WO1999007749A1 - Compose chimique complexe, synthese et applications diverses dudit compose - Google Patents

Compose chimique complexe, synthese et applications diverses dudit compose Download PDF

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WO1999007749A1
WO1999007749A1 PCT/FR1998/001731 FR9801731W WO9907749A1 WO 1999007749 A1 WO1999007749 A1 WO 1999007749A1 FR 9801731 W FR9801731 W FR 9801731W WO 9907749 A1 WO9907749 A1 WO 9907749A1
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organic polymer
biomonomers
solid support
chemical compound
biopolymers
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PCT/FR1998/001731
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Claire Minard
Carole Chaix
Thierry Delair
Bernard Mandrand
Original Assignee
Bio Merieux
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/14—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
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    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support

Definitions

  • the subject of the present invention is a complex chemical compound, its method of synthesis and its use for the synthesis of biopolymers. It also relates to the use of reagents obtained for, among other things, the amplification of detection and / or capture of different biological targets.
  • ligands for example proteins, haptens, peptides, polypeptides, antibodies or polynucleotides to capture target molecules or anti-ligands (biological molecules or analogs), for the purpose of detecting and / or to measure them, especially in carrying out diagnostic tests.
  • FR2 707 010 which discloses reagents and a device for capturing a target molecule of the sandwich type, comprising a solid support on which a ligand is adsorbed, said ligand consisting of a conjugate resulting from the covalent coupling of an organic polymer with a plurality of biopolymers, said organic polymer being a copolymer of N-vinyl-pyrrolidone.
  • Patent application EP 561 722 discloses a water-soluble compound derived from a homopolymer or copolymer of maleic anhydride, which can be directly used to immobilize a biological molecule, without a prior activation step being necessary.
  • the water-soluble compounds are derivatives of copolymers of maleic anhydride, and are used to immobilize at minus one biological molecule, to which it is linked directly or indirectly.
  • Said biological molecule being chosen in particular from proteins such as antibodies or fragments of antibodies or antigens; polypeptides; enzymes; small molecules such as haptens; fragments of nucleic acids.
  • Patent application WO 84/03053 discloses a solid support of polysaccharide type to which is covalently linked a synthetic polymer obtained by polymerization of comonomers to which is optionally covalently attached one or more affinity ligand or ent active biological molecule such as for example an inhibitor, a cofactor, a prosthetic group, an enzyme, a hormone, an antibody, a nucleic acid.
  • affinity ligand or ent active biological molecule such as for example an inhibitor, a cofactor, a prosthetic group, an enzyme, a hormone, an antibody, a nucleic acid.
  • Patent application FR 2 605 237 discloses a porous support, for example of silica, on which is fixed by adsorption a polymer derived from polyvinylimidazole which comprises SH functions, and its use for purifying or separating proteins.
  • Patent application EP 591 807 discloses a polymer onto which one or more biologically active molecules of the same nature is grafted covalently.
  • These molecules can be, for example biotin, digoxin, digitoxigenin or oligonucleotides comprising from 1 to 80 nucleotide units, preferably 15 to 50, and in particular 20 to 35.
  • Patent application FR 2019083 discloses a water-soluble polymer-enzyme binary system, used for the enzymatic treatment of substrates, so that after treatment, the products of the enzymatic reaction are separated from the enzyme product- soluble polymer by passage through a semi-permeable membrane.
  • the oligonucleotide / organic polymer ligands are obtained by chemical grafting, by covalence, of said oligonucleotides previously synthesized on the reactive organic polymer or made reactive.
  • This chemical grafting constitutes a delicate step to be implemented in the sense that it does not make it possible to obtain an optimal orientation of the oligonucleotides and that it can lead to aggregated compounds whose accessibility of the oligonucleotides is limited (Syntheses and Characterization of Conjugates of Nucleic Acid Probes and 6-Aminoglucose-based Polymer ⁇ , Polymers for Advanced Technologies, (1996) volume 8, pp. 297-304).
  • the present invention therefore relates to a complex chemical compound capable of simplifying and improving the production of ligands according to the prior art, while preserving them.
  • the first object of the invention is a complex chemical compound comprising:
  • - at least one conjugate comprising: - a reactive organic polymer, the backbone of which comprises chemical reactive side functions on the one hand with respect to the surface groups of the solid support linked to the latter by covalent bonding, and on the other hand chemical side residues, - a plurality of initiating biomonomers connected to the organic polymer, respectively linked to said chemical residues of said organic polymer, by a covalent bond.
  • the above complex chemical compound, or intermediate reagent makes it possible to directly synthesize the biopolymers on the organic polymer, linked in turn by an optionally cleavable bond to a solid support.
  • the cleavage of the organic polymer / solid support bond restores in the original state the synthesized biopolymers linked to the organic polymer in the form of ligand.
  • the binding of initiator biomonomers to the organic polymer is not cleavable under the conditions of cleavage of the organic polymer / solid support bond.
  • ligands can be obtained which can be used for the amplification of detection and capture of target molecules, said ligands being oriented correctly, and having no aggregates.
  • these different ligands can have identical or different biopolymers, at least of mixed natures, such as oligonucleotides / peptides.
  • solid support means any material in the relatively inert native state capable of being functionalized, to which can be bound a reactive organic polymer as defined below, and which can be used as a support in detection tests, in affinity chromatography and in separation processes.
  • Natural, synthetic, chemically modified or non-synthetic materials can be used as solid support, in particular polysaccharides such as cellulose-based materials, for example paper, cellulose derivatives such as cellulose acetate and nitrocellulose , dextran, polymers such as polyvinyl chloride, polyethylene, polystyrene, polyamide, or copolymers based on vinyl and aromatic monomers, esters of unsaturated carboxylic acids, vinylidene chloride, dienes or compounds having nitrile functions (acrylonitrile), vinyl chloride / propylene copolymers, or vinyl chloride / vinyl acetate, copolymers based on glycidyl methacrylate and ethylene dimethyl methacrylate, copolymers based on s
  • the complex chemical compound comprises, as a functional solid support, a support of mineral or organic type, more preferably activated silica or functionalized polystyrene.
  • the solid support can be without limitation in the form of a microtiter plate, a sheet, a cone, a tube, a well, beads, particles or the like.
  • ligand is meant a complex formed of a reactive organic polymer coupled to a plurality of biopolymers, said ligand being for example the complex chemical compound after synthesis of the biopolymers, with or without cleavage of the solid support / organic polymer bond, said ligand being capable of binding to anti-ligands.
  • conjugate in the present invention an organic polymer linked to a plurality of initiator biomonomers.
  • biopolymers any molecule which can be synthesized in an automatic synthesizer, such as enzymes, hormones, receptors, antigenic determinants, antibodies, DNA, RNA, peptides, glycopeptides, oligosaccharides, and their derivatives and synthetic analogues.
  • biomonomers any basic unit, the polymerization of which by the addition of synthons leads to a biopolymer as defined above; in particular biomonomers chemically modified to bind to the organic polymer and play the role of initiating the polymerization of the biopolymer. Mention may be made of amino acids, nucleosides, nucleotides, saccharides, and their derivatives or analogues.
  • the initiating biomonomers are of the nucleotide and / or peptide and / or saccharide type. More preferably, the bio onomers are of nucleotide and peptide type.
  • reactive organic polymer means any polymer or copolymer, natural or synthetic, with a linear or branched, statistical, alternating, grafted or sequenced, essentially carbon skeleton, carrying once activated substituents allowing covalent reactions to be carried out with solid support and initiating biomonomers.
