CN112997064A - 用于成像质谱分析法的基于融合的参考颗粒的归一化 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及试剂以及它们用于生物样品的元素成像质谱分析的用途。

Description

用于成像质谱分析法的基于融合的参考颗粒的归一化
相关申请的引证
该PCT申请要求2018年9月10日提交的美国临时专利申请号62/729,219的优先权，其全部内容出于所有目的通过引证并入。
技术领域
本发明涉及成像质谱校准物(imaging mass calibrator，成像质量校准物，成像质谱校准器)、其制备方法、使用其监测质谱成像仪(mass imaginginstrument)的性能的方法和使用其校准仪器的方法。
背景技术
在成像质谱细胞术(imaging mass cytometry，成像质谱流式细胞技术)中，用质量标签标记生物样品。例如，可以将特异性结合伴侣，如抗体缀合至质量标签并用于标记生物样品如细胞涂片或组织切片中的特异性蛋白质。存在于质量标签中的标记原子的元素分析使得存在于样品中的目标物质(例如，蛋白和核酸)能够被识别，并且在一些情况下，能够被定量。照此，生物样品中不同位置处的质量标签的定量可以提供对其生物学，如肿瘤学的重要解释。在所有技术中，激光烧蚀-电感耦合等离子体-质谱分析(LA-ICP-MS)已用于生物样品成像，生物样品包括在成像质谱细胞术中用质量标签标记的那些。成像质谱分析(imaging mass spectrometry，成像质谱分析法)(即不用质量标签标记)可以检测通常存在于样品中的原子。
在如质谱分析的技术中所检测的元素离子的定量通常需要与具有已知元素组成和量的标准品进行比较。然而，通过参考在样品之前或之后出现的标准品，定量或更广泛的归一化方法不能解释样品成像期间的仪器灵敏度漂移。基于系统和应用，仪器灵敏度漂移可以由多个因素引起，所述因素包括离子光学器件漂移、表面电荷、检测器漂移(例如，老化)、影响扩散的温度和气流漂移以及电子行为(例如，等离子体功率、离子光学电压等)。此外，仪器灵敏度的这些漂移也可以在不同样品成像之间发生。因此，如果期望在不同样品的成像期间对所采集的信号强度进行准确比较，则将需要使用具有已知元素组成和量的可定量标准品进行信号强度的绝对归一化。
发明内容
本发明的发明人已解决了对于用于成像质谱细胞术和成像质谱分析的可靠校准物的需要。因此，本发明提供了用于质谱成像设备(例如，成像质谱细胞计数仪、成像质谱仪)中所检测的信号强度的归一化和绝对校准的方法和设备，从而使得能够精确和绝对定量样品中的目标物质(也称为分析物)。具体地，本发明人已发现将包含已知元素组成和已知量的参考原子的参考颗粒融合(fused，熔融)至样品载体提供了可以在质谱成像设备(例如，成像质谱细胞计数仪，成像质谱仪)的信号强度的绝对校准中使用的成像质谱校准物。另外，本发明人已发现本发明的校准物可以用于监测在样品成像期间和在不同样品成像之间所检测的信号强度，因此使得要归一化的信号强度能够解释可以发生的任何仪器灵敏度的漂移。
因此，本发明提供了成像质谱校准物和用于制备它的方法。本发明还提供了使用本发明的校准物监测质谱成像设备(例如，成像质谱细胞计数仪，成像质谱仪)的性能的方法，使用它校准质谱成像设备(例如，成像质谱细胞计数仪，成像质谱仪)的方法和使用它归一化质谱成像设备(例如，成像质谱细胞计数仪，成像质谱仪)的检测器强度的方法。本发明还提供了使用它使样品成像的方法。作为另外一种选择或另外，本发明的校准物可以在成像质谱细胞术和成像质谱分析中用作标准物。
本发明还提供了用于制备成像质谱校准物的方法，包括将样品载体与包含至少一种参考颗粒的悬浮液(suspension)接触的步骤，其中至少一种参考颗粒包含至少一种参考原子，并且将至少一种参考颗粒融合到样品载体上。
本发明还提供了用于监测仪器性能的方法，所述方法包括提供包含具有融合至其的至少一种参考颗粒的样品载体的成像质谱校准物，其中至少一种融合的参考颗粒包含至少一种参考原子，和通过采样和检测元素组成和量确定每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度。
本发明还提供了具有融合至样品载体的至少一种参考颗粒的成像质谱校准物，并且其中至少一种参考颗粒包含至少一种参考原子。
本发明还提供了用于校准质谱成像设备(例如，成像质谱细胞计数仪)的方法，其包括提供包含具有融合至其的至少一种参考颗粒的样品载体的成像质谱校准物的步骤，其中至少一种参考颗粒包含至少一种参考原子，以及确定每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度。
本发明还提供了使样品成像的方法，其包括以下步骤：(i)提供包含具有融合至其的至少一种参考颗粒的样品载体的成像质谱校准物，其中至少一种融合的参考颗粒包含至少一种参考原子并且其中样品位于样品载体上，(ii)将样品与包含至少一种质量标签的溶液接触，其中质量标签包含至少一种标记原子，(iii)对至少一种融合的参考颗粒采样，确定每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度和(iv)对样品实施成像质谱细胞术和/或成像质谱分析以获得图像。
本发明还提供了使样品成像的方法，其包括以下步骤：(i)提供位于样品载体上的样品，制备成像质谱校准物，其中成像质谱校准物包含位于样品载体上的样品并且其中样品载体具有融合至其的至少一种参考颗粒并且其中至少一种融合的参考颗粒包含至少一种参考原子，(ii)将样品与包含至少一种质量标签的溶液接触，其中质量标签包含至少一种标记原子，(iii)对至少一种融合的参考颗粒采样，确定每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度和(iv)对样品实施成像质谱细胞术或成像质谱分析以获得图像。
附图说明
图1.加热(200℃，10分钟)前后，使用MCD查看器的组织图像对所有三个通道具有最小阈值1：红色＝波形蛋白，绿色＝CD45和蓝色＝DNA。检测加热前后的最大信号强度。数据显示未观察到各个质量标签由于样品载体加热所造成的检测信号的显著降低。
图2.在约24小时，对于每小时采样的EQ4珠，每个融合的珠的平均积分强度。每个数据点，对4至7个珠取平均值，采样之间为约1小时。所有珠之间在24小时的一段时间内的标准偏差小于15％。
图3.样品载体上的EQ4珠的光学显微图像。根据实施例3中所列举的方法制备样品载体。图像显示本发明的方法如何提供具有单个局限性参考颗粒的样品载体，从而有利于单独的参考颗粒的烧蚀以及定量校准和归一化。
图4.在加热10、20或30分钟后，融合至样品载体的EQ4珠的光学显微图像。
具体实施方式
本发明涉及用于成像质谱分析和成像质谱细胞术的校准物，制备它们的方法和它们的应用。如以下详细解释的，本发明人已确定将参考颗粒融合至样品载体导致产生了解决其它技术不足的可靠的标准物。这些其它技术包括将溶液中的金属原子旋涂至样品载体上。然而，该技术缺乏可重复性，因为这些标准物的制备必然导致校准物上存在的元素组成和参考原子的量的变化。
本发明人已确定使用包含一致量的已知的元素组成(即参考原子)的参考颗粒为这些问题提供了解决方案并且提供了可以在信号强度的绝对校准和归一化中使用的成像质谱校准物。显著地，本发明人发现采样这些颗粒中的至少一种并检测每个颗粒的积分信号强度使得能够对颗粒中存在的参考原子的量定量校准信号强度。因此，除了对不同细胞计数仪或光谱仪上成像的不同样品所检测的信号强度外，本发明的成像质谱校准物使得能够比较对不同样品所检测的信号强度。
本发明人发现将颗粒融合至样品载体有利于对整个颗粒采样，这对于其它情况将是不可能的，因为激光照射与参考颗粒的相互作用将导致样品载体上的参考颗粒的侧向位移并且将检测不到或仅部分检测到参考颗粒上存在的参考原子。因此，通过将参考颗粒与样品载体融合，本发明人已使得能够对整个颗粒采样，并因此可以检测与整个参考颗粒有关的积分信号强度。对整个颗粒的采样使得能够将积分信号强度与颗粒中已知的参考原子的量进行绝对比较。
质谱细胞术，包括成像质谱细胞术依赖于使用结合至特定分析物(蛋白、核酸、糖、代谢产物等)的质量-标签化SBP(SBP是特异性结合对的成员)的样品上或中的目标物质(在本文中和在本领域中也称为分析物)的标记。当分析物是细胞的一部分时，则可以将SBP应用于细胞上或中的标签分析物。
成像质谱分析法检测样品中天然存在的原子，例如，酶中的金属。本发明使得能够以定量方式进行分析样品中天然存在的分析物的新的方法。
成像质谱校准物
本发明提供了成像质谱校准物。如本文将描述的，本发明的成像质谱细胞术校准物可以通过将所检测的信号强度与参考颗粒中存在的参考原子的已知的量的采样相比较，用于校准系统，例如成像质谱细胞计数仪。本发明的成像质谱校准物因此可以用于解释由于成像质谱细胞计数仪的检测器或激光器中的流量(flux，通量)所造成的检测信号强度变化。本发明的成像质谱校准物可以用作样品采样期间和之间的检测信号强度归一化的标准物。另外，本发明的成像质谱校准物可以用于绘制检测信号强度的校准曲线并因此可以用于从采样样品所检测的信号强度的绝对定量。
本发明的成像质谱细胞术校准物包含具有融合至样品载体的至少一种参考颗粒的样品载体，其中至少一种融合的参考颗粒包含至少一种参考原子。
在一些实施方式中，样品载体包含至少2，如至少3、至少5、至少10、至少50、至少100、至少500、至少1000、至少2000、至少5000，如至少10000个融合的参考颗粒。参考颗粒可以全部相同。在一些实施方式中，参考颗粒是不同的。例如，参考颗粒可以在它们的元素组成(即它们所含的参考原子)和每个颗粒的参考原子的量方面是不同的。当使用不同的参考颗粒时，通常将存在多个每类参考颗粒。在本文中，将相同参考颗粒的团体称为“组(set)”。
颗粒可以散布在样品载体上，从而基本所有的颗粒单独(即离散地)位于样品载体上，从而可以单独识别和采样每个融合的参考颗粒。本领域技术人员将理解样品载体还可以包括在样品载体上团聚的一些融合的参考颗粒并因此这些团聚体可能不适合于用于信号强度校准和归一化的采样。例如，至多达2％，如至多达5％，至多达8％，至多达10％，至多达15％或至多达20％的融合的颗粒可以在本发明的成像质谱校准物的样品载体上团聚。换言之，在成像质谱校准物上，至少80％的颗粒是单独分离的，如至少85％，至少90％，至少92％或至少95％。
在一些实施方式中，融合的参考颗粒的直径为至少1μm，例如，至少2μm，至少3μm，至少5μm，至少8μm或至少10μm。在一些实施方式中，融合的参考颗粒的直径小于30μm，例如，小于20μm，小于15μm或小于10μm。在一些实施方式中，颗粒的直径在1至20μm之间，如1至15μm之间，如1至10μm之间，如2至8μm之间。
成像质谱细胞术通常使用不同质量通道上的多个不同标记原子的检测，其用于区分样品上已用不同质量标签标记的不同分析物。因此，在某些实施方式中，本发明的成像质谱校准物包含至少一种融合的参考颗粒，所述融合的参考颗粒包含多个不同的参考原子，例如，至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少20个或至少50个不同的参考原子。如本文所使用的不同的参考原子表示每个不同的参考原子具有不同的原子量(atomic mass，原子质量)(例如，不同的元素以及因此的同位素)。因此，本发明的成像质谱校准物可以用于多个质量通道，包括在已标记样品的质量标签化SBP中存在的标记原子的检测中使用的质量通道的校准和归一化。另外，成像质谱校准物可以用于校准用于检测天然存在于未标记的生物样品中的原子的质量通道。
本领域技术人员将理解与采样已知数目的特定参考原子有关的积分信号可以不同于与采样相同数目的不同参考原子有关的积分信号(例如，由于参考原子行为，例如，离子化效率的差异)。因此，可以选择存在于融合的参考颗粒中的参考原子的量，从而为对于归一化/校准的每个质量通道所检测的每种参考原子提供基本一致的信号强度。也就是说，如果第一参考原子的相同绝对原子数目在检测器提供了比第二参考原子低的信号，则应在参考颗粒中提供更大的绝对数量。因此，本发明还可以提供成像质谱校准物，所述成像质谱校准物包含至少一种融合的参考颗粒，所述融合的参考颗粒包含多个不同的参考原子，例如，至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少20个或至少50个不同的参考原子，其中至少一种融合的参考颗粒中的每种参考原子的量可以不同于存在于参考颗粒中的其它参考原子的量。
在一些实施方式中，本发明的成像质谱校准物可以包括多于一个融合的参考颗粒，例如，成像质谱校准物可以包括至少一种融合的参考颗粒的至少两个组，至少三个组，至少四个组，至少五个组，至少六个组，至少七个组，至少八个组或至少十个组，其中至少一种参考颗粒的每个组单独地包含不同的参考原子。将不同组的参考颗粒分离至样品载体的离散区域使得能够基于它们在样品载体上的位置来容易地鉴别各组参考颗粒。因此，可以容易地识别包含不同的特定参考原子、参考原子的组合和/或参考原子的量的不同组的颗粒，从而有利于对成像质谱细胞术的检测器的多个不同质量通道绘制校准曲线。将讨论用于这种校准，包括绘制校准曲线的方法(参见48页)。因此，在某些实施方式中，本发明的成像质谱校准物包含多于一个融合的颗粒，例如，成像质谱校准物可以包括至少一种融合的参考颗粒的至少2、3、4、5、6、7、8或至少10组，其中至少一种融合的参考颗粒的每个组位于样品载体的离散区域。因此，本发明提供了包含多于一组融合的参考颗粒的成像质谱校准物，其中用户可以容易地识别至少一种融合的参考颗粒的特定组，其中至少一种融合的参考颗粒的所述组包含特定的参考原子、参考原子的组合和/或参考原子的量。
在一些实施方式中，将每个不同组的参考颗粒融合至样品载体上的不同区域。每组的区域可以为例如1mm×1mm，2mm×2mm，4mm×4mm，6mm×6mm，8mm×8mm，10mm×10mm或者10mm×20mm。在一些实施方式中，每个离散区域包含一组至少5，如至少10，至少25，至少50或至少100个参考颗粒。在一些实施方式中，成像质谱校准物包含样品载体，样品载体包含具有融合至其的参考颗粒的至少两个离散区域(discrete area)，例如，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少8个或至少10个离散区域。
如以下详细说明的，不同标记原子的定量需要对用于检测标记原子的检测器的多个质量通道绘制校准曲线。因此，在某些实施方式中，本发明的成像质谱校准物包含至少一种融合的参考颗粒的多于一个组，其中至少一种融合的参考颗粒的每个组包含多个不同的参考原子，其中至少一种融合的参考颗粒的每个组包含不同的量的多个不同的参考原子。例如，每组融合的参考颗粒可以包含相同的参考原子混合物，但是其处于不同的量。因此，本发明的成像质谱校准物可以用于对成像质谱细胞术检测器的多个质量通道绘制校准曲线。
本发明的成像质谱校准物还可以包含样品，其中样品已被一个或多个质量标签标记。因此，本发明提供了位于成像质谱校准物上的标记的样品，其中样品已被至少一种质量标签中的至少一个标记原子(例如，至少2个，至少5个，至少10个或至少20个标记原子)标记，其中成像质谱校准物包含融合至样品载体的至少一种参考颗粒(例如，至少2个，至少5个，至少10个或至少20个参考原子)，其包含与标记原子相同的参考原子。
参考颗粒
在本发明中融合至样品载体的参考颗粒包含已知的参考原子的元素组成和量，以允许在成像质谱细胞计数仪的检测器成像和绝对校准期间定量归一化检测信号强度。因此，用于在本发明中使用的参考颗粒可以包含多种形式，只要满足上述条件，即参考颗粒包含已知的参考原子的元素组成和量并且颗粒能够融合至样品载体。如以下更详细地讨论的，颗粒可以能够通过加热融合至样品载体。在一些实施方式中，颗粒能够通过溶剂退火融合至样品载体。本领域中存在几种已知的方法，通过这些方法可以将已知的参考原子的元素组成和量引入参考颗粒。因此，本发明提供了至少一种参考颗粒在制备成像质谱校准物的方法中的使用。本发明还提供了珠悬浮液(suspension of bead)(即在溶剂中的珠)，其中悬浮液中的珠的浓度足够高，从而它们可以用于制备成像质谱校准物。
