CN117377759A - 自纯化的核酸编码的文库 - Google Patents

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迪米塔尔·佩特罗夫
昂达雄一
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Di MitaerPeiteluofu
Michelle Josiana Keller
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Di MitaerPeiteluofu
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Abstract

本发明涉及用于产生核酸编码的化合物和核酸编码的化合物的文库的方法。包含通过接头连接至固体载体的支架的新生化合物共价连接至一个或多个化学结构单元以形成连接至所述支架的化学部分。将编码所述一个或多个化学结构单元的编码寡核苷酸共价连接至所述新生化合物以形成连接至所述支架的编码核酸部分。将切割基团连接至所述化合物的所述化学部分、核酸部分或支架。然后使所述接头与所述切割基团反应，使得所述接头被切割并且所述化合物从所述固体载体释放。提供了核酸编码的化合物和文库以及它们的产生方法。

Description

自纯化的核酸编码的文库
技术领域
本发明涉及核酸编码的化学文库，特别是自纯化的核酸编码的化学文库，以及其生产和应用方法。
背景技术
DNA编码的化学文库(DEL)是药物发现的强大工具。为生产DNA编码的化学文库而提出的第一种方法采用在分离和汇集循环中在共同接头(例如珠粒)上聚合物(例如肽)和寡核苷酸序列(充当编码序列)的交替逐步合成(Brenner，S.和Lerner，R.A.PNAS USA 89(1992)，5381–5383；US 5,573,905；WO93/20242)。在靶蛋白上进行亲和捕获后，所选文库成员的标识符寡核苷酸群体将通过PCR进行扩增。化学实体的结构将通过对PCR产物进行测序来解码。据推测，编码程序可通过多种方法实施，包括化学合成、DNA聚合或DNA片段的连接(Brenner，S.和Lerner，R.A.PNAS USA 89(1992)，5381–5383；US 5,573,905；WO93/20242)。产生DNA编码的化学文库的各种方法随后在本领域中进行了描述(参见例如，Mannocci，L.等人PNAS USA 105(46):17670-17675；Brenner，S.和Lerner，R.A.同上；Nielsen，J.等人，J.Am.Chem.Soc.115(1993)；Needels等人，M.C.，PNAS USA 90(1993)，10700–10704；Gartner，Z.J.等人，Science 305(2004)，1601–1605；Melkko，S.等人，Nat.Biotechnol.22568–574(2004)；Sprinz，K.I.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.15(2005)，第3908–3911页；Leimbacher等人Chemistry.2012年6月18日；18(25):7729-37；Clark等人Nat ChemBiol.2009年9月；5(9):647-54；WO2009/077173；WO2003/076943；EP3284851；EP3184674)。
DEL技术的成熟使用使得筛选大量化合物(通常约100万至1亿)，所述化合物由特定核酸标签单独编码，并且针对目标蛋白质对整个DEL的基于亲和力的筛选可在单个实验中进行。DEL技术现在广泛用于制药行业。
迄今为止，DEL构建中的单独合成步骤的可变产量限制了连续合成步骤的数量和可并入的结构单元(building block)的性质。允许构建尺寸和/或纯度增加的DEL的方法将是有用的。
发明内容
本发明人开发了一种产生核酸编码的文库的方法，所述方法通过从固体载体选择性切割来从中间体中自纯化完整(intact或complete)文库成员。这例如可促进大型和/或纯核酸编码的文库和/或其中单独成员具有复杂结构和/或大量结构单元的核酸编码的文库的产生。通过这些方法产生的文库可例如展示改进的筛选性能和/或含有能够结合至靶蛋白上的较大表面的成员。
本发明的第一方面提供了一种用于产生核酸编码生物化合物的方法，所述方法包括以下步骤；
提供包含通过接头连接至固体载体的支架的新生化合物，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生化合物以形成连接至所述支架的化学部分，
将编码所述一个或多个化学结构单元的编码寡核苷酸共价连接至所述新生化合物以形成连接至所述支架的编码核酸部分，
将切割基团连接至所述化合物的所述化学部分、核酸部分或支架，以及
使所述接头与所述切割基团反应，使得所述接头被切割并且所述化合物从所述固体载体释放。
本发明的第二方面提供了一种用于产生核酸编码的化学文库的方法，对于每个文库成员，所述方法包括以下步骤；
提供包含通过接头连接至固体载体的支架的新生成员，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生成员以形成连接至所述支架的化学部分，
将编码所述一个或多个化学结构单元的编码寡核苷酸共价连接至所述新生成员以形成连接至所述支架的编码核酸部分，
将切割基团连接至所述化学部分、核酸部分或支架，
使所述接头与所述切割基团反应，使得所述接头被切割并且所述成员从所述固体载体释放。
在第一和第二方面的一些实施方案中，切割基团可连接至化学部分(图1A)。从固体载体选择性释放可通过完整化学部分或化学部分的完整区段的存在引发。
在第一和第二方面的其他实施方案中，切割基团可连接至编码核酸部分(图1B)。从固体载体选择性释放可通过完整核酸部分或核酸部分的完整区段的存在引发。
在第一和第二方面的其他实施方案中，切割基团可连接至支架(图1C)。从固体载体选择性释放可通过完整支架的存在引发。
在第一和第二方面的一些实施方案中，新生化合物或成员的支架可通过第二接头另外连接至固体载体，使得支架通过第一接头和第二接头连接至所述固体载体。所述方法可包括；
提供包含通过第一接头和第二接头连接至固体载体的支架的新生化合物或成员，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生化合物或成员以形成连接至所述支架的化学部分，
将编码所述一个或多个化学结构单元的编码寡核苷酸共价连接至所述新生化合物或成员以形成连接至所述支架的编码核酸部分，
将第一切割基团连接至所述编码核酸部分、化学部分或支架中的一者，
将第二切割基团连接至所述编码核酸部分、化学部分或支架中的另一者，
使所述第一接头与所述第一切割基团反应，使得所述第一接头被切割，以及
使所述第二接头与所述第二切割基团反应，使得所述第二接头被切割并且所述化合物或成员从所述固体载体释放。
第一和第二接头可以任何顺序依次切割或同时切割。
如果化合物或成员包含(i)完整化学部分或所述化学部分的完整区段和完整核酸部分或所述核酸部分的完整区段两者；(ii)完整化学部分或所述化学部分的完整区段和完整支架两者；或(iii)完整编码核酸部分或所述编码核酸部分的完整区段和完整支架两者，则所述化合物或成员从固体载体释放。
在一些实施方案中，切割基团或第一切割基团可共价连接至化学部分或支架。优选地，切割基团共价连接至化学部分的末端化学结构单元。
在其他实施方案中，切割基团可非共价连接至化学部分或支架。例如，通过将锚寡核苷酸连接至化学部分或支架，优选连接至化学部分的末端化学结构单元，并将所述锚定寡核苷酸与连接至切割基团的辅助寡核苷酸杂交。例如，产生核酸编码的化合物或化学文库的方法可包括以下步骤；
将锚寡核苷酸连接至化学部分或支架，
提供连接至切割基团的辅助寡核苷酸，
使连接寡核苷酸与所述辅助寡核苷酸杂交，以及
使接头与所述切割基团反应，使得所述接头被切割。
在一些实施方案中，切割基团可共价连接至核酸部分。优选地，切割基团共价连接至核酸部分的末端。
在其他实施方案中，切割基团可非共价连接至核酸部分，例如，通过将所述编码核酸部分与连接至切割基团的辅助寡核苷酸杂交。优选地，辅助寡核苷酸与编码核酸部分的末端杂交。例如，产生核酸编码的化合物或化学文库的方法可包括以下步骤；
提供共价连接至切割基团的辅助寡核苷酸，
将所述辅助寡核苷酸与编码核酸部分杂交，以及
使接头与所述切割基团反应，使得所述接头被切割。
在连接至化学部分、支架或编码核酸部分之后并且在与切割基团反应之前，接头可被转化或激活。
在一些实施方案中，切割基团在连接至化学部分、支架或编码核酸部分之后并且在与接头反应之前可能不需要进一步转化。在其他实施方案中，切割基团在连接至化学部分、支架或编码核酸部分之后并且在与接头反应之前可被激活。
在一些优选的实施方案中，加帽步骤可在每次化学结构单元添加之后进行，并且任选地在每次编码寡核苷酸添加之后进行。这防止切割基团连接至不完整的核酸或肽核酸编码的化合物。
在本文所述的方面中，除了切割接头和释放化合物或成员之外，切割基团还可形成将化学部分的末端连接至支架以产生大环的共价键。例如，接头和切割基团的反应可产生环化元件或切割部分，所述环化元件或切割部分将化学结构单元的链共价连接至支架，使得由成员展示的化学实体为大环。
本发明的第三方面提供了一种用于产生核酸编码的化合物的方法，所述方法包括以下步骤；
提供包含通过第一接头连接至固体载体的支架的新生化合物，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生化合物以形成连接至所述支架的化学部分，
将编码所述一个或多个化学结构单元的编码寡核苷酸共价连接至所述新生化合物以形成连接至所述支架的编码核酸部分，
用第二接头将所述化合物的化学部分连接至固体载体，
切割所述第一接头，
切割所述第二接头，使得所述化合物从所述固体载体释放。
根据第三方面的第一接头和第二接头可以是正交可切割的。
在第三方面的方法中，具有完整化学部分的化合物通过第二接头共价连接至固体载体。具有不完整化学部分的化合物不通过第二接头共价连接至固体载体。具有不完整化学部分的化合物因此通过第一接头的切割从固体载体选择性地释放。具有完整化学部分的化合物通过第二接头保持与固体载体连接。第二接头的切割从固体载体选择性地释放这些化合物。
优选地，在添加每个化学结构单元之后进行加帽步骤。具有不完整化学部分的化合物可保持加帽，以防止连接至第二接头。
在本文所述的所有第一至第三方面中，可将化学结构单元顺序地添加至新生成员或化合物中以形成直链化学部分(即化学结构单元的链)，其末端连接至新生成员和游离末端。可将编码每个化学结构单元的编码寡核苷酸顺序地添加至新生成员以形成直链编码核酸部分。本发明的方法可包括将化学结构单元共价连接至新生化合物或成员，以及将编码所述化学结构单元的编码寡核苷酸共价连接至所述新生成员。这可重复一次或多次以产生化学部分和编码核酸部分。在连接化学结构单元之后，可在添加下一个化学结构单元之前对任何缺少连接的化学结构单元的未反应物质进行加帽。
第四方面提供一种通过第一至第三方面的方法产生的核酸编码的文库。
下文更详细地描述本发明的这些方面和其他方面以及实施方案。
附图说明
图1示出可能的固体载体化合物的示意图。(A)、(B)和(C)中的固体载体化合物各自包含通过接头连接至支架的固体载体。在(A)、(B)和(C)中的每一者中，化学部分以及核酸部分均连接至支架。在(A)中，切割基团连接至化学部分。在(B)中，切割基团连接至核酸部分，在(C)中，切割基团连接至支架。缩略词：切割基团(CG)。
图2示出核酸或肽核酸编码的化合物或化学文库成员的自纯化的示意图。在所示的实施方案中，切割基团连接至化学部分。切割基团与化学部分的反应使自纯化化合物从固体载体释放。在所示的这一实施方案中，切割基团与接头的反应产生将化学部分连接至支架的产物(CG/接头产物；或切割部分)。切割的接头的一部分可保持与固体载体化合物连接。缩略词：切割基团(CG)。
图3示出核酸或肽核酸编码的化合物或化学文库成员的自纯化的示意图。在所示的实施方案中，切割基团连接至化学部分。切割基团与化学部分的反应使自纯化化合物从固体载体释放。在所示的这一实施方案中，切割基团与接头的反应产生连接至化学部分的切割基团产物(CG产物)。切割的接头的一部分可保持与固体载体化合物连接。缩略词：切割基团(CG)。
图4示出核酸或肽核酸编码的化合物或化学文库成员的自纯化的示意图，其中使用用于单独化学部分和编码核酸部分纯化的两个正交接头。使用两个正交切割基团，其中切割基团1(CG1)连接至化学部分，并且切割基团2(CG2)连接至核酸部分。在所示的实施方案中，切割基团1(CG1)与接头1反应以切割接头1并产生将化学部分连接至支架的产物(CG1/接头1产物)。在所示的实施方案中，切割基团2(CG2)与接头2反应以切割接头2并产生连接至核酸部分的切割基团产物(CG2产物)。在两个接头均切割后，自纯化化合物从固体载体释放。切割的接头中的每一者的部分可保持与固体载体化合物连接。缩略词：切割基团(CG)、切割基团1(CG1)、切割基团2(CG2)。
图5示出固体载体化合物中化学结构单元的两种可能排列的示意图。在(A)中，示出化学结构单元的直链排列。在(A)中，结构单元1(化学结构单元1)连接至支架。在(A)中，结构单元2(化学结构单元2)连接至结构单元1(化学结构单元1)。在(A)中，结构单元被排列为形成直链结构单元链，以末端结构单元(化学结构单元n)结束，其然后连接至所示实施方案中的切割基团(CG)。在(B)中，示出化学部分的交联结构，它是通过首先连接三个结构单元以形成直链链、然后将结构单元4(化学结构单元4)连接至结构单元3(化学结构单元3)和结构单元1(化学结构单元1)两者而形成的。在(B)在所示的实施方案中，其他结构单元可连接至结构单元3(化学结构单元3)，以末端结构单元(化学结构单元n)结束，其进而连接至切割基团(CG)。缩略词：切割基团(CG)、结构单元(化学结构单元)、结构单元1(化学结构单元1)、结构单元2(化学结构单元2)、结构单元3(化学结构单元3)、结构单元4(化学结构单元4)、末端结构单元(化学结构单元n)。
图6示出自纯化化合物的两种可能结构的示意图。自纯化化合物各自包含连接至核酸部分以及化学部分的支架。在实施方案(A)中，示出具有直链结构的自纯化化合物。在(A)中，结构单元以直链方式排列，并且自纯化反应产生连接至末端结构单元(化学结构单元n)的切割基团产物(CG产物)。在(A)中，支架、结构单元和切割基团产物(CG产物)以直链方式排列。在实施方案(B)中，示出具有环状结构的自纯化化合物。在(A)中，结构单元以直链方式排列，并且自纯化反应产生将末端结构单元(化学结构单元n)连接至支架的产物(CG/接头产物)。在(B)中，支架、结构单元和切割基团/接头产物(CG/接头产物)以环状方式排列。
图7示出自纯化化合物的两种可能结构的示意图。自纯化化合物各自包含连接至核酸部分以及化学部分的支架。在实施方案(A)中，示出具有支链结构的自纯化化合物。在(A)中，结构单元1(化学结构单元1)、结构单元2(化学结构单元2)、结构单元4(化学结构单元4)和末端结构单元(化学结构单元n)呈直链结构排列。在(A)中，结构单元3(化学结构单元3)作为附属物连接至结构单元2(化学结构单元2)。在(A)中，结构单元以支链方式排列，并且自纯化反应产生连接至末端结构单元(化学结构单元n)的切割基团产物(CG产物)。在(A)中，支架、结构单元和切割基团产物(CG产物)以支链方式排列。在实施方案(B)中，示出具有双环结构的自纯化化合物。在(B)中，结构单元1至末端结构单元以直链方式排列，并且另外，结构单元2(化学结构单元2)和结构单元4(化学结构单元4)交联。在(B)中，自纯化反应产生将末端结构单元(化学结构单元n)连接至支架的产物(CG/接头产物)。在(B)中，支架、结构单元和切割基团/接头产物(CG/接头产物)以双环方式排列。缩略词：切割基团(CG)、结构单元(化学结构单元)、结构单元1(化学结构单元1)、结构单元2(化学结构单元2)、结构单元3(化学结构单元3)、结构单元4(化学结构单元4)、末端结构单元(化学结构单元n)。
图8示出从固体载体选择性切割纯核酸或肽核酸编码的化合物或化学文库成员的示意图。从固体载体(上图)释放在接头与切割基团(CG)之间包含完全合成结构的固体载体化合物。在合成中加帽的截短产物不从固体载体切割，因为它们不包含切割基团(CG)(下图)。缩略词：切割基团(CG)。
图9示出顺序核酸代码的选择性连接的示意图。在核酸部分内，代码1只能连接至代码2，而不能连接至代码3。包含连接至代码2的完整代码1的化合物可连接至代码3(上图)。相比之下，由于代码2与代码1的不成功连接而被截短的化合物可能不在后续连接中与代码3连接(下图)。
图10示出对于完全合成的固体载体化合物选择性安装接头2的示意图。对于完整固体载体化合物，化学部分可连接至固体载体，或通过接头2连接至固体载体与接头1之间的支链区域(上图)。相比之下，对于具有不完整化学部分的化合物，诸如加帽化合物，可能无法成功安装接头2(下图)。
图11示出从固体载体选择性释放具有不完整化学部分的核酸或肽核酸编码的化合物或化学文库成员的示意图。接头1的切割从固体载体释放出没有第二接头(接头2)的化合物。具有截短化学部分的核酸编码的化合物通过接头1的切割从固体载体释放(下图)。包含接头1和接头2两者的核酸编码的化合物或文库成员在接头1切割后保持连接至固体载体(上图)。具有截短或加帽化学部分的化合物的选择性释放提供自纯化效应。
图12示出通过第二接头(接头2)的切割从固体载体释放具有完整化学部分的核酸或肽核酸编码的化合物或化学文库成员的示意图。接头2在接头1的切割和固体载体的洗涤之后以去除任何不需要的不纯化合物。
图13示出用于制备5'-叠氮基修饰的单链寡核苷酸(实施例1)的分析型LCMS数据。在(A)中，示出测量起始材料寡核苷酸(序列1)的260nm吸光度的色谱图。在(C)中示出起始材料寡核苷酸(序列1)的去卷积(decon.)质谱。在(B)中，示出测量产物5'-叠氮基修饰的单链寡核苷酸的260nm吸光度的色谱图。(D)示出产物峰的去卷积质谱。
图14示出新生文库成员的切割的分析型LCMS数据(实施例2)。(A)和(B)示出测量260nm吸光度的色谱图。(C)和(D)分别示出产物峰在3.84分钟处的质谱和去卷积质谱。
图15示出详述核酸编码的文库成员中MeDbz接头的激活的化学结构(实施例4、实施例5)。转化(A)示出MeDbz与氯甲酸对硝基苯酯的反应。反应(B)示出接头激活中的最终步骤。这是用于自纯化的接头激活步骤的实例。
图16示出用于硫辛酸切割基团中的二硫键还原的化学结构(实施例4、实施例5)。这是用于自纯化的切割基团脱保护步骤的实例。
图17示出核酸编码的文库成员的自洗脱(实施例4、实施例5)。所示的化学结构说明包含巯基(thiol)的切割基团与激活的MeNbz接头的反应。这使自洗脱的文库成员从固体载体释放。这一步骤产生具有硫酯的环状化合物。可获得两种可能的环状化合物，一种具有已与接头反应的切割基团的任一巯基。
图18示出用于水解具有硫酯键的环状自纯化文库成员的化学结构(实施例4)。在这种情况下，硫酯水解后获得的产物是直链的。
