CA2299555A1 - Compose chimique complexe, synthese et applications diverses dudit compose - Google Patents
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Abstract
Le composé chimique complexe comprend un support solide et au moins un conjugué constitué d'un polymère organique et d'une pluralité de biomonomères amorceurs. Synthèse dudit composé chimique, et utilisation dudit composé chimique complexe pour la synthèse de biopolymères. Utilisation du composé chimique complexe après la synthèse en tant que ligand pour l'amplification de la détection et/ou de la capture de molécules cibles.
Description
COMPOSE CHIMIQUE COMPLEXE, SYNTHESE ET APPLICATIONS
DIVERSES DUDIT COMPOSE
La présente invention a pour objet un composé
chimique complexe, son procédé de synthèse ainsi que son utilisation pour la synthèse de biopolymëres. Elle concerne également l'utilisation des réactifs obtenus pour entre autre l'amplification de détection et/ou de capture de différentes cibles biologiques.
I1 est connu aujourd'hui d'utiliser des ligands, par exemple des protéines, haptènes, peptides, polypeptides, anticorps ou polynucléotides pour capturer des molécules cibles ou anti-ligands (molécules biologiques ou analogues), dans le but de détecter et/ou de les doser, notamment dans la réalisation d'essais de diagnostic.
On connaît la demande WO 91/08307 qui divulgue des réactifs et un procédé pour amplifier la capture de molécules cibles en utilisant des oligonucléotides attachés de manière covalente à un polymère.
On connaît également la demande de brevet FR2 707 010 qui divulgue des réactifs et un dispositif de capture d'une molécule cible de type sandwich, comprenant un support solide sur lequel est adsorbé un ligand, ledit ligand étant constitué d'un conjugué résultant du couplage covalent d'un polymère organique avec une pluralité de biopolymères, ledit polymère organique étant un copolymère de N-vinyl-pyrrolidone.
Le document EP-A-0 561 722 divulgue, dans un mode d'exécution particulier, un composé chimique complexe, qui comprend .
- un support solide, par exemple en polychlorure de vinyle, - des groupements chimiques surfaciques liés par liaison covalence au support solide, appelés « agents de fonctionnalisation complémentaire », FEUILLE MCDIFIEE
DIVERSES DUDIT COMPOSE
La présente invention a pour objet un composé
chimique complexe, son procédé de synthèse ainsi que son utilisation pour la synthèse de biopolymëres. Elle concerne également l'utilisation des réactifs obtenus pour entre autre l'amplification de détection et/ou de capture de différentes cibles biologiques.
I1 est connu aujourd'hui d'utiliser des ligands, par exemple des protéines, haptènes, peptides, polypeptides, anticorps ou polynucléotides pour capturer des molécules cibles ou anti-ligands (molécules biologiques ou analogues), dans le but de détecter et/ou de les doser, notamment dans la réalisation d'essais de diagnostic.
On connaît la demande WO 91/08307 qui divulgue des réactifs et un procédé pour amplifier la capture de molécules cibles en utilisant des oligonucléotides attachés de manière covalente à un polymère.
On connaît également la demande de brevet FR2 707 010 qui divulgue des réactifs et un dispositif de capture d'une molécule cible de type sandwich, comprenant un support solide sur lequel est adsorbé un ligand, ledit ligand étant constitué d'un conjugué résultant du couplage covalent d'un polymère organique avec une pluralité de biopolymères, ledit polymère organique étant un copolymère de N-vinyl-pyrrolidone.
Le document EP-A-0 561 722 divulgue, dans un mode d'exécution particulier, un composé chimique complexe, qui comprend .
- un support solide, par exemple en polychlorure de vinyle, - des groupements chimiques surfaciques liés par liaison covalence au support solide, appelés « agents de fonctionnalisation complémentaire », FEUILLE MCDIFIEE
2 - un conjugué comprenant, d'une part un polymère organique, à savoir un homopolymère ou copolymère modifié
d'anhydride maléfique, comportant des fonctions latérales chimiques, appelées « agent de fonctionnalisation », liées aux groupements surfaciques, et des restes chimiques consistant en des fonctions anhydrides, et d'autre part des molécules biologiques, par exemple des protéines Ziées, par Liaison non covalence à un agent de fonctionnalisation, par exemple haptène, ledit agent de l0 fonctionnalisation étant lié par covalence aux fonctions anhydride du polymère.
La demande de brevet WO 84/03053 divulgue un support solide de type polysaccharides auquel est lié par covalence un polymère de synthèse obtenu par polymérisation de comonomères sur lequel est fixé
éventuellement par covalence un ou plusieurs ligands d'affinité ou molécules biologiquement actives telles que par exemple un inhibiteur, un cofacteur, un groupe prosthétique, une enzyme, une hormone, un anticorps, un acide nucléique.
La demande de brevet FR 2 605 237 divulgue un support poreux, par exemple de silice, sur lequel est fixé
par adsorption un polymère dérivé de polyvinylimidazole qui comporte des fonctions SH, et son utilisation pour purifier ou séparer des protéines.
La demande de brevet EP 591 807 divulgue un polymère sur lequel est greffé de manière covalente une ou plusieurs molécules biologiquement actives de même nature.
Ces molécules peuvent être par exemple la biotine, la digoxine, la digitoxigénine ou des oligonucléotides comprenant de 1 à 80 unités nucléotidiques, de préférence 15 à 50, et en particulier 20 à 35.
La demande de brevet FR 2 019 083 divulgue un système binaire polymère-enzyme soluble dans l'eau, utilisé pour traiter par voie enzymatique des substrats, de telle manière qu'après traitement, les produits de la FEUILLE MCDIFIEE
d'anhydride maléfique, comportant des fonctions latérales chimiques, appelées « agent de fonctionnalisation », liées aux groupements surfaciques, et des restes chimiques consistant en des fonctions anhydrides, et d'autre part des molécules biologiques, par exemple des protéines Ziées, par Liaison non covalence à un agent de fonctionnalisation, par exemple haptène, ledit agent de l0 fonctionnalisation étant lié par covalence aux fonctions anhydride du polymère.
La demande de brevet WO 84/03053 divulgue un support solide de type polysaccharides auquel est lié par covalence un polymère de synthèse obtenu par polymérisation de comonomères sur lequel est fixé
éventuellement par covalence un ou plusieurs ligands d'affinité ou molécules biologiquement actives telles que par exemple un inhibiteur, un cofacteur, un groupe prosthétique, une enzyme, une hormone, un anticorps, un acide nucléique.
La demande de brevet FR 2 605 237 divulgue un support poreux, par exemple de silice, sur lequel est fixé
par adsorption un polymère dérivé de polyvinylimidazole qui comporte des fonctions SH, et son utilisation pour purifier ou séparer des protéines.
La demande de brevet EP 591 807 divulgue un polymère sur lequel est greffé de manière covalente une ou plusieurs molécules biologiquement actives de même nature.
Ces molécules peuvent être par exemple la biotine, la digoxine, la digitoxigénine ou des oligonucléotides comprenant de 1 à 80 unités nucléotidiques, de préférence 15 à 50, et en particulier 20 à 35.
La demande de brevet FR 2 019 083 divulgue un système binaire polymère-enzyme soluble dans l'eau, utilisé pour traiter par voie enzymatique des substrats, de telle manière qu'après traitement, les produits de la FEUILLE MCDIFIEE
3 réaction enzymatique soient séparés du produit enzyme-polymère soluble par passage à travers une membrane semi-perméable.
I1 est donc évident que ces polymères greffés à
plusieurs oligonucléotides présentent un grand intérêt pour l'amplification dans les tests de détection.
Jusqu'à aujourd'hui, les ligands oligonucléotides/polymères organiques sont obtenus par greffage chimique par covalence, desdits oligonucléotides l0 préalablement synthétisés, sur le polymère organique réactif ou rendu réactif.
Ce greffage chimique constitue une étape délicate à mettre en oeuvre en ce sens qu'elle ne permet pas d'obtenir une orientation optimale des oligonucléotides et qu'elle peut conduire à des composés agrégés dont l'accessibilité des oligonucléotides est limitée (Syntheses and Characterisation of Conjugates of Nucleic Acid Probes and 6-Aminoglucose-based Polymers, Polymers for Advanced Technologies, (1996) volume 8, pp.297-304).
La présente invention a donc pour objet un composé
chimique complexe susceptible de simplifier et d'améliorer l'obtention des ligands selon l'art antérieur, tout en les préservant.
Selon 1a présente invention, des biomonomères amorceurs, éventuellement modifiés chimiquement, sont Liés par covalence, d'un côté respectivement aux restes chimiques dudit polymère organique, et de l'autre côté
chacun à un biopolymère.
Le composé chimique complexe selon l'invention, pouvant constituer un réactif intermédiaire, permet de synthétiser directement des ligands, liés quant à eux par une liaison éventuellement clivable à un support solide.
Le clivage de la liaison polymère organique/support solide restitue les biopolymères synthétisés liés au polymère organique sous forme de ligand. De préférence, la liaison des biomonomères FEUI~! E '~~pCniFIFE
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I1 est donc évident que ces polymères greffés à
plusieurs oligonucléotides présentent un grand intérêt pour l'amplification dans les tests de détection.
Jusqu'à aujourd'hui, les ligands oligonucléotides/polymères organiques sont obtenus par greffage chimique par covalence, desdits oligonucléotides l0 préalablement synthétisés, sur le polymère organique réactif ou rendu réactif.
Ce greffage chimique constitue une étape délicate à mettre en oeuvre en ce sens qu'elle ne permet pas d'obtenir une orientation optimale des oligonucléotides et qu'elle peut conduire à des composés agrégés dont l'accessibilité des oligonucléotides est limitée (Syntheses and Characterisation of Conjugates of Nucleic Acid Probes and 6-Aminoglucose-based Polymers, Polymers for Advanced Technologies, (1996) volume 8, pp.297-304).
La présente invention a donc pour objet un composé
chimique complexe susceptible de simplifier et d'améliorer l'obtention des ligands selon l'art antérieur, tout en les préservant.
Selon 1a présente invention, des biomonomères amorceurs, éventuellement modifiés chimiquement, sont Liés par covalence, d'un côté respectivement aux restes chimiques dudit polymère organique, et de l'autre côté
chacun à un biopolymère.
Le composé chimique complexe selon l'invention, pouvant constituer un réactif intermédiaire, permet de synthétiser directement des ligands, liés quant à eux par une liaison éventuellement clivable à un support solide.
Le clivage de la liaison polymère organique/support solide restitue les biopolymères synthétisés liés au polymère organique sous forme de ligand. De préférence, la liaison des biomonomères FEUI~! E '~~pCniFIFE
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4 amorceurs au polymère organique n'est pas clivable dans les conditions de clivage de la liaison polymêre organique/support solide.
Les avantages de la présente invention sont multiples puisqu'il est possible, après synthèse des biopolymères, soit d'utiliser le composé selon l'invention tel quel, soit de cliver les liaisons covalentes support solide/polymère organique afin d'utiliser les ligands.