本领域技术人员将理解参考颗粒将具有一定尺寸，从而允许足够量的参考原子的掺入以确保足够的信号检测，然而颗粒不应具有使整个颗粒从样品载体上烧蚀所需的时间变得不实际的这种尺寸。因此，本领域技术人员将理解在融合前，用于在本发明中使用的参考颗粒可以具有1μm至50μm，包括1μm至40μm，1μm至30μm，1μm至20μm，或1μm至10μm，或1μm至5μm的直径。在一些实施方式中，颗粒的直径为约3μm。本发明的参考颗粒包含至少一种参考原子(有关参考原子类型的讨论，参见15页)。在一些实施方式中，参考颗粒包含至少10,000，如至少50,000，至少100,000，至少500,000，至少1,000,000，至少5,000,000，至少10,000,000，至少30,000,000，至少50,000,000，至少100,000,000，至少200,000,000，至少500,000,000，至少1,000,000,000，至少5,000,000,000或者至少10,000,000,000个参考原子。在一些实施方式中，在该段中讨论的颗粒具有小于10μm的平均直径。
用于在本发明中使用的参考颗粒可以包含一种类型的参考原子。在一些实施方式中，参考颗粒包含多于一种不同的参考原子，例如，至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少8，至少10，至少20或至少30种不同的参考原子。换言之，本发明的参考颗粒可以包含不同的参考原子的混合物。在一些实施方式中，本发明的参考颗粒包含至少10,000，如至少50,000，至少100,000，至少500,000，至少1,000,000，至少5,000,000，至少10,000,000，至少30,000,000，至少50,000,000，至少100,000,000，至少200,000,000，至少500,000,000，至少1,000,000,000，至少5,000,000,000或者至少10,000,000,000个每种参考原子。在一些实施方式中，在该段中讨论的颗粒具有小于10μm的平均直径。
如所讨论的，对于相同绝对数量的参考原子，与采样特定参考原子有关的积分信号可以不同于与采样不同参考原子有关的积分信号。因此，用于在本发明中使用的颗粒可以因此包含不同的参考原子的混合物，其中存在于融合的参考颗粒中的不同参考原子的量是不同的并且选择所述量以为通过归一化/校准的每个质量通道所检测的每种参考原子提供基本一致的信号强度。
在本发明的一些实施方式中，不同组的参考颗粒包含不同参考原子的相同混合物，然而，每组参考颗粒包含不同的量的不同的参考原子。因此，用于在本发明中使用的颗粒可以用于制备可以用于绘制多个质量通道的校准曲线的成像质谱校准物。例如，可以通过一系列，例如，一系列数目相差2倍的参考原子，一系列数目相差3倍的参考原子，一系列数目相差5倍的参考原子或者一系列数目相差10倍的参考原子产生标准曲线。
在一些实施方式中，一组参考颗粒包含每种类型的n个参考原子，其中n＝10,000,000-30,000,000。一组参考颗粒可以包含至少(n×2)，至少(n×4)，至少(n×8)，至少(n×16)或者至少(n×32)。在一些实施方式中，一组参考颗粒包含至少(n×3)，如至少(n×9)，至少(n×27)或至少(n×81)。在一些实施方式中，一组参考颗粒包含至少(n/32)，如至少(n/16)，至少(n/8)，至少(n/4)或至少(n/2)的每种参考原子。在一些实施方式中，一组参考颗粒包含至少(n/81)，如至少(n/27)，至少(n/9)或至少(n/3)。在一些实施方式中，在该段中讨论的颗粒具有小于10μm的平均直径。
在一些实施方式中，一组参考颗粒包含每种类型的n个参考原子，其中n＝10,000,000-30,000,000。一组参考颗粒可以包含至少(n×102)个每种类型的参考原子，如至少(n×103)，至少(n×104)，至少(n×105)，至少(n×106)，至少(n×107)个每种类型的参考原子。在一些实施方式中，一组参考颗粒可以包含至少(n×10-5)，至少(n×10-4)，至少(n×10-3)或者至少(n×10-2)个每种类型的参考原子。在一些实施方式中，在该段中讨论的颗粒具有小于10μm的平均直径。
在一些实施方式中，一组参考颗粒包含n×10-5-n×105个每种类型的参考原子，如n×10-4-n×105个每种类型的参考原子，n×10-3-n×103个每种类型的参考原子，n×10-2-n×102个每种类型的参考原子或者n×10-1-n×101个每种类型的参考原子；其中n＝10,000,000-30,000,000。
在一些实施方式中，一组参考颗粒包含n/m，n和n×m个每种类型的参考原子；其中n＝10,000,000-30,000,000，其中m＝3、4、5、6、7、8或9或20。在一些实施方式中，一组参考颗粒包括含有n/m5个每种类型的参考原子，n/m4个每种类型的参考原子，n/m3个每种类型的参考原子，n/m2个每种类型的参考原子，n×m2个每种类型的参考原子，n×m3个每种类型的参考原子，n×m4个每种类型的参考原子，n×m5个每种类型的参考原子和n×m6个每种类型的参考原子的一个或多个组；其中n＝10,000,000-30,000,000，并且其中m＝3、4、5、6、7、8或9或20。
在一些实施方式中，用于在本发明中使用的参考颗粒包含至少5种不同类型的参考原子，例如，140Ce、151Eu、153Eu、165Ho、175Lu，并且每种参考颗粒包含至少1000，如至少5000，至少10,000，至少250,000，至少500,000，至少1,000,000，至少2,500,000，至少5,000,000，至少10,000,000，至少100,000,000，至少200,000,000或至少300,000,000个参考原子。在一些实施方式中，本发明的参考颗粒包含至少5种不同类型的参考原子，例如，140Ce、151Eu、153Eu、165Ho、175Lu，并且每种参考颗粒总计包含1,000-300,000,000，2,000-200,000,000，5,000-175,000,000，50,000-150,000,000，100,000-125,000,000，200,000-110,000,000，1,000,000-100,000,000，10,000,000-95,000,000，30,000,000-90,000,000，40,000,000-80,000,000或者50,000,000-70,000,000个参考原子。在一些实施方式中，在该段中讨论的颗粒具有小于10μm的平均直径。
在一些实施方式中，用于在本发明中使用的参考颗粒具有1μm至50μm之间的直径和总计n×10-5-n×107个参考原子，如1μm至40μm之间的直径和总计n×10-5-n×106个参考原子，1μm至30μm之间的直径和总计n×10-5-n×105个参考原子，1μm至20μm之间的直径和总计n×10-5-n×104个参考原子，1μm至10μm之间的直径和总计n×10-4-n×103个参考原子或者1μm至5μm之间的直径和总计n×10-3-n×102个参考原子；其中n＝10,000,000-30,000,000。
在一些实施方式中，用于在本发明中使用的参考颗粒包含至少5种不同类型的参考原子，例如，140Ce、151Eu、153Eu、165Ho、175Lu，并且具有1μm至50μm的直径和总计1,000-300,000,000个参考原子，如1μm至40μm的直径和总计2,000-200,000,000个参考原子，1μm至30μm的直径和总计100,000-125,000,000个参考原子，1μm至20μm的直径和总计1,000,000-100,000,000个参考原子，1μm至10μm的直径和总计30,000,000-90,000,000个参考原子或者1μm至5μm的直径和总计50,000,000-70,000,000个参考原子。在一些实施方式中，颗粒的直径为约3μm并且包含总计约60,000,000个参考原子。
在一些实施方式中，用于在本发明中使用的参考颗粒包含至少5种不同类型的参考原子，例如，140Ce、151Eu、153Eu、165Ho、175Lu，并且具有1μm至50μm的直径和1,000-100,000,000个每种类型的参考原子，例如1μm至40μm的直径和5,000-50,000,000个每种类型的参考原子，1μm至30μm的直径和100,000-30,000,000个每种类型的参考原子，1μm至20μm的直径和200,000-20,000,000个每种类型的参考原子，1μm至10μm的直径和1,000,000-20,000,000个每种类型的参考原子或者1μm至5μm的直径和10,000,000-20,000,000个每种类型的参考原子。在一些实施方式中，颗粒的直径为约3μm并且包含约15,000,000个每种类型的参考原子。
因此，可以组合提供包含不同的量的参考原子的参考颗粒的组以提供参考颗粒的“校准系列”。校准系列可以包含至少2组，如至少3组，至少4组，至少5组，至少6组，至少7组，至少8组，至少9组或者10组或更多组包含不同的量的参考原子的参考颗粒。
在一些实施方式中，校准系列包含至少3组参考颗粒，其具有n/m，n和n×m个每种类型的参考原子；其中n＝10,000,000-30,000,000，其中m＝3、4、5、6、7、8或9或20。在一些实施方式中，校准系列还包括含有n/m5个每种类型的参考原子，n/m4个每种类型的参考原子，n/m3个每种类型的参考原子，n/m2个每种类型的参考原子，n×m2个每种类型的参考原子，n×m3个每种类型的参考原子，n×m4个每种类型的参考原子，n×m5个每种类型的参考原子和n×m6个每种类型的参考原子的一个或多个组；其中n＝10,000,000-30,000,000，并且其中m等于n/m，n和n×m系列中的m的值。
在一些实施方式中，校准系列包含含有至少5种不同类型的参考原子例如，140Ce、151Eu、153Eu、165Ho、175Lu的参考颗粒的组，并且包含总计1,000,000-3,000,000个参考原子，3,000,000-5,000,000个参考原子，5,000,000-10,000,000个参考原子，10,000,000-20,000,000个参考原子，20,000,000-40,000,000个参考原子，40,000,000-60,000,000个参考原子，60,000,000-80,000,000个参考原子，80,000,000-100,000,000个参考原子，100,000,000-140,000,000个参考原子和/或140,000,000-200,000,000个参考原子。例如，校准系列可以包含含有总计约2,000,000个参考原子，约4,000,000个参考原子，约7,500,000个参考原子，约15,000,000个参考原子，约30,000,000个参考原子，约50,000,000个参考原子，约70,000,000个参考原子，约90,000,000个参考原子，约120,000,000个参考原子和/或约160,000,000个参考原子的参考颗粒的组。在一些实施方式中，在该段中讨论的颗粒具有小于10μm的平均直径。
在一些实施方式中，校准系列包含含有至少5种不同类型的参考原子例如，140Ce、151Eu、153Eu、165Ho、175Lu的参考颗粒的组，并且包含250,000-750,000，750,000-1,250,000，1,250,000-3,000,000，3,000,000-5,000,000，5,000,000-9,000,000，9,000,000-14,000,000，14,000,000-18,000,000，18,000,000-22,000,000，22,000,000-34,000,000和/或34,000,000-44,000,000个每种参考原子。例如，校准系列可以包含含有约500,000，约1,000,000，约2,000,000，约4,000,000，约7,000,000，约12,000,000，约16,000,000，约20,000,000，约28,000,000和/或约39,000,000个每种参考原子的参考颗粒的组。在一些实施方式中，在该段中讨论的颗粒具有小于10μm的平均直径。
在一些实施方式中，校准系列包含含有至少5种不同类型的参考原子例如，140Ce、151Eu、153Eu、165Ho、175Lu的参考颗粒的组，并且包含250,000-750,000，750,000-1,250,000，1,250,000-3,000,000，3,000,000-5,000,000，5,000,000-9,000,000，9,000,000-14,000,000，14,000,000-18,000,000，18,000,000-22,000,000，22,000,000-34,000,000和/或34,000,000-44,000,000个每种参考原子。例如，校准系列可以包含含有约500,000，约1,000,000，约2,000,000，约4,000,000，约7,000,000，约12,000,000，约16,000,000，约20,000,000，约28,000,000和/或约39,000,000个每种参考原子的参考颗粒的组。
参考颗粒中的参考原子的组成
不同组的参考颗粒可以包含不同的参考原子/同位素，不同的参考原子/同位素组合，不同的量的相同参考原子/同位素和甚至不同比例的不同的参考原子/同位素。因此，在一些实施方式中，一组参考颗粒中的所有参考原子具有相同的原子量。作为另外一种选择，一组参考颗粒可以包含原子量不同的参考原子，但是包含相同的量的每种不同的参考原子。因此，在一些情况下，一组参考颗粒可以由参考颗粒形成，每个所述参考颗粒仅包含单一类型的参考原子。另外，在一些情况下，一组参考颗粒可以在每个参考颗粒中包含具有相同原子量的参考原子和相同的量的所述参考原子。作为另外一种选择，在一些情况下，一组参考颗粒可以由参考颗粒形成，每个所述参考颗粒包含多于一种不同的参考原子，例如，至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8或至少10种不同的参考原子。参考颗粒的组在本文中详细描述的方法中具有具体应用。在一些情况下，一组参考颗粒可以由包含不同的量的相同参考原子的参考颗粒形成。
如所讨论的，与采样特定参考原子有关的积分信号可以不同于与采样不同参考原子有关的积分信号。因此，用于在本发明中使用的颗粒可以因此包含不同的参考原子的混合物，其中存在于融合的参考颗粒中的不同参考原子的量是不同的并且选择所述量以为通过归一化/校准的每个质量通道所检测的每种参考原子提供基本一致的信号强度。在一些实施方式中，用于在本发明中使用的参考颗粒包含15,000,000-20,000,000个140Ce参考原子，例如，17,500,000-22,500,000或者19,000,000-21,000,000个140Ce参考原子；6,000,000-16,000,000个151Eu参考原子，例如，8,500,000-13,500,000，10,000,000-12,000,000或约11,000,000个151Eu参考原子；8,000,000-17,000,000个153Eu参考原子，例如，9,500,000-14,500,000，11,000,000-13,000,000或约12,000,000个153Eu参考原子；2,000,000-12,000,000个165Ho参考原子，例如，4,500,000-9,500,000，6,000,000-8,000,000或者约7,000,000个165Ho参考原子；5,000,000-15,000,000个175Lu参考原子，例如，7,500,000-12,500,000个175Lu参考原子，9,000,000-11,000,000个或约10,000,000个175Lu参考原子。
