CN111819288A - 基于杂交链式反应的免疫信号放大方法 - Google Patents

基于杂交链式反应的免疫信号放大方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于抗体的生物分析方法，特别是一种用于放大免疫信号的基于杂交链式反应的方法，被称为免疫信号HCR(isHCR)，其将抗体‑抗原相互作用与杂交链式反应(HCR)技术相结合来放大免疫信号。本发明还提供了一种用于执行上述isHCR的试剂盒。

Description

基于杂交链式反应的免疫信号放大方法
背景技术
由于基于抗体的免疫测定的易于使用、速度和成本效益，它们一直是检测和鉴定蛋白质和其它生物分子在生物样品中的位置的最流行的方法。这些方法使用与目标分子(抗原)选择性结合的第一抗体，并且这种抗体-抗原相互作用可通过可识别第一抗体-表位复合物并与之反应的偶联的报道分子或标记的第二抗体而被可视化(Han，K.N.，Li，C.A.&Seong，G.H.Annu.Rev.Anal.Chem.6，119–141(2013))。使用免疫测定时的主要限制是样品中给定目标分子的低丰度往往需要先进行信号放大然后才可能检测。可以使用催化生色底物在目标复合物上沉积的偶联的酶例如辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶等来实现放大(Bobrow，M.N.，Harris，T.D.，Shaughnessy，K.J.&Litt，G.J.J.Immunol.Methods 125，279–285(1989))。已开发出荧光底物，尤其是基于HRP-酪胺反应化学的荧光底物，来支持高分辨率荧光显微术(Stack，E.C.，Wang，C.，Roman，K.A.&Hoyt，C.C.Methods70，46–58(2014))。虽然现行的放大方法非常有用且被广泛采用，但它们有几个缺点：它们经常产生高本底，它们可由于染料扩散而降低空间分辨率，它们难以用于同时检测多个放大的信号(Carvajal-Hausdorf，D.E.，Schalper，K.A.，Neumeister，V.M.&Rimm，D.L.Lab.Invest.95，385–396(2015))，而且它们不适合用于几种强大的新型组织膨胀和透明化技术中的大体积样品。
在本发明中，我们发现无酶放大途径能够克服这些限制中的许多种。特别是杂交链式反应(HCR)技术适于放大免疫信号。HCR，其根据在自组装为聚合物的DNA发夹寡聚体集之间发生的识别和杂交事件，迄今主要用于放大来自原位杂交样品的mRNA信号(Choi，H.M.T.，Beck，V.A.&Pierce，N.A.ACS Nano 8，4284–4294(2014)；Shah，S.等人Development143，2862–2867(2016))，并且最近用于检测蛋白质-蛋白质相互作用(Koos，B.等人Nat.Commun.6，7294(2015))。在典型的使用情况下，与目标mRNA分子互补的核酸探针被用作‘引发链’寡核苷酸。从引发链寡核苷酸开始，使用一系列聚合反应将荧光团标记的核酸‘放大链’寡核苷酸添加到目标mRNA-引发链复合物中；然后将荧光团可视化。
发明内容
本发明提供了一种基于抗体的生物分析方法，具体而言是一种称为免疫信号HCR(isHCR)的方法，所述方法将抗体-抗原相互作用与杂交链式反应(HCR)技术相结合。本发明还提供了一种用于执行上述isHCR的试剂盒。本发明进一步提供了一种基于抗体的生物分析方法，具体而言是一种称为多轮式免疫信号HCR(isHCR)的方法(多轮式isHCR)，所述方法将抗体-抗原相互作用与杂交链式反应(HCR)相结合，其中使用了多轮放大以使HCR聚合物分支和生长。相应地，本发明也提供了一种用于执行多轮式isHCR的试剂盒。
在第一方面，本发明提供了一种isHCR方法，所述方法包括将HCR引发链与分析物特异性的抗体(包括但不限于传统的IgG和纳米抗体)偶联，并添加一对放大链以进行杂交链式反应。
在第二方面，本发明提供了一种用于执行所述isHCR方法的试剂盒，所述试剂盒包含(1)分析物特异性的抗体；(a)HCR引发链(HCR initiator)；和(3)一对HCR放大链(HCRamplifiers)，其中所述HCR引发链具有用于与HCR放大链杂交的区域和用于偶联所述抗体的区域。
在第三方面，本发明提供了一种HCR引发链，所述引发链具有用于与HCR放大链杂交的区域和用于偶联待分析的分析物特异性的抗体的区域。
在第四方面，本发明提供了一种待分析的分析物特异性的抗体，所述抗体直接或间接地与HCR引发链偶联。
所述HCR引发链可以与几种类型的自组装型DNA HCR放大链中的任何一种杂交，所述放大链包括可用于使原始目标信号可视化的荧光团标记的放大链寡核苷酸。
所述放大链是带荧光标签的放大链或生物素化的HCR放大链。
HCR引发链利用许多相互作用与抗体偶联，所述相互作用例如链霉亲和素-生物素相互作用、共价键相互作用(化学接头，例如，胺反应性接头、硫醇反应性接头或点击化学接头)等。胺反应性接头可以是含有琥珀酰亚胺酯基团的接头。硫醇反应性接头可以是含有马来酰亚胺基团的接头。点击化学接头可以是含有点击化学官能团的接头，例如NHS-叠氮化物接头、NHS-DBCO接头、马来酰亚胺-叠氮化物接头或马来酰亚胺-DBCO接头。
优选地，所述HCR引发链是生物素化的引发链，它能够与链霉亲和素的空位结合位点相连，而链霉亲和素能够与生物素化的抗体相连，从而使所述HCR引发链与所述抗体偶联。
优选地，在本发明isHCR方法中使用的HCR引发链和放大链(H1和H2)可以被末端修饰或内部修饰以改善信号强度或作为进入其它化学反应的界面。本发明isHCR方法中使用的HCR引发链和放大链(H1和H2)可以用化学基团和/或荧光染料进行末端修饰或内部修饰。例如，本发明isHCR方法中使用的HCR引发链和放大链(H1和H2)可以用生物素、acrydite、胺、硫醇、DBCO和/或荧光染料进行末端修饰和/或内部修饰。荧光染料可以是FITC、花青染料、Alexa Fluors、Dylight fluors、Atto染料或Janelia Fluor染料。
优选地，所述isHCR方法使用生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用，其中DNA-生物素HCR引发链与生物素化抗体相连并进而触发标记的HCR放大链自组装成聚合物。例如，所述标记的HCR放大链是荧光团标记的HCR放大链。
所述isHCR方法使用无标记的链霉亲和素，这允许合成的5’-生物素化的DNAHCR引发链与链霉亲和素的空位结合位点相位，链霉亲和素又与生物素化抗体相连。
所述生物素化抗体可以是与目标抗原特异性的第一抗体反应的生物素化第二抗体。
优选地，本发明提供了一种试剂盒，其包含：(1)分析物特异性的生物素化抗体；(2)链霉亲和素；(3)生物素化的引发链；以及(4)一对HCR放大链。
本发明isHCR方法或试剂盒可用于在不同亚细胞位置(例如，细胞膜和囊泡膜、胞质溶胶、线粒体和细胞核)处以及在各种类型的样品(例如，印迹、培养细胞、组织切片和整个器官)中强有力地放大免疫信号。因此，所述isHCR方法可用于分析生物样品中的分析物。特别是，本发明isHCR方法可用于实验室、临床或诊断应用，尤其是现场应用，例如临床位点护理。
所述isHCR方法在需要灵敏检测免疫信号的应用中尤其有用。我们在此证明了它在用单克隆抗体放大免疫信号中、及在检测丰度极低的易位细菌效应子信号中的用途，以及其它应用。isHCR的实际放大性能取决于特定的应用和给定目标信号的丰度：对于在Western印迹和组织切片样品中的信号放大，isHCR的表现超出标准IHC高达两个数量级。
在第五方面，本发明提供了一种多轮式isHCR方法，所述方法包括将HCR引发链与分析物特异性的抗体(包括但不限于传统的IgG和纳米抗体)偶联，并添加一对放大链以进行杂交链式反应，其中放大链或一对放大链经过修饰以进入分支多轮放大以便使HCR聚合物分支和生长。