Dans le cas où on ne clive pas les liaisons covalentes, on peut utiliser ce ligand pour l'amplification de détection et de capture de molécules cibles ou d'autres utilisations. L'avantage de ce type de ligand est que les biopolymères du ligand sont orientés de manière correcte, et ne présentent pas d'agrégats. Dans le cas ou l'on clive la liaison covalente, on obtient des ligands utilisables pour l'amplification de détection et de capture de molécules cibles, lesdits ligands étant orientés de manière correcte, et ne présentant pas d'agrégats. De plus, ces différents ligands peuvent présenter des biopolymères identiques ou différents, au moins de natures mixtes, tels que oligonucléotides/peptides.
On entend par "support solide", tout matériau à
l'état natif relativement inerte, susceptible d'être fonctionnalisé, sur lequel peut être lié un polymère organique réactif tel que défini ci-dessous, et qui peut être utilisé comme support dans des tests de détection, en chromatographie d'affinité et dans des processus de séparation. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés ou non chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose, du dextran, des polymères tels que polychlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrène, polyamide, ou copolymères à base de monomères vinyliques et aromatiques, esters d'acides carboxyliques insaturés, FEUILLE fviODIFIEE
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chlorure de vinylidène, diènes ou composés présentant des fonctions nitrile (acrylonitrile), des copolymères chlorure de vinyle/propylène, ou chlorure de vinyle/acétate de vinyle, des copolymères à base de
Les avantages de la présente invention sont multiples puisqu'il est possible, après synthèse des biopolymères, soit d'utiliser le composé selon l'invention tel quel, soit de cliver les liaisons covalentes support solide/polymère organique afin d'utiliser les ligands.
Dans le cas où on ne clive pas les liaisons covalentes, on peut utiliser ce ligand pour l'amplification de détection et de capture de molécules cibles ou d'autres utilisations. L'avantage de ce type de ligand est que les biopolymères du ligand sont orientés de manière correcte, et ne présentent pas d'agrégats. Dans le cas ou l'on clive la liaison covalente, on obtient des ligands utilisables pour l'amplification de détection et de capture de molécules cibles, lesdits ligands étant orientés de manière correcte, et ne présentant pas d'agrégats. De plus, ces différents ligands peuvent présenter des biopolymères identiques ou différents, au moins de natures mixtes, tels que oligonucléotides/peptides.
On entend par "support solide", tout matériau à
l'état natif relativement inerte, susceptible d'être fonctionnalisé, sur lequel peut être lié un polymère organique réactif tel que défini ci-dessous, et qui peut être utilisé comme support dans des tests de détection, en chromatographie d'affinité et dans des processus de séparation. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés ou non chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose, du dextran, des polymères tels que polychlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrène, polyamide, ou copolymères à base de monomères vinyliques et aromatiques, esters d'acides carboxyliques insaturés, FEUILLE fviODIFIEE
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chlorure de vinylidène, diènes ou composés présentant des fonctions nitrile (acrylonitrile), des copolymères chlorure de vinyle/propylène, ou chlorure de vinyle/acétate de vinyle, des copolymères à base de
5 méthacrylate de glycidyle et d'éthylène diméthyl méthacrylate, des copolymères à base de styrène ou de dérivés substitués du styrène, des fibres naturelles telles que le coton et des fibres synthétiques telles que un polyamide, des matériaux inorganiques tels que la silice, le verre, la céramique, le quartz, des latex, c'est-à-dire des dispersions aqueuses colloïdales de polymère insoluble dans l'eau, des particules magnétiques, des dérivés métalliques.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le composé chimique complexe comprend en tant que support solide fonctionnel, un support de type minéral ou organique, de préférence encore de la silice activée ou du polystyrène fonctionnalisé.
Le support solide peut être sans limitation sous 2o la forme d'une plaque de microtitration, d'une feuille, d'un cône, d'un tube, d'un puits, de billes, de particules ou analogues.
Par "fonctionnel", on entend la caractéristique selon laquelle le support a été rendu chimiquement réactif par toute méthode dite de "fonctionnalisation", traditionnelle ou connue en soi par l'homme du métier, en fonction de la nature chimique du support, et qui génère lesdits groupements surfaciques.
Par "ligand", on entend un complexe formé d'un polymère organique réactif couplé à une pluralité de biopolymères, ledit ligand étant par exemple le composé
chimique complexe après synthèse des biopolymêres, avec ou sans clivage de la liaison support solide/polymère organique, ledit ligand étant susceptible de se lier à des anti-ligands.
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Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le composé chimique complexe comprend en tant que support solide fonctionnel, un support de type minéral ou organique, de préférence encore de la silice activée ou du polystyrène fonctionnalisé.
Le support solide peut être sans limitation sous 2o la forme d'une plaque de microtitration, d'une feuille, d'un cône, d'un tube, d'un puits, de billes, de particules ou analogues.
Par "fonctionnel", on entend la caractéristique selon laquelle le support a été rendu chimiquement réactif par toute méthode dite de "fonctionnalisation", traditionnelle ou connue en soi par l'homme du métier, en fonction de la nature chimique du support, et qui génère lesdits groupements surfaciques.
Par "ligand", on entend un complexe formé d'un polymère organique réactif couplé à une pluralité de biopolymères, ledit ligand étant par exemple le composé
chimique complexe après synthèse des biopolymêres, avec ou sans clivage de la liaison support solide/polymère organique, ledit ligand étant susceptible de se lier à des anti-ligands.
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6 Par "conjugué", on entend dans la présente invention un polymère organique lié à une pluralité de biomonomères amorceurs.
Par "biopolymères", on entend toutes molécules que l'on peut synthétiser dans un synthétiseur automatique, telles que enzymes, hormones, récepteurs, déterminants antigéniques, anticorps, ADN, ARN, les peptides, les glycopeptides, les oligosaccharides, et leurs dérivés et analogues synthétiques.
Par "biomonomères", on entend toute unité de base dont la polymérisation par addition de synthons conduit à
un biopolymère tels que défini précédemment ; notamment des biomonomères chimiquement modifiés pour se lier au polymère organique et jouer le rôle d'amorçage de la polymérisation du biopolymère. On peut citer les acides aminés, les nucléosides, les nucléotides, les saccharides, et leurs dérivés ou analogues.
Par "synthon", on entend tout biomonomère permettant la synthèse de biopolymères.
Par "liaison covalente clivable", on entend toute liaison fixe chimiquement qui peut être clivée par une réaction chimique, photochimique, thermique ou enzymatique.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, les biomonomères amorceurs, identiques ou diffêrents, sont de type nucléotidiques et/ou peptidiques et/ou saccharidiques. De préférence encore les biomonomères sont de type nucléotidiques et peptidiques.
On entend par "polymère organique réactif", tout polymère ou copolymère, naturel ou synthétique, avec un squelette linéaire ou branché, statistique, alterné, greffé ou séquencé, essentiellement carboné, portant une fois activé des substituants permettant d'effectuer des réactions covalentes avec le support solides et les biomonomères amorceurs. De préférence, le polymère est un copolymère. I1 porte les biopolymères en tant que FEUILLE MODI~IEE
Par "biopolymères", on entend toutes molécules que l'on peut synthétiser dans un synthétiseur automatique, telles que enzymes, hormones, récepteurs, déterminants antigéniques, anticorps, ADN, ARN, les peptides, les glycopeptides, les oligosaccharides, et leurs dérivés et analogues synthétiques.
Par "biomonomères", on entend toute unité de base dont la polymérisation par addition de synthons conduit à
un biopolymère tels que défini précédemment ; notamment des biomonomères chimiquement modifiés pour se lier au polymère organique et jouer le rôle d'amorçage de la polymérisation du biopolymère. On peut citer les acides aminés, les nucléosides, les nucléotides, les saccharides, et leurs dérivés ou analogues.
Par "synthon", on entend tout biomonomère permettant la synthèse de biopolymères.
Par "liaison covalente clivable", on entend toute liaison fixe chimiquement qui peut être clivée par une réaction chimique, photochimique, thermique ou enzymatique.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, les biomonomères amorceurs, identiques ou diffêrents, sont de type nucléotidiques et/ou peptidiques et/ou saccharidiques. De préférence encore les biomonomères sont de type nucléotidiques et peptidiques.
On entend par "polymère organique réactif", tout polymère ou copolymère, naturel ou synthétique, avec un squelette linéaire ou branché, statistique, alterné, greffé ou séquencé, essentiellement carboné, portant une fois activé des substituants permettant d'effectuer des réactions covalentes avec le support solides et les biomonomères amorceurs. De préférence, le polymère est un copolymère. I1 porte les biopolymères en tant que FEUILLE MODI~IEE
7 substituants latéraux liés au squelette polymère, directement ou indirectement, par des liaisons covalentes, grâce à des restes latéraux chimiques. I1 porte d'autres substituants latéraux présents, identiques ou différents des précédents, en tant que substituants latéraux liés au support solide, directement ou indirectement, par des liaisons covalentes clivables, grâce à des fonctions latérales chimiques.
Les motifs de copolymères qui ne sont pas impliqués dans l'établissement d'une liaison covalente avec les biomonomères amorceurs ou le support solide servent notamment à espacer, dans le copolymère, les motifs portant les biomonomères amorceurs, et peuvent ainsi servir à moduler, de façon connue, les propriétés du copolymère, par exemple les propriétés de solubilité.
De préférence le polymère est un polymère portant des fonctions réactives de type électrophile et/ou thiol et/ou disulfure.
De préférence encore le polymère est un copolymère linéaire d'anhydride maléfique tel que poly(anhydride maléfique-a1t-méthyl vinyl éther), (anhydride maléfique-a1t éthylène), (anhydride maléfique-a1t-stryrène) et (anhydride maléfique-a1t-N-vinylpyrrolidone) et peut être aussi un copolymère de (N-vinylpyrrolidone/N-acryloxysuccinimide).
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le polymère ou copolymère organique réactif selon l'invention a une masse moléculaire comprise entre 10000 et 1000000, de préférence encore entre 30000 et 70000.
Le copolymère provient par exemple de la copolymérisation d'un monomère d'anhydride maléfique et d'un deuxième monomère approprié par exemple le méthyl vinyl éther, pour permettre l'établissement d'un couplage covalent entre le copolymère et le support solide d'une part, et le copolymère et les biomonomères amorceurs d'autre part. Le monomère d'anhydride maléfique porte des ..
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Les motifs de copolymères qui ne sont pas impliqués dans l'établissement d'une liaison covalente avec les biomonomères amorceurs ou le support solide servent notamment à espacer, dans le copolymère, les motifs portant les biomonomères amorceurs, et peuvent ainsi servir à moduler, de façon connue, les propriétés du copolymère, par exemple les propriétés de solubilité.
De préférence le polymère est un polymère portant des fonctions réactives de type électrophile et/ou thiol et/ou disulfure.