因此，在本发明的一些实施方式中，不同组的参考颗粒包含不同参考原子的相同混合物，然而，每组参考颗粒包含不同量的不同参考原子。因此，颗粒可以用于制备可以绘制多个质量通道的校准曲线的成像质谱校准物。因此，可以组合提供包含不同量的参考原子的参考颗粒的组以提供参考颗粒的“校准系列”。在一些实施方式中，校准系列包含至少2组，如至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9或者10组或更多组包含不同量的参考原子的参考颗粒。
在一些实施方式中，校准系列包含至少3组参考颗粒，其具有n×10-1，n和n×10-2个每种类型的参考原子；其中n＝10,000,000-30,000,000。在一些实施方式中，校准系列还包括含有n×10-5-n×10-4个每种类型的参考原子，n×10-4-n×10-3个每种类型的参考原子，n×10-3-n×10-2个每种类型的参考原子，n×10-2-n×10-1，n×102-n×103个每种类型的参考原子，n×103-n×104个每种类型的参考原子，n×104-n×105个每种类型的参考原子和n×105-n×106个每种类型的参考原子的一个或多个组；其中n＝10,000,000-30,000,000。
在一些实施方式中，校准系列包含至少3组参考颗粒，其具有n/2，n和n×2个每种类型的参考原子；其中n＝10,000,000-30,000,000。在一些实施方式中，校准系列还包含含有n/64个每种类型的参考原子，n/32个每种类型的参考原子，n/16个每种类型的参考原子，n/8个每种类型的参考原子，n/4个每种类型的参考原子，n×4个每种类型的参考原子，n×8个每种类型的参考原子，n×16个每种类型的参考原子，n×32个每种类型的参考原子和n×64个每种类型的参考原子的一个或多个组；其中n＝10,000,000-30,000,000。
在一些实施方式中，校准系列包含具有300,000-1,000,000个140Ce参考原子，1,000,000-1,500,000个140Ce参考原子，1,500,000-3,500,000个140Ce参考原子，3,500,000-7,000,000个140Ce参考原子，7,000,000-11,000,000个140Ce参考原子，11,000,000-19,000,000个140Ce参考原子，19,000,000-23,000,000个140Ce参考原子，23,000,000-30,000,000个140Ce参考原子，30,000,000-44,000,000个140Ce参考原子和/或44,000,000-56,000,000个140Ce参考原子的参考颗粒的组。在一些实施方式中，校准系列包含具有约700,000，约1,300,000，约2,500,000，约5,500,000，约9,000,000，约16,000,000，约21,000,000，约26,000,000，约37,000,000和/或约51,000,000个140Ce参考原子的参考颗粒的组。
在一些实施方式中，校准系列包含具有200,000-500,000个151Eu参考原子，500,000-1,000,000个151Eu参考原子，1,000,000-2,000,000个151Eu参考原子，2,000,000-4,000,000个151Eu参考原子，4,000,000-6,000,000个151Eu参考原子，6,000,000-11,000,000个151Eu参考原子，11,000,000-13,000,000个151Eu参考原子，13,000,000-18,000,000个151Eu参考原子，18,000,000-23,000,000个151Eu参考原子和/或23,000,000-37,000,000个151Eu参考原子的参考颗粒的组。在一些实施方式中，校准系列包含具有约400,000，约750,000，约1,500,000，约3,000,000，约5,000,000，约9,000,000，约12,000,000，约15,000,000，约21,000,000和/或约29,000,000个151Eu参考原子的参考颗粒的组。
在一些实施方式中，校准系列包含具有200,000-600,000个153Eu参考原子，600,000-1,000,000个153Eu参考原子，1,000,000-2,000,000个153Eu参考原子，2,000,000-4,000,000个153Eu参考原子，4,000,000-7,000,000个153Eu参考原子，7,000,000-11,000,000个153Eu参考原子，11,000,000-14,000,000个153Eu参考原子，14,000,000-18,000,000个153Eu参考原子，18,000,000-26,000,000个153Eu参考原子和/或26,000,000-36,000,000个153Eu参考原子的参考颗粒的组。在一些实施方式中，校准系列包含具有约400,000，约800,000，约1,600,000，约3,000,000，约5,500,000，约10,000,000，约13,000,000，约16,000,000，约22,000,000和/或约31,000,000个153Eu参考原子的参考颗粒的组。
在一些实施方式中，校准系列包含具有200-000-300,000个165Ho参考原子，300-000-700,000个165Ho参考原子，700-000-1,300,000个165Ho参考原子，1,300,000-2,800,000个165Ho参考原子，2,800,000-3,500,000个165Ho参考原子，3,500,000-7,500,000个165Ho参考原子，7,500,000-9,000,000个165Ho参考原子，9,000,000-11,000,000个165Ho参考原子，11,000,000-17,000,000个165Ho参考原子和/或17,000,000-23,000,000个165Ho参考原子的参考颗粒的组。在一些实施方式中，校准系列包含具有约250,000，约500,000，约1,000,000，约2,000,000，约3,500,000，约6,000,000，约8,000,000，约10,000,000，约14,000,000和/或约20,000,000个165Ho参考原子的参考颗粒的组。
在一些实施方式中，校准系列包含具有200,000-400,000个175Lu参考原子；400,000-1,000,000个175Lu参考原子；1,000,000-1,500,000个175Lu参考原子；1,500,000-3,500,000个175Lu参考原子；3,500,000-5,500,000个175Lu参考原子；5,500,000-9,000,000个175Lu参考原子；9,000,000-11,000,000个175Lu参考原子；11,000,000-15,000,000个175Lu参考原子；15,000,000-21,000,000个175Lu参考原子；和/或21,000,000-31,000,000个175Lu参考原子的参考颗粒的组。在一些实施方式中，校准系列包含具有约300,000，约700,000，约1,300,000，约2,500,000，约4,500,000，约8,000,000，约10,500,000，约13,000,000，约19,000,000和/或约26,000,000个175Lu参考原子的参考颗粒的组。
用于在本发明中使用的参考颗粒中的一种或多种元素或同位素可以具有与样品中的目标元素相同的质量。在其它实施方式中，用于在本发明中使用的参考颗粒中的元素或同位素无一具有与任何目标元素相同的质量。作为另外一种选择或另外，用于在本发明中使用的参考颗粒中的某些元素或同位素可以具有比一些目标元素更大的质量，或者比其它目标元素更小的质量。在某些实施方式中，用于在本发明中使用的参考颗粒中的一种或多种元素或同位素可以具有与任何目标元素不同的质量。在一些情况下，连同参考原子，参考颗粒还可以包含一个或多个编码原子(coding atom)。编码原子是对一组颗粒唯一的原子。当检测编码原子时，它因此指示正在采样来自特定组的颗粒。例如，这在共同形成校准曲线的颗粒组中具有特别的应用，因为在该系列中，原子组成保持相同，所述颗粒中仅每种参考原子的量不同。因此，可以用特定编码原子(或其形成条型码的组合)来编码曲线中的每个点，借此识别颗粒所含的参考原子的量。
在某些实施方式中，用于在本发明中使用的参考颗粒包含对参考颗粒中存在的参考原子的量和特性(identity)特异的荧光部分。因此，在某些实施方式中，可以通过荧光光谱识别存在于参考颗粒中的参考原子的特性和量。可以使用的荧光部分包括Alexa Fluor350、Alexa Fluor 647、俄勒冈绿(Oregon Green)、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 680、荧光素(FITC)、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 750、Cy3、Alexa Fluor 532、太平洋蓝(Pacific Blue)、太平洋橙(Pacific Orange)、Alexa Fluor 546、香豆素、四甲基罗丹明(TRITC)、Alexa Fluor 555、BODIPY FL、德克萨斯红(Texas Red)、Alexa Fluor 568、太平洋绿(Pacific Green)、Cy5和Alexa Fluor 594。所述方法还包括在其中荧光标签识别参考颗粒之前，例如，其中将荧光显微术用于识别特定组的至少一种参考颗粒之前的步骤。
参考原子类型
可以引入参考颗粒的参考原子包括通过MS或OES可检测的任何物质。参考原子可以是根据本公开选择作为标记原子的原子。然而，参考原子可以包括将不会作为标记原子起作用的那些原子。如以下所提及的，通常基于它们在正在分析的生物样品中的不存在或以极低水平存在来选择标记原子。照此，它们的信号在标记样品中的检测表明质量标签化的SBP的靶标的存在。然而，在一些情况下，参考原子包括天然存在于样品中的那些。因此，这使得能够定量例如酶活性位点中的金属或者其它配位金属，尤其如血红素中的铁或者叶绿素中的镁。
通常，参考原子是金属。然而，在优选的实施方式中，参考原子是过渡金属，如稀土金属(15个镧系加钪和钇)。这些17个元素(可以通过OES和MS区分)提供了可以容易地(通过MS)区分的多种不同的同位素。多种这些元素以富集的同位素的形式可用，例如，钐具有6种稳定同位素，钕具有7种稳定同位素，其全部以富集形式可用。15个镧系元素提供了具有非冗余的唯一质量的至少37种同位素。适合用作参考原子的元素的实例包括镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钪(Sc)和钇(Y)。除稀土金属之外，其它金属原子适合于检测，例如，金(Au)、铂(Pt)、铱(Ir)、铑(Rh)、铋(Bi)等。放射性同位素的使用不是优选的，因为它们不太便于处理并且是不稳定的，例如，Pm不是镧系中的优选参考原子。
因此，在一些实施方式中，参考颗粒包含对应于用于标记要成像的样品的质量标签中存在的标记原子的参考原子。因此，使得能够使在成像质谱细胞术期间使用的质量通道归一化和校准。然而，在一些实施方式中，参考颗粒包含对应于天然存在于样品中的金属的参考原子。在这些实施方式中，本发明的成像质谱校准物可以用于校准和归一化与样品天然的金属原子/离子的成像质谱分析中使用的质量通道有关的信号强度，例如，当样品是生物样品时，参考颗粒可以包含硒(Se)、钴(Co)、铁(Fe)、铜(Cu)、镍(Ni)、砷(As)、钒(V)、锰(Mn)、铬(Cr)、锌(Zn)和钼(Mo)。
可以基于所使用的参考颗粒，将不同数目的参考原子引入参考颗粒。当将更多的参考原子引入参考颗粒时，可以实现更大的灵敏度。例如，在一些实施方式中，参考颗粒包含至少1000，如至少5000，至少10,000，至少250,000，至少500,000，至少1,000,000，至少2,500,000，至少5,000,000或者至少10,000,000个参考原子。
在一些实施方式中，参考颗粒包含至少5种不同类型的参考原子，例如，140Ce、151Eu、153Eu、165Ho、175Lu，并且包含1,000-100,000,000，5,000-50,000,000，50,000-40,000,000，100,000-30,000,000，200,000-20,000,000，1,000,000-20,000,000，10,000,000-20,000,000或者12,000,000-18,000,000个每种类型的参考原子。在一些实施方式中，本发明的参考颗粒包含总计1,000-300,000,000，2,000-200,000,000，5,000-175,000,000，50,000-150,000,000，100,000-125,000,000，200,000-110,000,000，1,000,000-100,000,000，10,000,000-95,000,000，30,000,000-90,000,000，40,000,000-80,000,000或者50,000,000-70,000,000个参考原子。例如，每种不同类型的参考原子可以以每个颗粒1,000-100,000,000，5,000-50,000,000，50,000-40,000,000，100,000-30,000,000，200,000-20,000,000，1,000,000-20,000,000，5,000,000-20,000,000或8,000,000-18,000,000个每种参考原子的拷贝数存在。如以下所注意的，可以使用具有窄分子量分布，含有多个单体单元的聚合物，其分别含有螯合剂，如二亚乙基三胺五乙酸(diethylene triaminepentaacetic acid，二乙烯三胺五乙酸)(DTPA)或DOTA。
金属掺杂珠
以已知元素组成和量引入参考原子的一种这种方式是通过使用掺杂珠。因此，用于在本发明中使用的参考颗粒可以是金属掺杂珠(metal doped bead)，如金属掺杂聚合物珠，例如，金属掺杂聚苯乙烯珠，如得自Fluidigm Canada,Inc.的EQ4或DM7珠。
可以掺杂聚合物珠以含有一种或多种不同的参考原子(在本文以下第15页更详细地讨论了参考原子)。制备用于在本发明中使用的掺杂珠的方法包括在微乳化聚合反应中使用螯合镧系(或其它金属)离子以产生具有嵌入聚合物中的螯合镧系离子的聚合物参考颗粒。如本领域技术人员已知的，以金属螯合物将在水中具有可忽略的溶解度，但在用于微乳化聚合反应的单体中具有合理的溶解度的方式选择螯合基团。可以使用的典型单体是苯乙烯、甲基苯乙烯、多种丙烯酸脂和甲基丙烯酸酯等，如本领域技术人员已知的。对于机械稳健性，金属标签化参考颗粒具有高于室温的玻璃化转变温度(Tg)。Winnik,M.A.等人,J.Am.Chem.Soc.,2009,131,15276公开了用于制备掺杂聚合物珠的分散聚合方法。
另外，可以通过皮克林(Pickering)乳液聚合制备用于在本发明中使用的金属掺杂珠，其中将固体颗粒加入至乳液以稳定乳液并防止分散相聚结。与微乳液聚合类似，可以将油溶性金属螯合物引入皮克林乳液聚合，从而将金属螯合物引入分散单体相并因此一旦聚合，引入聚合物珠。引入以稳定分散相的颗粒可以是含金属的纳米颗粒，从而在聚合反应期间所形成的颗粒还包含含金属的纳米颗粒。
