金属、放射能金属、ホウ
素、酸性性金属など）を含むもの、アルキル化剤を含む
もの、修飾された結合（例えばアルファ芳香族核酸な
ど）によるもの、並びに未修飾された形のポリヌクレオ
チドを含む。
酸」は、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドの
何れかの任意の長さのヌクレオチドの重合体の形に関す
る。この用語は、分子の一次構造にのみ関する。それ
故、この用語は、二本鎖及び一本鎖のDNA、並びに二本
鎖及び一本鎖のRNAを含む。それは、又周知のタイプの
修飾、例えば、当業者により知られているラベル、メチ
レーション、「キャップ」、アナログによる天然のヌク
レオチドの１種又はそれ以上の置換、インターヌクレオ
チド修飾例えば未荷電結合（例えばメチルホスホネー
ト、ホスホトリエステル、ホスルホアミデート、カルバ
メートなど）及び荷電結合（例えばホスホロチオエー
ト、ホスホロジチオエートなど）によるもの、インター
カレーター（例えばアクリジン、プソラレンなど）によ
るもの、キレート剤（例えば金属、放射能金属、ホウ
素、酸性性金属など）を含むもの、アルキル化剤を含む
もの、修飾された結合（例えばアルファ芳香族核酸な
ど）によるもの、並びに未修飾された形のポリヌクレオ
チドを含む。
ここで使用されるとき、指定された配列から「由来す
る」ポリヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列
の領域に対応する大体少なくとも約６個のヌクレオチ
ド、好ましくは少なくとも約８個のヌクレオチド、さら
に好ましくは少なくとも約10−12個のヌクレオチド、そ
してさらにより好ましくは少なくとも約15−20個のヌク
レオチドの配列よりなるポリヌクレオチド配列に関す
る。「対応する」は、指定された配列に相同的又は相補
的であることを意味する。好ましくは、ポリヌクレオチ
ドが由来する領域の配列は、ヒトTGエーゼＩ遺伝子にユ
ニークな配列に相同的又は相補的である。配列がヒトTG
エーゼＩ遺伝子にユニークであるかどうかは、当業者に
周知の手法により決定できる。例えば、配列は、従来の
コンピュータープログラムを使用して周知の配列に対す
るユニークさ及び関連性を決定するために、データーバ
ンク例えばGenebankの配列と比較できる。由来した配列
の他の配列への対応性又は非対応性は、又適切な緊縮を
条件下のハイブリッド形成により決定できる。核酸の配
列の相補性を決定するためのハイブリッド形成の手法
は、当業者にとり周知である。又、例えばSambrookら、
（1989）参照。さらに、ハイブリッド形成により形成さ
れた複式ポリヌクレオチドのミスマッチは、周知の手法
により決定でき、それは、例えば複式ポリヌクレオチド
の一本鎖領域を特に消化するヌクレアーゼ例えばS1によ
る消化を含む。代表的なDNA配列が「由来する」領域
は、例えば特定の調節要素をエンコードする領域、並び
に非転写及び／又は非翻訳領域を含むが、これらに限定
されない。
る」ポリヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列
の領域に対応する大体少なくとも約６個のヌクレオチ
ド、好ましくは少なくとも約８個のヌクレオチド、さら
に好ましくは少なくとも約10−12個のヌクレオチド、そ
してさらにより好ましくは少なくとも約15−20個のヌク
レオチドの配列よりなるポリヌクレオチド配列に関す
る。「対応する」は、指定された配列に相同的又は相補
的であることを意味する。好ましくは、ポリヌクレオチ
ドが由来する領域の配列は、ヒトTGエーゼＩ遺伝子にユ
ニークな配列に相同的又は相補的である。配列がヒトTG
エーゼＩ遺伝子にユニークであるかどうかは、当業者に
周知の手法により決定できる。例えば、配列は、従来の
コンピュータープログラムを使用して周知の配列に対す
るユニークさ及び関連性を決定するために、データーバ
ンク例えばGenebankの配列と比較できる。由来した配列
の他の配列への対応性又は非対応性は、又適切な緊縮を
条件下のハイブリッド形成により決定できる。核酸の配
列の相補性を決定するためのハイブリッド形成の手法
は、当業者にとり周知である。又、例えばSambrookら、
（1989）参照。さらに、ハイブリッド形成により形成さ
れた複式ポリヌクレオチドのミスマッチは、周知の手法
により決定でき、それは、例えば複式ポリヌクレオチド
の一本鎖領域を特に消化するヌクレアーゼ例えばS1によ
る消化を含む。代表的なDNA配列が「由来する」領域
は、例えば特定の調節要素をエンコードする領域、並び
に非転写及び／又は非翻訳領域を含むが、これらに限定
されない。
由来したポリヌクレオチドは、示されたヌクレオチド
の配列から物理的に必ずしも由来する必要はなく、例え
ば化学的合成、又はDNA複製又は逆転写又は転写を含む
任意のやり方で生ずる。さらに、指定した配列のそれに
対応する領域の組合せは、目的とする用途と一致するよ
うに、当業者に周知のやり方で修飾できる。
の配列から物理的に必ずしも由来する必要はなく、例え
ば化学的合成、又はDNA複製又は逆転写又は転写を含む
任意のやり方で生ずる。さらに、指定した配列のそれに
対応する領域の組合せは、目的とする用途と一致するよ
うに、当業者に周知のやり方で修飾できる。
ここで使用されるとき、用語「組換え核酸」は、その
起源又は操作により、（１）それが天然で結合している
ポリヌクレオチドの全部又は一部と結合していないか、
（２）それが天然で結合しているそれより以外のポリヌ
クレオチドに結合するか又は（３）天然に生じない、ゲ
ノム性、半合成性又は合成性の起源の核酸を意味する。
起源又は操作により、（１）それが天然で結合している
ポリヌクレオチドの全部又は一部と結合していないか、
（２）それが天然で結合しているそれより以外のポリヌ
クレオチドに結合するか又は（３）天然に生じない、ゲ
ノム性、半合成性又は合成性の起源の核酸を意味する。
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細
胞系」、「細胞培養」及び単細胞全体として培養される
微生物又は高級の真核細胞系を示す他の用語は、組換え
発現ベクター又は他の転移DNAに対する受容体として使
用でき又は使用されてきた細胞に関し、そしてトランス
フェクションされた初めの細胞の祖先を含む。単一の親
細胞の祖先は、天然、偶然又は意図的な突然変異によ
り、元の親と形態学的に又はゲノム性又は全DNA補体で
必ずしも完全に同じでないことを理解するべきである。
胞系」、「細胞培養」及び単細胞全体として培養される
微生物又は高級の真核細胞系を示す他の用語は、組換え
発現ベクター又は他の転移DNAに対する受容体として使
用でき又は使用されてきた細胞に関し、そしてトランス
フェクションされた初めの細胞の祖先を含む。単一の親
細胞の祖先は、天然、偶然又は意図的な突然変異によ
り、元の親と形態学的に又はゲノム性又は全DNA補体で
必ずしも完全に同じでないことを理解するべきである。
「コントロール配列」、「調節要素」及び「調節領
域」は、それらが操作可能に結合している遺伝子生成物
のコーディング配列の発現を行うのに必要なポリヌクレ
オチド又は核酸の配列に関する。これらコントロール配
列の性質は、宿主生物に応じて異なり、真核生物では、
一般に、これらコントロール配列は、プロモーター、タ
ーミネーターそして多くの場合エンハンサーを含む。用
語「コントロール配列」は、最低でも、その存在が発現
に必要な全ての成分を含むことを目的としており、そし
て又その存在が有利である追加の成分、例えばリーダー
配列、並びに他の調節配列例えば本発明の調節要素のケ
ラチン生成細胞特異的発現、カルシウム応答能力及びレ
チノイン酸応答能力をもたらす配列を含む。
域」は、それらが操作可能に結合している遺伝子生成物
のコーディング配列の発現を行うのに必要なポリヌクレ
オチド又は核酸の配列に関する。これらコントロール配
列の性質は、宿主生物に応じて異なり、真核生物では、
一般に、これらコントロール配列は、プロモーター、タ
ーミネーターそして多くの場合エンハンサーを含む。用
語「コントロール配列」は、最低でも、その存在が発現
に必要な全ての成分を含むことを目的としており、そし
て又その存在が有利である追加の成分、例えばリーダー
配列、並びに他の調節配列例えば本発明の調節要素のケ
ラチン生成細胞特異的発現、カルシウム応答能力及びレ
チノイン酸応答能力をもたらす配列を含む。
「操作可能に結合した」は、遺伝子生成物に関するコ
ーディング配列と、配列要素、調節要素、コントロール
配列などとの結合に関し、その際、そのように記述され
た成分は、それらがそれらの目的とするやり方で機能す
るような関係で、互いに結合する。コーディング配列に
「操作可能に結合した」コントロール配列は、コーディ
ング配列の発現がコントロール配列と両立可能な条件下
で達成されるようなやり方で連結される。特に、必要と
され又は望まれる本発明の調節要素は、概して、遺伝子
生成物のコーディング配列に結合して、選択された調節
要素の機能（可能性）と一致するその遺伝子生成物のコ
ントロールされた発現を達成する。
ーディング配列と、配列要素、調節要素、コントロール
配列などとの結合に関し、その際、そのように記述され
た成分は、それらがそれらの目的とするやり方で機能す
るような関係で、互いに結合する。コーディング配列に
「操作可能に結合した」コントロール配列は、コーディ
ング配列の発現がコントロール配列と両立可能な条件下
で達成されるようなやり方で連結される。特に、必要と
され又は望まれる本発明の調節要素は、概して、遺伝子
生成物のコーディング配列に結合して、選択された調節
要素の機能（可能性）と一致するその遺伝子生成物のコ
ントロールされた発現を達成する。
「コード配列（コーディング配列）」は、適切な調節
配列のコントロールの下に置かれたとき、mRNAに転写さ
れる及び／又はポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオ
チド配列である。コーディング配列は、遺伝子生成物を
エンコードする。コーディング配列の境界は、5'−末端
の翻訳開始コドン並びに3'−末端の翻訳停止コドンによ
り決定される。コーディング配列は、mRNA、cDNA、及び
ポリヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されず、任
意にイントロンを含むことができる。
配列のコントロールの下に置かれたとき、mRNAに転写さ
れる及び／又はポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオ
チド配列である。コーディング配列は、遺伝子生成物を
エンコードする。コーディング配列の境界は、5'−末端
の翻訳開始コドン並びに3'−末端の翻訳停止コドンによ
り決定される。コーディング配列は、mRNA、cDNA、及び
ポリヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されず、任
意にイントロンを含むことができる。
「形質転換」は、ここで使用されるとき、挿入に使用
される方法に関係なく、宿主細胞中への外来性ポリヌク
レオチド又は組換え核酸の挿入、例えば直接取込み、脂
質介在トランスフェクション、トランスフェクション、
導入、ｆ−交配、又はエレクトロポレーションに関す
る。外来性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター例
えばプラスミドとして維持されるか、又は別に、宿主ゲ
ノム中に組み込まれる。
される方法に関係なく、宿主細胞中への外来性ポリヌク
レオチド又は組換え核酸の挿入、例えば直接取込み、脂
質介在トランスフェクション、トランスフェクション、
導入、ｆ−交配、又はエレクトロポレーションに関す
る。外来性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター例
えばプラスミドとして維持されるか、又は別に、宿主ゲ
ノム中に組み込まれる。
ここで使用されるとき、用語「プローブ」は、標的領
域の配列とプローブの少なくとも一つの配列との相補性
により、核酸の標的配列の配列とハイブリッド構造を形
成するポリヌクレオチドに関する。
域の配列とプローブの少なくとも一つの配列との相補性
により、核酸の標的配列の配列とハイブリッド構造を形
成するポリヌクレオチドに関する。
従って、本発明は、ヒトTGエーゼＩ遺伝子のプロモー
ター領域からの転写調節要素に関する。これらの要素
は、ヒトTGエーゼＩ遺伝子のゲノムクローンから同定さ
れそして特性を求められた。ゲノムクローンを得るため
に、ヒトゲノムライブラリーが、ヒトTGエーゼＩのcDNA
配列から由来するオリゴヌクレオチドプローブ又は本発
明により提供されるゲノム配列を使用して、スクリーニ