图19示出在TCEP还原后的额外温育步骤的上清液沉淀后观察到的自洗脱模型核酸编码的文库成员的化学结构和分析型LCMS光谱(实施例4)。在(C)和(D)的LCMS光谱中观察到化学结构(A)和(B)。(B)是通过环状硫酯中间体的水解形成的直链自洗脱产物。(A)是通过环状硫酯中间体经乙醇开环形成的直链自洗脱产物，其被添加用于沉淀步骤。(C)是260nm处的吸光度的色谱图，并且(D)是280nm处的吸光度的色谱图。
图20示出从自洗脱模型核酸编码的文库成员的LCMS分析获得的质谱(实施例4)。(A)和(B)分别示出图19A中所示的自洗脱文库成员化合物的质谱和去卷积质谱。(C)和(D)分别示出图19B中所示的自洗脱文库成员化合物的质谱和去卷积质谱。
图21示出实施例5中制备的自洗脱核酸文库成员的化学结构和LCMS光谱。(A)示出两种可能的环状自洗脱核酸编码的文库成员的结构。(B)示出260nm处的色谱图，并且(C)是总离子流(TIC)。在5.88分钟观察到与环状自洗脱文库成员对应的质量的峰。
图22示出实施例5中制备的自洗脱核酸文库成员的化学结构和LCMS光谱。(A)示出两种可能的环状自洗脱核酸编码的文库成员的结构。(B)和(C)分别是自洗脱核酸文库成员的峰的质谱和相应的去卷积质谱。观察到所需的环状自洗脱核酸编码的文库成员的质量。
图23示出用于新生文库成员的合成中的步骤的反应方案(实施例6、实施例7)。首先，将胺官能化的固体载体与Fmoc-Lys(Mtt)-OH偶联(A)。然后，之后是Fmoc脱保护和与HMBA偶联(B)。此后，显示与Fmoc-Pra-OH的酰胺偶联(C)。
图24示出用于核酸编码的文库成员的合成中的步骤的反应方案(实施例6)。首先，图23中产物的Fmoc脱保护之后与1-(1,1-二甲基乙基)丁二酸酯结构单元偶联(A)。然后，将结构单元的远端基团tBu脱保护，并且将赖氨酸侧链用二氯甲烷中的TFA进行Mtt脱保护(B)。
图25示出用于核酸编码的文库成员的合成中的步骤的反应方案(实施例6)。通过铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)进行的寡核苷酸连接在(A)中示出。(B)显示在DNA存在下在固体载体上进行的酰胺偶联反应。(B)是第二接头的安装中的第一步骤。
图26示出用于核酸编码的文库成员的合成中的步骤的反应方案(实施例6)。通过酰胺偶联使图25中所示的产物与带有炔烃的Dbz接头衍生物反应(A)。然后，进行CuAAC反应以获得环状固体载体化合物(B)。环化化合物包含第一接头HMBA接头和第二接头Dbz接头。
图27示出核酸编码的文库成员的自纯化中的第一步骤的反应方案(实施例6)。图26中产物的第一接头在碱性条件下切割。在这一步骤中，未环化的化合物从固体载体释放。在这一步骤中，不需要的副产物可从固体载体洗掉。
图28示出用于核酸编码的文库成员的自纯化的第二接头的切割的反应方案(实施例6)。首先，使用亚硝酸异戊酯(A)激活二接头Dbz。在(B)中，然后使激活的接头在碱性条件下在水和DMSO中切割。这使自纯化核酸编码的文库成员从固体载体释放。
图29示出实施例6中制备的样品的LCMS光谱。(A)示出通过从固体载体切割合成核酸编码的文库成员中的中间体而获得的LCMS光谱。所分析的中间体是在偶联至Dbz接头衍生物之后且在CuAAC之前。HMBA接头的切割产生所需的中间体，在色谱图(A)中4.01分钟处所示。所需中间体的化学结构显示在(A)中。此外，所分析的样品包含不需要的中间产物。例如，这些可以是在合成中未经历先前酰胺偶联步骤的化合物。(B)示出在核酸编码的文库成员的合成中的最终CuAAC步骤之后，通过切割第一接头(HMBA接头)而获得的色谱图(实施例6)。这是核酸编码的文库成员的自纯化中的第一步骤。在这一步骤中，未环化的不需要的产物从固体载体释放。色谱图(B)与色谱图(A)的比较表明，除(A)中的所需中间体外，在(B)中所有化合物均从固体载体切割，因为这种化合物包含炔烃并且在在(B)中在切割之前经历了CuAAC。这说明CuAAC反应已经成功，并且在此步骤中只有不需要的产物从固体载体释放。(C)示出切割第二接头Dbz后获得的样品的色谱图。色谱图显示自纯化核酸编码的文库成员。所需的自纯化核酸编码的文库成员的结构显示在(C)中。
图30示出实施例6中制备的自纯化核酸编码的文库成员的LCMS光谱。(A)显示260nm吸光度的色谱图。(B)显示280nm吸光度的色谱图。(C)显示3.94分钟处的产物峰的质谱。(D)显示3.94分钟处的产物峰的去卷积质谱。观察到对应于所需的自纯化核酸编码的文库成员的质量。
图31示出用于模型核酸编码的文库成员的合成中的步骤的反应方案(实施例7)。(A)显示Fmoc脱保护，然后酰胺偶联至Fmoc-Dbz-OH。(B)显示固体载体化合物中的赖氨酸侧链的Mtt脱保护。
图32示出用于模型核酸编码的文库成员的合成中的步骤的反应方案(实施例7)。通过铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)进行的寡核苷酸连接在(A)中示出。(B)显示在DNA存在下在固体载体上进行的酰胺偶联反应。(B)是第二接头的安装中的第一步骤。
图33示出用于模型核酸编码的文库成员的合成中的步骤的反应方案(实施例7)。图32中所示产物的Fmoc脱保护之后是酰胺偶联至己酸(A)。然后，进行CuAAC反应以获得环状固体载体化合物(B)。环化化合物包含第一接头HMBA接头和第二接头Dbz接头。
图34示出核酸编码的文库成员的自纯化中的第一步骤的反应方案(实施例7)。图33中产物的第一接头在碱性条件下切割。在这一步骤中，未环化的化合物从固体载体释放。在这一步骤中，不需要的副产物可从固体载体洗掉。
图35示出用于核酸编码的文库成员的自纯化的第二接头的切割的反应方案(实施例7)。首先，使用亚硝酸异戊酯(A)激活二接头Dbz。在(B)中，然后使激活的接头在碱性条件下在水和DMSO中切割。这使自纯化核酸编码的文库成员从固体载体释放。
图36示出实施例7中制备的自纯化核酸编码的文库成员的LCMS光谱。(A)显示260nm吸光度的色谱图。(B)显示280nm吸光度的色谱图。(C)显示3.97分钟处的产物峰的质谱。(D)显示3.97分钟处的产物峰的去卷积质谱。这些数据表明获得了所需的自纯化核酸编码的文库成员。这些数据还表明Dbz接头已被激活。
图37(A)显示固体载体上的DNA连接的示意图(实施例8)。通过使用衔接子寡核苷酸和T4 DNA连接酶，将代码连接至与固体载体连接的寡核苷酸。260nm吸光度的LCMS色谱图(B)是通过在连接条件后切割酯接头而获得的。在4.47分钟处观察到连接产物。另外观察到剩余的衔接子、代码和未连接的起始材料。(C)显示连接产物峰的去卷积质谱。观察到所需连接产物的质量。
图38示出图37B中所示的LCMS色谱图的(A)衔接子寡核苷酸、(B)代码和(C)起始材料峰的去卷积质谱。
图39示出实施例9中进行的转化的反应方案。
图40示出实施例9中制备的样品的LCMS光谱。图40A示出步骤9.6中制备的样品在260nm处的色谱图，以及起始材料的化学结构。图40A中观察到的主峰对应于所需的起始材料。色谱图(图40A)中主峰的保留时间处的去卷积质谱显示在图40C中。观察到对应于所需起始材料的质量。图40B示出步骤9.8中制备的样品在260nm处的色谱图，以及所需产物的化学结构。图40B中观察到的主峰对应于所需产物。色谱图(图40B)中主要产物的保留时间处的去卷积质谱图显示在图40D中。观察到对应于所需产物的质量。这一实例表明，化学转化可在DNA上的固体载体上以高转化率进行。
具体实施方式
在一些方面，可如本文所述通过以下方法产生核酸编码的文库，所述方法涉及针对每个文库成员制备固体载体化合物，所述固体载体化合物包含经由接头连接至固体载体的支架、连接至支架的化学部分、连接至支架的核酸部分以及连接至所述化学部分、支架或核酸部分的切割基团。所述方法还包括使切割基团与接头反应以从固体载体释放化合物来形成文库成员。
切割基团对接头的切割可产生大环。大环可包含化学部分和支架。化学部分的末端可通过经由切割基团与激活接头的反应产生的环化元件而共价连接至大环中的支架。
具有完整化学部分、支架或编码核酸部分切割基团的成员(即其中存在所有预期化学结构单元、编码寡核苷酸或其他元件的物质)通过切割基团对接头的切割而选择性地从固体载体释放。例如，完整化学部分可以是连接的化学结构单元的链(即所有预期的化学结构单元都存在于化学部分中的物质)。切割基团不连接至具有不完整或部分化学部分、支架或编码核酸部分切割基团的化合物或成员(例如被加帽的未反应或部分反应的中间体)，因此这些化合物或成员不从固体载体释放。例如，不含所有预期的化学结构单元的不完整或部分化学部分的成员不从固体载体释放。这使完整化合物或文库成员自纯化，并且可避免对例如使用诸如HPLC的色谱技术进一步纯化步骤的需要。如本文所述的自纯化允许产生高纯成员并促进具有许多合成步骤的复杂文库成员的产生。与现有DEL产生技术相比，本文所述的方法可能是快速的。它们可能适合于自动化，并允许产生高度多样化的高质量DEL。
使完整成员或化合物与未从固体载体切割的不完全合成的化合物分离的过程在本文中可称为自纯化。在一个或多个接头切割后从固体载体释放的化合物或成员含有支架、化学部分和核酸部分，并且可含有在切割反应中一起反应的接头的部分和切割基团的部分，可称为自纯化化合物或成员。
在其他方面，可如本文所述通过以下方法产生核酸编码的文库，所述方法涉及针对每个文库成员制备固体载体化合物，所述固体载体化合物包含经由第一接头连接至固体载体的支架、连接至支架的化学部分、连接至支架的核酸部分和将所述化学部分连接至所述固体载体的第二接头。所述方法还包括切割第一接头，任选洗涤，然后切割第二接头以从固体载体释放化合物来形成文库成员。
第二接头不连接至具有不完整或部分化学部分的化合物或成员(例如被加帽的未反应或部分反应的中间体)。这些化合物或成员仅通过第一接头连接至固体载体并通过第一接头的切割从固体载体释放。例如，具有不含所有预期的化学结构单元的不完整或部分化学部分的成员通过第一接头的切割从固体载体释放并且可被去除。具有完整化学部分的成员(即其中存在所有预期的化学结构单元的物质)通过第一接头和第二接头两者连接至固体载体。例如，完整化学部分可以是连接的化学结构单元的链(即所有预期的化学结构单元都存在于化学部分中的物质)。这些成员通过第二接头的切割从固体载体选择性地释放。这使完整化合物或文库成员自纯化，并且可避免对例如使用诸如HPLC的色谱技术进一步纯化步骤的需要。如本文所述的自纯化允许产生高纯成员并促进具有许多合成步骤的复杂文库成员的产生。与现有DEL产生技术相比，本文所述的方法可能是快速的。它们可能适合于自动化，并允许产生高度多样化的高质量DEL。
使完整化合物与不完全合成的化合物分离的过程可在本文中称为自纯化，所述不完全合成的化合物通过第一接头的切割从固体载体释放。在第二接头的切割之后从固体载体释放并且含有支架、完整化学部分和核酸部分并且可含有在切割反应之后保留的接头的部分的化合物或成员可被称为自纯化的化合物或成员。
第一和第二接头可以是正交可切割的。例如，切割第一接头所需的反应条件可不同于切割第二接头所需的反应条件。因此，第一和第二接头可通过改变反应条件独立地切割。第一接头1在固体载体化合物的合成过程中必须稳定。第二接头必须对第一接头的切割条件稳定(即第二接头不可在将导致第一个接头切割的条件下切割。第一和第二接头的切割条件不可引起核酸部分的降解或破坏。
在一些实施方案中，第一和/或第二接头可在切割前被激活。
合适的第一和/或第二接头可包括碱基可切割接头，诸如酯接头、光可切割、氨基(甲基)苯胺(MeDbz)、氨基苯胺(Dbz)、掩蔽硫酯、磺酰胺、可氧化切割、可还原切割和酶促可切割接头。
合适的第一和/或第二接头可包括可被亲核体切割的接头。可被亲核体切割的接头的实例可包括硫酯、磺酰胺、苯并咪唑酮(例如，MeNbz)和苯并三唑(例如，由亚硝酸异戊酯激活的Dbz接头)。
合适的碱基可切割接头(诸如酯接头)可在高pH下被切割。基于碱基的接头的实例可包括酯、苄酯和4-(羟甲基)苯甲酸(HMBA)(Usanov，D.L.等人Nat.Chem.10，704–714(2018)；Soural，M.等人Linkers for Solid-Phase Peptide Synthesis.in Amino Acids，Peptides and Proteins in Organic Chemistry第3卷273–312(Wiley-VCH，2011))
光可切割接头可通过光致辐照切割。光可切割接头的实例可包括邻硝基苄氧基和邻硝基苄基氨基、邻硝基藜芦基、苯甲酰甲基、新戊酰基、安息香接头和其他光不稳定接头(Mikkelsen，R.J.T.等人Pho tolabile Linkers for Solid-Phase Synthesis.(2018)doi:10.1021/acsco mbsci.8b00028.)。
可氧化切割的接头包括偕二醇，诸如基于L-酒石酸盐、seramox和isoseramox接头的接头(Usanov，D.L.等人Nat.Chem.10，704–714(2018)；Pomplun等人Angew.Chemie-Int.Ed.59，11566–11572(2020)。这些可被切割，例如，被高碘酸钠切割。
其他合适的第一和/或第二接头在本领域中是可用的并且包括磺酰胺接头(Mende，F等人J.Am.Chem.Soc.132，11110–11118(2010))和可切割接头(Scott，P.J.H.Linker Strategies in Solid-Phase Organic Synthesis(2009)；Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques:第三版(2013)；Leriche，G.，Chisholm，L.和Wagner，A.，Cleavable linkers in chemical biology(2012))。在一些实施方案中，第一和第二接头可并入单一化学实体中。例如，单个第一和第二接头可基于亚氨基二乙酸。第一接头可在脱保护介导的环化中切割以产生二酮哌嗪第二接头，其然后在高pH下切割。(PáTek，M.和Lebl，M.Safety-Catch and Multiply Cleavable Linkers in Solid-PhaseSynthesis.Biopoly第47卷(1998)；P.，Krchňák，V.&Lebl，Tetrahedron Lett.34，7251–7252(1993))。
其他合适的第一和/或第二接头在连接至固体载体和支架和/或化学部分和/或核酸部分之前可包含两个或更多个结合基团。例如，接头可通过第一结合基团结合至固体载体并且可通过第二结合基团结合至支架和/或化学部分和/或核酸部分。接头的结合基团可以是官能团。合适的第一和/或第二接头可以是同双官能或异双官能的，是指它们的结合基团。合适的异双官能接头可包括3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-4-(甲基氨基)苯甲酸(Fmoc-MeDbz-OH)，其中羧酸基团可例如在Fmoc脱保护后结合至固体载体和胺基团，可例如结合至支架上。其他合适的异双官能接头可包括4-氨基-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]苯甲酸(Fmoc-Dbz-OH)和4-(羟甲基)苯甲酸(HMBA)。
DNA编码的化学文库(DEL)是化学上不同的文库成员的集合，所述成员各自包含(i)由一组化学连接的化学结构单元形成的化学部分和(ii)编码形成所述所述化学部分的化学结构单元的核酸。文库中不同成员的数量代表文库的复杂性，并且由形成每个化学部分的结构单元的数量以及每个结构单元的不同变体的数量来定义。
化学部分是由文库成员展示的化学实体或分子结构，并且包含一个、两个或多个化学结构单元。化学部分共价连接至支架并且通过连续共价添加一个或多个化学结构单元以形成具有连接至支架的末端和游离末端的直链或主链而产生。切割基团可连接至化学部分。DEL文库的成员所展示的不同化学部分是由化学结构单元的不同组合形成的。DEL所展示的化学部分可以是不同大小的直链、大环、双环、多环或支链化合物(例如利平斯基(Lipinski)样小化合物和较大化合物)。在一些实施方案中，化学部分可以是任何小分子(即具有低于约1,000道尔顿的分子量的分子)。在其他实施方案中，化学部分可以是任何中等大小的分子(即具有低于约5,000道尔顿的分子量的分子)。小分子可以是有机的或无机的、分离的(例如，从化合物文库或天然来源)或通过已知化合物的衍生化而获得。化学部分可被设计或构建为具有一种或多种所需特性，例如结合生物靶标的能力、溶解度、氢键供体和受体的可用性、键的旋转自由度、正电荷、负电荷、体内稳定性、细胞渗透性和/或口服利用度。
在核酸编码的化学文库中展示的化学部分可连接至单链核酸(“单药效团文库”)或杂交在一起的两条不同的核酸链，一个或多个结构单元连接至每条链(“双药效团文库”)。
编码核酸部分是鉴定化学部分中的化学结构单元的核酸标签或肽核酸标签。编码核酸部分可以是直链核酸分子，其包含连接至化合物或成员的末端和游离末端。优选地，编码核酸部分连接至支架。为了记录先前或随后引入的化学结构单元，可通过将编码寡核苷酸共价添加至游离末端来延长编码核酸部分。编码核酸部分可用于在扩增和核酸测序后自纯化化合物的鉴定。在一些实施方案中，切割基团可例如在游离末端处连接至核酸部分。
在本文所述的方法中，核酸编码的化学文库的成员可通过向新生成员添加化学结构单元和编码寡核苷酸而在固体载体上构建。
当连接至固体载体时，新生成员可被称为固体载体化合物。固体载体化合物是包含固体载体的化合物，所述固体载体经由接头连接至支架、化学部分、核酸部分、切割基团和新生成员的其他元件。根据一些实施方案的固体载体化合物的实例在图1中示出。例如，可如本文所述通过包括以下步骤的方法产生核酸编码的化学文库；
提供一组新生成员，所述新生成员各自包含通过接头连接至固体载体的支架，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述组中的新生成员以形成连接至支架的化学部分，不同的化学部分连接至所述组中的不同新生成员，
共价连接至每个新生成员编码寡核苷酸，所述编码寡核苷酸编码连接至新生成员的一个或多个化学结构单元以形成连接至所述组中的新生成员的支架的编码核酸部分，
将切割基团连接至新生成员的化学部分、核酸部分或支架，以及
使接头和每个成员的切割基团反应，使得所述接头被切割并且文库的成员从它们各自的固体载体释放。
图2和图3中举例说明自纯化反应(即切割基团与接头的反应)的实例。在图2和图3中，使用具有连接至化学部分的切割基团的固体载体化合物举例说明自纯化。
切割基团与接头的反应可导致化合物或成员从固体载体释放，所述化合物或成员包含通过接头与切割基团的反应(即切割基团/接头产物，参见图2)形成的切割部分(也称为环化元件)。接头的一部分(即切割的接头)可保持连接至固体载体。
在一些实施方案中，切割部分可连接至化学部分，其中切割基团连接至化学部分，并且可连接至支架，其中接头连接至支架。切割基团与接头的反应可导致环化反应，从而产生连接至编码核酸部分的环状化合物(图2)。环状化合物可包含化学部分、支架和切割部分。