可以从聚合物制备聚合物珠，聚合物选自由下述组成的组：线性聚合物、共聚物、支化聚合物、接枝共聚物、嵌段聚合物、星形聚合物和超支化聚合物。聚合物主链可以来源于聚烯烃、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酰胺、聚N-烷基丙烯酰胺、聚N,N-二烷基丙烯酰胺、聚N-芳基丙烯酰胺、聚N-烷基甲基丙烯酰胺、聚N,N-二烷基甲基丙烯酰胺、聚N-芳基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯及其功能等价物。用于在本发明中使用的聚合物珠还可以由聚(偏二氟乙烯)、聚(四氟乙烯)、聚乳酸、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯、聚(乙烯基吡啶)、其组合等制备。聚合物可以是取代的。在其中聚合物珠是聚苯乙烯珠的某些实施方式中，珠由聚苯乙烯均聚物或包含来源于聚苯乙烯的单体单元的共聚物，例如，无规或嵌段共聚物制成。
金属掺杂的核-壳聚合物参考颗粒
在一些情况下，使用核-壳参考颗粒，其中将通过微乳化聚合反应制备的金属掺杂的参考颗粒用作种子乳液聚合法的种子参考颗粒以控制表面官能团的性质。可以通过用于该第二阶段聚合反应的适当单体的选择来引入表面官能团。另外，相比于聚苯乙烯参考颗粒，丙烯酸酯聚合物是有利的，因为酯基可以结合至或稳定镧系络合物上不饱和的配体位点。用于制备这些掺杂珠的示例性方法是：(a)将含有至少一种参考原子的络合物并入溶剂混合物中，所述溶剂混合物包含其中含有至少一种参考原子的络合物是可溶性的至少一种有机单体(如苯乙烯和/或甲基丙烯酸甲酯)以及其中所述有机单体和所述含有至少一种参考原子的络合物不太可溶的至少一种不同的溶剂，(b)将步骤(a)的混合物乳化足以提供均一乳液的一段时间；(c)起始聚合反应并继续反应直至大部分单体转化为聚合物；和(d)将步骤(c)的产物温育足以获得聚合物参考颗粒与引入其中的所述参考颗粒中或上的所述含有至少一种参考原子的络合物的乳胶悬浮液的一段时间，其中选择所述含有至少一种参考原子的络合物，从而一旦探询聚合物参考颗粒，则从所述至少一种参考原子获得明显的质量信号。通过使用包括不同参考原子的两种或更多种络合物，可以制备包含两种或更多种不同参考原子的掺杂珠。此外，控制包含不同参考原子的络合物的比率使得能够产生具有不同参考原子比率的掺杂珠。在核-壳珠中，这可以通过将含有第一参考原子的络合物引入核中，并将含有第二参考原子的络合物引入壳中来实现。
聚合物涂覆的金属纳米颗粒
制备用于在本发明中使用的参考颗粒的另一种方式是产生已在聚合物中涂覆的颗粒，如金属纳米颗粒。在本文中，金属通过聚合物与环境隔离并被屏蔽，并且当通过加热将聚合物壳融合至样品载体时，金属不反应。
接枝至(grafting to)和接枝出(grafting from)是产生围绕纳米颗粒的聚合物刷(polymer brush)的两种原理机制。在接枝至中，单独合成聚合物，并因此合成不受需要保持纳米颗粒胶体稳定的限制。在本文中，由于单体的多种多样和易于官能化，可逆加成-断裂链转移(RAFT)合成是优越的。可以容易地将链转移剂(CTA)用作官能团本身，可以使用官能化的CTA或者聚合物链可以是后官能化的。使用化学反应或物理吸附将聚合物连接至纳米颗粒。接枝至的一个缺点在于接枝密度通常较低，这是由于在向参考颗粒表面连接期间，螺旋状聚合物链的位阻排斥所造成的。所有接枝至的方法具有以下缺点：需要严格检查以从官能化的纳米复合参考颗粒上除去过量的游离配体。这通常通过选择性沉淀和离心来实现。在接枝出的方法中，将分子，如用于原子转移自由基聚合(ATRP)的引发剂或者用于(RAFT)聚合反应的CTA固定在参考颗粒表面上。这种方法的缺点在于新的引发剂偶联反应的发展。此外，与接枝至相反，参考颗粒必须在聚合反应条件下是胶体稳定的。
包含具有金属螯合基团的聚合物的参考颗粒
用于产生用于在本发明中使用的参考颗粒的另一种方式是使用聚合物颗粒，其中聚合物包含连接至聚合物的至少一个亚基的金属螯合配体。能够结合聚合物中的至少一个金属原子的金属螯合基团的数目可以在约1至10,000之间，如5-100，10-250，250-5,000，500-2,500或500-1,000。至少一个金属原子可以结合到至少一个金属螯合基团。聚合物可以具有约1至10,000之间，如5-100，10-250，250-5,000，500-2,500或500-1,000的聚合度。
能够结合至少一个金属原子的金属螯合基团可以包含至少4个乙酸基团。例如，金属螯合基团可以是二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)基团或1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)基团。替代基团包括乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)。
在某些实施方式中，用于在本发明中使用的聚苯乙烯珠的聚苯乙烯也可以包含金属螯合基团。例如，聚苯乙烯珠可以包含聚苯乙烯-聚丙烯酸酯共聚物、聚苯乙烯-聚丙烯酰胺共聚物、聚苯乙烯-聚甲基丙烯酸酯共聚物或聚苯乙烯-聚甲基丙烯酰胺共聚物；其中每个金属螯合基团连接至衍生自聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯或聚甲基丙烯酰胺的聚合物亚基(polymer subunit)。
在某些实施方式中，金属螯合基团可以通过酯或通过酰胺连接至聚合物。适合的金属螯合聚合物的实例包括得自Fluidigm Canada,Inc.的X8和DM3聚合物。可以采用制备在重复单元中含有官能性侧基的聚合物的策略，其中所连接的过渡金属单元(例如Ln单元)可以连接至所述重复单元。这种实施方式具有几种优势。它避免了可能由于实施含有配体的单体的聚合反应所产生的复杂性。
在某些实施方式中，用于在本发明中使用的金属螯合聚合物可以包含通过环丙烷的ROP可得的聚环丙烷。环丙烷单体可以包含能够被金属螯合基团取代的取代基。例如，通过Illy,N.等人,Macromol.Rapid Comm.,2009,30,1731-1735所报道的环丙烷-1,1-二羧酸酯的ROP提供了每个重复单元具有两个羧酸酯基团的聚环丙烷。
在某些实施方式中，用于在本发明中使用的金属螯合聚合物可以包含通过降冰片烯的开环易位聚合(ROMP)(例如，使用如本领域技术人员已知的Grubb催化剂)可得的聚降冰片烯。降冰片烯单体可以被能够被金属螯合基团取代的取代基取代。例如，5-降冰片烯-2-羧酸酯可以经历ROMP以提供在每个重复单元上具有羧酸酯基团的聚降冰片烯。另外，其它取代基环烯和二烯单体也可以用于制备用于在本发明中使用的金属螯合聚合物。例如，1,5-环辛二烯。
可以通过本领域技术人员已知的方法将金属螯合基团连接至聚合物，例如，可以通过酯或通过酰胺连接侧基。例如，对于具有羧酸酯基的聚降冰片烯、聚环丙烷、或基于甲基丙烯酸酯的聚合物，可以首先通过聚合物与乙二胺在甲醇中的反应，然后通过过量DTPA与中等过量的4-(4,6-二甲氧-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-氯化吗啉鎓(DMTMM)的后续反应将金属螯合基团连接至聚合物骨架。这种方法在Majonis,D.等人,Anal Chem.,2010,82,8961-9中有所讨论。本领域技术人员将理解可以使用这些方法，用DOTA或DTPA对具有可以被二胺，例如，乙二胺取代的反应性部分的任何聚合物进行官能化。这些部分包括羧酸酯、烷基氯、酰基氯或环氧化物，例如，缩水甘油基。
在某些实施方式中，用于在本发明中使用的金属螯合聚合物可以包含聚硅氧烷，其得自例如环三硅氧烷的开环聚合(ROP)，如本领域技术人员已知的。在硅上具有乙烯基取代基的环三硅氧烷，例如，甲基乙烯基硅氧烷环三聚体的ROP提供了在主链中的每个硅原子上包含乙烯基基团的聚硅氧烷。然后，如本领域技术人员已知的，可以使用包含硫醇基团的试剂，使用点击化学将金属螯合基团取代至聚合物主链。
在某些实施方式中，用于在本发明中使用的金属螯合聚合物可以包含聚磷腈，其得自例如环三磷腈的开环聚合(ROP)，如本领域技术人员已知的。在每个磷上具有两个氯代取代基的环三磷腈，例如，六氯磷腈的ROP提供了在主链中的每个磷原子上包含两个氯代基团的聚磷腈。然后，可以通过用包含能够取代氯代取代基的亲核原子的金属螯合剂，例如，醇或胺取代氯代取代基将金属螯合基团取代至聚合物主链。作为另外一种选择，可以用包含乙烯基，例如，烯丙醇或烯丙胺的亲核试剂取代氯代取代基以提供在聚合物主链中的每个磷原子上具有乙烯基基团的聚磷腈。然后，如本领域技术人员已知的，可以使用包含硫醇基团的试剂，使用点击化学将金属螯合基团取代至聚合物主链。在一些实施方式中，使用本文所讨论的方法，用金属螯合基团，如DOTA、DPTA或EDTA官能化多肽，或者所述多肽是另外能够结合至金属的多肽或蛋白(例如，天然存在的或工程设计的金属结合肽、多肽和蛋白)。例如，可以用金属螯合基团之一官能化聚赖氨酸的每个重复单元上存在的末端烷基胺基团以提供能够结合镧系的多肽。这种官能化的实例可见于Haung,Z.等人,RSC Adv.2018,8,5005-5012。另外，在Lu,Y.等人,Biomacromolecules,2014,15,2027-2037中报道了使用DTPA的聚谷氨酰胺的官能化。
可以通过选择适当的试剂化学计量来小心地控制金属螯合基团对聚合物骨架的取代度，例如，当使用点击化学将金属螯合基团连接至聚合物主链上的乙烯基基团时。因此，在一些实施方式中，用于在本发明中使用的金属螯合聚合物的至少20％的重复单元具有与之结合的金属螯合基团，例如，至少30，至少50，至少70，至少80，至少90，至少99％或基本所有的重复单元具有与之结合的金属螯合基团。
可以将金属螯合聚合物引入用于在本发明中使用的参考颗粒。在一些实施方式中，可以将金属螯合聚合物引入到颗粒表面上，换言之，用金属螯合聚合物官能化颗粒表面以产生3D聚合物刷。可以直接从颗粒表面长出(接枝出)聚合物，作为另外一种选择，可以将预形成的金属螯合聚合物连接至颗粒表面(接枝至)。
颗粒将具有使得使用金属螯合聚合物的表面官能化能够提供足够用于精确检测和检测信号强度的后续归一化和校准的参考原子数的大小。因此，在一些实施方式中，来自包含金属螯合或含金属聚合物的SAM的颗粒将具有0.2μm至20μm，包括0.5μm至10μm，1μm至5μm，1μm至3μm或1μm至2μm或者约1μm的最长直径。
包括含金属的聚合物的参考颗粒
制备用于在本发明中使用的参考颗粒的其它方式是产生在聚合物主链中包括而不是作为配位金属配体包括参考原子的聚合物。例如，Carerra和Seferos(Macromolecules2015,48,297-308)公开了在聚合物主链中包括碲。其它聚合物引入了能够用作参考原子的原子，锡-、锑-和铋-引入聚合物。特别地，在Priegert等人,2016(Chem.Soc.Rev.,45,922-953)中讨论了这些分子。
最后，用于在本发明中使用的参考颗粒可以包含至少两种组分：参考原子和聚合物，其螯合，含有或掺杂了至少一种参考原子。
用于在本发明中使用的聚合物可以符合通过导致相对窄的聚合物分散性的路线的合成。例如，可以从可逆加成断裂聚合(RAFT)、原子转移自由基聚合(ATRP)、硝基氧介导的聚合(NMP)和光引发转移终止剂介导的聚合(PIMP)合成聚合物，其应导致在1.1至1.2的范围内的Mw(重均分子量)/Mn(数均分子量)值。另外，其中聚合物具有约1.02至1.05的Mw/Mn的单电子活性自由基聚合是可获得的。这些方法允许通过引发剂或终止剂的选择来控制末端基团。这使得能够合成可以将接头连接至其的聚合物。此外，这些方法允许通过连续单体加成来合成嵌段共聚物。
用于制备用于在本发明中使用的参考颗粒的聚合物还包括：
-无规共聚物聚(DMA-共-NAS)：在Relógio等人(2004)(Polymer,45,8639-49)中报道了通过RAFT的N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)与N,N-二甲基丙烯酰胺(DMA)的75/25摩尔比的无规共聚物的合成，其具有高转化，在5000至130,000的范围内的优良摩尔质量控制并且具有Mw/Mn≈1.1。活性NHS酯与具有反应性氨基的金属螯合基团反应以获得通过RAFT聚合反应合成的金属螯合共聚物。
-聚(NMAS)：可以通过ATRP聚合NMAS，从而获得平均摩尔质量在12至40KDa的范围内，Mw/Mn为约1.1的聚合物(参见，例如，Godwin等人,2001；Angew.Chem.Int.Ed,40:594-97)。
-聚(MAA)：可以通过其叔丁基或三甲基甲硅烷基(TMS)酯的阴离子聚合制备聚甲基丙烯酸(PMAA)。
-聚(DMAEMA)：可以通过ATRP制备聚(甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)(PDMAEMA)(参见Wang等人,2004,J.Am.Chem.Soc,126,7784-85)。这是熟知的聚合物，其方便地制备具有在2至35KDa的范围内的平均Mn值和约1.2的Mw/Mn。还可以通过阴离子聚合合成具有窄粒径分布的这种聚合物。
-聚丙烯酰胺或者聚甲基丙烯酰胺。
可以通过本领域技术人员已知的方法将金属螯合基团连接至聚合物，例如，可以通过酯或通过酰胺连接侧基。例如，对于基于甲基丙烯酸酯的聚合物，可以首先通过聚合物与乙二胺在甲醇中的反应，然后通过过量DTPA与中等过量的4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-氯化吗啉鎓(DMTMM)的后续反应将金属螯合基团连接至聚合物骨架。这种方法在Majonis,D.等人,Anal Chem.,2010,82,8961-9中有所讨论。作为另外一种选择，用乙二胺官能化的聚合物可以随后与DTPA酸酐在碱性条件下在碳酸酯缓冲液中反应。
样品载体基底
当将参考颗粒通过加热融合至样品载体时，样品载体基底可以是在将参考颗粒与之融合所需的温度下保留其结构完整性的任何固相。换言之，尽管可以在本发明中使用样品载体和参考颗粒的不同组合，但是本领域技术人员将理解样品载体基底不可以用玻璃化转变或熔融温度小于用于将颗粒融合至样品载体表面的最大温度的任何材料制成。如果满足该标准，则可以如本文所讨论的修饰在本发明中使用的样品载体。
当通过使用溶剂来使参考颗粒部分溶剂化或溶胀(swell，膨胀)从而将参考颗粒融合至样品载体时，样品载体基底可以是在用于将参考颗粒与之融合的溶剂中保留其结构完整性的任何固相。换言之，尽管可以在本发明中使用样品载体和参考颗粒的不同组合，但是本领域技术人员将理解样品载体基底不可以用希尔德布兰德溶解度参数相比于参考颗粒，与用于融合的溶剂更接近的任何材料制成。如果满足该标准，则可以如本文所讨论的修饰在本发明中使用的样品载体。
用于可以在本发明中使用的样品载体的材料的实例包括玻璃、二氧化硅、铝、纤维素、壳聚糖、铟锡氧化物(ITO)、氧化铝(Al2O3)、磁铁矿(Fe3O4)、CuOx、赤铁矿(c-Fe2O3)、锰螺旋铁氧体(MnFe2O4)、氢氧化镁(Mg(OH)2)、氧化锌(ZnO)、膦酸锆、埃洛石、蒙脱石、钢、蓝宝石、硒化镉(CdSe)、硫化镉(CdS)、砷化镓(GaAs)、云母、炭黑、金刚石、单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、石墨烯并且涵盖了处于例如显微镜载玻片(microscope slide)的形式的平面表面。
当样品载体是平面时，则它可以是光学透明的，例如，由玻璃制成。当样品载体是光学透明的时，它使得能够穿过支持物烧蚀样品材料。例如，固体支持物可以包括组织载玻片。例如，在WO2014169394中讨论了穿过载体的烧蚀。平面样品载体还可以含有在基底中编码的元素。
制备成像质谱校准物的方法
通过将颗粒融合至样品载体产生了成像质谱校准物。首先，将颗粒分散到样品载体上，然后将它们融合至载体。
将样品载体与参考颗粒的悬浮液接触
本发明的方法中的第一步包括将样品载体与至少一种参考颗粒的悬浮液接触，其中至少一种参考颗粒包含至少一种参考原子。