De préférence encore le polymère est un copolymère linéaire d'anhydride maléfique tel que poly(anhydride maléfique-a1t-méthyl vinyl éther), (anhydride maléfique-a1t éthylène), (anhydride maléfique-a1t-stryrène) et (anhydride maléfique-a1t-N-vinylpyrrolidone) et peut être aussi un copolymère de (N-vinylpyrrolidone/N-acryloxysuccinimide).
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le polymère ou copolymère organique réactif selon l'invention a une masse moléculaire comprise entre 10000 et 1000000, de préférence encore entre 30000 et 70000.
Le copolymère provient par exemple de la copolymérisation d'un monomère d'anhydride maléfique et d'un deuxième monomère approprié par exemple le méthyl vinyl éther, pour permettre l'établissement d'un couplage covalent entre le copolymère et le support solide d'une part, et le copolymère et les biomonomères amorceurs d'autre part. Le monomère d'anhydride maléfique porte des ..
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8 substituants carbonyles, qui peuvent réagir avec une fonction hydroxyle du support solide pour former une liaison covalente de type ester clivable dans des conditions basiques prédéterminées, et pour d'autres peuvent réagir avec une fonction amine primaire d'un biomonomère amorceur pour former une liaison covalente de type amide non clivable dans les conditions basiques prédéterminées.
A titre d'exemple, le polymère organique réactif est un copolymère linéaire d'anhydride maléfique-a1t-méthyl vinyl éther.
Lorsque le support solide est lui-même un polymère ou un copolymère, il doit étre entendu qu'il est dans ce cas différent du polymère réactif, dans sa nature chimique par exemple.
Le terme polymère organique "réactif" se rapporte au fait que le polymère ou copolymère porte, avant ou après activation , des substituants chimiques réactifs, notamment de type électrophile et/ou thiol et/ou disulfure. Ces substituants peuvent être par exemple les groupements aldéhyde, époxy, halogénoalkyle, ester, carbonyle, isocyanate, isothiocyanate, double liaison carbone-carbone activée et maléimide, vinyl sulfone.
De manière générale, les termes "fonction latérale", "groupement surfacique" et "reste latéral"
signifient fonction chimique réactive, permettant d'effectuer toute liaison covalente, il s'agit par exemple des radicaux électrophiles et/ou thiol et/ou disulfure cités ci-dessus, ou tout autre groupement connu de l'homme du métier, et choisi en fonction de la liaison covalente recherchée.
On entend par "cibles" ou "molécules cibles" ou "anti-ligands", toutes molécules susceptibles d'être liées aux ligands par l'intermédiaire des biopolymères, notamment les acides nucléiques tels qu'ADN ou ARN ou leurs fragments, simples ou doubles brins, les antigènes, ._ ..
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A titre d'exemple, le polymère organique réactif est un copolymère linéaire d'anhydride maléfique-a1t-méthyl vinyl éther.
Lorsque le support solide est lui-même un polymère ou un copolymère, il doit étre entendu qu'il est dans ce cas différent du polymère réactif, dans sa nature chimique par exemple.
Le terme polymère organique "réactif" se rapporte au fait que le polymère ou copolymère porte, avant ou après activation , des substituants chimiques réactifs, notamment de type électrophile et/ou thiol et/ou disulfure. Ces substituants peuvent être par exemple les groupements aldéhyde, époxy, halogénoalkyle, ester, carbonyle, isocyanate, isothiocyanate, double liaison carbone-carbone activée et maléimide, vinyl sulfone.
De manière générale, les termes "fonction latérale", "groupement surfacique" et "reste latéral"
signifient fonction chimique réactive, permettant d'effectuer toute liaison covalente, il s'agit par exemple des radicaux électrophiles et/ou thiol et/ou disulfure cités ci-dessus, ou tout autre groupement connu de l'homme du métier, et choisi en fonction de la liaison covalente recherchée.
On entend par "cibles" ou "molécules cibles" ou "anti-ligands", toutes molécules susceptibles d'être liées aux ligands par l'intermédiaire des biopolymères, notamment les acides nucléiques tels qu'ADN ou ARN ou leurs fragments, simples ou doubles brins, les antigènes, ._ ..
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9 les haptènes, les peptides, les protéines, les glycoprotéines, les hormones, les anticorps, les oligosaccharides, les médicaments, leurs dérivés et analogues synthétiques.
La réaction ligand /anti-ligand peut se faire de manière directe ou indirecte.
Dans une réaction de type direct, le ligand est spécifique de la molêcule cible. Le ligand est notamment choisi pour être susceptible de former un duplex l0 ligand/molécule cible. A titre d'exemple le duplex peut notamment être représenté par tout couple antigène/anticorps, anticorps/haptène, chélatant/molécule chélatée, les hybrides polynucléotide/polynucléotide, polynucléotide/acide nucléique, les hybrides oligosaccharide/oligosaccharide, hormone/récepteur.
Dans une réaction de type indirect, le ligand est capable de former un duplex avec un réactif bi-fonctionnel comprenant un groupement "anti-ligand", responsable de la formation du duplex avec le ligand, et dans lequel ledit groupement anti-ligand est lié, notamment par covalence, de façon connue, à un groupe partenaire de la cible. Le groupe partenaire de la cible est un groupement capable de se lier avec la cible (en formant un complexe cible/partenaire) et est donc capable de capturer la cible, dans des conditions de l'essai, par établissement d'une liaison suffisamment forte pour assurer l'interaction cible-partenaire, par exemple par covalence et/ou par interactions ioniques et/ou par liaisons hydrogènes et/ou par liaisons hydrophobes hydrophiles. Le duplex ligand/anti-ligand peut être dans ce cas tout couple mentionné ci-dessus pour la réaction de type direct, ou encore un duplex biotine/streptavidine, lectine/sucre ou analogues. En particulier le complexe ligand/anti-ligand est un hybride polynucléotide/polynucléotide. Le complexe partenaire/cible est du méme type que le complexe - ~.
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ligand/cible mentionné ci-dessus pour la réaction de type direct.
Un deuxième objet de l'invention est le procédé de synthèse chimique d'un composé chimique complexe objet de 5 l'invention et tel que décrit ci-dessus, comprenant une pluralité de biomonomëres, comprenant les étapes suivantes .
a) on dispose d'un support fonctionnel comprenant des groupements surfaciques ;
l0 b) on dispose d'au moins un polymère organique réactif dont le squelette comporte d'une part des fonctions latérales chimiques complémentaires des groupements surfaciques du support solide, et d'autre part des restes latéraux chimiques, ledit support solide étant IS inerte vis-à-vis dudit polymère organique ;
c) on dispose de biomonomères amorceurs de biopolymérisation, identiques ou différents, comprenant d'un côté un substituant réactif et d'un autre côté un groupement protecteur ;
d) on fait réagir au moins un polymère organique .
- soit avec le support solide, pour établir au moins une liaison covalente entre un groupement surfacique dudit support solide et une fonction latérale dudit polymère organique, puis on fait réagir le polymère organique lié au support solide avec une pluralité de biomonomères amorceurs, pour greffer ces derniers par covalence, directement ou indirectement, avec une pluralité de restes latéraux dudit polymère organique ;
- soit avec une pluralité de biomonomëres amorceurs, pour greffer ces derniers par covalence, directement ou indirectement, avec une pluralité de fonctions latérales dudit polymère organique, puis on fait réagir le polymère organique lié aux biomonomères amorceurs avec le support solide, pour établir au moins une liaison covalente entre un groupement surfacique dudit support solide et un reste dudit polymère organique.
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Le procédé de synthèse précédent s'effectue de préférence en faisant réagir au moins un polymère organique avec une pluralité de biomonomères amorceurs, pour greffer ces derniers par covalence, directement ou indirectement, avec une pluralité de restes latéraux dudit polymère organique, puis on fait réagir le polymère organique lié aux biomonomères amorceurs avec le support solide, pour établir au moins une liaison covalente entre un groupement surfacique dudit support solide et un reste l0 dudit polymère organique.
Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé comprend, après l'étape c et avant l'étape d, l'étape .
c') on fait réagir le polymère organique avec un réactif générateur de bras espaceurs, pour greffer sur une pluralité de restes latéraux dudit polymère organique une pluralité de bras espaceurs respectivement, comportant chacun à leur extrémité libre une fonction réactive.
Par exemple, le bras espaceur peut être:
R-O-(CH2)n-NH2 dans lequel R est un groupement diméthoxytrityle, tertiobutyldiméthysilyle ou un groupement photolabile.
Selon un autre mode préférentiel, le composé
chimique selon l'invention est caractérisé en ce que les biomonomères amorceurs sont prolongés et polymérisés avec des synthons, chacun selon une séquence prédéterminée pour obtenir des biopolymères.
Selon un mode très préférentiel de l'invention, le composé chimique selon l'invention est caractérisé en ce que les biopolymères sont de type oligonucléotide, et/ou peptide, et/ou oligonucléotide-peptide.
Selon un autre mode très préférentiel de l'invention, le composé chimique est caractérisé en ce que les biopolymères forment avec le polymère organique des ligands susceptibles de se lier directement ou indirectement à des anti-ligands.
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Un troisième objet de l'invention est l'utilisation du composé chimique complexe selon l'invention pour effectuer la synthèse des biopolymères, comprenant les étapes de:
f) on dispose de synthons identiques ou différents, g) par cycles successifs de couplage/déprotection, on fait croître les chaînes des biopolymères à partir des biomonomères amorceurs respectivement, selon au moins une même séquence prédéterminée de synthons.
Pour effectuer des synthèses de biopolymères différents, que ce soit des oligonucléotides/oligonucléotides ou peptides/peptides ou lo oligonucléotides/peptides, l'homme du métier saura choisir les biomonomëres amorceurs appropriés avec des groupements protecteurs sensibles ou non aux réactions chimiques effectuées. Ainsi, il est possible d'effectuer une première synthèse d'un premier groupe de biopolymères tout en gardant un deuxième groupe de biomonomères amorceurs protégés, et ensuite d'effectuer une seconde synthèse de biopolymères sur le deuxième groupe de biomonomères amorceurs déprotégés.
Les avantages de la synthèse des biopolymères sur le composé chimique complexe selon l'invention sont multiples. Cette synthèse directement sur le polymère réactif lié au support solide permet d'obtenir un biopolymère bien défini et orienté de manière correcte pour effectuer la détection et/ou la capture de molécules cibles de nature identique. De plus, la synthèse permet d'obtenir des biopolymères différents, tels que oligonucléotides et peptides, sur le même polymère réactif. I1 est également possible, par cette synthèse facilitée, d'obtenir en plusieurs étapes des dibiopolymères tels que oligonucléotides-peptides, pouvant par exemple permettre de détecter dans un même échantillon des matériels nucléiques et protéiques.