在其他实施方案中，切割部分可连接至其中切割基团连接至化学部分的化学部分。在自纯化过程中，切割基团与接头的反应可能不产生环化(参见图3)，使得切割部分不连接至支架。在一些实施方案中，接头的全部或部分(即切割的接头)可保持连接至支架。
根据其他实施方案的固体载体化合物的实例显示于图10中。例如，可如本文所述通过包括以下步骤的方法产生核酸编码的化学文库；
提供一组新生成员，所述新生成员各自包含通过第一接头连接至固体载体的支架，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述组中的新生成员以形成连接至支架的化学部分，不同的化学部分连接至所述组中的不同新生成员，
共价连接至每个新生成员编码寡核苷酸，所述编码寡核苷酸编码连接至新生成员的一个或多个化学结构单元以形成连接至所述组中的新生成员的支架的编码核酸部分，
用第二接头将所述新生成员的化学部分连接至固体载体，
切割所述第一接头，以及
切割所述第二接头，使得文库的成员从它们各自的固体载体释放。
如上所述，第一和第二接头可以是正交可切割的。
自纯化反应的实例(即切割基团与接头的反应)在图10至12中举例说明。在图10至12中，使用具有连接至化学部分的第二接头的固体载体化合物举例说明自纯化。
第一接头的切割可导致从固体载体释放具有不完整或部分化学部分的化合物或成员。这些化合物或成员可例如通过洗涤去除。第二接头的切割可导致从固体载体释放具有完整化学部分的化合物或成员。所释放的化合物或成员可包含分别通过第一和/或第二接头的切割形成的第一和/或第二切割部分(也称为环化元件)。第一和/或第二接头(即切割的接头)的全部或部分可保持连接至固体载体。
在一些优选的实施方案中，核酸编码的化学文库可通过连续分离和汇集步骤合成，每个步骤包括在并入编码寡核苷酸之前、之后或同时将化学结构单元并入化学部分。
单独核酸编码的化合物或文库成员可通过包括首先制备固体载体化合物的方法合成。
在一些实施方案中，通过以下方式来制备固体载体化合物：通过接头将支架连接至固体载体，将编码核酸部分连接至所述支架，将化学部分连接至所述支架，以及将切割基团连接至所述化学部分、支架或核酸部分。在固体载体化合物的制备之后，使切割基团与接头反应，使得接头被切割并且核酸编码的化合物或文库成员从固体载体释放。例如，可如本文所述通过包括以下步骤的方法产生核酸编码的化合物或文库成员；
提供包含通过接头连接至固体载体的支架的新生化合物，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生化合物以形成连接至所述支架的化学部分，
将编码所述一个或多个化学结构单元的编码寡核苷酸共价连接至所述新生化合物以形成编码核酸部分，
将切割基团连接至所述化学部分、核酸部分或支架，以及
使所述接头与所述切割基团反应，使得所述接头被切割并且所述自纯化化合物或文库成员从所述固体载体释放。
在其他实施方案中，通过以下方式来制备固体载体化合物：通过第一接头将支架连接至固体载体，将编码核酸部分连接至支架，将化学部分连接至支架，以及将第二接头连接至所述化学部分以将所述化学部分连接至所述固体载体。在固体载体化合物的制备之后，使第一接头切割，然后使第二接头切割并且核酸编码的化合物或文库成员从固体载体释放。例如，可如本文所述通过包括以下步骤的方法产生核酸编码的化合物或文库成员；
提供包含通过第一接头连接至固体载体的支架的新生化合物，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生化合物以形成连接至所述支架的化学部分，
将编码所述一个或多个化学结构单元的编码寡核苷酸共价连接至所述新生化合物以形成编码核酸部分，
用第二接头将所述化学部分连接至所述固体载体，以及
切割所述第一接头，以及
切割所述第二接头，使得所述第二接头被切割并且所述自纯化化合物或文库成员从所述固体载体释放。
第一化学结构单元可在第一编码寡核苷酸连接至支架之前、之后或同时连接至支架。
固体载体化合物可例如通过以下方式来制备：首先将接头连接至固体载体，随后将支架连接至所述固体载体上的接头；或者首先将支架连接至接头以形成接头-支架缀合物，随后将所述接头-支架缀合物连接至固体载体。
编码核酸部分或编码核酸部分的片段可在支架连接至固体载体之前、之后或同时连接至支架。
化学部分或化学部分的片段，诸如化学结构单元，可在支架连接至固体载体之前、之后或同时连接至支架。
支架是形成化学部分的化学结构单元连接至其的化学部分。在一些实施方案中，优选地，相同的化学部分形成文库的所有成员的支架。支架可以是连接固体载体、核酸部分和化学部分的至少三官能化学部分。
支架可包含捕获基团。捕获基团是反应性化学基团，其能够与化学结构单元反应以形成将化学结构单元连接至支架的共价键。这允许形成化学部分的化学结构单元连接至支架。
切割基团是可在有或没有预先切割基团激活的情况下切割接头的化学试剂或酶。为了提供自纯化化合物或成员，在一些实施方案中，切割基团可共价或非共价连接至化学部分、核酸部分或支架。切割基团可能需要在并入后被激活。化合物或成员可通过切割基团对接头的切割而从固体载体选择性释放来纯化。
在一些实施方案中，切割基团可连接至支架。具有完整支架和切割基团的化合物或文库成员可通过切割基团对接头的切割而从固体载体选择性地释放。
在其他实施方案中，切割基团可连接至化学部分。具有完整支架、化学部分和切割基团的化合物或文库成员可通过切割基团对接头的切割而从固体载体选择性地释放。
在其他实施方案中，切割基团可连接至核酸部分，优选核酸部分的末端。具有完整支架、核酸部分和切割基团的化合物或文库成员可通过切割基团对接头的切割而从固体载体选择性地释放。
在其他实施方案中，支架可通过两个不同的接头(第一和第二接头)连接至固体载体，并且固体载体化合物中可存在两个不同的切割基团(切割第一接头的第一切割基团和切割第二接头的第二切割基团)。切割基团中的一者可连接至化学部分或支架，并且另一个切割基团可连接至核酸部分。例如，所述方法还可包括；
将第一切割基团连接至化学部分或支架，
将第二切割基团连接至核酸部分，
使第一接头与第一切割基团反应，使得所述第一接头被切割，
使第二接头与第二切割基团反应，使得所述第二接头被切割并且化合物或成员从固体载体释放。例如，第一接头可包含取代的喹喔啉基团或由其组成，并且第一切割基团可包含邻二苯硫酚或由其组成；并且第二接头可包含氨基(甲基)苯胺(MeDbz)基团或由其组成，并且第二切割基团可包含巯基切割基团或由其组成。
从固体载体选择性释放可由完整化学部分和完整支架两者、完整编码核酸部分和完整支架两者、或更优选完整化学部分和完整核酸部分两者的存在来引发。
图4中示出使用两个不同的接头和两个不同的切割基团制备的化合物或成员的选择性释放的实例。在图4中，第一切割基团(CG1)连接至化学部分，并且第二切割基团(CG2)连接至核酸部分。两个不同的接头将支架连接至固体载体。CG1可仅与接头1反应，而CG2可仅与接头2反应。CG1与接头1的反应可在CG2与接头2的反应之前、期间或之后发生。只有当两个接头都切割时，化合物才从固体载体释放。在图4中所示的实例中，CG1与接头1的反应是环化反应，其导致形成连接至化学部分和支架的第一切割部分(即CG1/接头1反应产物)。CG2与接头2反应以产生第二切割部分(即CG2反应产物)，所述第二切割部分连接至核酸部分。
在一些实施方案中，仅当化合物或成员含有化学部分的化学结构单元的完整链和包含化学结构中的所有化学结构单元的编码寡核苷酸的完整核酸分子两者时，化合物或成员才可从固体载体释放。
在一些实施方案中，切割基团可共价连接至化学部分或支架。优选地，切割基团可共价连接至化学部分中的末端化学结构单元(即在形成化学部分的化学结构单元的链的游离末端)。这允许包含整个化学部分的成员或化合物的自纯化。
在其他实施方案中，切割基团可通过两个寡核苷酸的杂交非共价连接至化学部分或支架。锚寡核苷酸可共价连接至化学部分或支架，优选化学部分的末端化学结构单元。然后可使共价连接至切割基团的辅助寡核苷酸与锚寡核苷酸杂交。这将切割基团非共价连接至化学部分或支架。切割基团然后可与接头反应以切割接头并从固体载体释放成员或化合物。例如，切割基团可通过以下方法连接至化学部分或支架，所述方法包括；
将锚寡核苷酸连接至化学部分或支架，
提供共价连接至切割基团的辅助寡核苷酸，
使所述辅助寡核苷酸与所述锚寡核苷酸杂交，
使接头与所述切割基团反应，使得所述接头被切割。
在一些实施方案中，连接至化学部分或支架的锚寡核苷酸可分别在化学部分或支架上顺序合成。锚寡核苷酸也可以是核酸类似物，诸如肽核酸。例如，可在支架或化学部分上顺序合成肽核酸。
优选地，锚寡核苷酸可共价连接至化学部分的末端化学结构单元。
共价连接至切割基团的辅助寡核苷酸可以是能够与锚寡核苷酸特异性杂交的单链多核苷酸。优选地，与切割基团共价连接的辅助寡核苷酸包含10个或更多个碱基对。
在一些实施方案中，切割基团可共价连接至核酸部分，例如连接至核酸部分的游离末端。
在一些优选的实施方案中，通过共价连接至切割基团的辅助寡核苷酸与固体载体化合物中的编码核酸部分的杂交，切割基团可连接至编码核酸部分。例如，切割基团可通过以下方法连接至编码核酸部分，所述方法包括；
提供共价连接至切割基团的辅助寡核苷酸，
使共价连接至切割基团的寡核苷酸与编码核酸部分杂交，以及
使接头与所述切割基团反应，使得所述接头被切割。
优选地，使辅助寡核苷酸与编码核酸的末端部分杂交(即核酸的最远或远离支架的区域、区段或部分)。这允许包含整个核酸部分的成员或化合物的自纯化。
辅助寡核苷酸可以是能够与编码核酸部分特异性杂交的单链多核苷酸。优选地，与切割基团共价连接的辅助寡核苷酸包含10个或更多个碱基对。优选地，与切割基团共价连接的辅助寡核苷酸与编码核酸部分的末端区域杂交，例如在编码核酸部分的游离末端的10个碱基、20个碱基或30个碱基内。
本文所述的编码、连接、锚和辅助寡核苷酸以及编码核酸部分可独立地是天然核酸，诸如DNA或RNA，或核酸类似物，诸如肽核酸(PNA)、二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)、硫代磷酸酯寡聚物(PTO)、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)或苏糖核酸(TNA)。辅助寡核苷酸可通过任何方便的化学连接至切割基团。
在其他实施方案中，支架可通过第一接头连接至固体载体，并且化学部分可通过第二接头连接至固体载体。第一和第二接头是正交可切割的，即第一接头在第一反应条件下被切割，并且第二接头在第二反应条件下被切割。例如，所述方法还可包括；
使固体载体化合物暴露于或经受第一反应条件，使得第一接头被切割，以及
使固体载体化合物暴露于或经受第二反应条件，使得第二接头被切割并且化合物或成员从固体载体释放。
合适的第一和第二接头在本文别处描述。
反应性基团，诸如捕获基团、结合基团和切割基团，可在性反应基团不需要反应的一个或多个步骤过程中被保护。反应性基团可通过共价连接至保护基团而方便地被保护。可通过在需要反应性基团的反应的步骤之前去除保护基团来使反应性基团脱保护。
保护基团是可逆地保护捕获基团、结合基团、切割基团或本文所述的其他反应性基团在一个或多个步骤过程中免受不期望的反应的化学基团，在所述一个或多个步骤中不需要捕获基团、结合基团、切割基团或其他反应性基团发生的反应。常用的保护基团公开于Greene，"Protective Groups in Organic Synthesis,"第4版(John Wiley&Sons，NewYork，2007)中。合适的保护基团的实例包括酯基(例如，(甲氧基乙基)酯、异戊酰基酯和-乙酰丙基酯)、三苯甲基(例如，二甲氧基三苯甲基和单甲氧基三苯甲基)、呫吨基(例如，9-20苯基呫吨-9-基和9-(对甲氧基苯基)呫吨-9-基)、酰基(例如，苯氧基乙酰基和乙酰基)、甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)、2-硝基苄基、烯丙氧基羰基-氨基甲基、AllocamoNv、叔丁基、叔丁基烃硫基(StBu)、磺酸基9-芴基甲基、9-芴基甲氧基羰基或分子内二硫化物。
例如，支架的捕获基团可例如通过与保护基团的共价键联来保护。捕获基团可在与第一化学结构单元反应之前脱保护，例如通过去除保护基团。
可通过任何方便的方法添加和去除保护基团。合适的技术在本领域中已充分确立。在一些实施方案中，可通过核酸相容化学反应或更一般地，与编码系统相容的反应来添加和去除保护基团。在其他实施方案中，可通过酶促转化添加或去除保护基团。例如，酶催化反应可用于保护或脱保护新生成员中的结合基团。
优选地，化学部分通过将化学结构单元顺序地添加至新生成员以产生在近端连接至支架的化学结构单元的直链序列(即链)而产生。链中的化学结构单元可形成由它所连接的成员展示的化学部分。例如，第一化学结构单元可共价连接至支架的捕获基团。第二化学结构单元可连接至第一化学结构单元以形成由两个化学结构单元组成的直链序列或链。化学结构单元的链可具有连接至支架的近端和游离的远端。第一化学结构单元可位于近端位置并且第二化学结构单元可位于远端位置(即第二化学结构单元是链中的端或末端化学结构单元)。可通过将另外的化学结构单元顺序连接至链的远端，例如通过在末端位置与化学结构单元反应来使链延长。在化学结构单元的链完成后，切割基团可连接至完整链的远端，例如通过与远端的化学结构单元(末端化学结构单元)反应。
化学结构单元是形成由文库成员展示的化学部分的结构单元的化学基团。化学结构单元可以是包含一个、两个或更多个结合基团的任何化学基团。如果将化学结构单元并入化学结构单元的链中，则这种化学结构单元可以是包含两个或更多个结合基团的任何化学基团。
优选地，化学结构单元可包含两个或更多个结合基团，所述结合基团允许与支架或其他化学结构单元的共价连接。两个或更多个结合基团可展示不同的或正交的反应性。例如，化学结构单元可包含近端和远端结合基团(例如双官能结构单元)。例如，化学结构单元可通过近端结合基团共价连接至新生成员。化学结构单元的远端结合基团可被保护和/或用于将另外的化学结构单元连接至新生成员。每个结合基团可以是能够与来自另一个化学结构单元的结合基团反应的反应性官能团。两个不同结构单元上的近端和远端结合基团；或者结构单元上的结合基团和支架的捕获基团应该是互补的，即能够一起反应以形成共价键。可采用与编码系统、固体载体和接头完整性相容的任何反应。在一些实施方案中，可采用任何合适的DNA相容化学，例如酰胺化、薗头偶联(Sonogashira coupling)、铃木偶联(Suzuki coupling)或铜(I)-催化的叠氮化物炔烃环加成(CuAAC)或其他点击反应。例如，第一和第二结合基团中的一者可以是羧基并且另一者可以是胺基团。
合适的结合基团包括羧酸、炔烃、芳基卤、烷基卤、醛、酮、腈、磺酰卤、巯基、醇、乙炔、伯胺、仲胺、叠氮化物、脒、二胺、环氧化物、异氰酸酯、磺酰胺和硼酸。包含两个或更多个结合基团的合适的化学结构单元包括非天然氨基酸、D-氨基酸、N-烷基化氨基酸和酸炔烃。
在一些实施方案中，化学结构单元可包含额外的结合基团，其允许化学结构单元的链内的不同化学结构单元之间的交联，例如以产生大环、双环或多环化学实体。例如，三官能结构单元可以是具有侧链的氨基酸，所述侧链具有诸如炔烃、叠氮化物、胺、羧酸、巯基、醇或烷基卤的官能团。在一些实施方案中，化学结构单元可使用例如包含炔烃结合基团的化学结构单元与包含叠氮化物结合基团的化学结构单元之间的CuAAC反应或其他点击反应来交联。
在一些优选的实施方案中，化学结构单元可在采用多轮试剂添加和洗涤的反应中共价连接至新生成员或化合物。例如，可洗涤固体载体以去除反应混合物，并且可添加例如包含新鲜溶剂和试剂的新的反应混合物。这可用于例如驱动化学结构单元和新生成员的反应趋于完成、增加化学结构单元的并入和降低未反应的化学结构单元和新生成员的比例。多轮反应可允许并入通常与不良反应产率相关的化学结构单元，诸如N-甲基化氨基酸。
化学结构单元可通过其近端结合基团共价连接至新生成员。化学结构单元的远端结合基团可用于在后续步骤中将另外的化学结构单元或切割基团连接至链的末端。在化学结构单元的近端结合基团与新生成员的反应期间，化学结构单元的远端结合基团可例如通过与保护基团的共价连接而保护。例如，在化学结构单元链中顺序地添加下一个化学结构单元之前，可例如通过去除保护基而使远端结合基团脱保护。
在每个化学结构单元并入步骤之后，未能并入化学结构单元的新生成员的分子种类(即未反应的成员)可被加帽。例如，加帽基团可在并入第一化学结构单元之后共价连接至未反应的捕获基团，并且在并入另外的化学结构单元之后连接至未反应的远端结合基团，以防止切割基团连接至未反应的捕获或远端结合基团。
加帽基团是使反应性基团(诸如本文所述的捕获基团或远端结合基团)不可逆地加帽并防止其参与任何进一步的化学反应的化学基团。加帽基团用于本文所述的方法中以阻止来自本文所述方法的一个步骤的未反应物质在所述方法的后续步骤中反应。特别地，加帽基团防止切割基团连接至中间物质。例如，在化学结构单元的链中，完整链的末端的化学结构单元的远端结合基团保持未加帽并且可用于与切割基团反应。这允许切割基团选择性地连接至完整化学结构单元链的末端。
合适的加帽试剂可包括用于使胺加帽的单官能羧酸衍生物反应性基团，诸如乙酸酐；用于使炔烃反应性基团加帽的叠氮化物；和用于使羧酸反应性基团加帽的单官能胺。
在一些实施方案中，可能不需要加帽。例如，在一些实施方案中，由于官能团的性质，化学结构单元(例如结构单元1)的远端结合基团可能仅用于与后续结构单元(例如结构单元2)反应。此后的任何结构单元(例如结构单元3、结构单元4等)可能不包含与结合至倒数第二个结构单元(例如结构单元1)相容的官能团。因此，未能并入中间结构单元(例如结构单元2)的任何化合物可能不会并入任何另外的结构单元。由此可实现与加帽相同的效果。
可使用化学结构单元的不同组合将本文所述的方法重复一次或多次以生成包含展示不同化学部分的不同成员的文库。例如，化学结构单元的数量、身份和/或顺序在文库的不同成员的化学部分中可能不同。
如本文所述，化学结构单元和编码寡核苷酸可通过分离和汇集程序方便地添加至新生文库成员中。或者，对于足够小的文库，每个文库成员的并行合成也是可能的。
用于核酸编码的化学文库合成的分离和汇集程序可包括以下步骤；
将新生成员或核酸编码的文库中间体分离至单独的区室中，
连接一个或多个化学结构单元，
连接一个或多个编码化学结构单元的编码寡核苷酸，
以及将来自单独区室的成员或中间体汇集到一个或多个区室中。这一程序可重复一次或多次。
优选地，添加至新生成员的化学结构单元形成在近端连接至支架的化学结构单元的直链。包含化学结构单元的完整链的化合物和成员可通过本文所述的自纯化方法进行纯化。一系列化学结构单元最适合化学部分的最大自纯化。对于待并入化学结构单元的链中的化学结构单元，它们必须至少是双官能的(即包含至少两个结合基团)。化学结构单元的近端和远端结合基团可展示不同或正交的反应性。图5A中示出具有结构单元的直链排列的固体载体化合物的实例。
在其他实施方案中，添加至新生成员的化学结构单元可形成连接至支架的支链结构。支架可至少是四官能的(即它可包含两个或更多个捕获基团)，或者一个或多个化学结构单元可至少是三官能的以允许两个或更多个额外的化学结构单元的连接点以形成支链结构。