  • the polymer is a copolymer. It carries the biopolymers as lateral substituents linked to the polymer backbone, directly or indirectly, by covalent bonds, thanks to chemical side residues. It carries other lateral substituents present, identical or different from the preceding ones, as lateral substituents linked to the solid support, directly or indirectly, by cleavable covalent bonds, thanks to chemical lateral functions.
  • the units of copolymers which are not involved in the establishment of a covalent bond with the initiator biomonomers or the solid support serve in particular to space, in the copolymer, the units carrying the initiator biomonomers, and can thus serve to modulate, in known manner, the properties of the copolymer, for example the properties of solubility.
  • the polymer is a polymer carrying reactive functions of the electrophilic and / or thiol and / or disulfide type.
  • the polymer is a linear copolymer of maleic anhydride such as poly (maleic anhydride-alt-methyl vinyl ether), (maleic anhydride-alt-ethylene), (maleic anhydride-alt-stryrene) and (maleic anhydride-alt -N-vinylpyrrolidone) and can also be a copolymer of (N-vinylpyrrolidone / N-acryloxysuccinimide).
  • the reactive organic polymer or copolymer according to the invention has a molecular mass of between 10,000 and 1,000,000, more preferably between 30,000 and 70,000.
  • the copolymer comes for example from the copolymerization of a maleic anhydride monomer and a second suitable monomer, for example methyl vinyl ether, to allow the establishment of a covalent coupling between the copolymer and the solid support on the one hand, and the copolymer and the initiator biomonomers of somewhere else.
  • the maleic anhydride monomer carries carbonyl substituents, which can react with a hydroxyl function of the solid support to form a covalent bond of cleavable ester type under predetermined basic conditions, and for others can react with a primary amine function of an initiator biomonomer to form a non-cleavable amide-type covalent bond under the predetermined basic conditions.
  • the reactive organic polymer is a linear copolymer of maleic anhydride-alt-methyl vinyl ether.
  • the solid support is itself a polymer or a copolymer, it should be understood that it is in this different case of the reactive polymer, in its chemical nature for example.
  • reactive organic polymer refers to the fact that the polymer or copolymer carries, before or after activation, reactive chemical substituents, in particular of the electrophilic and / or thiol and / or disulfide type. These substituents can be, for example, the aldehyde, epoxy, haloal yl, ester, carbonyl, isocyanate, isothiocyanate, carbon-activated carbon double bond and maleimide, vinyl sulfone groups.
  • lateral function means reactive chemical function, making it possible to carry out any covalent bond, these are for example the electrophilic and / or thiol and / or disulfide radicals cited above, or any other group known to those skilled in the art, and chosen as a function of the desired covalent bond.
  • targets or “target molecules” or “anti-ligands” means any molecules capable of being linked to the ligands via biopolymers, in particular nucleic acids such as DNA or RNA or their fragments, simple or double strands, antigens, haptens, peptides, proteins, glycoproteins, hormones, antibodies, oligosaccharides, drugs, their derivatives and synthetic analogues.
  • nucleic acids such as DNA or RNA or their fragments, simple or double strands, antigens, haptens, peptides, proteins, glycoproteins, hormones, antibodies, oligosaccharides, drugs, their derivatives and synthetic analogues.
  • the ligand / anti-ligand reaction can be carried out directly or indirectly.
  • the ligand is specific for the target molecule.
  • the ligand is in particular chosen to be capable of forming a ligand / target molecule duplex.
  • the duplex can in particular be represented by any couple antigen / antibody, antibody / hapten, chelator / chelated molecule, polynucleotide / polynucleotide, polynucleotide / nucleic acid hybrids, oligosaccharide / oligosaccharide hybrids, hormone / receptor.
  • the ligand is capable of forming a duplex with a bi-functional reagent comprising an "anti-ligand" group, responsible for the formation of the duplex with the ligand, and in which said anti-ligand group is linked , in particular by covalence, in a known manner, to a partner group of the target.
  • the target partner group is a group capable of binding with the target (by forming a target / partner complex) and is therefore capable of capturing the target, under test conditions, by establishing a sufficiently strong bond. to ensure the target-partner interaction, for example by covalence and / or by ionic interactions and / or by hydrogen bonds and / or by hydrophilic hydrophobic bonds.
  • the ligand / anti-ligand duplex can in this case be any couple mentioned above for the direct type reaction, or else a biotin / streptavidin, lectin / sugar or the like duplex.
  • the ligand / anti-ligand complex is a polynucleotide / polynucleotide hybrid.
  • the partner / target complex is of the same type as the ligand / target complex mentioned above for the direct type reaction.
  • a second subject of the invention is the process for the chemical synthesis of a complex chemical compound which is the subject of the invention and as described above, comprising a plurality of biomonomers, comprising the following steps: a) a functional support comprising surface groupings; b) at least one reactive organic polymer is available, the backbone of which comprises, on the one hand, chemical side functions complementary to the surface groups of the solid support, and on the other hand chemical side residues, said solid support being inert with respect to -vis of said organic polymer; c) there are biomonomers which initiate biopolymerization, identical or different, comprising on the one hand a reactive substituent and on the other hand a protective group; d) reacting at least one organic polymer:
  • the preceding synthesis process is preferably carried out by reacting at least one organic polymer with a plurality of initiator biomonomers, in order to graft these covalently, directly or indirectly, with a plurality of lateral residues of said organic polymer, then reacting the organic polymer linked to the initiating biomonomers with the support solid, to establish at least one covalent bond between a surface group of said solid support and a residue of said organic polymer.
  • the process comprises, after step c and before step d, step: c ') the organic polymer is reacted with a reagent generating spacer arms, to grafting onto a plurality of lateral remains of said organic polymer a plurality of spacer arms respectively, each having at their free end a reactive function.
  • the spacer arm can be:
  • the chemical compound according to the invention is characterized in that the initiating biomonomers are extended and polymerized with synthons each according to a predetermined sequence to obtain biopolymers.
  • the chemical compound according to the invention is characterized in that the biopolymers are of oligonucleotide and / or peptide and / or oligonucleotide-peptide type.
  • the chemical compound is characterized in that the biopolymers form with the organic polymer ligands capable of binding directly or indirectly to anti-ligands.
  • a third object of the invention is the use of the complex chemical compound according to the invention for carrying out the synthesis of biopolymers, comprising the steps of: f) we have identical or different synthons, g) by successive coupling / deprotection cycles, the chains of the biopolymers are grown from the initiator biomonomers respectively, according to at least one and the same predetermined sequence of synthons.
  • This synthesis directly on the reactive polymer linked to the solid support makes it possible to obtain a well-defined and correctly oriented biopolymer for detecting and / or capturing target molecules of identical nature.
  • the synthesis makes it possible to obtain different biopolymers, such as oligonucleotides and peptides, on the same reactive polymer. It is also possible, by this facilitated synthesis, to obtain in several stages dibiopolymers such as oligonucleotides-peptides, which can for example make it possible to detect in the same sample nucleic and protein materials.
  • a fourth object of the invention is the complex chemical compound obtained by the process described previously and its use for different applications, in particular the amplification of capture and / or detection of biological targets, in different bioassay formats (microtiter plate, chromatography, bands, etc.), oligonucleotide sequencing, site-directed mutagenesis , in therapy and other applications adapted to the use of the complex chemical compound according to the invention.
  • the reagent obtained can be used to amplify the capture and detection of biological targets.
  • synthesis of a complex chemical compound comprising:
  • a reactive organic polymer the skeleton of which comprises chemical reactive side functions on the one hand with respect to the surface groups of the solid support linked to the latter by covalent bonding, and on the other hand chemical side residues, - a plurality of mixed initiator biomonomers connected to the organic polymer, linked respectively to said chemical residues of said organic polymer, by a covalent bond, characterized in that the mixed initiator biomonomers are extended and polymerized with other synthons each according to a predetermined sequence of said synthons to obtain mixed biopolymers, such as oligonucleotide and peptide.
  • the chemical compound comprises biopolymers of oligonucleotide and peptide or oligonucleotide-peptide type.
  • the complex chemical compound comprises biopolymers forming with the organic polymer to which they are linked ligands capable of being linked directly or indirectly to anti-ligands.
  • reagents or ligands are obtained, in particular ligands consisting of an organic polymer linked to biopolymers of mixed natures, for example peptides / oligonucleotides, capable of 'be used for amplification of capture and detection of target molecules.
  • ligands consisting of an organic polymer linked to biopolymers of mixed natures, for example peptides / oligonucleotides, capable of 'be used for amplification of capture and detection of target molecules.
  • These complex polymer / oligonucleotide / peptide compounds can also be used in therapy.
  • the oligonucleotide can be an antisense agent and the peptide can be fusogenic, the compound can be used to regulate gene expression and optimize the internalization of the complex in cells.
  • S stands for "support” in Figures 1 and 3.
  • G stands for
  • FIG. 1 represents different possible forms of the complex chemical compound according to the invention, and of the corresponding ligand.
  • Figures l (a) and l (a ') represent the complex chemical compound and the corresponding ligand whose biopolymers are oligonucleotides having the same nucleic acid sequence.
  • Figures l (b) and l (b ') represent the complex chemical compound and the corresponding ligand, the biopolymers of which are oligonucleotides and peptides.
  • Figures l (c) and l (c ') represent the complex chemical compound and the corresponding ligand, the biopolymers of which are oligonucleotides and oligonucleotide-peptides.
  • FIG. 2 represents four examples of initiator oligomer.
  • the radicals R being for: the monomer I: Dimethoxytrityl, Tertiobutyldimethysilyl, photolabile group, the monomer II: Monomethoxytrityl, Fluorenylmethoxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl, photolabile group,
  • FIG. 3 represents the general scheme for the synthesis of a complex chemical compound according to Example 1.
  • Fluka silica beads (CPG, controlled pore size glass) with a diameter of 2000A, particle size 40-85 ⁇ m and an area of 9.2 m 2 / g are available.
  • the glass beads (100-150 ⁇ m) come from the company Polysciences, Inc.
  • the H-NMR spectra were recorded on a Bruker AM400 spectrometer operating in a Fourier transformation mode.
  • the chemical shifts H were expressed in ppm with reference to the TMS.
  • the H signal assignments were made by two-dimensional H-H NMR experiments in a homonuclear relationship.
  • the mass analyzes were carried out on a ZAB2-SEQ FAB + spectrometer with a thio-glycerol matrix.
  • the polymer used is an alternating copolymer of maleic anhydride and methyl vinyl ether P (AMMVE) supplied by Polysciences, Inc. (Mn 67000g / mol).
  • oligodeoxyribonucleotides were synthesized on an ABI 394 instrument (Applied Biosystems, San Francisco, USA) using standard chemistry of DNA ⁇ kind cyanoethyl N, N-diisopropylamino phosphoramidite.
  • the beads were suspended in 10 ml of hexaethylene glycol with 6 l of sulfuric acid (more than 95%). The mixture is mixed gently and the reaction is carried out overnight at 90 ° C., then the beads are washed with anhydrous acetone and dried in a desiccator.
  • the sequence chosen is a HBV (hepatitis B virus) capture sequence.
  • Example 2 The same synthetic principle as in Example 1 is used but using as an organic reactive polymer other anhydride copolymers maleic such as copolymers (maleic anhydride-alt-ethylene), (maleic anhydride-alt-styrene), (maleic anhydride-alt-N-vinylpyrrolidone) or P (AMMVE) of another size (MM10.000 to 1.000 .000).
  • maleic such as copolymers (maleic anhydride-alt-ethylene), (maleic anhydride-alt-styrene), (maleic anhydride-alt-N-vinylpyrrolidone) or P (AMMVE) of another size (MM10.000 to 1.000 .000).
  • 224 nmol of polymer were dissolved in 1 ml of anhydrous DMSO at 37 ° C.
  • 10 mg (13.8 mol) of the nucleotide (I), modified in 3 ′ by an amino arm were dissolved in 1 ml of DMSO.
  • Example 2 Same principle of synthesis as in Example 1, using a solid support based on polystyrene. 224 nmol of polymer were dissolved in 1 ml of anhydrous DMSO at 37 ° C. In parallel, 10 mg (13.8 mol) of the nucleotide (I), modified in 3 ′ by an amino arm, were dissolved in 1 ml of DMSO. 20 nmol of copolymer, 2 mol of (I) and 1 mol of dimethylaminopyridine (DMAP- solution at 10 mg / ml in DMSO) are dissolved in a sufficient amount of anhydrous DMSO to reach a final volume of 1 ml.
  • DMAP- solution dimethylaminopyridine
  • the reaction is stirred at room temperature for 1 hour, then 90 mg of particles based on polystyrene (co-polystyrene resin-1% divinylbenzene, conventionally called Wang resin) functionalized with 4-hydroxymethylphenoxymethyl ends, or 90 mg of polystyrene-co-divinylbenzene (solid support) functionalized with 4-hydroxymethyl-phenylacetamidomethyl ends (PAM resin), or 90 mg of a composite support based on polyacrylamide and an inorganic matrix (Kieselguhr) functionalized by ends 4-hydroxymethyl-phenoxyacetyls (Novabiochem), or 90 mg of a polystyrene support functionalized with polyethylene glycol terminated by a hydroxyl or p-oxybenzyl alcohol function (Novabiochem), or 90 mg of all polystyrene-based resins functionalized by an arm hydroxyl spacer, are added to the solution.
  • the reaction is stirred overnight at room temperature.
  • the supports are then filtered and was
  • Example 5 The polystyrene-based supports are functionalized as described above with P (AMMVE) and the biomonomer (I) and / or the monomer (II) in order to initiate peptide synthesis on solid phase using Fmoc chemistry.
  • nucleic acid fragments will be synthesized before the peptides.
  • Syntheses of oligonucleotides or peptides are carried out on a spherical support based on porous or non-porous silica, or on polystyrene functionalized with a linear copolymer of maleic anhydride linked to the support by a spacer arm stable in basic medium.
  • the objective is not to unhook the conjugate (copolymer / biomolecules) after synthesis.
  • These reagents can be used for the capture of biological entity (gene fragments, antigen, antibody) directly from biological media.
  • the reaction is stirred at ambient temperature for 1 hour, then 90 mg of CPG 2000A silica beads (Control Pores Glass) or 100 mg of glass (Glass Beads) or 100 mg of polystyrene beads functionalized with an amino spacer are added to the solution.
  • the reaction is continued overnight, at room temperature.
  • the supports are then filtered and washed meticulously with DMSO, anhydrous acetone and then dried under vacuum in the presence of Calcium Chloride.
  • Example 7 Same protocol for the synthesis of spherical supports as in Example 1, or in Example 6, using initiator monomers of oligonucleotide syntheses of type (I), or using initiator monomers of peptide syntheses of type (I) II) or by using initiator monomers of type (III) or (IV), having a photolabile protective group at the site of initiation of the synthesis of the biopolymer.
  • the photolabile group used may be, for example, 6-nitroveratryl, 6-nitropiperonyl, methyl-6-nitroveratryl, nitroveratryloxycarbonyl, methyl-6-nitropiperonyl, nitrobenzyl, nitrobenzyloxycarbonyl, dimethyldimethoxybenzyl, dimethylbenzylcarbonyl 7-bromo-nitroindolinyl, hydroxy-methylcinnamoyl, 2-oxymethylene anthraquinone, pirenylmethoxycarbonyl.
  • the initiation of the synthesis of the biopolymer will be done by exposure of the support to a range of suitable wavelengths.
  • Example 8 Example 8:
  • Example 7 Same concept as in Example 7, using flat supports (silicon wafer, micro silica plate) silanized on the surface with an amino silane and then covered with a linear polymer based on maleic anhydride.
  • the amino functions of the spacer arm will react with the hydrophilic functions of the polymer to create a stable amide function in basic medium.
  • syntheses of oligonucleotides and / or peptides can be initiated in a controlled manner.
  • the plates are treated beforehand in an acidic or basic medium or, if a system of specific masks is used, they can be exposed to radiation on delimited areas of their surface, in order to eliminate the photolabile groups.
  • the reactive functions thus released, syntheses of biopolymers can be developed on the surface by the conventional methods of chemistry on support.
  • These functionalized matrices can be used for gene sequencing or antibody screening.

