EP1235839A2 - Produits comprenant un support sur lequel sont fixes des acides nucleiques et leur utilisation comme puce a adn - Google Patents

Produits comprenant un support sur lequel sont fixes des acides nucleiques et leur utilisation comme puce a adn

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EP1235839A2
EP1235839A2 EP00988891A EP00988891A EP1235839A2 EP 1235839 A2 EP1235839 A2 EP 1235839A2 EP 00988891 A EP00988891 A EP 00988891A EP 00988891 A EP00988891 A EP 00988891A EP 1235839 A2 EP1235839 A2 EP 1235839A2
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EP
European Patent Office
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group
support
oligonucleotide
function
oxoaldehyde
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00988891A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Oleg Melnyk
Christophe Olivier
Nathalie Ollivier
David Résidence Le Clos Saint Ruth HOT
Ludovic Huot
Yves Lemoine
Isabelle Wolowczuk
Tam Huynh-Dinh
Catherine Gouyette
Hélène Gras-Masse
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
    • C12Q2565/501—Detection characterised by immobilisation to a surface being an array of oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
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    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to products comprising a support on which nucleic acids are fixed, to their preparation process and to their use as DNA chips.
  • the present invention also relates to functionalized supports, to oligonucleotides and to DNAs modified in the 5 ′ position, as well as to their methods of preparation.
  • the present invention further relates to a method of attaching a nucleic acid to a support.
  • the process for obtaining DNA chips which implements DNA fixation on a glass slide mainly involves steps for preparing the glass slide (treatment of its surface with sodium hydroxide, then adsorption of polylysine or polyethyleneimine on the surface via ionic interactions; BURNS, NL, Langmuir, 1995, il, 2768-2776), depositing DNA on the glass slides thus prepared, then heat treatment and UN irradiation to bind , covalently, the AD ⁇ on the glass surface.
  • DNA normally makes it possible to obtain very specific hybridizations and of high affinity compared to that which is obtained with relatively short oligonucleotides.
  • the method of manufacturing the blades can explain this phenomenon.
  • DNA interacts with polylysine or polyethyleneimine by ionic interactions involving the negatively charged phosphodiester groups of nucleic acids: this mode of deposition thus limits the conformational freedom of DNA and its accessibility.
  • the heat treatment applied before UV irradiation degrades the DNA.
  • UV irradiation itself modifies the pyrimidine bases (formation of hydrates or binding to the surface via the silanol functions of the glass, dimerization between several pyrimidines) while these bases are important for hybridization.
  • US Pat. No. 4,874,813 describes the fixing of glycoproteins on a solid support by a hydrazone bond, the support being functionalized by a hydrazide and the glycoprotein carrying an aldehyde function, introduced by oxidation of the carbohydrate part of the glycoprotein, carrying a 1,2-diol function.
  • this technique cannot be extrapolated to DNAs, which are naturally devoid of 1,2-diol functions, or to any nucleic acids.
  • the glycoproteins used in US Pat. No. 4,874,813 are obtained with quantities of the order of ten milligrams, the nucleic acids are manipulated on the microgram scale.
  • nucleic acid carrying an aldehyde function at its end is not very stable, in particular subject to oxidation reactions in the presence of air, and easily gives rise to the formation of imines when it is put in the presence of enzymes. , for example during amplification reactions.
  • the inventors have given themselves the aim of overcoming the drawbacks of the prior art and of providing a method for fixing nucleic acids, in particular DNA or oligonucleotides, on a support which meets in particular the following criteria: - the process is simple at the experimental level, reproducible and inexpensive,
  • the subject of the present invention is a product of formula (I):
  • Z represents a group of formula
  • a group -XN CH-, X representing a group -CH 2 -O-, -CH 2 -NH- or -NH-, i is equal to 0 or to 1, n is between 1 and 16, n being equal to 1 when i is equal to O, m is greater than or equal to 1, SP represents a support, A represents a spacer arm,
  • Y represents a function ensuring the connection between A and Z
  • nucleic acid means a DNA, an RNA or an oligonucleotide, the latter corresponding to a sequence of approximately 1 to 50 bases, said nucleic acid comprising natural nucleosides (A, C, G , T or U) or modified at the base (heterocycle), sugar and / or phosphodiester bond.
  • Said nucleic acid can therefore also consist of a PNA (Peptide Nucleic Acid).
  • the product of formula (I) can also comprise a thiazolidine bond when Z represents a group of formula:
  • the product of formula (I) according to the present invention can therefore correspond to the products of formulas (la) and (Ib) represented below, in which SP, A, Y, X, M, i , n and m are as previously described:
  • the product of formula (I) according to the present invention is such that the binding between nucleic acid M and the support SP is very stable.
  • n is advantageously equal to 1 and A preferably represents a linear or branched carbon chain comprising from 2 to 100 carbon atoms, preferably from 5 to 50 carbon atoms, and optionally comprising from 1 to 35 oxygen or nitrogen atoms and from 1 to 5 silicon, sulfur or phosphorus atoms.
  • SP advantageously represents a solid support, preferably made of glass, silicon or synthetic polymer, such as nylon, polypropylene and polycarbonate.
  • SP can also advantageously represent a non-solid support, such as a natural polymer (for example a polysaccharide such as cellulose or mannan, or even a polypeptide), a synthetic polymer (for example a copolymer of N- vinylpyrrolidone and derivatives of acrylic acid), a liposome or a lipid.
  • SP can advantageously represent a transfection vector, that is to say an organic compound (lipid or peptide for example) permeable at the level of the cell membrane.
  • SP is a solid support, i is equal to 1, n is equal to 1 and M is DNA, said product constituting a DNA chip.
  • the m molecules M present in the chip can be identical, but are preferably different from each other.
  • the DNA chips according to the present invention are reusable in numerous hybridization cycles, the bond between the DNA and the support being very stable under the hybridization and washing conditions, which considerably limits the possibilities of desorption of the DNA.
  • SP represents a glass support
  • i is equal to 1
  • n is equal to 1
  • A represents a spacer arm of formula -Si- (CH 2 ) 3 - and Y represents an amide function -NH-CO-.
  • the present invention also relates to the use of the product of formula (I) above, when SP is a solid support, as a nucleic acid chip, such as a DNA or oligonucleotide chip.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of the product of formula (I) above, which comprises the reaction of nxm molecules of formula M-CO-CHO with a product of formula SP [A, (Y, - B - NH 2 ) n ] m , SP, A, Y, i, n, m and M being as defined above and B representing a group -CH 2 -O-, -CH 2 -NH-, -NH- or -CH (CH 2 SH) -.
  • the molecules of formula M-CO-CHO correspond to nucleic acids carrying an ⁇ -oxoaldehyde (-CO-CHO) function at their 5 ′ or 3 ′ end.
  • the present invention also relates to a process for fixing, by covalent bond, of at least one nucleic acid M on an SP support, for obtaining a product of formula (I) as previously described, characterized in that that it comprises the following steps: i) introduction of an ⁇ -oxoaldehyde function at a 5 ′ or 3 ′ end end of said nucleic acid, and ii) reaction of the functionalized nucleic acid obtained in step i) with a support modified by a function selected from the group consisting of hydrazine functions, derived from hydrazine, hydroxylamine and ⁇ -aminothiol.
  • hydrazide functions that is to say a hydrazine substituted with at least one acyl or carbonyl group.
  • the method according to the present invention implements a support modified by a stable function in a wide pH range.
  • the functions involved in the binding namely the ⁇ -oxoaldehyde function carried by the nucleic acid and the function carried by the support, are very reactive.
  • the process according to the present invention does not involve any denaturation of the structure of the nucleic acid, which remains optimal for subsequent hybridization reactions, in the case where the product of formula (I) obtained by the process according to the present invention is used as a DNA chip.
  • the introduction of an ⁇ -oxoaldehyde function at one end of said nucleic acid is carried out by the following steps: a) introduction of a group selected from the group consisting with tartaric acid, serine, threonine and their derivatives at one of the ends of an oligonucleotide, b) hybridization of the oligonucleotide obtained in step a) with said nucleic acid, c) elongation of said oligonucleotide, d) repeating steps b) and c) at least once, e) periodic oxidation of the nucleic acid obtained in step d), modified at one of its ends by a group selected from the group consisting of tartaric acid, serine, threonine and their derivatives, and f ) isolation of a nucleic acid modified at one of its ends by an ⁇ -oxoaldehyde function.
  • the introduction of an ⁇ -oxoaldehyde function at one end of said nucleic acid is carried out by the following steps: a) introduction of a group selected from the group consisting of tartaric acid, serine, threonine and their derivatives at one end of an oligonucleotide, b) periodic oxidation of the oligonucleotide obtained in step a), c) hybridization of the oligonucleotide obtained in step b), carrying an ⁇ -oxoaldehyde function at one of its ends, with said nucleic acid, d) elongation of said oligonucleotide, e) repeating steps c) and d) at least once, and f) isolation of a nucleic acid modified at one of its ends by an ⁇ -oxoaldehyde function.
  • the step of hybridizing the oligonucleotide with the nucleic acid is carried out after a step of denaturing said nucleic acid, as known to those skilled in the art.
  • the stages of hybridization between an oligonucleotide and a nucleic acid, of elongation of said oligonucleotide and of repeating these stages constitute amplification cycles of the nucleic acid, the oligonucleotide serving as a primer for these amplifications, which can be performed by the technique known as PCR (Polymerase Chain Reaction) well known to those skilled in the art, described for example in Molecular Cloning, second edition, J. SAMBROOK, EF FRITSCH and T. MANIATIS (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the elongation step of the oligonucleotide, after its hybridization with the nucleic acid, is carried out in a suitable buffer medium, in the presence of the nucleotide bases required for the formation of nucleic acid.
  • tartaric acid derivatives which can be used in the processes described above, mention may be made of di-acetyl-tartaric acid, di-para-toluyl-tartaric acid, metatartaric acid, dimethyl tartrate, dissuccinimidyl tartrate, tartaric anhydride and di-acetyl-tartaric anhydride.
  • the introduction of a selected group in the group consisting of tartaric acid, serine, threonine and their derivatives at one of the ends of an oligonucleotide is carried out via an amide bond.
  • the group selected from the group consisting of tartaric acid, serine, threonine and their derivatives is preferably linked to the oligonucleotide via a spacer arm linked, by one of its ends, to said oligonucleotide and carrying, to the 'other of its ends, an amino function.
  • the nucleic acid is preferably DNA.
  • the oligonucleotide which hybridizes with this nucleic acid is an oligodeoxynucleotide primer, which can be specific or universal.
  • DNA can be obtained by amplification of genomic DNA or by amplification of DNA inserted into a vector, for example phage M13.
  • a first amplification with a series of specific primers can be followed by amplification using universal primers (see for example POLLACK, JR in Nature Genetics, 1999, 21, 41-46). In this case, two primers make it possible to amplify a large number of different DNAs.
  • the present invention also relates to an oligonucleotide modified in position 5 ′ by a group selected from the group consisting of tartaric acid, serine, threonine, their derivatives and the ⁇ -oxoaldehyde group.
  • Such an oligonucleotide can advantageously be used as a primer in reactions for elongation or amplification of nucleic acids, in order to obtain nucleic acids modified in position 5 ′ by the groups carried by said oligonucleotide.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of such an oligonucleotide, characterized in that it comprises a step of introduction of a group selected from the group consisting of tartaric acid, serine, threonine and their derivatives in position 5 ′ of said oligonucleotide, this step being followed, in the case where said oligonucleotide is modified by an ⁇ -oxoaldehyde group, of periodic oxidation of said oligonucleotide.
  • the present invention also relates to a DNA modified in the 5 ′ position by a group selected from the group consisting of tartaric acid, serine, threonine, their derivatives and the ⁇ -oxoaldehyde group.
  • Such DNA can advantageously be used in the method according to the present invention allowing the attachment, by covalent bond, of at least one nucleic acid M on an SP support, as described above.
  • the tartaric acid, serine and threonine groups can easily be converted to the ⁇ -oxoaldehyde function by a periodic oxidation reaction. It is particularly advantageous to use DNA modified by an ⁇ -oxoaldehyde function, because this function is very stable and very reactive, in any event much more stable and reactive than an aldehyde function. These considerations also apply to the oligonucleotides according to the present invention, modified by an ⁇ -oxoaldehyde function. Thus, whatever nucleic acids (notably DNA or oligonucleotides) can be preserved without oxidizing or degrading, in particular in the presence of air (regardless of the position of their functionalization at the 3 ′ end or 5 ').
  • nucleic acids functionalized by an aldehyde they give rise to very stable bonds with supports carrying corresponding reactive functions, as described above.
  • they do not induce imine formation with the enzymes present during reactions of elongation or amplification of nucleic acids and, in the case of a PCR amplification using Taq polymerase, they do not interact with dithiothreitol, the enzyme's preservative.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a DNA modified in the 5 ′ position by a group selected from the group consisting of tartaric acid, serine, threonine, their derivatives and the ⁇ -oxoaldehyde group, such as described above, characterized in that it comprises the following steps: a) introduction of a group selected from the group consisting of tartaric acid, serine, threonine and their derivatives in position 5 'of a oligonucleotide, b) hybridization of the oligonucleotide obtained in step a) with DNA, c) elongation of said oligonucleotide, d) repetition of steps b) and c) at least once, or in the case where said DNA is modified by an ⁇ -oxoaldehyde group, steps a) to f) of the methods previously described in relation to the method according to the present invention relating to the introduction of a function ⁇ -oxoalde
  • the elongation step of the oligonucleotide, after its hybridization with DNA, is carried out in a suitable buffer medium, in the presence of the deoxynucleotide bases required for the formation of DNA.
  • the present invention also relates to a functionalized support of formula (II):
  • Such a support carries a hydrazine function (case where B represents a group -CH 2 -NH- or -NH-), hydroxylamine (case where B represents a group -CTL-O-) or ⁇ -aminothiol (case where B represents a group -CH (CH 2 SH) -).
  • the functionalized support of formula (II) can advantageously be used in the method according to the present invention allowing the attachment, by covalent bond, of at least one nucleic acid M to an SP support, as described above.
  • the present invention also relates to a process for preparing the functionalized support of formula (II), in which i is equal to 1, n is equal to 1 and SP represents a glass support, characterized in that it comprises the steps following: silanization of the glass support, grafting, onto said silanized glass support, of a function selected from the group consisting of hydrazine functions, derivatives of hydrazine, hydroxylamine and ⁇ -aminothiol.
  • the stage of silanization of the support is preferably carried out with the aid of aminopropyl-trimethoxysilane.
  • said grafting of a hydrazine function is carried out using hydrazinoacetic acid
  • said grafting of a function derived from hydrazine is carried out using triphosgene and hydrazine
  • said grafting of a hydroxylamine function is carried out using aminooxyacetic acid
  • said grafting of a ⁇ -aminothiol function is carried out using ⁇ -amino- ⁇ -mercaptopropionic acid.
  • the subject of the invention is also a process for controlling the quality of the support of formula (II) as defined above, characterized in that it includes the following steps:
  • a fluorescent probe for example rhodamine, derivatized by an ⁇ -oxoaldehyde function
  • This method makes it possible to analyze the homogeneity of the functionalization of the support, namely the spatial distribution of the terminal groups -B-NH 2 (cf. formula (II) above).
  • the subject of the invention is also a method for quantifying the functionality of the support of formula (II) as defined above, characterized in that it comprises the following steps:
  • a fluorescent probe for example rhodamine, derivatized by an ⁇ -oxoaldehyde function
  • This method makes it possible to quantify the number of functional sites accessible to the fluorescent probe, on the support of formula (II) above.
  • the present invention also relates to a kit for preparing a DNA chip as described above, characterized in that it comprises the following elements: at least one functionalized support of formula (II) according to the present invention, a plurality of oligodeoxynucleotide primers which are modified either in position 3 ', or in position 5', or in position 3 'for a part of said primers and in position 5' for the other part of said primers, by tartaric acid, serine, threonine, their derivatives and the ⁇ -oxoaldehyde group, - reagents and buffers capable of carrying out reactions for elongation and / or amplification of said DNA, and in the case where said oligodeoxynucleotide primers are modified by a group selected from the group consisting of tartaric acid, serine, threonine and their derivatives, reagents capable of carrying out a periodic oxidation reaction.
  • the invention further relates to a method for sorting molecules which implements the DNA chip as defined above, as well as the sorted molecules capable of being obtained by this method.
  • the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the methods which are the subject of the present invention, as well as to the appended figures, in which:
  • FIGS. 1 and 10 show the deprotection of the MMT group carried, respectively, by the oligonucleotide prepared in accordance with Example 1 and by the oligonucleotide prepared in accordance with Example 2,
  • FIG. 2 shows, respectively, the coupling of an oligonucleotide with (+) - diacetyl-L-tartaric anhydride, dissuccinimidyl tartrate and trifluoroacetyl-serine, in accordance with Example 1
  • - Figures 3, 6 and 8 represent aminolysis reactions of an oligonucleotide immobilized on a solid support, in accordance with Example 1,
  • FIGS. 4 and 9 represent periodic oxidation reactions, in accordance with Example 1,
  • FIG. 11 represents the coupling of primer 1 with (+) - diacetyl-L-tartaric anhydride
  • FIG. 12 represents the aminolysis reaction of the primer 1 immobilized on a solid support, in accordance with Example 2,
  • FIG. 13 represents the periodic oxidation reaction of the primer 1, in accordance with Example 2
  • FIG. 14 represents the coupling of an oligonucleotide with dissuccinimidyl tartrate, in accordance with Example 3,
  • FIG. 15 represents the synthesis of a glass surface functionalized by a hydrazide function, in accordance with Example 5,
  • FIG. 16 represents the ligation of a fluorescent probe (rhodamine probe) to a glass surface functionalized with a hydrazide group, for controlling the quality of this surface, in accordance with Example 5
  • FIG. 17 represents the synthesis of a rhodamine peptide functionalized with an ⁇ -oxoaldehyde group, in accordance with Example 5, and
  • FIG. 18 represents the preparation of a functionalized solid support suitable for the synthesis of oligonucleotides carrying, at their 3 ′ end, an ⁇ -oxoaldehyde function, in accordance with Example 4.
  • EXAMPLE 1 Obtaining, by solid phase chemistry, of oligonucleotides modified in position 5 ′ by an ⁇ -oxoaldehyde function.
  • the oligonucleotides all have the following sequence: ATCGATCG.
  • oligonucleotide of sequence ATCGATCG is synthesized in solid phase, for example on a CPG support (Controled Pore Glass), according to the technique described in "Oligonucleotide Synthesis: a practical approach", edition MJ GAIT, IRL Press, Oxford, 1984, or in “Protocols for oligonucleotides and analogs: synthesis ans properties", edition S. AGRAWAL, Humana Press, Totowa NJ 1993, or by ELLINGTON, A. and POLLARD, JD. in "Current Protocols in Molec lar Biology", 1998, 2.1 1.1-2.11.25, John Wiley & Sons Inc., New York.
  • the synthesis follows a classic strategy (5 'hydroxyls protected by dimethoxytrityl groups, chemistry of cyanoethoxyphosphoramidites).
  • the bases are protected by acyl groups, which will be labile at the end of the synthesis during aminolysis.
  • the 5 'hydroxyl is deprotected and is coupled with an amino spacer arm of formula C ⁇ 2 H 24 -OPO 2 -, protected by a monomethoxytrityl group (MMT).
  • MMT monomethoxytrityl group
  • the MMT group will be eliminated at the last moment, just before coupling with a tartaric acid derivative, according to the reaction scheme represented in FIG. 1, in which the group P represents the protective group for the nucleotide bases (benzoyl for the bases A and C, isobutyryl for base G).
  • oligonucleotide on a support, on the oligonucleotide synthesizer are brought into contact with 3% trichloroacetic acid in dichloromethane, for 5 minutes 30 minutes, by carrying out two intermediate washes with CH CN (acetonitrile) in order to remove the yellow coloration.
  • CH CN acetonitrile
  • the “supported” oligonucleotide (that is to say the oligonucleotide immobilized on the support) is then washed with CH 3 CN and dried under argon, then with compressed air.
  • Two plastic syringes are placed at the two ends of the column in which the oligonucleotide is located on a support.
  • 1 ml of NH 4 OH (ammonia) at 32% is placed in the water.