FEUILLE MOD!FIEE
Un quatrième objet de l'invention est le composé
complexe chimique obtenu par le procédé décrit précédemment et son utilisation pour différentes applications, notamment l'amplification de capture et/ou de détection de cibles biologiques, sous différents formats de bioessais (plaque de microtitrage, chromatographie, bandes, etc.), le séquençage d'oligonucléotides, la mutagénèse dirigée, en thérapeutique et autres applications adaptées à
l'utilisation du composé chimique complexe selon 1 - 111VC111~1V11.
Dans la mesure où l'on ne clive pas les liaisons covalentes liant le support aux polymères organiques, le réactif obtenu peut être utilisé pour amplifier la capture et la détection de cible biologiques.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, on effectue la synthèse d'un composé chimique complexe comprenant:
- un support solide fonctionnel comprenant des groupements surfaciques chimiques, - au moins un conjugué comprenant:
- un polymère organique réactif dont le squelette comporte d'une part des fonctions latérales chimiques réactives vis-à-vis des groupements surfaciques du support solide liées â ces derniers par liaison covalente, et d'autre part des restes latéraux chimiques, - une pluralité de biomonomères amorceurs mixtes branchés sur le polymère organique, liés respectivement auxdits restes chimiques dudit polymère organique, par une liaison covalente, caractérisé en ce que les biomonomères amorceurs mixtes sont prolongés et polymérisés avec d'autres synthons, chacun selon une séquence prédéterminée desdits synthons pour obtenir des biopolymères mixtes, tels que oligonucléotide et peptide.
Dans un autre mode de réalisation préféré selon 1 'invention, le composé chimique comprend des FF_UILLE l',~0~!FIEE
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biopolymères de type oligonucléotide et peptide, ou oligonucléotide-peptide.
Dans encore un autre mode de réalisation selon l'invention, le composé chimique complexe comprend des biopolymères formant avec le polymère organique auquel ils sont liés des ligands susceptibles d'être liés directement ou indirectement à des anti-ligands.
Dans la mesure où l'on clive les liaisons covalentes liant le support aux polymères organiques, on obtient des réactifs ou ligands, notamment des ligands constitués d'un polymère organique lié à des biopolymères de natures mixtes, par exemple peptides/oligonucléotides, susceptibles d'être utilisés pour l'amplification de capture et de détection de molécules cibles. Ces composés complexes polymère/oligonucléotides/peptides peuvent également être utilisés en thérapeutique. En effet, dans la mesure ou l'oligonucléotide peut être un agent antisens et le peptide être fusogène, on peut utiliser le composé
pour réguler l'expression génétique et optimiser l'internalisation du complexe dans les cellules. S
signifie "support" dans les figures 1 et 3. G signifie "groupement photolabile" dans la figure 2.
Les figures qui sont jointes ont un but d'illustration et ne limitent en rien l'étendue de la protection de la présente invention.
La figure 1 représente différentes formes possibles du composé chimique complexe selon 1 'invention, et du ligand correspondant.
Figures 1(a) et 1(a') représentent ie composé
chimique complexe et le ligand correspondant dont les biopolymères sont des oligonucléotides présentant la méme séquence d'acides nucléiques.
Figures 1(b) et 1(b') représentent le composé
chimique complexe et le ligand correspondant dont les biopolymères sont des oligonucléotides et des peptides.
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...
Figures 1(c) et 1(c') représentent le composé
chimique complexe et le ligand correspondant dont les biopolymères sont des oligonucléotides et des oligonucléotide-peptides.
5 La figure 2 représente quatre exemples d'oligomère amorceur.
Les radicaux R étant pour:
- le monomère I . diméthoxytrityle, ou tertiobutyldiméthysilyle, ou un groupement photolabile, l0 - le monomëre II . monométhoxytrityle, fluorénylméthoxycarbonyle, t-Butoxycarbonyle, ou un groupement photolabile, La figure 3 représente le schéma général de synthèse d'un composé chimique complexe selon l'exemple 1.
Exemple 1:
Synthèses d'oligonucléotides (séquence 26mer « HBV
Capture » et autres séquences utilisables pour le diagnostic médical) sur un support poreux CPG 2000A
recouvert par le copolymère linéaire P(AMMVE) (Anhydride Maléfique-a1t-Méthyl Vinyl Ether) (Masse moyenne en nombre (Mn) 67000).
A) Matériels et procédés On dispose de billes de silice Fluka (CPG, controlled pore size glass) de diamêtre 2000A, de taille de particules 40-85 ~~m et ayant une surface spécifique de 9,2 m2/g. Les billes de verre (100-150 ym) proviennent de la société Polysciences, Inc.
Les spectres 1H-RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker AM400 opérant dans un mode de transformation de Fourier. Les déplacements chimiques 1H
ont été exprimés en ppm avec référence au TMS. Les attributions des signaux 1H ont été effectuées par des expériences RMN en deux dimensions 1H-1H en rapport homonucléaire. Les analyses de masses ont été faites sur __' ~!~ ~ ,sr~;c:,-_i;~___ .. . _. .._ un spectromètre ZAB2-SEQ en FAB+, avec une matrice de thio-glycérol.
Le polymère utilisé est un copolymère alterné
d'anhydride maléfique et de méthyl vinyl éther P(AMMVE) fourni par Polysciences, Inc (Mn 67000g/mol).
Les synthèses d'oligodésoxyribonucléotides ont été
accomplies sur un appareil ABI 394 (Applied Biosystems, San Francisco, USA) en utilisant la chimie standard de synthèse ADN, du type cyanoéthyl N,N-diisopropylamino phosphoramidite.
Des expériences SEC-MALLS ont été effectuées en ligne avec le dispositif suivant de chromatographie haute performance d'exclusion de taille. Deux colonnes associées (Waters Ultra-Hydrogel 500 et 1000 ou Waters Ultra-Hydrogel 1000 et 2000) et une pompe Waters 510 de chromatographie liquide haute performance fonctionnaient avec un tampon à base d'acide borique de pH 10, en tant qu'éluant à une vitesse d'écoulement de 0,5 ml. min 1. Pour la partie détection, on a utilisé en même temps un détecteur d'absorbance Waters 484, un réfractomètre différehtiel Waters 410 et un détecteur MINI DAWN F à
trois angles (WYATT Technology) fonctionnant à 690 nm.
B) Synthèse de la 3'-amino modifiée dT (5'-Diméthoxytrityl-2'-déoxyThymidine,3'-(6-aminohéxyl)-phosphate selon la formule (I) de la figure 2 (biomonomère amorceur de polymérisation nucléotidique) ; cf. étape (B) de la figure 3.
On a séché 200 mg (0,37 mmol) de 5' diméthoxytrityl-2'-déoxy thymidine par coévaporations à
base de pyridine anhydre et d'acétonitrile anhydre, puis on l'a ensuite dissoute dans 7,5 ml d'acétonitrile. On a ajouté lentement de la 1H-tétrazole (0,55 mmol d'une solution acétonitrile à 0,35M) et de la 6-(trifluoroacétylamino)hexyl-(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)-phophoramidite (0,44 mmol d'une solution acétonitrile à 0,3M) par le septum et on a mélangé la solution à température ambiante. Après une heure, on a ajouté 4 ml d'une solution iodée (iode 100 mM dans H20 2%, pyridine 20%, THF 75%) goutte à goutte en 5 mn et on a agité le mélange pendant encore 10 mn avant de le concentrer sous pression réduite. On a dissous le résidu dans du CH2C12 et on a lavé le mélange organique une fois avec du NaHC03 à 5%, deux fois à l'eau, séché sur Na2S04 et évaporé jusqu'â l'état sec sous vide. Puis on a remis en suspension le résidu dans une solution de 700 1 d' éthanol et 6 ml (NHçOH à 30% aqueux) et on a réalisé la réaction de déprotection en 16 h, à 60°C, dans un flacon hermétique. Après concentration sous vide, on a soumis le résidu à une chromatographie sur une colonne de gel de silice dans (CH2CL2/TEA à 5%), avec élution par un gradient de méthanol pour obtenir le composé (I) (rendement 46%).
1H RMN (DMSO-d6): 1,32 (m, 2H, C-CH2-C), 1,37-1,42 (m, 4H, PO-CH2-CH2-CH2-C), 1,55 (t, 2H, C-CH2-CH2-NH2), 2,21-2,34 (m, 2H, H2'H2 "), 2,71 (t, 3H, C-CH2-NH2), 3,16-3,24 (m, 2H, H5'H5 "), 3,57 (t, 2H, PO-CH2-C), 3,71 (s, 6H, O-CH3), 4,07 (s, 1H, H4'), 4,-( (s, 1H, H3'), 6,16 (t, 1H, H1'), 7,21-7,36 (m, 13H, Har), 7,46 (s, 1H, H6), 7,8-8,6 (grand pic, 2H, NH2). En spectrométrie de masse, la masse exacte donnée par l'analyse est 724,3009 g/mol, ce qui correspond à la masse calculée (724,2999 g/mol).
C) Fonctionnalisation des supports CPG ou des billes de verre (support solide) ; cf. étape (C) de la figure 3, le support solide étant référencé S.
On a adapté l'étape de fonctionnalisation à partir d'une procédure antérieure publiée par Southern et Coll (Maskos, U. and Southern, E.M. (1992) Nucleic Acids Res., 20, 1679-1684). On a mis en suspension 3 g de CPG non modifié et 5 g de bille de verre dans 6m1 d'une solution d'acide chromique sulfurique (solution saturée en oxyde de chrome (VI) dans de l'acide sulfurique â 95%) (Prolabo).
Après 3h d'activation à 110°C, la majorité des groupements silane en surface étaient sous forme de groupements silanol. On a filtré les supports et on les a lavés minutieusement à l'eau. Après un lavage rapide avec de l'acétone sèche, on a séché les supports sous vide pendant une demi-heure et on les a immédiatement utilisés pour la silanisation.
On a mis en suspension les billes activées dans 28 ml d'une solution (6,1 ml de 3-glucidoxypropyltriméthoxysilane, 1,7 ml de triéthylamine, 20,2 ml de toluène sec). On a mélangé doucement les lo supports toute la nuit à 90°C, puis on les a lavés minutieusement avec de l'acétone anhydre et séchés 3h à
110°C.
Dans une deuxième étape, on a mis en suspension les billes dans 10 ml d'hexaéthylène glycol avec 6 1 d'acide sulfurique (à plus de 95%). On a mélangé doucement puis la réaction est effectuée toute la nuit à 90°C, puis on a lavé les billes avec de l'acétone anhydre et séché
dans un dessicateur.
D) Procédure générale pour greffer le conjugué
P(AMMVE)-nucléotide (I)) sur les billes de silice ; cf.
étape (D) de la figure 3.
Le nucléotide amorceur de polymérisation nucléotidique selon B) a été couplé sur les copolymères P(AMMVE) suivant le principe réactionnel décrit dans la figure 3.