在其他实施方案中，添加至新生成员的化学结构单元可形成连接至支架的环状或大环结构。这可能需要化学结构单元与化学部分内的另一个化学结构单元或与支架的交联。环状结构可以是大环的。化学结构单元与其他化学结构单元或支架的额外交联可产生具有由连接至支架的化学结构单元形成的双环、大环或多环结构的化学部分。图5B中示出具有通过使用额外的结构单元化学结构单元4使化学结构单元1和化学结构单元3交联而形成的结构单元的环状和支链排列的固体载体化合物的实例。
可在成员或固体载体化合物的合成中的合成步骤之后进行加帽步骤。优选地，可在添加每个化学结构单元和任选的每个编码寡核苷酸之后进行加帽步骤。化学加帽步骤可包括与单官能部分反应，或与不可延伸的核酸分子如寡核苷酸连接。可使官能化的固体载体、接头、支架、化学结构单元、化学部分、切割基团以及编码核酸部分加帽。加帽步骤可包括使未反应的官能团如结合基团或捕获基团与加帽试剂反应，以形成非反应性加帽基团。合适的加帽试剂包括激活的羧酸衍生物。
图8中示出从固体载体选择性释放完整化合物或成员的实例。在图8的下图中，在化学部分中加帽的化合物未从固体载体释放，因为它不完全合成、加帽，并且因此不包含切割基团。
编码核酸部分可通过使用末端仅与紧接在之前的编码寡核苷酸相容并且不能连接至先前添加至核酸部分的其他编码寡核苷酸的编码寡核苷酸来加帽。图9中示出编码核酸部分的“加帽”的实例。包含所有所需核酸代码(代码1和代码2)的固体载体化合物可连接至另一个代码，代码3。代码1仅可与代码2连接，并且代码2仅可与代码3连接。代码1可能不与代码3连接，因为这些代码可能不含适当的连接序列。因此，不完全合成的固体载体化合物(其在此实例中仅包含代码1并且不包含代码2)可能不连接至另一代码(在此实例中代码3)。
如本文所述的成员或化合物的制备可包括与编码系统和固体载体以及接头完整性相容的任何反应。在一些实施方案中，可能的反应可包括DNA相容性反应。可能的反应可包括酰胺键形成、铃木偶联、薗头偶联、还原胺化和铜催化的炔烃-叠氮化物环加成。DNA相容性反应在文献中进行了描述，包括(Malone，M.L，Paegel，B.M.，ACS Comb.Sci.2016，18(4)，182–187)。
在一些实施方案中，大环化反应可在切割基团与接头的反应、第二接头的安装、固体载体化合物中的其他化学实体的交联中使用或在从固体载体释放后在溶液中额外转化期间使用。例如，在一些实施方案中，第二接头可首先连接至固体载体，然后在大环化反应中连接至化学部分。大环化反应可优选地包括展示高产率的反应，诸如例如铜催化的叠氮化物-炔烃环加成。大环化反应在本领域中是已知的并且可包括描述于(Wang，W.，Khojasteh，S.C.和Su，D.，Mol.(2021)；Zhang，R.Y.，Thapa，P.，Espiritu，M.J.，Menon，V.和Bingham，J.P.，Bioorg.Med.Chem.(2018))中的反应。
成员或化合物可在制备期间和之后进一步转化。例如，方法可包括；
化学结构单元、支架或切割基团中的两者或更多者之间的交联，例如以生成环状或多环成员或化合物，
并入一个或多个另外的化学结构单元，和/或
一个或多个化学结构单元或支架、接头或切割基团的修饰或转化。
可将成员或化合物重新捕获到新的固体载体上。
在一些实施方案中，共价键形成可由核酸模板化反应介导。
在一些实施方案中，能够介导转化的大分子(诸如酶)可在自纯化化合物的制备过程中或之后使用。例如，可通过核酸模板化反应募集酶。
核酸编码的文库的成员包含核酸部分。
编码核酸部分可由单链或双链核酸，或单链和双链核酸的组合组成。在一些实施方案中，只有一条核酸链可连接至支架。在其他实施方案中，双链编码核酸部分的两条核酸链均可连接至支架。
支架、化学部分和/或切割基团可由核酸部分的一条或多条核酸链中的编码序列编码。可通过编码寡核苷酸的酶促连接；编码寡核苷酸的化学连接；使用聚合酶延伸编码寡核苷酸模板；或这三种方法中的任一者的组合来延长编码核酸部分以并入编码序列。
可在产生或转化支架、化学部分或切割基团的合成步骤之前或之后将编码寡核苷酸添加至核酸部分。编码序列可仅存在于一条核酸链上，或者可存在于两条核酸链上。可例如通过PCR方便地扩增一条核酸链上的编码序列。编码序列可在一条或两条核酸链上，并且可转录到可进行PCR扩增的一条核酸链上。编码序列可编码支架、一个或多个结构单元、切割基团、一个或多个接头或其组合。
可在产生、延长或转化支架、化学部分或切割基团的合成步骤之前或之后将编码序列添加至编码核酸部分。
在一些实施方案中，可仅编码化学结构单元。在其他实施方案中，还可编码支架、接头、切割基团或其他实体。尽管下文描述了所编码的化学结构单元，但应理解，其他实体也可以与下文描述的编码化学结构单元的方式相同的方式进行编码。
优选地，核酸编码的文库的成员包含编码核酸部分，所述编码核酸部分编码连接至所述成员的化学部分中的所有化学结构单元。连接至成员的编码核酸部分的测序允许鉴定由所述成员展示的化学部分中的化学结构单元。
新生成员或化合物可包含连接寡核苷酸(也称为头部)。在一些优选的实施方案中，连接寡核苷酸连接至新生成员的支架。
连接寡核苷酸是编码化学结构单元的编码寡核苷酸连接至其以形成核酸部分的核酸。连接寡核苷酸可在文库的不同成员中具有相同的核苷酸序列(即恒定核苷酸序列)。编码寡核苷酸的组合以及因此编码核酸部分的序列在文库的不同成员中可能不同。
连接寡核苷酸可具有连接至新生结合成员的末端和编码寡核苷酸所连接的游离末端。连接寡核苷酸的游离末端可与编码寡核苷酸的连接相容。例如，游离末端可包含短的5'或3'突出端(“粘性末端”)以促进连接。
连接寡核苷酸可以是天然核酸，诸如DNA或RNA，或者它可以是核酸类似物，诸如肽核酸(PNA)、二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)、硫代磷酸酯寡聚物(PTO)、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)或苏糖核酸(TNA)。
编码第一化学结构单元的第一编码寡核苷酸可连接至连接寡核苷酸。用于寡核苷酸的连接的合适技术是充分确立的并且包括酶促连接。编码第二和另外的化学结构单元的后续编码寡核苷酸可连接至前一编码寡核苷酸以形成编码核酸，所述编码核酸包含连接至成员的链中的化学结构单元的编码寡核苷酸。
在一些实施方案中，连接寡核苷酸可以是双链的。
双链连接寡核苷酸可由单核苷酸链(即发夹)的分子内杂交形成，或者可由两条单独核苷酸链的分子间杂交形成。可使双链核苷酸序列变性以在接头切割之前产生单链核酸。第一释放成员的单链核酸与第二释放成员的单链核酸的杂交可用于例如产生ESAC文库的成员。或者，可采用其中两条寡核苷酸链共价连接的双链连接寡核苷酸。
根据标准技术，双链编码寡核苷酸可通过使用连接酶如T4 DNA连接酶的连接而连接至双链连接寡核苷酸。
在其他实施方案中，连接寡核苷酸可以是单链的。根据标准技术，单链编码寡核苷酸可使用衔接子寡核苷酸通过夹板连接而连接至连接寡核苷酸。
编码寡核苷酸是含有核苷酸编码序列的核酸分子，所述核苷酸编码序列编码化学结构单元和任选的切割基团、支架和/或接头。编码序列(或编码区)可以是与特定化学结构单元独特相关的任何核酸碱基序列。这允许通过测序或以其他方式“读取”编码序列来确定化学部分的身份。
编码序列含有足够的核苷酸以独特地鉴定它所编码的化学结构单元。例如，如果化学部分具有20个变体，则编码序列需要含有至少3个核苷酸(42＝16，43＝64)。编码序列可能比必要的更长。使用比必要的更长的编码序列的好处是它们提供了通过不仅仅是单个核苷酸差异来区分代码的机会，这使解码过程更有信心。例如，来自20个不同化学结构单元(20种化合物)的群体的第一个化学结构单元可由6个核苷酸编码，并且来自200个不同部分的群体的第二化学结构单元可由8个核苷酸编码。因此，编码序列的大小取决于待编码的化学结构单元的数量(即文库中不同化学结构单元的数量)。核苷酸序列和/或其互补序列可用作编码序列以编码化学结构单元。用于编码文库中的化学结构单元的合适序列是本领域熟知的。
编码寡核苷酸的编码序列可侧接恒定区。恒定区可足够长以允许有效杂交和连接，例如2-20个碱基，优选9-15个碱基。
编码寡核苷酸以顺序方式添加至到成员或化合物中，同时并入结构单元，从而产生含有编码寡核苷酸的直链系列的核酸分子(即核酸部分)，所述编码寡核苷酸编码存在于成员或化合物中的化学结构单元的组合。编码第一化学结构单元的第一编码寡核苷酸可连接至连接寡核苷酸，并且另外的编码寡核苷酸可各自连接至系列中的前一编码寡核苷酸以形成核酸分子(即核酸部分)。文库成员的核酸部分的序列编码文库成员的化学结构单元。因此，对编码核酸部分进行测序允许鉴定成员的化学结构单元。
第一化学结构单元和编码寡核苷酸可通过以下方法连接至新生成员或化合物，所述方法包括；
将第一化学结构单元共价连接至所述新生成员或化合物的支架，以及
将编码所述第一化学结构单元的编码寡核苷酸共价连接至所述新生成员的连接寡核苷酸。
反应后，可通过洗涤或加帽去除未反应的物质以防止进一步反应。例如，所述方法还可包括使未共价连接至第一化学结构单元的支架加帽。合适的加帽方法如上所述。
可保护第一化学结构单元以防止不想要的反应。例如，第一化学结构单元的远端结合基团可共价连接至保护基团。第一化学结构单元可随后脱保护，例如在连接编码寡核苷酸之后。方法可包括从连接至支架的第一化学结构单元的远端结合基团去除保护基团。这允许添加第二化学结构单元。
在一些实施方案中，第一化学结构单元可通过以下方法连接至新生化合物或成员，所述方法包括；
将第一化学结构单元共价连接至所述新生成员的支架，其中所述第一化学结构单元包含与所述支架的捕获基团反应以形成共价键联的近端结合基团和受保护的远端结合基团，
使未连接至所述第一化学结构单元的未反应的捕获基团加帽，
将编码所述第一化学结构单元的第一编码寡核苷酸共价连接至所述新生成员的连接寡核苷酸以形成编码核酸，以及
使所述第一化学结构单元的远端结合基团脱保护。
在远端结合基团脱保护后，可通过以下方法将第二化学结构单元连接至新生成员，所述方法包括；
将第二化学结构单元共价连接至所述新生成员的第一化学结构单元，以及
将编码所述第二化学结构单元的编码寡核苷酸共价连接至所述新生成员。
反应后，可通过洗涤或加帽去除未反应的物质以防止进一步反应。例如，所述方法可进一步包括使任何未共价连接至另一化学结构单元的化学结构单元的远端结合基团加帽。
可保护另一化学结构单元以防止不想要的反应。例如，另一化学结构单元的远端结合基团可共价连接至保护基团。另一化学结构单元可随后脱保护，例如在连接编码寡核苷酸之后。方法可包括从连接至支架的另一化学结构单元的远端结合基团去除保护基团。这允许连接额外的化学结构单元或切割基团。
在一些实施方案中，另一化学结构单元可通过以下方法连接至新生成员，所述方法包括；
将另一化学结构单元共价连接至化学结构单元的链，其中所述另一化学结构单元包含近端和远端结合基团，并且所述另一化学结构单元的所述近端结合基团与在远端位置的化学结构单元的远端结合基团反应以形成共价键联，使得所述另一化学结构单元被添加至化学结构单元的链的远端，
将另一化学结构单元共价连接至化学结构单元的链，其中所述另一化学结构单元包含受保护的远端结合基团和与所述链的远端的化学结构单元的远端结合基团反应以形成共价键联的近端结合基团，
使在远端的未连接至所述另一化学结构单元的化学结构单元的未反应的远端结合基团加帽，
将编码所述另一化学结构单元的另一编码寡核苷酸共价连接至编码核酸，以及
使所述另一化学结构单元的远端结合基团脱保护。
可在远端结合基团的脱保护之前、之后或同时进行另一编码寡核苷酸的共价连接。
此过程可重复一次或多次以并入多个另外的化学结构单元以产生化学部分。例如，化学部分可包含1、2、3、4、5个或更多个化学结构单元的链。在一些优选的实施方案中，化学部分可包含至多20个化学结构单元。在其他优选的实施方案中，化学部分可包含至多10个化学结构单元。在其他优选的实施方案中，化学部分可包含至多6个化学结构单元。
在一些实施方案中，在化学结构单元的链末端的化学结构单元(即末端化学结构单元)可包含受保护的远端结合基团，例如与保护基团共价连接的远端结合基团。方法可包括在连接切割基团之前从位于化学结构单元的链末端的化学结构单元的远端结合基团去除保护基团。
固体载体是不溶性体，其呈现在如本文所述的生产过程中新生成员或化合物可连接在其上的表面。合适的载体的实例包括树脂、珠粒、纳米颗粒和聚合物，诸如聚苯乙烯-聚乙二醇(PEG)复合材料、PEG和聚-ε-赖氨酸(ε-PL)(参见例如Albericio F(2000).Solid-Phase Synthesis:A Practical Guide.Boca Raton:CRC Press)。方便地，载体可呈颗粒形式，例如珠粒。在一些实施方案中，固体载体可以是由接枝有聚乙二醇(PEG)的聚苯乙烯基质组成的接枝共聚物的珠粒。固体载体可使用标准技术生产或从商业供应商(例如，Rapp Polymere GmbH，DE)获得。从溶液中分离固体载体上的化合物可通过任何方便的方法，诸如过滤、通过磁相互作用(对于磁珠)、通过离心等实现。
其他合适的固体载体可包括聚苯乙烯珠、交联聚苯乙烯珠、聚合物珠、玻璃珠、涂层玻璃珠、控制孔径玻璃珠、珠状控制孔径玻璃珠、二氧化硅微粒、涂层二氧化硅微粒、氧化铁颗粒、涂层氧化铁颗粒、PEGA(聚乙二醇-丙烯酰胺)树脂和其他市售或定制的不同尺寸的合成固体载体或其组合。合适的固体载体可以是磁性的。磁性固体载体的实例包括MagnefyTM和ProMag微球(Bangs Laboratories，Inc.)。固体载体的实例可包括共聚物，诸如丙烯酰胺-PEG共聚物、另外包含顺磁性或铁磁性的材料的聚合物颗粒、核-壳颗粒、多孔颗粒、无孔颗粒或其他有机化学材料与铁磁材料的组合。其他合适的固体载体是本领域已知的(参见例如，Pon，R.T.Curr.Protoc.Nucleic Acid Chem.(2000)；Chaudhuri，R.G.和Paria，S.，Chem.Rev.(2011)；Wu，W.，He，Q.和Jiang，C.Nanoscale Res.Lett.(2008)；Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques:第三版(2013))。
在一些实施方案中，结合实体可用于捕获到固体载体上。例如，小的有机或无机实体可用于捕获到固体载体上，以允许从溶液中物理分离键合至固体载体的化合物。合适的小的有机或无机结合实体可包括生物素和量子点，诸如磁性量子点。在一些实施方案中，如本文所述的核酸编码的化合物或文库的合成中的一个或多个步骤可在捕获到固体载体上之前或之后在溶液中进行。
在一些实施方案中，固体载体可另外通过直链(例如，聚乙二醇(PEG)间隔基)或树枝状聚合物结构(例如，聚酰胺胺(PAMAM)树枝状聚合物)官能化。树状聚合物和间隔基在文献中进行了描述，包括(Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques:第3版(2013))。在一些实施方案中，固体载体表面可由小分子修饰。在一些实施方案中，例如，小分子可将固体载体的一部分与第一和/或第二接头连接。
优选地，如果需要，则固体载体颗粒的集合可容易地悬浮于溶液中以允许分离和汇集。在一些实施方案中，对于具有大量不同成员的文库的容易合成而言，小的固体载体粒度可能是优选的。例如，可使用微粒或纳米颗粒。
固体载体允许在如本文所述的一个或多个构建步骤之后洗涤结合的成员或化合物以去除未结合的反应物。只有完整成员才能自我释放。这可能允许将纯文库成员与不完全合成的文库成员分离，从而允许生产具有高纯度的DEL。在一些实施方案中，将溶液中释放的成员与保持连接至固体载体的物质分离允许富集或纯化完整成员，从而允许产生具有高纯度的DEL。在其他实施方案中，分离溶液中释放的成员之前有一个步骤，所述步骤可以仅或优先从固体载体中释放不完全合成的物质。随后释放保持连接至固体载体的成员允许富集或纯化完整成员，从而允许生产具有高纯度的DEL。
在一些实施方案中，如本文所述的成员或化合物通过切割基团与接头的反应而从固体载体释放。可采用亲电切割基团和亲核接头，或者更优选地可采用亲核切割基团和亲电接头。在一些实施方案中，接头与切割基团之间的反应可以是取代反应，用切割基团取代固体载体。取代反应可以是亲核取代反应，例如亲核芳族取代反应。接头与切割基团之间的其他合适的反应可包括金属催化的反应或复分解反应。
在一些优选的实施方案中，接头和切割基团中的一者可以是巯基或硒巯基基团，并且另一者可以是羰基。此反应可导致形成硫酯中间体。硫酯中间体随后可分子间或分子内切割，这可导致文库成员的不可逆环化(图2)。
接头是可切割的化学部分，在一些实施方案中其可将支架连接至固体载体。接头可将支架直接连接至固体载体或例如通过锚间接地连接。可通过由特定试剂(例如切割基团)或反应条件介导的化学反应来切割接头。
在其他实施方案中，可存在第一和第二接头。第一接头可以是将支架共价连接至固体载体的可切割化学部分。第二接头可以是将化学部分共价连接至固体载体的可切割化学部分。第一和第二接头可以是正交可切割的，即第一接头可通过不切割第二接头的特定试剂(例如切割基团)或反应条件切割。
在一些实施方案中，在与切割基团反应之前，接头在连接至固体载体和支架之后可能不需要进一步转化或激活。接头可以活性状态(即接头处于对切割基团具有反应性的形式)并入新生成员中。合适的接头包括取代的喹喔啉或其衍生物，其可被邻二苯硫酚切割基团切割而无需进一步转化或激活。
取代的喹喔啉可包含具有一个或多个取代(例如在位置2、3和5或位置2、3和6的取代)的喹喔啉基团。在一些实施方案中，取代的喹喔啉的位置2可以是卤素，诸如F、Cl、Br或I，优选Cl，或吸电子基团；位置3可以是-SR、-OR或–NR；并且位置5或6可以是–COOR、-CONR或炔烃。在其他实施方案中，取代的喹喔啉的位置2可以是-SR、-OR或-NR；位置3可以是卤素，诸如F、Cl、Br或I，优选Cl，或吸电子基团；并且位置5或6可以是-COOR或-CONR或炔烃。R可独立地选自氢原子、或C1-6烷基、C5-20芳基、C1-6烷氧基、C1-6酰氧基或C1-6反酯基；其中任一者可以是直链或支链的并且任选地被取代。合适的取代的喹喔啉的实例可包括3-氯-2-((2-羟乙基)硫代)喹喔啉-6-甲酸；3-氯-2-(4-(羟甲基)苯氧基)喹喔啉-6-甲酸；和N-(3-氨基丙基)-3-氯-2-(4-(羟甲基)苯氧基)喹喔啉-6-甲酰胺。
在其他实施方案中，接头可能需要在连接至固体载体和支架之后和与切割基团反应之前激活，即接头可以是可激活接头。接头可以非活性状态(即接头处于对切割基团没有反应性的形式)并入新生成员中。接头的激活将其从非激活形式转换为激活形式。接头的激活形式被切割基团选择性地切割，而接头的非激活形式不被切割基团切割。例如，接头的非活性形式可包含保护基并且接头可通过去除保护基团而被激活。本文所述的方法可包括激活可激活接头。在切割基团需要激活的实施方案中，接头可在切割基团的激活之前、之后或同时被激活。
合适的可激活接头包括掩蔽硫酯，诸如N-烷基半胱氨酸。掩蔽硫酯可被激活以产生可被巯基切割基团切割的硫酯(天然化学连接)。掩蔽硫酯中的巯基可例如通过叔丁基、烯丙氧基羰基氨基甲基、2-硝基藜芦基、9-芴基甲基或作为S-磺酸酯受保护。在掩蔽硫酯脱保护后，半胱氨酸衍生物可在巯基脱保护时经历N至S重排以产生硫酯。