  • a mechanical system makes it possible to push the plunger of this syringe in order to deliver 250 ⁇ l of fresh ammonia every 15 minutes.
  • the oligonucleotide in solution is thus recovered in the other syringe at the other end.
  • This solution is then transferred to a screw eppendorf and placed in an oven at 55 ° C overnight.
  • the solution is then cooled and 10 ⁇ l are taken in order to assay the oligonucleotide obtained (22.9 OD in 1000 ⁇ l).
  • the ammonia solution is evaporated and the residue is taken up in 400 ⁇ l of water.
  • RP-HPL C Analysis and purification by RP-HPL C.
  • the rest of the mother solution is purified on the column SP 250/10 Nucleosil 300/5 Cl 8 (room temperature, detection at 254 nm, buffer A: 10 mM TEAA in water, buffer B : CH 3 CN, gradient 5 to 40% B in 20 minutes, flow rate 5.5 ml / min).
  • the fractions corresponding to the majority product are isolated.
  • the fractions are combined and evaporated on a rotary evaporator, taken up in H 2 O, frozen and lyophilized.
  • Quantification analyzes by RP-HPLC and by mass spectrometry by electro-nebulization. The residue is taken up in 1000 ⁇ l of water.
  • the 260 nm assay makes it possible to calculate an oligonucleotide quantity of 256.28 ⁇ g.
  • Analysis by RP-HPLC 51 ⁇ l of the mother solution is injected onto Cl 8 hypersil 250 x 4.6 mm under the same analysis conditions as above. A 99.14% pure product is obtained.
  • Analysis by mass spectrometry by electro-nebulization 5 ⁇ l of the oligonucleotide dissolved in H 2 O / i-PrOH 20% / TEA 1% are injected at a concentration of 10 pmol / ⁇ l.
  • Analysis by mass spectrometry by electro-nebulization 20% i-PrOH buffer is continuously infused in H O.
  • the reaction was carried out on 181.5 ⁇ g of modified oligonucleotide.
  • the final oligonucleotide concentration is 0.65 mM, that of NaIO is 5 mM, ie 7.7 eq of NaIO relative to the oligonucleotide.
  • the product is frozen and lyophilized.
  • the residue is taken up in 3 ml of water.
  • the assay at 260 nm gives 112.6 ⁇ g of oligonucleotide, ie a periodic oxidation yield of 63.77%.
  • oligonucleotide on a support are transferred to an empty oligonucleotide synthesis column comprising, at its two ends, two gas-tight syringes.
  • 4 ⁇ l (85.86 eq) of 2,6-lutidine dissolved in 80 ⁇ l of THF are introduced into the column by one of the two syringes.
  • the oligonucleotide is left in contact with this solution the time to dissolve 6.38 mg (46.4 eq) of dissuccinimidyl tartrate in 80 ⁇ l of THF.
  • the latter solution is introduced in turn into the column and the mixture is stirred manually for 5 minutes.
  • the oligonucleotide in solution is thus recovered in the other syringe, at the other end. This solution is then transferred to a screw eppendorf and placed in an oven at 55 ° C overnight. The solution is then cooled and 10 ⁇ l are taken in order to assay the oligonucleotide obtained (26.9 OD in 1000 ⁇ l). The ammonia solution is evaporated and the residue is taken up in 400 ⁇ l of water.
  • CF 3 -CO-Ser (tBu) -OtBu (2 g, 6.39 mmol) is introduced into a 100 ml flask, then 10 ml of a trifluoroacetic anhydride (TFA) / water mixture (7.5 / 2.5). After three hours, 10 ml of TFA are added. After 2 hours of additional deprotection, the TFA and the water are concentrated under reduced pressure.
  • Rf 0.46 (CH 2 Cl 2 / MeOH / AcOH 77.5 / 15 / 7.5); N NMR (300 MHz, DMSO) ⁇ (ppm): 3.8 (m, 2H, CH 2 ⁇ ), 4.2 (m, 2H, CH ⁇ ), 9.5 (solid, 1H, NH).
  • the coupling was carried out on batches of 1 ⁇ mol of oligonucleotide.
  • the primary amine function of the 5 'aminolink is kept protected by the monomethoxytrityl (MMT) protective group and deprotected at the last moment, just before coupling with trifluoroacetyl-serine, as described above.
  • MMT monomethoxytrityl
  • Tube A 49.5 ⁇ l of lutidine (85 eq), 46 mg of CF 3 -CO-Ser-OH (46 eq) solubilized in 0.5 ml of DMF
  • tube B 120 mg of PyBop (46 eq) dissolved in 0.5 ml of DMF (dimethylformamide).
  • the support containing the oligonucleotide is conditioned beforehand for 3 minutes with a solution of 49.5 ⁇ l of lutidine in 1 ml of DMF.
  • the tube A is then aspirated with the syringe then the tube B, then the mixture is stirred manually for 5 minutes.
  • the resin is washed with DMF (3 times 2 minutes), with DCM (2 times 2 minutes), then is dried with argon.
  • the protective groups P of the nucleotides are benzoyl for the bases A and C and isobutyryl for the base G.
  • Aminolysis (FIG. 8).
  • the resin is placed in the presence of 250 ⁇ l of NH 4 OH 32% for 15 minutes.
  • the aminolysis solution is recovered. This operation is repeated 3 times.
  • the ammonia solutions obtained as well as 1 ml of solution for rinsing the support with 32% ammonia is transferred to a clean, pyrolized glass tube.
  • the tube is closed hermetically and left stirring, at 60 ° C, overnight. The next day, the tube is cooled in an ice bath.
  • the oligonucleotide solution is transferred to a hemolysis tube.
  • the glass tube is rinsed with 1 ml of water and this aqueous solution is transferred to the same hemolysis tube as above. The solution is then evaporated under reduced pressure.
  • the fractions corresponding to the product are combined, frozen and lyophilized.
  • ES-MS the product is analyzed under the usual conditions. The observed mass is 2728.0.
  • EXAMPLE 2 Another example of obtaining, by solid phase chemistry, oligonucleotides modified in position 5 ′ by an ⁇ -oxoaldehyde function.
  • the oligonucleotides have larger sequences than that of the oligonucleotides according to the previous example.
  • These oligonucleotides will be called, in what follows, primers 1 and 2 and have the following sequences respectively:
  • Primer 1 H 2 NC 6 H ⁇ 2 - spacer arm - GTC CAA GCT CAG CTA ATT
  • Primer 2 H 2 NC 6 H 12 - spacer arm - GCA GGA CTC TAG AGG ATC
  • the primary amine function of the aminolink in position 5 ′ of the oligonucleotide is kept protected by the protective group MMT and deprotected at the last moment, just before coupling with tartaric anhydride.
  • FIG. 10 represents the primer 1, in which the protective groups P of the nucleotides are benzoyl for the bases A and C and isobutyryl for the base G.
  • the arm spacer with the following formula: -OPO 2 - (OCH 2 CH 2 ) 6 OPO 2 - (OCH 2 CH 2 ) 6 -OPO 2 - 2) Modification of primers 1 and 2. in position 5 '.
  • the primers are each taken up in 1000 ⁇ l of water.
  • the assay at 260 nm gives 1605.12 ⁇ g of primer 1 and 1771.44 ⁇ g of primer 2.
  • Primer 1 represented below: M expected 6458.48, obtained 6454.5.
  • M expected 6458.48 obtained 6454.5.
  • the residues are taken up in 1000 ⁇ l of water.
  • the 260 nm assay gives the following results: 785.4 ⁇ g of primer 1, 500.3 ⁇ g of primer 2 (for the batch oxidized with 1 mM NaIO 4 ) and 521.4 ⁇ g of primer 2 (for the batch oxidized with 5 mM NaIO 4 ).
  • the primers are each taken up in 1000 ⁇ l of water.
  • the 260 nm assay gives the following results.
  • Primer 1 (1 mM NaIO 4 ): 781.4 ⁇ g of oligonucleotide.
  • Primer 2 (1 mM NaIO 4 ): 500.9 ⁇ g of oligonucleotide.
  • Primer 2 (5 mM NaIO 4 ): 505.6 ⁇ g of oligonucleotide.
  • reaction medium is taken up with 2210 ⁇ l of water and purified on the same ion exchange column using the same elution conditions. The product is frozen and lyophilized.
  • a 10 ml syringe is placed above a desalting cartridge (Sep Pak Plus Cl 8 Cartridge).
  • 7 ml of 95% CH 3 OH are passed therein in water and then 3 times 7 ml of buffer A.
  • the 200 ⁇ l of the oligonucleotide solution are then deposited on the cartridge.
  • the salts are eluted with 7 ml of buffer A.
  • Argogel resin ® -NH 2 pomrifying be used such as CPG supports (Controlled Pore Glass beads). • Protection of the free hydroxyl function by DMT.
  • the resin previously functionalized by 3 is conditioned successive washes of 3 minutes in pyridine.
  • 1 g of 4,4'-dimethoxytrityl chloride (3 mmol) dissolved in 5 ml of pyridine is added.
  • the excess reagents are removed by filtration and the resin is washed by successive washes with pyridine (5 times 3 minutes), with 3% triethylamine in DCM (3 times 3 minutes) before being vacuum dried.
  • the periodic oxidation is then carried out by the following steps.
  • the oxidized product is purified by RP-HPLC and lyophilized.
  • the majority product is isolated: 213.93 ⁇ g of oligonucleotides (yield of 11%) by quantitative measurement of the OD. Lyophilization in the presence of 1426.9 ⁇ g of mannitol and 0.189 ⁇ l of tri-N-butyl-triphenylphosphine.
  • the surface of the glass slides needs to be suitably arranged beforehand.
  • the presence of a spacer arm can be useful for moving the probe away from the surface and obtaining optimal hydration, as well as for partially controlling the physicochemical properties of the surface (hydrophilicity, hydrophobia, charge).
  • the surface can also be arranged to increase the number of functional sites per unit of surface, for example by the synthesis of dendrimeric structures on glass (BEIER, M. et al., Nucleic Acids Research, 1999, 27, 1970-1977) or by the coupling of polyamines.
  • the synthesis strategy envisaged is shown in FIG. 15.
  • the same reaction is used as that which will be used to fix the oligonucleotides, that is to say a ligation reaction with a compound functionalized with an ⁇ -oxoaldehyde group (cf. FIG. 16).
  • a probe for characterizing the slides with high sensitivity was chosen: it is a fluorescent peptide functionalized by an ⁇ -oxoaldehyde group.
  • a rhodamine peptide functionalized by an ⁇ -oxoaldehyde group of sequence (5) -6-carboxytetramethylrhodamine-Lys-Arg-NH- (CH) -NH-CO-CHO was synthesized from the support called IPT (2,3-O -isopropylidene-D-tartrate) described by JS FRUCHART et al. in Tet. Zetters, 1999, 40, 6225-6228 and in the PCT International Application published under the number W ⁇ 00/64843. The synthesis is summarized in FIG. 17.
  • the resin is washed with NMP (2 x 2 min), then with DCM (2 x 2 min).
  • the side chain protections and the isopropylidene group are deprotected with 5 ml of TFA in the presence of scavengers (375 mg of phenol, 125 mg of ethanedithiol, 250 ⁇ l of thioanisole and 250 ⁇ l of water).
  • the resin is then packaged in 5 ml of 33% acetic acid for 2 minutes.
  • the peptide is then cleaved from the support by the addition of sodium periodate (0.147 g, 6 eq) diluted in 1 ml of water with stirring for 5 minutes.
  • the resin is filtered and then washed with 10 ml of water (3 times 1 minute).
  • the cleavage solutions are combined and added to 21 ⁇ l of ethanolamine (3 eq) before being immediately purified on a Cl 8 RP-HPLC Hype ⁇ rep column (15 x 300mm). 8 mg
  • Protocol 1 the slides are immersed for 2 hours by ultrasound in a solution of K HPO at 5% in water. The slides are rinsed successively by bathing for 3 minutes in water (2 times) and finally in methanol (1 time). The slides are then dried in a vacuum desiccator.
  • Protocol 2 the slides are washed with a tris (hydroxymethyl) - aminomethane-acetate buffer 100 mM pH 5.5 containing 0.1% by mass of Tween 20 for 15 min.
  • Pre-cleaned microscope slides with ground edges and frosted margin are immersed in a 10% soda bath in water, first with ultrasound for 10 minutes and then overnight without ultrasound. After having rinsed these slides by three successive baths of 3 minutes in water, they are immersed for 4 hours in a solution of hydrochloric acid at 3.7% in water. Three-minute preliminary rinses are carried out with water (3 times) then with methanol (1 time), before immersing the slides in a bath at 3% aminopropyl-trimethoxysilane in 95% methanol for 30 minutes with ultrasound. The slides are rinsed successively by baths for 3 minutes in methanol (1 time), water (2 times) and finally methanol (1 time).
  • the slides functionalized with an isocyanate group are immersed for 2 hours by ultrasound in a solution of Fmoc-NH-NH 2 (22mmol / l) in DMF.
  • the slides are then rinsed successively by baths for 3 minutes in DMF (1 time), with water (2 times) and finally with methanol (1 time) before being dried and stored in a vacuum desiccator .
  • the slides functionalized by an isocyanate group could be reacted with hydrazine (1% by volume) in DMF. • Protection.
  • the process corresponding to the best conditions tested is as follows: the previously obtained slides are immersed in a DMF solution containing piperidine (0.2% by volume) and diazabicyclo-undecene (DBU, 2% by volume) for 30 minutes . The slides are then rinsed successively by baths for 3 minutes in DMF (1 time), with water (2 times) and finally with methanol (1 time) before being dried and stored in a vacuum desiccator .
  • Other deprotection systems could consist, for example, of mixtures DMF / piperidine (80/20) or DMF / piperidine / DBU (96/2/2), the contact times with the blades then being respectively 30 minutes or between 2 and 30 minutes. 3) Revelation, quality control of the blades.
  • the silanization of the veneer blades is carried out as described by BEIER, M. et al, in Nucleic Acids Research, 1999, 21, 1970-1977 and by BURNS, N. L. et al. in Langmuir, 1995, il, 2768-2776.
  • the slides are treated with an aqueous sodium hydroxide solution (10%) overnight, washed with water, with 1% hydrochloric acid in water, again with water and finally with methanol. After sonication for 15 minutes in 95% methanol containing 3% by volume of aminopropyltrimethoxysilane, the slides are washed with methanol, then with water, and dried under a stream of nitrogen. They are heated for 1 minute at 110 ° C. After cooling, they are stored under nitrogen.
  • b) Functionalization of the veneer blades • By a hydrazine function.
  • Fmoc-hydrazinoacetic acid (Fmoc: 9-fluorenylmethoxycarbonyl) of formula Fmoc-NH-NH-CH -COOH is synthesized from the hydrochloride of ethyl ⁇ -hydrazinoacetate (ALDRICH) by saponification of the ester function in soda followed by protection of the hydrazine function, according to the protocol described by ATHERTON, E. in The Peptides, 1987, 9, part C, Udenfriend S. and Meienhofer J. Eds., Académie Press, San Diego, California.
  • ATHERTON ethyl ⁇ -hydrazinoacetate
  • the silanized glass slides are brought into contact with Fmoc-hydrazinoacetic acid (100 mM) in the presence of BOP (100 mM) and DIEA (diisopropylethylamine; 200 mM) in dimethylformamide (DMF), for 1 hour.
  • BOP 100 mM
  • DIEA diisopropylethylamine; 200 mM
  • DMF dimethylformamide
  • the slides are then washed with DMF, treated with 20% by volume piperidine in DMF for 5 minutes (departure of the Fmoc groups protecting the hydrazine functions), then washed with DMF, with methanol, and dried under nitrogen. • By a hydroxylamine function.
  • the silanized veneer blades are treated with Fmoc-aminooxyacetic acid of formula Fmoc-NH-O-CH 2 -COOH (SENN CHEMICALS; 100 mM) in the presence of BOP (100 mM) and DIEA (200 mM) in the DMF, for 1 hour. They are washed with DMF and treated, for 5 minutes, with piperidine at 20% by volume in DMF (departure of the Fmoc groups protecting the hydroxylamine functions). They are then washed with DMF, with methanol and dried under nitrogen.
  • Fmoc-aminooxyacetic acid of formula Fmoc-NH-O-CH 2 -COOH
  • the silanized veneer blades are treated, in the presence of BOP (100 mM), DIEA (200 mM) and in DMF, for 1 hour, with Fmoc-Cys acid (StBu) -OH (acid of formula Fmoc- NH-CH (CH 2 SStBu) -COOH, corresponding to ⁇ -amino- ⁇ -mercaptopropionic acid whose thiol and amino functions are respectively protected by StBu and Fmoc groups; NOVABIOCHEM, 100 mM). After washing with DMF, they are treated with 20% piperidine in DMF for 5 minutes (departure of the Fmoc groups protecting amino functions).
  • EXAMPLE 7 Ligation of nucleic acids functionalized with an ⁇ -oxoaldehyde group to a support functionalized with hydrazide groups, for obtaining DNA or oligonucleotide arrays in accordance with the present invention.
  • the ligation of nucleic acids functionalized in position 5 ′ by an ⁇ -oxoaldehyde function on a blade of vene functionalized by a function hydrazide is described below.
  • the binding of nucleic acids to the glass slide results in the formation of hydrazone bonds (semicarbazone bonds).
  • the efficiency of the ligation on these slides was evaluated by hybridization of complementary oligonucleotides labeled in 5 ′ with a molecule of cyanine-3 (Cy-3).
  • the oligonucleotides were deposited on veneer blades using an Affymetrix ® 417 Arrayer robot (Affymetrix Inc., 3380 Central Exwy, Santa Clara, CA 95051) equipped with a sampling head with "needle - and - ring” mechanisms (4 needles).
  • the needles have a diameter of 125 ⁇ m and deposit a circular shape of approximately 150-170 ⁇ m in diameter for a volume of approximately 30-50 ⁇ l (volume announced by the supplier). The deposits were spaced 375 ⁇ m from center to center.
  • Detection of the fluorescent hybridization probe is obtained using an Affymetrix 8 '418 Array Scanner equipped with 2 laser diodes allowing reading at excitation wavelengths of 532 and 635 nm.
  • the fluorescence emitted by the fluorochromes after excitation is detected by a photo-multiplier tube (PMT).
  • PMT photo-multiplier tube
  • the result is obtained in the form of a 16-bit image file with a resolution of 10 ⁇ m / pixel.
  • the computer analysis of the image files and the quantification of the fluorescence intensity was done using the freeware "ScanAlyze" developed by M. EISEN, of Stanford University.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • the oligonucleotides carrying an ⁇ -oxoaldehyde function in the 5 ′ position are as obtained in Example 2 above.
  • the oligonucleotides used in this ligation protocol correspond to the following formulas
  • Pl- ⁇ -oxo 5'- ⁇ -oxo-GTC CAA GCT CAG CTA ATT-3 ';
  • PI -diol 5'-diol-GTC CAA GCT CAG CTA ATT-3 ';
  • PI -tartrate 5'-tartrate-GTC CAA GCT CAG CTA ATT-3 '.
  • sequences of the complementary oligonucleotides labeled with Cy3 are:
  • Complementary P2-Cy3 5'-Cy3-GAT CCT CTA GAG TCC TGC-3 '
  • the functionalized oligonucleotides are diluted in water and kept at -20 ° C. until use. The quantity necessary for the deposits is taken from this stock and lyophilized before being resuspended in the deposit solution.
  • the veneer blades used are functionalized by a hydrazide group and are as obtained in Example 5 above.
  • Different quantities of lyophilized oligonucleotides were resuspended in 20 ⁇ l of solution in order to obtain concentrations of 0.1 mM, 0.05 mM, 0.01 mM and 0.001 mM.
  • Different resuspension solutions have been tried in order to obtain the best possible spot appearance.
  • the deposits were made at 375 ⁇ m from each other, at a temperature of 20 ° C. and in an atmosphere at 70% ( ⁇ 5%) of relative humidity. After deposition, the slides were incubated in a humidity saturated enclosure (close to 100 relative humidity) at 37 ° C. for 14 to 16 h.
  • the slides were then washed in a 0.1% SDS solution for 5 minutes at room temperature in order to remove the oligonucleotides which did not react with the slide.
  • This washing step has been optimized in order to eliminate the maximum aspecific adsorption between the oligonucleotide and the vene.