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Abstract

Le composé chimique complexe comprend un support solide et au moins un conjugué constitué d'un polymère organique et d'une pluralité de biomonomères amorceurs. Synthèse dudit composé chimique, et utilisation dudit composé chimique complexe pour la synthèse de biopolymères. Utilisation du composé chimique complexe après la synthèse en tant que ligand pour l'amplification de la détection et/ou de la capture de molécules cibles.

Description

COMPOSE CHIMIQUE COMPLEXE, SYNTHESE ET APPLICATIONS DIVERSES DUDIT COMPOSE
La présente invention a pour objet un composé chimique complexe, son procédé de synthèse ainsi que son utilisation pour la synthèse de biopolymères. Elle concerne également l'utilisation des réactifs obtenus pour entre autre l'amplification de détection et/ou de capture de différentes cibles biologiques.
Il est connu aujourd'hui d'utiliser des ligands, par exemple des protéines, haptènes, peptides, polypeptides, anticorps ou polynucleotides pour capturer des molécules cibles ou anti-ligands (molécules biologiques ou analogues) , dans le but de détecter et/ou de les doser, notamment dans la réalisation d'essais de diagnostic.
On connaît la demande WO 91/08307 qui divulgue des réactifs et un procédé pour amplifier la capture de molécules cibles en utilisant des oligonucléotides attachés de manière covalente à un polymère. On connaît également la demande de brevet
FR2 707 010 qui divulgue des réactifs et un dispositif de capture d'une molécule cible de type sandwich, comprenant un support solide sur lequel est adsorbé un ligand, ledit ligand étant constitué d'un conjugué résultant du couplage covalent d'un polymère organique avec une pluralité de biopolymères, ledit polymère organique étant un copolymère de N-vinyl-pyrrolidone.
La demande de brevet EP 561 722 divulgue un composé hydrosoluble dérivé d'un homopolymère ou copolymère d'anhydride maléique, directement utilisable pour immobiliser une molécule biologique, sans qu'une étape préalable d'activation ne soit nécessaire. Les composés hydrosolubles sont des dérivés de copolymères de l'anhydride maléique, et sont utilisés pour immobiliser au moins une molécule biologique, à laquelle il est lié directement ou indirectement. Ladite molécule biologique étant notamment choisie parmi les protéines telles que les anticorps ou des fragments d'anticorps ou des antigènes; des polypeptides; des enzymes; des petites molécules telles que des haptènes; des fragments d'acides nucléiques.
La demande de brevet WO 84/03053 divulgue un support solide de type polysaccharides auquel est lié par covalence un polymère de synthèse obtenu par polymérisation de comonomères sur lequel est fixé éventuellement par covalence un ou plusieurs ligand d'affinité ou molécule biologique ent active tels que par exemple un inhibiteur, un cofacteur, un groupe prosthetique, une enzyme, une hormone, un anticorps, un acide nucléique.
La demande de brevet FR 2 605 237 divulgue un support poreux, par exemple de silice, sur lequel est fixé par adsorption un polymère dérivé de polyvinylimidazole qui comporte des fonctions SH, et son utilisation pour purifier ou séparer des protéines.
La demande de brevet EP 591 807 divulgue un polymère sur lequel est greffé de manière covalente une ou plusieurs molécules biologiquement actives de même nature. Ces molécules pouvant être par exemple la biotine, la digoxine, la digitoxigénine ou des oligonucléotides comprenant de 1 à 80 unités nucléotidiques, de préférence 15 à 50, et en particulier 20 à 35.
La demande de brevet FR 2019083 divulgue un système binaire polymère-enzyme soluble dans l'eau, utilisé pour traiter par voie enzymatique des substrats, de telle manière qu'après traitement, les produits de la réaction enzymatique soient séparés du produit enzyme- polymère soluble par passage à travers une membrane semi- perméable.
Il est donc évident que ces polymères greffés à plusieurs oligonucléotides présentent un grand intérêt pour l'amplification dans les tests de détection.
Jusqu'à aujourd'hui, les ligands oligonucléotides/polymèreε organiques sont obtenus par greffage chimique, par covalence, desdits oligonucléotides préalablement synthétisés sur le polymère organique réactif ou rendu réactif.
Ce greffage chimique constitue une étape délicate à mettre en oeuvre en ce sens qu'elle ne permet pas d'obtenir une orientation optimale des oligonucléotides et qu'elle peut conduire à des composés agrégés dont l'accessibilité des oligonucléotides est limitée (Synthèses and Characterisation of Conjugates of Nucleic Acid Probes and 6-Aminoglucose-based Polymerε, Polymers for Advanced Technologies , (1996) volume 8 , pp .297-304) .
La présente invention a donc pour objet un composé chimique complexe susceptible de simplifier et d'améliorer l'obtention des ligands selon l'art antérieur, tout en les préservant.
L'invention a pour premier objet un composé chimique complexe comprenant:
- un support solide fonctionnel comprenant des groupements surfaciques chimiques,
- au moins un conjugué comprenant : - un polymère organique réactif dont le squelette comporte d'une part des fonctions latérales chimiques réactives vis-à-vis des groupements surfaciques du support solide liées à ces derniers par liaison covalente, et d'autre part des restes latéraux chimiques, - une pluralité de biomonomères amorceurs branchés sur le polymère organique, liés respectivement auxdits restes chimiques dudit polymère organique, par une liaison covalente.
Le composé chimique complexe précédent, ou réactif intermédiaire, permet de synthétiser directement les biopolymères sur le polymère organique, lié quant à lui par une liaison éventuellement clivable à un support solide.
Le clivage de la liaison polymère organique/support solide restitue à l'état originel les biopolymères synthétisés liés au polymère organique sous forme de ligand. La liaison des biomonomères amorceurs au polymère organique n'est pas clivable dans les conditions de clivage de la liaison polymère organique/support solide. Les avantages de la présente invention sont multiples puisqu'il est possible, après synthèse des biopolymères, soit d'utiliser le ligand tel quel, soit de cliver les liaisons covalentes support solide/polymère organique afin d'utiliser les ligands. Dans le cas où on ne clive pas les liaisons covalentes, on peut utiliser ce ligand pour l'amplification de détection et de capture de molécules cibles ou d'autres utilisations. L'avantage de ce type de ligand est que les biopolymères du ligand sont orientés de manière correcte, et ne présentent pas d'agrégats. Dans le cas ou l'on clive la liaison covalente, on obtient des ligands utilisables pour l'amplification de détection et de capture de molécules cibles, lesdits ligands étant orientés de manière correcte, et ne présentant pas d'agrégats. De plus, ces différents ligands peuvent présenter des biopolymères identiques ou différents, au moins de natures mixtes, tels que oligonucléotides/peptides.
On entend par "support solide", tout matériau à l'état natif relativement inerte, susceptible d'être fonctionnalisé, sur lequel peut être lié un polymère organique réactif tel que défini ci-dessous, et qui peut être utilisé comme support dans des tests de détection, en chromatographie d'affinité et dans des processus de séparation. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés ou non chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose, du dextran, des polymères tels que polychlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrène, polyamide, ou copolymères à base de monomères vinyliques et aromatiques, esters d'acides carboxyliques insaturés, chlorure de vinylidène, diènes ou composés présentant des fonctions nitrile (acrylonitrile) , des copolymères chlorure de vinyle/propylène, ou chlorure de vinyle/acétate de vinyle, des copolymères à base de méthacrylate de glycidyle et d'éthylène diméthyl méthacrylate, des copolymères à base de styrène ou de dérivés substitués du styrène, des fibres naturelles telles que le coton et des fibres synthétiques telles que un polyamide, des matériaux inorganiques tels que la silice, le verre, la céramique, le quartz, des latex, c'est-à-dire des dispersions aqueuses colloïdales de polymère insoluble dans l'eau, des particules magnétiques, des dérivés métalliques.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le composé chimique complexe comprend en tant que support solide fonctionnel, un support de type minéral ou organique, de préférence encore de la silice activée ou du polystyrène fonctionnalisé.
Le support solide peut être sans limitation sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une feuille, d'un cône, d'un tube, d'un puits, de billes, de particules ou analogues.
Par "fonctionnel", on entend la caractéristique selon laquelle le support a été rendu chimiquement réactif par toute méthode dite de "fonctionnalisation" , traditionnelle ou connue en soi par l'homme du métier, en fonction de la nature chimique du support, et qui génère lesdits groupements surfaciques.
Par "ligand", on entend un complexe formé d'un polymère organique réactif couplé à une pluralité de biopolymeres, ledit ligand étant par exemple le composé chimique complexe après synthèse des biopolymeres, avec ou sans clivage de la liaison support solide/polymère organique, ledit ligand étant susceptible de se lier à des anti-ligands.
Par "conjugué", on entend dans la présente invention un polymère organique lié à une pluralité de biomonomères amorceurs .
Par "biopolymeres" , on entend toute molécule que l'on peut synthétiser dans un synthétiseur automatique, tels que enzymes, hormones, récepteurs, déterminants antigéniques, anticorps, ADN, ARN, les peptides, les glycopeptides, les oligosaccharides, et leurs dérivés et analogues synthétiques. Par "biomonomères", on entend toute unité de base dont la polymérisation par addition de synthons conduit à un biopolymère tels que défini précédemment ; notamment des biomonomères chimiquement modifiés pour se lier au polymère organique et jouer le rôle d'amorçage de la polymérisation du biopolymère. On peut citer les acides aminés, les nucléosideε, les nucléotides, les saccharides, et leurs dérivés ou analogues.