在第六方面，本发明提供了一种用于执行多轮式isHCR的试剂盒，所述试剂盒包含(1)分析物特异性的抗体；(a)HCR引发链；和(3)一对HCR放大链，其中所述HCR引发链具有用于与HCR放大链杂交的区域和用于偶联所述抗体的区域，并且放大链或一对放大链经过修饰以进入分支多轮放大以便使HCR聚合物分支和生长。
在第七方面，本发明提供了一对放大链，其中放大链或一对放大链经过修饰以进入分支多轮放大以便使HCR聚合物分支和生长。
所述HCR引发链可以与几种类型的自组装型DNA HCR放大链中的任何一种杂交，所述放大链包括可用于使原始目标信号可视化的荧光团标记的放大链寡核苷酸。
HCR引发链利用许多相互作用与抗体偶联，所述相互作用例如链霉亲和素-生物素相互作用、共价键相互作用(化学接头，例如，胺反应性接头或点击化学接头)等。胺反应性接头可以是含有琥珀酰亚胺酯基团的接头。点击化学接头可以是含有点击化学官能团的接头，例如NHS-叠氮化物接头、NHS-DBCO接头、马来酰亚胺-叠氮化物接头或马来酰亚胺-DBCO接头。
优选地，所述HCR引发链是生物素化的引发链，它能够与链霉亲和素的空位结合位点相连，而链霉亲和素能够与生物素化的抗体相连，从而使所述HCR引发链与所述抗体偶联。
在本多轮HCR中使用的HCR引发链和/或放大链(H1和H2)可以被末端修饰或内部修饰以改善信号强度或作为进入其它化学反应的界面。
本多轮式isHCR中使用的HCR放大链(H1和H2)可以用化学基团和/或荧光染料进行末端修饰或内部修饰，从而允许引发更多轮的放大。在这种情况下，所述放大链(H1和H2)可以用生物素、洋地黄毒苷、acrydite、胺、琥珀酰亚胺酯、硫醇、叠氮化物、TCO、四嗪、炔烃和/或DBCO进行末端修饰或内部修饰。荧光染料，例如FITC、花青染料、Alexa Fluors、Dylightfluors、Atto染料或Janelia Fluor染料，其中Alexa Fluors可以是例如Alexa Fluro 546、Alexa Fluor 488和/或Alexa Fluor 647，也可以与生物素、洋地黄毒苷、acrydite、胺、琥珀酰亚胺酯、硫醇、叠氮化物、TCO、四嗪、炔烃和/或DBCO一起标签于所述放大链上。例如，可以用生物素基团标记放大链。一旦这些DNA-生物素放大链自组装并与正在生长的isHCR聚合物连接，它们的生物素就可以与新添加的链霉亲和素反应(并由此可以与更多的HCR引发链等反应)，从而引发更多轮的聚合物生成。可以将一对信号分子修饰的放大链(例如一对带荧光团标签的放大链)添加到isHCRn的最后一轮中以进行可视化。
优选地，所述放大链在内部位置被修饰，其更易于接近结合配偶体，例如链霉亲和素，充当了多轮式isHCR(isHCRn)中每个连续的分支轮的锚点。
本多轮式isHCR方法中使用的HCR引发链可被末端修饰或内部修饰以改善信号强度。用于本多轮式isHCR方法中的HCR引发链可以用化学基团和/或荧光染料进行末端修饰或内部修饰。例如，用于本多轮HCR中的HCR引发链可以用生物素、acrydite、胺、硫醇、DBCO和/或荧光染料进行末端修饰和/或内部修饰。荧光染料可以是FITC、花青染料、AlexaFluors、Dylight fluors、Atto染料或Janelia Fluor染料，其中Alexa Fluors可以是例如Alexa Fluro 546、Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 647。
优选地，所述多轮式isHCR使用生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用，其中DNA-生物素HCR引发链与生物素化抗体相连并进而触发标记的HCR放大链自组装成聚合物。例如，所述标记的HCR放大链是荧光团标记的HCR放大链。
所述多轮式isHCR使用无标记的链霉亲和素，这允许合成的5’-生物素化的DNAHCR引发链与链霉亲和素的空位结合位点相位，链霉亲和素又与生物素化抗体相连。
所述生物素化抗体可以是与目标抗原特异性的第一抗体反应的生物素化第二抗体。
所述多轮式isHCR可用于在不同亚细胞位置(例如，细胞膜和囊泡膜、胞质溶胶、线粒体和细胞核)处以及在各种类型的样品(例如，印迹、培养细胞、组织切片和整个器官)中强有力地放大免疫信号。因此，所述isHCR方法可用于分析生物样品中的分析物。特别是，本isHCR方法可用于实验室、临床或诊断应用，尤其是现场应用，例如临床位点护理。
所述多轮式isHCR在需要灵敏检测免疫信号的应用中尤其有用。所述isHCR方法可用于用单克隆抗体放大免疫信号、用于检测易位细菌效应子的丰度极低的信号和在ExM中增强稀释的免疫信号，以及其它应用。isHCR的实际放大性能取决于特定的应用和给定目标信号的丰度：对于在Western印迹和组织切片样品中的信号放大，isHCR的表现超出标准IHC高达两个数量级；用ExM样品实现了3个数量级的改善。与非多轮式isHCR相比，基于带HA标签的scFv的western印迹的测试显示，额外进行两轮放大(isHCR3)导致蛋白质检测灵敏度多改善十倍。当我们测试isHCRn对于针对TH的免疫染色性能时，每轮isHCR放大均增加了免疫阳性信号强度。
在第八方面，本发明提供了一种用于放大免疫荧光且本底较低的改进的isHCR方法或改进的isHCRn方法，所述方法除上述isHCR或isHCRn之外，还包括使用氧化石墨烯(GO)以吸收未组装的HCR放大链。如果所述放大链被荧光染料末端修饰和/或内部修饰，则氧化石墨烯(GO)也可猝灭荧光。
在第九方面，本发明提供了一种用于执行所述改进的isHCR方法的试剂盒，所述试剂盒包含(1)分析物特异性的抗体；(a)HCR引发链；(3)一对HCR放大链，其中所述HCR引发链具有用于与HCR放大链杂交的区域和用于偶联所述抗体的区域；和(4)氧化石墨烯(GO)。
在第十方面，本发明提供了一种用于执行所述改进的多轮式isHCR的试剂盒，所述试剂盒包含(1)分析物特异性的抗体；(a)HCR引发链；(3)一对HCR放大链，其中所述HCR引发链具有用于与HCR放大链杂交的区域和用于偶联所述抗体的区域，并且放大链或一对放大链经过修饰以进入分支多轮放大以便使HCR聚合物分支和生长；和(4)氧化石墨烯(GO)。
本发明中的氧化石墨烯的粒度<500nm。关键的是，除了消除HCR放大链的荧光之外，将HCR引发链与HCR放大链和GO一起添加还导致荧光的显著恢复，这很可能是因为所述引发链触发了HCR放大链形成双链带缺口的聚合物，从而保护它们免受GO的吸附活性。也就是说，GO可用来抑制本底水平，进一步提高isHCR的性能。
GO的添加降低了本底，但并未削弱信号强度，导致与未用GO的isHCR放大相比，信噪比改善。令人惊讶的是，使用抗体系列稀释实验进行进一步分析表明，与标准IHC染色方法相比，用GO的isHCR显著增加了信号强度，当第一抗体被高度稀释时达到了大于80×的放大倍数。
本发明包括本文所列举的特定实施方式的所有组合。
附图说明
图1.所述isHCR方法可大幅放大各种类型的生物样品中的免疫荧光信号。
图2.使用isHCR确定Western印迹的动态范围。纯化的scFv-GCN4-HA-GB1蛋白经连续稀释。
图3.isHCR放大维持了培养细胞中膜结合GFP(mGFP)免疫信号的空间分辨率。
图4.使用isHCR的TH免疫染色揭示了丰富得多的脑中儿茶酚胺能神经支配。
图5.降低本底噪声的isHCR优化。
图6.isHCR大幅增加小鼠脑切片中的IHC信号。
图7.isHCR特异性放大小鼠脑切片中的Vglut3免疫信号。
图8.isHCR有效放大各种免疫荧光信号。
图9.isHCR能够检测对标准IHC方法具有挑战性的生物分子。
图10.isHCR放大能够检测低丰度的蛋白质。
图11.HCR引发链可以使用化学接头直接偶联到抗体上。
图12.使用isHCRn进行多轮放大。
具体实施方式