  • the slides are dried by centrifugation (5 minutes; 30 xg; 20 ° C) in a vertical position.
  • Hybridizations are done in “CMT-Hybridization Chambers” (Corning).
  • the deposition zone is prehybridized with 15 ⁇ l of prehybridization buffer (50% formamide, 4x SSC, 0.5% SDS; 2.5x Denhardt) at 50 ° C for 1 h 30 min.
  • the prehybridization solution is placed between blade and coverslip.
  • the slide is placed in the hybridization chamber which contains 2 reservoirs receiving approximately 15 ⁇ l of prehybridization buffer to saturate the atmosphere inside the chamber with humidity.
  • the room is sealed and immersed in a water bath at 50 ° C.
  • the chamber is opened, the coverslip is removed and the prehybridization buffer is removed by tilting the slide on absorbent paper.
  • 15 ⁇ l of hybridization buffer (50% formamide; 6x SSC; 0.4% SDS; 4x Denhardt; 0.01 mM of additional oligonucleotide) are prepared and incubated 5 min at 95 ° C before being placed on the zone of deposit.
  • the slide is covered with the coverslip and placed in the hybridization chamber to be incubated at 50 ° C for 14 to 16 h. This process should be done as quickly as possible to avoid drying out after having removed the coverslip.
  • the slide After hybridization, the slide is immersed in 50 ml of 2x SSC in the vertical position in order to take off the coverslip. After detachment, the slide is successively washed in 50 ml of 0.1% SDS, 0.1 x SSC for 5 min; 50 ml of 0.1 l SSC for 5 min; 50 ml of 0.1 x SSC for 5 min. These washes are done in 50 ml Falcon tubes, at room temperature. Agitation is ensured by inverting the tube lx every minute. After the last washing, the slides are rinsed under a jet of sterile water and dried immediately by centrifugation (5 minutes; 30 xg; 20 ° C). • Reading of the slides with the scanner.
  • the slides are scanned at 532 nm wavelength (Cy-3), immediately after washing.
  • the reading is done at different settings of the laser power and the opening of the PMT tube.
  • a standard setting (35% laser power,
  • the oligonucleotides PI -tartrate and P2 were engaged in a PCR on the plasmid pFus II comprising a fragment of the S 1 gene from bordetella pertussis: pFus II + SI (the amplified part corresponds to the gene fragment inserted).
  • the PCR was performed using AmpliTaq Gold ® from Perkin Elmer and under the conditions recommended by the supplier.
  • the amplification cycles are as follows: lx
  • the deposition and ligation of these PCR products were carried out under the same conditions as in 3) above.
  • the hybridization was carried out as indicated in 4) above using a probe synthesized by unidirectional PCR on the plasmid pFus II + SI and using the oligonucleotide P2 to initiate the synthesis. After hybridization, the slides were washed and analyzed as described in 4) and 5) above.
  • Table 2 Fluorescence intensity of oligonucleotides deposited, in a tris-acetate buffer medium pH 5.5 + 450 mM NaCl, on a hydrazide slide and hybrids with complementary sequences labeled with Cy3.
  • An aspecific adsorption control is obtained by depositing an oligonucleotide with the same nucleotide sequence as Pl- ⁇ -oxo but whose functionalization is not complete (stop at the diol step) and which therefore does not have the possibility of reacting with the semicarbazid functions of the support.
  • This oligonucleotide is deposited at a concentration of 0.1 mM and has an intensity of fluorescence much lower than the Pl- ⁇ -oxo equivalent
  • Table 1 allow the estimation of the aspecific fixation intensity as representing only about 4% of the signal (10871 of 0.1 mM Pl- ⁇ -oxo by compared to 441 for 0.1 l mM Pl-d ⁇ ol).
  • the t ⁇ s-acetate buffer deposits (Table 2) have the same characteristics as in 3x SSC (Table 1), but with lower fluorescence intensities
  • the deposition (in 3x SSC) and hybridization protocols detailed above were repeated several times under the same conditions and identical results were obtained.
  • the same concentration range was prepared and deposited using an oligonucleotide of different sequence P2- ⁇ -oxo.
  • the deposition and the fixation on a hydrazide slide were carried out under the same conditions as for Pl- ⁇ -oxo
  • the hybridization was carried out using an oligonucleotide labeled with a Cy3 at 5 'and complementary to P2. After hybndation, the fluorescence measurements are very comparable to those obtained with Pl- ⁇ -oxo, proving that the results obtained with Pl- ⁇ -oxo are verified with pairs of oligonucleotides of different sequences.
  • results presented in this example show that it is possible to fix oligonucleotides functionalized in 5 ′ by an ⁇ -oxoaldehyde function on a hydrazide plate and that the oligonucleotides, once fixed, remain accessible for hybridizations with complementary oligonucleotides. It is also possible to dehybridize, by heating to 95 ° C., the oligonucleotides attached to the slide and to reuse this slide in a new hybridization. As for the oligonucleotide carrying, at its 5 ′ end, a tartrate group, it can be engaged in a PCR reaction then oxidized before being deposited on the hydrazide slide.
  • EXAMPLE 8 Deposit of oligonucleotides modified in position 5 ′ by an ⁇ -oxoaldehyde function on glass slides functionalized with hydrazine, hydroxylamnine or ⁇ -aminothiol groups. a) Case of the veneer blades functionalized by hydrazine or hydroxylamine groups.
  • the oligonucleotides modified in the 5 ′ position by an ⁇ -oxoaldehyde function are taken up in solution in a phosphate buffer of pH 6.0, then deposited manually or using a robot on the slides of vene obtained in Example 6.
  • the deposit is accompanied by the immobilization of the oligonucleotides on the surface by the formation of hydrazone bonds (in the case where the surface carries a hydrazine function) or oximes (in the case where the surface carries a hydroxylamine function).
  • the slides are incubated in a humid chamber overnight at 37 ° C. They were washed with water, then undergo a stripping treatment with disodium phosphate (Na 2 HPO 4 ; 2.5 mM) and 0.1% by volume of SDS (sodium salt of the ester of dodecyl sulfate) at 95 ° C and for 30 seconds. After washing with water, the slides are dried under a flow of nitrogen and stored under an inert atmosphere. b) Case of the veneer blades functionalized by ⁇ -aminothiol groups.
  • the oligonucleotides modified in position 5 ′ by an ⁇ -oxoaldehyde function are taken up in solution in a phosphate buffer of pH 6.0 containing 1 mM of TCEP (tris- (carboxyethyl) phosphine hydrochloride), then deposited manually or using a robot on the glass slides obtained in Example 6.
  • TCEP tris- (carboxyethyl) phosphine hydrochloride
  • the protocols described in a) and b) above can also use oligonucleotides modified in position 3 ′ by an ⁇ -oxoaldehyde function, or larger nucleic acids, such as DNA.
  • EXAMPLE 9 Ligation between a peptide having a hydrazine function in the N-terminal position and an oligonucleotide having a ⁇ -oxoaldehyde function in the 5 'position.
  • This example illustrates the ligation of an oligonucleotide in accordance with the invention to a non-solid support of peptide nature.
  • the peptide synthesis was carried out according to the Fmoc / t-Bu strategy on an Applied Biosystems 431 A synthesizer, on 0.25 mmol of MB HA Rink resin
  • Amide ® loaded at 0.74 mmol / g.
  • the amino acids are activated using a HBTU / HOBt / DIEA mixture (amino acid / HBTU / HOBt / DIEA: 4 eq / 4 eq / 4 eq / 8 eq) in the NMP.
  • the side chains are protected as follows: Arg (Pbf), Tyr (t-Bu).
  • the resin is divided into 2 lots. On one half (0.125 mmol), the Fmoc is manually deprotected by a piperidine / NMP 20/80 mixture and the triBocGlycineHydrazine is coupled using also HBTU, HOBt and DIEA (4 eq / 4 eq / 4 eq / 8 eq).
  • the resin is dried and cleaved for 1 h 30 min with 2.75 ml of a phenol / EDT / thioanisole / H 2 O / TFA mixture (0.3 g / 0.1 ml / 0.2 ml / 0.2 ml / qsp) 4 ml).
  • the peptide is precipitated in 200 ml of an Et 2 O / pentane 50/50 mixture. After lyophilization, 42.5 mg of crude peptide are obtained (ie a coupling yield of 45.4%).
  • the eppendorf containing the reaction medium, surrounded by parafilm in order to limit evaporation, is placed in a
  • the eppendorf is removed from the thermostated bath and 10 ⁇ l of citrate buffer are added 1 hour later.
  • the reaction medium is left at room temperature and frozen at -30 ° C after 27 hours. After thawing, 5 ⁇ l of the reaction medium are removed and 55 ⁇ l of water are added thereto.
  • SP support can consist of a polyacrylamide tree polymer; in this case, it will be interesting to fix, by covalent bond, of the oligonucleotides on this tree polymer, using the process according to the present invention.

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Abstract

La présente invention se rapporte à des produits comprenant un support sur lequel sont fixés des acides nucléiques, à leur procédé de préparation et à leur utilisation comme puce à ADN. La présente invention se rapporte également à des supports fonctionnalisés, à des oligonucléotides et à des ADN modifiés en position 5' par un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la sérine, la thréonine, leurs dérivés et le groupement alpha -oxoaldéhyde, ainsi qu'à leurs procédés de préparation. La présente invention se rapporte, en outre, à un procédé de fixation d'un acide nucléique sur un support.

Description

PRODUITS COMPRENANT UN SUPPORT SUR LEQUEL SONT FIXES DES ACIDES NUCLEIQUES ET LEUR UTILISATION COMME PUCE A ADN.
La présente invention se rapporte à des produits comprenant un support sur lequel sont fixés des acides nucléiques, à leur procédé de préparation et à leur utilisation comme puce à ADN. La présente invention se rapporte également à des supports fonctionnalisés, à des oligonucléotides et à des ADN modifiés en position 5', ainsi qu'à leurs procédés de préparation. La présente invention se rapporte, en outre, à un procédé de fixation d'un acide nucléique sur un support.
La fixation d'un ensemble d'ADN de séquences connues sur un support, dans un ordre bien précis, permet l'obtention de puces à ADN qui, par hybridation des ADN immobilisés sur le support avec des acides nucléiques ou des oligonucléotides cibles, permettent de déterminer la séquence de ces molécules cibles ou de suivre l'expression de gènes. Les applications sont nombreuses : découverte de nouveaux gènes, de nouveaux médicaments, réalisation de diagnostics, études de toxicité, etc.
Le procédé d'obtention de puces à ADN qui met en oeuvre la fixation d'ADN sur une lame de verre fait intervenir principalement des étapes de préparation de la lame de verre (traitement de sa surface par de la soude, puis adsorption de polylysine ou de polyéthylèneimine sur la surface via des interactions ioniques ; BURNS, N.L., Langmuir, 1995, il, 2768-2776), de dépôt de l'ADN sur les lames de verre ainsi préparées, puis de traitement thermique et d'irradiation UN pour lier, de façon covalente, l'ADΝ à la surface de verre.
L'utilisation d'ADN permet normalement d'obtenir des hybridations très spécifiques et de haute affinité par rapport à ce que l'on obtient avec des oligonucléotides relativement courts. Or, comme indiqué par LOCKHART, D.J. dans Nature Biotechnology, 1996, 14, 1675-1680, cela n'est pas le cas. Le mode de fabrication des lames peut expliquer ce phénomène. En effet, les ADN interagissent avec la polylysine ou la polyéthylèneimine par des interactions ioniques faisant intervenir les groupements phosphodiesters chargés négativement des acides nucléiques : ce mode de dépôt limite ainsi la liberté conformationnelle de l'ADN et son accessibilité. D'autre part, le traitement thermique appliqué avant l'irradiation UV dégrade l'ADN. En outre, l'irradiation UV elle-même modifie les bases pyrimidiniques (formation d'hydrates ou liaison à la surface via les fonctions silanol du verre, dimérisation entre plusieurs pyrimidines) alors que ces bases sont importantes pour l'hybridation.
Il apparaît ainsi que le procédé de liaison d'ADN sur une lame de verre décrit ci-dessus est complexe et sujet à un manque de reproductibilité. Les avantages liés à l'utilisation d'ADN au lieu d'oligonucléotides sont perdus du fait du mode de traitement des dépôts. Enfin, le lien ADN-surface de verre n'est pas stable : les lames de verre ne peuvent pas être utilisées plus de 2 ou 3 fois dans des réactions d'hybridation.
Une autre méthode d'immobilisation d'ADN ou d'oligonucléotides sur des lames de verre a été décrite par BEIR, M. (Nucleic Acids Research, 1999, 27, 1970-1977). Elle consiste en la formation d'une liaison amide entre 1ΑDN ou l'oligonucléotide et le support. A cet effet, des lames de verre silanisées avec de l'aminopropyl-triméthoxysilane sont dérivatisées avec un agent de couplage bifonctionnel apportant une fonction acide carboxylique activée. Des agents de couplages utilisables sont par exemple le phénylène diisothiocyanate, le disuccinimidylcarbonate, le disuccinimidyloxalate ou le diméthylsuberimidate décrits par HERMANSON, G.T. dans Bioconjugate Techniques, 1996, Académie Press (San Diego, Californie). Les ADN ou oligonucléotides, modifiés en position 5' par une fonction aminé, sont déposés en conditions basiques sur les lames de verre fonctionnalisées. Les lames obtenues semblent assez stables au recyclage.
Toutefois, cette méthode comporte plusieurs inconvénients : tout d'abord, l'utilisation d'un agent bifonctionnel sur le support peut conduire à une réticulation de cet agent sur la surface, et donc à une perte partielle de charge de la surface. L'utilisation d'isothiocyanate ou d'esters de N-hydroxysuccinimide conduit à un risque d'hydrolyse de ces fonctions lors du stockage des lames ou pendant la fixation, en conditions basiques, de l'ADN ou de l'oligonucléotide au support, c'est-à- dire, encore une fois, à une perte de charge de la surface. Enfin, les auteurs précisent qu'il faut bloquer les fonctions réactives du support après la fixation de l'ADN ou des oligonucléotides : clairement, toutes les fonctions réactives n'ont pas réagi. Ceci peut s'expliquer par la lenteur de la cinétique de couplage, qui conduit à un taux de fixation faible et à une hydrolyse partielle des fonctions réactives.
D'autres techniques consistent à utiliser un gel de polyacrylamide en tant que support et à y immobiliser des oligonucléotides par le biais d'une liaison hydrazone (GUSCHIN, D. et al., Anal. Biochem., 1997, 250, 203-211). Une telle immobilisation fait intervenir la synthèse d'un oligonucléotide fonctionnalisé en 3' par une 3-méthyluridine, son oxydation périodique pour transformer le diol de l'uridine en dialdéhyde, l'activation du gel de polyacrylamide par de l'hydrazine afin de créer des fonctions hydrazides, puis le dépôt de l'oligonucléotide oxydé sur le gel activé.
Cette méthode, qui ne s'applique pas à des ADN, est complexe et fait intervenir une oxydation périodique d'un ribose en position 3' ; les produits ainsi formés sont connus pour ne pas être stables (ADAMS, R.L.P. et al., The Biochemistry ofthe nucleic acids, tenth édition , 1986, Chapman and Hall, New- York). GUSCHIN, D. et al. (ibid) précisent d'ailleurs que les oligonucléotides oxydés ne peuvent être conservés qu'une semaine à 4°C.
En ce qui concerne l'immobilisation d'ADN, ces mêmes auteurs (GUSCHIN, D. et al., ibid) décrivent des étapes de dépurination de l'ADN dans l'acide formique, de précipitation dans l'acétone puis de dépôt sur un gel de polyacrylamide activé à l'hydrazine. Dans ce procédé, la structure initiale de l'ADN est donc dénaturée pour permettre son immobilisation, ce qui affecte ses capacités ultérieures d'hybridation. En outre, la dépurination de l'ADN en milieu acide conduit à des régions de polypentose-phosphate-diesters liant des régions d'oligonucléotides pyrimidiniques : or, les liaisons phosphate-diesters sont fragiles, donnant facilement une β-élimination en présence de bases. L'ADN ainsi immobilisé est donc peu stable. Outre des gels de polyacrylamide, il a également été proposé d'immobiliser de l'ADN sur des gels d'agarose. A cet effet, GILLES, P.N. (Nature Biotechnology, 1999, J_7, 365-370) procède à la préparation d'un gel de glycosal agarose avec de la streptavidine, à sa réduction avec du cyanoborohydrure de sodium, à la synthèse d'ADN portant une biotine en position 5', puis à leur dépôt sur le gel. Un inconvénient majeur de cette méthode est la nature non covalente de la liaison ADN- support.
Dans un autre domaine technique, le Brevet US 4 874 813 décrit la fixation de glycoprotéines sur un support solide par une liaison hydrazone, le support étant fonctionnalisé par un hydrazide et la glycoprotéine portant une fonction aldéhyde, introduite par oxydation de la partie carbohydrate de la glycoprotéine, porteuse d'une fonction diol-1,2. Cette technique n'est toutefois pas extrapolable à des ADN, qui sont naturellement dépourvus de fonctions diol- 1,2, ni à des acides nucléiques quels qu'ils soient. En effet, si les glycoprotéines utilisées dans le Brevet US 4 874 813 sont obtenues avec de quantités de l'ordre de la dizaine de milligramme, les acides nucléiques quant à eux sont manipulés à l'échelle du microgramme. Il est donc nécessaire de compenser ce facteur de dilution par l'utilisation de groupements fonctionnels plus réactifs que les aldéhydes obtenus par oxydation de sucres. Enfin, un acide nucléique portant une fonction aldéhyde à son extrémité est peu stable, notamment sujet à des réactions d'oxydation en présence d'air, et donne facilement lieu à la formation d'imines lorsqu'il est mis en présence d'enzymes, par exemple lors de réactions d'amplification. Ainsi, les Inventeurs se sont donnés pour but de pallier les inconvénients de l'Art antérieur et de pourvoir à un procédé de fixation d'acides nucléiques, notamment d'ADN ou d'oligonucléotides, sur un support qui réponde notamment aux critères suivants : - le procédé est simple au niveau expérimental, reproductible et non coûteux,
- il permet la liaison de l'acide nucléique à un support par l'intermédiaire de liaisons covalentes,
- il permet une liaison acide nucléique-support très stable dans les conditions d'hybridation et de lavage, limitant la désorption de l'acide nucléique et permettant l'obtention, lorsque l'acide nucléique est de l'ADN, de puces à ADN réutilisables dans de nombreux cycles d'hybridation,
- il met en œuvre un acide nucléique modifié qui est stable et dont l'obtention est simple, - il met en œuvre un support dérivatisé par une fonction stable, non hydrolysable,
- il fait intervenir, lors de la liaison entre l'acide nucléique et le support, des fonctions très réactives, compensant la faible concentration des partenaires, - il n'implique aucune dénaturation de la structure de l'acide nucléique, cette dernière restant optimale pour des réactions ultérieures d'hybridation. La présente invention a pour objet un produit de formule (I) :
SP [ A, ( Y1- Z - CO - M ) „ ] m (I)
dans laquelle :
Z représente un groupement de formule
ou un groupement -X-N=CH-, X représentant un groupement -CH2-O-, -CH2-NH- ou -NH-, i est égal à 0 ou à 1 , n est compris entre 1 et 16, n étant égal à 1 lorsque i est égal à O, m est supérieur ou égal à 1 , SP représente un support, A représente un bras espaceur,
Y représente une fonction assurant la liaison entre A et Z, et
M représente un acide nucléique lié au groupement -CO- adjacent par son extrémité 5' ou 3'. On entend par « acide nucléique », au sens de la présente invention, un ADN, un ARN ou un oligonucléotide, ce dernier correspondant à un enchaînement de 1 à 50 bases environ, ledit acide nucléique comportant des nucléosides naturels (A, C, G, T ou U) ou modifiés au niveau de la base (hétérocycle), du sucre et/ou de la liaison phosphodiester. Ledit acide nucléique peut donc également consister en un PNA (Peptide Nucleic Acid).