可以在本发明的方法中使用使参考颗粒悬浮的任何溶剂，即不是溶解参考颗粒的溶剂。本领域技术人员将理解参考颗粒的性质将决定可以使用哪些溶剂来形成在本发明的方法中使用的悬浮液。例如，其中参考颗粒是金属掺杂的聚苯乙烯珠，参考颗粒可以在水、乙醇、其它醇和溶剂，例如，甲醇、丙醇、丁醇、丙酮、乙酸、其混合物等中悬浮。
当可以从样品载体烧蚀具有已知元素组成和量的整个参考颗粒并且确定与参考颗粒有关的每个参考原子的积分信号强度并与基于已知存在的参考原子的量的参考颗粒的预期积分信号强度相比较时，可以最好地实施信号强度的归一化和/或成像质谱细胞计数仪的校准(在第44页开始的部分中进一步讨论了使用本发明的成像样品载体的检测器的归一化和校准)。因此，期望将单独的参考颗粒离散地融合至样品载体，即它们不在样品载体表面上团聚，因此使得能够准确确定每个参考颗粒的平均积分信号强度。因此，参考颗粒必须以防止参考颗粒明显团聚并因此允许离散的参考颗粒融合至样品载体上的方式与样品载体接触。例如，样品载体与参考颗粒的悬浮液的接触可以允许至多达2％，5％，8％，10％，15％或20％的参考颗粒在本发明的成像质谱校准物的样品载体上团聚。
因此，在一些实施方式中，本发明的方法还包括将样品载体与至少一种参考颗粒的悬浮液接触，其中参考颗粒以确保在样品载体上充分覆盖的浓度存在，从而用户可以容易地在归一化和校准期间定位用于烧蚀的参考颗粒，并且可以小心地将各个参考颗粒融合至样品载体。此外，颗粒以允许在样品成像期间采样对于检测信号强度的校准和归一化所必需的颗粒数目的足够数目存在。充分的样品载体覆盖是确保满足上述条件所需的。
在一些实施方式中，在将样品载体与包含参考颗粒的悬浮液接触后，本发明的方法包括使悬浮液蔓延通过样品载体区，例如，1mm×1mm，2mm×2mm，4mm×4mm，6mm×6mm，8mm×8mm，10mm×10mm或10mm×20mm的样品载体区。参考颗粒的悬浮液在样品载体区上的蔓延将提高溶剂的蒸发速率，另外可以帮助提供在样品载体上离散地分离的足够数目的参考颗粒，即减少参考颗粒团聚的量。
本领域技术人员将理解确保至少一种参考颗粒在样品载体上的充分覆盖以及分离的各个参考颗粒的融合两者所需的参考颗粒在悬浮液中的浓度将依赖于参考颗粒和所使用的溶剂两者的性质，并且可以通过常规实验容易地确定。例如，当颗粒是3μm直径的金属掺杂的聚苯乙烯珠在水或EtOH中的悬浮液时，以1×103至1×1015个颗粒/ml，例如，1×106至1×108个颗粒/ml，1×105至1×109个颗粒/ml，1×106至1×108个颗粒/ml，1×106到1×108个颗粒/ml或者约9×107个颗粒/ml的浓度，用颗粒悬浮液覆盖样品载体区，例如，1mm×1mm，2mm×2mm，4mm×4mm，6mm×6mm，8mm×8mm，10mm×10mm或10mm×20mm的样品载体区，以提供至少1，至少2，至少3，至少5，至少8，至少10，至少15，至少20个颗粒/100μm×100μm的样品载体区的浓度。例如，其中参考颗粒是金属掺杂的聚苯乙烯EQ4珠，发现以1×106至1×108个颗粒/ml在EtOH和水两者中的浓度移液2μl所述珠的悬浮液提供了用单独分离的珠对样品载体的充分覆盖，例如，约12个颗粒/100μm×100μm的样品载体区和在1×1cm的样品载体区中约1.7×105个珠。
可以将颗粒悬浮液移液至样品载体上。在一些实施方式中，将至少1μl，至少2μl，至少3μl，至少4μl，至少5μl，至少8μl或者至少10μl的颗粒悬浮液移液至载玻片上。在一些实施方式中，将参考颗粒的悬浮液移液显著远离样品载体边缘。例如，将参考颗粒的悬浮液移液距载玻片边缘至少1mm，至少2mm，至少3mm，至少4mm，至少5mm。本领域技术人员将理解将颗粒定位远离载玻片边缘将降低可能由定位在载玻片边缘附近的颗粒所产生的检测的积分信号强度的变化(即“边缘效应”)。
在一些实施方式中，所述方法包括用包含至少一种参考颗粒的悬浮液接触样品载体，其中至少一种参考颗粒包含多于一个不同的参考原子，例如，至少2、3、4、5、6、7、8或10种不同的标记原子。例如，每种至少一种参考颗粒包含不同参考原子的混合物。因此，所述方法可以提供可以用于校准和归一化成像质谱细胞计数仪的检测器的多个质量通道的信号强度的成像质谱校准物。
在一些实施方式中，所述方法包括用包含多于一个参考颗粒的悬浮液接触样品载体，例如，至少2、3、4、5、6、7、8或至少10组的至少一种参考颗粒，其中至少一种参考颗粒的每个组包含不同的参考原子。因此，所述方法可以提供包含位于样品载体的离散区域中的至少一种颗粒的不同组的成像质谱校准物，其可以用于容易地识别用于信号强度的校准和归一化的成像质谱细胞计数仪的检测器的不同质量通道。因此，在一些实施方式中，所述方法包括用包含多于一个参考颗粒的悬浮液接触样品载体，例如，至少2、3、4、5、6、7、8或至少10组的至少一种参考颗粒，其中至少一种参考颗粒的每个组包含不同的参考原子并且其中每组参考颗粒与样品载体的不同的离散区域接触。
在一些实施方式中，所述方法包括用包含多于一个参考颗粒的悬浮液接触样品载体，例如，至少2、3、4、5、6、7、8或至少10组的至少一种参考颗粒，其中至少一种参考颗粒的每个组包含不同量的相同参考原子。因此，所述方法可以提供可以用于绘制成像质谱细胞术的检测器的质量通道的校准曲线的成像质谱校准物(有关校准曲线的讨论，参见第48页)。因此，在一些实施方式中，所述方法包括用包含多于一个参考颗粒的悬浮液接触样品载体，例如，至少2、3、4、5、6、7、8或至少10组的至少一种参考颗粒，其中至少一种参考颗粒的每个组包含不同量的相同参考原子，并且其中每组参考颗粒与样品载体的不同的离散区域接触。
在一些实施方式中，所述方法包括用包含多于一个参考颗粒的悬浮液接触样品载体，例如，至少2、3、4、5、6、7、8或至少10组的至少一种参考颗粒，其中每组参考颗粒包含多个不同的参考原子，其中至少一种融合的参考颗粒的每个组包含不同量的多个不同的参考原子。例如，每组参考颗粒可以包含参考原子的相同混合物，但是其处于不同的量。因此，所述方法可以提供可以用于绘制成像质谱细胞术的检测器的多个不同的质量通道的校准曲线的成像质谱校准物(有关校准曲线的讨论，参见第48页)。另外，可以将不同组的参考颗粒置于离散区域中。因此，在一些实施方式中，所述方法包括用包含多于一个参考颗粒的悬浮液接触样品载体，例如，至少2、3、4、5、6、7、8或至少10组的至少一种参考颗粒，其中每组参考颗粒包含多个不同的参考原子，其中至少一种融合的参考颗粒的每个组包含不同量的多个不同的参考原子，并且其中将每组参考颗粒与样品载体的不同的离散区域接触。
如所讨论的，将不同组的参考颗粒分离至样品载体的离散区域使得能够基于它们在样品载体上的位置来容易地识别各组参考颗粒。因此，可以容易地识别包含不同的特定参考原子、参考原子的组合和/或参考原子的量的不同组的颗粒，从而有利于对成像质谱细胞术的检测器的多个不同质量通道绘制校正曲线。本文讨论了用于绘制校准曲线的方法(参见第48页)。
在一些实施方式中，本发明的方法还包括在用包含至少一种参考颗粒的悬浮液接触样品载体之后，干燥样品载体的步骤。可以将样品载体在室温下在空气中保持干燥。作为另外一种选择，可以通过在低于溶剂沸点的温度下加热样品载体来干燥样品载体。例如，可以将样品载体加热至低于溶剂沸点10℃，20℃，30℃，40℃，50℃。应在不导致溶剂鼓泡或沸腾(这可能导致颗粒在载玻片上团聚)的温度下加热样品载体以蒸发溶剂。可以通过光学显微镜检查样品载体以确定溶剂已蒸发。
将参考颗粒融合至样品载体
制备本发明的成像质谱校准物的方法还包括一旦样品载体已与包括至少一种参考颗粒的悬浮液接触，将至少一种参考颗粒与样品载体融合的步骤。可以通过多种方法将参考颗粒融合至样品载体。
如上所述，在一些情况下，可以将多组颗粒与样品载体的不同离散区域接触。在本发明的一些实施方式中，在单一融合步骤中，在所有参考颗粒融合至样品载体之前，将所有不同组的参考颗粒与不同的离散区域接触。
通过加热融合
将至少一种参考颗粒融合至样品载体的步骤可以包括加热样品载体。本发明的方法还可以包括在将至少一种颗粒与样品载体融合前，干燥样品载体的额外的步骤。在一些实施方式中，将至少一种参考颗粒与样品载体融合的步骤包括在高于参考颗粒的玻璃化转变温度的温度下加热样品载体并随后将样品载体冷却至低于参考颗粒的玻璃化转变温度。换言之，可以通过玻璃化发生至少一种参考颗粒向样品载体的融合。在本发明的一些实施方式中，至少一种参考颗粒可以是晶体，从而通过将样品载体加热至高于至少一种参考颗粒的熔融温度来将至少一种参考颗粒融合至样品载体。换言之，将至少一种参考颗粒在样品载体上熔融。
在本发明的一些实施方式中，至少一种参考颗粒具有至少80℃，如至少100℃，至少120℃，至少140℃，至少160℃，至少180℃或者至少200℃的玻璃化转变温度，从而在高于所述温度加热样品载体以将至少一种参考颗粒与之融合。在一些实施方式中，将样品载体加热至最高高达300℃，例如，高达275℃，高达250℃，高达225℃或者高达200℃。将至少一种参考颗粒加热到高于其玻璃化转变温度将至少一种参考颗粒从其玻璃态改变至粘稠的橡胶态。一旦至少一种参考颗粒处于粘稠橡胶态，则它可以融合至样品载体。例如，其中至少一种参考颗粒是聚合物珠，则将至少一种参考颗粒加热至高于其玻璃化转变温度为聚合物链提供了足够的能量以克服构象旋转的能垒，从而所述链可以彼此滑过并采取新的构象，因此粘附至样品载体。
可以通过光学显微法评价颗粒向样品载体融合的程度。因此，在加热样品载体后，可以在光学显微镜下检查样品载体并且将融合颗粒的直径与加热前的颗粒直径相比较。不受理论束缚，当将颗粒加热到高于它们的Tg并变得粘稠和橡胶状时，颗粒将丢失它们的球形并变得与样品载体融合。当处于粘稠橡胶态时，球形参考颗粒将变得更平(例如，圆顶形)。当观察到它们的尺寸从非融合颗粒尺寸升高时，则认为颗粒充分融合至样品载体。可以通过光学显微法检查融合颗粒。在一些实施方式中，加热样品载体直至颗粒直径比非融合参考颗粒的尺寸大至少5％，如至少10％，至少15％，至少20％，至少30％，至少50％，至少75％，至少100％或者至少150％。
对于本领域技术人员将显而易见的是尽管将至少一种参考颗粒加热至稍微高于其Tg(例如5℃)将有利于至少一种参考颗粒融合至样品载体所需的参考颗粒中的构象变化，但是如果在超过Tg的温度下加热至少一种参考颗粒，则将提供更多能量(例如，向聚合物链)，从而有利于更快的构象重排(例如，链的构象重排)并因此使至少一种参考颗粒更快速的融合至载玻片。因此，在一些实施方式中，在本发明的方法中将至少一种参考颗粒融合至样品载体的步骤包括在超过参考颗粒Tg的温度，例如，超过参考颗粒Tg至少10℃，至少20℃，至少30℃，至少40℃，至少50℃，至少60℃，至少80℃或者至少100℃的温度下加热样品载体和参考颗粒。此外，对本领域技术人员还将显而易见的是当加热参考颗粒的温度升高超过参考颗粒的Tg时，则参考颗粒融合所需的时间可以减少。例如，本领域技术人员将理解在高于其Tg加热参考颗粒的温度越高，则参考颗粒融合至载玻片所需的持续时间越短。
例如，在一些实施方式中，本发明的方法包括将样品载体和参考颗粒在高于Tg至少20℃加热60分钟，在高于Tg至少50℃加热30分钟，在高于Tg至少60℃加热10分钟，在高于Tg至少70℃加热30分钟，在高于Tg至少70℃加热20分钟，在高于Tg至少100℃加热10分钟，在高于Tg至少100℃加热5分钟。本领域技术人员将理解除加热持续时间外，将选择大于参考颗粒Tg的加热温度以确保在对于用户实际的时间内不会发生热引起的样品损害并且发生参考颗粒与样品载体的融合。
在一些实施方式中，本发明的方法包括将至少一种参考颗粒的一组融合至样品载体离散区的样品载体，然后将样品载体与包含至少一种参考颗粒的另一组的另外的悬浮液接触，其中至少一种参考颗粒的每组可以包含不同的参考原子，不同量的相同参考原子或者相同参考原子但不同量的混合物。可以重复样品载体与至少一种参考颗粒的一组接触和将所述至少一种参考颗粒融合至样品载体的所述方法直至形成2、3、4、5、6、7、8或至少10个不同的样品载体区，其中每个区可以包含不同的参考原子或者不同量的相同参考原子。
在一些实施方式中，本发明的方法包括将多于一组参考颗粒融合至样品载体，其中每组参考颗粒具有不同的Tg。因此，在一些实施方式中，所述方法包括将样品载体与包含至少一种参考颗粒的第一组的悬浮液接触，将至少一种参考颗粒的第一组加热至高于其Tg，将样品载体与至少一种颗粒的至少另外一组接触，其中至少一种颗粒的另外一组具有与至少一种颗粒的第一组不同的Tg，并且将至少一种颗粒的至少另外一组加热至高于其Tg。如本领域技术人员将理解的，顺序添加步骤应以具有最高Tg的参考颗粒开始，然后是次最高的等，从而可以使用逐渐降低的温度将第二和后续颗粒融合至样品载体。所述方法还可以包括在每个加热步骤之间清洗样品。
对于本领域技术人员还将显而易见的是基于要成像的参考颗粒和样品的性质，可能需要修改将至少一种参考颗粒融合至载玻片的方法。例如，本领域技术人员将理解不可以在样品载体本身将失去结构完整性的温度，例如，高于样品载体材料的熔融温度下加热参考颗粒。因此，在低于样品载体的Tg的温度下实施本发明的方法中的融合步骤。
基于溶剂的融合
本发明人已发现了可以使用使参考颗粒部分溶剂化或溶胀的溶剂来实施的用于将参考颗粒融合至本发明的成像质谱校准物的替代方法。当用户需要将参考颗粒融合至已包含(如果使用热将参考颗粒融合至样品载体，则将受到不利影响的)热敏感样品的样品载体时，这种技术将具有特别的应用。
本发明人因此已发现聚合物参考颗粒的部分溶剂化有利于颗粒与样品载体的融合。不希望受理论束缚，据信能够使聚合物颗粒至少部分溶剂化的溶剂或溶剂混合物(即“融合”溶剂)渗透到聚合物链基质中并使聚合物链增塑以降低聚合物基质内构象变化的能垒。因此，溶剂有效地将参考颗粒的Tg降低至低于室温的温度，例如，低于25℃，从而使得聚合物链可以彼此滑过并融合至载玻片表面。一旦溶剂蒸发，则参考颗粒因此融合至样品载体。
可以选择用于在本发明的方法中使用的“融合”溶剂或包含“融合”溶剂的溶剂混合物的量和选择以确保溶剂向参考颗粒的渗透，从而使聚合物链增塑并引起向样品载体的融合，而不是使参考颗粒溶剂化至发生参考原子从参考颗粒浸出的程度。在质谱细胞术/质谱中检测的信号强度的绝对校准和归一化需要融合至样品载体的每个参考颗粒具有相同且已知的元素组成和量。参考原子从参考颗粒的浸出显然阻碍了这些绝对方法。
可以基于它们使正在使用的具体参考颗粒至少部分溶剂化的能力来选择溶剂或溶剂混合物。确定适合在本发明的方法中使用的溶剂的一种方法是通过将包含参考颗粒的聚合物的希尔德布兰德溶解度参数与溶剂相比较。如果溶剂的希尔德布兰德溶解度参数与参考颗粒的类似，即是参考颗粒的“融合”溶剂，则该特定溶剂将易于使参考颗粒溶剂化。作为另外一种选择，如果溶剂的希尔德布兰德溶解度参数不同于参考颗粒，即是参考颗粒的“悬浮液”溶剂，则该特定溶剂将不会使参考颗粒溶剂化或明显渗透。
因此，在一些实施方式中，具有与参考颗粒类似的希尔德布兰德溶解度参数的溶剂具有至少2J1/2m-3/2，至少1J1/2m-3/2，至少0.6J1/2m-3/2，至少0.4J1/2m-3/2，至少0.2J1/2m-3/2，至少0.1J1/2m-3/2内的参数值或者基本相同的希尔德布兰德溶解度参数。在一些实施方式中，具有不同于参考颗粒的希尔德布兰德溶解度参数的溶剂具有与参考颗粒的值相差至少2J1 /2m-3/2，至少2.4J1/2m-3/2，至少3J1/2m-3/2，至少4J1/2m-3/2，至少6J1/2m-3/2或至少10J1/2m-3/2的参数值。
在本发明的一些实施方式中，“融合”溶剂或包含“融合”溶剂的溶剂混合物将具有与参考颗粒的希尔德布兰德溶解度参数相差0.02至10J1/2m-3/2的希尔德布兰德溶解度参数，例如，与参考颗粒的希尔德布兰德溶解度参数相差0.1至8J1/2m-3/2，0.2至6J1/2m-3/2，0.4至4J1/2m-3/2，0.2至2J1/2m-3/2，0.6至2J1/2m-3/2，0.8至1.6J1/2m-3/2的希尔德布兰德溶解度参数。