在第一实施方式中，发明人使用isHCR用典型的蛋白质印迹法分析纯化的带HA标签的蛋白。分析物蛋白是纯化的单链可变片段(scFv)(Tanenbaum，M.E.，Gilbert，L.A.，Qi，L.S.，Weissman，J.S.，和Vale，R.D.Cell 159，635–646.(2014))，并且这些实验使用DNA-Alexa Fluor 546HCR放大链(HCR-546)。1ng scFv的isHCR放大的荧光信号在强度上与用传统的Alexa Fluor 546偶联的链霉亲和素方法(SA-546)测量的100ng scFv的荧光信号强度相当，表明isHCR可以使蛋白检测灵敏度增加100倍(图1b)。与流行的可商购的酶基化学发光检测方法相比，isHCR表现出相似的检测灵敏度，但动态范围更广(图2)。
然后，在第二实施方式中，发明人接下来检查了其在细胞中的性能。将表达膜结合增强的GFP(mGFP)的培养HEK293T细胞针对GFP进行免疫染色。该免疫信号使用DNA荧光团HCR放大链通过isHCR进行放大。靶标的isHCR放大的荧光信号比用典型的荧光团偶联的链霉亲和素方法测得的信号大幅增强(图1c)。为了证实isHCR放大的特异性，进行了用表达mGFP的细胞的另外的对照实验和分析。将含有等量Alexa Fluor 488偶联第二抗体和生物素化第二抗体的抗体混合物用于检测抗GFP第一抗体，并使用isHCR-546放大生物素化第二抗体的信号。共焦显微术显示未放大的信号和放大的信号是共定位的，表明isHCR放大了真正的mGFP信号(图3a)。此外，这些实验证实，isHCR在亚细胞水平上不影响衍射极限共焦成像的空间分辨率：由未放大的mGFP信号数据计算的细胞膜平均宽度与由isHCR放大的mGFP信号数据计算的平均宽度没有差异(图3b，c)。
在第三实施方式中，将isHCR应用于增强组织中的免疫组织化学(IHC)染色信号。将小鼠脑切片针对酪氨酸羟化酶(TH)进行免疫染色，酪氨酸羟化酶是儿茶酚胺生物合成的关键酶。与平行进行的传统荧光团偶联链霉亲和素方法相比，我们的isHCR分析揭示了TH阳性信号在整个大脑神经元突起中分布更为广泛。除了这两种方法都可见的强信号外，isHCR放大还揭示了皮质和皮质下结构中许多离散的TH阳性神经元突起；在传统的免疫染色分析中，这些突起的TH阳性信号非常弱或可忽略(图1d和图4a)。省略针对TH的第一抗体在脑中产生的无特异性标记(图4b)。在传统的IHC分析中，另外对两个脑区的对照TH免疫染色实验显示出强烈的TH信号：背侧纹状体(DS)和脑旁核(PVN)(图1e和图4c)。对这两个脑区，未放大的信号和isHCR放大的信号共定位，并且TH阳性神经元突起的平均宽度上没有观察到显著性差异(图1e和图4c)，进一步证实了isHCR放大的特异性并显示isHCR放大没有影响细胞和亚细胞水平上衍射极限共焦成像的空间分辨率。
考虑到可商购的生物素化抗体(第二抗体和单克隆第一抗体)为数众多，isHCR与链霉亲和素-生物素相互作用的相容性将允许迅速采用isHCR作为大多数现有免疫测定的任选“附加”放大步骤。链霉亲和素-生物素版本的isHCR也可能与其它蛋白-链霉亲和素技术(例如，Strep标签和使用生物素连接酶的体内生物素化)结合使用。
这些直接偶联策略将减小isHCR放大复合物的大小，从而可能促进isHCR在大体积样品和高分辨率成像中的用途。isHCR所需的所有试剂都是可商购的，而且价格非常便宜。考虑到可能被纳入到isHCR中的广泛的生物技术(例如蛋白质标签、DNA修饰、反应化学等)，可以想到，通过这些方法的创造性应用，可以改善或扩展生命科学研究中的许许多多生物传感器和基于抗体的方法。
尽管在免疫印迹、培养细胞和组织切片应用中，isHCR在免疫信号放大上的性能令人印象深刻，但发明人注意到在脑切片中，isHCR产生的本底比传统的荧光IHC更高(图5a和图4a、b)。将脑切片单独与DNA-荧光团HCR放大链一起温育导致高本底水平，即使是在充分洗涤之后(图5a)，提示在组织切片中未组装的HCR放大链造成了我们观察到的高本底水平。考虑到降低本底强度将有望改善信噪比，探索了修改isHCR过程来抑制本底荧光的途径。
在第四实施方式中，使HCR引发链与DNA-生物素放大链反应。一旦这些DNA-生物素放大链自组装并与正在生长的isHCR聚合物连接，它们的生物素就可以与新添加的链霉亲和素反应(由此与更多的HCR引发链等反应)，从而引发更多轮的聚合物生成(图12a)。最后一轮isHCRn应添加用于可视化的放大链(例如，DNA-荧光团放大链)。基于带HA标签的scFv的western印迹的测试显示，额外进行两轮放大(isHCR3)导致蛋白质检测灵敏度多改善十倍(图12b)。
在第五实施方式中，我们测试isHCRn对于针对TH的免疫染色的性能，每轮isHCR放大均增加了免疫阳性信号强度(图12c)。
另外，在该实施方式中，我们发现生物素化位置对于决定放大效率至关重要。与末端带有生物素的放大链相比，在内部位置带有生物素基团的放大链更容易接近链霉亲和素，其充当isHCRn中每个连续的分支轮的锚点(图12c)。
对照实验证实，经过多轮isHCRn放大，特异性和光学分辨率仍然保留(图12d、e)。进一步的测试表明，通过三轮isHCR，渐进性地放大了神经肽物质P的免疫信号，根据isHCR3揭示了纹状体和基底前脑的神经元突起中富于P物质表达(图12f、g)。
在第六实施方式中，使用GO吸附未组装的HCR放大链，从而猝灭它们的荧光(图5b)。在微孔板的孔中，GO完全消除了HCR放大链的荧光(图5c)。关键的是，HCR引发链与HCR放大链和GO一起添加导致荧光的显著恢复，这很可能是因为所述引发链触发了HCR放大链形成双链带缺口的聚合物，从而保护它们免于GO的吸附活性(图5c)。在脑切片中，应用GO和DNA-荧光团HCR放大链的混合物产生的本底荧光水平与单独应用DNA-荧光团HCR放大链相比明显更低(图5a)。我们对脑切片针对NeuN进行免疫染色，以定量评估GO对在组织样品中isHCR放大的作用。GO的添加降低了本底，但并未削弱信号强度，导致与未用GO的isHCR放大相比，信噪比改善(图5d)。使用抗体系列稀释实验的进一步分析表明，与标准IHC染色方法相比，用GO的isHCR显著增加了信号强度，当第一抗体被高度稀释时达到了大于80×的放大倍数(图6)。
在第七实施方式中，进行了针对膜蛋白、肽神经递质和两种酶的免疫染色以检查用GO的isHCR在脑切片中的通用性。使用标准IHC方法来定位囊泡谷氨酸转运蛋白3(Vglut3；囊泡膜蛋白)的表达一直是挑战性的(图5e和图7a)。在不添加GO的情况下进行的isHCR在脑干中缝核中产生强标记信号，但也显示出高本底噪声。令人鼓舞的是，加入GO的isHCR降低了本底，并展示了清晰的点状标记的Vglut3阳性突触末端(图5e和图7a、c)。在没有第一抗体的脑切片中或在缺乏编码Vglut3的功能基因的突变小鼠中，未观察到特异性标记(图7b)。另外的对照实验证实isHCR忠实地放大了真实的Vglut3信号并维护了共焦成像的空间分辨率(图7d、e)。接下来，本发明人使用HCR来检查脑切片中血管活性肠肽(VIP)、神经元一氧化氮合酶(nNOS)和芳族L-氨基酸脱羧酶(AADC)的表达模式。在所有情况下，用GO的isHCR都产生了强免疫阳性信号且本底低，一致地揭示，这些蛋白质各自的表达模式比用传统IHC方法观察到的丰富得多(图8)。
我们成功使用GO减小本底信号强度促使我们探索了将isHCR与单克隆抗体一起使用。尽管单克隆抗体经常比多克隆抗体更具特异性，但通过传统IHC染色，它们往往无法提供足够强的信号用于检测。在第六实施方式中，发明人使用了两种策略在小鼠脑切片中测试用单克隆抗体的HCR：针对GAD67的生物素化第一单克隆抗体，以及针对c-Fos的单克隆第一抗体与生物素化第二抗体的组合(图9a、b和图10a)。在这两种情况下，在isHCR放大的样品中均得到比在非isHCR样品中强得多的信号。