Dans la formule (I) ci-dessus, lorsque Z représente un groupement -
-X-N=CH-, ce dernier représente une liaison oxime quand X est un groupement
-CH2-O- et une liaison hydrazone quand X est un groupement -CH2-NH- ou -NH-. Le produit de formule (I) peut également comprendre une liaison thiazolidine lorsque Z représente un groupement de formule :
Selon la nature du groupement Z, le produit de formule (I) selon la présente invention peut donc correspondre aux produits de formules (la) et (Ib) représentées ci-dessous, dans lesquelles SP, A, Y, X, M, i, n et m sont tels que précédemment décrits :
SP [ A, ( Yl - X -N = CH - CO - M ) n ] m (la)
SP A ( (Ib)
Le produit de formule (I) selon la présente invention est tel que la liaison entre l'acide nucléique M et le support SP est très stable.
Dans la formule (I), n est avantageusement égal à 1 et A représente de préférence une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée comprenant de 2 à 100 atomes de carbone, de préférence de 5 à 50 atomes de carbone, et comprenant éventuellement de 1 à 35 atomes d'oxygène ou d'azote et de 1 à 5 atomes de silicium, de soufre ou de phosphore.
SP représente avantageusement un support solide, de préférence en verre, en silicium ou en polymère synthétique, tel que le nylon, le polypropylène et le polycarbonate. SP peut également, de façon avantageuse, représenter un support non solide, tel qu'un polymère naturel (par exemple un polysaccharide tel que la cellulose ou le mannane, ou encore un polypeptide), un polymère synthétique (par exemple un copolymère de N-vinylpyrrolidone et de dérivés de l'acide acrylique), un liposome ou un lipide. SP peut avantageusement représenter un vecteur de transfection, c'est-à-dire un composé organique (lipide ou peptide par exemple) perméable au niveau de la membrane cellulaire.
Selon un mode de réalisation avantageux du produit de formule (I) selon la présente invention, SP est un support solide, i est égal à 1, n est égal à 1 et M est un ADN, ledit produit constituant une puce à ADN.
Dans une telle puce à ADN, les m molécules M présentes dans la puce peuvent être identiques, mais sont de préférence différentes entre elles. Les puces à ADN selon la présente invention sont réutilisables dans de nombreux cycles d'hybridation, la liaison entre l'ADN et le support étant très stable dans les conditions d'hybridation et de lavage, ce qui limite considérablement les possibilités de désorption de l'ADN. Selon un autre mode de réalisation avantageux du produit de formule (I) selon la présente invention, SP représente un support en verre, i est égal à 1, n est égal à 1, A représente un bras espaceur de formule -Si-(CH2)3- et Y représente une fonction amide -NH-CO-.
La présente invention a également pour objet l'utilisation du produit de formule (I) ci-dessus, quand SP est un support solide, comme puce à acides nucléiques, telle qu'une puce à ADN ou à oligonucléotides.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation du produit de formule (I) ci-dessus, qui comprend la réaction de n x m molécules de formule M-CO-CHO avec un produit de formule SP [ A, ( Y, - B - NH2 ) n ] m , SP, A, Y, i, n, m et M étant tels que définis ci-avant et B représentant un groupement -CH2-O-, -CH2-NH-, -NH- ou -CH(CH2SH)-. Les molécules de formule M-CO-CHO correspondent à des acides nucléiques portant une fonction α-oxoaldéhyde (-CO-CHO) à leur extrémité 5' ou 3'.
La présente invention a également pour objet un procédé de fixation, par liaison covalente, d'au moins un acide nucléique M sur un support SP, pour l'obtention d'un produit de formule (I) tel que précédemment décrit, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : i) introduction d'une fonction α-oxoaldéhyde en une extrémité extrémité 5' ou 3') dudit acide nucléique, et ii) réaction de l'acide nucléique fonctionnalisé obtenu à l'étape i) avec un support modifié par une fonction sélectionnée dans le groupe constitué par les fonctions hydrazine, dérivées d'hydrazine, hydroxylamine et β-aminothiol.
En tant que fonction dérivée d'hydrazine, on peut citer par exemple les fonctions hydrazides, c'est-à-dire une hydrazine substituée par au moins un groupement acyle ou carbonyle. L'étape ii) ci-dessus résulte en la formation d'une liaison hydrazone
(cas où le support porte une fonction hydrazine ou dérivée d'hydrazine), oxime (cas où le support porte une fonction hydroxylamine) ou thiazolidine (cas où le support porte une fonction β-aminothiol) entre l'acide nucléique et le support.
De façon particulièrement avantageuse, le procédé selon la présente invention met en œuvre un support modifié par une fonction stable dans une large gamme de pH. Les fonctions qui interviennent lors de la liaison, à savoir la fonction α-oxoaldéhyde portée par l'acide nucléique et la fonction portée par le support, sont très réactives. En outre, le procédé selon la présente invention n'implique aucune dénaturation de la structure de l'acide nucléique, qui reste optimale pour des réactions ultérieures d'hybridation, dans le cas où le produit de formule (I) obtenu par le procédé selon la présente invention est utilisé comme puce à ADN.
Selon un mode de mise en œuvre avantageux du procédé selon la présente invention, l'introduction d'une fonction α-oxoaldéhyde en une extrémité dudit acide nucléique est effectuée par les étapes suivantes : a) introduction d'un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine et leurs dérivés à l'une des extrémités d'un oligonucléotide, b) hybridation de l'oligonucléotide obtenu à l'étape a) avec ledit acide nucléique, c) élongation dudit oligonucléotide, d) réitération des étapes b) et c) au moins une fois, e) oxydation périodique de l'acide nucléique obtenu à l'étape d), modifié à l'une de ses extrémités par un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine et leurs dérivés, et f) isolement d'un acide nucléique modifié à l'une de ses extrémités par une fonction α-oxoaldéhyde.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux du procédé selon la présente invention, l'introduction d'une fonction α-oxoaldéhyde en une extrémité dudit acide nucléique est effectuée par les étapes suivantes : a) introduction d'un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine et leurs dérivés à l'une des extrémités d'un oligonucléotide, b) oxydation périodique de l'oligonucléotide obtenu à l'étape a), c) hybridation de l'oligonucléotide obtenu à l'étape b), portant une fonction α-oxoaldéhyde à l'une de ses extrémités, avec ledit acide nucléique, d) élongation dudit oligonucléotide, e) réitération des étapes c) et d) au moins une fois, et f) isolement d'un acide nucléique modifié à l'une de ses extrémités par une fonction α-oxoaldéhyde.
Dans les procédés ci-dessus, il est bien entendu que l'étape d'hybridation de l'oligonucléotide avec l'acide nucléique s'effectue après une étape de dénaturation dudit acide nucléique, comme connu de l'Homme de l'art.
Les étapes d'hybridation entre un oligonucléotide et un acide nucléique, d'élongation dudit oligonucléotide et de réitération de ces étapes constituent des cycles d'amplification de l'acide nucléique, l'oligonucléotide servant d'amorce à ces amplifications, qui peuvent être réalisées par la technique dite PCR (Polymerase Chain Reaction) bien connue de l'Homme du métier, décrite par exemple dans Molecular Cloning, second édition, J. SAMBROOK, E.F. FRITSCH et T. MANIATIS (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
L'étape d'élongation de l'oligonucléotide, après son hybridation avec l'acide nucléique, est réalisée dans un milieu tampon convenable, en présence des bases nucléotidiques requises pour la formation d'acide nucléique.
A titre d'exemples de dérivés de l'acide tartrique utilisables dans les procédés décrits ci-dessus, on peut citer l'acide di-acétyl-tartrique, l'acide di-para- toluyl-tartrique, l'acide métatartrique, le tartrate de diméthyle, le tartrate de dissuccinimidyle, l'anhydride tartrique et l'anhydride di-acétyl-tartrique.
De façon avantageuse, l'introduction d'un groupement sélectionné dans le -groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine et leurs dérivés à l'une des extrémités d'un oligonucléotide (étape a) des procédés décrits ci-dessus) est effectuée via une liaison amide. Le groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine et leurs dérivés est de préférence lié à l'oligonucléotide via un bras espaceur lié, par l'une de ses extrémités, audit oligonucléotide et portant, à l'autre de ses extrémités, une fonction aminé.
Dans le procédé de fixation d'un acide nucléique M à un support SP décrit ci-dessus, l'acide nucléique est de préférence un ADN. Dans ce cas, l'oligonucléotide qui s'hybride avec cet acide nucléique est une amorce oligodésoxynucléotidique, qui peut être spécifique ou universelle. L'ADN peut être obtenu par amplification d'ADN génomique ou par amplification d'ADN inséré dans un vecteur, par exemple le phage M13. Dans le cas d'ADN obtenu par amplification d'ADN génomique, une première amplification avec une série d'amorces spécifiques peut être suivie d'une amplification à l'aide d'amorces universelles (voir par exemple POLLACK, J.R. dans Nature Genetics, 1999, 21, 41-46). Dans ce cas, deux amorces permettent d'amplifier un nombre important d'ADN différents. Il est particulièrement avantageux de modifier ces amorces universelles par un groupement choisi parmi l'acide tartrique, la serine, la thréonine, leurs dérivés ou le produit d'oxydation de ces groupements, à savoir une fonction α-oxoaldéhyde. Dans le cas d'ADN obtenu par amplification d'ADN inséré dans un vecteur, ici aussi un nombre important d'ADN différents peuvent être amplifiés grâce à l'utilisation d'amorces universelles fonctionnalisées par un groupement choisi parmi l'acide tartrique, la serine, la thréonine, leurs dérivés ou le produit d'oxydation de ces groupements.
La présente invention a également pour objet un oligonucléotide modifié en position 5' par un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine, leurs dérivés et le groupement α-oxoaldéhyde.
Un tel oligonucléotide peut avantageusement être utilisé en tant qu'amorce dans des réactions d'élongation ou d'amplification d'acides nucléiques, afin d'obtenir des acides nucléiques modifiés en position 5' par les groupements portés par ledit oligonucléotide.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un tel oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'introduction d'un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine et leurs dérivés en position 5' dudit oligonucléotide, cette étape étant suivie, dans le cas où ledit oligonucléotide est modifié par un groupement α-oxoaldéhyde, d'une oxydation périodique dudit oligonucléotide. La présente invention a également pour objet un ADN modifié en position 5' par un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine, leurs dérivés et le groupement α-oxoaldéhyde.
Un tel ADN peut avantageusement être utilisé dans le procédé selon la présente invention permettant la fixation, par liaison covalente, d'au moins un acide nucléique M sur un support SP, tel que décrit précédemment.
En effet, les groupements acide tartrique, serine et thréonine peuvent facilement être convertis en fonction α-oxoaldéhyde par une réaction d'oxydation périodique. Il est particulièrement intéressant d'utiliser un ADN modifié par une fonction α-oxoaldéhyde, car cette fonction est très stable et très réactive, en tout état de cause bien plus stable et réactive qu'une fonction aldéhyde. Ces considérations s'appliquent aussi aux oligonucléotides selon la présente invention, modifiés par une fonction α-oxoaldéhyde. Ainsi, les acides nucléiques quels qu'ils soient (notamment les ADN ou les oligonucléotides) peuvent être conservés sans s'oxyder ni se dégrader, en particulier en présence d'air (indépendamment de la position de leur fonctionnalisation à l'extrémité 3' ou 5'). Ils donnent lieu à des liaisons très stables avec des supports portant des fonctions réactives correspondantes, comme décrit ci- avant. En outre, et contrairement à des acides nucléiques fonctionnalisés par un aldéhyde, ils n'induisent pas de formation d'imine avec les enzymes présentes lors de réactions d'élongation ou d'amplification d'acides nucléiques et, dans le cas d'une amplification PCR à l'aide de la Taq polymérase, ils n' interagissent pas avec le dithiothreitol, agent de conservation de l'enzyme.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un ADN modifié en position 5' par un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine, leurs dérivés et le groupement α-oxoaldéhyde, tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) introduction d'un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine et leurs dérivés en position 5' d'un oligonucléotide, b) hybridation de l'oligonucléotide obtenu à l'étape a) avec un ADN, c) élongation dudit oligonucléotide, d) réitération des étapes b) et c) au moins une fois, ou dans le cas où ledit ADN est modifié par un groupement α-oxoaldéhyde, les étapes a) à f) des procédés précédemment décrits en rapport avec le procédé selon la présente invention ayant trait à l'introduction d'une fonction α-oxoaldéhyde à l'une des extrémités d'un acide nucléique.
L'étape d'élongation de l'oligonucléotide, après son hybridation avec l'ADN, est réalisée dans un milieu tampon convenable, en présence des bases désoxynucléotidiques requises pour la formation d'ADN. La présente invention a également pour objet un support fonctionnalisé de formule (II) :
SP [ A, ( Y1 - B - NH2 ) n ] m (II)
dans laquelle SP, A, Y, B, i, n et m sont tels que définis précédemment.
Un tel support porte une fonction hydrazine (cas où B représente un groupement -CH2-NH- ou -NH-), hydroxylamine (cas où B représente un groupement -CTL-O-) ou β-aminothiol (cas où B représente un groupement -CH(CH2SH)-). Le support fonctionnalisé de formule (II) peut avantageusement être utilisé dans le procédé selon la présente invention permettant la fixation, par liaison covalente, d'au moins un acide nucléique M à un support SP, tel que décrit précédemment.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation du support fonctionnalisé de formule (II), dans lequel i est égal à 1, n est égal à 1 et SP représente un support en verre, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : silanisation du support en verre, greffage, sur ledit support en verre silanisé, d'une fonction sélectionnée dans le groupe constitué par les fonctions hydrazine, dérivées d'hydrazine, hydroxylamine et β-aminothiol.
L'étape de silanisation du support est de préférence effectuée à 1 ' aide d ' aminopropyl-triméthoxysilane.
De façon particulièrement avantageuse, ledit greffage d'une fonction hydrazine est effectué à l'aide d'acide hydrazinoacétique, ledit greffage d'une fonction dérivée d'hydrazine est effectué à l'aide de triphosgène et d'hydrazine, ledit greffage d'une fonction hydroxylamine est effectué à l'aide d'acide aminooxyacétique et ledit greffage d'une fonction β-aminothiol est effectué à l'aide d'acide α-amino- β-mercaptopropionique. L'invention a également pour objet un procédé de contrôle de la qualité du support de formule (II) tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en contact du support avec une sonde fluorescente, par exemple la rhodamine, dérivatisée par une fonction α-oxoaldéhyde,
- lavage du support obtenu à l'issue de l'étape précédente, et - analyse de la fluorescence de ce support.
Ce procédé permet d'analyser l'homogénéité de la fonctionnalisation du support, à savoir la distribution spatiale des groupements terminaux -B-NH2 (cf. formule (II) ci-dessus).
L'invention a également pour objet un procédé de quantification de la fonctionnalité du support de formule (II) tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en contact du support avec une sonde fluorescente, par exemple la rhodamine, dérivatisée par une fonction α-oxoaldéhyde,
- lavage du support obtenu à l'issue de l'étape précédente, - hydrolyse du lien entre le support et la sonde fluorescente, en milieu acide fort ou par hydrolyse enzymatique (nucléase, protéase, ...), et
- mesure de la quantité de fluorescence libérée en solution à l'issue de cette hydrolyse.
Ce procédé permet de quantifier le nombre de sites fonctionnels accessibles à la sonde fluorescente, sur le support de formule (II) ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un kit de préparation d'une puce à ADN telle que décrite ci-avant, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : au moins un support fonctionnalisé de formule (II) selon la présente invention, une pluralité d'amorces oligodésoxynucléotidiques qui sont modifiées soit en position 3', soit en position 5', soit en position 3' pour une partie desdites amorces et en position 5' pour l'autre partie desdites amorces, par l'acide tartrique, la serine, la thréonine, leurs dérivés et le groupement α-oxoaldéhyde, - des réactifs et tampons aptes à la mise en œuvre de réactions d'élongation et/ou d'amplification dudit ADN, et dans le cas où lesdites amorces oligodésoxynucléotidiques sont modifiées par un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine et leurs dérivés, des réactifs aptes à la mise en œuvre d'une réaction d'oxydation périodique.
L'invention a également pour objet l'utilisation de la puce à ADN telle que définie précédemment dans les domaines d'application suivants :
- en chimie combinatoire, notamment pour le criblage de molécules à haut débit. Il peut s'agir par exemple du criblage de souches bactériennes, de l'identification de contaminants ou encore de l'identification de gènes ; - en tant qu'outil de diagnostic ; et
- pour le tri de molécules.
L'invention a, en outre, pour objet un procédé de tri de molécules qui met en œuvre la puce à ADN telle que définie précédemment, ainsi que les molécules triées susceptibles d'être obtenues par ce procédé. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre des procédés objets de la présente invention, ainsi qu'aux figures annexées, dans lesquelles :
- les figures 1 et 10 représentent la déprotection du groupe MMT porté, respectivement, par l'oligonucléotide préparé conformément à l'exemple 1 et par l'oligonucléotide préparé conformément à l'exemple 2,
- les figures 2, 5 et 7 représentent, respectivement, le couplage d'un oligonucléotide avec de l'anhydride (+)-diacétyl-L-tartrique, du tartrate de dissuccinimidyle et de la trifluoroacétyl-sérine, conformément à l'exemple 1, - les figures 3, 6 et 8 représentent des réactions d'aminolyse d'un oligonucléotide immobilisé sur un support solide, conformément à l'exemple 1,
- les figures 4 et 9 représentent des réactions d'oxydation périodique, conformément à l'exemple 1,
- la figure 11 représente le couplage de l'amorce 1 avec de l'anhydride (+)-diacétyl-L-tartrique,
- la figure 12 représente la réaction d'aminolyse de l'amorce 1 immobilisée sur un support solide, conformément à l'exemple 2,
- la figure 13 représente la réaction d'oxydation périodique de l'amorce 1, conformément à l'exemple 2, - la figure 14 représente le couplage d'un oligonucléotide avec du tartrate de dissuccinimidyle, conformément à l'exemple 3,
- la figure 15 représente la synthèse d'une surface de verre fonctionnalisée par une fonction hydrazide, conformément à l'exemple 5,
- la figure 16 représente la ligation d'une sonde fluorescente (sonde rhodaminee) à une surface de verre fonctionnalisée par un groupement hydrazide, pour le contrôle de la qualité de cette surface, conformément à l'exemple 5, - la figure 17 représente la synthèse d'un peptide rhodamine fonctionnalisé par un groupe α-oxoaldéhyde, conformément à l'exemple 5, et
- la figure 18 représente la préparation d'un support solide fonctionnalisé adapté à la synthèse d'oligonucléotides portant, à leur extrémité 3', une fonction α-oxoaldéhyde, conformément à l'exemple 4.
Sur les figures 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 10, 1 1 et 12, lorsque l'oligonucléotide immobilisé sur le support est protégé, la protection β-cyanoéthyle du lien phosphodiester est omise pour plus de clarté.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Obtention, par une chimie en phase solide, d'oligonucléotides modifiés en position 5' par une fonction α-oxoaldéhyde.
Dans cet exemple, les oligonucléotides présentent tous la séquence suivante : ATCGATCG.
1) Synthèse de l'oligonucléotide.
Un oligonucléotide de séquence ATCGATCG est synthétisé en phase solide, par exemple sur un support CPG (Controled Pore Glass), suivant la technique décrite dans « Oligonucléotide Synthesis : a practical approach », édition M.J. GAIT, IRL Press, Oxford, 1984, ou dans « Protocols for oligonucléotides and analogs : synthesis ans properties », édition S. AGRAWAL, Humana Press, Totowa NJ 1993, ou encore par ELLINGTON, A. et POLLARD, JD. dans « Current Protocols in Molec lar Biology », 1998, 2.1 1.1-2.11.25, John Wiley & Sons Inc., New York. La synthèse suit une stratégie classique (hydroxyles en 5' protégés par des groupements diméthoxytrityles, chimie des cyanoéthoxyphosphoramidites). Les bases sont protégées par des groupements acyles, qui seront labiles en fin de synthèse lors de l'aminolyse.