其他合适的可激活接头包括二氨基苯甲酰基或其衍生物，诸如甲基二氨基苯甲酰基。例如，可激活接头可以是氨基(甲基)苯胺(MeDbz)。MeDbz可通过与氯甲酸对硝基苯酯反应而激活，以产生N-酰基N'-甲基苯并咪唑啉(MeNbz)，其可被巯基切割基团切割。合适的可激活接头的其他实例包括3,4-二氨基苯甲酸(Dbz)及其衍生物，其可用亚硝酸异戊酯激活以产生苯并三唑衍生物(Selvaraj，A.等人，Chem.Sci.，2018，9，345–349)。
其他合适的可激活接头包括酶底物。例如，激活的接头可以是被核酸酶切割基团切割的寡核苷酸或被肽酶切割的肽。
在一些实施方案中，接头被切割基团切割以释放固体载体化合物。切割基团是反应性化学基团、试剂或酶，其能够与接头反应以切割接头并从固体载体释放新生成员。为了提供自纯化化合物，切割基团可与化学部分、核酸部分或支架共价连接或可逆地缔合。例如，切割基团可在化学部分完成后连接至化学结构单元的链的远端。切割基团可连接至在化学部分中的化学结构单元的链的远端位置的化学结构单元的远端结合基团。在其他实施方案中，切割基团可连接至化学部分中的任何位置、支架或核酸部分。
在一些实施方案中，切割基团在连接至化学部分、支架或编码核酸部分之后并且在与接头反应之前不需要进一步转化或激活。
在其他实施方案中，切割基团在连接至化学部分、支架或编码核酸部分之后并且在与接头反应之前需要激活，即切割基团可以是可激活切割基团。切割基团可含有在切割基团整合至成员或化合物中时受保护并且在脱保护后切割接头的官能团。例如，切割基团可包含保护基团并且可通过去除保护基团而被激活。
在一些优选的实施方案中，切割基团可受保护。例如，它可与保护基团共价连接。受保护的切割基团可以是非活性的并且可通过脱保护而被激活。方法可进一步包括使切割基团脱保护，例如通过去除保护基团。切割基团可在接头的潜在激活之前、之后或同时脱保护。合适的保护基团如上所述。
切割基团可优选位于形成连接至支架的化学部分的化学结构单元的链的末端(即化学部分的远端)。或者，切割基团可连接至链中除末端化学结构单元以外的化学结构单元，或者并入链中的两个化学结构单元之间。
在一些实施方案中，化合物或成员可包含多个不同的切割基团。例如，两个不同的或正交的切割基团可连接至化学部分中的两个不同位置。
切割基团的选择将取决于可激活接头。
合适的切割基团可包含巯基或由其组成。在一些实施方案中，巯基切割基团可用于切割硫酯接头，例如通过掩蔽硫酯或掩蔽N-烷基半胱氨酸的激活产生的硫酯接头；或二氨基苯甲酰基接头，诸如MeNbz接头，例如通过激活MeDbz而产生的MeNbz接头。巯基可在并入固体载体化合物中的过程中受保护。
其他合适的切割基团可包含硒巯基或由其组成，其可在并入固体载体上的成员或化合物中的过程中受保护。与巯基相比，硒巯基可展示与接头相似的反应性。硒巯基可在并入固体载体化合物中的过程中受保护。例如，切割基团可以是半胱氨酸或其衍生物，或硒代半胱氨酸或其衍生物。除了巯基或硒巯基之外，切割基团中的胺可导致在切割基团与接头通过胺反应后形成的硫酯或硒代酯的分子内切割。
在一些实施方案中，切割基团可包含多个巯基或硒巯基基团。
其他合适的切割基团可包含邻二苯硫酚或由其组成。邻二苯硫酚切割基团可用于切割取代的喹喔啉接头。上文更详细地描述了取代的喹喔啉接头。
其他合适的切割基团可包含酶或由其组成。酶切割基团可用于切割包含酶促可切割结构的接头。例如，核酸酶切割基团可用于切割多核苷酸接头，并且肽酶可用于切割肽接头。
其他反应可用于通过切割基团切割接头。可采用与如本文所述的切割基团和接头的选择性反应相容的反应。例如，接头可以是N-和O-取代的羟胺，并且切割基团可包含α-酮酸基团。在另一个实例中，接头可包含在芳环上进一步衍生化的羧酸邻羟基苯甲醛酯，并且切割基团可包含通过其羧基连接至化学部分、支架或编码核酸部分的丝氨酸或其衍生物、或苏氨酸或其衍生物。
相同或不同类型的保护基团可用于支架、化学结构单元和切割基团，只要它们不会不利地干扰自纯化化合物或成员的合成。
例如，巯基切割基团可通过与烯丙氧基羰基-氨基甲基、邻硝基苄基、2-硝基藜芦基(Nv)、叔丁基(tBu)、9-芴基甲基的共价连接、通过形成S-磺酸酯或通过二硫键或硒硫键而受保护。优选地，通过二硫键或硒硫键的保护可以是分子内的。
可通过硒硫键或二硒键保护硒巯基切割基团。
邻二苯硫酚切割基团可通过每个巯基的分子间二硫键形成而受共价连接保护。例如，邻二苯硫酚切割基团中的巯基可各自受S-叔丁基保护。在一些实施方案中，巯基可由上述其他保护基团保护。
在一些实施方案中，切割基团中的官能团的保护基团可以是光不稳定的并且可通过光不稳定键连接至切割基团。可通过施加光以切割光不稳定键并激活切割基团来去除保护基团。切割基团可在接头的潜在激活之前、之后或同时脱保护。合适的光不稳定保护基团包括2-硝基苄基，诸如2-硝基藜芦基。
在其他实施方案中，固体载体成员可包含第一和第二接头，所述第一和第二接头可通过将成员暴露于合适的条件而独立地切割，而不需要切割基团。第一接头可将支架连接至固体载体。第二接头可将化学部分连接至固体载体。第一接头的切割可释放也未通过第二接头连接的成员(即具有不完整化学部分的成员)。
一种酶或不同的酶可介导如本文所述的自纯化化合物或成员的生产中涉及的一个反应或多个反应。
选择性释放的自纯化文库成员可包含由化学部分和任选的支架以及由接头与切割基团的反应产生的一个或多个切割部分或接头切割后剩余的一个或多个部分形成的直链、支链、环状、大环或多环结构。图6A示出具有直链结构的自纯化化合物的实例。图6B示出具有环状或大环结构的自纯化化合物的实例。图7A示出具有支链结构的自纯化化合物的实例。图7B示出具有双环结构的自纯化化合物的实例。
在自纯化文库成员选择性地从固体载体释放之后，可进行进一步的反应。例如，可在溶液中进行额外的转化，或者可将自纯化化合物重新捕获到固体载体上以进行额外的转化，包括转化、随后自纯化反应。进一步的转化可包括化学结构单元并入反应、化学结构单元的交联、化学结构单元与支架的交联、切割反应、开环反应和大环化反应。例如，在通过在CuAAC(铜催化的叠氮化物-炔烃环加成)中两个结构单元的交联而从固体载体释放大环自纯化文库成员后，可形成双环结构。
在一些实施方案中，单独固体载体连接的文库成员可在成员从固体载体释放之前被区室化。这允许对自纯化文库成员进行基于活性的测定。这也允许释放的成员在区室内与包含编码寡核苷酸的核酸分子物理分离。同一区室中核酸分子和所释放成员的存在允许编码所释放成员的核酸分子被鉴定和测序以确定形成所述成员的化学部分的化学结构单元。这在例如基于活性的测定系统中可能是有用的。
可通过将固体载体的每个颗粒分离在单独的区室中来将成员区室化。分离防止不同颗粒的固体载体结合的成员彼此相互作用，并允许编码核酸保持与所释放成员缔合，即使它通过接头的切割与其物理分离时也是如此。区室可包含分离体积或液滴。例如，可使用介于约0.5pL与约100nL之间的体积或液滴。然而，也可使用更小或更大的体积。区室可包含固体载体结合的成员和合适的反应物、缓冲液和其他试剂以促进接头的切割和成员从载体的释放。区室化文库可呈任何合适的形式，例如呈阵列、微流体或微图案化装置或多孔培养皿形式。
在一些实施方案中，包含编码寡核苷酸的编码核酸部分可连接至位于接头与固体载体之间的锚，使得当接头被切割并且释放成员时，所述锚和所述编码核酸部分保持连接至所述固体载体。
锚是连接寡核苷酸所连接至的化学部分。优选地，相同的化学部分形成文库的所有成员的锚。
在一些实施方案中，产生DNA编码的文库的方法对于每个成员可包括以下步骤；
提供包含支架和锚的新生成员，其中所述支架通过所述锚连接至接头；并且所述锚包含连接寡核苷酸并连接至固体载体，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生成员以形成连接至所述支架的化学部分，
将一个或多个编码寡核苷酸共价连接至所述连接寡核苷酸以形成连接至所述锚的核酸部分，
将切割基团连接至所述化学部分或所述支架，
将所述新生成员分离在区室中，
使所述接头和所述切割基团反应，使得所述接头被切割并且连接至所述支架的化学部分从所述区室中的固体载体释放。
在其他实施方案中，产生DNA编码的文库的方法对于每个成员可包括以下步骤；
提供包含支架和锚的新生成员，其中所述支架通过所述锚连接至第一接头；并且所述锚包含连接寡核苷酸并连接至固体载体，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生成员以形成连接至所述支架的化学部分，
将一个或多个编码寡核苷酸共价连接至所述连接寡核苷酸以形成连接至所述锚的核酸部分，
将第二接头连接至所述化学部分以将所述化学部分连接至所述固体载体，
切割所述第一接头，
将所述新生成员分离在区室中，以及
切割所述第二接头，使得所述第二接头被切割并且连接至所述支架的化学部分从所述区室中的固体载体释放。
化学部分保持与核酸部分区室缔合，从而允许对核酸部分进行测序以鉴定区室缔合的化学部分。
在其他实施方案中，包含编码寡核苷酸的编码核酸部分可连接至固体载体，使得当接头被切割并且释放成员时，所述编码核酸部分保持连接至所述固体载体。例如，产生DNA编码的文库的方法对于每个成员可包括以下步骤；
提供包含通过接头连接至固体载体的支架的新生成员；并且所述固体载体包含连接寡核苷酸，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生成员以形成连接至所述支架的化学部分，
将一个或多个编码寡核苷酸共价连接至所述连接寡核苷酸以形成连接至所述固体载体的编码核酸部分，
将切割基团连接至所述化学部分或所述支架，
将所述新生成员分离在区室中，
使所述接头和所述切割基团反应，使得所述接头被切割并且连接至所述支架的化学部分从所述区室中的固体载体释放。
产生DNA编码的文库的另一种方法对于每个成员可包括以下步骤；
提供包含通过第一接头连接至固体载体的支架的新生成员；并且所述固体载体包含连接寡核苷酸，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生成员以形成连接至所述支架的化学部分，
将一个或多个编码寡核苷酸共价连接至所述连接寡核苷酸以形成连接至所述固体载体的编码核酸部分，
将第二接头连接至所述化学部分以将所述化学部分连接至所述固体载体，
切割所述第一接头，将所述新生成员分离在区室中，以及
切割所述第二接头，使得所述第二接头被切割并且连接至所述支架的化学部分从所述区室中的固体载体释放。
在本发明的上述方面的一些优选的实施方案中，接头的介于1与1015个之间的拷贝可存在于一个固体载体实体，诸如颗粒或珠粒上。
从载体释放后，成员或化合物可进行额外纯化。例如，可在自纯化后进行额外HPLC纯化。
可筛选通过本文所述的方法产生的文库中结合至靶分子的成员。可鉴定结合至靶分子的文库成员，并对核酸分子进行测序以鉴定形成由鉴定的文库成员展示的化学实体的化学结构单元。
可在不存在编码核酸的情况下验证所鉴定的文库成员的结合。例如，方法可包括；
(i)提供包含通过接头连接至固体载体的经标记支架的新生成员，
(ii)将所鉴定的文库成员的化学部分的化学结构单元共价连接至所述支架，以产生包含所述化学部分的经标记的新生成员，
(iii)将切割基团连接至所述化学部分或支架，
(iv)使所述接头与所述切割基团反应，从而切割所述接头并从固体载体释放所述成员，以及
(vi)确定所释放的经标记成员与靶分子的结合。
所释放的成员与靶分子的结合可使用标记来确定。支架可用任何方便的标记，例如荧光标记来进行标记。
本发明的其他方面和实施方案提供其中术语“包含”由术语“由……组成”代替的上述方面和实施方案，以及其中术语“包含”由术语“基本上由……组成”代替的上述方面和实施方案。
应理解，除非上下文另有要求，否则本申请公开上述方面和上述实施方案中的任一者与彼此的所有组合。类似地，除非上下文另有要求，否则本申请公开优选和/或任选特征的所有组合，单独地或与任何其他方面一起。
上述实施方案的修改、进一步的实施方案及其修改对于阅读本公开的技术人员来说将是显而易见的，并且因此，这些都在本发明的范围内。
本说明书中提及的所有文献和序列数据库条目均出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
要求EP20203475.7的优先权，其公开内容也出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
当在本文使用时，“和/或”应理解为明确地公开两个指定特征或组分中的每一者(具有或不具有另一者)。例如，“A和/或B”应被视为(i)A、(ii)B以及(iii)A和B中的每一者的明确公开，如同各自在本文中单独阐述一样。
实验
材料和方法
树脂溶胀
首次使用前或在-20℃下储存后，将珠粒(Rapp Polymere GmbH)与合适的溶剂一起温育10分钟。
固体载体干燥和洗涤
珠粒(Rapp Polymere GmbH)用于带有玻璃料的固相合成反应容器中。使用真空过滤来去除任何与/>珠粒一起温育的溶剂或溶液。通过添加合适的溶剂并随后去除所得溶剂或溶液来洗涤珠粒。通过使用磁体将磁性固体载体与溶液分离。
固体载体量
每个实验中使用的固体载体的数量以mmol相应表面官能团(负载量)、质量(g或mg)或体积(μL)给出，其中珠粒的体积是指在与制造商所提供的相同浓度下使用的珠粒悬浮液的体积。
固体载体储存
将官能化的珠粒(Rapp Polymere GmbH)在-20℃下干燥储存。其他固体载体类型在4℃下以悬浮液形式储存在合适的溶剂或水溶液中。
寡核苷酸
将购买的定制寡核苷酸通过乙醇沉淀进行额外纯化。通过LCMS分析mQ中重新溶解的寡核苷酸，并使用NanoDrop 2000c分光光度计测量它们的浓度。
氨基修饰的单链(ss)DNA(序列1)：
5'd氨基C6-GGAGCTTCTGAATT 3'
分子量＝4473.02Da，ε260＝133700M-1cm-1
氨基修饰的双链(ds)DNA(序列2)：
5'd Phos-GAGTCA-间隔基9-氨基C7-间隔基9-TGACTCCC 3'
分子量＝4937.24Da，ε260＝127872M-1cm-1
衔接子(序列3)：
3’CCTCGAAGACTTAAGACACACGAC 5’
代码(序列4)：
5'd Phos-CTGTGTGCTGACAGCTCGAGTCCCATGGCGC 3'
分子量＝9584.16Da，ε260＝280300M-1cm-1
寡核苷酸的乙醇沉淀
通过添加10％(v/v)5M NaCl和3.5体积的EtOH进行乙醇沉淀。将样品在-20℃下储存至少2小时，然后在4℃下以20800×g离心1小时。离心后丢弃上清液。将沉淀物在ChristAlpha RVC Speedvac旋转真空浓缩器仪器中完全干燥，然后溶解于mQ水中。
寡核苷酸溶液的浓度评估
使用NanoDrop 2000c分光光度计仪器通过测量260nm处的UV吸光度来确定寡核苷酸溶液的浓度。每次测量使用2μL寡核苷酸溶液。寡核苷酸的浓度是根据DNA序列的已知吸收系数和在260nm处的所测量的UV吸光度计算的。
液相色谱-质谱(LCMS)
使用Waters Acquity UPLC和Xevo G2-XS QTof四极飞行时间质谱仪(Waters)记录质谱(LCMS)光谱。Oligonucleotide BEHTMC18，/>2.5μm，2.1mm×50mm柱或/>Oligonucleotide BEHTMC18，/>1.7μm，2.1mm×50mm柱用于寡核苷酸的LCMS分析。Acquity />CSHTMC18，1.7μm，2.1mm×50mm柱用于小分子的LCMS分析。
一般程序1：用于羧酸与胺官能化的固体载体的酰胺偶联的一般程序
将官能化的珠粒在DMF(10mL)中溶胀。将胺官能化的/>珠粒(1当量胺负载量)与二甲基甲酰胺(每0.1mmol负载量6mL)中的66.7mM相应酸(4当量)、133.3mM N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(8当量)和66.7mM N-[(二甲基氨基)-1H-1,2,3-三唑并-[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐N-氧化物(HATU)(4当量)一起在室温下在旋转振荡器上温育2小时。将官能化的/>珠粒用二甲基甲酰胺(3×10mL)、二氯甲烷(3×10mL)洗涤，然后用二甲基甲酰胺(3×10mL)洗涤。
一般程序2：用于固体载体上Fmoc脱保护的一般程序
将官能化的珠粒在DMF(10mL)中溶胀。然后将干燥的官能化珠粒与二甲基甲酰胺(每0.1mmol负载量6mL)中的20％(v/v)哌啶一起在室温下在旋转振荡器上温育30分钟。将官能化的/>珠粒用二甲基甲酰胺(3×10mL)、二氯甲烷(3×10mL)洗涤，然后用二甲基甲酰胺(3×10mL)洗涤。
一般程序3：用于酸与胺官能化的磁性固体载体的酰胺偶联的一般程序
将胺官能化的固体载体(50μL)用二甲基甲酰胺(200μL)洗涤。将胺官能化的珠粒与50mM二异丙基碳二亚胺(DIC)、50mM氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯(OxymaPure)和50mM相应酸于二甲基甲酰胺(150μL)中的溶液一起在室温下在旋转振荡器上温育4小时。将官能化的珠粒用二甲基甲酰胺(6×200μL)洗涤。
一般程序4：用于磁性固体载体上Fmoc脱保护的一般程序
将官能化的珠粒(50μL)用二甲基甲酰胺(200μL)洗涤。将官能化的珠粒与二甲基甲酰胺(200μL)中的20％(v/v)哌啶一起在室温下在旋转振荡器上温育1小时。将官能化的珠粒用二甲基甲酰胺(6×200μL)洗涤。
一般程序5：通过CuAAC方法1将5'-叠氮基修饰的单链寡核苷酸(或5'-叠氮基修饰的双链寡核苷酸)连接至固体载体
所述程序改编自MacConnell等人2015。将炔烃官能化的珠粒(20mg)在含0.034％(v/v)Tween 20的mQ水中的50％DMSO中的30mM乙酸三乙铵pH 8.5中在室温下在旋转振荡器上溶胀15分钟。使干燥的固体载体与1-5nmol 5'-叠氮基修饰的单链寡核苷酸(在实施例1中合成)在2.6mM 1-(苯基甲基)-N,N-双[[1-(苯基甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基]-1H-1,2,3-三唑-4-甲胺(TBTA)、14.0mM抗坏血酸钠和2.8mM硫酸铜于含0.035％(v/v)Tween 20的mQ水(195μL)中的48％ DMSO中的20mM乙酸三乙铵pH 8.5中的溶液中在60℃下在旋转振荡器上反应3小时。将固体载体用10mM 2,2′-(1,3-丙烷二基二亚氨基)双[2-(羟甲基)-1,3-丙二醇]、100mM氯化钠、10mM N,N'-1,2-乙烷二基双[N-(羧甲基)甘氨酸](EDTA)与1％(v/v)Tween 20和1％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，pH 7.6(3×0.6mL)的溶液洗涤。
一般程序6：通过CuAAC方法2将5'-叠氮基修饰的单链寡核苷酸连接至固体载体