15 mg (224 mmol) de copolymère ont été dissous dans 1 ml de diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO) à 37°C. En parrallèle, 10 mg (13,8 mol) de (I) ont été dissous dans 1 ml du même solvant. On ajoute successivement à un volume approprié de DMSO permettant un volume final de 1 ml pour la réaction 20 nmol de copolymère, 2 mol de nucléotide (I) et 1 mol de 4-diméthylaminopyridine (DMAP). Après avoir remué à température ambiante pendant 1 heure, on ajoute 90 mg de billes de silice au mélange et on permet à la réaction de greffage de s'effectuer toute la nuit. On filtre ensuite les supports et on lave délicatement avec du DMSO et de l' acétone anhydre avant de sécher sous vide pendant plusieurs heures. La quantité de diméthoxytrityle en surface a été estimée par un traitement acide de la silice.
E) Synthèse oligonucléotidique ; Cf étape (E) de la figure 3 La séquence choisie est une séquence de capture du VHB (virus de l'hépatite B).
5'-TCA ATC TCG GGA ATC TCA ATG TTA GT-3' l0 On a utilisé 0,1 mol ou 0,15 mol de support fonctionnalisé pour la synthèse en utilisant un protocole standard de cycle de couplage de 0,2 mol. Avant la synthèse, on a expérimenté différents temps de blocage des fonctions hydroxyles résiduelles du support solide (capping). Au cours de la synthèse, on a déterminé de manière automatique le rendement des étapes de la réaction de couplage par des mesures de la quantité de cations de type diméthoxytrityle relargée à chaque étape de couplage/déprotection. On a appliqué différents 2o traitements basiques pour les étapes de clivage et de déprotection. Après le dessalage (dans le cas de la déprotection au NaOH) et concentration sous vide, les distributions des masses molaires des conjugués (copolymère-ODN) ont été analysés par SEC-MALLS. On obtient des rendements par cycle de 98%.
Exemple 2:
Le même principe de synthèse que dans l'exemple 1 est mis en oeuvre mais en utilisant à titre de polymère réactif organique d'autres copolymères d'anhydride maléfique, tels que les copolymères (anhydride maléique-alt-éthylène), (anhydride maléfique-alt-styrène), (anhydride maléfique-alt-N-vinylpyrrolidone) ou des P(AMMVE) d'une autre taille (MM10.000 à 1.000.000). 224 nmol de polymère ont été dissous dans 1 ml de DMSO anhydre à 37°C. En parallèle, 10 mg (13,8 mol) du nucléotide (I) , FEUILLE MODIFIEE
modifié en 3' par un bras aminé, ont été dissous dans 1 ml de DMSO. 20 nmol de copolymère, 2 mol de (I) et 1 mol de diméthylaminopyridine (DMAP) - (solution à 10 mg/ml dans du DMSO) sont mis en solution dans une quantité suffisante 5 de DMSO anhydride pour atteindre un volume f final de 1 ml .
La réaction est agitée à température ambiante pendant 1 heure, puis 90 mg de billes de silice CPG 2000A (Control Pores Glass) ou 100 mg de billes de verre (Glass Beads) fonctionnalisées par un espaceur hydroxyle sont ajoutées à
La réaction ligand /anti-ligand peut se faire de manière directe ou indirecte.
Dans une réaction de type direct, le ligand est spécifique de la molêcule cible. Le ligand est notamment choisi pour être susceptible de former un duplex l0 ligand/molécule cible. A titre d'exemple le duplex peut notamment être représenté par tout couple antigène/anticorps, anticorps/haptène, chélatant/molécule chélatée, les hybrides polynucléotide/polynucléotide, polynucléotide/acide nucléique, les hybrides oligosaccharide/oligosaccharide, hormone/récepteur.
Dans une réaction de type indirect, le ligand est capable de former un duplex avec un réactif bi-fonctionnel comprenant un groupement "anti-ligand", responsable de la formation du duplex avec le ligand, et dans lequel ledit groupement anti-ligand est lié, notamment par covalence, de façon connue, à un groupe partenaire de la cible. Le groupe partenaire de la cible est un groupement capable de se lier avec la cible (en formant un complexe cible/partenaire) et est donc capable de capturer la cible, dans des conditions de l'essai, par établissement d'une liaison suffisamment forte pour assurer l'interaction cible-partenaire, par exemple par covalence et/ou par interactions ioniques et/ou par liaisons hydrogènes et/ou par liaisons hydrophobes hydrophiles. Le duplex ligand/anti-ligand peut être dans ce cas tout couple mentionné ci-dessus pour la réaction de type direct, ou encore un duplex biotine/streptavidine, lectine/sucre ou analogues. En particulier le complexe ligand/anti-ligand est un hybride polynucléotide/polynucléotide. Le complexe partenaire/cible est du méme type que le complexe - ~.
_;
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ligand/cible mentionné ci-dessus pour la réaction de type direct.
Un deuxième objet de l'invention est le procédé de synthèse chimique d'un composé chimique complexe objet de 5 l'invention et tel que décrit ci-dessus, comprenant une pluralité de biomonomëres, comprenant les étapes suivantes .
a) on dispose d'un support fonctionnel comprenant des groupements surfaciques ;
l0 b) on dispose d'au moins un polymère organique réactif dont le squelette comporte d'une part des fonctions latérales chimiques complémentaires des groupements surfaciques du support solide, et d'autre part des restes latéraux chimiques, ledit support solide étant IS inerte vis-à-vis dudit polymère organique ;
c) on dispose de biomonomères amorceurs de biopolymérisation, identiques ou différents, comprenant d'un côté un substituant réactif et d'un autre côté un groupement protecteur ;
d) on fait réagir au moins un polymère organique .
- soit avec le support solide, pour établir au moins une liaison covalente entre un groupement surfacique dudit support solide et une fonction latérale dudit polymère organique, puis on fait réagir le polymère organique lié au support solide avec une pluralité de biomonomères amorceurs, pour greffer ces derniers par covalence, directement ou indirectement, avec une pluralité de restes latéraux dudit polymère organique ;
- soit avec une pluralité de biomonomëres amorceurs, pour greffer ces derniers par covalence, directement ou indirectement, avec une pluralité de fonctions latérales dudit polymère organique, puis on fait réagir le polymère organique lié aux biomonomères amorceurs avec le support solide, pour établir au moins une liaison covalente entre un groupement surfacique dudit support solide et un reste dudit polymère organique.
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Le procédé de synthèse précédent s'effectue de préférence en faisant réagir au moins un polymère organique avec une pluralité de biomonomères amorceurs, pour greffer ces derniers par covalence, directement ou indirectement, avec une pluralité de restes latéraux dudit polymère organique, puis on fait réagir le polymère organique lié aux biomonomères amorceurs avec le support solide, pour établir au moins une liaison covalente entre un groupement surfacique dudit support solide et un reste l0 dudit polymère organique.
Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé comprend, après l'étape c et avant l'étape d, l'étape .
c') on fait réagir le polymère organique avec un réactif générateur de bras espaceurs, pour greffer sur une pluralité de restes latéraux dudit polymère organique une pluralité de bras espaceurs respectivement, comportant chacun à leur extrémité libre une fonction réactive.
Par exemple, le bras espaceur peut être:
R-O-(CH2)n-NH2 dans lequel R est un groupement diméthoxytrityle, tertiobutyldiméthysilyle ou un groupement photolabile.
Selon un autre mode préférentiel, le composé
chimique selon l'invention est caractérisé en ce que les biomonomères amorceurs sont prolongés et polymérisés avec des synthons, chacun selon une séquence prédéterminée pour obtenir des biopolymères.
Selon un mode très préférentiel de l'invention, le composé chimique selon l'invention est caractérisé en ce que les biopolymères sont de type oligonucléotide, et/ou peptide, et/ou oligonucléotide-peptide.
Selon un autre mode très préférentiel de l'invention, le composé chimique est caractérisé en ce que les biopolymères forment avec le polymère organique des ligands susceptibles de se lier directement ou indirectement à des anti-ligands.
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Un troisième objet de l'invention est l'utilisation du composé chimique complexe selon l'invention pour effectuer la synthèse des biopolymères, comprenant les étapes de:
f) on dispose de synthons identiques ou différents, g) par cycles successifs de couplage/déprotection, on fait croître les chaînes des biopolymères à partir des biomonomères amorceurs respectivement, selon au moins une même séquence prédéterminée de synthons.
Pour effectuer des synthèses de biopolymères différents, que ce soit des oligonucléotides/oligonucléotides ou peptides/peptides ou lo oligonucléotides/peptides, l'homme du métier saura choisir les biomonomëres amorceurs appropriés avec des groupements protecteurs sensibles ou non aux réactions chimiques effectuées. Ainsi, il est possible d'effectuer une première synthèse d'un premier groupe de biopolymères tout en gardant un deuxième groupe de biomonomères amorceurs protégés, et ensuite d'effectuer une seconde synthèse de biopolymères sur le deuxième groupe de biomonomères amorceurs déprotégés.
Les avantages de la synthèse des biopolymères sur le composé chimique complexe selon l'invention sont multiples. Cette synthèse directement sur le polymère réactif lié au support solide permet d'obtenir un biopolymère bien défini et orienté de manière correcte pour effectuer la détection et/ou la capture de molécules cibles de nature identique. De plus, la synthèse permet d'obtenir des biopolymères différents, tels que oligonucléotides et peptides, sur le même polymère réactif. I1 est également possible, par cette synthèse facilitée, d'obtenir en plusieurs étapes des dibiopolymères tels que oligonucléotides-peptides, pouvant par exemple permettre de détecter dans un même échantillon des matériels nucléiques et protéiques.
FEUILLE MOD!FIEE
Un quatrième objet de l'invention est le composé
complexe chimique obtenu par le procédé décrit précédemment et son utilisation pour différentes applications, notamment l'amplification de capture et/ou de détection de cibles biologiques, sous différents formats de bioessais (plaque de microtitrage, chromatographie, bandes, etc.), le séquençage d'oligonucléotides, la mutagénèse dirigée, en thérapeutique et autres applications adaptées à
l'utilisation du composé chimique complexe selon 1 - 111VC111~1V11.
Dans la mesure où l'on ne clive pas les liaisons covalentes liant le support aux polymères organiques, le réactif obtenu peut être utilisé pour amplifier la capture et la détection de cible biologiques.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, on effectue la synthèse d'un composé chimique complexe comprenant:
- un support solide fonctionnel comprenant des groupements surfaciques chimiques, - au moins un conjugué comprenant:
- un polymère organique réactif dont le squelette comporte d'une part des fonctions latérales chimiques réactives vis-à-vis des groupements surfaciques du support solide liées â ces derniers par liaison covalente, et d'autre part des restes latéraux chimiques, - une pluralité de biomonomères amorceurs mixtes branchés sur le polymère organique, liés respectivement auxdits restes chimiques dudit polymère organique, par une liaison covalente, caractérisé en ce que les biomonomères amorceurs mixtes sont prolongés et polymérisés avec d'autres synthons, chacun selon une séquence prédéterminée desdits synthons pour obtenir des biopolymères mixtes, tels que oligonucléotide et peptide.