Une fois l'oligonucléotide synthétisé, l'hydroxyle en 5' est déprotégé et est couplé avec un bras espaceur aminé de formule Cι2H24-OPO2-, protégé par un groupement monométhoxytrityle (MMT). Le groupement MMT sera éliminé au dernier moment, juste avant le couplage avec un dérivé de l'acide tartrique, selon le schéma réactionnel représenté sur la figure 1, dans laquelle le groupement P représente le groupement protecteur des bases nucléotidiques (benzoyle pour les bases A et C, isobutyryle pour la base G). A cette fin, 0.8 μmoles d'oligonucléotide sur support, sur le synthétiseur d'oligonucléotides, sont mis en présence avec de l'acide trichloroacétique à 3% dans le dichlorométhane, pendant 5 minutes 30, en effectuant deux lavages intermédiaires au CH CN (acétonitrile) afin d'éliminer la coloration jaune. L'oligonucléotide « supporté » (c'est-à-dire l'oligonucléotide immobilisé sur le support) est ensuite lavé par CH3CN et séché sous argon, puis à l'air comprimé.
2) Introduction de la fonction α-oxoaldéhyde par l'utilisation de l'anhydride C+Vdiacétyl-L-tartrique. a) Couplage de l 'anhydride (+)-diacétyl-L-tartrique (figure 2). Cette réaction est représentée sur la figure 2, dans laquelle Ac représentent des groupes acétyles. 0.4 μmol d' oligonucléotide sur support sont transférés dans une colonne de synthèse d'oligonucléotides vide comprenant, à ses deux extrémités, deux seringues étanches au gaz. 4 μl (85.86 eq) de 2,6-lutidine dissous dans 80 μl de THF (tétrahydrofurane) sont introduits dans la colonne par l'une des deux seringues. On laisse l'oligonucléotide au contact de cette solution le temps de dissoudre 4.012 mg (46.4 eq) d'anhydride (+)-diacétyl-L-tartrique (ci-après désigné « anhydride tartrique ») dans 80 μl de THF. Cette dernière solution est introduite à son tour dans la colonne et on agite manuellement pendant 5 minutes. L'oligonucléotide supporté est ensuite lavé plusieurs fois (6 cycles) avec du THF sur le synthétiseur. Il est séché à l'argon et à l'air comprimé avant de subir un deuxième couplage de 10 minutes dans les mêmes conditions. Enfin, il est de nouveau lavé avec du THF au synthétiseur et séché à l'argon, puis à l'air comprimé. b) Aminolyse (figure 3).
On place 2 seringues en plastique aux 2 extrémités de la colonne dans laquelle se trouve l'oligonucléotide sur support. Dans la première, on place 1 ml de NH4OH (ammoniaque) à 32% dans l'eau. Un système mécanique permet de pousser le piston de cette seringue afin de délivrer 250 μl d'ammoniaque fraîche toutes les 15 minutes. L'oligonucléotide en solution est ainsi récupéré dans l'autre seringue à l'autre extrémité. Cette solution est ensuite transférée dans un eppendorf à vis et placé dans une étuve à 55°C pendant une nuit. La solution est ensuite refroidie et 10 μl sont prélevés afin de doser l'oligonucléotide obtenu (22.9 OD dans 1000 μl). La solution ammoniacale est évaporée et le résidu est repris dans 400 μl d'eau. c) Analyses et purification par RP-HPL C.
Pour la RP-HPLC analytique, 10 μl de la solution mère sont mis de côté (0.57 OD, soit 18.90 μg d'oligonucléotide), lyophilisés et repris dans 400 μl d'eau. 83.5 μl de cette dernière solution sont injectés sur Cl 8 hypersil 250 x 4.6 mm (30°C, détection à 260 nm, tampon A : 100 mM TEAA dans l'eau pH=6.5/CH3CN 99/1 en volume, tampon B : CH3CN/H2O 95/5 en volume, gradient 1 à 40% de B en 28 minutes, débit 1 ml/min). On observe un pic largement majoritaire de pureté (74.75%).
Pour la RP-HPLC préparative, le reste de la solution mère est purifié sur la colonne SP 250/10 Nucleosil 300/5 Cl 8 (température ambiante, détection à 254 nm, tampon A : TEAA 10 mM dans l'eau, tampon B : CH3CN, gradient 5 à 40% de B en 20 minutes, débit 5.5 ml/min). On isole les fractions correspondant au produit majoritaire. Les fractions sont rassemblées et évaporées à l'évaporateur rotatif, reprises dans H?O, congelées et lyophilisées. d) Quantification, analyses par RP-HPLC et par spectrométrie de masse par électro-nébulisation. Le résidu est repris dans 1000 μl d'eau. Le dosage à 260 nm permet de calculer une quantité d' oligonucléotide de 256.28 μg. Analyse par RP-HPLC : 51 μl de la solution mère sont injectés sur Cl 8 hypersil 250 x 4.6 mm dans les mêmes conditions d'analyse que précédemment. On obtient un produit pur à 99.14%. Analyse par spectrométrie de masse par électro-nébulisation : 5 μl de l'oligonucléotide en solution dans H2O/i-PrOH 20%/TEA 1% sont injectés à une concentration de 10 pmol/μl. Analyse par spectrométrie de masse par électro-nébulisation : on infuse en continu du tampon i-PrOH 20% dans H O. 5 μl de l'oligonucléotide en solution dans H2O/i-PrOH 20%/TEA 1% est injecté à une concentration de 10 pmol/μl. On travaille en mode d'ionisation négative et le cône est de 50V. Le débit est de 10 μl/min et la température de 70°C. On obtient un oligonucléotide correspondant à la formule suivante, dont la masse observée est de 2803.0 :
e) Oxydation périodique (figure 4).
La réaction a été réalisée sur 181.5 μg d'oligonucléotide modifié. 1.29 mg de NaIO (periodate de sodium, M=213.89) sont dissous dans 1206.73 μl de tampon acétate de sodium 100 mM pH=4.04. On prélève 100 μl de cette dernière solution (soit 0.1069 mg de NaIO ) que l'on dépose sur le résidu d'oligonucléotide. La concentration finale en oligonucléotide est de 0.65 mM, celle en NaIO est de 5 mM, soit 7.7 eq de NaIO par rapport à l'oligonucléotide. Le milieu est agité à température ambiante pendant lh30 min (suivi RP-HPLC : 4 μl du milieu réactionnel sont prélevés et dilués avec 96 μl d'eau ; colonne Cl 8 hypersil 250 x 4.6 mm ; 30°C ; détection tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1 en volume, tampon B : CH3CN/H2O
95/5, gradient 1 à 40 % de B en 28 minutes, 1 ml/min). 1 heure 30 plus tard, l'excès de NaIO4 est consommé avec 2 eq d'acide tartrique par rapport à NaIO , soit 10 μl d'une solution contenant 0.9 mg d'acide tartrique dissous dans 60 μl d'eau. Le milieu réactionnel est congelé à -30°C, avant d'être purifié par RP-HPLC. fi Purification du produit oxydé par RP-HPLC.
Le milieu réactionnel est repris dans 2 ml d'eau et le tube ayant contenu le milieu réactionnel est encore rincé par 2 ml d'eau et injecté sur une Cl 8 hyperprep (30°C, détection 260 nm, tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1 en volume, tampon B : CH3CN/H2O 95/5 en volume, gradient 0 à 40% de B en 86 minutes, 3 ml/min, détection à 260 nm). Le produit est congelé et lyophilisé. Le résidu est repris dans 3 ml d'eau. Le dosage à 260 nm donne 112.6 μg d'oligonucléotide, soit un rendement d'oxydation périodique de 63.77%. Analyse par spectrométrie de masse par électro-nébulisation : on infuse en continu du tampon i-PrOH 20% dans H O. 5 μl de l'oligonucléotide en solution dans H2O/i-PrOH 20%/TEA 1% est injecté à une concentration de 10 pmol/μl. On travaille en mode d'ionisation négative et le cône est de 50V. Le débit est de 10 μl/min et la température de 70°C. Résultats : [M-3H]3'
908.4, [M-4H]4" 681.1, [M-5H]5" 544.7. On obtient un oligonucléotide correspondant à la formule suivante :
5' 3'
3) Introduction de la fonction α-oxoaldéhvde par l'utilisation du tartrate de dissuccinimidyle. a) Couplage du tartrate de dissuccinimidyle (figure 5).
0.4 μmol d'oligonucléotide sur support sont transférés dans une colonne de synthèse d'oligonucléotide vide comprenant, à ses deux extrémités, deux seringues étanches au gaz. 4 μl (85.86 eq) de 2,6-lutidine dissous dans 80 μl de THF sont introduits dans la colonne par l'une des deux seringues. On laisse l'oligonucléotide au contact de cette solution le temps de dissoudre 6.38 mg (46.4 eq) de tartrate de dissuccinimidyle dans 80 μl de THF. Cette dernière solution est introduite à son tour dans la colonne et on agite manuellement pendant 5 minutes. L'oligonucléotide supporté est ensuite lavé plusieurs fois (6 cycles) avec du THF sur le synthétiseur. Il est séché à l'argon et à l'air comprimé avant de subir un deuxième couplage de 10 minutes dans les mêmes conditions. Enfin, il est de nouveau lavé avec du THF au synthétiseur et séché à l'argon, puis à l'air comprimé. b) Aminolyse (figure 6). On place 2 seringues en plastique aux 2 extrémités de la colonne dans laquelle se trouve l'oligonucléotide sur support. Dans la première, on place 1 ml de NH OH à 32% dans l'eau. Un système mécanique permet de pousser le piston de cette seringue afin de délivrer 250 μl d'ammoniaque fraîche toutes les 15 minutes. L'oligonucléotide en solution est ainsi récupéré dans l'autre seringue, à l'autre extrémité. Cette solution est ensuite transférée dans un eppendorf à vis et placée dans une étuve à 55°C pendant une nuit. La solution est ensuite refroidie et 10 μl sont prélevés afin de doser l'oligonucléotide obtenu (26.9 OD dans 1000 μl). La solution ammoniacale est évaporée et le résidu est repris dans 400 μl d'eau. c) Analyse et purification par RP-HPLC. Le brut est analysé par RP-HPLC analytique dans les mêmes conditions que précédemment. On obtient 1 pic majoritaire de pureté 30.1%. d) Analyse par spectrométrie de masse par électro-nébulisation
En utilisant les conditions habituelles d'analyse, le produit est pur à 97%. M observée : 2803.5 (ES-MS). e) Oxydation périodique.
On procède comme indiqué précédemment.
4) Introduction de la fonction α-oxoaldéhyde par l'utilisation de la trifluoroacétyl-sérine.
Dans cet exemple est décrit la couplage d'un oligonucléotide avec un dérivé de la serine, afin d'introduire une fonction α-oxoaldéhyde à l'extrémité dudit oligonucléotide. De façon générale, un dérivé de la thréonine pourrait également convenir, ainsi que tout β-aminoalcool portant une fonction carbonyle en α. a) Synthèse de la trifluoroacétyl-sérine. • Synthèse de CF3-CO-Ser(tBu)-OtBu Dans un ballon de 250 ml, sous agitation et à 0°C, on dissout 3 g de
H-Ser(tBu)-OtBu (13,8 mmol, 1 eq) dans 50 ml de DCM (dichlorométhane) fraîchement distillé sur de l'hydrure de calcium. On additionne 15 ml de pyridine fraîchement distillée sur de l'hydrure de calcium (0,185 mmol, 13 eq) puis 4,3 ml d'anhydride trifluoroacétique (4,3 ml, 2,2 eq). Après 15 minutes, le brut réactionnel est concentré sous pression réduite puis est repris par 50 ml d'acétate d'ethyle. La phase organique obtenue est lavée par une solution saturée de NaCl (2 fois 40 ml) puis séchée -sur sulfate de sodium anhydre, filtrée et concentrée sous vide. Le brut réactionnel est alors repris par du toluène (30 ml) puis lavé par une solution saturée de sulfate de cuivre (3 fois 30 ml) et à nouveau avec une solution saturée de NaCl (2 fois 40 ml). La phase organique est alors séchée sur sulfate de sodium anhydre, filtrée puis concentrée sous vide. On obtient ainsi une huile jaune (4,03g, rendement de 93%). Rf= 0,47 (AcOEt/Hexane 1/9) ; RMN Η (300 MHz, DMSO) δ (ppm): 1,2 (s, 9H, tBu), 1,5 (s, 9H, tBu), 3,5-4 (m, 2H, CH2β), 4,5 (m, 1H, CHα). • Synthèse de CF3-CO-Ser-OH
Dans un ballon de 100 ml, on introduit du CF3-CO-Ser(tBu)-OtBu (2 g, 6,39 mmol), puis 10 ml d'un mélange anhydride trifluoroacétique (TFA)/eau (7,5/2,5). Au bout de trois heures on additionne 10 ml de TFA. Après 2 heures de déprotection supplémentaire le TFA et l'eau sont concentrés sous pression réduite. Rf = 0,46 (CH2Cl2/MeOH/AcOH 77,5/15/7,5) ; RMN Η (300 MHz, DMSO) δ (ppm): 3,8 (m, 2H, CH2β), 4,2 (m, 2H, CHα), 9,5 (massif, 1H, NH). b) Couplage de la trifluoroacétyl-sérine sur l'oligonucléotide
(figure 7).
Le couplage a été réalisée sur des lots de 1 μmol d'oligonucléotide. La fonction aminé primaire de l'aminolink en 5' est conservée protégée par le groupement protecteur monométhoxytrityle (MMT) et déprotégée au dernier moment, juste avant le couplage avec la trifluoroacétyl-sérine, comme décrit précédemment.
Deux solutions sont préparées indépendamment, à savoir le tube A : 49,5 μl de lutidine (85 eq), 46 mg de CF3-CO-Ser-OH (46 eq) solubilisés dans 0,5 ml de DMF, et le tube B : 120 mg de PyBop (46 eq) solubilisés dans 0,5 ml de DMF (diméthylformamide) . Le support contenant l'oligonucléotide est préalablement conditionné pendant 3 minutes par une solution de 49,5 μl de lutidine dans 1 ml de DMF. Après avoir éliminé la solution de conditionnement par filtration, on aspire à la seringue le tube A puis le tube B, puis on agite manuellement pendant 5 minutes. Après élimination des réactifs par filtration, la résine est lavée au DMF (3 fois 2 minutes), au DCM (2 fois 2 minutes), puis est séchée à l'argon.
Sur la figure 7, les groupements protecteurs P des nucléotides sont le benzoyle pour les bases A et C et l'isobutyryle pour la base G. c) Aminolyse (figure 8).
La résine est mise en présence de 250 μl de NH4OH 32% pendant 15 minutes. La solution d'aminolyse est récupérée. Cette opération est répétée 3 fois. Les solutions ammoniacales obtenues ainsi qu'l ml de solution de rinçage du support par de l'ammoniaque à 32 % sont transvasés dans un tube en verre propre et pyrolisé. Le tube est refermé hermétiquement et laissé sous agitation, à 60°C, pendant une nuit. Le lendemain, le tube est refroidi dans un bain de glace. La solution d'oligonucléotide est transférée dans un tube à hémolyse. Le tube en verre est rincé par 1 ml d'eau et cette solution aqueuse est transvasée dans le même tube à hémolyse que précédemment. On évapore ensuite la solution sous pression réduite. d) Quantification, analyses et purification par RP-HPLC.
Le résidu brut est repris dans 2500 μl d'eau. Le dosage à 260 nm donne 2347.95 μg d'oligonucléotide brut. Analyse du brut par RP-HPLC : on purifie le milieu réactionnel brut sur une colonne Cl 8 hyperprep (30°C, détection à 260 nm, tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1 en volume, tampon B : CH3CN/H2O
95/5 en volume, gradient : 0 à 40% de B en 86 minutes, débit : 3 ml/min). Les fractions correspondant au produit sont congelées et lyophilisées. e) Quantification, analyses par RP-HPLC et spectrométrie de masse par électro-nébulisation.
Le résidu est repris dans 1 ml d'eau. Le dosage à 260 nm donne
175.3 μg d'oligonucléotide. Analyse par RP-HPLC : 35 μl de la solution sont dilués avec 25 μl d'eau. 30 μl de ces solutions sont alors injectés sur une colonne Cl 8 hypersil 250 x 4.6 mm dans les mêmes conditions d'analyse que précédemment. Le produit est pur à 99%. Analyse par spectrométrie de masse à électro-nébulisation : on infuse en continu du tampon i-PrOH 20% dans H2O. 10 μl des oligonucléotides en solution dans H2O/i-PrOH 20%/TEA 1% sont injectés à une concentration de
10 pmol/μl. On travaille en mode d'ionisation négative et le cône est de 50V. Le débit est de 10 μl/min et la température 70°C. La masse molaire observée pour le produit de formule suivante est de 2758.0 :
fi Oxydation périodique (figure 9).
46.1 μg d'oligonucléotide sont repris dans 25.6 μl de tampon phosphate 100 mM pH=6.92. 0.98 mg de NaIO4 sont dissous dans 416.3 μl d'eau. On prélève 2.56 μl de cette solution (soit 6.03 μg de NaIO4) que l'on dépose sur l'oligonucléotide en solution. 35 minutes plus tard, l'excès de NaIO est consommé avec 2 eq d'acide tartrique par rapport à NaIO4, soit 2.82 μl d'une solution contenant 0.81 mg d'acide tartrique dans 270 μl d'eau. Le milieu réactionnel est agité quelques instants et 4 μl du milieu réactionnel sont prélevés afin de réaliser une RP-HPLC. Pour cela, 4 μl du milieu réactionnel sont prélevés et dilués avec 96 μl d'eau. On réalise ainsi une RP-HPLC sur colonne Cl 8 hypersil 250 x 4.6 mm (30°C, détection à 260 nm, tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1 en volume, tampon B CH3CN/H2O mQ 95/5 en volume, gradient 1 à 40% de B en 28 minutes, volume injecté 70 μl, débit 1 ml/min). La réaction est totale. g) Purification du produit oxydé par RP-HPLC.
Le milieu réactionnel est injecté sur une colonne Cl 8 hyperprep (30°C, détection à 260 nm, tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1 en volume, tampon B : CH3CN/H2O 95/5 en volume, gradient 0 à 40% de B en 86 minutes, débit 3 ml/min). Les fractions correspondant au produit sont rassemblées, congelées et lyophilisées. h) Quantification et spectrométrie de masse par électro- nébulisation.
Le résidu est repris dans 1000 μl d'eau. Le dosage à 260 nm donne 19.87 μg d'oligonucléotide. ES-MS : le produit est analysé dans les conditions habituelles. La masse observée est de 2728.0.
EXEMPLE 2 : Autre exemple d'obtention, par une chimie en phase solide, d'oligonucléotides modifiés en position 5' par une fonction α-oxoaldéhyde.
1) Synthèse des oligonucléotides.
Dans cet exemple, les oligonucléotides présentent des séquences de taille plus importante que celle des oligonucléotides selon l'exemple précédent. Ces oligonucléotides seront appelés, dans ce qui suit, amorces 1 et 2 et présentent respectivement les séquences suivantes :
Amorce 1 : H2N-C6Hι2-bras espaceur-GTC CAA GCT CAG CTA ATT Amorce 2 : H2N-C6H12-bras espaceur-GCA GGA CTC TAG AGG ATC
Comme décrit dans l'exemple précédent, la fonction aminé primaire de l'aminolink en position 5' de l'oligonucléotide est conservée protégée par le groupement protecteur MMT et déprotégée au dernier moment, juste avant le couplage avec l'anhydride tartrique. Cette réaction est schématisée sur la figure 10 qui représente l'amorce 1, dans laquelle les groupements protecteurs P des nucléotides sont le benzoyle pour les bases A et C et l'isobutyryle pour la base G. Pour les amorces 1 et 2, le bras espaceur a la formule suivante : -OPO2-(OCH2CH2)6OPO2-(OCH2CH2)6-OPO2- 2) Modification des amorces 1 et 2. en position 5'. par une fonction α-oxoaldéhyde. a) Couplage des amorces avec de l'anhydride (+)-diacétyl-L- tartrique (figure 11, dans laquelle est représentée l 'amorce 1), puis réaction d 'aminolyse (figure 12, dans laquelle est représentée l 'amorce 1). On procède comme décrit dans l'exemple 1. b) Analyses et purification par RP-HPLC.