将具有过量负载容量的炔烃官能化的磁性固体载体(25μL)用mQ水中的50％ DMSO(3×200μL)洗涤。使固体载体与1-5nmol 5’-叠氮基修饰的单链寡核苷酸(在实施例1中合成)在993μM 1-(苯基甲基)-N,N-双[[1-(苯基甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基]-1H-1,2,3-三唑-4-甲胺(TBTA)、945μM硫酸铜(CuSO4)和5.672mM抗坏血酸钠(NaAsc)以及100mM氯化锂于mQ水(90μL)中的42％ DMSO中的混合物中在室温下在旋转振荡器上反应1小时。将固体载体用mQ水中的50％DMSO(3×200μL)洗涤。
实施例1：5'-叠氮基修饰的单链寡核苷酸的制备
氨基修饰的ssDNA：5'd氨基C6-GGAGCTTCTGAATT 3'(序列1)
酸叠氮化物：3-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸
将3-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(300μL，100mM于DMSO中)、1-羟基-2,5-二氧代-3-吡咯烷磺酸(S-NHS)(145μL，100mM于DMSO中的33％(v/v)mQ水中)和N3-(乙基碳酰亚胺基)-N1,N1-二甲基-1,3-丙二胺(EDC)(145μL，100mM于DMSO中)添加至含有1mL二甲亚砜(DMSO)的试管中，并在37℃下在旋转振荡器上温育30分钟。与此同时，将504μL mQ水中的250nmol氨基修饰的ssDNA与350μL 250mM硼酸盐缓冲液pH 9.5一起在37℃下在旋转振荡器上温育30分钟。将含有S-NHS、EDC和3-[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸的激活溶液与硼酸盐缓冲液中的DNA合并，并在37℃下在旋转振荡器上反应45分钟。通过LCMS监测反应。通过添加20％(v/v)的5M NaCl，然后添加3.5倍体积的无水乙醇来沉淀DNA。将样品在-20℃下储存18小时，然后在4℃和4000×g下离心。丢弃上清液，并将沉淀物在Speedvac旋转真空浓缩器仪器中完全干燥。将干燥的沉淀物溶解于1mL 100mM TEAA pH 7.0中。使用Waters BEH C18 OBDTM制备柱(/>5μm，10mm x 150mm)以及缓冲液1(100mM TEAA pH 7.0缓冲液)和缓冲液2(100mM TEAA pH 7.0)于mQ水中的80％乙腈中的梯度通过RP-HPLC纯化粗产物。合并且浓缩所收集的级分，并通过添加20％(v/v)的5M NaCl、然后添加3.5倍体积的无水乙醇来沉淀寡核苷酸。将样品在-20℃下储存2小时，然后在4℃和4000×g下离心。丢弃上清液，并将沉淀物在Speedvac旋转真空浓缩器仪器中完全干燥。将干燥的沉淀物溶解于500μL mQ水中。通过在NanoDrop 2000c分光光度计上测量260nm处的UV吸光度进行的浓度评估显示61％产率。通过LCMS分析产物(图13)。在(图13B)中，示出测量产物5'-叠氮基修饰的单链寡核苷酸的260nm吸光度的色谱图。所需产物是主要产物。(图13D)示出产物峰的区卷积(decon.)质谱。观察到对应于所需产物的质量。为了进行比较，起始材料的LCMS光谱显示在(图13A)和(图13C)中。(图13A)，示出测量起始材料寡核苷酸(序列1)的260nm吸光度的色谱图。在(图13C)中示出起始材料寡核苷酸(序列1)的去卷积(decon.)质谱。
实施例2：新生文库成员制备(接头+切割基团方法)
将NH2官能化的10μm珠粒(Rapp Polymere GmbH)(385mg，0.1mmol负载量)添加至带有玻璃料的固相合成反应容器中。将/>珠粒在室温下在旋转振荡器上用二甲基甲酰胺(6mL)溶胀10分钟，然后用二甲基甲酰胺(3×10mL)洗涤。
步骤2.1与琥珀酸单叔丁酯偶联
按照一般程序1，将官能化的珠粒与琥珀酸单叔丁酯偶联。
步骤2.2加帽
将官能化的珠粒在室温下在旋转振荡器上用二氯甲烷(6mL)溶胀10分钟，然后用二氯甲烷(3×10mL)洗涤。将官能化的/>珠粒与二氯甲烷(6mL)、乙酸酐(2mL)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(2mL)的混合物一起在室温下温育1小时。将官能化的/>珠粒用DCM(3×10mL)洗涤。
步骤2.3叔丁基脱保护
向官能化的珠粒中添加50％(v/v)三氟乙酸于二氯甲烷(5mL)中的混合物。在室温下在旋转振荡器上10分钟后，去除溶液。然后，将50％(v/v)三氟乙酸于二氯甲烷(5mL)中的新鲜混合物与/>珠粒一起在室温下在旋转振荡器上温育20分钟。将树脂用二氯甲烷(3×10mL)洗涤，然后用二甲基甲酰胺(3×10mL)洗涤。
步骤2.4与N-Boc-乙二胺偶联
将官能化的珠粒在DMF(10mL)中溶胀。然后将干燥的官能化的珠粒与二甲基甲酰胺(6mL)中的N-Boc-乙二胺(63μL，0.4mmol，4当量)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(136μL，0.8mmol，8当量)和N-[(二甲基氨基)-1H-1,2,3-三唑并-[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐N-氧化物(HATU)(152mg，0.4mmol，4当量)一起在室温下在旋转振荡器上温育2小时。将官能化的/>珠粒用二甲基甲酰胺(3×10mL)、二氯甲烷(3×10mL)洗涤，然后用二甲基甲酰胺(3×10mL)洗涤。
步骤2.5Boc脱保护
向官能化的珠粒中添加50％(v/v)三氟乙酸于二氯甲烷(5mL)中的混合物。在室温下在旋转振荡器上10分钟后，去除溶液。然后，将50％(v/v)三氟乙酸于二氯甲烷(5mL)中的新鲜混合物与/>珠粒一起在室温下在旋转振荡器上温育20分钟。将树脂用二氯甲烷(3×10mL)洗涤，然后用二甲基甲酰胺(3×10mL)洗涤。
步骤2.6与6-(Fmoc-氨基)己酸偶联
将官能化的珠粒在DMF(10mL)中溶胀。然后按照一般程序1将官能化的/>珠粒与6-(Fmoc-氨基)己酸偶联。
步骤2.7Fmoc脱保护
根据一般程序2，将官能化的珠粒进行Fmoc脱保护。
步骤2.8与3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-4-(甲基氨基)苯甲酸偶联
按照一般程序1，使官能化的珠粒与3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-4-(甲基氨基)苯甲酸(Fmoc-MeDbz-OH)反应。
步骤2.9Fmoc脱保护
根据一般程序2，将官能化的珠粒进行Fmoc脱保护。
步骤2.10与6-(Fmoc-氨基)己酸偶联
按照一般程序1使官能化的珠粒与6-(Fmoc-氨基)己酸反应。
步骤2.11Fmoc脱保护
根据一般程序2，将官能化的珠粒进行Fmoc脱保护。
步骤2.12与(2S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-4-戊炔酸偶联
按照一般程序1，将官能化的珠粒与(2S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-4-戊炔酸(Fmoc-Pra-OH)偶联。
步骤2.13Fmoc脱保护
根据一般程序2，将官能化的珠粒进行Fmoc脱保护。
步骤2.14寡核苷酸连接
步骤2.1-2.13中合成的化合物是具有连接至支架的MeDbz接头的固体载体，其包含用于在胺官能团处结构单元连接的位点，以及用于核酸连接的炔烃。按照一般程序5，将5nmol 5'-叠氮基修饰的单链寡核苷酸(在实施例1中合成)连接至官能化的TentaGel(步骤2.1-2.13，20mg)。
用于LCMS分析的新生文库成员切割
步骤2.15MeDbz接头激活步骤1–与氯甲酸对硝基苯酯一起温育
将连接有寡核苷酸的官能化的珠粒(20mg)与二氯甲烷(600μL)中的100mM氯甲酸对硝基苯酯一起在室温下在旋转振荡器上温育30分钟。用二氯甲烷(3×600μL)洗涤树脂。
步骤2.16MeDbz接头激活步骤2–与N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)一起温育
将连接有寡核苷酸的官能化的珠粒(20mg)与二氯甲烷(600μL)中的8.7％(v/v)N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)一起在室温下在旋转振荡器上温育30分钟。用二氯甲烷(2×600μL)洗涤树脂。
步骤2.17通过半胱胺进行的MeDbz切割
将连接有寡核苷酸的官能化的珠粒(20mg)与含0.01％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)的mQ水(150μL)中的50％(v/v)DMSO中的过量半胱胺一起在60℃下在旋转振荡器上温育1小时。通过离心将所得溶液与珠粒分离并收集。将收集的溶液通过LCMS进行分析(图14)。图14示出新生文库成员的切割的分析型LCMS数据。(图14A)和(图14B)示出测量260nm吸光度的色谱图。(图14C)和(图14D)分别示出产物峰在3.80分钟处的质谱和去卷积质谱。这些LCMS光谱表明获得了所需的新生文库成员。在较晚的保留时间观察到的大峰是当时在所述机器上的所有LCMS测量中观察到的LCMS杂质。
实施例3：脱DNA的自洗脱模型化合物的合成
在步骤2.1-2.13中制备的官能化固体载体用作合成脱DNA的自洗脱模型化合物的起始材料。将官能化的珠粒在室温下在旋转振荡器上用二甲基甲酰胺(6mL)溶胀10分钟，然后用二甲基甲酰胺(3×10mL)洗涤。
步骤3.1树脂分离
将步骤2.1-2.13中制备的官能化的珠粒分离成两个0.05mmol部分。合成用两个部分中的一个以0.05mmol规模继续进行。
步骤3.2与6-(Fmoc-氨基)己酸偶联
按照一般程序1使官能化的珠粒与6-(Fmoc-氨基)己酸反应。
步骤3.3Fmoc脱保护
根据一般程序2，将官能化的珠粒进行Fmoc脱保护。
步骤3.4与(2S)-2-([[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基]氨基)-3-(萘-1-基)丙酸偶联
按照一般程序1使官能化的珠粒与(2S)-2-([[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基]氨基)-3-(萘-1-基)丙酸(Fmoc-1-Nal-OH)反应。
步骤3.5树脂分离
将官能化的珠粒分离成两个0.025mmol部分。合成用两个部分中的一个以0.025mmol规模继续进行。
步骤3.6Fmoc脱保护
根据一般程序2，将官能化的珠粒进行Fmoc脱保护。
步骤3.7与(RS)-硫辛酸偶联
按照一般程序1使官能化的珠粒与(RS)-硫辛酸反应。
实施例4：模型核酸编码的文库成员的自洗脱
步骤4.1寡核苷酸连接
按照一般程序5，将5nmol 5'-叠氮基修饰的单链寡核苷酸连接至实施例3中合成的自洗脱模型化合物(20mg)。
步骤4.2MeDbz接头激活步骤1–与氯甲酸对硝基苯酯一起温育
将连接有寡核苷酸的官能化的珠粒(20mg)与二氯甲烷(600μL)中的100mM氯甲酸对硝基苯酯一起在室温下在旋转振荡器上温育30分钟。用二氯甲烷(3×600μL)洗涤树脂。
步骤4.3MeDbz接头激活步骤2–与N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)一起温育
将官能化的珠粒与二氯甲烷(600μL)中的8.7％(v/v)N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)一起在室温下在旋转振荡器上温育30分钟。用二氯甲烷(3×600μL)洗涤树脂。
步骤4.4切割基团脱保护
将官能化的珠粒在100mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)于含0.01％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)的mQ水pH 8-9(150μL)中的6％(v/v)三乙胺、53％二甲基亚砜(DMSO)中的溶液中在60℃下旋转振荡器上温育1小时。将珠粒通过离心干燥。
步骤4.5模型核酸编码的文库成员的自洗脱
将官能化的珠粒与10％(v/v)N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)于含0.01％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)的mQ水(150μL)中的80％乙腈中的溶液一起在60℃下在旋转振荡器上温育1小时。通过离心将所得溶液与珠粒分离并收集。使用Speedvac旋转真空浓缩器仪器浓缩所收集的溶液。
步骤4.6自洗脱模型核酸编码的文库成员的乙醇沉淀
将步骤4.5后获得的残余物重悬于mQ水(150μL)中的50％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)中。过滤样品并将10μL样品用于LCMS分析。125μL的样品用于通过添加10％(v/v)的5M氯化钠(12.5μL)、10％(v/v)的2.5M乙酸钠缓冲液pH 4.79(12.5μL)、然后3.5体积的无水乙醇(525μL)来使自洗脱模型核酸编码的文库成员乙醇沉淀。将样品在-20℃下储存18小时，然后在4℃和20800×g下离心1小时。丢弃上清液，并将沉淀物在Speedvac旋转真空浓缩器仪器中完全干燥。将干燥的沉淀物溶解于mQ水(100μL)中。LCMS分析显示自洗脱模型核酸编码的文库成员的质量(图19、图20)。在260nm(图19C)和280nm(图19D)吸光度下的色谱图中观察到化学结构(图19A)和(图19B)。(图19B)是通过环状硫酯中间体的水解形成的直链自洗脱产物。(图19A)是通过环状硫酯中间体经乙醇开环形成的直链自洗脱产物，其被添加用于沉淀步骤。所观察到的化合物可通过巯基团的氧化以形成分子内二硫键而形成。(图20A)和(图20B)分别示出(图19A)中所示的自洗脱文库成员化合物的质谱和去卷积质谱。(图20C)和(图20D)分别示出(图19B)中所示的自洗脱文库成员化合物的质谱和去卷积质谱。这些数据表明实现了自洗脱。
实施例5：模型核酸编码的文库成员的自洗脱
步骤5.1寡核苷酸连接
按照一般程序5，将5nmol的5'-叠氮基修饰的单链寡核苷酸连接至实施例3中合成的自洗脱模型化合物(20mg)。
步骤5.1MeDbz接头激活步骤1–与氯甲酸对硝基苯酯一起温育
将连接有寡核苷酸的官能化的珠粒(20mg)与二氯甲烷(600μL)中的100mM氯甲酸对硝基苯酯一起在室温下在旋转振荡器上温育30分钟。用二氯甲烷(3×600μL)洗涤树脂。
步骤5.2MeDbz接头激活步骤2–与N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)一起温育
将官能化的珠粒与二氯甲烷(600μL)中的8.7％(v/v)N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)一起在室温下在旋转振荡器上温育30-40分钟。用二氯甲烷(3×600μL)洗涤树脂。
步骤5.3切割基团脱保护
将官能化的珠粒在100mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)于含0.01％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)的mQ水pH 8-9中的6％(v/v)三乙胺、53％二甲基亚砜(DMSO)中的溶液中在60℃下旋转振荡器上温育1小时。将珠粒通过离心干燥。
步骤5.4模型核酸编码的文库成员的自洗脱
将官能化的珠粒与10％(v/v)N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)于二氯甲烷(150μL)中的溶液一起在60℃下在旋转振荡器上温育1小时。然后将珠粒通过离心干燥。将珠粒用1mM碳酸钠(Na2CO3)于含0.01％SDS的mQ水pH 9中的49％DMSO中的溶液洗涤，并通过LCMS分析通过离心收集的所得溶液(图21，图22)。(图21A)示出两个可能的环状自洗脱核酸编码的文库成员的结构。(图21B)是260nm处的色谱图，并且(图21C)是TIC。在5.88分钟处观察到具有与环状自洗脱文库成员对应的质量的峰。(图22B)和(图22C)分别是自洗脱核酸文库成员的峰的质谱和相应的去卷积质谱。观察到所需的环状自洗脱核酸编码的文库成员的质量，这表明实现了自洗脱。
实施例6：模型核酸编码的文库成员的自纯化
步骤6.1Dbz接头衍生物合成
在圆底烧瓶中将4-氨基-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]苯甲酸(Fmoc-Dbz-OH)(200mg，0.534mmol，1.0当量)溶解于10mL二甲基甲酰胺(DMF)中。添加炔丙胺(68.3μL，1.068mmol，2.0当量)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(372μL，2.137mmol，4.0当量)和N-[(二甲基氨基)-1H-1,2,3-三唑并-[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐N-氧化物(HATU)(407mg，1.068mmol，2.0当量)，并将溶液在室温下搅拌2小时。将反应混合物用水淬灭。用乙酸乙酯萃取水性组分。将合并的有机组分在减压下浓缩。将粗产物通过快速柱色谱(70％(v/v)于己烷中的乙酸乙酯)纯化，得到白色固体。
将上述产物在THF(10mL)中的20％(v/v)二乙胺中在室温下搅拌5小时。将反应混合物在减压下浓缩。粗反应产物用于连接至固体载体。
新生文库成员的制备
步骤6.2与N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N6-[(4-甲基苯基)二苯基甲基]-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Mtt)-OH)偶联
按照一般程序3将胺官能化的固体载体(官能化的1，BangsLabarotories，Inc.)(50μL)偶联至N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N6-[(4-甲基苯基)二苯基甲基]-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Mtt)-OH)。
步骤6.3Fmoc脱保护
按照一般程序4，将官能化的珠粒(50μL)进行Fmoc脱保护。
步骤6.4与4-(羟甲基)苯甲酸(HMBA)偶联
按照一般程序3，将胺官能化的固体载体(50μL)偶联至4-(羟甲基)苯甲酸(HMBA)。