Par "synthon", on entend tout biomonomère permettant la synthèse de biopolymères. Par "liaison covalente clivable", on entend toute liaison fixe chimiquement qui peut être clivée par une réaction chimique, photochimique, thermique ou enzymatique. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, les biomonomères amorceurs, identiques ou différents, sont de type nucléotidiques et/ou peptidiques et/ou saccharidiques. De préférence encore les bio onomères sont de type nucléotidiques et peptidiques. On entend par "polymère organique réactif", tout polymère ou copolymère, naturel ou synthétique, avec un squelette linéaire ou branché, statistique, alterné, greffé ou séquence, essentiellement carboné, portant une fois activé des substituants permettant d'effectuer des réactions covalentes avec le support solides et les biomonomères amorceurs. De préférence, le polymère est un copolymère. Il porte les biopolymères en tant que substituants latéraux liés au squelette polymère, directement ou indirectement, par des liaisons covalentes, grâce à des restes latéraux chimiques. Il porte d'autres substituants latéraux présents, identiques ou différents des précédents, en tant que substituants latéraux liés au support solide, directement ou indirectement, par des liaisons covalentes clivables, grâce à des fonctions latérales chimiques.
Les motifs de copolymères qui ne sont pas impliqués dans l'établissement d'une liaison covalente avec les biomonomères amorceurs ou le support solide servent notamment à espacer, dans le copolymère, les motifs portant les biomonomères amorceurs, et peuvent ainsi servir à moduler, de façon connue, les propriétés du copolymère, par exemple les propriétés de solubilité. De préférence le polymère est un polymère portant des fonctions réactives de type électrophile et/ou thiol et/ou disulfure.
De préférence encore le polymère est un copolymère linéaire d'anhydride maléique tel que poly (anhydride maléique-alt-méthyl vinyl éther) , (anhydride maléique-alt- éthylène) , (anhydride maléique-alt-stryrène) et (anhydride maléique-alt-N-vinylpyrrolidone) et peut être aussi un copolymère de (N-vinylpyrrolidone/N-acryloxysuccinimide) . Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le polymère ou copolymère organique réactif selon l'invention a une masse moléculaire comprise entre 10000 et 1000000, de préférence encore entre 30000 et 70000. Le copolymère provient par exemple de la copolymérisation d'un monomère d'anhydride maléique et d'un deuxième monomère approprié par exemple le méthyl vinyl éther, pour permettre l'établissement d'un couplage covalent entre le copolymère et le support solide d'une part, et le copolymère et les biomonomères amorceurs d'autre part. Le monomère d'anhydride maléigue porte des substituants carbonyles, qui peuvent réagir avec une fonction hydroxyle du support solide pour former une liaison covalente de type ester clivable dans des conditions basiques prédéterminées, et pour d'autres peuvent réagir avec une fonction aminé primaire d'un biomonomère amorceur pour former une liaison covalente de type amide non clivable dans les conditions basiques prédéterminées . A titre d'exemple, le polymère organique réactif est un copolymère linéaire d'anhydride maléique-alt-méthyl vinyl éther.
Lorsque le support solide est lui-même un polymère ou un copolymère, il doit être entendu qu'il est dans ce cas différent du polymère réactif, dans sa nature chimique par exemple.
Le terme polymère organique "réactif" se rapporte au fait que le polymère ou copolymère porte, avant ou après activation , des substituants chimiques réactifs, notamment de type électrophile et/ou thiol et/ou disulfure. Ces substituants peuvent être par exemple les groupements aldéhyde, époxy, halogénoal yle, ester, carbonyle, isocyanate, isothiocyanate, double liaison carbone-carbone activée et maléimide, vinyl sulfone.
De manière générale, les termes "fonction latérale", "groupement surfacique" et "reste latéral" signifient fonction chimique réactive, permettant d'effectuer toute liaison covalente, il s'agit par exemple des radicaux electrophiles et/ou thiol et/ou disulfure cités ci-dessus, ou tout autre groupement connu de l'homme du métier, et choisi en fonction de la liaison covalente recherchée.
On entend par "cibles" ou "molécules cibles" ou "anti-ligands" , toutes molécules susceptibles d'être liées aux ligands par l'intermédiaire des biopolymères, notamment les acides nucléiques tels qu'ADN ou ARN ou leurs fragments, simples ou doubles brins, les antigènes, les haptènes, les peptides, les protéines, les glycoprotéines, les hormones, les anticorps, les oligosaccharides, les médicaments, leurs dérivés et analogues synthétiques.
La réaction ligand /anti-ligand peut se faire de manière directe ou indirecte. Dans une réaction de type direct, le ligand est spécifique de la molécule cible. Le ligand est notamment choisi pour être susceptible de former un duplex ligand/molécule cible. A titre d'exemple le duplex peut notamment être représenté par tout couple antigène/anticorps, anticorps/haptène, chélatant/molécule chélatée, les hybrides polynucléotide/polynucléotide, polynucléotide/acide nucléique, les hybrides oligosaccharide/oligosaccharide, hormone/récepteur . Dans une réaction de type indirect, le ligand est capable de former un duplex avec un réactif bi-fonctionnel comprenant un groupement "anti-ligand", responsable de la formation du duplex avec le ligand, et dans lequel ledit groupement anti-ligand est lié, notamment par covalence, de façon connue, à un groupe partenaire de la cible. Le groupe partenaire de la cible est un groupement capable de se lier avec la cible (en formant un complexe cible/partenaire) et est donc capable de capturer la cible, dans des conditions de l'essai, par établissement d'une liaison suffisamment forte pour assurer l'interaction cible-partenaire, par exemple par covalence et/ou par interaction ioniques et/ou par liaisons hydrogènes et/ou par liaisons hydrophobes hydrophiles. Le duplex ligand/anti-ligand peut être dans ce cas tout couple mentionné ci-dessus pour la réaction de type direct, ou encore un duplex biotine/streptavidine, lectine/sucre ou analogues. En particulier le complexe ligand/anti-ligand est un hybride polynucléotide/polynucléotide. Le complexe partenaire/cible est du même type que le complexe ligand/cible mentionné ci-dessus pour la réaction de type direct.
Un deuxième objet de l'invention est le procédé de synthèse chimique d'un composé chimique complexe objet de l'invention et tel que décrit ci-dessus, comprenant une pluralité de biomonomères, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un support fonctionnel comprenant des groupements surfaciques ; b) on dispose d'au moins un polymère organique réactif dont le squelette comporte d'une part des fonctions latérales chimiques complémentaires des groupements surfaciques du support solide, et d'autre part des restes latéraux chimiques, ledit support solide étant inerte vis-à-vis dudit polymère organique ; c) on dispose de biomonomères amorceurs de biopolymérisation, identiques ou différents, comprenant d'un côté un substituant réactif et d'un autre côté un groupement protecteur ; d) on fait réagir au moins un polymère organique :
- soit avec le support solide, pour établir au moins une liaison covalente entre un groupement surfacique dudit support solide et un reste latéral dudit polymère organique, puis on fait réagir le polymère organique lié au support solide avec une pluralité de biomonomères amorceurs, pour greffer ces derniers par covalence, directement ou indirectement, avec une pluralité de restes latéraux dudit polymère organique ;
- soit avec une pluralité de biomonomères amorceurs, pour greffer ces derniers par covalence, directement ou indirectement, avec une pluralité de restes latéraux dudit polymère organique, puis on fait réagir le polymère organique lié aux biomonomères amorceurs avec le support solide, pour établir au moins une liaison covalente entre un groupement surfacique dudit support solide et un reste dudit polymère organique.
Le procédé de synthèse précédent s'effectue de préférence en faisant réagir au moins un polymère organique avec une pluralité de biomonomères amorceurs, pour greffer ces derniers par covalence, directement ou indirectement, avec une pluralité de restes latéraux dudit polymère organique, puis on fait réagir le polymère organique lié aux biomonomères amorceurs avec le support solide, pour établir au moins une liaison covalente entre un groupement surfacique dudit support solide et un reste dudit polymère organique.
Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé comprend, après l'étape c et avant l'étape d, l'étape : c') on fait réagir le polymère organique avec un réactif générateur de bras espaceurs, pour greffer sur une pluralité de restes latéraux dudit polymère organique une pluralité de bras espaceurs respectivement, comportant chacun à leur extrémité libre une fonction réactive.
Par exemple, le bras espaceur peut être:
R-0-(CH2)n-NH2 dans lequel R est un groupement diméthoxytrityle, tertiobutyldiméthysilyle ou un groupement photolabile.
Selon un autre mode préférentiel, le composé chimique selon 1 ' invention est caractérisé en ce que les biomonomères amorceurs sont prolongés et polymérisés avec des synthons chacun selon une séquence prédéterminée pour obtenir des biopolymères.
Selon un mode très préférentiel de l'invention, le composé chimique selon 1 ' invention est caractérisé en ce que les biopolymères sont de type oligonucleotide et/ou peptide et/ou oligonucléotide-peptide. Selon un autre mode très préférentiel de l'invention, le composé chimique est caractérisé en ce que les biopolymères forment avec le polymère organique des ligands susceptibles de se lier directement ou indirectement à des anti-ligands. Un troisième objet de l'invention est l'utilisation du composé chimique complexe selon l'invention pour effectuer la synthèse des biopolymères, comprenant les étapes de: f) on dispose de synthons identiques ou différents, g) par cycles successifs de couplage/déprotection, on fait croître les chaînes des biopolymeres à partir des biomonomères amorceurs respectivement, selon au moins une même séquence prédéterminée de synthons .