ングされる。cDNA配列は、例えば「背景技術」に示され
たようなPolakowskaら、（1991）及びその他により提供
される。ヒトゲノムDNAライブラリーは、市販されてい
るか又は標準の方法を使用して構築できる。DNAライブ
ラリーは、Sambrookらにより提供される二三のやり方の
任意のものを使用してプローブできる。
ター領域からの転写調節要素に関する。これらの要素
は、ヒトTGエーゼＩ遺伝子のゲノムクローンから同定さ
れそして特性を求められた。ゲノムクローンを得るため
に、ヒトゲノムライブラリーが、ヒトTGエーゼＩのcDNA
配列から由来するオリゴヌクレオチドプローブ又は本発
明により提供されるゲノム配列を使用して、スクリーニ
ングされる。cDNA配列は、例えば「背景技術」に示され
たようなPolakowskaら、（1991）及びその他により提供
される。ヒトゲノムDNAライブラリーは、市販されてい
るか又は標準の方法を使用して構築できる。DNAライブ
ラリーは、Sambrookらにより提供される二三のやり方の
任意のものを使用してプローブできる。
ヒトTGエーゼＩに関するゲノム遺伝子の制限マップ
は、図１に提供される。この図は、約14kbの領域に及ぶ
14個のイントロン及び15個のエキソンを含むヒトTGエー
ゼＩ遺伝子のイントロン−エキソン構造を示す。本発明
により提供される、転写調節領域即ちヒトTGエーゼＩ遺
伝子のプロモーター領域は、この遺伝子の5'末端に存在
し、そして転写開始部位に対する5'位置する配列（配列
の約930bpまで）、TATAボックス、転写開始部位（CAP部
位）、第一のエキソンによる5'−未翻訳領域、並びに第
一のイントロンを含む。このプロモーター領域の配列及
びエキソンIIの一部は、配列番号１（SEQID NO:1）で
提供される。表１は、ヒトTGエーゼＩプロモーター領域
並びに選択された制限部位の種々の特徴を同定する。
は、図１に提供される。この図は、約14kbの領域に及ぶ
14個のイントロン及び15個のエキソンを含むヒトTGエー
ゼＩ遺伝子のイントロン−エキソン構造を示す。本発明
により提供される、転写調節領域即ちヒトTGエーゼＩ遺
伝子のプロモーター領域は、この遺伝子の5'末端に存在
し、そして転写開始部位に対する5'位置する配列（配列
の約930bpまで）、TATAボックス、転写開始部位（CAP部
位）、第一のエキソンによる5'−未翻訳領域、並びに第
一のイントロンを含む。このプロモーター領域の配列及
びエキソンIIの一部は、配列番号１（SEQID NO:1）で
提供される。表１は、ヒトTGエーゼＩプロモーター領域
並びに選択された制限部位の種々の特徴を同定する。
ａ エキソンIIの全配列は提供されていない。
ｂ 直接関係のあるNla III部位のみが同定される。
ヒトTGエーゼＩプロモーター領域は、配列番号１（SE
Q ID NO:1）のヌクレオチド１−1757により提供され
る。このフラグメントは、少なくとも一つのケラチン生
成細胞特異的調節要素、少なくとも一つのCa応答調節要
素及び少なくとも一つのRA応答調節要素を含む。ケラチ
ン生成細胞特異的調節要素は、このフラグメント、BamH
Iフラグメント及びNla III−194フラグメントが、ケラ
チン生成細胞に比較したとき繊維芽細胞で低いプロモー
ター活性を示すことに基づいて同定された。
Q ID NO:1）のヌクレオチド１−1757により提供され
る。このフラグメントは、少なくとも一つのケラチン生
成細胞特異的調節要素、少なくとも一つのCa応答調節要
素及び少なくとも一つのRA応答調節要素を含む。ケラチ
ン生成細胞特異的調節要素は、このフラグメント、BamH
Iフラグメント及びNla III−194フラグメントが、ケラ
チン生成細胞に比較したとき繊維芽細胞で低いプロモー
ター活性を示すことに基づいて同定された。
BamH Iフラグメント（SEQ ID NO:1のヌクレオチド4
85−1093）は、少なくとも一つのケラチン生成細胞特異
的調節要素及び一つのCa応答調節要素を含む。このCa応
答調節要素は、高カルシウム（Ca+2）の存在下遺伝子発
現の正の調節をもたらす。ここで使用される高Ca+2は、
0.5mMCa+2より大きいか又はそれに等しく、そして好ま
しくは1.0mMCa+2より大きいか又はそれに等しい。従っ
て、高Ca+2は、約0.5−約5mMに及ぶ。さらに好ましく
は、高Ca+2は、約1.2mMである。
85−1093）は、少なくとも一つのケラチン生成細胞特異
的調節要素及び一つのCa応答調節要素を含む。このCa応
答調節要素は、高カルシウム（Ca+2）の存在下遺伝子発
現の正の調節をもたらす。ここで使用される高Ca+2は、
0.5mMCa+2より大きいか又はそれに等しく、そして好ま
しくは1.0mMCa+2より大きいか又はそれに等しい。従っ
て、高Ca+2は、約0.5−約5mMに及ぶ。さらに好ましく
は、高Ca+2は、約1.2mMである。
Hind IIIフラグメント（SEQ ID NO:1のヌクレオチ
ド616−1574）は、カルシウム及びレチノイン酸の応答
性を阻害する負の調節要素を含む。
ド616−1574）は、カルシウム及びレチノイン酸の応答
性を阻害する負の調節要素を含む。
Nla III−194フラグメント（SEQ ID NO:1のヌクレ
オチド1563−1760）は、少なくとも一つのケラチン生成
細胞特異的調節要素、少なくとも一つのCa応答調節要素
及び少なくとも一つのRA応答調節要素を含む。遺伝子の
発現をコントロールできるレチノイン酸のレベルは、約
10-7−約10-5M、好ましくは約10-6Mである。これらのCa
及びRA応答調節要素は、遺伝子発現の負の調節ができ
る。Ca+2について、この負の調節は、上記の高Ca+2の存
在下で明らかである。
オチド1563−1760）は、少なくとも一つのケラチン生成
細胞特異的調節要素、少なくとも一つのCa応答調節要素
及び少なくとも一つのRA応答調節要素を含む。遺伝子の
発現をコントロールできるレチノイン酸のレベルは、約
10-7−約10-5M、好ましくは約10-6Mである。これらのCa
及びRA応答調節要素は、遺伝子発現の負の調節ができ
る。Ca+2について、この負の調節は、上記の高Ca+2の存
在下で明らかである。
ここで使用されるとき、「ケラチン生成細胞特異的調
節要素」は、そのコントロールの下遺伝子生成物の発現
をケラチン生成細胞に生じさせることのできるポリヌク
レオチド配列に関する。例えば、ケラチン生成細胞特異
的調節要素は、繊維芽細胞において発現を導かない。遺
伝子生成物は、発現が開始されるときケラチン生成細胞
に存在し、そしてケラチン生成細胞特異的調節要素は、
正のやり方でこの発現をコントロールする。ケラチン生
成細胞特異的調節要素が、負のやり方で発現をコントロ
ールするとき、遺伝子生成物は、ケラチン生成細胞から
存在しないか、又は遺伝子生成物のレベルが低下してい
るかの何れかである。
節要素」は、そのコントロールの下遺伝子生成物の発現
をケラチン生成細胞に生じさせることのできるポリヌク
レオチド配列に関する。例えば、ケラチン生成細胞特異
的調節要素は、繊維芽細胞において発現を導かない。遺
伝子生成物は、発現が開始されるときケラチン生成細胞
に存在し、そしてケラチン生成細胞特異的調節要素は、
正のやり方でこの発現をコントロールする。ケラチン生
成細胞特異的調節要素が、負のやり方で発現をコントロ
ールするとき、遺伝子生成物は、ケラチン生成細胞から
存在しないか、又は遺伝子生成物のレベルが低下してい
るかの何れかである。
ケラチン生成細胞は、二三の皮膚細胞の一つであり、
即ち、表皮を生成できる細胞である。ここで使用される
とき、「ケラチン生成細胞」は、胎児皮膚ケラチン生成
細胞、新生児皮膚ケラチン生成細胞、及び成人ケラチン
生成細胞の一次培養を含む、全ての増殖及び／又は分化
表皮細胞である。その上、ここで使用されるとき、「ケ
ラチン生成細胞」は、さらに特殊化した分化性を有する
上皮ケラチン生成細胞であるが、特徴的なケラチン生成
細胞遺伝子、特にケラチン遺伝子及びトランスグルタミ
ナーゼを発現するケラチン生成細胞様細胞を含む。上皮
ケラチン生成細胞は、咽頭、中咽頭、口、舌、気管、気
管支上皮、結膜、角膜、膣、頚を含む特殊化された上皮
のケラチン生成細胞であり、そしてさらにこれらの特殊
化された上皮からの正常及び悪性の両方のケラチン生成
細胞様細胞を含む。さらに、「ケラチン生成細胞」は、
腫瘍性又は形質転換した表皮細胞を含む組織培養で成長
を継続できる表皮細胞（即ち確立された培養細胞）を含
む。一次細胞系は、乾燥又は形質転換の実施の何れかの
前に１回乃至数回から確立された培養細胞系に培養中で
通過した細胞を含む。
即ち、表皮を生成できる細胞である。ここで使用される
とき、「ケラチン生成細胞」は、胎児皮膚ケラチン生成
細胞、新生児皮膚ケラチン生成細胞、及び成人ケラチン
生成細胞の一次培養を含む、全ての増殖及び／又は分化
表皮細胞である。その上、ここで使用されるとき、「ケ
ラチン生成細胞」は、さらに特殊化した分化性を有する
上皮ケラチン生成細胞であるが、特徴的なケラチン生成
細胞遺伝子、特にケラチン遺伝子及びトランスグルタミ
ナーゼを発現するケラチン生成細胞様細胞を含む。上皮
ケラチン生成細胞は、咽頭、中咽頭、口、舌、気管、気
管支上皮、結膜、角膜、膣、頚を含む特殊化された上皮
のケラチン生成細胞であり、そしてさらにこれらの特殊
化された上皮からの正常及び悪性の両方のケラチン生成
細胞様細胞を含む。さらに、「ケラチン生成細胞」は、
腫瘍性又は形質転換した表皮細胞を含む組織培養で成長
を継続できる表皮細胞（即ち確立された培養細胞）を含
む。一次細胞系は、乾燥又は形質転換の実施の何れかの
前に１回乃至数回から確立された培養細胞系に培養中で
通過した細胞を含む。
ケラチン生成細胞特異的発現を導く調節要素を同定す
るために、ヒトTGエーゼ１プロモーター領域の欠失分析
が行われる。欠失分析は、マーカー遺伝子に操作可能に
結合したポリヌクレオチド配列即ちプロモーター領域の
部分を有するベクターを構築することを含む。これらの
ベクターは、次にケラチン生成細胞におけるマーカー遺
伝子の発現を導くが、他の細胞のタイプ例えば繊維芽細
胞ではそうではない能力についてアッセイされる。この
やり方では、プロモーター領域のポリヌクレオチド配列
は、ケラチン生成細胞特異的調節要素を同定するために
調べられる。これらのポリヌクレオチド配列は、ヒトTG
エーゼＩプロモーター領域からであり、そして制限フラ
グメント、合成オリゴヌクレオチド、エキソヌクレアー
ゼ例えばBa131による酵素的消化により生ずるフラグメ
ント、これらのフラグメントの任意の組合せ、又は当業
者における従来の手段により得られるヒトTGエーゼＩプ
ロモーター領域の任意のフラグメントからなる。同様
に、一度ケラチン生成細胞特異的調節要素が同定されそ
して特徴が分ると、これらの要素は、又ケラチン生成細
胞特異的発現を行う別のポリヌクレオチド配列を同定す
るために、ヌクレオチドを置換、挿入、欠失又は転換す
ることにより、修飾できる。これらの修飾された調節要
素は、部位特異的突然変異誘発により、Ba131を使用す
る欠失により又は他の従来の手段により好都合に作ら
れ、そして次にマーカー遺伝子を使用してケラチン生成
細胞特異的発現についてアッセイされる。
るために、ヒトTGエーゼ１プロモーター領域の欠失分析
が行われる。欠失分析は、マーカー遺伝子に操作可能に
結合したポリヌクレオチド配列即ちプロモーター領域の
部分を有するベクターを構築することを含む。これらの
ベクターは、次にケラチン生成細胞におけるマーカー遺
伝子の発現を導くが、他の細胞のタイプ例えば繊維芽細
胞ではそうではない能力についてアッセイされる。この
やり方では、プロモーター領域のポリヌクレオチド配列
は、ケラチン生成細胞特異的調節要素を同定するために
調べられる。これらのポリヌクレオチド配列は、ヒトTG
エーゼＩプロモーター領域からであり、そして制限フラ
グメント、合成オリゴヌクレオチド、エキソヌクレアー
ゼ例えばBa131による酵素的消化により生ずるフラグメ
ント、これらのフラグメントの任意の組合せ、又は当業
者における従来の手段により得られるヒトTGエーゼＩプ
ロモーター領域の任意のフラグメントからなる。同様
に、一度ケラチン生成細胞特異的調節要素が同定されそ
して特徴が分ると、これらの要素は、又ケラチン生成細
胞特異的発現を行う別のポリヌクレオチド配列を同定す
るために、ヌクレオチドを置換、挿入、欠失又は転換す
ることにより、修飾できる。これらの修飾された調節要
素は、部位特異的突然変異誘発により、Ba131を使用す
る欠失により又は他の従来の手段により好都合に作ら
れ、そして次にマーカー遺伝子を使用してケラチン生成
細胞特異的発現についてアッセイされる。
マーカー遺伝子は、CAT遺伝子、β−グルクロニダー
ゼ（GUS）、β−ガラクトシダーゼ（β−gal）などを含