Dans un autre mode de réalisation préféré selon 1 'invention, le composé chimique comprend des FF_UILLE l',~0~!FIEE
~.
biopolymères de type oligonucléotide et peptide, ou oligonucléotide-peptide.
Dans encore un autre mode de réalisation selon l'invention, le composé chimique complexe comprend des biopolymères formant avec le polymère organique auquel ils sont liés des ligands susceptibles d'être liés directement ou indirectement à des anti-ligands.
Dans la mesure où l'on clive les liaisons covalentes liant le support aux polymères organiques, on obtient des réactifs ou ligands, notamment des ligands constitués d'un polymère organique lié à des biopolymères de natures mixtes, par exemple peptides/oligonucléotides, susceptibles d'être utilisés pour l'amplification de capture et de détection de molécules cibles. Ces composés complexes polymère/oligonucléotides/peptides peuvent également être utilisés en thérapeutique. En effet, dans la mesure ou l'oligonucléotide peut être un agent antisens et le peptide être fusogène, on peut utiliser le composé
pour réguler l'expression génétique et optimiser l'internalisation du complexe dans les cellules. S
signifie "support" dans les figures 1 et 3. G signifie "groupement photolabile" dans la figure 2.
Les figures qui sont jointes ont un but d'illustration et ne limitent en rien l'étendue de la protection de la présente invention.
La figure 1 représente différentes formes possibles du composé chimique complexe selon 1 'invention, et du ligand correspondant.
Figures 1(a) et 1(a') représentent ie composé
chimique complexe et le ligand correspondant dont les biopolymères sont des oligonucléotides présentant la méme séquence d'acides nucléiques.
Figures 1(b) et 1(b') représentent le composé
chimique complexe et le ligand correspondant dont les biopolymères sont des oligonucléotides et des peptides.
-,' I~! i r_ '-~ L.:_ ~. . _~'I 'w . .
...
Figures 1(c) et 1(c') représentent le composé
chimique complexe et le ligand correspondant dont les biopolymères sont des oligonucléotides et des oligonucléotide-peptides.
5 La figure 2 représente quatre exemples d'oligomère amorceur.
Les radicaux R étant pour:
- le monomère I . diméthoxytrityle, ou tertiobutyldiméthysilyle, ou un groupement photolabile, l0 - le monomëre II . monométhoxytrityle, fluorénylméthoxycarbonyle, t-Butoxycarbonyle, ou un groupement photolabile, La figure 3 représente le schéma général de synthèse d'un composé chimique complexe selon l'exemple 1.
Exemple 1:
Synthèses d'oligonucléotides (séquence 26mer « HBV
Capture » et autres séquences utilisables pour le diagnostic médical) sur un support poreux CPG 2000A
recouvert par le copolymère linéaire P(AMMVE) (Anhydride Maléfique-a1t-Méthyl Vinyl Ether) (Masse moyenne en nombre (Mn) 67000).
A) Matériels et procédés On dispose de billes de silice Fluka (CPG, controlled pore size glass) de diamêtre 2000A, de taille de particules 40-85 ~~m et ayant une surface spécifique de 9,2 m2/g. Les billes de verre (100-150 ym) proviennent de la société Polysciences, Inc.
Les spectres 1H-RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker AM400 opérant dans un mode de transformation de Fourier. Les déplacements chimiques 1H
ont été exprimés en ppm avec référence au TMS. Les attributions des signaux 1H ont été effectuées par des expériences RMN en deux dimensions 1H-1H en rapport homonucléaire. Les analyses de masses ont été faites sur __' ~!~ ~ ,sr~;c:,-_i;~___ .. . _. .._ un spectromètre ZAB2-SEQ en FAB+, avec une matrice de thio-glycérol.
Le polymère utilisé est un copolymère alterné
d'anhydride maléfique et de méthyl vinyl éther P(AMMVE) fourni par Polysciences, Inc (Mn 67000g/mol).
Les synthèses d'oligodésoxyribonucléotides ont été
accomplies sur un appareil ABI 394 (Applied Biosystems, San Francisco, USA) en utilisant la chimie standard de synthèse ADN, du type cyanoéthyl N,N-diisopropylamino phosphoramidite.
Des expériences SEC-MALLS ont été effectuées en ligne avec le dispositif suivant de chromatographie haute performance d'exclusion de taille. Deux colonnes associées (Waters Ultra-Hydrogel 500 et 1000 ou Waters Ultra-Hydrogel 1000 et 2000) et une pompe Waters 510 de chromatographie liquide haute performance fonctionnaient avec un tampon à base d'acide borique de pH 10, en tant qu'éluant à une vitesse d'écoulement de 0,5 ml. min 1. Pour la partie détection, on a utilisé en même temps un détecteur d'absorbance Waters 484, un réfractomètre différehtiel Waters 410 et un détecteur MINI DAWN F à
trois angles (WYATT Technology) fonctionnant à 690 nm.
B) Synthèse de la 3'-amino modifiée dT (5'-Diméthoxytrityl-2'-déoxyThymidine,3'-(6-aminohéxyl)-phosphate selon la formule (I) de la figure 2 (biomonomère amorceur de polymérisation nucléotidique) ; cf. étape (B) de la figure 3.
On a séché 200 mg (0,37 mmol) de 5' diméthoxytrityl-2'-déoxy thymidine par coévaporations à
base de pyridine anhydre et d'acétonitrile anhydre, puis on l'a ensuite dissoute dans 7,5 ml d'acétonitrile. On a ajouté lentement de la 1H-tétrazole (0,55 mmol d'une solution acétonitrile à 0,35M) et de la 6-(trifluoroacétylamino)hexyl-(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)-phophoramidite (0,44 mmol d'une solution acétonitrile à 0,3M) par le septum et on a mélangé la solution à température ambiante. Après une heure, on a ajouté 4 ml d'une solution iodée (iode 100 mM dans H20 2%, pyridine 20%, THF 75%) goutte à goutte en 5 mn et on a agité le mélange pendant encore 10 mn avant de le concentrer sous pression réduite. On a dissous le résidu dans du CH2C12 et on a lavé le mélange organique une fois avec du NaHC03 à 5%, deux fois à l'eau, séché sur Na2S04 et évaporé jusqu'â l'état sec sous vide. Puis on a remis en suspension le résidu dans une solution de 700 1 d' éthanol et 6 ml (NHçOH à 30% aqueux) et on a réalisé la réaction de déprotection en 16 h, à 60°C, dans un flacon hermétique. Après concentration sous vide, on a soumis le résidu à une chromatographie sur une colonne de gel de silice dans (CH2CL2/TEA à 5%), avec élution par un gradient de méthanol pour obtenir le composé (I) (rendement 46%).
1H RMN (DMSO-d6): 1,32 (m, 2H, C-CH2-C), 1,37-1,42 (m, 4H, PO-CH2-CH2-CH2-C), 1,55 (t, 2H, C-CH2-CH2-NH2), 2,21-2,34 (m, 2H, H2'H2 "), 2,71 (t, 3H, C-CH2-NH2), 3,16-3,24 (m, 2H, H5'H5 "), 3,57 (t, 2H, PO-CH2-C), 3,71 (s, 6H, O-CH3), 4,07 (s, 1H, H4'), 4,-( (s, 1H, H3'), 6,16 (t, 1H, H1'), 7,21-7,36 (m, 13H, Har), 7,46 (s, 1H, H6), 7,8-8,6 (grand pic, 2H, NH2). En spectrométrie de masse, la masse exacte donnée par l'analyse est 724,3009 g/mol, ce qui correspond à la masse calculée (724,2999 g/mol).
C) Fonctionnalisation des supports CPG ou des billes de verre (support solide) ; cf. étape (C) de la figure 3, le support solide étant référencé S.
On a adapté l'étape de fonctionnalisation à partir d'une procédure antérieure publiée par Southern et Coll (Maskos, U. and Southern, E.M. (1992) Nucleic Acids Res., 20, 1679-1684). On a mis en suspension 3 g de CPG non modifié et 5 g de bille de verre dans 6m1 d'une solution d'acide chromique sulfurique (solution saturée en oxyde de chrome (VI) dans de l'acide sulfurique â 95%) (Prolabo).
Après 3h d'activation à 110°C, la majorité des groupements silane en surface étaient sous forme de groupements silanol. On a filtré les supports et on les a lavés minutieusement à l'eau. Après un lavage rapide avec de l'acétone sèche, on a séché les supports sous vide pendant une demi-heure et on les a immédiatement utilisés pour la silanisation.
On a mis en suspension les billes activées dans 28 ml d'une solution (6,1 ml de 3-glucidoxypropyltriméthoxysilane, 1,7 ml de triéthylamine, 20,2 ml de toluène sec). On a mélangé doucement les lo supports toute la nuit à 90°C, puis on les a lavés minutieusement avec de l'acétone anhydre et séchés 3h à
110°C.
Dans une deuxième étape, on a mis en suspension les billes dans 10 ml d'hexaéthylène glycol avec 6 1 d'acide sulfurique (à plus de 95%). On a mélangé doucement puis la réaction est effectuée toute la nuit à 90°C, puis on a lavé les billes avec de l'acétone anhydre et séché
dans un dessicateur.
D) Procédure générale pour greffer le conjugué
P(AMMVE)-nucléotide (I)) sur les billes de silice ; cf.
étape (D) de la figure 3.
Le nucléotide amorceur de polymérisation nucléotidique selon B) a été couplé sur les copolymères P(AMMVE) suivant le principe réactionnel décrit dans la figure 3.
15 mg (224 mmol) de copolymère ont été dissous dans 1 ml de diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO) à 37°C. En parrallèle, 10 mg (13,8 mol) de (I) ont été dissous dans 1 ml du même solvant. On ajoute successivement à un volume approprié de DMSO permettant un volume final de 1 ml pour la réaction 20 nmol de copolymère, 2 mol de nucléotide (I) et 1 mol de 4-diméthylaminopyridine (DMAP). Après avoir remué à température ambiante pendant 1 heure, on ajoute 90 mg de billes de silice au mélange et on permet à la réaction de greffage de s'effectuer toute la nuit. On filtre ensuite les supports et on lave délicatement avec du DMSO et de l' acétone anhydre avant de sécher sous vide pendant plusieurs heures. La quantité de diméthoxytrityle en surface a été estimée par un traitement acide de la silice.
E) Synthèse oligonucléotidique ; Cf étape (E) de la figure 3 La séquence choisie est une séquence de capture du VHB (virus de l'hépatite B).
5'-TCA ATC TCG GGA ATC TCA ATG TTA GT-3' l0 On a utilisé 0,1 mol ou 0,15 mol de support fonctionnalisé pour la synthèse en utilisant un protocole standard de cycle de couplage de 0,2 mol. Avant la synthèse, on a expérimenté différents temps de blocage des fonctions hydroxyles résiduelles du support solide (capping). Au cours de la synthèse, on a déterminé de manière automatique le rendement des étapes de la réaction de couplage par des mesures de la quantité de cations de type diméthoxytrityle relargée à chaque étape de couplage/déprotection. On a appliqué différents 2o traitements basiques pour les étapes de clivage et de déprotection. Après le dessalage (dans le cas de la déprotection au NaOH) et concentration sous vide, les distributions des masses molaires des conjugués (copolymère-ODN) ont été analysés par SEC-MALLS. On obtient des rendements par cycle de 98%.