Pour chacune des amorces, à 1 μl de la solution mère, on ajoute 99 μl d'eau. 70 μl de cette solution sont alors injectés sur une colonne C18 hypersil 250 x 4.6 mm (30°C, détection 260 nm, tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1 en volume, tampon B CH3CNH2O 95/5 en volume, gradient 1 à 100% de B en 65 minutes pour l'amorce 1, gradient 1 à 40% de B en 28 minutes pour l'amorce 2, débit lml/min). L'amorce 1 est pure à 72.1%, l'amorce 2 à 59.5%. Les 2 amorces sont de nouveau lyophilisées puis reprises dans 2000 μl et 3000 μl d'eau, respectivement. Ces solutions sont purifiées sur une colonne Cl 8 hyperprep (30°C, détection 260 nm, tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1 en volume, tampon B : CH3CN/H2O 95/5 en volume, gradient 0 à 40% de B en 86 minutes, débit 3 ml/min). Les fractions correspondant au produit sont congelées et lyophilisées. c) Quantification, analyses par RP-HPLC et spectrométrie de masse par électronébulisation.
Les amorces sont reprises chacune dans 1000 μl d'eau.
Le dosage à 260 nm donne 1605.12 μg d'amorce 1 et 1771.44 μg d'amorce 2.
Analyse par RP-HPLC : pour chacune des amorces, à 5 μl de la solution mère, on ajoute 60 μl d'eau. 35 μl de cette solution sont alors injectés sur une colonne Cl 8 hypersil 250 x 4.6 mm dans les mêmes conditions d'analyse que précédemment. Amorce 1 : pureté > 99% ; amorce 2 : pureté de 98.6%.
Analyse par spectrométrie de masse par électronébulisation : on infuse en continu du tampon i-PrOH 20% dans H2O. 10 μl des amorces en solution dans H2O/i-PrOH 20%/TEA 1% sont injectés à une concentration de 10 pmol/μl. On travaille en mode d'ionisation négative et le cône est de 50V. le débit est de lOμl/min et la température 70°C.
Amorce 1, représentée ci-dessous : M attendue 6458.48, obtenue 6454.5. CAA GCT CAG CTA ATT
Amorce 2, représentée ci-dessous : M attendue 6548.533, obtenue
6544.0.
d) Oxydation périodique (figure 13, dans laquelle est représentée l 'amorce 1).
On procède comme décrit dans l'exemple 1, à la différence près que la réaction d'oxydation est effectuée à un pH de 6.56. La concentration du NaIO4 est de 1 mM dans le cas de l'amorce 1, et de 1 mM ou de 5 mM dans le cas de l'amorce 2 (séparée en deux lots). e) Purification du produit oxydé par RP-HPLC. Le milieu réactionnel est dilué avec de l'eau et injecté sur une C18 hypeφrep dans les mêmes conditions que précédemment. Dans chaque cas, le produit est congelé et lyophilisé. fi Quantification, analyse RP-HPLC et analyse par spectrométrie de masse.
Les résidus sont repris dans 1000 μl d'eau. Le dosage à 260 nm donne les résultats suivants : 785.4 μg d'amorce 1, 500.3 μg d'amorce 2 (pour le lot oxydé avec 1 mM de NaIO4) et 521.4 μg d'amorce 2 (pour le lot oxydé avec 5 mM de NaIO4).
Pour chacun des trois lots d'amorces (amorce 1, amorce 2 oxydée avec 1 mM de NaIO4 et amorce 2 oxydée avec 5 mM de NaIO ), respectivement à 7 μl, 11 μl et 10 μl de la solution mère, on ajoute respectivement 53 μl, 49 μl et 50 μl d'eau. 30 μl de ces solutions sont alors injectés sur une colonne Cl 8 hypersil 250 x 4.6 mm (3Θ°C, détection 260 nm, tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1 en volume, tampon B : CH3CNΗ2O 95/5 en volume, gradient 1 à 40 % de B en 28 minutes, débit 1 ml/min). La pureté des amorces dans chacun des lots est respectivement de 81,6%, 90,4% et 95,2%. Analyse par spectrométrie de masse à électro-nébullisation : on réalise les analyses dans les mêmes conditions que précédemment. Amorce 1 : M + H2O (hydrate) attendue 6400.4, observée 6397.0. Amorce 2 : M + H2O (hydrate) attendue 6490.4, observée 6487.0. g) Echange de contre-ions. Les contre-ions triéthylammonium provenant des RP-HPLC ont été échangés contre des ammonium. Ceci se réalise sur une petite colonne échangeuse remplie de résine AG 50W-x8, 200-400 Mesh de chez BIO-RAD, dont les H+ ont été au préalable échangés contre des NH4 +. Les amorces sont déposées dans l'eau et éluées également à l'eau. On recueille directement les amorces dans des pots à pénicilline, la colonne étant reliée à un détecteur UV. Les solutions sont congelées et lyophilisées. h) Quantification et analyse RP-HPLC
Les amorces sont reprises chacune dans 1000 μl d'eau. Le dosage à 260 nm donne les résultats suivants. Amorce 1 (1 mM de NaIO4) : 781.4 μg d'oligonucléotide. Amorce 2 (1 mM de NaIO4) : 500.9 μg d'oligonucléotide. Amorce 2 (5 mM de NaIO4) : 505.6 μg d'oligonucléotide.
Pour l'analyse RP-HPLC, on procède comme en f) ci-dessus. On obtient les pourcentage de pureté suivants : 80.2% pour l'amorce 1, 91.6% pour l'amorce 2 (1 mM de NaIO4), et 92.7% pour l'amorce 2 (5 mM de NaIO4). EXEMPLE 3 : Obtention, par une chimie en phase homogène, d'oligonucléotides modifiés en position 5' par une fonction α-oxoaldéhyde.
1) Couplage de l'oligonucléotide avec le tartrate de dissuccinimidyle (Tigure 14..
Comme dans l'exemple 1, l'oligonucléotide utilisé dans le présent exemple présente la séquence suivante : ATCGATCG. Il est fourni par Genset Paris (référence : L00032077, oligo nr 1289153). Il est repris dans 1 ml d'eau désionisée et dosé (19.8 OD dans 1000 μl d'eau ). 100 μl (65.34 μg d'oligonucléotide) de la solution mère sont ensuite évaporés sous pression réduite. Le résidu est repris dans 100 μl d'une solution bicarbonate de sodium 100 mM pH=8.51. Après agitation, 1 mg (115 eq) de tartrate de dissuccinimidyle, dissous dans 100 μl de THF stabilisé avec 0.025 % de BHT, sont ajoutés sur l'oligonucléotide en solution. La réaction est suivie en injectant un échantillon du milieu réactionnel sur une colonne échangeuse d'ions. Pour cela, 5 μl du milieu réactionnel sont prélevés, dilués avec 65 μl d'eau et injectés sur colonne ET 125/4 Nucleogen DEAE 60/7 (50°C, détection 260 nm, tampon A : 20 mM KH2PO4/K2HPO4 pH=7.21/CH3CN 80/20 en volume, tampon B : 20 mM KH2PO4/K2HPO4 1M KC1 pH=6.67/CH CN 80/20 en volume, gradient 0 à 30% de B en 5 minutes puis 30 à 100% de B en 42 minutes, volume injecté 70 μl, débit 1 ml/min).
Après 6 heures, la réaction est terminée. 2 μl de NH4OH 32 % sont ajoutés au milieu réactionnel pour consommer l'excès d'ester de N-hydroxy- succinimide. Après 24 heures, le milieu réactionnel est repris avec 2210 μl d'eau et purifié sur la même colonne échangeuse d'ions en utilisant les mêmes conditions d'élution. Le produit est congelé et lyophilisé.
2) Dessalage.
Le résidu est repris dans 200 μl de tampon A de dessalage (5 mM TEAA pH=7.04). Une seringue de 10 ml est placée au-dessus d'une cartouche de dessalage (Sep Pak Plus Cl 8 Cartridge). On y fait passer 7 ml de CH3OH 95% dans l'eau puis 3 fois 7 ml de tampon A. Les 200 μl de la solution d'oligonucléotide sont ensuite déposés sur la cartouche. Les sels sont élues avec 7 ml de tampon A. On élue enfin l'oligonucléotide avec 3 fois 3 ml de tampon B (5 mM TEAA pH=7.04/CH3OH 50/50) et on suit l'élution par dosage UV à 260 nm. La fraction contenant l'oligonucléotide est concentrée sous pression réduite.
3) Quantification, analyses par échange d'ions et spectrométrie de masse.
Le résidu est repris dans 1 ml d'eau. Le dosage à 260 nm donne 15.32 μg d'oligonucléotide. Analyse par spectrométrie de masse par électronébulisation : 5 μl de l'oligonucléotide en solution dans H2O/i-PrOH 20%/TEA 1% sont injectés à une concentration de 2.8 pmol/μl. On travaille toujours dans les mêmes conditions que précédemment. On obtient un oligonucléotide correspondant à la formule suivante, avec M 2720,0 ; (M-H+Na) 2742,0 ; (M-H+K) 2757.0 :
4) Oxydation périodique.
On procède comme décrit dans les exemples 1 et 2. EXEMPLE 4 : Obtention d'oligonucléotides modifiés en position 3' par une fonction α-oxoaldéhyde. Des oligonucléotides modifiés en position 3' par une fonction α-oxoaldéhyde, aptes à être immobilisés sur un support convenablement fonctionnalisé pour préparer une biopuce conforme à la présente invention, peuvent être obtenus à l'aide du support solide fonctionnalisé décrit dans la Demande internationale PCT publiée sous le numéro WO 00/64843 et dans l'article de J.S. FRUCHART et al. paru dans Tetrahedron Letters, 1999, 40, 6225-6228.
1 . Préparation d'un support solide fonctionnalisé ("figure 18 .
• Couplage de la propanolamine sur l 'anhydride diacétyl- tartrique.
Dans un ballon de 10 ml à 0°C sous agitation et sous pression d'argon, on solubilise 1,297 g d'anhydride-(+)-diacétyl-L-tartrique (6 mmoles) dans
2 ml de DMF. On additionne 0,459 ml de propanolamine (6 mmoles) puis 0,843 ml de triéthylamine (6 mmoles). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation pendant 5 minutes.
• Couplage de l 'acide 2,3-diacétoxy-N-(3-hydroxy-propyl)- succinamique sur une résine Argogel "-NH?.
On conditionne dans une seringue 263,18 mg (0,1 mmoles) de résine Argogel®-NH de charge 0,38 mmol/g par 3 lavages successifs de 3 minutes dans le DMF. On additionne 1,6 ml de la solution d'acide 2,3-diacétoxy-N-(3-hydroxy- propyl)-succinamique synthétisée précédemment, puis 1,56 g de PyBOP (3mmoles) solubilisés dans 1 ml de DMF. Après 15 minutes d'agitation, l'excès de réactifs est éliminé par filtration puis la résine est lavée par des lavages successifs au DMF (3 fois
3 minutes) et au DCM (2 fois 3 minutes) avant d'être séchée sous vide. Un test de Kaiser positif montre l'absence d'aminé libre sur la résine en fin de réaction. RMN HR-MAS (avec filtre de diffusion) (δ ppm) : 1,7 (s, 2H, CH2_CH2CH2), 2,1 (s, 6H, 2 x CH3 CO), 4,2 (m, 2H, CH2OH), 5,7 (s, 2H, 2 x CH tartrate), 6,5-7,2 (m, PS résine), 7,9 (m, 1H, NH), 8,2 (m, 1H, NH).
Il est bien entendu qu'en variante, d'autres supports solides que la résine Argogel®-NH2 pomraient être utilisés, tels que des supports CPG (Controlled Pore Glass beads). • Protection de la fonction hydroxyle libre par le DMT.
On conditionne la résine précédemment fonctionnalisée par 3 lavages- successifs de 3 minutes dans la pyridine. On additionne 1 g de chlorure de 4,4'-diméthoxytrityle (3mmoles) solubilisés dans 5 ml de pyridine. Après 1 heure d'agitation, l'excès de réactifs est éliminé par filtration puis la résine est lavée par des lavages successifs à la pyridine (5 fois 3 minutes), à la triéthylamine à 3% dans le DCM (3 fois 3 minutes) avant d'être séchée sous vide. RMN HR-MAS (avec filtre de diffusion) (δ ppm) : 1,8 (s, 6H, 2 x £H3CO), 2-2,5 (m, 2H, CH2CH2CH2), 3-3,6 (m, PEG résine), 3,7 (s, 6H, -O-CH3 DMT), 5,4 (s, 2H, 2*CH tartrate), 6,5-7,2 (m, PS résine et aromatiques du DMT), 7,7 (m, 1H, NH), 8,3 (m, 1H, NH)
2) Obtention d'un oligonucléotidique portant, en position 3'. une fonction α-oxoaldéhyde. à l'aide du support solide obtenu ci-dessus.
La synthèse de (T)6-PO2-O-(CH2)3-NH-CO-CHO est effectuée comme détaillé ci-dessous.
Après la synthèse oligonucléotidique sur le support solide préparé en 1) ci-dessus, conformément aux méthodes connues de l'Homme de l'art, 1 μmol d'oligonucléotide déprotégé en 5' (élimination du groupement DMT) sont introduits dans un eppendorf muni d'un joint résistant à la pression en présence d'1 ml d'ammoniaque à 32% dans l'eau. Après une nuit à 60°C, le mélange réactionnel est refroidi puis est transvasé dans une seringue. La solution ammoniacale est éliminée par filtration, puis la résine est lavée par des lavages successifs à l'ammoniaque à 32% (2 fois 3 minutes), puis à l'eau jusqu'à ce que la solution de lavage soit neutre par mesure au papier pH. La résine est ensuite séchée sous vide.
L'oxydation périodique est ensuite réalisée par les étapes suivantes. On conditionne la résine précédemment fonctionnalisée par 3 lavages successifs de 3 minutes dans un tampon phosphate 0,1 M à pH=6,4. On additionne l/10eme d'une solution constituée de 36,3 mg (170 μmol) de periodate de sodium solubilisé dans un mélange d'eau (0,1 ml) et de tampon phosphate 0,1 M à pH=6,4 (5 ml). Après 1 heure d'agitation, on additionne 5,1 mg d'acide tartrique (34 μmol) solubilisés dans 500 μl d'eau. Après 2 minutes, la solution d'oxydation est récupérée dans un tube par filtration. La résine est lavée par 2 lavages successifs à l'eau, les eaux de filtrations étant associées à la solution d'oxydation précédente (volume total = 3,63 ml).
Le produit oxydé est purifié par RP-HPLC et lyophilisé. Pour la RP- HPLC, le milieu réactionnel est directement injecté sur une Cl 8 hypeφrep (t°=30°C, 260 nm, tampon A=100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1, tampon B=CH3CN/H2O 95/5, gradient=0 à 40% de B en 86 minutes, volume injecté=3,53 ml, débit=3 ml/min). On isole le produit majoritaire : 213,93 μg d'oligonucléotides (rendement de 11%) par mesure quantitative de la DO. Lyophilisation en présence de 1426,9 μg de mannitol et de 0,189 μl de tri-N-butyl-triphénylphosphine.
EXEMPLE 5 : Préparation de surfaces de verre fonctionnalisées par un groupement hydrazide (figure 15)
Afin de pouvoir se lier aux acides nucléiques portant une fonction α-oxoaldéhyde à leur extrémité 3' ou 5', conformément au procédé conforme à l'invention, la surface des lames de verre nécessite d'être convenablement aménagée au préalable. En particulier, la présence d'un bras espaceur peut être utile pour éloigner la sonde de la surface et obtenir une hydridation optimale, ainsi que pour contrôler en partie les propriétés physico-chimiques de la surface (hydrophilie, hydrophobie, charge). La surface peut également être aménagée pour augmenter le nombre de sites fonctionnels par unité de surface, par exemple par la synthèse de structures dendrimériques sur le verre (BEIER, M. ét al., Nucleic Acids Research, 1999, 27, 1970-1977) ou par le couplage de polyamines. La stratégie de synthèse envisagée est représentée sur la figure 15. Pour déterminer la qualité des lames hydrazides synthétisées, on utilise la même réaction que celle qui sera utilisée pour fixer les oligonucléotides, c'est à dire une réaction de ligation avec un composé fonctionnalisé par un groupe α-oxoaldéhyde (cf. figure 16). Une sonde permettant de caractériser les lames avec une grande sensibilité a été choisie : il s'agit d'un peptide fluorescent fonctionnalisé par un groupe α-oxoaldéhyde.
1) Synthèse d'une sonde fluorescente fonctionnalisée par un groupe α-oxoaldéhyde.
Un peptide rhodamine fonctionnalisé par un groupe α-oxoaldéhyde de séquence (5)-6-carboxytetraméthylrhodamine-Lys-Arg-NH-(CH ) -NH-CO-CHO a été synthétisé à partir du support dénommé IPT (2,3-O-isopropylidène-D-tartrate) décrit par J.S. FRUCHART et al. dans Tet. Zetters, 1999, 40, 6225-6228 et dans la Demande internationale PCT publiée sous le numéro WΟ 00/64843. La synthèse est résumée sur la figure 17. 500 mg de résine IPT (0,23 mmol/g) sont utilisés dans un cycle de synthèse en phase solide selon une stratégie Fmoc/t-Bu dans du NMP (N-méthylpyrrolidone) avec les réactifs et les quantités suivantes :
- Fmoc-Arg(Pbf)-OH (0,298 g, 4 eq), HBTU (0,174 g, 4 eq), HOBt (62 mg, 4 eq), DIE A (240 μl, 12 eq) pendant 1 heure. Déprotection NMP/pipéridine (80/20) 30 minutes,
- Fmoc-Lys(Boc)-OH (0,215 g, 4 eq), HBTU (0,174 g, 4 eq), HOBt (62 mg, 4 eq), DIE A (240 μl, 12 eq) pendant 1 heure. Déprotection NMP/pipéridine
(80/20) 30 minutes, - (5)-6-carboxytétraméthylrhodamine (99 mg, 2 eq), HBTU (0,087 g, 2 eq), HOBt (31 mg, 2 eq), DIEA (120 μl, 6 eq) pendant 1 heure.
La résine est lavée par du NMP (2 x 2min), puis par du DCM (2 x 2min). Les protections des chaînes latérales et le groupe isopropylidène sont déprotégés par 5 ml de TFA en présence scavengers (375 mg de phénol, 125 mg d'éthanedithiol, 250 μl de thioanisole et 250 μl d'eau). La résine est alors conditionnée dans 5 ml d'acide acétique à 33% pendant 2 minutes. Le peptide est alors clivé du support par addition de periodate de sodium (0,147g, 6 eq) dilué dans 1 ml d'eau sous agitation pendant 5 minutes. La résine est filtrée puis est lavée par 10 ml d'eau (3 fois 1 minute). Les solutions de clivages sont combinées et additionnées à 21 μl d'éthanolamine (3 eq) avant d'être purifiées immédiatement sur une colonne Cl 8 RP-HPLC Hypeφrep (15 x 300mm). On obtient ainsi 8 mg de peptide.
Après que les peptides rhodaminés auront été fixés sur les lames hydrazides, les lames seront lavées pour éliminer l'adsoφtion non covalente, selon les différentes protocoles suivants. Protocole 1 : les lames sont plongées pendant 2 heures aux ultrasons dans une solution de K HPO à 5% dans l'eau. Les lames sont rincées successivement par bains de 3 minutes dans de l'eau (2 fois) et enfin dans du méthanol (1 fois). Les lames sont ensuite séchées dans un dessiccateur sous vide. Protocole 2 : les lames sont lavées avec un tampon tris(hydroxyméthyl)- aminométhane-acétate 100 mM pH 5,5 contenant 0.1% en masse de Tween 20 pendant 15 min.
2) Fonctionnalisation des lames de verre par un groupement hvdrazide ("fonction dérivée d'hydrazine . a) Etapes de lavage, de décapage et de silanisation des lames commerciales.
Des lames porte-objets (Esco) pré-nettoyées, à bords rodés et à marge dépolie sont plongées dans un bain de soude à 10% dans l'eau, d'abord aux ultrasons pendant 10 minutes puis une nuit sans ultrasons. Après avoir rincé ces lames par trois bains successifs de 3 minutes dans de l'eau, elles sont plongées pendant 4 heures dans une solution d'acide chlorhydrique à 3,7% dans l'eau. Des rinçages préalables de trois minutes sont effectués par de l'eau (3 fois) puis par du méthanol (1 fois), avant de plonger les lames dans un bain à 3% d'aminopropyl-triméthoxysilane dans du méthanol à 95% pendant 30 minutes aux ultrasons. Les lames sont rincées successivement par des bains de 3 minutes dans du méthanol (1 fois), de l'eau (2 fois) et enfin du méthanol (1 fois). Les lames sont ensuite égouttées pendant quelques minutes, séchées 15 minutes dans une étuve à 110°C puis stockées dans un dessiccateur sous vide. b) Fonctionnalisation des lames silanisées par réaction d 'un dérivé de l 'hydrazine sur un isocyanate. • Formation de l'isocyanate.