む。これらの遺伝子は、当業者にとり周知の従来の手段
によりアッセイされ、それらは、酵素的活性、組織化学
的局在、免疫アッセイ、比色アッセイ及び蛍光を含む。
アッセイは、ケラチン生成細胞特異的発現を評価するた
めに定量及び定性に基づいて行うことができる。
ゼ（GUS）、β−ガラクトシダーゼ（β−gal）などを含
む。これらの遺伝子は、当業者にとり周知の従来の手段
によりアッセイされ、それらは、酵素的活性、組織化学
的局在、免疫アッセイ、比色アッセイ及び蛍光を含む。
アッセイは、ケラチン生成細胞特異的発現を評価するた
めに定量及び定性に基づいて行うことができる。
本発明のケラチン生成細胞特異的調節要素は、SEQ I
D NO:1のヌクレオチド１−1757により提供されるヒトT
GエーゼＩプロモーター領域で存在し、SEQ ID NO:1の
ヌクレオチド485−1093により提供されるBamH Iフラグ
メントによりそしてSEQ ID NO:1のヌクレオチド1563
−1760により提供されるNla III−194フラグメントによ
り存在する。
D NO:1のヌクレオチド１−1757により提供されるヒトT
GエーゼＩプロモーター領域で存在し、SEQ ID NO:1の
ヌクレオチド485−1093により提供されるBamH Iフラグ
メントによりそしてSEQ ID NO:1のヌクレオチド1563
−1760により提供されるNla III−194フラグメントによ
り存在する。
ここで使用されるとき、「Ca応答調節要素」は、その
コントロールの下遺伝子生成物の発現を生じさせて高カ
ルシウムに応答することのできるポリヌクレオチド配列
に関する。高カルシウムへの応答性は、遺伝子生成物の
正又は負の何れかの調節を行うことができる。コントロ
ールが正のやり方で生ずるとき、高カルシウムの存在
は、遺伝子の発現を刺激する。コントロールが負のやり
方で生ずるとき、高カルシウムの存在は、遺伝子の発現
を阻害する。
コントロールの下遺伝子生成物の発現を生じさせて高カ
ルシウムに応答することのできるポリヌクレオチド配列
に関する。高カルシウムへの応答性は、遺伝子生成物の
正又は負の何れかの調節を行うことができる。コントロ
ールが正のやり方で生ずるとき、高カルシウムの存在
は、遺伝子の発現を刺激する。コントロールが負のやり
方で生ずるとき、高カルシウムの存在は、遺伝子の発現
を阻害する。
Ca応答調節要素を同定するために、ヒトTGエーゼＩプ
ロモーター領域の欠失の分析は、ケラチン生成細胞特異
的調節要素を同定するのに記載されたのと同様なやり方
で行われる。しかし、分析は、ベクターが、高カルシウ
ムに応じてマーカー遺伝子の発現を導く能力について分
析することで異なる。高カルシウムは、上記で規定され
た通りである。その上、これらのアッセイは、必ずしも
ケラチン生成細胞に制限されるばかりでなく、任意の好
都合な細胞のタイプで行うことができる。
ロモーター領域の欠失の分析は、ケラチン生成細胞特異
的調節要素を同定するのに記載されたのと同様なやり方
で行われる。しかし、分析は、ベクターが、高カルシウ
ムに応じてマーカー遺伝子の発現を導く能力について分
析することで異なる。高カルシウムは、上記で規定され
た通りである。その上、これらのアッセイは、必ずしも
ケラチン生成細胞に制限されるばかりでなく、任意の好
都合な細胞のタイプで行うことができる。
本発明のCa応答調節要素は、SEQ ID NO:1のヌクレ
オチド１−1757により提供されるヒトTGエーゼＩプロモ
ーター領域で存在する。BamH Iフラグメント（SEQ ID
NO:1のヌクレオチド485−1093）は、遺伝子発現の正
の調節を行うCa応答調節要素を提供する。Hind IIIフラ
グメント（ヌクレオチド616−1574）は、Nla III−194
フラグメントの調節コントロールをオーバーライドする
（即ち支配的である）負の調節要素を含む。
オチド１−1757により提供されるヒトTGエーゼＩプロモ
ーター領域で存在する。BamH Iフラグメント（SEQ ID
NO:1のヌクレオチド485−1093）は、遺伝子発現の正
の調節を行うCa応答調節要素を提供する。Hind IIIフラ
グメント（ヌクレオチド616−1574）は、Nla III−194
フラグメントの調節コントロールをオーバーライドする
（即ち支配的である）負の調節要素を含む。
ここで使用されるとき、「RA応答調節要素」は、その
コントロールの下遺伝子生成物の発現を生じさせてレチ
ノイン酸に応答することのできるポリヌクレオチド配列
に関する。レチノイン酸への応答性は、遺伝子生成物の
正又は負の何れかの調節を行うことができる。コントロ
ールが正のやり方で生ずるとき、レチノイン酸の存在
は、遺伝子の発現を刺激する。コントロールが負のやり
方で生ずるとき、レチノイン酸の存在は、遺伝子の発現
を阻害する。同様に、レチノイン酸への応答は、高カル
シウムの存在で調べられ、そして或る条件下では、高カ
ルシウムの存在下のみで生じ、即ちレチノイン酸応答調
節要素は、高カルシウムの存在下で活性（操作可能）で
あるに過ぎなかった。
コントロールの下遺伝子生成物の発現を生じさせてレチ
ノイン酸に応答することのできるポリヌクレオチド配列
に関する。レチノイン酸への応答性は、遺伝子生成物の
正又は負の何れかの調節を行うことができる。コントロ
ールが正のやり方で生ずるとき、レチノイン酸の存在
は、遺伝子の発現を刺激する。コントロールが負のやり
方で生ずるとき、レチノイン酸の存在は、遺伝子の発現
を阻害する。同様に、レチノイン酸への応答は、高カル
シウムの存在で調べられ、そして或る条件下では、高カ
ルシウムの存在下のみで生じ、即ちレチノイン酸応答調
節要素は、高カルシウムの存在下で活性（操作可能）で
あるに過ぎなかった。
RA応答調節要素を同定するために、ヒトTGエーゼＩプ
ロモーター領域の欠失の分析が、ケラチン生成細胞特異
的調節要素を同定するのに記載されたのと同様なやり方
で行われる。しかし、分析は、ベクターが、レチノイン
酸に応じてマーカー遺伝子の発現を導く能力について分
析することで異なる。レチノイン酸の量は、上記で規定
された通りである。これらのアッセイは、必ずしもケラ
チン生成細胞に制限されるばかりでなく、任意の好都合
な細胞のタイプでしかも高カルシウムの存在又は不存在
で行うことができる。
ロモーター領域の欠失の分析が、ケラチン生成細胞特異
的調節要素を同定するのに記載されたのと同様なやり方
で行われる。しかし、分析は、ベクターが、レチノイン
酸に応じてマーカー遺伝子の発現を導く能力について分
析することで異なる。レチノイン酸の量は、上記で規定
された通りである。これらのアッセイは、必ずしもケラ
チン生成細胞に制限されるばかりでなく、任意の好都合
な細胞のタイプでしかも高カルシウムの存在又は不存在
で行うことができる。
本発明のRA応答調節要素は、SEQ ID NO:1のヌクレ
オチド１−1757により提供されるヒトTGエーゼＩプロモ
ーター領域で存在する。Nal III−194フラグメント（SE
Q ID NO:1のヌクレオチド1563−1760）は、高カルシ
ウムの存在下遺伝子の発現の負の調節を行うRA応答調節
要素を提供する。Hind IIIフラグメント（ヌクレオチド
616−1574）は、Nla III−194フラグメントの調節コン
トロールを排除（即ちオーバーライドする）負の調節要
素を含む。
オチド１−1757により提供されるヒトTGエーゼＩプロモ
ーター領域で存在する。Nal III−194フラグメント（SE
Q ID NO:1のヌクレオチド1563−1760）は、高カルシ
ウムの存在下遺伝子の発現の負の調節を行うRA応答調節
要素を提供する。Hind IIIフラグメント（ヌクレオチド
616−1574）は、Nla III−194フラグメントの調節コン
トロールを排除（即ちオーバーライドする）負の調節要
素を含む。
本発明の他の態様は、遺伝子生成物をエンコードする
DNAへ操作可能に結合した調節領域及び要素を有する複
製可能な発現ベクター、並びにこれらベクターを含む宿
主細胞を提供する。これらの遺伝子生成物は、ヒトTGエ
ーゼＩ、ヒトケラチン生成細胞特異的遺伝子例えば酸性
及び塩基性のケラチンを含むケラチン、マーカー遺伝
子、又は任意の他の外来性の遺伝子生成物である。マー
カー遺伝子は、CAT、GUS、β−galなどを含む。外来性
遺伝子生成物は、本発明の調節要素のコントロールの下
発現が望まれる外来のDNA（ヒトTGエーゼＩ遺伝子に関
して）をエンコードした生成物である。外来性遺伝子生
成物の例は、上皮又は表皮の疾患の治療のための蛋白、
薬理学的剤として治療効果を強化する蛋白などを含む。
これらの外来性蛋白は、個々に又は組み合わされて、イ
ンターフェロン（α、β又はγ）、IL−１α及びIL−１
βを含むインターロイキン（IL1−９）、コロニー刺激
因子（GM−CSF、Ｇ−CSF、Ｍ−CSF、及びIL−３）、レ
チノイン酸受容体（α、β、γ）、ステロイドホルモン
受容体、ビタミンＤ受容体、嚢胞性繊維症膜透過受容体
蛋白（CFTR）、エピデルマリシン及び表皮蛋白ケラチ
ン、フィラグリン及びロリクリンを含む。同様に、外来
性蛋白は、細胞生物を修飾して製薬上活性な剤を生ずる
ことのできる酵素を含むことができる。
DNAへ操作可能に結合した調節領域及び要素を有する複
製可能な発現ベクター、並びにこれらベクターを含む宿
主細胞を提供する。これらの遺伝子生成物は、ヒトTGエ
ーゼＩ、ヒトケラチン生成細胞特異的遺伝子例えば酸性
及び塩基性のケラチンを含むケラチン、マーカー遺伝
子、又は任意の他の外来性の遺伝子生成物である。マー
カー遺伝子は、CAT、GUS、β−galなどを含む。外来性
遺伝子生成物は、本発明の調節要素のコントロールの下
発現が望まれる外来のDNA（ヒトTGエーゼＩ遺伝子に関
して）をエンコードした生成物である。外来性遺伝子生
成物の例は、上皮又は表皮の疾患の治療のための蛋白、
薬理学的剤として治療効果を強化する蛋白などを含む。
これらの外来性蛋白は、個々に又は組み合わされて、イ
ンターフェロン（α、β又はγ）、IL−１α及びIL−１
βを含むインターロイキン（IL1−９）、コロニー刺激
因子（GM−CSF、Ｇ−CSF、Ｍ−CSF、及びIL−３）、レ
チノイン酸受容体（α、β、γ）、ステロイドホルモン
受容体、ビタミンＤ受容体、嚢胞性繊維症膜透過受容体
蛋白（CFTR）、エピデルマリシン及び表皮蛋白ケラチ
ン、フィラグリン及びロリクリンを含む。同様に、外来
性蛋白は、細胞生物を修飾して製薬上活性な剤を生ずる
ことのできる酵素を含むことができる。
ベクターの構築は、当業者に周知の手法を使用する。
部位特異的DNA開裂は、市販されている酵素の製造者に
より一般に特定されている条件下好適な制限酵素により
DNAを処理することにより行われる。一般に、約１ミク
ロｇのプラスミド又はDNA配列は、37℃で１−２時間の
インキュベーションにより約20ミクロＬの緩衝溶液中の
１単位の酵素により開裂される。制限酵素によるインキ
ュベーション後、蛋白は、フェノール／クロロホルム抽
出により除去でき、そしてDNAは、エタノールによる沈
殿により回収される。開裂されたフラグメントは、例え
ばMethods of Enzymology（1980）65、499−560に見
出される一般的なやり方に従って、ポリアクリルアミド
又はアガロースゲル電気泳動を使用して分離できる。
部位特異的DNA開裂は、市販されている酵素の製造者に
より一般に特定されている条件下好適な制限酵素により
DNAを処理することにより行われる。一般に、約１ミク
ロｇのプラスミド又はDNA配列は、37℃で１−２時間の
インキュベーションにより約20ミクロＬの緩衝溶液中の
１単位の酵素により開裂される。制限酵素によるインキ
ュベーション後、蛋白は、フェノール／クロロホルム抽
出により除去でき、そしてDNAは、エタノールによる沈
殿により回収される。開裂されたフラグメントは、例え
ばMethods of Enzymology（1980）65、499−560に見
出される一般的なやり方に従って、ポリアクリルアミド
又はアガロースゲル電気泳動を使用して分離できる。
粘着性末端開裂フラグメントは、混合物に存在する適
切なデオキシヌクレオチドトリホスフェート（dNTP）の
存在下E.coliDNAポリメラーゼ１（Klenow）を使用して
平滑末端フラグメントに転換できる。別に、S1ヌクレア
ーゼによる処理は、又使用でき、任意の一本鎖DNA部分
の加水分解を生ずる。
切なデオキシヌクレオチドトリホスフェート（dNTP）の
存在下E.coliDNAポリメラーゼ１（Klenow）を使用して
平滑末端フラグメントに転換できる。別に、S1ヌクレア
ーゼによる処理は、又使用でき、任意の一本鎖DNA部分
の加水分解を生ずる。
連結反応は、T4DNAリガーゼ及びATPにより標準の緩衝
液及び温度の条件を使用して実施され、粘着性末端連結
反応は、平滑末端連結反応より少ないATP及び少ないリ