Pour effectuer des synthèses de biopolymeres différents, que ce soit des oligonucléotides/oligonucléotides ou peptides/peptides ou oligonucléotides/peptides, l'homme du métier saura choisir les biomonomères amorceurs appropriés avec des groupements protecteurs sensibles ou non aux réactions chimiques effectuées. Ainsi, il est possible d'effectuer une première synthèse d'un premier groupe de biopolymeres tout en gardant un deuxième groupe de biomonomères amorceurs protégés, et ensuite d'effectuer une seconde synthèse de biopolymères sur le deuxième groupe de biomonomères amorceurs déprotégés. Les avantages de la synthèse des biopolymères sur le composé chimique complexe selon l'invention sont multiples. Cette synthèse directement sur le polymère réactif lié au support solide permet d'obtenir un biopolymère bien défini et orienté de manière correcte pour effectuer la détection et/ou la capture de molécules cibles de nature identique. De plus, la synthèse permet d'obtenir des biopolymères différents, tels que oligonucléotides et peptides, sur le même polymère réactif. Il est également possible, par cette synthèse facilitée, d'obtenir en plusieurs étapes des dibiopolymères tels que oligonucléotides-peptides, pouvant par exemple permettre de détecter dans un même échantillon des matériels nucléiques et protéiques.
Un quatrième objet de l'invention est le composé complexe chimique obtenu par le procédé décrit précédemment et son utilisation pour différentes applications, notamment l'amplification de capture et/ou de détection de cibles biologiques, sous différents formats de bioessais (plaque de microtitrage, chromatographie, bandes, etc.), le séquençage d' oligonucléotides, la mutagénèse dirigée, en thérapeutique et autres applications adaptées à l'utilisation du composé chimique complexe selon 1 ' invention. Dans la mesure où l'on ne clive pas les liaisons covalentes liant le support aux polymères organiques, le réactif obtenu peut être utilisé pour amplifier la capture et la détection de cible biologiques.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, on effectue la synthèse d'un composé chimique complexe comprenant:
- un support solide fonctionnel comprenant des groupements surfaciques chimiques,
- au moins un conjugué comprenant:
- un polymère organique réactif dont le squelette comporte d'une part des fonctions latérales chimiques réactives vis-à-vis des groupements surfaciques du support solide liées à ces derniers par liaison covalente, et d'autre part des restes latéraux chimiques, - une pluralité de biomonomères amorceurs mixtes branchés sur le polymère organique, liés respectivement auxdits restes chimiques dudit polymère organique, par une liaison covalente, caractérisé en ce que les biomonomères amorceurs mixtes sont prolongés et polymérisés avec d'autres synthons chacun selon une séquence prédéterminée desditε synthons pour obtenir des biopolymères mixtes, tels que oligonucleotide et peptide.
Dans un autre mode de réalisation préféré selon 1 'invention, le composé chimique comprend des biopolymères de type oligonucleotide et peptide ou oligonucléotide-peptide .
Dans encore un autre mode de réalisation selon l'invention, le composé chimique complexe comprend des biopolymères formant avec le polymère organique auquel ils sont liés des ligands susceptibles d'être liés directement ou indirectement à des anti-ligands.
Dans la mesure où l'on clive les liaisons covalentes liant le support aux polymères organiques, on obtient des réactifs ou ligands, notamment des ligands constitués d'un polymère organique lié à des biopolymeres de natures mixtes, par exemple peptides/oligonucléotides, susceptibles d'être utilisés pour l'amplification de capture et de détection de molécules cibles. Ces composés complexes polymère/oligonucléotides/peptides peuvent également être utilisés en thérapeutique. En effet, dans la mesure ou 1 ' oligonucleotide peut être un agent antisens et le peptide être fusogène, on peut utiliser le composé pour réguler l'expression génétique et optimiser 1 ' internalisation du complexe dans les cellules. S signifie "support" dans les figures 1 et 3. G signifie
"groupement photolabile" dans la figure 2.
Les figures qui sont jointes ont un but d'illustration et ne limitent en rien l'étendue de la protection de la présente invention.
La figure 1 représente différentes formes possibles du composé chimique complexe selon 1 'invention, et du ligand correspondant.
Figures l(a) et l(a') représentent le composé chimique complexe et le ligand correspondant dont les biopolymères sont des oligonucléotides présentant la même séquence d'acides nucléiques. Figures l(b) et l(b') représentent le composé chimique complexe et le ligand correspondant dont les biopolymères sont des oligonucléotides et des peptides.
Figures l(c) et l(c') représentent le composé chimique complexe et le ligand correspondant dont les biopolymères sont des oligonucléotides et des oligonucléotide-peptides .
La figure 2 représente quatre exemples d' oligomère amorceur . Les radicaux R étant pour: le monomère I : Diméthoxytrityle, Tertiobutyldiméthysilyle, groupement photolabile, le monomère II : Monométhoxytrityle, Fluorénylméthoxycarbonyle, t-Butoxycarbonyle, groupement photolabile,
La figure 3 représente le schéma général de synthèse d'un composé chimique complexe selon l'exemple 1.
Exemple 1 : Synthèses d 'oligonucléotides (séquence 26mer HBV
Capture et autres séquences utilisables pour le diagnostic médical) sur un support poreux CPG 2000A recouvert par le copolymère linéaire P(AMMVE) (Anhydride Maléique-alt- Méthyl Vinyl Ether) (Masse moyenne en nombre (Mn) 67000) . A) Matériels et procédés
On dispose de billes de silice Fluka (CPG, controlled pore size glass) de diamètre 2000A, de taille de particules 40-85 μm et de superficie 9,2 m2 /g. Les billes de verre (100-150 μm) proviennent de la société Polysciences, Inc.
Les spectres H-RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker AM400 opérant dans un mode de transformation de Fourier. Les déplacements chimiques H ont été exprimés en ppm avec référence au TMS. Les attributions des signaux H ont été effectuées par des expériences RMN en deux dimensions H- H en rapport homonucléaire. Les analyses de masses ont été faites sur un spectromètre ZAB2-SEQ en FAB+ avec une matrice de thio-glycérol.
Le polymère utilisé est un copolymère alterné d'anhydride maléique et de méthyl vinyl éther P(AMMVE) fourni par Polysciences, Inc (Mn 67000g/mol) .
Les synthèses d' oligodésoxyribonucléotides ont été accomplies sur un appareil ABI 394 (Applied Biosystems, San Francisco, USA) en utilisant la chimie standard d^ADN du type cyanoéthyl N,N-diisopropylamino phosphoramidite.
Des expériences SEC-MALLS ont été effectuées en ligne avec le dispositif suivant de chromatographie haute performance d'exclusion de taille. Deux colonnes associées (Waters Ultra-Hydrogel 500 et 1000 ou Waters Ultra- Hydrogel 1000 et 2000) et une pompe Waters 510 de chromatographie liquide haute performance fonctionnaient avec un tampon à base d'acide borique de pH 10 en tant qu'éluant à une vitesse d'écoulement de 0,5 ml. min" . Pour la partie détection, on a utilisé en même temps un détecteur d'absorbance Waters 484, un réfractomètre différentiel Waters 410 et un détecteur MINI DAWN F à trois angles (WYATT Technology) fonctionnant à 690 nm. B) Synthèse de la 3 ' -amino modifiée dT (5'-
Diméthoxytrityl-2 • -déoxyThy idine, 3 ' - (6-aminohéxyl) - phosphate (I) (biomonomère amorceur de polymérisation nucléotidique)
On a séché 200 mg (0,37 mmol) de 5'- Diméthoxytrityl-2 * -déoxy Thymidine par coevaporations à base de pyridine anhydre et d'acétonitrile anhydre, puis on l'a ensuite dissoute dans 7,5 ml d'acétonitrile. On a ajouté lentement de la lH-tétrazole (0,55 mmol d'une solution acétonitrile à 0,35M) et de la 6- (Trifluoroacétylamino)hexyl- (2-cyanoéthyl) - (N,N- diisopropyl) -phophoramidite (0,44 mmol d'une solution acétonitrile à 0,3M) par le septum et on a mélangé la solution à température ambiante. Après une heure, on a ajouté 4 ml d'une solution iodée (iode 100 mM dans H2O 2%, Pyridine 20%, THF 75%) goutte à goutte en 5 mn et on a agité le mélange pendant encore 10 mn avant de le concentrer sous pression réduite. On a dissous le résidu dans du CH2CI2 et on a lavé le mélange organique une fois avec du NaHC03 à 5%, deux fois à l'eau, séché sur Na2Sθ4 et évaporé jusqu'à l'état séché sous vide. Puis on a remis en suspension le résidu dans une solution de 700 1 d'éthanol et 6 ml (NH4OH à 30% aqueux) et on a réalisé la réaction de déprotection en 16 h, à 60°C, dans un flacon hermétique. Après concentration sous vide, on a soumis le résidu à la chromatographie sur une colonne de gel de silice dans (CH2CL2/TEA à 5%) et élution par un gradient de méthanol pour obtenir le composé (I) (rendement 46%) . H RMN (DMSO-d6) : 1,32 (m, 2H, C-CH2-C) , 1,37-1,42 (m, 4H, PO-CH2-CH2-CH2-C) , 1,55 (t, 2H, C-CH2-CH2-NH2 ) . 2,21-2,34 (m, 2H, H2'H2'*), 2,71 (t, 3H, C-CH2-NH2) , 3,16-3,24 (m, 2H, H5'H5''), 3,57 (t, 2H, PO-CH2-C) , 3,71 (s, 6H, 0-CH3 ) , 4,07 (s, 1H, H4'), 4,-( (s, 1H, H3 ' ) , 6,16 (t, 1H, Hl ' ) , 7,21-7,36 (m, 13H, Har) , 7,46 (s, 1H, H6) , 7,8-8,6 (grand pic, 2H, NH2) . En spectrometrie de masse, la masse exacte donnée par l'analyse est 724,3009 g/mol, ce qui correspond à la masse calculée (724,2999 g/mol).
C) Fonctionnalisation des CPG ou des billes de verre (support solide) On a adapté l'étape de fonctionnalisation à partir d'une procédure antérieure publiée par Southern et Coll (Maskos, U. and Southern, E.M. (1992) Nucleic Acids Res., 20, 1679-1684) . On a mis en suspension 3 g de CPG non modifié et 5 g de bille de verre dans 6ml d'une solution d'acide chromique sulfurique (solution saturée en oxyde de chrome (VI) dans de l'acide sulfurique à 95%) (Prolabo) . Après 3h d'activation à 110°C, la majorité des groupements silane en surface étaient sous forme de groupements silanol. On a filtré les supports et on les a lavés minutieusement à l'eau. Après un lavage rapide avec de l'acétone sèche, on a séché les supports sous vide pendant une demie heure et on les a immédiatement utilisés pour la silanisation. On a mis en suspension les billes activées dans