步骤6.5与(2S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-4-戊炔酸(Fmoc-Pra-OH)偶联
将醇官能化的固体载体(50μL)用二甲基甲酰胺(200μL)洗涤。将官能化的珠粒与100mM二异丙基碳二亚胺(DIC)、5.76mM DMAP和80mM(2S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-4-戊炔酸(Fmoc-Pra-OH)于二甲基甲酰胺(150μL)中的溶液一起在4℃下在旋转振荡器上温育4小时。将官能化的珠粒用二甲基甲酰胺(6×200μL)洗涤。
步骤6.6Fmoc脱保护
按照一般程序4，将官能化的珠粒(50μL)进行Fmoc脱保护。
步骤6.7与1-(1,1-二甲基乙基)丁二酸酯结构单元偶联
按照一般程序3，将胺官能化的固体载体(50μL)偶联至1-(1,1-二甲基乙基)丁二酸酯。
步骤6.8Mtt脱保护和tBu脱保护
将官能化的珠粒(50μL)与二氯甲烷(600μL)中的50％(v/v)三氟乙酸一起在室温下在旋转振荡器上温育3分钟(步骤重复3次)。将官能化的珠粒用二甲基甲酰胺中的10％(v/v)N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(3×200μL)洗涤，然后用二甲基甲酰胺(3×200μL)洗涤。
步骤6.9寡核苷酸连接至固体载体
按照一般程序6，使用双倍规定体积，将5nmol 5'-叠氮基修饰的单链寡核苷酸(在实施例1中合成)连接至炔烃官能化的珠粒(50μL)。
步骤6.10小分子炔烃淬灭
使DNA连接后的官能化珠粒(50μL)经受含苄基叠氮化物的CuAAC条件以淬灭任何未反应的炔烃官能团。将官能化的固体载体(50μL)用二甲亚砜(DMSO)(3×200μL)洗涤。将固体载体在50mM苄基叠氮化物、993μM 1-(苯基甲基)-N,N-双[[1-(苯基甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基]-1H-1,2,3-三唑-4-甲胺(TBTA)、945μM硫酸铜(CuSO4)和5.672mM抗坏血酸钠(NaAsc)于mQ水(360μL)中的89％二甲基亚砜(DMSO)中的混合物中在室温下在旋转振荡器上温育1小时。将固体载体用DMSO(3×200μL)洗涤。保留5μL官能化的固体载体用于分析。
接头2的安装
步骤6.11与5-叠氮基戊酸偶联(固体载体上的DNA上反应)
N3-(乙基碳酰亚胺基)-N1,N1-二甲基-1,3-丙二胺(EDC)和1-羟基-2,5-二氧代-3-吡咯烷磺酸(S-NHS)的50mg/mL储备液在100mM2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液pH 4.5中制备。将40μL的每种储备液与120μL的于二甲基甲酰胺(DMF)中的450mM 5-叠氮基戊酸混合，最终体积为200μL。将溶液在室温下温育15小时。然后将溶液添加至官能化的珠粒(45μL)中，并将反应物在室温下放置在旋转振荡器上静置2小时。将官能化的珠粒用二甲基甲酰胺(DMF)(3×200μL)洗涤。
步骤6.12与反向Dbz接头2偶联(固体载体上的DNA上反应)
保留5μL官能化的固体载体用于分析。用二甲基甲酰胺(DMF)(200μL)洗涤剩余的官能化的固体载体(40μL)。将官能化的珠粒与360mM胺(在步骤6.1中制备的反向Dbz接头)、360mM HATU和1.50M DIPEA于40℃的二甲基甲酰胺(DMF)(100μL)中的溶液一起在室温下在旋转振荡器上温育1小时。将官能化的珠粒用二甲基甲酰胺(DMF)(3×200μL)洗涤。
步骤6.13来自固体载体的10μL珠粒的寡核苷酸切割用于LCMS分析
将一部分官能化的固体载体(10μL)与100mM氢氧化锂(LiOH)在mQ水(60μL)中的25％二甲亚砜(DMSO)中在40℃下在旋转振荡器上温育1小时。过滤样品并通过LCMS进行分析(图29A)。LCMS光谱显示HMBA接头的切割产生所需的中间体，在色谱图(A)中4.01分钟处所示(图29A)。所需中间体的化学结构显示在(图29A)中。此外，所分析的样品包含不需要的中间产物。例如，这些可以是在合成中未经历先前酰胺偶联步骤的化合物。
步骤6.14通过CuAAC环化
将剩余官能化的固体载体(30μL)用二甲亚砜(DMSO)(3×200μL)洗涤。将固体载体在993μM1-(苯基甲基)-N,N-双[[1-(苯基甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基]-1H-1,2,3-三唑-4-甲胺(TBTA)、945μM硫酸铜(CuSO4)和5.672mM抗坏血酸钠(NaAsc)于mQ水(270μL)中的89％DMSO中的混合物中在室温下在旋转振荡器上温育1小时。将固体载体用DMSO(3×200μL)洗涤。
自纯化
步骤6.15接头1的切割
对于官能化的固体载体(30μL)，将HMBA接头1在mQ水(60μL)中的25％DMSO中在40℃下在旋转振荡器上通过100mM氢氧化锂(LiOH)切割1.5小时。此溶液的LCMS分析表明，在此步骤中，不需要的产物从固体载体切割(图29B)。色谱图(图29B)与色谱图(图29A)的比较表明，除了在步骤6.12中形成的所需中间体之外，所有化合物都在步骤6.15中从固体载体切割，因为此化合物包含炔烃并且在步骤6.15中切割之前经历了CuAAC反应。这说明CuAAC反应已经成功，并且在此步骤中只有不需要的产物从固体载体释放。
步骤6.16接头2的切割(末端接头)
通过在mQ水(200μL)中与36mM亚硝酸异戊酯在室温下在旋转振荡器上温育1.5小时，将官能化的固体载体(30μL)上的Dbz接头2激活。用mQ水(2x200μL)洗涤固体载体。将激活的接头在mQ水(60μL)中的25％DMSO中的100mM氢氧化锂(LiOH)中切割。LCMS分析显示所需的自纯化核酸编码的文库成员(图29C，图30)。图29C示出切割第二接头Dbz后获得的样品的色谱图。色谱图显示自纯化核酸编码的文库成员。示出所需的自纯化核酸编码的文库成员的结构(图29C)。图30A示出260nm吸光度的色谱图。图30B示出280nm吸光度的色谱图。图30C示出3.94分钟处的产物峰的质谱。图30D示出3.94分钟处的产物峰的去卷积质谱。观察到对应于所需的自纯化模型核酸编码的文库成员的质量。所需的自纯化模型核酸编码的文库成员是步骤6.16中获得的主要产物。
实施例7：模型核酸编码的文库成员的自纯化
步骤7.1与N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N6-[(4-甲基苯基)二苯基甲基]-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Mtt)-OH)偶联
按照一般程序3将胺官能化的固体载体(官能化的1，BangsLabarotories，Inc.)(50μL)偶联至N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N6-[(4-甲基苯基)二苯基甲基]-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Mtt)-OH)。
步骤7.2Fmoc脱保护
按照一般程序4，将官能化的珠粒(50μL)进行Fmoc脱保护。
步骤7.3与4-(羟甲基)苯甲酸(HMBA)偶联
按照一般程序3，将胺官能化的固体载体(50μL)偶联至4-(羟甲基)苯甲酸(HMBA)。
步骤7.4与(2S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-4-戊炔酸(Fmoc-Pra-OH)偶联
将醇官能化的固体载体(50μL)用二甲基甲酰胺(DMF)(200μL)洗涤。将官能化的珠粒与100mM二异丙基碳二亚胺(DIC)、5.76mM N,N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)和80mM(2S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-4-戊炔酸(Fmoc-Pra-OH)于二甲基甲酰胺(150μL)中的溶液一起在4℃下在旋转振荡器上温育4小时。将官能化的珠粒用二甲基甲酰胺(DMF)(6×200μL)洗涤。
步骤7.5Fmoc脱保护
按照一般程序4，将官能化的珠粒(50μL)进行Fmoc脱保护。
步骤7.6与Fmoc-Dbz-OH偶联
按照一般程序3，将胺官能化的固体载体(50μL)与4-氨基-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]苯甲酸(Fmoc-Dbz-OH)偶联。
步骤7.7Mtt脱保护
将官能化的珠粒(50μL)与二氯甲烷(600μL)中的50％(v/v)三氟乙酸一起在室温下在旋转振荡器上温育3分钟(步骤重复3次)。将官能化的珠粒用二甲基甲酰胺中的10％(v/v)N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(3×200μL)洗涤，然后用二甲基甲酰胺(3×200μL)洗涤。
步骤7.8寡核苷酸连接至固体载体
按照一般程序6，使用双倍规定体积，将5nmol 5'-叠氮基修饰的单链寡核苷酸(在实施例1中合成)连接至炔烃官能化的珠粒(50μL)。
步骤7.9小分子炔烃淬灭
使DNA连接后的官能化珠粒(50μL)经受含苄基叠氮化物的CuAAC条件以淬灭任何未反应的炔烃官能团。将官能化的固体载体(50μL)用DMSO(3×200μL)洗涤。将固体载体在50mM苄基叠氮化物、993μM 1-(苯基甲基)-N,N-双[[1-(苯基甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基]-1H-1,2,3-三唑-4-甲胺(TBTA)、945μM硫酸铜(CuSO4)和5.672mM抗坏血酸钠(NaAsc)于mQ水(360μL)中的89％ DMSO中的混合物中在室温下在旋转振荡器上温育1小时。将固体载体用DMSO(3×200μL)洗涤。保留5μL官能化的固体载体用于分析。
步骤7.10与5-叠氮基戊酸偶联(固体载体上的DNA上反应)
N3-(乙基碳酰亚胺基)-N1,N1-二甲基-1,3-丙二胺(EDC)和1-羟基-2,5-二氧代-3-吡咯烷磺酸(S-NHS)的50mg/mL储备液在100mM2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液pH 4.5中制备。将40μL的每种储备液与120μL的于二甲基甲酰胺中的450mM 5-叠氮基戊酸混合，最终体积为200μL。将溶液在室温下温育15小时。然后将溶液添加至官能化的珠粒(45μL)中，并将反应物在室温下放置在旋转振荡器上静置2小时。将官能化的珠粒用二甲基甲酰胺(3×200μL)洗涤。保留5μL官能化的固体载体用于分析。
步骤7.11Fmoc脱保护
使用80％的规定体积，按照一般程序4，将官能化的珠粒(40μL)进行Fmoc脱保护。
步骤7.12与5-己炔酸偶联
将官能化的固体载体(40μL)用DMSO(200μL)洗涤。将固体载体在5mM 3-羟基-3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶(HOAt)、500mM 5-己炔酸和50mM N3-(乙基碳酰亚胺)-N1,N1-二甲基-1,3-丙二胺(EDC)于DMSO(500μL)中的溶液中在室温下在旋转振荡器上温育2小时。将固体载体用DMSO(3×200μL)洗涤。
保留10μL官能化的固体载体用于分析。
步骤7.13通过CuAAC环化
将炔烃和叠氮化物官能化的固体载体(30μL)用DMSO(3×200μL)洗涤。
将固体载体在993μM1-(苯基甲基)-N,N-双[[1-(苯基甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基]-1H-1,2,3-三唑-4-甲胺(TBTA)、945μM硫酸铜(CuSO4)和5.672mM抗坏血酸钠(NaAsc)于mQ水(360μL)中的89％DMSO中的混合物中在室温下在旋转振荡器上温育1小时。将固体载体用DMSO(3×200μL)洗涤。
自纯化
步骤7.14接头1的切割
对于官能化的固体载体(30μL)，将HMBA接头1在mQ水(60μL)中的25％ DMSO中在40℃下在旋转振荡器上通过100mM氢氧化锂(LiOH)切割1.5小时。
步骤7.15接头2的切割(末端接头)
对于官能化的固体载体(30μL)，通过在mQ水(200μL)中与36mM亚硝酸异戊酯在室温下在旋转振荡器上温育2小时，将Dbz接头2激活。用mQ水(2x200μL)洗涤固体载体。将激活的接头在mQ水(60μL)中的25％DMSO中的100mM氢氧化锂(LiOH)中切割。通过LCMS分析切割溶液(图36)。图36A示出260nm吸光度的色谱图。图36B示出280nm吸光度的色谱图。图36C示出3.97分钟处的产物峰的质谱。图36D示出3.97分钟处的产物峰的去卷积质谱。观察到对应于所需的自纯化模型核酸编码的文库成员的质量。此实施例另外表明Dbz接头在切割之前已被激活。
实施例8：固体载体上的DNA连接
衔接子(序列3)：
3’-CCTCGAAGACTTAAGACACACGAC-5’
代码(序列4)：
5'd Phos-CTGTGTGCTGACAGCTCGAGTCCCATGGCGC 3'
分子量＝9584.16Da，ε260＝280300M-1cm-1
步骤8.1与乙二胺偶联
将羧酸官能化的磁性固体载体(1，Bangs Labarotories，Inc.)(25μL)用DMSO(1×1mL)和二甲基甲酰胺(DMF)(2×1mL)洗涤。将官能化的珠粒与360mM HATU、360mM乙二胺和1.1MDIPEA在DMF(25μL，2×30分钟)中温育。将官能化的珠粒用二甲基甲酰胺(3×200μL)洗涤。
步骤8.2与4-(羟甲基)苯甲酸(HMBA)偶联
使用相应规定体积的一半，按照一般程序3，将胺官能化的固体载体(25μL)偶联至4-(羟甲基)苯甲酸(HMBA)。
步骤8.3与N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N6-[(4-甲基苯基)二苯基甲基]-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Mtt)-OH)偶联
使用相应规定体积的一半，按照一般程序3，将胺官能化的固体载体(25μL)偶联至N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N6-[(4-甲基苯基)二苯基甲基]-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Mtt)-OH)。
步骤8.4Fmoc脱保护
使用相应规定体积的一半，按照一般程序4，将官能化的珠粒(25μL)进行Fmoc脱保护。
步骤8.5与1-(9H-芴-9-基甲基)5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七烷二酸酯(Fmoc-PEG4-OH)偶联
使用相应规定体积的一半，按照一般程序3，将胺官能化的固体载体(25μL)偶联至1-(9H-芴-9-基甲基)5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七烷二酸酯(Fmoc-PEG4-OH)。
步骤8.6Fmoc脱保护
使用相应规定体积的一半，按照一般程序4，将官能化的珠粒(25μL)进行Fmoc脱保护。
步骤8.7与5-己炔酸偶联
使用相应规定体积的一半，按照一般程序3，将胺官能化的固体载体(25μL)偶联至5-己炔酸。
步骤8.8Mtt脱保护
将官能化的珠粒(25μL)与二氯甲烷(300μL)中的50％(v/v)三氟乙酸一起在室温下在旋转振荡器上温育3分钟(步骤重复3次)。将官能化的珠粒用二甲基甲酰胺中的10％(v/v)N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(3×200μL)洗涤，然后用二甲基甲酰胺(3×200μL)洗涤。
步骤8.9寡核苷酸连接至固体载体
按照一般程序6，将1nmol 5'-叠氮基修饰的单链寡核苷酸(在实施例1中合成)连接至官能化的固体载体(25μL)，但不使用任何氯化锂。
步骤8.10固体载体上的连接
用于连接的程序改编自Pengpumkiat等人2016。将官能化的固体载体用10mMTris、1mM EDTA、2M NaCl和0.05％(v/v)Tween 20，pH 7.4(1×200μL)的溶液洗涤。然后用mQ水(2×200μL)洗涤官能化的固体载体。向官能化的固体载体(25μL)中添加90μL mQ水中的1.9nmol衔接子(序列3)，以及100mM Tris、500mM NaCl、10mM EDTA，pH 7.4的10μL溶液。将混合物加热至95℃持续10分钟。将样品冷却至室温1小时。将1.5nmol代码(序列4)、17μLmQ水、2μL的10×T4连接酶缓冲液(500mM Tris-HCl、100mM MgCl2、10mM ATP、100mM DTT，pH7.5，New England Biolabs)和600U(1μL)T4 DNA连接酶(New England Biolabs)添加至混合物中，并在室温下进行连接18小时。用TE缓冲液(10mM Tris、1mM EDTA和0.05％(v/v)Tween 20，pH 7.4)洗涤官能化的固体载体。
步骤8.11从固体载体切割寡核苷酸用于LCMS分析
将官能化的固体载体(25μL)与100mM氢氧化锂(LiOH)在mQ水(60μL)中的25％DMSO中在40℃下在旋转振荡器上温育1小时。过滤样品并通过LCMS进行分析(图37，图38)。(图37A)示出固体载体上的DNA连接的示意图。通过使用衔接子寡核苷酸和T4 DNA连接酶，将代码连接至与固体载体连接的寡核苷酸。260nm吸光度的LCMS色谱图(图37B)是通过在连接条件后切割酯接头而获得的(步骤8.11)。可在4.47分钟处观察到连接产物。另外观察到剩余的衔接子、代码和未连接的起始材料。图37C示出连接产物峰的去卷积质谱。观察到所需连接产物的质量。图38示出图37B中所示的LCMS色谱图的(图38A)衔接子寡核苷酸、(图38B)代码和(图38C)起始材料峰的去卷积质谱。
实施例9：固体载体上的DNA上反应
使用羧酸官能化的固体载体(官能化的1，Bangs Laboratories，Inc.)。
步骤9.1与N-Boc-乙醇胺偶联
将羧酸官能化的磁性固体载体(50μL)用DMSO(1×1mL)和二甲基甲酰胺(2×1mL)洗涤。将官能化的珠粒与360mM HATU、360mM N-Boc-乙醇胺和1.1M DIPEA在DMF(25μL，2×30分钟)中温育。将官能化的珠粒用二甲基甲酰胺(DMF)(3×200μL)洗涤。
步骤9.2Boc脱保护