ガーゼを要する。ベクターフラグメントが連結反応の混
合物の一部として使用されるとく、ベクターフラグメン
トは、しばしば、細菌性のアルカリ性ホスファターゼ
（BAP）又はウシ腸管アルカリ性ホスファターゼにより
処理されて、5'−ホスファターゼを除き、そのためベク
ターの再連結反応を防ぐか、別に、望まないフラグメン
トの制限酵素消化を使用して連結反応を防止する。
液及び温度の条件を使用して実施され、粘着性末端連結
反応は、平滑末端連結反応より少ないATP及び少ないリ
ガーゼを要する。ベクターフラグメントが連結反応の混
合物の一部として使用されるとく、ベクターフラグメン
トは、しばしば、細菌性のアルカリ性ホスファターゼ
（BAP）又はウシ腸管アルカリ性ホスファターゼにより
処理されて、5'−ホスファターゼを除き、そのためベク
ターの再連結反応を防ぐか、別に、望まないフラグメン
トの制限酵素消化を使用して連結反応を防止する。
連結反応の混合物は、好適なクローニング宿主例えば
E.coli中に形質転換され、そして成功した形質転換体
は、例えば抗生物質抵抗性により選択され、そして正し
い構築体についてスクリーニングする。
E.coli中に形質転換され、そして成功した形質転換体
は、例えば抗生物質抵抗性により選択され、そして正し
い構築体についてスクリーニングする。
宿主細胞は、原核宿主（ベクターの構築及びテスト）
及び真核宿主（ベクターの構築及びテスト、発現及び治
療）を含む。ベクターは、適切な宿主中に形質転換によ
り導入される。
及び真核宿主（ベクターの構築及びテスト、発現及び治
療）を含む。ベクターは、適切な宿主中に形質転換によ
り導入される。
形質転換は、宿主細胞中へポリヌクレオチドを導入す
る任意の周知の方法によることができ、例えばポリヌク
レオチドをウイルスに包みそしてウイルスを宿主細胞に
導入すること、並びにポリヌクレオチド又はベクターの
直接的な取込みを含む。使用する形質転換のやり方は、
形質転換されるべき宿主に依存する。直接的な取込みに
よる細菌性形質転換は、一般に、カルシウム又は塩化ル
ビジウムによる処理を使用する。酵母の形質転換は、直
接的な取込みによる。直接的な取込みによる哺乳動物の
形質転換は、カルシウム−ホスフェート沈殿法又はその
種々の周知の修飾を使用して実施できる。形質転換の方
法は、例えばSambrookらにより提供されている。
る任意の周知の方法によることができ、例えばポリヌク
レオチドをウイルスに包みそしてウイルスを宿主細胞に
導入すること、並びにポリヌクレオチド又はベクターの
直接的な取込みを含む。使用する形質転換のやり方は、
形質転換されるべき宿主に依存する。直接的な取込みに
よる細菌性形質転換は、一般に、カルシウム又は塩化ル
ビジウムによる処理を使用する。酵母の形質転換は、直
接的な取込みによる。直接的な取込みによる哺乳動物の
形質転換は、カルシウム−ホスフェート沈殿法又はその
種々の周知の修飾を使用して実施できる。形質転換の方
法は、例えばSambrookらにより提供されている。
原核宿主は、好ましくは本発明の発現ベクターの構築
中に使用されるが、一方真核宿主細胞は、指定された宿
主と両立可能な調節配列を使用して望ましい遺伝子生成
物の発現のために使用される。原核宿主の中で、E.coli
が、最も頻繁に使用される。原核宿主と両立可能な転移
ベクターは、例えば、pBR322、アンピシリン及びテトラ
サイクリン抵抗性を与えるオペロンを含むプラスミド、
並びに抗生物質抵抗性マーカーを与える配列を又含む種
々のpUCベクターから普通由来する。これらのマーカー
は、抗生物質抵抗性に関する選択により成功する形質転
換体を得るのに使用できる。
中に使用されるが、一方真核宿主細胞は、指定された宿
主と両立可能な調節配列を使用して望ましい遺伝子生成
物の発現のために使用される。原核宿主の中で、E.coli
が、最も頻繁に使用される。原核宿主と両立可能な転移
ベクターは、例えば、pBR322、アンピシリン及びテトラ
サイクリン抵抗性を与えるオペロンを含むプラスミド、
並びに抗生物質抵抗性マーカーを与える配列を又含む種
々のpUCベクターから普通由来する。これらのマーカー
は、抗生物質抵抗性に関する選択により成功する形質転
換体を得るのに使用できる。
真核宿主は、培養系における酵母、並びにヒト表皮細
胞を含む哺乳動物の細胞を含む。Saccharomyces cerev
iciae及びSaccharomyces carisbergensisは、最も普通
に使用される酵母宿主である。酵母と両立可能なベクタ
ーは、野性タイプの菌株に重金属に対する抵抗性を与え
るか又は栄養要求性突然変異体にプロトトロフィーを与
えることにより、成功する形質転換体を選択できるマー
カーを有する。酵母のベクターに関するコントロール配
列は、当業者に周知であり、そして３−ホスホグリセレ
ートキナーゼに対するプロモーターを含む解糖酵素の合
成のためのプロモーターを含む。ターミネーターも含ま
れ、例えばエノラーゼ遺伝子から由来するものを含む。
胞を含む哺乳動物の細胞を含む。Saccharomyces cerev
iciae及びSaccharomyces carisbergensisは、最も普通
に使用される酵母宿主である。酵母と両立可能なベクタ
ーは、野性タイプの菌株に重金属に対する抵抗性を与え
るか又は栄養要求性突然変異体にプロトトロフィーを与
えることにより、成功する形質転換体を選択できるマー
カーを有する。酵母のベクターに関するコントロール配
列は、当業者に周知であり、そして３−ホスホグリセレ
ートキナーゼに対するプロモーターを含む解糖酵素の合
成のためのプロモーターを含む。ターミネーターも含ま
れ、例えばエノラーゼ遺伝子から由来するものを含む。
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物の細胞系
は、当業者にとり周知であり、そして上記のケラチン生
成細胞、並びにAmerican Type Culture Collection
（ATCC）から入手可能な多くの不死の細胞系を含み、そ
れは、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）
細胞、ベビーハムスター腎（BHK）細胞、及び多数の他
の細胞系を含む。哺乳動物の細胞のための好適なプロモ
ーターは、又当業者に周知であり、そしてウイルス性プ
ロモーター例えばサルウイルス40（SV40）、ラウス肉腫
ウイルス（RSV）、アデノウイルス（ADV）、及びウシパ
ピローマウイルス（BPV）からのものを含む。哺乳動物
の細胞は、又ターミネーター配列及びポリＡ添加配列を
必要とし、発現を増大させるエンハンサー配列も含ま
れ、そして遺伝子の拡大を生じさせる配列は、所望なら
ば含まれる。これらの配列は、当業者に周知である。哺
乳動物細胞における複製に好適なベクターは、ウイルス
のレプリコン、又は宿主ゲノム中への適切な配列の組み
込みを確実にする配列を含むことができる。
は、当業者にとり周知であり、そして上記のケラチン生
成細胞、並びにAmerican Type Culture Collection
（ATCC）から入手可能な多くの不死の細胞系を含み、そ
れは、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）
細胞、ベビーハムスター腎（BHK）細胞、及び多数の他
の細胞系を含む。哺乳動物の細胞のための好適なプロモ
ーターは、又当業者に周知であり、そしてウイルス性プ
ロモーター例えばサルウイルス40（SV40）、ラウス肉腫
ウイルス（RSV）、アデノウイルス（ADV）、及びウシパ
ピローマウイルス（BPV）からのものを含む。哺乳動物
の細胞は、又ターミネーター配列及びポリＡ添加配列を
必要とし、発現を増大させるエンハンサー配列も含ま
れ、そして遺伝子の拡大を生じさせる配列は、所望なら
ば含まれる。これらの配列は、当業者に周知である。哺
乳動物細胞における複製に好適なベクターは、ウイルス
のレプリコン、又は宿主ゲノム中への適切な配列の組み
込みを確実にする配列を含むことができる。
他の態様では、本発明は、ケラチン生成細胞特異的調
節要素のコントロールの下遺伝子生成物を発現するのに
十分な時間及び条件下で本発明の発現ベクターの一つを
含むケラチン生成細胞を培養することにより、遺伝子生
成物のケラチン生成細胞特異的発現を行う方法を提供す
る。例えば、この方法は、皮膚同等物即ちケラチン生成
細胞においてマーカー遺伝子を使用して、薬剤及び化粧
品の発現コントロールに対する効果をテストするため
に、適切なコントロールをしつつ実施できる。
節要素のコントロールの下遺伝子生成物を発現するのに
十分な時間及び条件下で本発明の発現ベクターの一つを
含むケラチン生成細胞を培養することにより、遺伝子生
成物のケラチン生成細胞特異的発現を行う方法を提供す
る。例えば、この方法は、皮膚同等物即ちケラチン生成
細胞においてマーカー遺伝子を使用して、薬剤及び化粧
品の発現コントロールに対する効果をテストするため
に、適切なコントロールをしつつ実施できる。
この態様では、ケラチン生成細胞は、本発明の発現ベ
クターにより形質転換される。これらのベクターは、少
なくとも一つの本発明のケラチン生成細胞特異的調節要
素を含み、そして任意に本発明の他の調節要素の一つ又
はそれ以上を含む。ベクターの存在のための選択後、そ
のベクターを含む細胞系は、目的のために必要とされる
発現を直ぐ得るための十分な数のケラチン生成細胞を生
ずるように拡大できる。これらのケラチン生成細胞は、
次に遺伝子生成物の発現を誘発する条件下で培養され
る。例えば、もしベクターが正のCa応答調節要素を含む
ならば、ケラチン生成細胞は、遺伝子生成物が発現する
まで、高カルシウム（例えば1.2mMCa+2）を添加した成
長培地で培養される。
クターにより形質転換される。これらのベクターは、少
なくとも一つの本発明のケラチン生成細胞特異的調節要
素を含み、そして任意に本発明の他の調節要素の一つ又
はそれ以上を含む。ベクターの存在のための選択後、そ
のベクターを含む細胞系は、目的のために必要とされる
発現を直ぐ得るための十分な数のケラチン生成細胞を生
ずるように拡大できる。これらのケラチン生成細胞は、
次に遺伝子生成物の発現を誘発する条件下で培養され
る。例えば、もしベクターが正のCa応答調節要素を含む
ならば、ケラチン生成細胞は、遺伝子生成物が発現する
まで、高カルシウム（例えば1.2mMCa+2）を添加した成
長培地で培養される。
ヒトTGエーゼＩ調節要素に対する薬剤及び化粧品の効
果をテストするために、マーカー遺伝子に操作可能に結
合した所望の調節要素を有する発現ベクターが構築され
る。これらのベクターを含むケラチン生成細胞又は皮膚
同等物は、次に遺伝子の発現を誘発する条件（使用する
調節要素と一致する条件）下であるが、又研究中の薬剤
又は化粧品の存在下で培養される。
果をテストするために、マーカー遺伝子に操作可能に結
合した所望の調節要素を有する発現ベクターが構築され
る。これらのベクターを含むケラチン生成細胞又は皮膚
同等物は、次に遺伝子の発現を誘発する条件（使用する
調節要素と一致する条件）下であるが、又研究中の薬剤
又は化粧品の存在下で培養される。
ここで使用されるとき、薬剤及び化粧品は、完全な処
方、並びにこれらの処方中の個々の成分を含む。好まし
い生成物は、皮膚、表皮又は特殊化した上皮に治療上の
利益又は治療上の利益の可能性を有する処方物、成分、
剤などを含む。同様に、この方法は、皮膚、表皮又は特
殊化した上皮に対するその生成物の有利か或は不利かの
何れかの潜在的な効果を決めるために、任意の生成物を
スクリーニングするのに使用できる。
方、並びにこれらの処方中の個々の成分を含む。好まし
い生成物は、皮膚、表皮又は特殊化した上皮に治療上の
利益又は治療上の利益の可能性を有する処方物、成分、
剤などを含む。同様に、この方法は、皮膚、表皮又は特
殊化した上皮に対するその生成物の有利か或は不利かの
何れかの潜在的な効果を決めるために、任意の生成物を
スクリーニングするのに使用できる。
本発明のさらに他の態様は、治療的量で遺伝子生成物
の組織特異的発現を行うことの可能な発現ベクターをヒ
トに投与することにより、表皮の疾患を治療するための
ヒト遺伝子治療又は薬剤伝達の方法を提供し、その際、
該発現ベクターは、遺伝子生成物をエンコードするDNA
に操作可能に結合した（ヒトタイプＩトランスグルタミ
ナーゼ遺伝子からの）本発明の転写調節領域を有する。
の組織特異的発現を行うことの可能な発現ベクターをヒ
トに投与することにより、表皮の疾患を治療するための
ヒト遺伝子治療又は薬剤伝達の方法を提供し、その際、
該発現ベクターは、遺伝子生成物をエンコードするDNA
に操作可能に結合した（ヒトタイプＩトランスグルタミ
ナーゼ遺伝子からの）本発明の転写調節領域を有する。
本発明により治療可能な上皮疾患は、嚢胞性繊維症を
含む。
含む。