28 ml d'une solution (6,1 ml de 3- glucidoxypropyltriméthoxysilane, 1,7 ml de triéthylamine, 20,2 ml de toluène sec). On a mélangé doucement les supports toute la nuit à 90°C, puis on les a lavés minutieusement avec de l'acétone anhydre et séchés 3h à 110°C.
Dans une deuxième étape, on a mis en suspension les billes dans 10 ml d'hexaéthylène glycol avec 6 1 d'acide sulfurique (à plus de 95%). On a mélangé doucement puis la réaction est effectuée toute la nuit à 90°C, puis on a lavé les billes avec de l'acétone anhydre et séché dans un dessicateur.
D) Procédure générale pour greffer le conjugué P(AMMVE) -nucléotide (I)) sur les billes de silice Le nucléotide amorceur de polymérisation nucléotidique selon B) a été couplé sur les copolymères P(AMMVE) suivant le principe réactionnel décrit dans la figure 3.
15 mg (224 mmol) de copolymère ont été dissous dans 1 ml de diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO) à 37 °C. En parrallèle, 10 mg (13,8 mol) de (I) ont été dissous dans 1 ml du même solvant. On ajoute successivement à un volume approprié de DMSO permettant un volume final de 1 ml pour la réaction 20 nmol de copolymère, 2 mol de nucléotide (I) et 1 mol de 4-Diméthylaminopyridine (DMAP) . Après avoir remué à température ambiante pendant 1 heure, on ajoute 90 mg de billes de silice au mélange et on permet à la réaction de greffage de s'effectuer toute la nuit. On filtre ensuite les supports et on lave délicatement avec du DMSO et de 1 ' acétone anhydre avant de sécher sous vide pendant plusieurs heures. La quantité de diméthoxytrityle en surface a été estimée par un traitement acide de la silice. E) Synthèse oligonucléotidique.
La séquence choisie est une séquence de capture du VHB (virus de l'hépatite B) .
5'-TCA ATC TCG GGA ATC TCA ATG TTA GT-3 •
On a utilisé 0,1 mol ou 0,15 mol de support fonctionnalisé pour la synthèse en utilisant un protocole standard de cycle de couplage de 0,2 mol. Avant la synthèse, on a expérimenté différents temps de blocage des fonctions hydroxyles résiduelles du support solide (capping) . Au cours de la synthèse, on a déterminé de manière automatique le rendement des étapes de la réaction de couplage par des mesures de la quantité de cations de type diméthoxytrityle relargée à chaque étape de couplage/déprotection. On a appliqué différents traitements basiques pour les étapes de clivage et de déprotection. Après le dessalage (dans le cas de la déprotection au NaOH) et concentration sous vide, les distributions des masses molaires des conjugués (copolymère-ODN) ont été analysés par SEC-MALLS. On obtient des rendements par cycle de 98%.
Exemple 2 :
Le même principe de synthèse que dans 1 ' exemple 1 est mis en oeuvre mais en utilisant à titre de polymère réactif organique d'autres copolymères d'anhydride maléique tel que les copolymères (anhydride maléique-alt- éthylène) , (anhydride maléique-alt-styrène) , (anhydride maléique-alt-N-vinylpyrrolidone) ou des P(AMMVE) d'une autre taille (MM10.000 à 1.000.000). 224 nmol de polymère ont été dissous dans 1 ml de DMSO anhydre à 37 °C. En parallèle, 10 mg (13,8 mol) du nucléotide (I), modifié en 3' par un bras aminé, ont été dissous dans 1 ml de DMSO. 20 nmol de copolymère, 2 mol de (I) et 1 mol de diméthylaminopyridine (DMAP- solution à 10 mg/ml dans du DMSO) sont mis en solution dans une quantité suffisante de DMSO anhydride pour atteindre un volume final de 1 ml. La réaction est agitée à température ambiante pendant 1 heure, puis 90 mg de billes de silice CPG 2000A (Control Pores Glass) ou 100 mg de billes de verre (Glass Beads) fonctionnalisées par un espaceur hydroxyle sont ajoutées à la solution. La réaction est poursuivie toute la nuit, à température ambiante. Les supports sont alors filtrés et lavés méticuleusement par du DMSO, de l'acétone anhydre puis séchés sous vide en présence de chlorure de calcium. Ces supports sont alors utilisés pour effectuer des synthèses d' oligonucléotides comme décrit dans l'exemple 1, une étape de capping de 11 minutes étant nécessaire au préalable.
Exemple 3 :
Même synthèse que dans l'exemple 2, en utilisant à titre de polymère organique réactif le copolymère linéaire NVP-NAS (N-vinylpyrrolidone/N-acryloxy-succinimide) à la place de P(AMMVE).
Exemple 4.
Même principe de synthèse que dans l'exemple 1, en utilisant un support solide à base de polystyrène. 224 nmol de polymère ont été dissous dans 1 ml de DMSO anhydre à 37 °C. En parallèle, 10 mg (13,8 mol) du nucléotide (I), modifié en 3' par un bras aminé, ont été dissous dans 1 ml de DMSO. 20 nmol de copolymère, 2 mol de (I) et 1 mol de diméthylaminopyridine (DMAP- solution à 10 mg/ml dans du DMSO) sont mis en solution dans une quantité suffisante de DMSO anhydride pour atteindre un volume final de 1 ml. La réaction est agitée à température ambiante pendant 1 heure, puis 90 mg de particules à base de polystyrène (Résine de co-polystyrène-1% divinylbenzène, classiquement appelée la résine de Wang) fonctionnalisées par des extrémités 4-hydroxyméthyl- phénoxyméthyles, ou 90 mg de polystyrène-co-divinylbenzène (support solide) fonctionnalisés par des extrémités 4- hydroxyméthyl-phénylacétamidométhyles (PAM résine) , ou 90 mg d'un support composite à base de polyacrylamide et d'une matrice inorganique (Kieselguhr) fonctionnalisés par des extrémités 4-hydroxyméthyl-phénoxyacétyles (Novabiochem) , ou 90 mg d'un support polystyrène fonctionnalisé par du polyethylene glycol terminé par une fonction hydroxyle ou p-oxybenzyl alcool (Novabiochem) , ou 90 mg de toutes résines à base de polystyrène fonctionnalisées par un bras espaceur hydroxyle, sont ajoutés à la solution. La réaction est agitée toute la nuit, à température ambiante. Les supports sont alors filtrés et lavés méticuleusement par du DMSO, de l'acétone anhydre puis séchés sous vide en présence de chlorure de calcium.
Ces supports sont alors utilisés pour effectuer des synthèses d' oligonucléotides comme décrits dans l'exemple 1, une étape de capping de 11 minutes étant nécessaire au préalable.
Exemple 5: Les supports à base de polystyrène sont fonctionnalisés comme décrit précédemment avec P(AMMVE) et le biomonomère (I) et/ou le monomère (II) dans le but d'amorcer une synthèse peptidique sur phase solide en utilisant la chimie du Fmoc.
Dans le cas des synthèses mixtes oligonucléotides/peptides, les fragments d'acides nucléiques seront synthétisés avant les peptides.
Exemple 6:
Des synthèses d • oligonucléotides ou de peptides sont effectuées sur un support sphérique à base de silice poreuse ou non poreuse, ou de polystyrène fonctionnalisé avec un copolymère linéaire d'anhydride maléique relié au support par un bras espaceur stable en milieu basique. L'objectif est de ne pas décrocher le conjugué (copolymère/biomolécules) après synthèse. Ces réactifs pourront être utilisés pour la capture d'entité biologique (fragments de gène, antigène, anticorps) directement à partir de milieux biologiques.
Le mode opératoire de la synthèse du support est le même que celui décrit dans l'exemple 2 et dans l'exemple 5, mais on utilise un support solide aminé et non pas hydroxyle. 224 nmol de polymère ont été dissous dans 1 ml de
DMSO anhydre à 37 °C. En parallèle, 10 mg (13,8 mol) du nucléotide (I), modifié en 3* par un bras aminé, ont été dissous dans 1 ml de DMSO. 20 nmol de polymère, 2 mol de (I) et 1 mol de diméthylaminopyridine (DMAP- solution à 10 mg/ml dans du DMSO) sont mis en solution dans une quantité suffisante de DMSO anhydride pour atteindre un volume final de 1ml. La réaction est agitée à température ambiante pendant 1 heure, puis 90 mg de billes de silice CPG 2000A (Control Pores Glass) ou 100 mg de billes de verre (Glass Beads) ou 100 mg de billes de polystyrène fonctionnalisées par un espaceur aminé sont ajoutées à la solution. La réaction est poursuivie toute la nuit, à température ambiante. Les supports sont alors filtrés et lavés meticuleusement par du DMSO, de l'acétone anhydre puis séchés sous vide en présence de Chlorure de Calcium.
Ces supports sont alors utilisés pour effectuer des synthèses d ' oligonucléotides comme décrits dans l'exemple 1. Si le monomère (II), amorceur de synthèse peptidique est couplé sur le polymère, des synthèses peptidiques peuvent être développées sur les supports, en utilisant la chimie du Fmoc.
Exemple 7: Même protocole de synthèse des supports sphériques que dans l'exemple 1, ou dans l'exemple 6, en utilisant des monomères amorceurs des synthèses oligonucléotidiques de type (I) , ou en utilisant des monomères amorceurs des synthèses peptidiques de type (II) ou en utilisant des monomères amorceurs de type (III) ou (IV) , possédant un groupement protecteur photolabile sur le site d'initiation de la synthèse du biopolymère.
Le groupement photolabile utilisé peut être par exemple le 6-nitrovératryle, le 6-nitropipéronyle, le méthyl-6-nitrovératryle, le nitroveratryloxycarbonyle, le méthyl-6-nitropipéronyle, le nitrobenzyle, le nitrobenzyloxycarbonyle, le diméthyldiméthoxybenzyle, le diméthyldiméthoxybenzyloxycarbonyle, le 5-bromo-7- nitroindolinyle, 1 'hydroxy-méthylcinnamoyle, le 2- oxyméthylène anthraquinone, le pirénylméthoxycarbonyle. L'amorce de la synthèse du biopolymère se fera par une exposition du support à une gamme de longueur d'ondes adaptée. Exemple 8 :
Même concept que dans l'exemple 7, en utilisant des supports plans (wafer de silicium, micro plaque de silice) silanisés en surface par un silane aminé puis recouverts par un polymère linéaire à base d'anhydride maléique. Les fonctions aminés du bras espaceur vont réagir avec les fonctions hydrophiles du polymère pour créer une fonction amide stable en milieu basique. En greffant sur le polymère le monomère (I) et/ou (II) et/ou (III) et/ou (IV), des synthèses d ' oligonucléotides et/ou de peptides peuvent être amorcées d'une manière contrôlée. Les plaques sont traitées au préalable en milieu acide ou basique ou bien, si l'on utilise un système de masques spécifiques, elles peuvent être exposées à des radiations sur des zones délimitées de leur surface, afin d'éliminer les groupements photolabiles. Les fonctions réactives ainsi libérées, des synthèses de biopolymères peuvent être développées en surface par les méthodes classiques de la chimie sur support. Ces matrices fonctionnalisées peuvent être utilisées pour le sequençage de gènes ou le screening d'anticorps.