例如，其中参考颗粒是金属掺杂的聚苯乙烯珠(希尔德布兰德溶解度参数＝18.68J1/2m-3/2)，则适合于使参考颗粒部分溶剂化的溶剂是丙酮(希尔德布兰德溶解度参数＝19.9J1/2m-3/2)，然而乙醇(希尔德布兰德溶解度参数＝26.5J1/2m-3/2)不会使参考颗粒部分溶剂化并且乙酸乙酯(希尔德布兰德溶解度参数＝18.2J1/2m-3/2)是聚苯乙烯参考颗粒的良好溶剂，并因此它的使用可以导致参考原子从参考颗粒的浸出。
用于在本发明的方法中使用的溶剂包括戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、丙酮、甲苯、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、四氢呋喃、二甲苯、二甲基亚砜、丙酮、乙酸、水、其混合物等。用于在本发明的方法中使用的挥发性溶剂包括戊烷、己烷、环己烷、乙醚、氯仿、二氯甲烷、其混合物等。
另外，溶剂混合物还可以用于使参考颗粒部分溶剂化。例如，可以使用至少两种溶剂的混合物，其中一种溶剂具有类似于参考颗粒的希尔德布兰德溶解度参数(即“融合”溶剂)并且另一种具有不同于参考颗粒的希尔德布兰德溶解度参数(即“悬浮液”溶剂)。例如，其中参考颗粒是聚苯乙烯参考颗粒，则可以使用乙酸乙酯和乙醇的混合物。所得混合物可以使参考颗粒部分溶剂化，而不会使参考原子明显浸出。本领域技术人员将理解可以在本发明的方法中使用的两种溶剂的具体比值将取决于包含参考颗粒的聚合物和形成混合物的溶剂。因此，在一些实施方式中，混合物包含按重量计99％与1％的“悬浮液”溶剂与“融合”溶剂，例如，按重量计98％与2％，95％与5％，90％与10％，80％与20％，70％与30％，60％与40％，60％与50％，40％与60％，30％与70％，20％与80％或者10％与90％的“悬浮液”溶剂与“融合”溶剂。
在存在“融合”溶剂的情况下限制颗粒所花的时间量将降低参考原子从参考颗粒中浸出的可能性。另外，要求参考颗粒在包含良好溶剂的溶液中长期悬浮的方法是不期望的，因为可能发生参考颗粒的完全溶剂化，从而用户获得了包含溶剂化的聚合物链和溶剂化的参考原子的溶液，这不可以在本发明中使用。因此，期望限制颗粒在“融合”溶剂或包含“融合”溶剂的溶剂混合物中所花的时间量，从而参考原子将不会从颗粒中浸出至不再可能进行准确绝对校准和归一化的程度。因此，本发明的方法将限制参考颗粒在存在“融合”溶剂的情况下所花的时间量。
将参考颗粒溶剂融合至本发明的成像质谱校准物的第一方法包括在与如上所述的第一方法相同的方法中，通过将样品载体与参考颗粒在不使颗粒溶剂化的溶剂(即不良溶剂)中的悬浮液接触，将参考颗粒分散在样品载体上。一旦参考颗粒已在样品载体上分散并干燥，则然后将参考颗粒暴露于溶剂蒸气。已蒸发并引入参考颗粒的溶剂或溶剂混合物包含能够使参考颗粒至少部分溶剂化的溶剂，即“融合”溶剂。在本发明的方法中，溶剂蒸气渗透参考颗粒的聚合物基质，使聚合物链增塑，从而聚合物链可以融合至样品载体。然后，已渗透参考颗粒的溶剂蒸气蒸发。换言之，溶剂退火可以用于将参考颗粒融合至样品载体。
本领域技术人员将理解将根据它们的相对希尔德布兰德溶剂参数(即相对于所讨论的参考颗粒)和它们的挥发性选择溶剂。易挥发溶剂将在环境温度蒸发以提供溶剂蒸气而无需加热样品。例如，其中参考颗粒包含聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或其共聚物，则二氯甲烷(DCM)(25℃的蒸气压＝58kPa)或氯仿(25℃的蒸气压＝30kPa)可以用于形成渗透颗粒并将它们融合至样品载体的溶剂蒸气。在一些实施方式中，用于使参考颗粒溶剂退火的溶剂在25℃的蒸气压为至少10kPa，例如，在25℃为至少20，至少30，至少40，至少50kPa。
该方法降低了参考原子从参考颗粒中的任何浸出的可能性，因为溶剂蒸气可以渗透颗粒，但是不提供参考原子从参考颗粒中浸出到其它样品载体区的媒介物。
将参考颗粒溶剂-融合至本发明的成像质谱校准物的第二方法包括通过将样品载体与参考颗粒在不使颗粒溶剂化的溶剂(即“悬浮液”溶剂)中的悬浮液接触，将参考颗粒分散在样品载体上。例如，如果参考颗粒是金属掺杂的聚苯乙烯珠，则可以使用在第23页上的部分中所述的用于将参考颗粒在载玻片上分散的任何溶剂，例如，水或乙醇或其混合物。一旦颗粒已在载玻片上分散并且样品载体干燥，则将一定量的“融合”溶剂或包含“融合”溶剂的溶剂混合物加入至在样品载体上分散的参考颗粒。然后，随着溶剂或溶剂混合物首先渗透参考颗粒，然后蒸发，使参考颗粒增塑并融合至样品载体。尽管可以加热样品载体以辅助溶剂蒸发，但是将理解这可能不是所期望的，如果样品载体包含热敏感样品。
可以根据其挥发性选择溶剂。具有更高挥发性的溶剂将从样品载体更快速蒸发，因此限制了参考颗粒与所述溶剂接触的时间。因此，如果溶剂或溶剂混合物是易挥发的时，则可以使用希尔德布兰德溶解度参数更类似于参考颗粒的溶剂或包含所述溶剂的溶剂混合物。还可以以更大的量使用具有更高挥发性的溶剂或溶剂混合物。
因此，在本发明方法的一些实施方式中，将至少2μl，至少3μl，至少4μl，至少5μl，至少10μl，至少15μl，至少20μl，至少50μl，至少100μl的“融合”溶剂或包含“融合”溶剂的溶剂混合物加入至在样品载体上分散的参考颗粒。
将参考颗粒溶剂-融合至本发明的成像质谱校准物的第三方法包括使用溶剂，其包括在将样品载体与悬浮液接触之前，将一定量的“融合”溶剂，即具有与参考颗粒类似的希尔德布兰德溶解度参数的溶剂添加至所述颗粒在“悬浮液”溶剂，即具有与参考颗粒不同的希尔德布兰德溶解度参数的溶剂中的悬浮液的步骤。基于参考颗粒和溶剂的各自特性，选择加入至“悬浮液”溶剂中的“融合”溶剂的特性和量。因此，在一些实施方式中，所得的溶剂混合物包含按重量计99％与1％的“悬浮液”溶剂(不同的希尔德布兰德溶解度参数)与“融合”溶剂(类似的希尔德布兰德溶解度参数)，例如，按重量计98％与2％，95％与5％，90％与10％，80％与20％，70％与30％，60％与40％，60％与50％，40％与60％，30％与70％，20％与80％或者10％与90％的“悬浮液”溶剂与“融合”溶剂。然后，可以如第23页开始的部分中详细描述的，实施将样品载体与包含参考颗粒的悬浮液接触的方法。
如所述的，挥发性更强的溶剂从样品载体中更快速蒸发并因此与参考颗粒接触时间更短，因此挥发性更强的溶剂混合物可以包含更多的“融合”溶剂。
如上所述的任何方法可以用于溶剂-融合参考颗粒，如第7页开始的部分中所讨论的那些。特别适合于溶剂-融合的其它类型的参考颗粒是交联的聚合物颗粒。这些颗粒包含聚合物链的交联基质。因此，溶剂、溶剂混合物或溶剂蒸气的添加可以不使聚合物链溶剂化，而无论添加多少“融合”溶剂和对于什么时间段。作为替代，“融合”溶剂或包含“融合”溶剂的溶剂混合物的添加使交联参考颗粒溶胀，从而随着溶剂蒸发和颗粒收缩，允许颗粒融合至样品载体。
因此，当处于悬浮液中时，例如，如果在接触样品载体之前，将参考颗粒引入“融合”溶剂或包含“融合”溶剂的溶剂混合物中(即如上所述的第二方法))，或者在样品载体本身上时，例如，如果一旦在载玻片上分散，“融合”溶剂或包含“融合”溶剂的溶剂混合物接触参考颗粒(即如上所述的第一和第三方法)，则交联聚合物颗粒将不会完全溶剂化。因此，交联颗粒的使用可以减少参考原子从参考颗粒的浸出。
尽管本发明的方法降低了参考原子的浸出，但是将理解将交联聚合物参考颗粒与“融合”溶剂或包含“融合”溶剂的溶剂混合物长期接触仍可以导致参考原子浸出。因此，将交联聚合物参考颗粒溶剂-融合至样品载体的方法优选地仍限制参考颗粒在存在“融合”溶剂或包含“融合”溶剂的溶剂混合物的情况下的时间。
对于成像质谱校准物的样品制备
如果在制备本发明的成像质谱校准物的方法中使用的样品载体已包含样品，例如，生物样品，则对于本领域技术人员显而易见的是融合参考颗粒的条件的优化可以是必需的以最大程度减少对可能发生的样品的热损害。本领域技术人员将理解所述优化将包括在加热至少一种参考颗粒的温度和加热至少一种参考颗粒的持续时间之间做出折中。换言之，本领域技术人员将优化本发明的方法，使用确保参考颗粒向样品载体快速融合的加热温度，从而可以减少样品加热时间，但是所述加热温度不会使样品受到热损害或者影响在成像期间所检测的与样品有关的信号强度，或者任何损害仅限于可接受的程度。
在一些实施方式中，本发明的方法还包括在样品载体与包含至少一种参考颗粒的悬浮液接触之前，将样品负载到样品载体上并用包含至少一种质量标签化SBP的标签溶液使样品标签化的另外的步骤。在一些实施方式中，所述方法还包括清洗样品和使样品干燥。样品可以是生物样品，其可以包括至少一个特异性结合对中的另一半，其中所述特异性结合对的一半与染色溶液中的特异性结合对的一半互补。
在成像质谱细胞术和成像质谱中使用的生物样品可以包括来自样品处理中的先前阶段的材料。例如，为了产生组织切片，通常将组织固定在石蜡中。在可以用质量标签化SBP使样品标签化并成像前，需要除去所述材料。例如，可以用石蜡层覆盖生物样品，并通过使用适合的溶剂(例如，二甲苯)除去所述石蜡层。在来自样品处理中的先前阶段的材料的除去中使用的溶剂还可以溶解参考颗粒，其可以导致参考原子在样品上的浸出，这污染了样品并影响所产生的图像，另外存在于参考颗粒中的参考原子的量可能降低，从而影响校准物的绝对归一化和校准的准确度。因此，在一些实施方式中，将样品负载到样品载体上并用适合的溶剂除去来自样品处理中的先前阶段的材料，然后将样品载体与至少一种参考颗粒的悬浮液接触并将参考颗粒融合至样品载体。
在本发明的一些实施方式中，参考颗粒包含多于一种组分，例如，参考颗粒可以是包含被聚合物壳体围绕的金属核的核-壳颗粒。本领域技术人员将理解这些参考颗粒将需要被加热到高于聚合物壳体的Tg(即不是金属核的熔融温度)，因为这是融合至样品载体的材料。另外，出于上述原因，这种聚合物壳体的Tg比金属的熔融温度更适合用于本发明的方法。
用于制备成像质谱校准物的试剂盒
本发明还提供了在实施如本文所公开的方法中使用的一系列试剂盒。例如，试剂盒可以包括包含至少一组参考颗粒的悬浮液，所述参考颗粒包含至少一种参考原子。试剂盒可以包括包含至少一组参考颗粒的悬浮液，其中至少一组参考颗粒包含多于一种不同的参考原子，例如，至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8或至少10种不同的参考原子(即不同的参考原子是具有不同原子量的原子)。试剂盒还可以包括包含多于一组参考颗粒的悬浮液，其中每组参考颗粒包含不同的参考原子，所述不同的参考原子可以以相同的量存在于一组颗粒内的每个颗粒中。试剂盒还可以包括包含如上所述的多于一组参考颗粒的悬浮液，例如，其中悬浮液包含多于一组参考颗粒并且每组参考颗粒包含不同量的相同参考原子和/或不同的参考原子。试剂盒还可以包括包含至少一组参考颗粒的悬浮液，其中每组参考颗粒包含不同于另外的组的参考颗粒的元素编码(如上所述，元素编码由参考原子及其组合形成)。通过本发明所提供的颗粒悬浮液包括由适合于通过加热融合至样品载体的材料组成。在一些实施方式中，通过本发明所提供的颗粒悬浮液包括由适合于通过溶剂退火融合至样品载体的材料组成。悬浮液包括颗粒浓度足够高，从而它们可以在制备本发明的成像质谱校准物的方法中使用的那些(例如，1×108或更高的颗粒浓度)。在一些实施方式中，本发明的试剂盒包括一组参考颗粒，参考颗粒的悬浮液或参考颗粒的校准系列以及用于将参考颗粒融合至样品载体以制备本发明的成像质谱校准物的说明书。同样地，在一些实施方式中，本发明的试剂盒包括一组参考颗粒、参考颗粒的悬浮液或参考颗粒的校准系列，其用于融合(通过加热或溶剂退火)至样品载体以制备本发明的成像质谱校准物。
在一些实施方式中，试剂盒包括一组参考颗粒(例如，悬浮液)，其包含每种类型的n个参考原子，其中n＝10,000,000-30,000,000。一组参考颗粒可以包含至少(n×2)，至少(n×4)，至少(n×8)，至少(n×16)或至少(n×32)个参考原子。在一些实施方式中，一组参考颗粒包含至少(n×3)，如至少(n×9)，至少(n×27)或至少(n×81)个参考原子。在一些实施方式中，包含两种或更多种类型的参考原子的一组参考颗粒可以包含至少(n/32)，如至少(n/16)，至少(n/8)，至少(n/4)或者至少(n/2)个每种类型的参考原子。在一些实施方式中，包含两种或更多种类型的参考原子的一组参考颗粒可以包含至少(n/81)，如至少(n/27)，至少(n/9)或者至少(n/3)个每种类型的参考原子。在一些实施方式中，在该段中讨论的颗粒具有小于10μm的平均直径。
在一些实施方式中，试剂盒包括一组参考颗粒(例如，悬浮液)，其包含多于一种类型的参考原子，其中颗粒包含每种类型的n个参考原子，其中n＝10,000,000-30,000,000。一组参考颗粒可以包含至少(n×102)个每种类型的参考原子，如至少(n×103)，至少(n×104)，至少(n×105)，至少(n×106)或至少(n×107)个每种类型的参考原子。在一些实施方式中，参考颗粒的组包含至少(n×10-5)，至少(n×10-4)，至少(n×10-3)或者至少(n×10-2)个每种类型的参考原子。在一些实施方式中，本段所讨论的颗粒具有小于10μm的平均直径。
在一些实施方式中，试剂盒包含一组参考颗粒(例如，悬浮液)，其包含n×10-5-n×107个每种类型的参考原子，如n×10-5-n×106个每种类型的参考原子，n×10-5-n×105个每种类型的参考原子，n×10-5-n×104个每种类型的参考原子，n×10-4-n×103个每种类型的参考原子，n×10-3-n×102个每种类型的参考原子或者n×10-2-n×101个每种类型的参考原子；其中n＝10,000,000-30,000,000。
在一些实施方式中，试剂盒可以包括包含参考颗粒的悬浮液，所述参考颗粒包含至少5种不同类型的参考原子，其包括140Ce、151Eu、153Eu、165Ho、175Lu，并且包含15,000,000-20,000,000个140Ce参考原子，例如，17,500,000至22,500,000或19,000,000-21,000,000个140Ce参考原子；6,000,000-16,000,000个151Eu参考原子，例如，8,500,000-13,500,000，10,000,000-12,000,000或者约11,000,000个151Eu参考原子；8,000,000-17,000,000个153Eu参考原子，例如，9,500,000-14,500,000，11,000,000-13,000,000或约12,000,000个153Eu参考原子；2,000,000-12,000,000个165Ho参考原子，例如，4,500,000-9,500,000，6,000,000-8,000,000或约7,000,000个165Ho参考原子；和/或5,000,000-15,000,000个175Lu参考原子，例如，7,500,000-12,500,000个175Lu参考原子，9,000,000-11,000,000或约10,000,000个175Lu参考原子。
在某些实施方式中，试剂盒可以包括包含多于一组参考颗粒的悬浮液，其中每组参考颗粒包含多个不同的参考原子，即不同的参考原子的混合物，其中所述组中的每个颗粒中的每种不同的参考原子的量相同。另外，悬浮液中的不同组的参考颗粒包含不同量的每种不同的参考原子。在所述实施方式中，每组参考颗粒中的每种不同的参考原子的量是已知的，因此有利于构建多个质量通道的校准曲线。
校准系列
试剂盒可以包括包含不同量的参考原子的参考颗粒的组，并因此其可以作为组合提供以提供参考颗粒的“校准系列”。校准系列可以包含至少2组，如至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9或者10组或更多组包含不同量的参考原子的参考颗粒。
在一些实施方式中，本发明的试剂盒包括许多容器，例如，至少2个，如至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9或10个容器，其中每个容器包含不同组的校准系列的参考颗粒。