本発明により治療可能な表皮疾患は、湿疹、乾癬、魚
鱗癬、表皮剥脱性角化症、表皮剥脱性水泡症、並びに水
泡性類天疱瘡の形を含む基底膜の帯（表皮から由来す
る）の遺伝的及び後天的疾患を含む。
鱗癬、表皮剥脱性角化症、表皮剥脱性水泡症、並びに水
泡性類天疱瘡の形を含む基底膜の帯（表皮から由来す
る）の遺伝的及び後天的疾患を含む。
例えば、本発明の方法により伝達できる薬剤は、成長
ホルモン、インシュリン、上皮小体ホルモン、ACTH、物
質Ｐ、内在性オピエートなどを含む、皮膚同等物で生成
されるホルモンを含む。
ホルモン、インシュリン、上皮小体ホルモン、ACTH、物
質Ｐ、内在性オピエートなどを含む、皮膚同等物で生成
されるホルモンを含む。
発現ベクターは、ヒトに直接投与できるか、又は次に
ヒトに投与されるヒトの細胞を形質転換するのに使用さ
れる。従って、生理学的条件が適切ならば、本発明の調
節要素のコントロールの下の遺伝子生成物が発現され
る。生理学的条件は、もし必要ならば、ベクターを受け
るヒトに薬剤を投与することにより、又はそのヒトの食
事をコントロールすることにより、操作できる。ベクタ
ーがヒトに直接又は間接に投与されるならば、ベクター
は、第二の核酸例えばウイルス性核酸により、又は他の
担体例えばウイルス、又はウイルスエンベロープ或はウ
イルスコート蛋白中の包膜により、該ヒトの細胞中へ転
移できる。
ヒトに投与されるヒトの細胞を形質転換するのに使用さ
れる。従って、生理学的条件が適切ならば、本発明の調
節要素のコントロールの下の遺伝子生成物が発現され
る。生理学的条件は、もし必要ならば、ベクターを受け
るヒトに薬剤を投与することにより、又はそのヒトの食
事をコントロールすることにより、操作できる。ベクタ
ーがヒトに直接又は間接に投与されるならば、ベクター
は、第二の核酸例えばウイルス性核酸により、又は他の
担体例えばウイルス、又はウイルスエンベロープ或はウ
イルスコート蛋白中の包膜により、該ヒトの細胞中へ転
移できる。
本発明のさらに他の態様は、本発明の発現ベクターの
一つによりヒト皮膚同等物を形質転換し、患者に適用す
るのに十分な皮膚同等物を生成するのに有効な時間及び
条件下で、形質転換した皮膚同等物を培養し、患者に形
質転換した皮膚同等物の塊を適用し、そして必要に応じ
遺伝子生成物の発現を誘発し、それにより薬剤を伝達す
るか又は所望の表皮の治療を行うことにより、薬剤を表
皮に伝達するか又は上皮疾患、表皮疾患を治療するため
のヒト遺伝子治療を行う方法を提供する。
一つによりヒト皮膚同等物を形質転換し、患者に適用す
るのに十分な皮膚同等物を生成するのに有効な時間及び
条件下で、形質転換した皮膚同等物を培養し、患者に形
質転換した皮膚同等物の塊を適用し、そして必要に応じ
遺伝子生成物の発現を誘発し、それにより薬剤を伝達す
るか又は所望の表皮の治療を行うことにより、薬剤を表
皮に伝達するか又は上皮疾患、表皮疾患を治療するため
のヒト遺伝子治療を行う方法を提供する。
皮膚同等物又は人工皮膚は、例えばここに参考として
引用する。Haakeら、（1991）J.Invest.Dermat.96、71
−77又は米国特許第4888291号により提供される、特殊
化上皮のケラチン生成細胞様細胞を含むヒトケラチン生
成細胞から生成される上皮シートである。皮膚同等物
は、皮膚同等物を構成する上皮シートの形成中の任意の
段階で形質転換でき、好ましくはケラチン生成細胞は、
シート形成が生ずる前に形質転換される。
引用する。Haakeら、（1991）J.Invest.Dermat.96、71
−77又は米国特許第4888291号により提供される、特殊
化上皮のケラチン生成細胞様細胞を含むヒトケラチン生
成細胞から生成される上皮シートである。皮膚同等物
は、皮膚同等物を構成する上皮シートの形成中の任意の
段階で形質転換でき、好ましくはケラチン生成細胞は、
シート形成が生ずる前に形質転換される。
或る場合では、形質転換した細胞中の遺伝子生成物の
発現は、形質転換された皮膚同等物が患者に適用される
前に達成できる。従って、皮膚同等物に関する成長媒体
は、本発明の発現ベクターを使用して遺伝子発現を誘発
するのに必要な剤を補給される。他の例では、遺伝子生
成物の発現は、形質転換された皮膚同等物が患者に適用
された後に達成できる。その場合、発現を誘発する剤
は、もし必要ならば、患者に非経口的に与えられるか、
又は皮膚同等物に局所的に適用される。
発現は、形質転換された皮膚同等物が患者に適用される
前に達成できる。従って、皮膚同等物に関する成長媒体
は、本発明の発現ベクターを使用して遺伝子発現を誘発
するのに必要な剤を補給される。他の例では、遺伝子生
成物の発現は、形質転換された皮膚同等物が患者に適用
された後に達成できる。その場合、発現を誘発する剤
は、もし必要ならば、患者に非経口的に与えられるか、
又は皮膚同等物に局所的に適用される。
実 施 例
以下の実施例は、本発明をさらに説明する。
実施例 １
一般的な方法
ヒトTGエーゼＩのゲノムクローンの隔離
ヒト胎盤EMBL−３ SP6/T7ゲノムライブラリー（Clon
tech、Palo Alto、CA）を、プローブとしてヒトTGエー
ゼIcDNA（26）により標準のやり方によってスクリーニ
ングした。［α−32P］dCTPをラベルした126aプローブ
（11）を、ランダムプライミング法を使用して製造し、
セファデックスＧ−50スパンカラムで精製し、そして高
度の緊縮性（1M NaCl、１％SDS、150μg/mL担体DNA、6
5℃）で、E.coli LE392菌株の３×105プラークを含む1
0枚の150cm2のGene Screen Plusフィルターにハイブ
リッド形成した。信号正のプラークからのファージを精
製して均一とし、そしてDNAをグリセロール勾配法（2
6）により隔離した。挿入DNAをXho I制限酵素による開
裂により11個の正のクローンから離脱させ、アガロース
ゲル上でサイズ分画し、126a cDNAとの配列相同につい
てサザンブロットにより分析した。
tech、Palo Alto、CA）を、プローブとしてヒトTGエー
ゼIcDNA（26）により標準のやり方によってスクリーニ
ングした。［α−32P］dCTPをラベルした126aプローブ
（11）を、ランダムプライミング法を使用して製造し、
セファデックスＧ−50スパンカラムで精製し、そして高
度の緊縮性（1M NaCl、１％SDS、150μg/mL担体DNA、6
5℃）で、E.coli LE392菌株の３×105プラークを含む1
0枚の150cm2のGene Screen Plusフィルターにハイブ
リッド形成した。信号正のプラークからのファージを精
製して均一とし、そしてDNAをグリセロール勾配法（2
6）により隔離した。挿入DNAをXho I制限酵素による開
裂により11個の正のクローンから離脱させ、アガロース
ゲル上でサイズ分画し、126a cDNAとの配列相同につい
てサザンブロットにより分析した。
制限酵素マッピング及びサザンブロット
３個の隔離されたゲノムクローン（EMBL−Ｂ、EMBL−
Ｋ及びEMBL−Ｎ）の物理的マップを、制限酵素Xho I、S
ac I、EcoR I、及びBamH IによるそのDNAの一回及び二
回の消化によって構築した。DNA制限フラグメント及び
コントロールDNAマーカーは、kbによるサイズの測定の
ためにゲル電気泳動により分離された。ナイロンフィル
ター上に移した後、遺伝子の5'及び3'末端を含むDNAフ
ラグメントを、サザンブロットにより同定し、そして
［γ−32P］ATP末端ラジオラベルしたオリゴヌクレオチ
ドプローブ＃219（ヌクレオチド29−45、ヌクレオチド
１は、cDNAの第一のATGコドンの第一のＡに相当する）
及び＃220（ヌクレオチド2343−2360）とバイブリッド
形成した。フィルターを、低度の緊縮性（1M NaCl、１
％SDS、150μg/mLの担体DNA、37℃）下で、ハイブリッ
ド形成させた。その配列は、周知のTGエーゼＩ cDNA配
列に基づいてデザインされたオリゴヌクレオチドを、ロ
チェスター大学の微生物学部で合成した。一つの酵素の
他に関する開裂の位置は、得られるDNAフラグメントの
長さの完全な相加性、サザンブロット分析及び配列のデ
ータにより規定された。ゲノムサザンブロット分析で
は、ヒト末梢白血球から抽出された高分子量ゲノムDNA
を、二三の制限エンドヌクレアーゼにより消化し、そし
てDNAフラグメントを0.8％アガロースゲル上で電気泳動
した。フィルター上に移した後、ゲノムフラグメントを
切れ目移動32Pラベル126a（ヌクレオチド14−1652）及
び16b（ヌクレオチド314−2622）cDNAプローブ、並びに
それぞれ5'−及び3'−末端配列を含むK3及びK5ゲノムサ
ブクローンのハイブリッド形成した（図２参照）。オー
トラジオグラフを、１−３日間コダックＸ線フィルム上
に露出した。
Ｋ及びEMBL−Ｎ）の物理的マップを、制限酵素Xho I、S
ac I、EcoR I、及びBamH IによるそのDNAの一回及び二
回の消化によって構築した。DNA制限フラグメント及び
コントロールDNAマーカーは、kbによるサイズの測定の
ためにゲル電気泳動により分離された。ナイロンフィル
ター上に移した後、遺伝子の5'及び3'末端を含むDNAフ
ラグメントを、サザンブロットにより同定し、そして
［γ−32P］ATP末端ラジオラベルしたオリゴヌクレオチ
ドプローブ＃219（ヌクレオチド29−45、ヌクレオチド
１は、cDNAの第一のATGコドンの第一のＡに相当する）
及び＃220（ヌクレオチド2343−2360）とバイブリッド
形成した。フィルターを、低度の緊縮性（1M NaCl、１
％SDS、150μg/mLの担体DNA、37℃）下で、ハイブリッ
ド形成させた。その配列は、周知のTGエーゼＩ cDNA配
列に基づいてデザインされたオリゴヌクレオチドを、ロ
チェスター大学の微生物学部で合成した。一つの酵素の
他に関する開裂の位置は、得られるDNAフラグメントの
長さの完全な相加性、サザンブロット分析及び配列のデ
ータにより規定された。ゲノムサザンブロット分析で
は、ヒト末梢白血球から抽出された高分子量ゲノムDNA
を、二三の制限エンドヌクレアーゼにより消化し、そし
てDNAフラグメントを0.8％アガロースゲル上で電気泳動
した。フィルター上に移した後、ゲノムフラグメントを
切れ目移動32Pラベル126a（ヌクレオチド14−1652）及
び16b（ヌクレオチド314−2622）cDNAプローブ、並びに
それぞれ5'−及び3'−末端配列を含むK3及びK5ゲノムサ
ブクローンのハイブリッド形成した（図２参照）。オー
トラジオグラフを、１−３日間コダックＸ線フィルム上
に露出した。
他のDNA操作
欠失分析及び他のDNA分析法に関する制限酵素消化、
連結反応、酵素を、製造者の指示に従って、又はSambro
okら（1989）Molecular Cloning、Ａ Laboratory Ma
nual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess、Cold Spring Harbor、NYに記述されているよう
に行った。
連結反応、酵素を、製造者の指示に従って、又はSambro
okら（1989）Molecular Cloning、Ａ Laboratory Ma
nual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess、Cold Spring Harbor、NYに記述されているよう
に行った。
DNA配列化
DNA配列は、Sequenaseキット及びプラスミド配列プロ
トコール（US Biochemical Corp.）を使用して決定さ
れた。使用されたストラテジーは、図２に示されるよう
に合成オリゴヌクレオチドプライマー法及びpUC19又はp
UC18ベクター中へのサブクローニングの両方を含んだ。
図２では、上のレベルは、全遺伝子に関して、配列した
部分（浅い棒）及びK3及びK5のゲノムサブクローン（か
っこ）の位置である。低いレベルは、GeneBank寄託番号
M83227、M83228、M83229及びM83230に相当するＡ、Ｂ、
Ｃ及びＤと名付けられた配列された領域の詳細なタイア
グラムである。ソリッドヘッド矢印は、合成オリゴヌク
レオチドプライマー法による配列化の方向を示し、オー
プンヘッド矢印は、サブクローン化手法による方向を示
す。
トコール（US Biochemical Corp.）を使用して決定さ
れた。使用されたストラテジーは、図２に示されるよう
に合成オリゴヌクレオチドプライマー法及びpUC19又はp
UC18ベクター中へのサブクローニングの両方を含んだ。
図２では、上のレベルは、全遺伝子に関して、配列した
部分（浅い棒）及びK3及びK5のゲノムサブクローン（か
っこ）の位置である。低いレベルは、GeneBank寄託番号