更重要的是，使用GO的isHCR能够检测对于传统IHC而言太弱的免疫信号。细菌病原体将蛋白效应子传递到宿主细胞中以操纵它们的生理；然而，一些易位效应子的存在和确切分布仍不清楚，因为它们的浓度极低。在第七实施方式中，发明人用FLAG标签对肠道沙门氏菌血清变种鼠伤寒(Salmonella enterica serovarTyphimurium)(鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium))效应子SteA和SopD2作标签，并在鼠伤寒沙门氏菌中表达这些融合蛋白，并使用这些转化的菌株感染HeLa细胞(图9c和图10b)。isHCR放大在感染了表达带FLAG标签的SteA和SopD2蛋白的鼠伤寒沙门氏菌的细胞中产生强信号，但在未感染的HeLa细胞或感染野生型鼠伤寒沙门氏菌的HeLa细胞中则没有(图9c上图和中图；图10b、c)。与此相反，标准IHC染色方法无法检测到任何FLAG标签表位信号(图9c下图和图10b)。因此，这些结果突出了isHCR放大在获得新的生物学发现中的效用。
HCR是杂交链式反应(Hybridization Chain Reaction)的缩写。当将单链DNA引发链添加到反应体系后，它打开一个种类的发夹(H1放大链)，暴露出新的单链区域，而该区域则打开另一个种类的发夹(H2放大链)。该过程又暴露与原始引发链一致的单链区域。由此产生的链式反应导致形成带缺口的双螺旋，该双螺旋一直生长到所述发夹供应耗尽为止。
点击化学是一类生物相容性反应，主要是意欲将所选的底物与特定生物分子连接。点击化学反应不是单一的特定反应，而是描述了一种遵循自然界中的实例来生成产物的方式，其也通过连接小的模块化单元来生成物质。一般而言，点击反应通常连接生物分子和报道分子。点击化学不限于生物学条件：“点击”反应的概念已用于药理学和各种仿生应用中。然而，它们在生物分子的检测、定位和定性中特别有用。
典型的点击化学反应包括：(1)环加成，例如Huisgen 1,3-偶极环加成，特别是Cu(I)催化的逐步型变体；(2)硫醇-烯反应；(3)Diels-Alder反应和反向电子需求Diels-Alder反应(inverse electron demand Diels-Alder reaction)；(4)异腈(异氰化物)和四嗪之间的环加成；(5)亲核取代，尤其是对小的张力环如环氧化合物和氮丙啶化合物的亲核取代；(6)由于热力学驱动力低，羰基化学样形成脲而不是醛醇型反应；和(7)碳-碳双键的加成反应，如二羟基化或硫醇-炔反应中的炔烃。
氧化石墨是通过用强氧化剂处理石墨得到的碳、氧和氢以可变比例的化合物。被最大程度氧化的主体产物是一种C:O比在1.3和2.9之间的黄色固体，其保留了石墨的层结构，但间距大得多且不规则。
本发明中的抗体包括但不限于传统的IgG和纳米抗体。
实施例
方法和材料
试剂和试剂制备.DNA寡核苷酸由Thermo Fisher Scientific和Sangon Biotech合成。DNA寡核苷酸的详细序列和修饰可见于表1。所有寡核苷酸均溶于ddH2O中并在-20℃下保存。
抗体和荧光试剂的详细信息示于表2。硫酸葡聚糖(D8906)购自Sigma-Aldrich。氧化石墨烯(GO，XF020，粒度<500nm，C/O比＝1.6)得自南京先丰纳米材料科技有限公司(Nanjing XFNANO Materials Tech Co.，Ltd.)。
质粒构建.从pHR-scFv-GCN4-sfGFP-GB1-NLS-dWPRE(Addgene质粒#60906，来自Ron Vale的馈赠)扩增scFv-GCN4-HA-GB1序列。为了膜靶向，通过PCR将GAP43-棕榈酰化序列添加至GFP的5’末端(以下称为mGFP)。将mGFP克隆到pcDNA3.1载体中。将scFv-GCN4-HA-GB1克隆到pET-21a载体中以进行细菌胞质表达。从野生型鼠伤寒沙门氏菌菌株SL1344的基因组DNA中通过PCR扩增编码鼠伤寒沙门氏菌效应子SteA或SopD2的序列。然后将SteA和SopD2克隆到带有C端FLAG标签的pME6032中。
重组蛋白的纯化.将携带pET-21a-scFv-GCN4-HA-GB1的大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)细胞在补充有100μg mL-1氨苄青霉素的溶菌肉汤(LB)培养基中生长。在37℃下用浓度为0.1M的IPTG诱导蛋白表达3小时。
然后通过在4℃下以2,000×旋转20分钟来沉淀细胞。通过超声处理裂解细胞。在4℃下通过以39,000×g离心1小时除去细胞碎片。将上清液与His-Select镍亲和树脂结合，用His-洗涤缓冲液(20mM NaH2PO4，pH 8.0，1M NaCl，20mM咪唑)洗涤，用His-洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，pH 8.0，0.5M NaCl，250mM咪唑)洗脱，然后将洗脱液用磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析。
蛋白-HCR DNA引发链偶联.使用马来酰亚胺-PEG2-NHS(SMCC，746223，Sigma-Aldrich)或NHS-叠氮化物(合成或购自Thermo Fisher Scientific，26130)作为接头进行偶联。对于马业酰亚胺-PEG2-NHS偶联，将蛋白(IgG)透析到磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中，并在室温下与马来酰亚胺-PEG2-NHS(7.5倍摩尔过量)反应2小时。使用Zeba离心柱(7000MWCO)从马来酰亚胺活化的蛋白中去除过量的交联剂。平行地，使用二硫苏糖醇(DTT，100mM)在PBS(1mMEDTA，pH 8.0)中于室温下将硫醇修饰的HCR引发链还原2小时，然后使用MicroBio-Spin P-6凝胶柱进行纯化。将所述马来酰亚胺活化的蛋白和还原的引发链(相对IgG为15倍摩尔过量)混合，并在室温下反应2小时。使用Amicon超滤离心过滤器(50kDaMWCO)或Zeba离心柱(7000MWCO)纯化HCR引发链标记的蛋白。
对于NHS-叠氮化物偶联，将蛋白透析到磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中，并在室温下与NHS-叠氮化物(7.5倍摩尔过量)反应2小时。使用Zeba离心柱(7000MWCO)从叠氮化物活化的蛋白中去除过量的交联剂。将所述叠氮化物活化的蛋白与DBCO标记的HCR引发链(相对IgG为15倍摩尔过量)混合，然后在室温下反应12小时。使用Amicon超滤离心过滤器(50kDa MWCO)或Zeba离心柱(7000MWCO)纯化HCR引发链标记的蛋白。
细胞培养和细菌感染.HEK293T细胞(ATCC CRL-3216)和HeLa细胞(ATCCCCL-2)用于培养细胞染色实验。将细胞接种在12mm的1.5号盖玻片上。使用PEI进行转染。在后续的实验之前，将细胞用低聚甲醛固定。根据以前的报道(Shi，J.等人Nature 514，187–192(2014))进行鼠伤寒沙门氏菌感染。
小鼠.动物的护理和使用符合北京的国家生命科学研究所(National InstituteofBiological Sciences，NIBS)的机构准则以及中国的政府法规。
使用任一性别的成年(8-12周龄)Vglut3-/-小鼠(Liu，Z.等人Neuron 81，1360–1374(2014))和C57BL/6N小鼠。将小鼠维持12/12的光周期(在8AM开灯)，并不限量地提供食物和水。小鼠在被处死前用戊巴比妥麻醉(i.p.，80mg×kg-1)。
小鼠行为.根据以下方案，使用成年(8-12周龄)C57BL/6N雄性小鼠进行丰富环境实验。实验前三天将小鼠单只笼养。将它们随机分派到“环境丰富”组和“饲养笼(homecage)对照组”(每组n＝3只小鼠)。丰富的环境场地是一个装有转轮、塑料隧道、用于咀嚼的碎木片和埋藏的食物的50×50cm塑料盒。让实验组的小鼠(n＝3只小鼠)探索场地1小时。将小鼠从新环境中移出并放回居家笼中。30分钟后处死小鼠。居家笼对照小鼠(n＝3只小鼠)不用探索场地，直接处死。不用盲法，检查了c-Fos表达。