Claims

REVENDICATIONS 1/ Composé chimique complexe comprenant:
- un support solide fonctionnel comprenant des groupements surfaciques chimiques,
- au moins un conjugué comprenant:
- un polymère organique réactif dont le squelette comporte d'une part des fonctions latérales chimiques réactives vis-à-vis des groupements surfaciques du support solide liées à ces derniers par liaison covalente, et d'autre part des restes latéraux chimiques, - une pluralité de biomonomères amorceurs branchés sur le polymère organique, liés respectivement auxdits restes chimiques dudit polymère organique, par une liaison covalente.
2/ Composé chimique complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que la liaison covalente des biomonomères amorceurs au polymère organique n'est pas clivable dans les conditions de clivage de la liaison support/polymère organique.
3/ Composé chimique complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support solide fonctionnel est de type minéral ou organique.
4/ Composé chimique complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère organique a une masse molaire comprise entre 10000 et 1000000.
5/ Composé chimique complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que les fonctions latérales du polymère organique réactif sont de type électrophile et /ou thiol et/ou pont disulfure.
6/ Composé chimique complexe selon les revendications 1 et 3 , caractérisé en ce que le polymère organique est un copolymère linéaire d'anhydride maléique. 7/ Composé chimique complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que les biomonomères, identiques ou différents, sont des nucléosides et/ou nucléotides et/ou des acides aminés et/ou des saccharides, naturels ou modifiés.
8/ Composé chimique complexe selon les revendication 1 et 7, caractérisé en ce que les biomonomères amorceurs sont à la fois des nucléotides et des acides aminés. 9/ Composé chimique complexe comprenant:
- un support solide fonctionnel comprenant des groupements surfaciques chimiques,
- au moins un conjugué comprenant:
- un polymère organique réactif dont le squelette comporte d'une part des fonctions latérales chimiques réactives vis-à-vis des groupements surfaciques du support solide liées à ces derniers par liaison covalente, et d'autre part des restes latéraux chimiques,
- une pluralité de biomonomères amorceurs mixtes branchés sur le polymère organique, liés respectivement auxdits restes chimiques dudit polymère organique, par une liaison covalente, caractérisé en ce que les biomonomères amorceurs mixtes sont prolongés et polymérisés avec d'autres synthons chacun selon une séquence prédéterminée desdits synthons pour obtenir des biopolymeres mixtes, tels que oligonucleotide et peptide.
10/ Composé chimique selon la revendication 9, caractérisé en ce que les biopolymères sont de type oligonucleotide et peptide ou oligonucléotide-peptide. 11/ Composé chimique complexe selon la revendication 10, caractérisé en ce que les biopolymères forment avec le polymère organique auquel ils sont liés des ligands susceptibles d'être liés directement ou indirectement à des anti-ligands. 12/ Procédé de synthèse chimique d'un composé selon la revendication 1, comprenant une pluralité de biomonomères amorceurs, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un support fonctionnel comprenant des groupements surfaciques, b) on dispose d'au moins un polymère organique réactif dont le squelette comporte d'une part des fonctions latérales chimiques complémentaires des groupements surfaciques du support solide, et d'autre part des restes latéraux chimiques, c) on dispose de biomonomères amorceurs de biopolymérisation, identiques ou différents, comprenant d'un côté un substituant réactif et d'un autre côté un groupement protecteur, d) on fait réagir au moins un polymère organique:
- soit avec le support solide, pour établir au moins une liaison covalente entre un groupement surfacique dudit support solide et un reste latéral dudit polymère organique, puis on fait réagir le polymère organique lié au support solide avec une pluralité de biomonomères amorceurs, pour greffer ces derniers par covalence, directement ou indirectement, avec une pluralité de restes latéraux dudit polymère organique, soit avec une pluralité de biomonomères amorceurs, pour greffer ces derniers par covalence, directement ou indirectement, avec une pluralité de restes latéraux dudit polymère organique, puis on fait réagir le polymère organique lié aux biomonomères amorceurs avec le support solide, pour établir au moins une liaison covalente entre un groupement surfacique dudit support solide et un reste dudit polymère organique.
13/ Procédé de synthèse selon la revendication 12, caractérisé en ce que on fait réagir au moins un polymère organique avec une pluralité de biomonomères amorceurs, pour greffer ces derniers par covalence, directement ou indirectement, avec une pluralité de restes latéraux dudit polymère organique, puis on fait réagir le polymère organique lié aux biomonomères amorceurs avec le support solide, pour établir au moins une liaison covalente entre un groupement surfacique dudit support solide et un reste dudit polymère organique.
14/ Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend, après l'étape c et avant l'étape d, 1 ' étape : c1) on fait réagir le polymère organique avec un réactif générateur de bras espaceurs, pour greffer sur une pluralité de restes latéraux dudit polymère organique une pluralité de bras espaceurs respectivement, comportant chacun à leur extrémité libre une fonction réactive.
15/ Utilisation du composé chimique selon la revendication 1 pour effectuer la synthèse des biopolymères, comprenant les étapes de : f) on dispose de synthons identiques ou différents, g) par cycles successifs de couplage/déprotection, on fait croître les chaînes des biopolymères à partir des biomonomères amorceurs respectivement, selon au moins une même séquence prédéterminée des synthons. 16/ Utilisation selon la revendication 15 comprenant, après l'étape g, l'étape : h) on fait croître des chaînes de biopolymeres, par cycles successifs de couplage/déprotection des synthons, à partir d'autres biomonomères amorceurs respectivement, selon au moins une même autre séquence prédéterminée des synthons.
17/ Réactif caractérisé en ce qu'il comprend un composé chimique selon l'une quelconque des revendications
9 à 11. 18/ Procédé d'obtention d'un ligand constitué d'un conjugué comprenant un polymère organique et une pluralité de biopolymères à partir d'un composé complexe selon la revendication 9, caractérisé en ce que par réaction chimique ou enzymatique ou thermique ou photochimique on sépare le support solide du reste du composé chimique complexe en rompant la liaison covalente entre les groupements surfaciques du support solide et les fonctions latérales du polymère organique. 19/ Réactif susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que les biopolymères sont de nature mixte, notamment peptide/oligonucléotide .
20/ Utilisation d'un réactif selon la revendication 9 et 19 pour l'amplification de la capture de cibles biologiques ou autres.
21/ Utilisation d'un réactif selon les revendications 9 et 19 pour l'amplification de la détection de cibles biologiques ou autres. 22/ Utilisation d'un réactif selon la revendication 19 en thérapeutique.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005503474A (ja) * 2001-09-26 2005-02-03 スミス　アンド　ネフュー　ピーエルシー 構造により特徴付けられている機能をもつ重合体
EP1248679B1 (fr) * 2000-01-21 2005-03-09 Bio Merieux Procede d'isolement de proteines ou d'associations de proteines et d'acides nucleiques et complexes de particules et de proteines ainsi formes
WO2007023181A1 (fr) * 2005-08-24 2007-03-01 Qiagen Gmbh Procede de separation de cellules vivantes

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60119318T2 (de) * 2000-05-29 2007-05-03 Bio Merieux Biokompatible polymere für die bindung von biologischen liganden

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2019083A1 (fr) * 1968-09-27 1970-06-26 Monsanto Co
GB1290702A (fr) * 1968-09-27 1972-09-27
US4046723A (en) * 1976-04-22 1977-09-06 The Dow Chemical Company Azide bonding of a protein to a latex
WO1984003053A1 (fr) * 1983-02-14 1984-08-16 Amf Inc Supports de polysaccharides modifies
FR2605237A1 (fr) * 1986-10-20 1988-04-22 Centre Nat Rech Scient Support pour la purification et la separation des proteines, procede de preparation et application en chromatographie
EP0273895A2 (fr) * 1986-12-24 1988-07-06 Monsanto Company Synthèse de peptides en phase solide
EP0561722A1 (fr) * 1992-03-17 1993-09-22 Bio Merieux Composés hydrosolubles dérivés d'un homopolymère ou copolymère de l'anhydride maléique, et applications desdits composés au support de molécules biologiques
EP0591807A2 (fr) * 1992-10-09 1994-04-13 Bayer Ag Polymères biologiquement actifs
EP0632269A1 (fr) * 1993-06-25 1995-01-04 Bio Merieux Dispositif pour la capture de molécules cibles, et procédé de capture utilisant ledit dispositif

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2019083A1 (fr) * 1968-09-27 1970-06-26 Monsanto Co
GB1290702A (fr) * 1968-09-27 1972-09-27
US4046723A (en) * 1976-04-22 1977-09-06 The Dow Chemical Company Azide bonding of a protein to a latex
WO1984003053A1 (fr) * 1983-02-14 1984-08-16 Amf Inc Supports de polysaccharides modifies
FR2605237A1 (fr) * 1986-10-20 1988-04-22 Centre Nat Rech Scient Support pour la purification et la separation des proteines, procede de preparation et application en chromatographie
EP0273895A2 (fr) * 1986-12-24 1988-07-06 Monsanto Company Synthèse de peptides en phase solide
EP0561722A1 (fr) * 1992-03-17 1993-09-22 Bio Merieux Composés hydrosolubles dérivés d'un homopolymère ou copolymère de l'anhydride maléique, et applications desdits composés au support de molécules biologiques
EP0591807A2 (fr) * 1992-10-09 1994-04-13 Bayer Ag Polymères biologiquement actifs
EP0632269A1 (fr) * 1993-06-25 1995-01-04 Bio Merieux Dispositif pour la capture de molécules cibles, et procédé de capture utilisant ledit dispositif

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1248679B1 (fr) * 2000-01-21 2005-03-09 Bio Merieux Procede d'isolement de proteines ou d'associations de proteines et d'acides nucleiques et complexes de particules et de proteines ainsi formes
JP2005503474A (ja) * 2001-09-26 2005-02-03 スミス　アンド　ネフュー　ピーエルシー 構造により特徴付けられている機能をもつ重合体
US7955594B2 (en) * 2001-09-26 2011-06-07 Smith & Nephew, Plc Polymers with structure-defined functions
WO2007023181A1 (fr) * 2005-08-24 2007-03-01 Qiagen Gmbh Procede de separation de cellules vivantes
WO2007023057A1 (fr) * 2005-08-24 2007-03-01 Qiagen Gmbh Procede pour isoler des acides nucleiques dans le sang
US8222030B2 (en) 2005-08-24 2012-07-17 Qiagen Gmbh Method for the separation of living cells
US9506107B2 (en) 2005-08-24 2016-11-29 Qiagen Gmbh Method for extracting nucleic acid from blood

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EP1001996A1 (fr) 2000-05-24
FR2767137A1 (fr) 1999-02-12
AU8987698A (en) 1999-03-01
US20020055185A1 (en) 2002-05-09
CA2299555A1 (fr) 1999-02-18

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