Exemple 2:
Le même principe de synthèse que dans l'exemple 1 est mis en oeuvre mais en utilisant à titre de polymère réactif organique d'autres copolymères d'anhydride maléfique, tels que les copolymères (anhydride maléique-alt-éthylène), (anhydride maléfique-alt-styrène), (anhydride maléfique-alt-N-vinylpyrrolidone) ou des P(AMMVE) d'une autre taille (MM10.000 à 1.000.000). 224 nmol de polymère ont été dissous dans 1 ml de DMSO anhydre à 37°C. En parallèle, 10 mg (13,8 mol) du nucléotide (I) , FEUILLE MODIFIEE
modifié en 3' par un bras aminé, ont été dissous dans 1 ml de DMSO. 20 nmol de copolymère, 2 mol de (I) et 1 mol de diméthylaminopyridine (DMAP) - (solution à 10 mg/ml dans du DMSO) sont mis en solution dans une quantité suffisante 5 de DMSO anhydride pour atteindre un volume f final de 1 ml .
La réaction est agitée à température ambiante pendant 1 heure, puis 90 mg de billes de silice CPG 2000A (Control Pores Glass) ou 100 mg de billes de verre (Glass Beads) fonctionnalisées par un espaceur hydroxyle sont ajoutées à
10 la solution. La réaction est poursuivie toute la nuit, à
température ambiante. Les supports sont alors filtrés et lavés méticuleusement par du DMSO, de l'acétone anhydre puis séchés sous vide en présence de chlorure de calcium.
Ces supports sont alors utilisés pour effectuer 15 des synthèses d'oligonucléotides comme décrit dans l'exemple 1, une étape de capping de 11 minutes étant nécessaire au préalable.
Exemple 3:
20 Même synthèse que dans l'exemple 2, en utilisant à
titre de polymëre organique réactif le copolymère linéaire NVP-NAS (N-vinylpyrrolidone/N-acryloxy-succinimide) à la place de P(AMMVE).
Exemple 4.
Même principe de synthêse que dans l'exemple 1, en utilisant un support solide à base de polystyrène.
224 nmol de polymère ont été dissous dans 1 ml de DMSO anhydre à 37°C. En parallèle, l0 mg (13,8 mol) du nucléotide (I), modifié en 3' par un bras aminé, ont été
dissous dans 1 ml de DMSO. 20 nmol de copolymère, 2 mol de (I) et 1 mol de diméthylaminopyridine (DMAP) - (solution à
10 mg/ml dans du DMSO) sont mis en solution dans une quantité suffisante de DMSO anhydride pour atteindre un volume final de 1 ml. La réaction est agitée à température ambiante pendant 1 heure, puis 90 mg de particules à base FEUILLE fVlODIFIEE
~ , " ~ ...
de polystyrène (résine de co-polystyrène-1%
divinylbenzène, classiquement appelée la résine de Wang) fonctionnalisées par des extrémités 4-hydroxyméthyl-phénoxyméthyles, ou 90 mg de particules de co-polystyrène-divinylbenzène (support solide) fonctionnalisées par des extrémités 4-hydroxyméthyl-phénylacétamidométhyles (PAM résine), ou 90 mg de particules d'un support composite à base de polyacrylamide et d'une matrice inorganique (Kieselguhr), l0 fonctionnalisées par des extrémités 4-hydroxyméthyl-phénoxyacétyles (Novabiochem), ou 90 mg de particules d'un support polystyrène fonctionnalisées par du polyéthylène glycol terminé par une fonction hydroxyle ou p-oxybenzyl alcool (Novabiochem), ou 90 mg de particules de toutes résines à base de polystyrène fonctionnalisées par un bras espaceur hydroxyle, sont ajoutés à la solution. La réaction est agitée toute la nuit, à température ambiante.
Les supports sont alors filtrés et lavés méticuleusement par du DMSO, de l'acétone anhydre, puis séchés sous vide en présence de chlorure de calcium.
Ces supports sont alors utilisés pour effectuer des synthèses d'oligonucléotides comme décrits dans l'exemple 1, une étape de capping de 11 minutes étant nécessaire au préalable.
Exemple 5:
Les supports à base de polystyrène sont fonctionnalisés comme décrit précédemment avec P(AMMVE) et le biomonomère de formule (I) selon la figure 2, et/ou le monomère de formule (II) selon la figure 2, dans le but d'amorcer une synthèse peptidique sur phase solide en utilisant la chimie dite Fmoc.
Dans le cas des synthèses mixtes oligonucléotides/peptides, les fragments d'acides nucléiques seront synthétisés avant les peptides.
~~UILLE .'v?0~!~!E~
Exemple 6:
Des synthëses d'oligonucléotides ou de peptides sont effectuées sur un support sphérique à base de silice poreuse ou non poreuse, ou de polystyrène, fonctionnalisé
avec un copolymère linéaire d'anhydride maléfique relié au support par un bras espaceur stable en milieu basique.
L'objectif est de ne pas décrocher le conjugué
(copolymère/biomolécules) après synthèse. Ces réactifs pourront être utilisés pour la capture d'entités l0 biologiques (fragments de gëne, antigène, anticorps) directement à partir de milieux biologiques.
Le mode opératoire de la synthèse du support est le même que celui décrit dans l'exemple 2 et dans l'exemple 5, mais on utilise un support solide aminé et non pas hydroxyle.
224 nmol de polymëre ont été dissous dans 1 ml de DMSO anhydre à 37°C. En parallèle, 10 mg (13,8 mol) du nucléotide (I), modifié en 3' par un bras aminé, ont été
dissous dans 1 ml de DMSO. 20 nmol de polymère, 2 mol de (I) et 1 mol de diméthylaminopyridine (DMAP- solution à 10 mg/ml dans du DMSO) sont mis en solution dans une quantité
suffisante de DMSO anhydride pour atteindre un volume final de lml. La réaction est agitée à température ambiante pendant 1 heure, puis 90 mg de billes de silice CPG 2000A (Control Pores Glass) ou 100 mg de billes de verre (Glass Beads) ou 100 mg de billes de polystyrëne, fonctionnalisées par un espaceur aminé sont ajoutées à la solution. La réaction est poursuivie toute la nuit, à
température ambiante. Les supports sont alors filtrés et lavés méticuleusement par du DMSO, de l'acétone anhydre puis séchés sous vide en présence de Chlorure de Calcium.
Ces supports sont alors utilisés pour effectuer des synthèses d'oligonucléotides comme décrits dans l'exemple 1. Si le monomère (II), amorceur de synthèse peptidique est couplé sur le polymère, des synthèses __"i~L~ ~~,.w~=~~~
peptidiques peuvent ètre développées sur les supports, en utilisant la chimie dite Fmoc.
Exemple 7:
Méme protocole de synthèse des supports sphériques que dans l'exemple 1, ou dans l'exemple 6, en utilisant des monomères amorceurs des synthèses oligonucléotidiques de type (I), ou en utilisant des monomères amorceurs des synthèses peptidiques de type (II) ou en utilisant des l0 monomères amorceurs ayant la formule (III) selon la figure 2, ou ayant la formule (IV) selon la figure 3, possédant un groupement (G) protecteur photolabile sur le site d'initiation de la synthèse du biopolymère.
Le groupement photolabile (G) utilisé peut être par exemple le 6-nitrovératryle, le 6-nitropipéronyle, le méthyl-6-nitrovératryle, le nitrovératryloxycarbonyle, le mêthyl-6-nitropipéronyle, le nitrobenzyle, le nitrobenzyloxycarbonyle, le diméthyldiméthoxybenzyle, le diméthyldiméthoxybenzyloxycarbonyle, le 5-bromo-7 nitroindolinyle, l'hydroxy-méthylcinnamoyle, le 2-oxyméthylène anthraquinone, le pirénylméthoxycarbonyle.
L'amorce de la synthèse du biopolymère se fera par une exposition du support à une gamme de longueur d'ondes adaptée.
Exemple 8:
Même concept que dans l'exemple 7, en utilisant des supports plans (wafer de silicium, micro plaque de silice) silanisés en surface par un silane aminé, puis recouverts par un polymère linéaire à base d'anhydride maléfique. Les fonctions amines du bras espaceur vont réagir avec les fonctions hydrophiles du polymère pour créer une fonction amide stable en milieu basique. En greffant sur le polymère le monomère (I) et/ou (II) et/ou (III) et/ou (IV), des synthèses d'oligonucléotides et/ou de peptides peuvent ètre amorcées d'une manière contrôlée.
FEUILLE MODIFIEE
Les plaques sont traitées au préalable en milieu acide ou basique ou bien, si l'on utilise un système de masques spécifiques, elles peuvent être exposées à des radiations sur des zones délimitées de leur surface, afin d'éliminer les groupements photolabiles. Les fonctions réactives ainsi libérées, des synthèses de biopolymères peuvent être développées en surface par les méthodes classiques de la chimie sur support. Ces matrices fonctionnalisées peuvent étre utilisées pour le séquençage de gènes ou le screening lo d'anticorps.
FEUILLE MODIFlEE
température ambiante. Les supports sont alors filtrés et lavés méticuleusement par du DMSO, de l'acétone anhydre puis séchés sous vide en présence de chlorure de calcium.
Ces supports sont alors utilisés pour effectuer 15 des synthèses d'oligonucléotides comme décrit dans l'exemple 1, une étape de capping de 11 minutes étant nécessaire au préalable.
Exemple 3:
20 Même synthèse que dans l'exemple 2, en utilisant à
titre de polymëre organique réactif le copolymère linéaire NVP-NAS (N-vinylpyrrolidone/N-acryloxy-succinimide) à la place de P(AMMVE).
Exemple 4.
Même principe de synthêse que dans l'exemple 1, en utilisant un support solide à base de polystyrène.
224 nmol de polymère ont été dissous dans 1 ml de DMSO anhydre à 37°C. En parallèle, l0 mg (13,8 mol) du nucléotide (I), modifié en 3' par un bras aminé, ont été
dissous dans 1 ml de DMSO. 20 nmol de copolymère, 2 mol de (I) et 1 mol de diméthylaminopyridine (DMAP) - (solution à
10 mg/ml dans du DMSO) sont mis en solution dans une quantité suffisante de DMSO anhydride pour atteindre un volume final de 1 ml. La réaction est agitée à température ambiante pendant 1 heure, puis 90 mg de particules à base FEUILLE fVlODIFIEE
~ , " ~ ...
de polystyrène (résine de co-polystyrène-1%
divinylbenzène, classiquement appelée la résine de Wang) fonctionnalisées par des extrémités 4-hydroxyméthyl-phénoxyméthyles, ou 90 mg de particules de co-polystyrène-divinylbenzène (support solide) fonctionnalisées par des extrémités 4-hydroxyméthyl-phénylacétamidométhyles (PAM résine), ou 90 mg de particules d'un support composite à base de polyacrylamide et d'une matrice inorganique (Kieselguhr), l0 fonctionnalisées par des extrémités 4-hydroxyméthyl-phénoxyacétyles (Novabiochem), ou 90 mg de particules d'un support polystyrène fonctionnalisées par du polyéthylène glycol terminé par une fonction hydroxyle ou p-oxybenzyl alcool (Novabiochem), ou 90 mg de particules de toutes résines à base de polystyrène fonctionnalisées par un bras espaceur hydroxyle, sont ajoutés à la solution. La réaction est agitée toute la nuit, à température ambiante.