组织样品制备.用过量的戊巴比妥麻醉小鼠，并用PBS、然后用低聚甲醛(PFA，在PBS中4％wt/vol)进行心内灌注。解剖出组织(脑或肺)并在4％PFA中在室温下4小时或在4℃下1天进行后固定。将组织样品首先在30％蔗糖溶液中脱水以制备薄切片(50μm)。为了免疫荧光标记，小鼠脑切片的厚度为50μm。薄切片在冷冻切片机(Leica CM1950)上制备。用于比较来自isHCR放大方法和传统IHC方法的信号强度的那些实验的脑切片样品是来自同一只小鼠的连续切片，并在同一天制备。将连续切片均等分为两组，用于后续的实验。
免疫组织化学.抗体的详细信息、工作浓度和温育时间可见于表2。对于脑切片和培养细胞，将样品用含0.3％Triton X-100的PBS(PBST)透化，并在室温下在含2％BSA的PBST中封闭1小时。然后将切片与第一抗体一起温育。将样品在PBST中洗涤3次，然后与生物素化的或HCR引发链偶联的第二抗体一起温育。对于对照实验，我们使用含有等量的荧光团偶联的第二抗体和生物素化的第二抗体的混合物。然后将样品再次在PBST中洗涤3次。通过荧光团偶联的链霉亲和素或DNA-荧光团HCR放大链使生物素化的第二抗体可视化。通过DNA-荧光团HCR放大链使HCR引发链偶联的第二抗体可视化。
对于鼠伤寒沙门氏菌感染的HeLa细胞，将样品用PBS洗涤一次，并在室温下用4％PFA固定15分钟。将样品在PBS中洗涤3次以去除PFA，然后与抗沙门氏菌第一抗体在室温下温育1小时。然后将样品再次在PBST中洗涤3次。施加Cy3偶联的山羊抗兔第二抗体来检测细胞外鼠伤寒沙门氏菌。在室温下温育1小时后，将样品在PBS中洗涤3次。然后将样品在室温下在0.3％PBST中透化5分钟。将样品在含有抗FLAG和抗沙门氏菌第一抗体的抗体混合物中在室温下温育1小时。将样品在PBS中洗涤3次以除去未结合的第一抗体。施加含有生物素化驴抗小鼠第二抗体(用于检测FLAG标签)和Alexa Fluor-647偶联的第二抗体(用于检测细胞内鼠伤寒沙门氏菌)的混合物。在室温下温育1小时后，将样品在PBS中洗涤3次。通过荧光团偶联的链霉亲和素或DNA-荧光团HCR放大链使生物素化驴抗小鼠第二抗体可视化。
isHCR引发链的标记.将所有试剂溶解在HCR放大缓冲液中[5×柠檬酸钠氯化钠(sodium chloride citrate)(SCC缓冲液)，0.1％vol/vol Tween-20和含10％wt/vol硫酸葡聚糖的ddH2O]。用生物素化的第二抗体标记后，将样品在1μg·mL-1链霉亲和素中在室温下温育30分钟。在PBST中洗涤3次后，将样品与0.5μM DNA-生物素HCR引发链一起在室温下温育30分钟。然后将样品洗涤三次并保存在PBST中。
isHCR放大.要注意，虽然有关isHCR引发链的实验步骤根据偶联策略而有所不同，但基本的isHCR放大过程在所有实验中都是共同的。首先，制备HCR放大缓冲液[5×柠檬酸钠氯化钠(SCC缓冲液)，0.1％vol/vol Tween-20和含10％wt/vol硫酸葡聚糖的ddH2O]。接下来，通过在95℃加热90秒并在30分钟内冷却至室温，将一对DNA-荧光团HCR放大链分别在5×SSC缓冲液中快速冷却。然后将这两个放大链添加到放大缓冲液中(对于薄切片，通常终浓度为12.5nM)。在样品于室温下与该缓冲液一起温育过夜时进行isHCR放大，然后在信号检测之前用PBST洗涤3次以除去游离的放大链。要注意，对于要求本底抑制的应用，对该基本过程增添了额外的氧化石墨烯步骤。简而言之，为了包括淬灭步骤，将GO(20μg·mL-1)与放大链在放大缓冲液中混合。将所述放大链/GO混合物充分涡旋并在室温下温育至少5分钟，然后添加到引发链标记的样品中。
为了进行多轮放大，我们使用DNA-生物素HCR放大链。在使用前，对DNA-生物素HCR放大链进行快速冷却。将样品与12.5nM DNA-生物素HCR放大链一起在室温下温育过夜。充分洗涤后，再次施加链霉亲和素(1μg·mL-1)以开始下一轮放大。添加DNA-生物素HCR放大链以及然后添加链霉亲和素的程序重复两次或三次，以达到期望的信号强度。在最后一轮中使用DNA-荧光团放大链(12.5nM)以使信号可视化。对于对照实验，第一轮放大使用生物素和Alexa Fluor-488双标记的HCR放大链。第二轮放大使用Alexa Fluor-546标记的HCR放大链。
我们最初进行了GO对未组装的和聚合的这两种HCR放大链性能的作用的测试(图5c)。在此，将DNA-Alexa Fluor 546HCR放大链快速冷却并以12.5nM的终浓度添加到所述放大缓冲液中，并添加GO(20μg·mL-1)以淬灭溶液中游离HCR放大链的荧光。5分钟的淬灭后，添加DNA-生物素HCR引发链(0.5μM)以触发HCR放大链的聚合和伴随的荧光恢复。在室温下温育样品过夜后，我们使用Molecular Device SpectraMax M3酶标仪测量样品的荧光。
荧光显微术.在使用10×0.3NA、20×0.5NA、63×1.4NA或100×1.3NA物镜的ZeissMeta LSM510共焦扫描显微镜上、或在使用20×0.5NA或40×0.75NA物镜的Zeiss LSM880共焦扫描显微镜上进行共焦显微术。用FIJI和Matlab对图像进行处理和测量。对于共焦成像，使用相同的激光强度、针孔值、探测器增益和偏移量对这两个组的脑切片进行成像。在一些实验中，使用更高的激光强度对SA组样品的脑切片进行成像：这样的图像在图中被标记为“更高激光强度”。
为了对全脑切片进行成像，我们使用带有10×物镜的Olympus VS120虚拟显微术载玻片扫描系统进行了宽视野荧光成像。对于载玻片扫描仪成像，在同一个成像运行过程中使用相同的光强度和曝光时间对同一载玻片上来自两个组的脑切片进行成像。图像以16位采集，并直接转换为TIFF格式进行发布。
数据分析.为了确定免疫阳性神经元突起或细胞膜的宽度(图1e，图3b和7e)，我们使用来自非放大的或isHCR放大的通道的信号计算了半峰全宽(FWHM)(Ramanathan，S.P.等人Nat.Cell Biol.17，148–159(2015))。绘制一系列垂直于膜或神经元突起的直线(图1e和图3a)。对每个通道绘制相应的强度轮廓并求平均值。对于神经元突起测量，施行基线校正。用非线性最小二乘法，将每个通道的校正平均强度拟合为高斯分布。FWHM用等式：
Figure BDA0002601658360000151
来计算，其中σ是拟合的高斯曲线的标准偏差。对于细胞膜测量，将距膜或神经元突起的边缘的距离(通常在-3μm至-2μm之间)的平均强度计算为基线(表示为m)。确定曲线的峰值(表示为p)。半峰强度(I)定义为(p+m)/2。半峰全宽(FWHM)被量化为I处平均强度轮廓的宽度。
为了确定印迹信号的动态范围(图2)，使用以短或长曝光时间采集的信号来计算和绘制每个泳道的峰强度面积。然后，我们使用log2标尺绘制强度值对分析物蛋白质量。然后，我们跨蛋白质量的范围进行了一系列线性回归，并计算了对每个回归的R平方值。线性动态范围表示报告最大R平方值的范围。
为了计算脑切片中isHCR的放大倍数(图6)，我们使用不同稀释比的抗NeuN第一抗体进行了NeuN免疫染色。然后，我们使用isHCR(带有GO或没有GO)或SA-546将信号可视化。使用相同的显微术设置获取来自ACC、DS和MS的isHCR-546和SA-546样品的图像。然后，我们计算了每个数据组内的平均信号强度。
使用t检验或Kolmogorov-Smirnov检验确定统计学显著性。P<0.05被认为是显著的。
表1.寡核苷酸序列和修饰
Figure BDA0002601658360000161
表2.抗体和荧光试剂
第一抗体：
Figure BDA0002601658360000171
第二抗体：
Figure BDA0002601658360000172
荧光试剂
Figure BDA0002601658360000181
实施例1
所述isHCR方法可显著放大各种类型的生物样品中的免疫荧光信号。