Pour la formation de l'isocyanate, le triphosgène et le carbonyldiimidazole ont été testés. Mais de nombreux autres réactifs pourraient être utilisés. Différents solvants ont également été testés : dichlorométhane, DMF, tBu- OMe, toluène et dichloroéthane. Les lames précédemment silanisées sont plongées pendant 2 heures dans une solution de dichloroéthane contenant du triphosgène (100 mmol/1) et de la DIEA (800 mmol/1). Ces lames sont ensuite rapidement égouttées avant d'être directement plongées dans la solution contenant le dérivé d'hydrazine. • Réaction de l'isocyanate avec l'hydrazine ou un dérivé. Synthèse de Fmoc-NH-NH2 : dans un ballon de 1 litre on introduit 10 ml d'hydrazine hydrate sous agitation. On additionne par une ampoule à brome 1 g de Fmoc-Cl dissous dans 250 ml d'acétonitrile. Le mélange réactionnel est agité pendant 30 minutes à température ambiante puis est concentré sous vide. Le brut obtenu est recristallisé dans 200 ml d'éthanol absolu puis est filtré sur fritte. Les cristaux blancs sont lavés par de l'éthanol absolu puis sont séchés sous vide (m = 0,65 g, Rendement = 65%). Rf = 0,74 (CH2C12/TEA 9,5/0,5); T°f=162-165°C ; RMN Η (300 MHz, DMSO) δ (ppm): 4 (massif, 2H, NH2), 4-4,1 (m, 3H, CH2 et CH (Fmoc)) ; 7,2-7,9 (m, 8H (Fmoc)), 8,3 (massif, 1H, NH).
Les lames fonctionnalisées par un groupe isocyanate sont plongées pendant 2 heures aux ultrasons dans une solution de Fmoc-NH-NH2 (22mmol/l) dans du DMF. Les lames sont alors rincées successivement par des bains de 3 minutes dans du DMF (1 fois), par de l'eau (2 fois) et enfin par du méthanol (1 fois) avant d'être séchées et stockées dans un dessiccateur sous vide. Alternativement, on pourrait faire réagir les lames fonctionnalisées par un groupement isocyanate avec de l'hydrazine (1% en volume) dans le DMF. • Déprotection.
Le procédé correspondant aux meilleures conditions testées est le suivant : les lames précédemment obtenues sont plongées dans une solution de DMF contenant de la pipéridine (0,2% en volume) et du diazabicyclo-undecène (DBU, 2% en volume) pendant 30 minutes. Les lames sont alors rincées successivement par des bains de 3 minutes dans du DMF (1 fois), par de l'eau (2 fois) et enfin par du méthanol (1 fois) avant d'être séchées et stockées dans un dessiccateur sous vide. D'autres systèmes de déprotection pouvaient consister, par exemple, en des mélanges DMF/pipéridine (80/20) ou DMF/pipéridine/DBU (96/2/2), les temps de contact avec les lames étant alors respectivement de 30 minutes ou compris entre 2 et 30 minutes. 3) Révélation, contrôle de la qualité des lames. Les lames obtenues sont révélées (contrôle de leur qualité) avec le peptide rhodamine α-oxoaldéhyde précédemment synthétisé : les lames fonctionnalisées par un groupe hydrazide sont trempées pendant 1 heure à 37 °C dans un bain du peptide rhodamine fonctionnalisé par un groupe α-oxoaldéhyde (64 μmol/1) en présence de tampon acétate (100 mM, pH=5,5). Le peptide non fixé de façon covalente, mais adsorbé sur la lame est éliminé par trempage pendant 2 heures aux ultrasons dans une solution de K2HPO4 à 5% dans l'eau. Les lames sont rincées successivement par des bains de 3 minutes d'eau (2 fois) et de méthanol (1 fois). Les lames sont ensuite séchées dans un dessiccateur sous vide puis passées au scanner. La même expérience peut être réalisée avec un peptide rhodamine non porteur d'une fonction α-oxo-aldéhyde (contrôle négatif). Séquence du peptide : rhodamine-Lys- Arg-NH2.
EXEMPLE 6 : Préparation de surfaces de verre fonctionnalisées par un groupement hydrazine, hydroxylamine ou β-aminothiol.
Les procédés décrits ci-dessous permettent d'obtenir des surfaces de vene convenablement fonctionnalisées en vue de la fixation d'acides nucléiques modifiés en position 5' ou 3' par une fonction α-oxoaldéhyde. a) Silanisation des lames de verre.
La silanisation des lames de vene est effectuée comme décrit par BEIER, M. ét al, dans Nucleic Acids Research, 1999, 21, 1970-1977 et par BURNS, N. L. et al. dans Langmuir, 1995, il, 2768-2776. Les lames sont traitées avec une solution aqueuse de soude (10%) pendant une nuit, lavées à l'eau, à l'acide chlorhydrique à 1% dans l'eau, de nouveau à l'eau et enfin au méthanol. Après une sonication pendant 15 minutes dans du méthanol à 95% contenant 3% en volume d'aminopropyltriméthoxysilane, les lames sont lavées au méthanol, puis à l'eau, et séchées sous un flux d'azote. Elles sont chauffées pendant 1 minutes à 110°C. Après refroidissement, elles sont stockées sous azote. b) Fonctionnalisation des lames de vene. • Par une fonction hydrazine.
L'acide Fmoc-hydrazinoacétique (Fmoc : 9-fluorènylméthoxy- carbonyle) de formule Fmoc-NH-NH-CH -COOH est synthétisé à partir du chlorhydrate de l'α-hydrazinoacétate d'ethyle (ALDRICH) par saponification de la fonction ester dans de la soude suivie d'une protection de la fonction hydrazine, selon le protocole décrit par ATHERTON, E. dans The Peptides, 1987, 9, part C, Udenfriend S. et Meienhofer J. Eds., Académie Press, San Diego, Californie. Les lames de verre silanisées sont mises en contact avec l'acide Fmoc-hydrazinoacétique (100 mM) en présence de BOP (100 mM) et de DIEA (diisopropyléthylamine ; 200 mM) dans le diméthylformamide (DMF), pendant 1 heure. Les lames sont ensuite lavées au DMF, traitées avec de la pipéridine à 20% en volume dans le DMF pendant 5 minutes (départ des groupes Fmoc protecteurs des fonctions hydrazines), puis lavées au DMF, au méthanol, et séchées sous azote. • Par une fonction hydroxylamine.
Les lames de vene silanisées sont traitées par l'acide Fmoc- aminooxyacétique de formule Fmoc-NH-O-CH2-COOH (SENN CHEMICALS ; 100 mM) en présence de BOP (100 mM) et de DIEA (200 mM) dans le DMF, pendant 1 heure. Elles sont lavées au DMF et traitées, pendant 5 minutes, par de la pipéridine à 20% en volume dans le DMF (départ des groupes Fmoc protecteurs des fonctions hydroxylamines). Elles sont ensuite lavées au DMF, au méthanol et séchées sous azote.
• Par une fonction β-aminothiol.
Les lames de vene silanisées sont traitées, en présence de BOP (100 mM), de DIEA (200 mM) et dans le DMF, pendant 1 heure, par l'acide Fmoc-Cys(StBu)-OH (acide de formule Fmoc-NH-CH(CH2SStBu)-COOH, conespondant à l'acide α-amino-β-mercaptopropionique dont les fonctions thiol et aminé sont respectivement protégées par des groupes StBu et Fmoc ; NOVABIOCHEM, 100 mM). Après un lavage au DMF, elles sont traitées avec de la pipéridine à 20% dans le DMF pendant 5 minutes (départ des groupes Fmoc protecteurs des fonctions aminés). Elles sont ensuite lavées au DMF, au méthanol, et traitées avec une solution aqueuse de chlorhydrate de tris-(carboxyéthyl)phosphine (TCEP) 100 mM dans un tampon phosphate de pH 7.0, pendant 30 minutes (départ des groupes StBu protecteurs des groupes thiols). Elles sont ensuite lavées au DMF, au méthanol et séchées sous azote.
EXEMPLE 7 : Ligation d'acides nucléiques fonctionnalisés par un groupe α-oxoaldéhyde à un support fonctionnalisé par des groupements hydrazides, pour l'obtention de puces à ADN ou à oligonucléotides conformes à la présente invention. La ligation d'acides nucléiques fonctionnalisés en position 5' par une fonction α-oxoaldéhyde sur une lame de vene fonctionnalisée par une fonction hydrazide est décrite ci-dessous. La fixation des acides nucléiques à la lame de verre se traduit par la formation de liaisons hydrazones (liens semicarbazones). L'efficacité de la ligation sur ces lames a été évaluée par hybridation d'oligonucléotides complémentaires marqués en 5' par une molécule de cyanine-3 (Cy-3). La même expérience de ligation a été réalisée avec succès en utilisant des oligonucléotides fonctionnalisés en position 3' par une fonction α-oxoaldéhyde, et des mélanges d'oligonucléotides fonctionnalisés en position 3' ou 5'. 1) Matériel et méthodes.
• Matériel de dépôt et de lecture. Le dépôt des oligonucléotides a été fait sur lames de vene en utilisant un robot Affymetrix® 417 Arrayer (Affymetrix Inc., 3380 Central Exwy, Santa Clara, CA 95051) équipé d'une tête de prélèvement à mécanismes « aiguille - et - anneau » (4 aiguilles). Les aiguilles ont un diamètre de 125 μm et font un dépôt de forme circulaire d'environ 150-170 μm de diamètre pour un volume d'environ 30- 50 pi (volume annoncé par le fournisseur). Les dépôts ont été espacés de 375 μm de centre à centre. La détection de la sonde d'hybridation fluorescente est obtenue en utilisant un scanner Affymetrix8' 418 Array Scanner équipé de 2 lasers-diodes permettant une lecture à des longueurs d'ondes d'excitation de 532 et 635 nm. La fluorescence émise par les fluorochromes après excitation est détectée par un tube photo-multiplicateur (PMT). Le résultat est obtenu sous forme d'un fichier image 16-bit avec une résolution de 10 μm/pixel. L'analyse informatique des fichiers images et la quantification de l'intensité de fluorescence a été faite en utilisant le freeware « ScanAlyze » développé par M. EISEN, de l'université de Stanford.
• Réactifs. On utilise les solutions commerciales suivantes : 20x SSC (NaCl
3M, Na Citrate 0,3M ; Quantum Bioprobe, Quantum Biotechnologies Inc.), NaBH4
(Sigma), PBS (Phosphate buffered saline ; Gibco Life Technology).
Les oligonucléotides porteurs d'une fonction α-oxoaldéhyde en position 5' sont tels qu'obtenus dans l'exemple 2 ci-avant. Les oligonucléotides utilisés dans le présent protocole de ligation répondent aux formules suivantes
(« α-oxo » indique la présence d'une fonction α-oxoaldéhyde) :
Pl-α-oxo = 5'-α-oxo-GTC CAA GCT CAG CTA ATT-3' ;
P2-α -oxo = 5'-α -oxo-GCA GGA CTC TAG AGG ATC-3' ;
PI -diol ≈ 5'-diol-GTC CAA GCT CAG CTA ATT-3' ; PI -tartrate = 5'-tartrate-GTC CAA GCT CAG CTA ATT-3'.
Les séquences des oligonucléotides complémentaires marqués au Cy3 sont les suivantes :
Complémentaire Pl-Cy3 = 5'-Cy3-AAT TAG CTG AGC TTG GAC-3'
Complémentaire P2-Cy3 = 5'-Cy3-GAT CCT CTA GAG TCC TGC-3'
Les oligonucléotides fonctionnalisés sont dilués dans de l'eau et gardés à -20°C jusqu'à utilisation. La quantité nécessaire pour les dépôts est prélevée de ce stock et lyophilisée avant d'être remise en suspension dans la solution de dépôt.
• Dépôt des oligonucléotides sur les lames de verre.
Les lames de vene utilisées sont fonctionnalisées par un groupement hydrazide et sont telles qu'obtenues dans l'exemple 5 ci-avant. Des quantités différentes d'oligonucléotides lyophilisés ont été remises en suspension dans 20 μl de solution afin d'obtenir des concentrations de 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM et 0,001 mM. Différentes solutions de resuspension ont été essayées afin d'obtenir le meilleur aspect de spot possible. Les dépôts ont été réalisés à 375 μm les uns des autres, à une température de 20°C et dans une atmosphère à 70 % (± 5 %) d'humidité relative. Après dépôt, les lames ont été incubées dans une enceinte saturée en humidité (proche de 100 d'humidité relative) à 37°C pendant 14 à 16 h. Les lames ont ensuite été lavées dans une solution à 0,1% SDS pendant 5 minutes à température ambiante afin d'éliminer les oligonucléotides n'ayant pas réagi avec la lame. Cette étape de lavage a été optimisée afin d'éliminer le maximum d'adsoφtion aspécifique entre l'oligonucléotide et le vene. Après lavage les lames sont séchées par centrifugation (5 minutes ; 30 xg ; 20°C) en position verticale.
• Préhybridation, hybridation et lavage.
Les hybridations se font dans des « CMT-Hybridization Chambers » (Corning). La zone de dépôt est préhybridée par 15 μl de tampon de préhybridisation (50% formamide, 4x SSC, 0,5% SDS ; 2,5x Denhardt) à 50°C pendant lh30. La solution de préhybridation est placée entre lame et lamelle. La lame est placée dans la chambre d'hybridation qui contient 2 réservoirs recevant environ 15 μl de tampon de préhybridation pour saturer en humidité l'atmosphère à l'intérieur de la chambre. La chambre est fermée hermétiquement et plongée dans un bain-marie à 50°C. Après préhybridation, la chambre est ouverte, la lamelle est retirée et le tampon de préhybridation est éliminé en inclinant la lame sur un papier absorbant. 15 μl de tampon d'hybridation (50% formamide ; 6x SSC ; 0.4% SDS ; 4x Denhardt ; 0,01 mM d'oligonucléotide complémentaire) sont préparés et incubés 5 min à 95 °C avant d'être placés sur la zone de dépôt. La lame est recouverte de la lamelle et placée dans la chambre d'hybridation pour être incubée à 50°C pendant 14 à 16 h. Ce processus doit être réalisé le plus rapidement possible afin d'éviter tout séchage après avoir retiré la lamelle.
Après hybridation, la lame est plongée dans 50 ml de 2x SSC en position verticale afin de décoller la lamelle. Après décollement, la lame est successivement lavée dans 50 ml de 0,1% SDS, 0,lx SSC pendant 5 min ; 50 ml de 0,lx SSC pendant 5 min ; 50 ml de 0,1 x SSC pendant 5 min. Ces lavages se font dans des tubes Falcon 50 ml, à température ambiante. L'agitation est assurée par retournement du tube lx toutes les minutes. Après le dernier lavage les lames sont rincées sous un jet d'eau stérile et séchées immédiatement par centrifugation (5 minutes ; 30 xg ; 20°C). • Lecture des lames au scanner.
Les lames sont scannées à 532 nm de longueur d'onde (Cy-3), immédiatement après lavage. La lecture se fait à différents réglages de la puissance du laser et de l'ouverture du tube PMT. Un réglage standard (35% de puissance laser,
50% d'ouverture du PMT) a été choisi et utilisé systématiquement pour toutes les lectures afin de pouvoir comparer visuellement les résultats entre eux. Lorsqu'une quantification de l'intensité de fluorescence est souhaitée le réglage L/PMT est modifié pour obtenir tous les signaux fluorescents en dessous du seuil de saturation.
• Synthèse de produits PCR, dépôts et hybridation.
Les oligonucléotides PI -tartrate et P2 ont été engagés dans une PCR sur le plasmide pFus II comprenant un fragment du gène S 1 de bordetella pertussis : pFus II + SI (la partie amplifiée correspond au fragment de gène inséré). La PCR a été faite en utilisant l'AmpliTaq Gold® de Perkin Elmer et dans les conditions recommandées par le fournisseur. Les cycles d'amplification sont les suivants : lx
(94°C, 10 min) ; 35x(94°C, 45 sec / 55°C, 45 sec / 72°C, 45 sec) ; lx (72°C, 10 min). Après PCR les produits obtenus ont été répartis dans 4 puits d'une plaque Multiscreen PCR (Millipore) et traités de la façon suivante. Le liquide réactionnel a été filtré au travers de la membrane par aspiration. L'ADN fixé sur la membrane a été lavé 3 fois par 100 μl de tampon 3x SSC pH 5,5. L'ADN a été resuspendu dans 50 μl de 6x SSC et la fonction tartrate a été oxydée par 50 μl de periodate de sodium (2 mM dans l'eau). Les différents puits ont subi différents temps d'oxydation : Oh (contrôle négatif non oxydé), 30min, lh et 3h. Après oxydation la réaction a été stoppée par 100 μl d'acide tartrique (dans du 3x SSC) pendant 10 min. Les produits ont été ensuite lavés 3 fois avec du 3x SSC avant d'être repris dans de l'eau, évaporés et remis en suspension dans la solution de dépôt (3x SSC). Les concentrations obtenues étaient de 0,3 à 0,4 μg/μl. Deux contrôles (oxydé et non oxydé) ont été ajoutés à l'expérience : ils correspondent à la même amplification PCR obtenue avec le couple d'oligonucléotide P1-P2.
Le dépôt et la ligation de ces produits PCR ont été réalisés dans les mêmes conditions qu'en 3) ci-dessus. L'hybridation a été réalisée comme indiqué en 4) ci-dessus en utilisant une sonde synthétisée par PCR unidirectionnelle sur le plasmide pFus II + SI et en utilisant l'oligonucléotide P2 pour initier la synthèse. Après hybridation les lames ont été lavées et analysées comme décrit en 4) et 5) ci-dessus.
2) Résultats.
• Aspect du dépôt et adsorption aspécifique. Différentes solutions de dépôt, à différentes concentrations et différents pH ont été testées. La qualité du résultat a été estimée en déposant directement l'oligonucléotide complémentaire PI à une concentration de 0,1 ou 0,01 mM. La forme, l'intensité et l'homogénéité du point ont été évalués visuellement et en quantifiant l'intensité de fluorescence. Les meilleurs résultats ont été obtenus en utilisant du 3x SSC pH 5,5. Des résultats acceptables ont été aussi obtenus en faisant les dépôts dans une solution de Tris Acétate ImM pH 5,5 + 450 mM NaCl. Ces deux solutions ont été utilisées pour déposer du Pl-α-oxo sur les lames hydrazides afin de quantifier le taux d'hybridation. Le lavage des oligonucléotides non fixés à la lame a été optimisé afin d'obtenir une adsoφtion aspécifique minimale. Le meilleur protocole de lavage permet d'éliminer 90% des oligonucléotides non fixés.
• Hybridation sur lames fonctionnalisées par un groupement hydrazide.
Le dépôt de Pl-α-oxo sur lame hydrazide, ainsi que les hybridations avec le complémentaire PI, ont été réalisés comme détaillé ci-dessus. Les résultats de l'hybridation sont présentés dans les tableaux 1 et 2. Les dépôts ont été faits en 3x SSC pH 5,5 (tableau 1) et en tris-acétate pH 5,5 + 450 mM NaCl (tableau 2). Les valeurs des intensités de fluorescence présentées dans les tableaux 1 et 2 ont été mesurées en utilisant le programme ScanAlyze. Les réglages de laser et PMT ont d'abord été modifiés pour obtenir une image ne présentant aucune saturation (30% laser et 35% PMT). Les valeurs moyennes de 6 repliquats pour chaque dépôt et un écart type de ces valeurs sont reportés dans les tableaux 1 et 2. Tableau 1 : Intensité de fluorescence d'oligonucléotides déposés, dans un milieu tampon 3x SSC pH 5,5, sur une lame hydrazide et hybrides avec des séquences complémentaires marquées au Cy3.