在一些实施方式中，试剂盒包括包含至少3组参考颗粒的校准系列，其具有n/m，n和n×m个每种类型的参考原子；其中n＝10,000,000-30,000,000，其中m＝3、4、5、6、7、8或9或20。在一些实施方式中，校准系列还包含含有n/m5个每种类型的参考原子，n/m4个每种类型的参考原子，n/m3个每种类型的参考原子，n/m2个每种类型的参考原子，n×m2个每种类型的参考原子，n×m3个每种类型的参考原子，n×m4个每种类型的参考原子，n×m6个每种类型的参考原子和n×m6个每种类型的参考原子的一个或多个组；其中n＝10,000,000-30,000,000，并且其中m等于n/m，n和n×m系列中的m的值。
在一些实施方式中，试剂盒包括包含至少3组参考颗粒的校准系列，其具有n×10-1，n和n×10-2个每种类型的参考原子；其中n＝10,000,000-30,000,000。在一些实施方式中，校准系列还包含含有n×10-5-n×10-4个每种类型的参考原子，n×10-4-n×10-3个每种类型的参考原子，n×10-3-n×10-2个每种类型的参考原子，n×10-2-n×10-1，n×102-n×103个每种类型的参考原子，n×103-n×104个每种类型的参考原子，n×104-n×105个每种类型的参考原子和n×105-n×106个每种类型的参考原子的一个或多个组；其中n＝10,000,000-30,000,000。
在一些实施方式中，试剂盒包括包含至少3组参考颗粒的校准系列，其具有n/2，n和n×2个每种类型的参考原子；其中n＝10,000,000-30,000,000。在一些实施方式中，校准系列还包含含有n/64个每种类型的参考原子，n/32个每种类型的参考原子，n/16个每种类型的参考原子，n/8个每种类型的参考原子，n/4个每种类型的参考原子，n×4个每种类型的参考原子，n×8个每种类型的参考原子，n×16个每种类型的参考原子，n×32个每种类型的参考原子和n×64个每种类型的参考原子的一个或多个组；其中n＝10,000,000-30,000,000。
在一些实施方式中，试剂盒包括包含至少5种不同类型的参考原子的校准系列，例如，140Ce、151Eu、153Eu、165Ho、175Lu，并且包含总计含有1,000,000-3,000,000个参考原子，3,000,000-5,000,000个参考原子，5,000,000-10,000,000个参考原子，10,000,000-20,000,000个参考原子，20,000,000-40,000,000个参考原子，40,000,000-60,000,000个参考原子，60,000,000-80,000,000个参考原子，80,000,000-100,000,000个参考原子，100,000,000-140,000,000个参考原子和/或140,000,000-200,000,000个参考原子的参考颗粒的组。例如，校准系列可以包含含有总计约2,000,000个参考原子，约4,000,000个参考原子，约7,500,000个参考原子，约15,000,000个参考原子，约30,000,000个参考原子，约50,000,000个参考原子，约70,000,000个参考原子，约90,000,000个参考原子，约120,000,000个参考原子和/或约160,000,000个参考原子的参考颗粒的组。
在一些实施方式中，试剂盒包括包含至少5种不同类型的参考原子的校准系列，例如，140Ce、151Eu、153Eu、165Ho、175Lu，并且包含含有250,000-750,000，750,000-1,250,000，1,250,000-3,000,000，3,000,000-5,000,000，5,000,000-9,000,000，9,000,000-14,000,000，14,000,000-18,000,000，18,000,000-22,000,000，22,000,000-34,000,000和/或34,000,000-44,000,000个每种参考原子的参考颗粒的组。例如，校准系列可以包含含有约500,000，约1,000,000，约2,000,000，约4,000,000，约7,000,000，约12,000,000，约16,000,000，约20,000,000，约28,000,000和/或约39,000,000个每种参考原子的参考颗粒的组。
在一些实施方式中，试剂盒包括校准系列，所述校准系列包含具有300,000-1,000,000个140Ce参考原子，1,000,000-1,500,000个140Ce参考原子，1,500,000-3,500,000个140Ce参考原子，3,500,000-7,000,000个140Ce参考原子，7,000,000-11,000,000个140Ce参考原子，11,000,000-19,000,000个140Ce参考原子，19,000,000-23,000,000个140Ce参考原子，23,000,000-30,000,000个140Ce参考原子，30,000,000-44,000,000个140Ce参考原子和/或44,000,000-56,000,000个140Ce参考原子的参考颗粒的组。在一些实施方式中，校准系列包含具有约700,000，约1,300,000，约2,500,000，约5,500,000，约9,000,000，约16,000,000，约21,000,000，约26,000,000，约37,000,000和/或约51,000,000个140Ce参考原子的参考颗粒的组。
在一些实施方式中，试剂盒包括校准系列，所述校准系列包含具有200,000-500,000个151Eu参考原子，500,000-1,000,000个151Eu参考原子，1,000,000-2,000,000个151Eu参考原子，2,000,000-4,000,000个151Eu参考原子，4,000,000-6,000,000个151Eu参考原子，6,000,000-11,000,000个151Eu参考原子，11,000,000-13,000,000个151Eu参考原子，13,000,000-18,000,000个151Eu参考原子，18,000,000-23,000,000个151Eu参考原子和/或23,000,000-37,000,000个151Eu参考原子的参考颗粒的组。在一些实施方式中，校准系列包含具有约400,000，约750,000，约1,500,000，约3,000,000，约5,000,000，约9,000,000，约12,000,000，约15,000,000，约21,000,000和/或约29,000,000个151Eu参考原子的参考颗粒的组。
在一些实施方式中，试剂盒包括校准系列，所述校准系列包含具有200,000-600,000个153Eu参考原子，600,000-1,000,000个153Eu参考原子，1,000,000-2,000,000个153Eu参考原子，2,000,000-4,000,000个153Eu参考原子，4,000,000-7,000,000个153Eu参考原子，7,000,000-11,000,000个153Eu参考原子，11,000,000-14,000,000个153Eu参考原子，14,000,000-18,000,000个153Eu参考原子，18,000,000-26,000,000个153Eu参考原子和/或26,000,000-36,000,000个153Eu参考原子的参考颗粒的组。在一些实施方式中，校准系列包含具有约400,000，约800,000，约1,600,000，约3,000,000，约5,500,000，约10,000,000，约13,000,000，约16,000,000，约22,000,000和/或约31,000,000个153Eu参考原子的参考颗粒的组。
在一些实施方式中，试剂盒包括校准系列，所述校准系列包含具有200-000-300,000个165Ho参考原子，300-000-700,000个165Ho参考原子，700-000-1,300,000个165Ho参考原子，1,300,000-2,800,000个165Ho参考原子，2,800,000-3,500,000个165Ho参考原子，3,500,000-7,500,000个165Ho参考原子，7,500,000-9,000,000个165Ho参考原子，9,000,000-11,000,000个165Ho参考原子，11,000,000-17,000,000个165Ho参考原子和/或17,000,000-23,000,000个165Ho参考原子的参考颗粒的组。在一些实施方式中，校准系列包含具有约250,000，约500,000，约1,000,000，约2,000,000，约3,500,000，约6,000,000，约8,000,000，约10,000,000，约14,000,000和/或约20,000,000个165Ho参考原子的参考颗粒的组。
在一些实施方式中，试剂盒包括校准系列，所述校准系列包含具有200,000-400,000个175Lu参考原子；400,000-1,000,000个175Lu参考原子；1,000,000-1,500,000个175Lu参考原子；1,500,000-3,500,000个175Lu参考原子；3,500,000-5,500,000个175Lu参考原子；5,500,000-9,000,000个175Lu参考原子；9,000,000-11,000,000个175Lu参考原子；11,000,000-15,000,000个175Lu参考原子；15,000,000-21,000,000个175Lu参考原子；和/或21,000,000-31,000,000个175Lu参考原子的参考颗粒的组。在一些实施方式中，校准系列包含具有约300,000，约700,000，约1,300,000，约2,500,000，约4,500,000，约8,000,000，约10,500,000，约13,000,000，约19,000,000和/或约26,000,000个175Lu参考原子的参考颗粒的组。
颗粒直径
在一些实施方式中，本发明的试剂盒包括直径在1μm至50μm之间，例如，1μm至40μm，1μm至30μm，1μm至20μm或者1μm至10μm之间或者1μm至5μm之间的珠的悬浮液(例如，多于一种悬浮液)。
在一些实施方式中，试剂盒包括直径在1μm至50μm之间且总计具有n×10-5-n×105个参考原子，如直径在1μm至40μm之间且总计具有n×10-4-n×104个参考原子，直径在1μm至30μm之间且总计具有n×10-3-n×103个参考原子，直径在1μm至20μm之间且总计具有n×10-2-n×102个参考原子，直径在1μm至10μm之间且总计具有n×10-1-n×101个参考原子或者直径在1μm至5μm之间且总计具有n×10-1-n×101个参考原子的参考颗粒；其中n＝10,000,000-30,000,000。
在一些实施方式中，试剂盒包括参考颗粒，所述参考颗粒包含至少5种不同类型的参考原子例如，140Ce、151Eu、153Eu、165Ho、175Lu，并且具有1μm至50μm的直径且总计1,000-300,000,000个参考原子，例如，1μm至40μm的直径且总计2,000-200,000,000个参考原子，1μm至30μm的直径且总计100,000-125,000,000个参考原子，1μm至20μm的直径且总计1,000,000-100,000,000个参考原子，1μm至10μm的直径且总计30,000,000-90,000,000个参考原子或者1μm至5μm的直径且总计50,000,000-70,000,000个参考原子。在一些实施方式中，颗粒的直径为约3μm并且包含总计约60,000,000个参考原子。
在一些实施方式中，试剂盒包括包含参考颗粒的悬浮液，所述参考颗粒包含至少5种不同类型的参考原子，例如，140Ce、151Eu、153Eu、165Ho、175Lu，并且包括直径为1μm至50μm且具有1,000-100,000,000个每种类型的参考原子，例如，直径为1μm至40μm且具有5,000-50,000,000个每种类型的参考原子，直径为1μm至30μm且具有100,000-30,000,000个每种类型的参考原子，直径为1μm至20μm且具有200,000-20,000,000个每种类型的参考原子，直径为1μm至10μm且具有1,000,000-20,000,000个每种类型的参考原子或者直径为1μm至5μm且具有10,000,000-20,000,000个每种类型的参考原子的参考颗粒。在一些实施方式中，包含悬浮液的试剂盒包括直径为约3μm且包含约15,000,000个每种类型的参考原子的参考颗粒。
悬浮液浓度
在一些实施方式中，本发明的试剂盒包含浓度在1×106至1×1015个颗粒每ml之间，例如，1×107至1×1013个颗粒每ml，1×108至1×1013个颗粒每ml，1×109至1×1012个颗粒每ml，1×109到1×1011个颗粒每ml或者约1×1010个颗粒每ml的参考颗粒的悬浮液(例如，多于一种悬浮液)。在一些实施方式中，本发明的试剂盒包含1-50％固体含量，例如，10-40％，10-30％，15-25％，15-20％或者约18％固体含量的珠的悬浮液。珠的浓缩悬浮液(例如，大于1×109个颗粒每ml或10％的固体含量)通常需要用户稀释以获得当将悬浮液移液至样品载体上时，颗粒在样品载体上实现均匀分布的颗粒浓度。将认识到这些浓缩悬浮液是方便的，因为可以将试剂盒提供给用户而无需运输较大的溶剂体积。
在一些实施方式中，本发明的试剂盒包含处于用于在本发明的方法中使用的浓度，例如，1×106至1×1015个颗粒每ml，例如，1×107至1×1013个颗粒每ml，1×107至1×1012个颗粒每ml，1×107至1×1010个颗粒每ml，1×107到1×109个颗粒每ml或约1×108个颗粒每ml的参考颗粒的悬浮液(例如，多于一种悬浮液)。
在一些实施方式中，本发明的试剂盒包含参考颗粒的悬浮液(例如，多于一种悬浮液)，所述参考颗粒具有1μm至50μm之间的直径，其中颗粒浓度为1×106至1×1015个颗粒每ml，具有1μm至40μm之间的直径，其中颗粒浓度为1×107至1×1013个颗粒每ml，具有1μm至30μm之间的直径，其中颗粒浓度为1×108至1×1013个颗粒每ml，具有1μm至20μm之间的直径，其中颗粒浓度为1×109至1×1012个颗粒每ml，具有1μm至10μm之间的直径，其中颗粒浓度为1×109至1×1011个颗粒每ml，具有1μm至5μm之间的直径，其中颗粒浓度为1×109至1×1010个颗粒每ml，或者具有约3μm的直径，其中颗粒浓度为1×1010个颗粒每ml。
在一些实施方式中，本发明的试剂盒包含参考颗粒的悬浮液(例如，多于一种悬浮液)，所述参考颗粒处于1×106至1×1015个颗粒每ml之间的浓度并且具有n×10-5-n×107个每种类型的参考原子，例如，1×107至1×1013个颗粒每ml的浓度并且具有n×10-5-n×106个每种类型的参考原子，1×108至1×1013个颗粒每ml的浓度并且具有n×10-5-n×105个每种类型的参考原子，1×109至1×1012个颗粒每ml的浓度并且具有n×10-4-n×104个每种类型的参考原子，1×109至1×1010个颗粒每ml的浓度并且具有n×10-3-n×103个每种类型的参考原子，1×109至1×1010个颗粒每ml的浓度并且具有n×10-2-n×102个每种类型的参考原子，1×109至1×1010个颗粒每ml的浓度并且具有n×10-1-n×101个每种类型的参考原子；其中n＝10,000,000-30,000,000。