图1(a)显示了使用生物素-链霉亲和素相互作用的isHCR方法的示意图。DNA-生物素HCR引发链连在抗体上，进而触发DNA-荧光团HCR放大链自组装成荧光聚合物。图1(b)显示了用纯化的scFv-GCN4-HA-GB的蛋白质印迹进行的验证，scFv-GCN4-HA-GB被生物素化的抗HA第一抗体识别并用Alexa Fluor 546偶联的链霉亲和素(SA-546)或Alexa Fluor 546偶联的HCR放大链(isHCR-546)进行可视化。图1(c)显示了使用生物素化抗GFP抗体与SA-546或isHCR-546一起对表达膜结合增强型GFP(mGFP)的HEK293T细胞进行GFP的免疫染色。图1(d)显示了使用SA-488(上图)或isHCR-488(下图)针对TH进行免疫染色的小鼠脑切片图像。右图显示了方框区域的放大视图。在本图及后面的图中，除非另有说明，否则使用相同的成像参数比较来自标准IHC方法和来自isHCR的信号强度。图1(e)显示了使用含有等量的Cy3偶联第二抗体(GAR-Cy3，非放大)和生物素化第二抗体的混合物来检测抗TH第一抗体。使用isHCR-488放大所述生物素化第二抗体的信号。调整激光功率以产生两个通道相似的强度轮廓。TH阳性神经元突起的宽度使用来自非放大或isHCR放大的通道的信号来测量。显示了两个被测纤维的示例。在DS或PVN中均未观察到平均FWHM的显著性差异(对于DS，n＝196，P＝0.1069；对于PVN，n＝256，P＝0.8327；配对t检验)。误差棒指示s.e.m。比例尺，100μm(c，d右图)，1mm(d左图)，10μm(e)。
实施例2
使用isHCR确定Western印迹的动态范围。纯化的scFv-GCN4-HA-GB1蛋白被连续稀释。
图2显示了分析物蛋白被生物素化的抗HA第一抗体识别并用isHCR-546(a)或传统的HRP-ECL方法(c)可视化。使用短(a、c的上图)和长(a、c的下图)曝光时间采集的信号来计算和绘制每个泳道的峰值强度面积。含有最低量的检测到的分析物蛋白质的泳道以红色突出显示。使用log2标尺绘制使用任一检测方法在每个曝光时间下的线性动态范围，并以蓝色突出显示(b，d)。要注意，isHCR放大方法覆盖了7个单位的动态范围为(b)，而HRP-ECL方法取决于曝光时间覆盖4个或5个单位的动态范围(d)。
实施例3
isHCR放大维持了培养细胞中膜结合GFP(mGFP)免疫信号的空间分辨率。
图3显示isHCR放大维持了培养细胞中膜结合GFP(mGFP)免疫信号的空间分辨率。图3(a)显示，使用含有等量的Alexa Fluor 488偶联第二抗体(GAR-488，绿色)和生物素化第二抗体的抗体混合物对HEK293T细胞中的mGFP蛋白免疫染色和可视化。生物素化第二抗体的信号使用isHCR-546可视化(红色)。为了比较，收集了具有不同参数的图像以实现两个通道相似的强度轮廓。图3(b)显示了如(a)所示绘制一系列垂直于膜的直线。绘制了相应的强度轮廓。计算每个通道的平均强度。将距细胞边缘的距离(-3μm至-2μm之间)的平均强度计算为基线(表示为m)。确定曲线的峰值(表示为p)。将半峰强度(I)定义为(p+m)/2。半峰全宽(FWHM)被量化为I处平均强度曲线的宽度。图3(c)显示了使用来自非放大样品和isHCR放大样品的数据计算的FWHM之间没有显著性差异(n＝12；P＝0.9163；配对t-检验)。误差棒指示s.e.m.。比例尺，10μm。
实施例4
使用isHCR的TH免疫染色揭示了丰富得多的脑中儿茶酚胺能神经支配。
图4显示使用isHCR的TH免疫染色揭示了丰富得多的脑中儿茶酚胺能神经支配。图4(a)显示了在使用isHCR-488或SA-488针对TH免疫染色的小鼠脑切片的VTA、脚间核(IPN；上图)和上丘(下图)中TH表达模式的共焦图像。图4(b)显示，当省略所述第一抗体时，未观察到免疫阳性信号。图4(c)显示了使用标准IHC和isH针对TH免疫染色的小鼠脑切片的图像。使用含有等量的Cy3偶联第二抗体(GAR-Cy3，非放大)和生物素化第二抗体的混合物来检测所述抗TH第一抗体。使用isHCR-488放大所述生物素化第二抗体的信号。将非放大通道(红色)和放大通道(绿色)的信号共定位。要注意，我们使用了不同的成像参数来实现两个通道相似的强度轮廓。比例尺，100μm(a，b)，50μm(c)。
实施例5
降低本底噪声的isHCR优化。
图5显示了降低本底噪声的isHCR优化。图5(a)显示了未组装的HCR放大链和添加氧化石墨烯(GO)对洗涤后的本底荧光水平的作用。图5(b)是显示GO吸附HCR放大链的单链突出端并猝灭未组装成双链聚合物的HCR放大链的荧光的示意图。图5(c)显示在微孔板的孔中，GO淬灭了未组装的而不是聚合的HCR放大链的荧光。在条形图中，ns，不显著；*，P<0.05；****，P<0.0001；使用Holm-Sidak方法来校正多重比较的t检验用于分析各组之间的差异(n＝3次重复)。图5(d)显示了在使用没有GO的isHCR-546或带有GO的isHCR-546针对NeuN免疫染色的小鼠脑切片中前扣带回皮质(ACC)的图像。GO的添加显著降低了本底信号并提高了信噪比(n＝3；ns，不显著；*，P<0.05；***，P<0.005；t-检验)。图5(e)显示了在使用SA-546、没有GO的isHCR-546或带有GO的isHCR-546针对Vglut3免疫染色的小鼠脑切片中的中缝背核的图像。下图显示了上图中方框区域的放大视图。使用更高的针孔值、检测器增益设置和激光强度(更高的设置)收集SA-546样品的图像。(c和e)中，误差棒指示s.e.m.。比例尺，50μm(a，d，e)。
实施例6
isHCR大幅增加小鼠脑切片中的IHC信号。
图6(a)显示小鼠脑切片针对NeuN免疫染色。使用具有不同稀释比的抗NeuN第一抗体进行平行实验。使用isHCR-546(上部)或SA-546(中部和下部)将信号可视化。使用相同的显微术设置获取来自ACC区域的isHCR-546和SA-546样品的图像。下图显示了SA-546样品的更高对比度图像。图6(b)显示了对图6(a)中的样品的三个区域中的信号强度的量化。isHCR放大的样品的信号强度显著高于非放大的SA-546样品的信号强度。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；非配对t-检验。(c)在不同抗体稀释度下，isHCR-546对比SA-546的放大倍数。误差棒指示s.e.m.，(b和c)中。比例尺，100μm。
实施例7
isHCR特异性放大小鼠脑切片中的Vglut3免疫信号。
图7显示isHCR特异性放大小鼠脑切片中的Vglut3免疫信号。图7(a)指示在使用isHCR-546或SA-546针对Vglut3免疫染色的小鼠脑切片中的内侧中缝核的共焦图像。对于isHCR-546，将氧化石墨烯(GO)与HCR放大链混合以猝灭本底荧光。图7(b)显示在省略第一抗体的脑切片中(上图)或在使用isHCR-546免疫染色的Vglut3-/-小鼠的脑切片中(下图)未观察到Vglut3-免疫阳性信号。图7(c)显示了对使用SA-546、没有GO的isHCR546或带有GO的isHCR针对Vglut3免疫染色的脑切片样品的数据的量化(每组n＝3个脑切片；P<0.0001；Kolmogorov-Smirnov检验)。图7(d)显示了isHCR和标准IHC之间的比较。使用含有等量的Alexa Fluor 488偶联第二抗体(GAR-488)和生物素化第二抗体的混合物检测抗Vglut3第一抗体。使用isHCR-546放大所述生物素化第二抗体的信号。将非放大通道(红色)和放大通道(绿色)的信号共定位。图7(e)显示了使用非放大样品和isHCR放大样品的数据测量Vglut3阳性斑点的平均直径。显示了代表性的测量斑点。绘制穿过斑点的直线并使用所述斑点作为转动中心进行转动。每6度绘制沿非放大通道和isHCR放大通道的直线的强度轮廓。计算每个通道的平均强度，然后施行基线校正。用非线性最小二乘法，将每个通道的校正平均强度拟合为高斯分布。FWHM用等式：