M83227、M83228、M83229及びM83230に相当するＡ、Ｂ、
Ｃ及びＤと名付けられた配列された領域の詳細なタイア
グラムである。ソリッドヘッド矢印は、合成オリゴヌク
レオチドプライマー法による配列化の方向を示し、オー
プンヘッド矢印は、サブクローン化手法による方向を示
す。
細胞培養
ヒトの包皮の新生児ケラチン生成細胞培養を、Rheinw
ald、J.G.ら（1975）Cell、６、331−341により、又はH
aakeら（1991）により記述されているように、確立し維
持した。他の細胞系（繊維芽細胞、確立されたケラチン
生成細胞）。トランスフェクションを、ヒトの包皮のケ
ラチン生成細胞を第三の継代後に行った。
ald、J.G.ら（1975）Cell、６、331−341により、又はH
aakeら（1991）により記述されているように、確立し維
持した。他の細胞系（繊維芽細胞、確立されたケラチン
生成細胞）。トランスフェクションを、ヒトの包皮のケ
ラチン生成細胞を第三の継代後に行った。
CATアッセイ
CATアッセイは、Gormanら、（1982）Mol.Cell.Bio1.
2、1044−1051により記述された方法に従って行われ
た。トランスフェクションされた細胞は、急速な凍結凍
解により0.25MトリスHCl（pH7.5）中で溶解され、細胞
の屑を遠心分離により除き、抽出物を−70℃で貯蔵する
か、又は直ちにCATアッセイに使用した。５×105細胞か
らの抽出物0.1mL容積に、80mMトリスHCl（pH7.5）中の
14C−クロラムフェニコール（0.3μCi/6.3nモル）を含
む混合物63μＬを加え、次に10μＬの40mMアセチルCoA
（Sigma）を加えた。37℃で60分間のインキュベーショ
ン後、反応を、1mLの氷冷酢酸エチルを添加し、撹拌す
ることにより停止させた。反応混合物を遠心分離し、上
相を取り出し、真空下蒸発させ、そして10μＬの酢酸エ
チルに再懸濁させた。最後の生成物を、クロロホルム：
メタノール（95:5）中の薄層クロマトグラフィ（TLC）
プレート（American Scientific Products）で分離
し、乾燥し、そして一晩オートラジオグラフを行った。
2、1044−1051により記述された方法に従って行われ
た。トランスフェクションされた細胞は、急速な凍結凍
解により0.25MトリスHCl（pH7.5）中で溶解され、細胞
の屑を遠心分離により除き、抽出物を−70℃で貯蔵する
か、又は直ちにCATアッセイに使用した。５×105細胞か
らの抽出物0.1mL容積に、80mMトリスHCl（pH7.5）中の
14C−クロラムフェニコール（0.3μCi/6.3nモル）を含
む混合物63μＬを加え、次に10μＬの40mMアセチルCoA
（Sigma）を加えた。37℃で60分間のインキュベーショ
ン後、反応を、1mLの氷冷酢酸エチルを添加し、撹拌す
ることにより停止させた。反応混合物を遠心分離し、上
相を取り出し、真空下蒸発させ、そして10μＬの酢酸エ
チルに再懸濁させた。最後の生成物を、クロロホルム：
メタノール（95:5）中の薄層クロマトグラフィ（TLC）
プレート（American Scientific Products）で分離
し、乾燥し、そして一晩オートラジオグラフを行った。
実施例 ２
ゲノムヒトTGエーゼＩ遺伝子のクローニング及びそのプ
ロモーター領域の同定ヒトTGエーゼＩ遺伝子の隔離及び
特徴の確認 約３×105個の組換えファージプラークをヒトゲノム
ライブラリーからスクリーニングし、そして11個が、TG
エーゼIcDNAにハイブリッド形成するDNA配列を含んだ。
ハイブリッド形成の正のファージを隔離し、プラーク精
製し、それらのDNAを二三の制限酵素により消化した。
３個のユニークなクローンを同定した。EMBL−Ｂ、EMBL
−Ｋ及びEMBL−Ｎ。BamH I、Sac I、Xho I、及びEcoR I
による一回及び二回の消化によってこれらの３個のクロ
ーンについて構築した制限マップは、図１のBamH Iマッ
プについて示されているように、クローンは重複してい
ることを明らかにしていた。cDNAの5'及び3'末端に相同
性のオリゴヌクレオチドプローブによる制限フラグメン
トのサザンブロット分析は、EMBL−Ｂ、−Ｋ及び−Ｎク
ローンが、その転写単位が14.2kbのゲノムDNAに及ぶ、
全ヒトTGエーゼＩ遺伝子をカバーしていることを立証し
た。EMBL−Ｂクローンは、遺伝子にフランキングしてい
る5'−上流領域約10kb、並びにEMBL−Ｋクローンによる
重複約4kbを含む。EMBL−Ｋクローンは、ヒトTGエーゼ
Ｉ遺伝子の殆ど全部の転写単位に及ぶ。このクローンの
5'及び3'末端のヌクレオチド配列分析は、それが推定の
転写開始部位から930bp上流から始まり、TAGアンバー停
止コドン後86bpで終ることを明らかにした。AATAAAポリ
アデニル化信号は、ターミネーションコードから156bp
下流に位置し、そのためEMBL−Ｋクローンに存在しな
い。
ロモーター領域の同定ヒトTGエーゼＩ遺伝子の隔離及び
特徴の確認 約３×105個の組換えファージプラークをヒトゲノム
ライブラリーからスクリーニングし、そして11個が、TG
エーゼIcDNAにハイブリッド形成するDNA配列を含んだ。
ハイブリッド形成の正のファージを隔離し、プラーク精
製し、それらのDNAを二三の制限酵素により消化した。
３個のユニークなクローンを同定した。EMBL−Ｂ、EMBL
−Ｋ及びEMBL−Ｎ。BamH I、Sac I、Xho I、及びEcoR I
による一回及び二回の消化によってこれらの３個のクロ
ーンについて構築した制限マップは、図１のBamH Iマッ
プについて示されているように、クローンは重複してい
ることを明らかにしていた。cDNAの5'及び3'末端に相同
性のオリゴヌクレオチドプローブによる制限フラグメン
トのサザンブロット分析は、EMBL−Ｂ、−Ｋ及び−Ｎク
ローンが、その転写単位が14.2kbのゲノムDNAに及ぶ、
全ヒトTGエーゼＩ遺伝子をカバーしていることを立証し
た。EMBL−Ｂクローンは、遺伝子にフランキングしてい
る5'−上流領域約10kb、並びにEMBL−Ｋクローンによる
重複約4kbを含む。EMBL−Ｋクローンは、ヒトTGエーゼ
Ｉ遺伝子の殆ど全部の転写単位に及ぶ。このクローンの
5'及び3'末端のヌクレオチド配列分析は、それが推定の
転写開始部位から930bp上流から始まり、TAGアンバー停
止コドン後86bpで終ることを明らかにした。AATAAAポリ
アデニル化信号は、ターミネーションコードから156bp
下流に位置し、そのためEMBL−Ｋクローンに存在しな
い。
ポリアデニル化信号配列は、しかし、EMBL−Ｎクロー
ン中に存在し、それは、停止コドンから下流に2.1kbを
超えてEMBL−Ｋクローンを延在している。従って、その
5'及び3'−フランキング領域を有する全ヒトTGエーゼＩ
遺伝子が、隔離された。ヒトTGエーゼＩ遺伝子の正当性
は、ヒト白血球から、そしてプローブとして126a及び16
b cDNA並びにゲノムK3及びK5サブクローンを使用して
クローンしたバクテリオファージ遺伝子からの消化した
ゲノムDNAのサザンブロット分析により立証された。K3
及びK5プローブは、図２に示される。
ン中に存在し、それは、停止コドンから下流に2.1kbを
超えてEMBL−Ｋクローンを延在している。従って、その
5'及び3'−フランキング領域を有する全ヒトTGエーゼＩ
遺伝子が、隔離された。ヒトTGエーゼＩ遺伝子の正当性
は、ヒト白血球から、そしてプローブとして126a及び16
b cDNA並びにゲノムK3及びK5サブクローンを使用して
クローンしたバクテリオファージ遺伝子からの消化した
ゲノムDNAのサザンブロット分析により立証された。K3
及びK5プローブは、図２に示される。
大体半分のクローンした遺伝子が配列化され、14.2kb
のTGエーゼＩ転写単位からの6977bp並びに5'−上流フラ
ンキング領域の930bpを含んだ。配列化された領域及び
配列ストラテジーは、図２に示される。ゲノム配列のcD
NAのそれに対する比較は、（機能的mRNAは、ポリＡ尾部
を除いて長さ2630bpであることが分っている）、ヒトTG
エーゼＩ遺伝子の分裂特性を明らかにした。遺伝子は、
14イントロンの介在配列により分離された15エキソンよ
りなる。エキソンＩ及びエキソンXVの一部は、それぞれ
5'−及び3'−未翻訳領域をエンコードし、それらは、他
の真核遺伝子へのアナロジーにより、重要な転写後の調
節の役割を果たすことができる。
のTGエーゼＩ転写単位からの6977bp並びに5'−上流フラ
ンキング領域の930bpを含んだ。配列化された領域及び
配列ストラテジーは、図２に示される。ゲノム配列のcD
NAのそれに対する比較は、（機能的mRNAは、ポリＡ尾部
を除いて長さ2630bpであることが分っている）、ヒトTG
エーゼＩ遺伝子の分裂特性を明らかにした。遺伝子は、
14イントロンの介在配列により分離された15エキソンよ
りなる。エキソンＩ及びエキソンXVの一部は、それぞれ
5'−及び3'−未翻訳領域をエンコードし、それらは、他
の真核遺伝子へのアナロジーにより、重要な転写後の調
節の役割を果たすことができる。
5'−未翻訳領域の86bpの配列は、ヌクレオチド84及び
85の間のイントロン１により分割される。5'−未翻訳領
域の残りの２個のヌクレオチドは、長さ734bpのイント
ロンにより分離され、そしてエキソンIIに位置する第一
のAUG翻訳開始コドンに先立つ。エキソンＩのサイズ
は、Kimらにより報告されたヒトTGエーゼImRNAのプライ
マー延長分析に基づいて評価され、それは、Phillipsら
及びYamanishiらにより報告されたものより数個のヌク
レオチド長い。しかし、より長い86bpプライマー延長フ
ラグメントは、転写開始部位を含むように見える。それ
は、このフラグメントが開始するシチジンは、真核遺伝
子について予想されるように、CATAA配列から30bp下流
に位置するからである。この配列は、930bpの分析され
た5'−上流の中で唯一のTATA様配列であり、そしてプロ
モーターの強さ及びmRNA開始部位の選択に関する重要な
配列のモチーフである、機能的であるが弱いTATAボック
スを代表するように思われる。比較的弱いTATAボックス
コンセンサス配列は、多数の部位でmRNA転写の開始を生
じさせ、それは、TGエーゼＩプライマー延長生成物に関
する報告されたサイズの差を説明することができるだろ
う。
85の間のイントロン１により分割される。5'−未翻訳領
域の残りの２個のヌクレオチドは、長さ734bpのイント
ロンにより分離され、そしてエキソンIIに位置する第一
のAUG翻訳開始コドンに先立つ。エキソンＩのサイズ
は、Kimらにより報告されたヒトTGエーゼImRNAのプライ
マー延長分析に基づいて評価され、それは、Phillipsら
及びYamanishiらにより報告されたものより数個のヌク
レオチド長い。しかし、より長い86bpプライマー延長フ
ラグメントは、転写開始部位を含むように見える。それ
は、このフラグメントが開始するシチジンは、真核遺伝
子について予想されるように、CATAA配列から30bp下流
に位置するからである。この配列は、930bpの分析され
た5'−上流の中で唯一のTATA様配列であり、そしてプロ
モーターの強さ及びmRNA開始部位の選択に関する重要な
配列のモチーフである、機能的であるが弱いTATAボック
スを代表するように思われる。比較的弱いTATAボックス
コンセンサス配列は、多数の部位でmRNA転写の開始を生
じさせ、それは、TGエーゼＩプライマー延長生成物に関
する報告されたサイズの差を説明することができるだろ
う。
実施例 ３
トランスフェクション条件の決定
ａ）リポソーム介在トランスフェクション
ケラチン生成細胞又は繊維芽細胞中へDNAを導入する
ために、Roseら（1991）BioTechniques、10、520−524
のリピド介在トランスフェクションプロトコールに従っ
た。リポソームは、5mg/mLのカチオン性リピドジメチル
ジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）及び1mg/
mLの中性リピドジオレオイル−Ｌ−α−ホスファチジル
エタノールアミン（PtdEtn）により製造された。細胞が
50−70％の集密度に達するまで、ケラチン生成細胞は、
ケラチン生成細胞成長培地（KGM）中で60mmの培養皿で
成長し、そして繊維芽細胞は、RPMI培地＋10％牛胎児血
清（FCS）中で成長した。トランスフェクション前の
夜、細胞は、それらのそれぞれの培地に供給された。ト
ランスフェクション混合物、1.5mLのダルベッコの修飾
イーグル培地（DMEM）、12μｇのDNA及び45μＬのリピ
ドミックスを、４時間37℃で培地洗浄細胞への添加前
に、10分間室温でインキュベートした。４時間後、等量
のKGM又は４％FCSを補給されたRPMIを、さらに２時間加