Tableau 2 : Intensité de fluorescence d'oligonucléotides déposés, dans un milieu tampon tris-acétate pH 5,5 + 450 mM NaCl, sur une lame hydrazide et hybrides avec des séquences complémentaires marquées au Cy3.
Une hybridation importante est détectable au niveau des dépôts (tableaux 1 et 2) alors qu'une lame non hybridée possède une fluorescence très faible (intensité de fluorescence : 50-70). L'intensité de fluorescence la plus forte est obtenue pour un dépôt à 0,1 mM en oligonucléotide Pl-α-oxo et dans le tampon 3 x SSC pH5,5. L'intensité de fluorescence décroît avec la concentration en oligonucléotide déposé. A 0,001 mM, le signal devient a peine détectable.
Un contrôle d'adsoφtion aspécifique est obtenu en déposant un oligonucléotide de même séquence nucléotidique que Pl-α-oxo mais dont la fonctionnalisation n'est pas complète (arrêt à l'étape diol) et qui n'a donc pas la possibilité de réagir avec les fonctions semicarbazides du support. Cet oligonucléotide est déposé à une concentration de 0,1 mM et présente une intensité de fluorescence beaucoup plus faible que l'équivalent Pl-α-oxo Les valeurs résumées dans le tableau 1 permettent d'estimer l'intensité de fixation aspécifique comme représentant seulement environ 4 % du signal (10871 de 0,1 mM Pl-α-oxo par rapport à 441 pour 0,l mM Pl-dιol). D'une manière générale les dépôts en tampon tπs-acétate (tableau 2) présentent les mêmes caracténstiques qu'en 3x SSC (tableau 1), mais avec des intensités de fluorescence moindres Les protocoles de dépôts (en 3x SSC) et d'hybridation détaillés ci-dessus ont été répétés plusieurs fois dans les même conditions et des résultats identiques ont été obtenus. La même gamme de concentration a été préparée et déposée en utilisant un oligonucléotide de séquence différente P2-α-oxo. Le dépôt et la fixation sur lame hydrazide ont été faits dans les mêmes conditions que pour Pl-α-oxo L'hybndation a été faite en utilisant un oligonucléotide marqué par un Cy3 en 5' et complémentaire à P2. Après hybndation, les mesures de fluorescence sont très comparables à celles obtenues avec Pl-α-oxo, prouvant que les résultats obtenus avec Pl-α-oxo sont vénfiés avec des paires d'oligonucléotides de séquences différentes.
• Réutilisation des lames (dés hybridation - réhvbridation) .
Des essais de déshybndation puis réhybridation ont été menés sur un dépôt de 0,1 mM en Pl-α-oxo sur lame hydrazide Après la première hybndation (avec 0,01 mM en complémentaire PI) et la lecture des résultats, les lames ont été plongées dans de l'eau à 95 °C pendant 5 minutes Les lames ont ensuite été séchées et le signal fluorescent encore présent au niveau des dépôts a été évalué par une nouvelle lecture au scanner Apres trois cycles d'hybndations/deshybndations successives, les résultats obtenus montrent que l'ADN déposé a été déshybnde presque complètement puis réhybridé pour atteindre un niveau de fluorescence comparable à l'hybndation initiale Ces essais montrent que les oligonucléotides fixés aux lames hydrazides résistent aux conditions de déshybndation et restent accessibles pour subir des hybndations successives
• Résultats d'hvbndation sur produits PCR Dans cet essai, on engage les oligonucléotides PI -tartrate dans une réaction de PCR. On les soumet ensuite à une réaction de peroxydation (temps de réaction 30 minutes, 1 h ou 3 h) et on dépose les oligonucléotides ainsi oxydés sur la lame hydrazide. On observe une augmentation du signal fluorescent en fonction du temps d'oxydation, montrant que la fonction tartrate est bien transformée en fonction α-oxoaldéhyde et qu'il y a donc de plus en plus de produits PCR disponibles pour la ligation. 3) Conclusion.
Les résultats présentés dans cet exemple montrent qu'on peut fixer des oligonucléotides fonctionnalisés en 5' par une fonction α-oxoaldéhyde sur une lame hydrazide et que les oligonucléotides, une fois fixés, restent accessibles pour des hybridations avec des oligonucléotides complémentaires. Il est également possible de déshybrider, par chauffage à 95°C, les oligonucléotides fixés à la lame et de réutiliser cette lame dans une nouvelle hybridation. Quant à l'oligonucléotide portant, à son extrémité 5', un groupement tartrate, il peut être engagé dans une réaction de PCR puis oxydé avant d'être déposé sur la lame hydrazide. Une fois fixé sur la lame, le produit de la PCR peut être hybride avec une séquence nucléotidique complémentaire. EXEMPLE 8 : Dépôt d'oligonucléotides modifiés en position 5' par une fonction α-oxoaldéhyde sur des lames de verre fonctionnalisées par des groupements hydrazine, hydroxylamnine ou β-aminothiol. a) Cas des lames de vene fonctionnalisées par des groupements hydrazine ou hydroxylamine.
Les oligonucléotides modifiés en position 5' par une fonction α-oxoaldéhyde, tels qu'obtenus dans les exemples précédents, sont repris en solution dans un tampon phosphate de pH 6.0, puis déposés manuellement ou à l'aide d'un robot sur les lames de vene obtenues dans l'exemple 6. Le dépôt s'accompagne de l'immobilisation des oligonucléotides sur la surface par la formation de liaisons hydrazones (dans le cas où la surface porte une fonction hydrazine) ou oximes (dans le cas où la surface porte une fonction hydroxylamine).
Les lames sont incubées dans une chambre humide pendant une nuit à 37°C. Elles ont lavées à l'eau, puis subissent un traitement de « stripping » par du phosphate de disodium (Na2HPO4 ; 2,5 mM) et 0,1% en volume de SDS (sel de sodium de l'ester du sulfate de dodécyle) à 95°C et pendant 30 secondes. Après des lavages à l'eau, les lames sont séchées sous flux d'azote et stockées sous atmosphère inerte. b) Cas des lames de vene fonctionnalisées par des groupements β-aminothiol.
Les oligonucléotides modifiés en position 5' par une fonction α-oxoaldéhyde, tels qu'obtenus dans les exemples précédents, sont repris en solution dans un tampon phosphate de pH 6.0 contenant 1 mM de TCEP (chlorhydrate de tris- (carboxyéthyl)phosphine), puis déposés manuellement ou à l'aide d'un robot sur les lames de verre obtenues dans l'exemple 6. L'immobilisation des oligonucléotides sur la lame de vene s'accompagne de la formation de liaisons thiazolidines. Les lames sont incubées et traitées comme décrit en a).
Les protocoles décrits en a) et b) ci-dessus pounaient également mettre en œuvre des oligonucléotides modifiés en position 3' par une fonction α-oxoaldéhyde, ou des acides nucléiques de plus grande taille, tels que des ADN. EXEMPLE 9 : Ligation entre un peptide possédant une fonction hydrazine en position N-terminale et un oligonucléotide possédant une fonction α-oxoaldéhyde en position 5'.
Cet exemple illustre la ligation d'un oligonucléotide conforme à l'invention à un support non solide de nature peptidique. 1 ) Synthèse du peptide de formule H2N-GRYL-NH?.
La synthèse peptidique a été réalisée suivant la stratégie Fmoc/t-Bu sur un synthétiseur Applied Biosystems 431 A, sur 0.25 mmole de résine MB HA Rink
Amide® chargée à 0.74 mmol/g. Les acides aminés sont activés en utilisant un mélange HBTU/HOBt/DIEA (acide aminé/HBTU/HOBt/DIEA : 4 eq/4 eq/4 eq/8 eq) dans le NMP. Les chaînes latérales sont protégées comme suit : Arg(Pbf), Tyr(t-Bu).
A la fin de la synthèse, la résine est divisée en 2 lots. Sur une moitié (0.125 mmol), on déprotège manuellement le Fmoc par un mélange pipéridine/NMP 20/80 et on couple la triBocGlycineHydrazine en utilisant aussi HBTU, HOBt et DIEA (4 eq/4 eq/4 eq/8 eq). Après contrôle du couplage par un test de Kaiser, la résine est séchée et clivée pendant lh30 avec 2.75 ml d'un mélange phénol/EDT/thioanisole/H2O/TFA (0.3 g/0.1 ml/0.2 ml/0.2 ml/qsp 4 ml). Le peptide est précipité dans 200 ml d'un mélange Et2O/pentane 50/50. Après lyophilisation, on obtient 42.5 mg de peptide brut (soit un rendement de couplage de 45.4%).
Après purification par RP-HPLC sur une colonne Cl 8 nucléosil (t°=60°C, λ=225 nm, tampon A=H2O/TFA 0.05%, tampon B=n-propanol 40%/H2O
60%/TFA 0.05%, gradient de 0 à 20% de B en 30 minutes, débit de 4 ml/min), congélation et lyophilisation, on obtient 16.4 mg de produit pur (soit un rendement final de 17.5%). Analyse par MALDI-TOF : [M+HJ+ calculé 522, observée 522.3.
2) Synthèse de l'oligonucléotide de formule HCO-CO-HN-CnH - ATCGATCG.
Cet oligonucléotide a été obtenu dans les conditions classiques d'oxydation périodique (tampon phosphate 100 mM pH=6.56, 35 minutes de réaction avec NaIO ImM, puis anêt de la réaction avec 2 équivalents d'acide tartrique par rapport à NaIO4), purifié dans les conditions habituelles, isolé, congelé et lyophilisé en ajoutant du mannitol (6.67 μg de mannitol/μg d'oligonucléotide) et de la tri-n-butyl- phosphine (0.005% en volume). La masse de cet oligonucléotide a été contrôlée par spectrométrie de masse par électronébulisation dans les conditions habituelles.
3) Réaction de ligation entre l'oligonucléotide et le peptide.
On engage la réaction de ligation entre 6.3 μg d'oligonucléotide dissous dans 6 μl de tampon citrate 50 mM pH=5.33 et 3.5 μg (2 eq) d'hydrazinopeptide dissous dans 4 μl d'eau. L'eppendorf contenant le milieu réactionnel, entouré de parafilm afin de limiter l'évaporation, est placé dans un bain à
37°C. L'eppendorf est retiré du bain thermostaté et 10 μl de tampon citrate sont ajoutés lh plus tard. Le milieu réactionnel est laissé à température ambiante et congelé à -30°C après 27h. Après décongélation, 5 μl du milieu réactionnel sont prélevés et on y ajoute 55 μl d'eau. On réalise une RP-HPLC analytique sur une colonne C18 hypersil 250 x 4.6 mm (t°=30°C, λ=260 nm, tampon A=TEAA 100 mM pH=6.5/CH3CN 99/1, tampon B=CH3CN/H2O 95/5, gradient de 1 à 40% de B en 28 minutes, volume injecté=30 μl, débit=l ml/min). Un produit nouveau est effectivement apparu. Le milieu réactionnel est de nouveau congelé en attendant de le purifier.
Après décongélation, on dilue le milieu réactionnel avec 300 μl d'eau et on injecte 270 μl sur une colonne Cl 8 hypersil 250 x 4.6 mm (t°=30°C, λ=260 nm, tampon A=TEAA 100 mM pH=6.5/CH3CN 99/1, tampon B=CH3CN/H2O mQ 95/5, gradient de 1 à 40% de B en 28 minutes, volume injecté=30 μl, débit=l ml/min). On recueille le produit majoritaire. Le produit est congelé et lyophilisé. Il est repris dans 250 μl d'eau et dosé : 0.022 OD/250 μl soit 0.726 μg d'oligonucléotide. Ce produit est analysé par MALDI-TOF. [M+H]+ calculé 3233.6, observée 3233.5. Il présente la formule suivante :
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
En particulier, il est entendu que dans les formules (I) et (II) des produits et des supports selon la présente invention, ainsi que dans le procédé de fixation d'un acide nucléique M sur un support SP selon la présente invention, le support SP peut consister en un polymère arborescent de type polyacrylamide ; dans ce cas de figure, il sera intéressant de fixer, par liaison covalente, des oligonucléotides sur ce polymère arborescent, en utilisant le procédé selon la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Produit de formule (I) :
SP [ A, ( Y, - Z - CO - M ) „ ] m (I)
dans laquelle :
Z représente un groupement de formule
ou un groupement -X-N=CH-, X représentant un groupement -CH2-O-, -CH2-NH- ou -NH-, i est égal à 0 ou à 1 , n est compris entre 1 et 16, n étant égal à 1 lorsque i est égal à O, m est supérieur ou égal à 1 , SP représente un support, . A représente un bras espaceur,
Y représente une fonction assurant la liaison entre A et Z, et
M représente un acide nucléique lié au groupement -CO- adjacent par son extrémité 5' ou 3'. 2°) Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que n est égal à 1 et en ce que A représente une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée comprenant de 2 à 100 atomes de carbone, de préférence de 5 à 50 atomes de carbone, et comprenant éventuellement de 1 à 35 atomes d'oxygène ou d'azote et de 1 à 5 atomes de silicium, de soufre ou de phosphore. 3°) Produit selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que SP représente un support solide.
4°) Produit selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit support est sélectionné dans le groupe constitué par le vene, le silicium et les polymères synthétiques. 5°) Produit selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que ledit support est un support non solide. 6°) Produit selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit support est un vecteur de transfection.
7°) Produit selon l'un quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que SP est un support solide, i est égal à 1, n est égal à 1 et M est un ADN, ledit produit constituant une puce à ADN.
8°) Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 7, caractérisé en ce que SP représente un support en vene, i est égal à 1, n est égal à 1, A représente un bras espaceur de formule -Si-(CH2) - et Y représente une fonction amide -NH-CO-. 9°) Utilisation du produit selon l'une quelconque des revendications
1 à 4, 7 ou 8 comme puce à acides nucléiques.
10°) Procédé de préparation du produit de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend la réaction de n x m molécules de formule M-CO-CHO avec un produit de formule SP [ A, ( Yj - B - NH2 ) π ] m , SP, A, Y, i, n, m et M étant tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 8 et B représentant un groupement -CH2-O-, -CH2-NH, -NH- ou -CH(CH2SH)-.
11°) Procédé de fixation, par liaison covalente, d'au moins un acide nucléique M sur un support SP, pour l'obtention d'un produit de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : i) introduction d'une fonction α-oxoaldéhyde en une extrémité dudit acide nucléique, et ii) réaction de l'acide nucléique fonctionnalisé obtenu à l'étape i) avec un support modifié par une fonction sélectionnée dans le groupe constitué par les fonctions hydrazine, dérivées d'hydrazine, hydroxylamine et β-aminothiol.
12°) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'introduction d'une fonction α-oxoaldéhyde en une extrémité dudit acide nucléique est effectuée par les étapes suivantes : a) introduction d'un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine et leurs dérivés à l'une des extrémités d'un oligonucléotide, b) hybridation de l'oligonucléotide obtenu à l'étape a) avec ledit acide nucléique, c) élongation dudit oligonucléotide, d) réitération des étapes b) et c) au moins une fois, e) oxydation périodique de l'acide nucléique obtenu à l'étape d), modifié à l'une de ses extrémités par un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine et leurs dérivés, et f) isolement d'un acide nucléique modifié à l'une de ses extrémités par une fonction α-oxoaldéhyde.
13°) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'introduction d'une fonction α-oxoaldéhyde en une extrémité dudit acide nucléique est effectuée par les étapes suivantes : a) introduction d'un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine et leurs dérivés à l'une des extrémités d'un oligonucléotide, b) oxydation périodique de l'oligonucléotide obtenu à l'étape a), c) hybridation de l'oligonucléotide obtenu à l'étape b), portant une fonction α-oxoaldéhyde à l'une de ses extrémités, avec ledit acide nucléique, d) élongation dudit oligonucléotide, e) réitération des étapes c) et d) au moins une fois, et f) isolement d'un acide nucléique modifié à l'une de ses extrémités par une fonction α-oxoaldéhyde.
14°) Procédé selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisé en ce que l'introduction d'un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine et leurs dérivés à l'une des extrémités d'un oligonucléotide est effectuée via une liaison amide.
15°) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine et leurs dérivés est lié à l'oligonucléotide via un bras espaceur lié, par l'une de ses extrémités, audit oligonucléotide et portant, à l'autre de ses extrémités, une fonction aminé.
16°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que ledit acide nucléique est un ADN. 17°) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit oligonucléotide défini dans la revendication 12 ou dans la revendication 13 est une amorce oligodésoxynucléotidique.
18°) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite amorce est une amorce spécifique. 19°) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite amorce est une amorce universelle. 20°) Oligonucléotide modifié en position 5' par un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine, leurs dérivés et le groupement α-oxoaldéhyde.
21°) Procédé de préparation d'un oligonucléotide selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape a) selon la revendication 13 suivie, dans le cas où ledit oligonucléotide est modifié par un groupement α-oxoaldéhyde, de l'étape b) selon la revendication 13.
22°) ADN modifié en position 5' par un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine, leurs dérivés et le groupement α-oxoaldéhyde.
23°) Procédé de préparation d'un ADN selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes a) à d) selon la revendication 12 ou, dans le cas où ledit ADN est modifié par un groupement α-oxoaldéhyde, les étapes a) à f) selon la revendication 12 ou la revendication 13. 24°) Support fonctionnalisé de formule (II) :
SP [ A, ( Y, - B - NH2 ) n ] m (II)
dans laquelle SP, A, Y, i, n et m sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 8 et dans laquelle B est tel que défini dans la revendication 10.
25°) Procédé de préparation d'un support fonctionnalisé de formule (II) selon la revendication 24, dans lequel i est égal à 1 , n est égal à 1 et SP représente un support en vene, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - silanisation du support en vene, greffage, sur ledit support en vene silanisé, d'une fonction sélectionnée dans le groupe constitué par les fonctions hydrazine, dérivées d'hydrazine, hydroxylamine et β-aminothiol.
26°) Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que ladite silanisation du support est effectuée à l'aide d'aminopropyl-triméthoxysilane.
27°) Procédé selon la revendication 25 ou la revendication 26, caractérisé en ce que ledit greffage d'une fonction hydrazine est effectué à l'aide d'acide hydrazinoacétique, ledit greffage d'une fonction dérivée d'hydrazine est effectué à l'aide de triphosgène et d'hydrazine, ledit greffage d'une fonction hydroxylamine est effectué à l'aide d'acide aminooxyacétique et ledit greffage d'une fonction β-aminothiol est effectué à l'aide d'acide α-amino-β-mercaptopropionique. 28°) Procédé de contrôle de la qualité du support de formule (II) selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en contact du support avec une sonde fluorescente dérivatisée par une fonction α-oxoaldéhyde, - lavage du support obtenu à l'issue de l'étape précédente, et
- analyse de la fluorescence de ce support.
29°) Procédé de quantification de la fonctionnalité du support de formule (II) selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en contact du support avec une sonde fluorescente dérivatisée par une fonction α-oxoaldéhyde,
- lavage du support obtenu à l'issue de l'étape précédente,
- hydrolyse du lien entre le support et la sonde fluorescente, et
- mesure de la quantité de fluorescence libérée en solution à l'issue de cette hydrolyse.
30°) Kit de préparation d'une puce à ADN selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : au moins un support fonctionnalisé selon la revendication 24, une pluralité d'amorces oligodésoxynucléotidiques qui sont modifiées soit en position 3', soit en position 5', soit en position 3' pour une partie desdites amorces et en position 5' pour l'autre partie desdites amorces, par un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine, leurs dérivés et le groupement α-oxoaldéhyde, des réactifs et tampons aptes à la mise en œuvre de réactions d'élongation et/ou d'amplification dudit ADN, et dans le cas où lesdites amorces oligodésoxynucléotidiques sont modifiées par un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide tartrique, la serine, la thréonine et leurs dérivés, des réactifs aptes à la mise en œuvre d'une réaction d'oxydation périodique. 31°) Utilisation de la puce à ADN selon la revendication 7 en chimie combinatoire, notamment pour le criblage de molécules à haut débit.
32°) Utilisation de la puce à ADN selon la revendication 7 en tant qu'outil de diagnostic.
33°) Utilisation de la puce à ADN selon la revendication 7 pour le tri de molécules.
34°) Procédé de tri de molécules, caractérisé en ce qu'il met en œuvre la puce à ADN selon la revendication 7.
35°) Molécules triées, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues par le procédé selon la revendication 34.
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