Figure BDA0002601658360000211
来计算，其中σ是拟合的高斯曲线的标准偏差。
比较两个通道的FWHM结果。观察到Vglut3阳性斑点的平均直径没有差异(n＝20；P＝0.1846；配对t-检验)。(e)中，误差棒指示s.e.m.。比例尺，100μm(a，b)，50μm(d)，10μm(e)。
实施例8
isHCR有效放大各种免疫荧光信号。
图8显示了使用isHCR-546或SA-546将小鼠脑切片针对(a)血管活性肠肽(VIP；一种神经肽)、(b)神经元一氧化氮合酶(nNOS；一种胞质酶)或(c)芳族L-氨基酸脱羧酶(AADC；一种在轴突末端的酶)免疫染色。比例尺，100μm(a，b)，500μm(c)。
实施例9
isHCR能够检测对标准IHC方法具有挑战性的生物分子。
图9(a)显示了使用生物素化单克隆第一抗体针对GAD67免疫染色的小鼠脑切片的宽视野图像。信号用isHCR-546(上部)或SA-546(下部)可视化。图9(b)指示了在图9(a)的方框区域中显示GAD67免疫反应性的高功率共焦图像。使用相同的显微术设置收集SA-546和isHCR-546样品的图像。右图显示了使用更高设置收集的中图中相同区域的图像。图9(c)显示了鼠伤寒沙门氏菌感染的HeLa细胞的图像。使用SteA-FLAG突变菌株(上部和下部)和野生型菌株(中部)。使用isHCR-488实现了带有FLAG标签的SteA的检测(上)。使用标准IHC方法(非放大，驴抗小鼠，DAM-488，下部)或在野生型鼠伤寒沙门氏菌感染的HeLa细胞样品中(中部)未观察到特异性信号。比例尺，1mm(a)，100μm(b)，10μm(c)。
实施例10
isHCR放大能够检测低丰度的蛋白质。
图10显示isHCR放大能够检测低丰度的蛋白质。图10(a)显示了使用单克隆抗体针对c-Fos免疫染色的小鼠脑切片的图像。使用isHCR-546或SA-546将信号可视化。左侧图显示了探索丰富环境的小鼠的图像。右侧图显示了不许探索丰富环境的对照小鼠的图像。图10(b)显示了SopD2-FLAG鼠伤寒沙门氏菌突变株感染的HeLa细胞的图像。使用isHCR-488(上部)实现了带FLAG标签的SopD2的检测，但使用Alexa Fluor 488标记的第二抗体(非放大，驴抗小鼠，DAM-488，底部)的标准IHC则不能实现。图10(c)显示在未被鼠伤寒沙门氏菌感染的HeLa细胞中未检测到特异性信号。比例尺，50μm(a)，10μm(b，c)。
实施例11
HCR引发链可以使用化学接头直接偶联到抗体上。
图11(a)显示了HCR引发链和IgG直接偶联的示意图。图11(b)显示了使用HCR引发链偶联的第二抗体针对DAT免疫染色的小鼠脑切片。使用SMCC作为接头将HCR引发链偶联到抗体上。使用isHCR-546来放大信号。图11(c)显示了使用HCR引发链偶联的第二抗体针对核蛋白Ki67免疫染色的HEK 293T细胞的图像。使用NHS-叠氮化物作为接头将HCR引发链偶联到抗体上。使用isHCR--488来放大信号。比例尺，500μm(b)，10μm(c)。
实验结果
如表3所示，使用各种试剂、抗体和放大链并加以不同修改的本发明isHCR，不仅大幅提高了Western印迹中分析物蛋白的检测，而且大幅提高了IHC在培养细胞样品和组织切片样品中的性能。另外，本发明改进的带有GO的isHCR在组织切片样品的IHC中实现了高水平的放大且本底噪声低。尤其是，本发明改进的带有GO的isHCR显著提高了囊泡转运蛋白的检测，成功增强了各种免疫荧光信号，大幅提高了单克隆抗体在IHC中的性能，并能够检测体内易位的细菌效应子。
表3.实验结果总结
Figure BDA0002601658360000221
Figure BDA0002601658360000231
实施例12
使用isHCRn进行多轮放大
图12(a)显示了isHCRn的示意性概述。初始轮和分支轮使用DNA生物素HCR放大链用于另外连接HCR引发链。最后一轮使用DNA荧光团HCR放大链来可视化信号。(b)纯化的scFv-GCN4-HA-GB1蛋白在一轮或三轮isHCR后的western印迹(isHCR1对比isHCR3)。(c)为了评价放大聚合物上生物素基团的可及性，我们在脑切片上使用isHCRn针对TH进行免疫染色。我们测试了两对在内部或末端位点连有生物素的放大链的性能。每轮放大后，施加SA-546以检测生物素基团。在内部位置加生物素标签导致放大效率明显高于在末端位点加生物素标签。(d)小鼠脑切片针对TH免疫染色。首先使用生物素和Alexa-fluor-488双重标记的HCR放大链通过isHCR来放大信号，然后使用Alexa-fluor-546标记的HCR放大链通过另一轮isHCR进一步放大信号。将第一轮和第二轮放大的信号共定位。我们使用不同的成像参数来实现两个通道相似的强度轮廓。(e)使用来自isHCR1-488或isHCR2-546通道的信号测量TH阳性神经元突起的宽度。显示了被测纤维的示例。观察到平均FWHM没有显著性差异(n＝50；P＝0.7119；配对t-检验)。(f)针对P物质免疫染色的小鼠脑切片未经放大(SA-546)或经过1-3轮放大(isHCR1-546，isHCR2-546和isHCR3-546)的图像。(g)小鼠脑切片使用isHCR3针对P物质免疫染色。通过isHCR3多轮放大展现出纹状体中P物质的斑片状分布。右图显示了左侧方框区域的放大图像。(e)中，误差棒指示s.e.m.。比例尺，500μm(c，f，g左)，100μm(g右)，50μm(d)，10μm(e)。
序列表
<110> 北京生命科学研究所
<120> 基于杂交链式反应的免疫信号放大方法
<130> AN2324BS66WO
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
atatagcatt ctttcttgag gagggcagca aacgggaaga g 41
<210> 2
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
cgtaaaggaa gactcttccc gtttgctgcc ctcctcgcat tctttcttga ggagggcagc 60
aaacgggaag ag 72
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
gaggagggca gcaaacggga agagtcttcc tttacgctct tcccgtttgc tgccctcctc 60
aagaaagaat gc 72
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
atatacactt catatcactc actcccaatc tctatctacc c 41
<210> 5
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
attggatttg tagggtagat agagattggg agtgagcact tcatatcact cactcccaat 60
ctctatctac cc 72
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
ctcactccca atctctatct accctacaaa tccaatgggt agatagagat tgggagtgag 60
tgatatgaag tg 72

Claims (32)

1.一种免疫信号杂交链式反应(isHCR)，其包括将杂交链式反应(HCR)引发链与分析物特异性的抗体偶联，并添加一对HCR放大链以进行杂交链式反应。
2.根据权利要求1所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述HCR引发链具有用于与HCR放大链杂交的区域和用于偶联分析物特异性的抗体的区域。