Les supports sont alors filtrés et lavés méticuleusement par du DMSO, de l'acétone anhydre, puis séchés sous vide en présence de chlorure de calcium.
Ces supports sont alors utilisés pour effectuer des synthèses d'oligonucléotides comme décrits dans l'exemple 1, une étape de capping de 11 minutes étant nécessaire au préalable.
Exemple 5:
Les supports à base de polystyrène sont fonctionnalisés comme décrit précédemment avec P(AMMVE) et le biomonomère de formule (I) selon la figure 2, et/ou le monomère de formule (II) selon la figure 2, dans le but d'amorcer une synthèse peptidique sur phase solide en utilisant la chimie dite Fmoc.
Dans le cas des synthèses mixtes oligonucléotides/peptides, les fragments d'acides nucléiques seront synthétisés avant les peptides.
~~UILLE .'v?0~!~!E~
Exemple 6:
Des synthëses d'oligonucléotides ou de peptides sont effectuées sur un support sphérique à base de silice poreuse ou non poreuse, ou de polystyrène, fonctionnalisé
avec un copolymère linéaire d'anhydride maléfique relié au support par un bras espaceur stable en milieu basique.
L'objectif est de ne pas décrocher le conjugué
(copolymère/biomolécules) après synthèse. Ces réactifs pourront être utilisés pour la capture d'entités l0 biologiques (fragments de gëne, antigène, anticorps) directement à partir de milieux biologiques.
Le mode opératoire de la synthèse du support est le même que celui décrit dans l'exemple 2 et dans l'exemple 5, mais on utilise un support solide aminé et non pas hydroxyle.
224 nmol de polymëre ont été dissous dans 1 ml de DMSO anhydre à 37°C. En parallèle, 10 mg (13,8 mol) du nucléotide (I), modifié en 3' par un bras aminé, ont été
dissous dans 1 ml de DMSO. 20 nmol de polymère, 2 mol de (I) et 1 mol de diméthylaminopyridine (DMAP- solution à 10 mg/ml dans du DMSO) sont mis en solution dans une quantité
suffisante de DMSO anhydride pour atteindre un volume final de lml. La réaction est agitée à température ambiante pendant 1 heure, puis 90 mg de billes de silice CPG 2000A (Control Pores Glass) ou 100 mg de billes de verre (Glass Beads) ou 100 mg de billes de polystyrëne, fonctionnalisées par un espaceur aminé sont ajoutées à la solution. La réaction est poursuivie toute la nuit, à
température ambiante. Les supports sont alors filtrés et lavés méticuleusement par du DMSO, de l'acétone anhydre puis séchés sous vide en présence de Chlorure de Calcium.
Ces supports sont alors utilisés pour effectuer des synthèses d'oligonucléotides comme décrits dans l'exemple 1. Si le monomère (II), amorceur de synthèse peptidique est couplé sur le polymère, des synthèses __"i~L~ ~~,.w~=~~~
peptidiques peuvent ètre développées sur les supports, en utilisant la chimie dite Fmoc.
Exemple 7:
Méme protocole de synthèse des supports sphériques que dans l'exemple 1, ou dans l'exemple 6, en utilisant des monomères amorceurs des synthèses oligonucléotidiques de type (I), ou en utilisant des monomères amorceurs des synthèses peptidiques de type (II) ou en utilisant des l0 monomères amorceurs ayant la formule (III) selon la figure 2, ou ayant la formule (IV) selon la figure 3, possédant un groupement (G) protecteur photolabile sur le site d'initiation de la synthèse du biopolymère.
Le groupement photolabile (G) utilisé peut être par exemple le 6-nitrovératryle, le 6-nitropipéronyle, le méthyl-6-nitrovératryle, le nitrovératryloxycarbonyle, le mêthyl-6-nitropipéronyle, le nitrobenzyle, le nitrobenzyloxycarbonyle, le diméthyldiméthoxybenzyle, le diméthyldiméthoxybenzyloxycarbonyle, le 5-bromo-7 nitroindolinyle, l'hydroxy-méthylcinnamoyle, le 2-oxyméthylène anthraquinone, le pirénylméthoxycarbonyle.
L'amorce de la synthèse du biopolymère se fera par une exposition du support à une gamme de longueur d'ondes adaptée.
Exemple 8:
Même concept que dans l'exemple 7, en utilisant des supports plans (wafer de silicium, micro plaque de silice) silanisés en surface par un silane aminé, puis recouverts par un polymère linéaire à base d'anhydride maléfique. Les fonctions amines du bras espaceur vont réagir avec les fonctions hydrophiles du polymère pour créer une fonction amide stable en milieu basique. En greffant sur le polymère le monomère (I) et/ou (II) et/ou (III) et/ou (IV), des synthèses d'oligonucléotides et/ou de peptides peuvent ètre amorcées d'une manière contrôlée.
FEUILLE MODIFIEE
Les plaques sont traitées au préalable en milieu acide ou basique ou bien, si l'on utilise un système de masques spécifiques, elles peuvent être exposées à des radiations sur des zones délimitées de leur surface, afin d'éliminer les groupements photolabiles. Les fonctions réactives ainsi libérées, des synthèses de biopolymères peuvent être développées en surface par les méthodes classiques de la chimie sur support. Ces matrices fonctionnalisées peuvent étre utilisées pour le séquençage de gènes ou le screening lo d'anticorps.
FEUILLE MODIFlEE
Claims
1/ Composé chimique complexe comprenant:
- un support solide, des groupements chimiques surfaciques liés par liaison covalente au support solide, - un conjugué comprenant un polymère organique comportant des fonctions latérales chimiques liées aux groupements surfaciques, et des restes latéraux chimiques, caractérisé en ce que des biomonomères amorceurs, éventuellement modifiés chimiquement, d'un côté sont liés par covalence, d'un côté respectivement aux restes chimiques dudit polymère organique, et de l'autre côté
chacun à un biopolymère 2/ Composé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la liaison covalente des biomonomères amorceurs aux restes chimiques du polymère organique n'est pas clivable, dans les conditions de clivage de la liaison support/polymère organique.
3/ Composé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que les fonctions latérales du polymère organique réactif sont de type électrophile, et /ou thiol, et/ou pont disulfure.
4/ Composé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que les biomonomères amorceurs, identiques ou différents, sont des nucléosides, et/ou nucléotides, et/ou des acides aminés, et/ou des saccharides, naturels ou modifiés.
5/ Composé selon la revendication 4, caractérisé
en ce que les biomonomères amorceurs sont à la fois des nucléotides et des acides aminés.
6/ Composé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que les biomonomères amorceurs sont prolongés et polymérisés avec d'autres synthons, chacun selon une séquence prédéterminée desdits synthons, pour obtenir des biopolymères mixtes, tels que oligonucléotides et/ou peptides liés au polymère organique.
7/ Composé chimique selon la revendication 6, caractérisé en ce que les biopolymères mixtes sont de type oligonucléotide et peptide, ou de type oligonucléotide-peptide.
8/ Composé chimique complexe selon la revendication 7, caractérisé en ce que les biopolymères forment avec le polymère organique auquel ils sont liés des ligands susceptibles d'être liés directement ou indirectement à des anti-ligands.
9/ Procédé de synthèse chimique d'un composé selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes :
a) on dispose d'un support solide fonctionnel, comprenant des groupements surfaciques, b) on dispose d'au moins un polymère organique réactif, dont le squelette comporte d'une part des fonctions latérales chimiques complémentaires des groupements surfaciques du support solide, et d'autre part des restes latéraux chimiques, c) on dispose de biomonomères amorceurs de biopolymérisation, identiques ou différents, comprenant d'un côté un substituant réactif et d'un autre côté un groupement protecteur, d) on fait réagir au moins ledit polymère organique:
- soit avec le support solide, pour établir une liaison covalente entre les groupements surfaciques dudit support solide et les fonctions latérales dudit polymère organique, puis on fait réagir le polymère organique lié
au support solide avec les biomonomères amorceurs, pour greffer ces derniers par covalence, directement ou indirectement, avec les restes latéraux dudit polymère organique, - soit avec les biomonomères amorceurs, pour greffer ces derniers par covalence, directement ou indirectement, avec les restes latéraux dudit polymère organique, puis on fait réagir le polymère organique lié
aux biomonomères amorceurs avec le support solide, pour établir une liaison covalente entre les groupements surfaciques dudit support solide et les fonctions latérales dudit polymère organique.
10/ Procédé selon la revendication 9, caractérisé
en ce qu'il comprend, après l'étape c et avant l'étape d, l'étape suivante :
c') on fait réagir le polymère organique avec un réactif générateur de bras espaceurs, pour greffer sur les fonctions latérales dudit polymère organique des bras espaceurs respectivement, comportant chacun à leur extrémité libre une fonction réactive.
11/ Composé chimique complexe comprenant:
- un support solide, - des groupements chimiques surfaciques liés par liaison covalente au support solide, - au moins un conjugué comprenant un polymère organique comportant des fonctions latérales chimiques liées aux groupements surfaciques, et des restes latéraux chimiques, caractérisé en ce que des biomonomères amorceurs, c'est-à-dire des biomonomères modifiés chimiquement sont liés par covalence, respectivement aux restes chimiques dudit polymère organique.
12/ Utilisation du composé selon la revendication 11, pour effectuer la synthèse d'un ligand, comprenant les étapes de :
f) on dispose de synthons identiques ou différents, g) par cycles successifs de couplage/déprotection, on fait croître les chaînes des biopolymères à partir des biomonomères amorceurs du composé respectivement, selon au moins une même séquence prédéterminée des synthons, h) on clive la liaison support/polymère organique.
13/ Utilisation selon la revendication 12 comprenant entre les étapes g et h, l'étape :
i) on fait croître des chaînes de biopolymères, par cycles successifs de couplage/déprotection des synthons, à partir d'autres biomonomères amorceurs respectivement, selon au moins une même autre séquence prédéterminée des synthons.
14/ Utilisation selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'étape (h) est effectuée par réaction chimique ou enzymatique ou thermique ou photochimique.
15/ Réactif caractérisé en ce qu'il comprend un composé chimique selon l'une quelconque des revendications
1 à 11.
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