えた。細胞は、次に成長培地により洗い、3mLのKGM又は
２％FCSを有するRPMI培地の何れかで48時間成長させ
た。この時間後、細胞を、CAT分析のために採取した。
ために、Roseら（1991）BioTechniques、10、520−524
のリピド介在トランスフェクションプロトコールに従っ
た。リポソームは、5mg/mLのカチオン性リピドジメチル
ジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）及び1mg/
mLの中性リピドジオレオイル−Ｌ−α−ホスファチジル
エタノールアミン（PtdEtn）により製造された。細胞が
50−70％の集密度に達するまで、ケラチン生成細胞は、
ケラチン生成細胞成長培地（KGM）中で60mmの培養皿で
成長し、そして繊維芽細胞は、RPMI培地＋10％牛胎児血
清（FCS）中で成長した。トランスフェクション前の
夜、細胞は、それらのそれぞれの培地に供給された。ト
ランスフェクション混合物、1.5mLのダルベッコの修飾
イーグル培地（DMEM）、12μｇのDNA及び45μＬのリピ
ドミックスを、４時間37℃で培地洗浄細胞への添加前
に、10分間室温でインキュベートした。４時間後、等量
のKGM又は４％FCSを補給されたRPMIを、さらに２時間加
えた。細胞は、次に成長培地により洗い、3mLのKGM又は
２％FCSを有するRPMI培地の何れかで48時間成長させ
た。この時間後、細胞を、CAT分析のために採取した。
ｂ）ポリブレン法
細胞を、105細胞/mLの密度で、トランスフェクション
24時間前に植え付けた。ポリブレン（30μg/mL）を、培
養皿に直接２時間かけて加えた。成長培地は、細胞をカ
バーするための0.5mLを除いて除去し、そして10μｇのD
NAをさらに６時間かけて加えた。４時間のインキュベー
ション後、クロロキンを、残りの２時間、100μＭの最
終濃度になるように添加した。クロロキン段階は、トラ
ンスフェクションの能率に効果が最低のため、しばしば
除かれた。トランスフェクションされた細胞を、成長培
地により洗浄し、そして２％の血清を補給されたこの培
地3mL中で48時間成長させた。これらの細胞は、次にCAT
アッセイのために採取された。
24時間前に植え付けた。ポリブレン（30μg/mL）を、培
養皿に直接２時間かけて加えた。成長培地は、細胞をカ
バーするための0.5mLを除いて除去し、そして10μｇのD
NAをさらに６時間かけて加えた。４時間のインキュベー
ション後、クロロキンを、残りの２時間、100μＭの最
終濃度になるように添加した。クロロキン段階は、トラ
ンスフェクションの能率に効果が最低のため、しばしば
除かれた。トランスフェクションされた細胞を、成長培
地により洗浄し、そして２％の血清を補給されたこの培
地3mL中で48時間成長させた。これらの細胞は、次にCAT
アッセイのために採取された。
ｃ）結果及び結論
リピド介在トランスフェクション法は、ケラチン生成
細胞中への外来性DNAの導入に、ポリブレン法により能
率的である。ケラチン生成細胞の成長は、リピド介在ト
ランスフェクションにより認められるほど影響を受け
ず、そのためそれは特に優れたトランスフェクション法
となった。
細胞中への外来性DNAの導入に、ポリブレン法により能
率的である。ケラチン生成細胞の成長は、リピド介在ト
ランスフェクションにより認められるほど影響を受け
ず、そのためそれは特に優れたトランスフェクション法
となった。
実施例 ４
ヒトTGエーゼＩ遺伝子プロモーター領域の欠失分析
A.欠失突然変異体の構築
ヒトTGエーゼＩ遺伝子の発現をコントロールするのに
含まれるシス作用調節DNA配列を規定するために、二三
のクロラムフェニコールアセチル転写酵素（CAT）プラ
スミドを構築した。それぞれの欠失突然変異体コンスト
ラクトは、CAT遺伝子に結合したTGエーゼＩプロモータ
ー領域の異なるセグメントを含む。
含まれるシス作用調節DNA配列を規定するために、二三
のクロラムフェニコールアセチル転写酵素（CAT）プラ
スミドを構築した。それぞれの欠失突然変異体コンスト
ラクトは、CAT遺伝子に結合したTGエーゼＩプロモータ
ー領域の異なるセグメントを含む。
これらのコンストラクトは、親ベクターとしてプラス
ミドpBLCAT−３を使用して作られた（図５）。プラスミ
ドpBLCAT−３は、pSV2−catに似ているが、但しそれ
は、図４に示されたPvu II−Hind IIIフラグメントにお
いてSV40プロモーター及びエンハンサー要素を欠く。Ba
mH Iフラグメントを含む欠失突然変異体コンストラクト
は、pBLCAI−３のCAT遺伝子開始コドンに隣接するポリ
リンカーのBamH I部位中へ、ヒトTGエーゼＩプロモータ
ー領域（表１）からのBamH Iフラグメントを挿入するこ
とにより作られた。Nla III−194フラグメントを含むコ
ンストラストは、ポリリンカーのSph I部位中へ、ヒトT
GエーゼＩプロモーター領域（表１）からのNli III−19
4フラグメントを挿入することにより作られた。Hind II
Iフラグメントを含むコンストラクトは、ポリリンカー
のHind III部位中へ、ヒトTGエーゼＩプロモーター領域
のHind IIIフラグメントを挿入することにより作られ
た。Nla III−194フラグメント及びHind IIIフラグメン
トを含む二重突然変異体（又は194＋フラグメントとも
呼ばれる）は、そのプラスミドのHind III消化後Nla II
I＋194フラグメントを含むプラスミド中へHind IIIフラ
グメントを挿入することにより構築された。
ミドpBLCAT−３を使用して作られた（図５）。プラスミ
ドpBLCAT−３は、pSV2−catに似ているが、但しそれ
は、図４に示されたPvu II−Hind IIIフラグメントにお
いてSV40プロモーター及びエンハンサー要素を欠く。Ba
mH Iフラグメントを含む欠失突然変異体コンストラクト
は、pBLCAI−３のCAT遺伝子開始コドンに隣接するポリ
リンカーのBamH I部位中へ、ヒトTGエーゼＩプロモータ
ー領域（表１）からのBamH Iフラグメントを挿入するこ
とにより作られた。Nla III−194フラグメントを含むコ
ンストラストは、ポリリンカーのSph I部位中へ、ヒトT
GエーゼＩプロモーター領域（表１）からのNli III−19
4フラグメントを挿入することにより作られた。Hind II
Iフラグメントを含むコンストラクトは、ポリリンカー
のHind III部位中へ、ヒトTGエーゼＩプロモーター領域
のHind IIIフラグメントを挿入することにより作られ
た。Nla III−194フラグメント及びHind IIIフラグメン
トを含む二重突然変異体（又は194＋フラグメントとも
呼ばれる）は、そのプラスミドのHind III消化後Nla II
I＋194フラグメントを含むプラスミド中へHind IIIフラ
グメントを挿入することにより構築された。
B.分析
プロモーター領域の分析は、図３で数えられたよう
に、AUG翻訳開始コドンから上流の、推定のCAP部位に関
して、ヌクレオチド−448と822との間に位置する1270bp
のDNAフラグメントにより行われた。欠失突然変異体Nla
III−194、194＋、Hind III及びBamH I（図３のマップ
参照）を、10-6Mレチノイン酸（RA）の存在及び不存在
の下、低（0.07mM）Ca+2及び高（1.2mM）Ca+2で成長し
た一時的にトランスフェクションされた一次新生児ケラ
チン生成細胞で、CAT遺伝子活性についてアッセイし
た。CAT活性に関するアッセイは、トランスフェクショ
ン48又は72時間後実施された。高Ca+2又はRAが存在する
とき、細胞はトランスフェクションされ、72時間Ca+2又
はRAと培養され、次にアッセイされた。pSV2−catプラ
スミド及びpBLCAT−３ベクターの活性は、全てのTGエー
ゼＩプロモーターコンストラクトについて、それぞれ、
正及び負のコントロールとして働いた。
に、AUG翻訳開始コドンから上流の、推定のCAP部位に関
して、ヌクレオチド−448と822との間に位置する1270bp
のDNAフラグメントにより行われた。欠失突然変異体Nla
III−194、194＋、Hind III及びBamH I（図３のマップ
参照）を、10-6Mレチノイン酸（RA）の存在及び不存在
の下、低（0.07mM）Ca+2及び高（1.2mM）Ca+2で成長し
た一時的にトランスフェクションされた一次新生児ケラ
チン生成細胞で、CAT遺伝子活性についてアッセイし
た。CAT活性に関するアッセイは、トランスフェクショ
ン48又は72時間後実施された。高Ca+2又はRAが存在する
とき、細胞はトランスフェクションされ、72時間Ca+2又
はRAと培養され、次にアッセイされた。pSV2−catプラ
スミド及びpBLCAT−３ベクターの活性は、全てのTGエー
ゼＩプロモーターコンストラクトについて、それぞれ、
正及び負のコントロールとして働いた。
ヒトTGエーゼＩプロモーターの欠失分析の結果は、表
２に示される。これらのデータは、−448から822DNAフ
ラグメントがTGエーゼＩ遺伝子転写の速度をコントロー
ルする調節要素を含むことを示す。AUGコドンに直ぐ隣
接した194bpの第一のイントロンを含むNla III−194突
然変異体は、最高のプロモーター活性を与えた。この活
性は、高Ca+2により２倍低下するが、RAにより処理され
たケラチン生成細胞ではもとに戻された。その上、194
＋突然変異体のHind III DNAフラグメントの添加は、CA
T遺伝子活性に対して阻害効果を示し、そしてCa+2又はR
Aに対するNla III−194DNAフラグメントの応答性を排除
した。この結果は、TGエーゼＩ遺伝子の発現をコントロ
ールするのにHind III配列に関して負の調節の役割を示
す。Hind III DNAフラグメントのみは、それがTATA様ボ
ックスを含む転写開始CAT部位から319bp上流で未翻訳エ
キソンＩをエンコードしているが、CAT遺伝子の転写を
開始することができない。興味のあることは、TATA様ボ
ックスは、BamH I突然変異体においてプロモーター活性
を有するするように見える。この結果は、図３において
3'BamH I及びHind III部位により規定されるDNAフラグ
メント（即ち、SEQ ID NO:1のヌクレオチド1088及び1
569）は、ヒトTGエーゼＩプロモーターに関する負の調
節要素を含むことを示す。最後に、BamH I突然変異体
は、その転写活性が高Ca+2培地で成長した細胞では増大
するので、Ca+2応答速度を含む。
２に示される。これらのデータは、−448から822DNAフ
ラグメントがTGエーゼＩ遺伝子転写の速度をコントロー
ルする調節要素を含むことを示す。AUGコドンに直ぐ隣
接した194bpの第一のイントロンを含むNla III−194突
然変異体は、最高のプロモーター活性を与えた。この活
性は、高Ca+2により２倍低下するが、RAにより処理され
たケラチン生成細胞ではもとに戻された。その上、194
＋突然変異体のHind III DNAフラグメントの添加は、CA
T遺伝子活性に対して阻害効果を示し、そしてCa+2又はR
Aに対するNla III−194DNAフラグメントの応答性を排除
した。この結果は、TGエーゼＩ遺伝子の発現をコントロ
ールするのにHind III配列に関して負の調節の役割を示
す。Hind III DNAフラグメントのみは、それがTATA様ボ
ックスを含む転写開始CAT部位から319bp上流で未翻訳エ
キソンＩをエンコードしているが、CAT遺伝子の転写を
開始することができない。興味のあることは、TATA様ボ
ックスは、BamH I突然変異体においてプロモーター活性
を有するするように見える。この結果は、図３において
3'BamH I及びHind III部位により規定されるDNAフラグ
メント（即ち、SEQ ID NO:1のヌクレオチド1088及び1
569）は、ヒトTGエーゼＩプロモーターに関する負の調
節要素を含むことを示す。最後に、BamH I突然変異体
は、その転写活性が高Ca+2培地で成長した細胞では増大
するので、Ca+2応答速度を含む。
要するに、データは、TGエーゼＩ遺伝子の発現が、転
写促進活性を両者とも有する二つの明確なDNAフラグメ
ントにより調節できることを示す。これらのフラグメン
トのヌクレオチド配列は、細胞及び環境の因子へのTGエ
ーゼＩ遺伝子の応答性をコントロールする正及び負の調
節要素を含む。
写促進活性を両者とも有する二つの明確なDNAフラグメ
ントにより調節できることを示す。これらのフラグメン
トのヌクレオチド配列は、細胞及び環境の因子へのTGエ
ーゼＩ遺伝子の応答性をコントロールする正及び負の調
節要素を含む。
a:指示されたプラスミドは、一次新生児ケラチン生成細