3.根据权利要求1或2所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述HCR引发链和/或所述放大链用生物素、acrydite、胺、硫醇、DBCO和/或荧光染料进行末端修饰和/或内部修饰，并且所述荧光染料选自FITC、花青染料、Dylight fluors、Atto染料、Janelia Fluor染料、AlexaFluro 546、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述HCR引发链通过选自链霉亲和素-生物素相互作用和共价键相互作用的相互作用与抗体偶联。
5.根据权利要求4所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述HCR引发链是生物素化的引发链，它能够与链霉亲和素的空位结合位点相连，链霉亲和素能够与生物素化的抗体相连，从而使所述HCR引发链与所述抗体偶联。
6.根据权利要求4所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述共价键相互作用是通过选自含有琥珀酰亚胺酯基团的胺反应性接头和点击化学接头的化学接头的相互作用。
7.根据权利要求6所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述点击化学接头选自NHS-叠氮化物接头、NHS-DBCO接头、马来酰亚胺-叠氮化物接头和马来酰亚胺-DBCO接头。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫信号杂交链式反应，其中放大链或一对放大链经过修饰以进入分支多轮放大以便使HCR聚合物分支和生长。
9.根据权利要求8所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述放大链或所述放大链对用化学基团和/或荧光染料进行末端修饰或内部修饰，这允许引发更多轮的放大，所述化学基团选自生物素、洋地黄毒苷、acrydite、胺、琥珀酰亚胺酯、硫醇、叠氮化物、TCO、四嗪、炔烃和/或DBCO，并且所述荧光染料选自FITC、花青染料、Dylight fluors、Atto染料、JaneliaFluor染料、Alexa Fluro 546、Alexa Fluor488和Alexa Fluor 647。
10.根据权利要求8或9所述的免疫信号杂交链式反应，其中将一对带荧光团标签的放大链添加到所述多轮式isHCR的最后一轮中以进行可视化。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述放大链在内部位置被修饰，其更易于接近链霉亲和素并充当多轮式isHCR中每个连续的分支轮的锚点。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的免疫信号杂交链式反应，其中所述抗体是与分析物特异性的第一抗体发生反应的第二抗体，所述第二抗体是IgG或纳米抗体，并且所述第一抗体是IgG、纳米抗体或scFv。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫信号杂交链式反应，其还包括使用氧化石墨烯(GO)以吸收未组装的HCR放大链。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫信号杂交链式反应，其还包括使用氧化石墨烯(GO)以吸收未组装的HCR放大链并猝灭荧光，其中所述放大链被荧光染料末端修饰和/或内部修饰。
15.根据权利要求13或14所述的免疫信号杂交链式反应，其中GO的粒度<500nm。
16.一种用于免疫信号杂交链式反应(isHCR)的试剂盒，所述试剂盒包含：(1)分析物特异性的抗体；(a)HCR引发链；和(3)一对HCR放大链，其中所述HCR引发链具有用于与HCR放大链杂交的区域和用于偶联所述抗体的区域。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述HCR引发链和/或所述放大链用生物素、acrydite、胺、硫醇、DBCO和/或荧光染料进行末端修饰和/或内部修饰，并且所述荧光染料选自FITC、花青染料、Dylight fluors、Atto染料、Janelia Fluor染料、Alexa Fluro 546、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的试剂盒，其中所述HCR引发链通过选自链霉亲和素-生物素相互作用和共价键相互作用的相互作用与抗体偶联。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述HCR引发链是生物素化的引发链，它能够与链霉亲和素的空位结合位点相连，链霉亲和素能够与生物素化的抗体相连，从而使所述HCR引发链与所述抗体偶联。
20.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述共价键相互作用是通过选自含有琥珀酰亚胺酯基团的胺反应性接头和点击化学接头的化学接头的相互作用。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述点击化学接头选自NHS-叠氮化物接头、NHS-DBCO接头、马来酰亚胺-叠氮化物接头和马来酰亚胺-DBCO接头。
22.根据权利要求16-21中任一项所述的试剂盒，其中放大链或一对放大链经过修饰以进入分支多轮放大以便使HCR聚合物分支和生长。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述放大链或所述放大链对用选自生物素、洋地黄毒苷、acrydite、胺、琥珀酰亚胺酯、硫醇、叠氮化物、TCO、四嗪、炔烃和/或DBCO的化学基团和/或选自FITC、花青染料、Dylight fluors、Atto染料、Janelia Fluor染料、AlexaFluro 546、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647的荧光染料进行末端修饰或内部修饰，这允许引发更多轮的放大。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的试剂盒，其中将一对带荧光团标签的放大链添加到所述多轮式isHCR的最后一轮中以进行可视化。
25.根据权利要求22-24中任一项所述的试剂盒，其中所述放大链在内部位置被修饰，其更易于接近链霉亲和素并充当多轮式isHCR中每个连续的分支轮的锚点。
26.根据权利要求16-25中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体是与分析物特异性的第一抗体发生反应的第二抗体，所述第二抗体是IgG或纳米抗体，并且所述第一抗体是IgG、纳米抗体或scFv。
27.根据权利要求16-26中任一项所述的试剂盒，其还包含用于吸收未组装的HCR放大链的氧化石墨烯(GO)。
28.根据权利要求16-26中任一项所述的试剂盒，其还包含用于吸收未组装的HCR放大链并猝灭荧光的氧化石墨烯(GO)。
29.权利要求1-15中任一项所述的免疫信号杂交链式反应或权利要求16-28中任一项所述的试剂盒在强有力放大免疫信号、在分析生物样品中的分析物、或在实验室、临床或诊断应用中的用途。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述应用选自Western印迹和ELISA。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的用途，其中所述生物样品选自培养细胞、分散细胞、组织切片、体液和整个器官。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述临床或诊断应用选自生物学研究、法医检查、临床检验或诊断。
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