将官能化的珠粒(50μL)与二氯甲烷(600μL)中的50％(v/v)三氟乙酸一起在室温下在旋转振荡器上温育5分钟。然后将珠粒与二氯甲烷(600μL)中的50％(v/v)三氟乙酸的新鲜溶液在室温下在旋转振荡器上温育15分钟。将官能化的珠粒用1×PBS pH 7.4(3×600μL)洗涤，然后用二甲基甲酰胺(3×600μL)洗涤。
步骤9.3与(2S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-4-戊炔酸(Fmoc-Pra-OH)偶联
按照一般程序3，将胺官能化的固体载体(50μL)与(2S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-4-戊炔酸(Fmoc-Pra-OH)偶联。
步骤9.4Fmoc脱保护
按照一般程序4，将官能化的珠粒(50μL)进行Fmoc脱保护。
步骤9.5寡核苷酸连接至固体载体
按照一般程序6，使用双倍相应规定体积，将2nmol 5'-叠氮基修饰的单链寡核苷酸(在实施例1中合成)连接至炔烃官能化的珠粒(50μL)。
步骤9.6来自固体载体的25μL珠粒的寡核苷酸切割用于LCMS分析
将一半官能化的固体载体(25μL)与100mM氢氧化锂(LiOH)在mQ水(60μL)中的25％DMSO中在40℃下在旋转振荡器上温育1小时。过滤样品并通过LCMS进行分析。图40A示出在260nm处的色谱图，以及起始材料的化学结构。图40A中观察到的主峰对应于所需的起始材料。色谱图(图40A)中主峰的保留时间处的去卷积质谱显示在图40C中。观察到对应于所需起始材料的质量。
步骤9.7与5-叠氮基戊酸偶联(固体载体上的DNA上反应)
使用剩余一半的在步骤9.5中制备的官能化的固体载体(25μL)。N3-(乙基碳酰亚胺基)-N1,N1-二甲基-1,3-丙二胺(EDC)和1-羟基-2,5-二氧代-3-吡咯烷磺酸(S-NHS)的50mg/mL储备液在100mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液pH 4.5中制备。将20μL的每种储备液与60μL的于二甲基甲酰胺(DMF)中的450mM 5-叠氮基戊酸混合，最终体积为100μL。将溶液在室温下温育15小时。然后将溶液添加至官能化的珠粒(25μL)中，并将反应物在室温下放置在旋转振荡器上静置2小时。将官能化的珠粒用二甲基甲酰胺(DMF)(3x 200μL)洗涤。
步骤9.8从固体载体切割寡核苷酸用于LCMS分析
将在步骤9.7中制备的官能化的固体载体(25μL)与100mM氢氧化锂(LiOH)在mQ水(60μL)中的25％二甲基亚砜(DMSO)中在40℃下在旋转振荡器上温育1小时。过滤样品并通过LCMS进行分析。图40B示出在260nm处的色谱图，以及所需产物的化学结构。图40B中观察到的主峰对应于所需产物。色谱图(图40B)中主要产物的保留时间处的去卷积质谱图显示在图40D中。观察到对应于所需产物的质量。这一实例表明，化学转化可在DNA上的固体载体上以高转化率进行。
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Claims (53)

1.一种用于产生核酸编码的化合物的方法，所述方法包括以下步骤；
提供包含通过接头连接至固体载体的支架的新生化合物，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生化合物以形成连接至所述支架的化学部分，
将编码所述一个或多个化学结构单元的编码寡核苷酸共价连接至所述新生化合物以形成连接至所述支架的编码核酸部分，
将切割基团连接至所述化学部分、编码核酸部分或支架，
使所述接头与所述切割基团反应，使得所述接头被切割并且所述化合物从所述固体载体释放。
2.一种用于产生核酸编码的化学文库的方法，对于每个文库成员，所述方法包括以下步骤；
提供包含通过接头连接至固体载体的支架的新生成员，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生成员以形成连接至所述支架的化学部分，
将编码所述一个或多个化学结构单元的编码寡核苷酸共价连接至所述新生成员以形成连接至所述支架的编码核酸部分，
将切割基团连接至所述化学部分、编码核酸部分或支架，
使所述接头与所述切割基团反应，使得所述接头被切割并且所述成员从所述固体载体释放。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述新生成员的所述支架通过第一接头和第二接头连接至所述固体载体，并且所述方法还包括；
将第一切割基团和第二切割基团连接至所述新生化合物化学部分或支架，
使第一接头与第一切割基团反应，使得所述第一接头被切割，
使所述第二接头与所述第二切割基团反应，使得所述第二接头被切割并且所述化合物或成员从所述固体载体释放。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述切割基团连接至所述化学部分或所述支架。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述切割基团共价连接至所述化学部分的末端化学结构单元。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述切割基团通过包括以下的方法连接至所述化学部分或支架；
将锚寡核苷酸连接至所述化学部分或支架，
提供共价连接至切割基团的辅助寡核苷酸，
使所述辅助寡核苷酸与所述锚寡核苷酸杂交，以及
使所述接头与所述切割基团反应，使得所述接头被切割。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述切割基团连接至所述编码核酸部分。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述切割基团通过包括以下的方法连接至所述编码核酸部分；
提供共价连接至切割基团的辅助寡核苷酸，
使共价连接至所述切割基团的所述辅助寡核苷酸与所述编码核酸部分杂交，以及
使所述接头与所述切割基团反应，使得所述接头被切割。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述接头在与所述切割基团反应之前被激活。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述切割基团在与所述接头反应之前被激活。
11.一种用于产生核酸编码的化合物的方法，所述方法包括；
提供包含通过第一接头连接至固体载体的支架的新生化合物，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生化合物以形成连接至所述支架的化学部分，
将编码所述一个或多个化学结构单元的编码寡核苷酸共价连接至所述新生化合物以形成连接至所述支架的编码核酸部分，
用第二接头将所述化合物的所述化学部分连接至所述固体载体，
切割所述第一接头，
切割所述第二接头，使得所述化合物从所述固体载体释放。
12.一种用于产生核酸编码的化学文库的方法，对于每个文库成员，所述方法包括以下步骤；
提供包含通过第一接头连接至固体载体的支架的新生成员，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生成员以形成连接至所述支架的化学部分，
将编码所述一个或多个化学结构单元的编码寡核苷酸共价连接至所述新生成员以形成连接至所述支架的编码核酸部分，
用第二接头将所述成员的所述化学部分连接至所述固体载体，
切割所述第一接头，
切割所述第二接头，使得所述成员从所述固体载体释放。
13.根据权利要求11和权利要求12所述的方法，其中所述第二接头连接所述固体载体与所述支架或所述核酸部分。
14.根据权利要求2至13中任一项所述的方法，其中所述核酸编码的化学文库通过包括以下步骤的方法产生；
将新生成员或核酸编码的文库中间体分离至单独的区室中，
连接一个或多个化学结构单元，
连接一个或多个编码所述化学结构单元的编码寡核苷酸，
以及将来自单独区室的成员或中间体汇集到一个或多个区室中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所连接的所述化学结构单元和所述编码寡核苷酸对于不同区室中的成员或中间体是不同的。
16.一种方法，所述方法包括重复如权利要求14或15所述的步骤一次或多次。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，其中所述第一接头和所述第二接头是正交可切割的。
18.根据权利要求11至17中任一项所述的方法，其中所述第一接头和/或所述第二接头在切割前被激活。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述化学结构单元顺序地连接至所述新生成员以形成所述化学部分。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中包括将第一化学结构单元共价连接至所述支架。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述支架包含捕获基团，并且所述方法包括使第一化学结构单元与所述捕获基团反应以将所述第一化学结构单元共价连接至所述支架。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一化学结构单元包含近端结合基团，并且所述方法包括使所述近端结合基团与所述支架的所述捕获基团反应以将所述第一化学结构单元共价连接至所述支架。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述捕获基团受保护，并且所述方法包括在连接所述化学部分的所述第一化学结构单元之前使所述支架的所述捕获基团脱保护。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述方法包括使未共价连接至所述第一化学结构单元的未反应的捕获基团加帽。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，所述方法包括将第二化学结构单元共价连接至所述第一化学结构单元以形成在末端位置具有所述第二化学结构单元的化学部分。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一化学结构单元包含远端结合基团，并且所述方法包括使所述第二化学结构单元与所述第一化学结构单元的所述远端结合基团反应以将所述第二化学结构单元共价连接至所述第一化学结构单元。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述第二化学结构单元包含近端结合基团，并且所述方法包括使所述第二化学结构单元的所述近端结合基团与所述第一化学结构单元的所述远端结合基团反应以将所述第二化学结构单元共价连接至所述第一化学结构单元。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中所述第一化学结构单元的所述远端结合基团受保护，并且所述方法包括在连接所述第二化学结构单元之前使所述第一化学结构单元的所述远端结合基团脱保护。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述方法包括使未共价连接至所述第二化学结构单元的所述第一化学结构单元的未反应的远端结合基团加帽。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，所述方法包括将另一化学结构单元附接至所述化学部分的所述末端位置处的所述化学结构单元。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在所述末端位置处的所述化学结构单元包含远端结合基团，并且所述方法包括使所述另一化学结构单元与在所述末端位置处的所述化学结构单元的所述远端结合基团反应以共价连接所述另一化学结构单元以形成具有所述末端位置处的所述另一化学结构单元的化学结构单元的链。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述另一化学结构单元包含近端结合基团，并且所述方法包括使所述另一化学结构单元的所述近端结合基团与在所述末端位置处的所述化学结构单元的所述远端结合基团反应以共价连接所述另一化学结构单元。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中在所述末端位置处的所述化学结构单元的所述远端结合基团受保护，并且所述方法包括在连接所述另一化学结构单元之前使在所述末端位置处的所述化学结构单元的所述远端结合基团脱保护。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使未共价连接至所述另一化学结构单元的未反应的远端结合基团加帽。
35.一种方法，所述方法包括重复如权利要求30至34所述的步骤一次或多次。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中将编码每个化学结构单元的编码寡核苷酸顺序地添加至所述新生成员以形成所述编码核酸部分，其中在将化学结构单元添加至所述新生结合成员之前、之后或同时将编码所述化学结构单元的所述编码寡核苷酸添加至所述新生成员。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述方法包括将编码所述第一化学结构单元的第一编码寡核苷酸共价连接至所述支架。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述支架包含附接寡核苷酸，并且所述方法包括将所述第一编码寡核苷酸共价连接至所述连接寡核苷酸以形成连接至所述支架的编码核酸部分。
39.根据权利要求37至38所述的方法，所述方法包括将编码所述第二化学结构单元的第二编码寡核苷酸共价连接至所述编码核酸部分。
40.根据权利要求39所述的方法，所述方法包括将一个或多个编码另外化学结构单元的另外编码寡核苷酸连接至所述编码核酸部分。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，所述方法包括使所述化学部分中的两个或更多个化学结构单元交联。
42.一种产生DNA编码的文库的方法，对于每个成员所述方法包括以下步骤；
提供新生成员，所述新生成员包含通过接头连接至锚的支架，其中所述锚连接至固体载体，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生成员以形成连接至所述支架的化学部分，
将一个或多个编码寡核苷酸共价连接至所述新生成员以形成连接至所述锚的编码核酸部分，
将切割基团连接至所述化学部分，
将所述新生成员分离在区室中，以及
使所述接头与所述切割基团反应，使得所述接头被切割并且所述支架从所述区室中的所述固体载体释放。
43.一种产生DNA编码的文库的方法，对于每个成员所述方法包括以下步骤；
提供包含支架和锚的新生成员，其中所述支架通过所述锚连接至第一接头；并且所述锚包含连接寡核苷酸并连接至固体载体，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生成员以形成连接至所述支架的化学部分，
将一个或多个编码寡核苷酸共价连接至所述连接寡核苷酸以形成连接至所述锚的核酸部分，
将第二接头连接至所述化学部分以将所述化学部分连接至所述固体载体，
切割所述第一接头，
将所述新生成员分离在区室中，以及
切割所述第二接头，使得所述第二接头被切割并且连接至所述支架的所述化学部分从所述区室中的所述固体载体释放。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述锚包含连接寡核苷酸，并且将编码每个化学结构单元的所述编码寡核苷酸顺序地添加至所述连接寡核苷酸以形成连接至所述锚的所述编码核酸部分。
45.一种产生核酸编码的文库的方法，对于每个成员所述方法包括以下步骤；
提供包含通过接头连接至固体载体的支架的新生成员，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生成员以形成连接至所述支架的化学部分，
将一个或多个编码寡核苷酸共价连接至所述固体载体以形成连接至所述固体载体的编码核酸部分，
将切割基团连接至所述化学部分，
将所述新生成员分离在区室中，以及
使所述接头与所述切割基团反应，使得所述接头被切割，并且所述支架从所述区室中的所述固体载体释放。
46.一种产生核酸编码的文库的方法，对于每个成员所述方法包括以下步骤；
提供包含通过第一接头连接至固体载体的支架的新生成员；并且所述固体载体包含连接寡核苷酸，
将一个或多个化学结构单元共价连接至所述新生成员以形成连接至所述支架的化学部分，
将一个或多个编码寡核苷酸共价连接至所述连接寡核苷酸以形成连接至所述固体载体的编码核酸部分，
将第二接头连接至所述化学部分以将所述化学部分连接至所述固体载体，
切割所述第一接头，
将所述新生成员分离在区室中，以及
切割所述第二接头，使得所述第二接头被切割并且连接至所述支架的所述化学部分从所述区室中的所述固体载体释放。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述固体载体包含连接寡核苷酸，并且将编码每个化学结构单元的所述编码寡核苷酸顺序地添加至所述连接寡核苷酸以形成所述编码核酸部分。
48.根据权利要求42至47中任一项所述的方法，其中所述区室是位于阵列上的可寻址特征处的微体积。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，所述方法包括进一步纯化所述化合物或成员或化合物或成员的文库。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，所述方法还包括产生化合物或文库成员的不同群体，针对与靶分子的结合筛选所述不同群体，并鉴定所述群体中与所述靶分子结合的文库成员。
51.根据权利要求50所述的方法，所述方法包括；
提供包含通过接头连接至固体载体的经标记支架的新生成员，
将所鉴定的文库成员的所述化学部分共价连接至所述支架，以产生包含所述化学部分的经标记的新生成员，
将切割基团连接至所述化学部分或所述支架，
使所述接头与所述切割基团反应，从而切割所述接头并从所述固体载体释放所述成员，以及
确定所述释放的经标记成员与所述靶分子的结合。
52.根据权利要求50所述的方法，所述方法包括；
提供包含通过第一接头连接至固体载体的经标记支架的新生成员，
将所鉴定的文库成员的所述化学部分共价连接至所述支架，以产生包含所述化学部分的经标记的新生成员，
用第二接头将所述化学部分连接至所述固体载体，
切割所述第一接头，
切割所述第二接头并从所述固体载体释放所述成员，以及
确定所述释放的经标记成员与所述靶分子的结合。
53.一种核酸编码的文库，其通过根据权利要求1至52中任一项所述的方法产生。
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