胞に一時的にトランスフェクションされ、そしてCAT活
性についてアッセイされた。活性は、アセチル化の％と
して表示されている。プラスミドは、以下の通りであ
る。pSV2、pSV2−cat（正のコントロール）、pBL3、pBL
CAT−３（負のコントロール）、B:pBLCAT−３中のBamH
Iフラグメント、H:pBLCAT−３中のHind IIIフラグメン
ト、N:pBLCAT−３中のNla III−194フラグメント、194
＋:pBLCAT−３中のHind III−Nla III−194フラグメン
ト、なし:DNAなし。
胞に一時的にトランスフェクションされ、そしてCAT活
性についてアッセイされた。活性は、アセチル化の％と
して表示されている。プラスミドは、以下の通りであ
る。pSV2、pSV2−cat（正のコントロール）、pBL3、pBL
CAT−３（負のコントロール）、B:pBLCAT−３中のBamH
Iフラグメント、H:pBLCAT−３中のHind IIIフラグメン
ト、N:pBLCAT−３中のNla III−194フラグメント、194
＋:pBLCAT−３中のHind III−Nla III−194フラグメン
ト、なし:DNAなし。
b:コントロールは、低カルシウム（0.07mMCa+2）であ
り、Hi Ca+2は、1.2mM Ca+2であり、Hi Ca+2＋RAは、
1.2mM Ca+2及び10-6Mレチノイン酸である。
り、Hi Ca+2は、1.2mM Ca+2であり、Hi Ca+2＋RAは、
1.2mM Ca+2及び10-6Mレチノイン酸である。
配列のリスト
（１）一般的情報
（ｉ）出願人:Polakowska、Renata R.Goldsmith、Lo
well A. （ii）発明の名称：ヒト表皮遺伝子プロモーター （iii）配列の数:1 （iv）通信先： （Ａ）宛先:Scully、Scott、Murphy＆Presser （Ｂ）ストリート:400 Garden City Plaza （Ｃ）市:Garden City （Ｄ）州:NY （Ｅ）国:USA （Ｆ）ZIP:11530 （ｖ）コンピュータ読みだし可能フォーム： （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PCコンパチブル （Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウエア:Patentin Release＃1.0、バ
ージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願データ： （Ｃ）分類： （viii）代理人の情報： （Ａ）名前:DiGiglio、Frank S. （Ｂ）登録番号:31346 （Ｃ）参考／ドケット番号:8455 （ix）通信の情報： （Ａ）電話:516−742−4343 （Ｂ）ファックス:516−742−4366 （Ｃ）テレックス:230 901 SANS UR （２）SEQ ID NO:1に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:2003塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：両者 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （xi）配列の記述:SEQ ID NO:1:
well A. （ii）発明の名称：ヒト表皮遺伝子プロモーター （iii）配列の数:1 （iv）通信先： （Ａ）宛先:Scully、Scott、Murphy＆Presser （Ｂ）ストリート:400 Garden City Plaza （Ｃ）市:Garden City （Ｄ）州:NY （Ｅ）国:USA （Ｆ）ZIP:11530 （ｖ）コンピュータ読みだし可能フォーム： （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PCコンパチブル （Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウエア:Patentin Release＃1.0、バ
ージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願データ： （Ｃ）分類： （viii）代理人の情報： （Ａ）名前:DiGiglio、Frank S. （Ｂ）登録番号:31346 （Ｃ）参考／ドケット番号:8455 （ix）通信の情報： （Ａ）電話:516−742−4343 （Ｂ）ファックス:516−742−4366 （Ｃ）テレックス:230 901 SANS UR （２）SEQ ID NO:1に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:2003塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：両者 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （xi）配列の記述:SEQ ID NO:1:
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ゴールドスミス，ローウエル アラン
アメリカ合衆国ニューヨーク州 14534
ピッツフォード ウッドストーン ラ
イス 36
(56)参考文献 Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄ
ｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．96
（２），ｐ285−288（1991)
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ.
267（４），ｐ2282−2286（1992)
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ.
267（11），ｐ7710−7717（1992)
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ.
267（25），ｐ17858−17863（1992)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/09
C12N 1/19
C12N 5/10
A61K 48/00
A61P 17/00
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／Ｗ
ＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】ヒトタイプＩトランスグルタミナーゼ遺伝
子のプロモーター領域からの転写調節領域からなる単離
された核酸であり、該核酸が下記のフラグメントからな
る群から選ばれる単離された核酸。 （ａ）配列番号１の塩基485−1093のヌクレオチド配列
からなるBamH I制限フラグメント、 （ｂ）配列番号１の塩基1563−1760のヌクレオチド配列
からなるNla III制限フラグメント、 （ｃ）配列番号１の塩基616−1574のヌクレオチド配列
からなるHind III制限フラグメント、及び （ｄ）配列番号１の塩基616−1760のヌクレオチド配列
からなるHind III−Nla III制限フラグメント。 - 【請求項２】核酸が配列番号１の塩基485−1093のヌク
レオチド配列からなるBamH I制限フラグメントからな
り、該フラグメントがケラチン生成細胞特異的調節要素
及びカルシウム応答調節要素をコードするポリヌクレオ
チド配列からなる請求項１記載の核酸。 - 【請求項３】核酸が配列番号１の塩基1563−1760のヌク
レオチド配列からなるNla III制限フラグメントからな
り、該フラグメントがケラチン生成細胞特異的調節要
素、カルシウム応答調節要素及びレチノイン酸応答調節
要素をコードするポリヌクレオチド配列からなる請求項
１記載の核酸。 - 【請求項４】核酸が配列番号１の塩基616−1574のヌク
レオチド配列からなるHind III制限フラグメントからな
り、該フラグメントがカルシウム及びレチノイン酸応答
を阻害する負の調節要素をコードするポリヌクレオチド
配列からなる請求項１記載の核酸。 - 【請求項５】核酸が配列番号１の塩基616−1760のヌク
レオチド配列からなるHind III−Nla III制限フラグメ
ントからなり、該フラグメントがケラチン生成細胞特異
的調節要素、カルシウム応答調節要素及びレチノイン酸
応答調節要素をコードするポリヌクレオチド配列からな
る請求項１記載の核酸。 - 【請求項６】ヒトタイプＩトランスグルタミナーゼ遺伝
子のプロモーター領域からの転写調節領域からなる単離
された核酸であり、該核酸が配列番号１の塩基１−1757
のヌクレオチド配列からなる単離された核酸。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US82693192A | 1992-01-23 | 1992-01-23 | |
| US826,931 | 1992-01-23 | ||
| PCT/US1993/000537 WO1993015209A1 (en) | 1992-01-23 | 1993-01-22 | Human epidermal gene promoter |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002271623A Division JP2003159089A (ja) | 1992-01-23 | 2002-09-18 | ヒト表皮遺伝子プロモーター |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07505764A JPH07505764A (ja) | 1995-06-29 |
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Family
ID=25247882
Family Applications (2)
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| US20060148080A1 (en) * | 2004-12-30 | 2006-07-06 | Paul Diamond | Methods for supporting and producing human cells and tissues in non-human mammal hosts |
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|---|---|---|---|---|
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-
1994
- 1994-03-21 US US08/216,219 patent/US5643746A/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-09-18 JP JP2002271623A patent/JP2003159089A/ja active Pending
Non-Patent Citations (4)
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|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６７（１１），ｐ７７１０−７７１７（１９９２） |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６７（２５），ｐ１７８５８−１７８６３（１９９２） |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６７（４），ｐ２２８２−２２８６（１９９２） |
| Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９６（２），ｐ２８５−２８８（１９９１） |
Also Published As
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| DE69332373D1 (de) | 2002-11-14 |
| EP0625206A1 (en) | 1994-11-23 |
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| EP0625206B1 (en) | 2002-10-09 |
| US5643746A (en) | 1997-07-01 |
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