在一些实施方式中，本发明的试剂盒包含参考颗粒的悬浮液，所述参考颗粒包含浓度在1×106至1×1015个颗粒每ml之间的至少5种不同类型的参考原子，例如，140Ce、151Eu、153Eu、165Ho、175Lu，其中所述珠包含1,000-100,000,000个每种类型的参考原子，例如，浓度在1×107至1×1013个颗粒每ml之间并且具有5,000-50,000,000个每种类型的参考原子，浓度在1×108至1×1013个颗粒每ml之间并且具有100,000-30,000,000个每种类型的参考原子，浓度在1×109至1×1012个颗粒每ml之间并且具有200,000-25,000,000个每种类型的参考原子，浓度在1×109至1×1011个颗粒每ml之间并且具有1,000,000-25,000,000个每种类型的参考原子或者浓度在1×109至1×1010个颗粒每ml之间并且具有10,000,000-25,000,000个每种类型的参考原子。
在一些实施方式中，本发明的试剂盒包含移液工具，其配置以将多个悬浮液/溶液移液至样品载体的离散区域。例如，在一些实施方式中，试剂盒包含移液器，其配置以将至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8或至少10种悬浮液移液至样品载体的离散区域上。可以配置移液器以将约1μm，约2μm，约3μm，约4μm，约5μm，约8μm，约10μm，约15μm或约20μm的悬浮液移液至载玻片上。可以配置移液工具以将多个悬浮液移液到邻近的样品载体区中的样品载体上。可以配置移液工具以将悬浮液/溶液移液至离散的1mm×1mm，2mm×2mm，4mm×4mm，6mm×6mm，8mm×8mm，10mm×10mm或10mm×20mm的样品载体区。
作为另外一种选择，替代移液，可以通过针式复制器转移颗粒，以将颗粒在样品载体上以规则排列的图案绘制。因此，在一些情况下，试剂盒可以包括复制器。
在一些实施方式中，本发明的试剂盒包含含有参考原子的参考颗粒和含有标记原子的质量标签化试剂，其中参考原子与标记原子相同。在一些实施方式中，试剂盒包含分别含有至少2，例如，至少3，至少4，至少5，至少10，至少20或至少50个不同的参考原子，以及至少2，例如，至少3，至少4，至少5，至少10，至少20或至少50个包含标记原子的质量标签化试剂的参考颗粒，其中每个参考原子是质量标签化试剂中的标记原子。
采样，归一化和校准
本发明提供了用于监测质谱成像设备(成像质谱细胞计数仪/成像质谱仪)性能的方法，所述方法包括提供包含具有至少一种与之融合的参考颗粒的样品载体的成像质谱校准物，其中至少一种融合参考颗粒包含至少一种参考原子，确定每个融合参考颗粒的平均积分信号强度和监测每个融合参考颗粒的平均积分信号强度的步骤。换言之，通过在样品成像期间或样品之间成像的特定点检测存在于融合至样品载体表面的参考颗粒中的元素离子，本发明的方法有利于样品成像时所检测的信号强度的归一化并因此可以观察并解释样品成像期间所发生的仪器灵敏度的漂移。通常，多个融合参考颗粒位于样品载体上，以有利于随时间监测每个融合参考颗粒的平均积分信号强度。如以下详细描述的，当不同的样品位于已融合了相同参考颗粒的样品载体上时，可以监测多个样品之间并且甚至可以监测不同设备之间的性能。
可以使用在成像质谱细胞术中常用的程序，通过从样品载体烧蚀材料来实现采样。
一般地说，将成像质谱校准物上的样品置于样品室中，样品室是其中当进行分析时放置样品的质谱成像设备的组件。样品室包括台，其保持质量成像校准物，并因此在操作时保持样品。采样和电离系统起作用以从样品室中的样品除去材料，作为导致材料从样品除去的过程的一部分或者通过采样系统下游的单独的电离系统，将其转化为离子。以下更详细地讨论了不同类型的设备。
然后，通过作为检测器系统的第二系统分析电离材料。基于要确定的电离样品材料的特定特征，检测器系统可以采取不同的形式，例如，基于质谱的设备中的质量检测器。
因此，在操作中，将样品采集到设备中，使用激光系统采样以产生电离材料(采样可以产生蒸汽/特定材料，随后通过电离系统使其电离)，并使样品材料离子通过检测器系统。尽管检测器系统可以检测多种离子，但是这些中的大部分将是天然组成样品的原子的离子。通过用在正常情况下分析的材料中不存在或至少不大量存在的原子(例如，某些过渡金属原子，如稀土金属；有关进一步详细描述，参见以下标记部分)标记样品，可以确定样品的特定特征。
融合参考颗粒的采样
通过采样至少一种完整融合参考颗粒并确定与所述参考颗粒有关的积分信号强度，在本发明的方法中确定每个融合参考颗粒的平均积分信号强度。积分信号强度是完整颗粒的信号强度。因此，这可以通过在一个事件(例如，当激光焦点尺寸>融合颗粒直径时)或者在多个事件(例如，当激光焦点尺寸小于所述直径并且需要多次激光发射来烧蚀所有参考颗粒)中从样品载体采样完整颗粒，然后将由单次照射所产生的信号加和以产生完整颗粒的积分信号来实现。
因此，采样可以包括通过激光烧蚀将离散的参考颗粒烧蚀。在某些实施方式中，可以在电感耦合等离子体中实施参考颗粒的电离和雾化。在其它实施方式中，参考颗粒的电离和雾化可以包括激光解吸电离以形成样品离子(如本领域技术人员将理解的，这所需要的设备可以基于如本文所述的采样和电离系统。
可以通过采样至少1，至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少10或至少20个参考颗粒；并计算其平均积分强度来确定每个融合参考颗粒的平均积分信号强度。例如，在一些实施方式中，在产生每个融合参考颗粒的平均积分信号强度中采样了3个参考颗粒。在一些实施方式中，在产生每个融合参考颗粒的平均积分信号强度中采样了5个参考颗粒。
因此，在本发明的一些实施方式中，实施了各个参考颗粒的识别，从而可以烧蚀各个参考颗粒。作为另外一种选择，对于本领域技术人员显而易见的是如果参考颗粒在样品载体上团聚，则假如可以识别参考颗粒的总数，则可以实施所有团聚的参考颗粒的烧蚀和采样以获得团聚体中存在的所有参考颗粒的积分信号强度，从而仍可以计算每个融合参考颗粒的平均积分信号强度。
本领域技术人员将理解参考颗粒将具有某一尺寸，从而允许足够量的参考原子的掺入以确保足够的信号检测，然而所述颗粒不应具有在融合至样品载体后，所述颗粒扩散至从样品载体烧蚀整个颗粒所需的时间变得不现实的程度的这种尺寸。例如，对于使用光斑尺寸(spot size，焦点直径)为1μm的激光器烧蚀2μm直径的参考颗粒，将需要4次激光发射以烧蚀完整颗粒，并因此确定积分信号强度。随着融合颗粒直径的增大，将需要更多次使用光斑尺寸1μm的激光器的发射，这增加了时间成本。因此，本领域技术人员将理解1μm至50μm之间，包括1μm至40μm，1μm至30μm，1μm至20μm或者1μm至10μm的范围内的融合参考颗粒适合于在本发明中使用。
在某些实施方式中，使用照相机来识别用于采样的参考颗粒。因此，如果可以以高置信度，如参考颗粒分离的90％、80％或70％的置信度识别各个参考颗粒(例如，通过光学显微术或元素成像)，则参考颗粒可以是单个可分辨的。因此，可以检测来自各个参考颗粒的元素离子，而不会同时检测来自另一个参考颗粒的元素离子。因此，在一些实施方式中，所述方法包括在采样单个颗粒以确定积分信号强度之前，使用照相机来识别融合至样品载体的各个颗粒的步骤。
如第42页所讨论的，可以通过以足够低的密度在样品载体上分布所述参考颗粒，从而可以单个烧蚀和采样参考颗粒，从而很少同时采样和检测来自多个参考颗粒的元素离子来单个检测参考颗粒。如本文所述，沉积参考颗粒的方法还可以减少参考颗粒的团聚。在某些实施方式中，与另一个参考颗粒同时检测了小于50％，小于40％，小于30％，小于20％，小于10％或小于5％的从参考颗粒所检测的元素离子。
在某些实施方式中，参考颗粒可以分别含有可以基于它们的元素组成用于区分参考颗粒的编码原子。与在相同位置所检测的2个或更多个编码有关的元素离子将表示存在2种或更多种不同的参考颗粒。在该位置的采样中检测的元素离子将因此不用于归一化。参考颗粒中的编码原子可以表示参考颗粒的其它性质，如参考颗粒中特定元素或同位素的数目，如上所述。
在其中参考颗粒小于采样焦点尺寸(例如，激光烧蚀光斑尺寸或原射线束光斑尺寸)的实施方式中，在紧邻空间(如相邻像素)中所检测的参考颗粒的元素离子可以不在归一化中使用，因为它们可能来源于两种或更多种参考颗粒。
归一化信号强度
质谱成像设备(成像质谱细胞计数仪和成像质谱仪)经受仪器漂移，从而包括离子光学器件漂移、表面电荷、检测器漂移(例如，老化)、影响扩散的温度和气流漂移以及电子行为(例如，等离子体功率、离子光学电压等)在内的因素可以在单个样品成像期间以及在不同样品成像之间引起仪器灵敏度漂移。因此，归一化信号强度是所期望的，因为它使得能够获得一致的图像，另外允许不同样品图像进行比较。记录样品成像之前、期间和/或之后从采样参考颗粒检测的信号强度，使用成像质谱校准物和本发明的方法确保仪器灵敏度的任何漂移不会影响所产生的图像。因此，当本发明的成像质谱校准物还包含样品时，本发明的方法还可以包括使用本发明的校准物归一化样品成像期间所检测的信号。另外，所述方法还可以包括使用本发明的校准物归一化不同样品之间所检测的信号。
本发明的成像质谱校准物和方法可以用于归一化质谱成像(例如，成像质谱细胞术)期间所检测的信号强度。因此，可以确定一组参考颗粒的初始平均积分信号强度(即样品成像前)。随后，可以在经过一段时间以后再次采样相同组的参考颗粒中的不同参考颗粒并在此时确定每个参考颗粒的平均积分信号强度(即在样品成像期间和之后)。根据本发明，可以计算t＝0(t＝时间)时每个参考颗粒的平均积分强度。随后，可以如技术人员基于所进行的成像易于确定的，对用户定义的时间段，例如，样品成像所需的总时间，计算t＝nx(x＝采样间隔；n＝整数)时每个融合参考颗粒的平均积分信号强度。
可以比较不同时间点，例如，样品成像前和样品成像期间的多个时间点的每个参考颗粒的平均积分信号强度。例如，在本发明的归一化方法中，至少每10分钟(即x＝10)，至少每20分钟(即x＝20)，至少每30分钟(即x＝30)，至少每40分钟(即x＝40)，至少每50分钟(即x＝50)，至少每60分钟(即x＝60)，至少每90分钟(即x＝90)，至少每120分钟(即x＝120)或者至少每300分钟(即x＝300)采样至少一种参考颗粒。可以采样的参考颗粒次数(即上述方程中的n)可以基于样品成像所需的时间而不同。例如，可以在至少5小时，至少10小时，至少15小时，至少20小时，至少24小时，至少48小时，至少72小时或者至少96小时的时间段内采样参考颗粒。
然后，在本发明的归一化方法中进行在t＝0和t＝nx系列中的每一个时的每个参考颗粒的平均积分信号强度的比较。如果检测到平均积分信号强度变化，则因此可以调整与样品上的质量标签有关的信号强度。
根据本发明，可以通过使用以下方程实现在t＝nx时的成像期间所检测的信号强度的归一化：
Figure BDA0003056852520000461
本发明的融合参考颗粒的方法还使得能够进行通过其具有已知元素组成和量的标准品可以融合至多个样品上的方法。因此，还可以在多个样品之间应用本发明的归一化方法。
可以绝对比较和归一化平均积分信号强度。
积分平均信号强度的变化可以表示为绝对初始平均积分信号强度的百分比。本领域技术人员将认识到这种绝对技术将有利于对不同样品(包括在不同天成像的样品)所检测的信号强度的比较以及因此的归一化。
因此，本发明提供了对样品成像期间在成像质谱细胞计数仪中所检测的信号强度归一化的方法。在一些实施方式中，所述方法因此包括制备包含含有样品和至少两个融合参考颗粒的样品载体的成像质谱校准物，采样至少一种融合参考颗粒，对至少一种融合参考颗粒确定每个融合颗粒的平均积分信号强度，对样品部分成像，采样至少一种融合参考颗粒和对样品其它部分成像。可以继续采样至少一种融合参考颗粒和对样品其它部分成像的步骤直至对整个样品成像。例如，可以在样品成像期间对参考颗粒采样至少两次，如至少三次，至少四次，至少五次，至少10次或超过10次。使用上述方程对样品成像期间所检测的信号强度归一化。
另外，本发明提供了当成像不同样品，包括不同天成像的那些时，对成像质谱细胞计数仪中所检测的信号强度归一化的方法。因此，本发明提供了使用质谱成像设备(例如，成像质谱细胞计数仪)对多个样品成像的方法，其包括以下步骤：(i)提供包含含有第一样品和至少一种融合参考颗粒的样品载体的第一成像质谱校准物，(ii)采样第一成像质谱校准物上的至少一种融合参考颗粒，(iii)对于至少一种融合参考颗粒确定每个融合颗粒的平均积分信号强度，(iv)对第一样品成像，(v)提供包含第二样品和与第一校准物相同的至少一种融合参考颗粒的第二成像质谱校准物，(vi)采样第二成像质谱校准物上的至少一种融合参考颗粒，(vii)对于至少一种融合颗粒确定每个融合颗粒的平均积分信号强度，(viii)对第二样品成像，(ix)将对于第一和第二校准物上的融合颗粒所检测的每个融合颗粒的平均积分信号强度的绝对强度进行比较和(x)使用以上所列的方程对第二样品成像期间所检测的信号强度归一化。可以继续至少一种融合参考颗粒的采样以及每个样品的另一部分的成像步骤，直至对完整样品成像(例如，重复步骤(ii)-(iv)和/或步骤(vi)-(viii))。例如，可以在样品成像期间对参考颗粒采样至少两次，如至少三次，至少四次，至少五次，至少10次或超过10次。在一些实施方式中，所述方法还包括对至少第3，例如，至少第4，第5，第6，第7，第8，第9，第10，第20，第30，第40或第50个样品成像，其包括对于其它样品的成像和归一化，重复各个次数的步骤(v)-(x)。
可以对特定质量通道，例如，镧系，如铈、铕、钬和/或镥，或者对于第15页上所讨论的任何参考原子进行检测器的归一化。
在本发明的一些实施方式中，样品成像期间信号强度的归一化包括相对于与从样品采样和电离的质量标签中的至少一种标记原子的原子量最接近的质量通道(即特定质量通道)，归一化对特定质量通道所检测的信号强度。例如，可以对与从样品上的质量标签采样和电离的质量通道相同的质量通道归一化信号强度。在一些实施方式中，相对于样品上存在的质量标签中采样的至少一个标记原子的原子量的10原子单位内，20原子单位内，30原子单位内，40原子单位内，50原子单位内或60原子单位内的质量通道，归一化对特定质量通道所检测的信号强度。
在本发明的一些实施方式中，归一化样品成像期间的信号强度包括对与从样品采样和电离的质量标签中的至少一个标记原子的强度最接近的质量通道进行归一化。例如，可以对具有与从样品上的质量标签中的至少一个标记原子采样和电离的质量通道的基本相同的强度的质量通道归一化信号强度。
校准
因此，在一些实施方式中，本发明的方法包括提供包含至少一种融合参考颗粒的成像质谱校准物，采样至少一种融合参考颗粒，对至少一种颗粒确定每个融合颗粒的平均积分信号强度，和对至少一种参考颗粒中存在且对应于要校准的检测器的质量通道的参考原子的已知量校准平均积分信号强度。
本领域技术人员将理解当对包含融合参考颗粒的样品载体区进行用于将样品放置在样品载体上的相同处理步骤时，需要小心。如上所述，这些处理步骤可以从融合参考颗粒中除去参考原子。然而，如果用于参考颗粒的特定处理步骤污染样品，则这可以导致参考原子从融合参考颗粒浸出到样品上，因此影响所获得的样品图像。例如，当制备样品载体时，如果在相同清洗步骤中，用相同清洗溶液处理包含样品的区域和包含融合参考颗粒的区域两者，则用于清洗参考颗粒的一些溶液可以接触样品，反之亦然，从而导致样品污染。因此，本领域技术人员将理解为了评价样品制备变化是否影响所检测的信号强度，则将要求对样品和融合参考颗粒两者进行相同处理步骤，本领域技术人员还将理解所述处理步骤应理想地单独进行，从而不发生样品污染。
校准曲线的产生
如上所述，由于其极强的选择性和灵敏度，元素分析，包括元素质谱，如质谱细胞术和成像质谱细胞术已成为用于定量大量生物分析物，包括药物、代谢产物、肽和蛋白的有效工具。然而，由于进样、电离过程、离子加速、离子分离和离子检测中的差异，化合物所产生的信号在不同轮次之间改变。
在一些实施方式中，为了能够定量样品中的分析物，将来自样品的测量与已知的标准品进行比较。标准品可以用于形成参考原子的离子计数的校准曲线，并且根据校准曲线可以计算分析物的绝对定量。在一些实施方式中，校准曲线包含至少2点，如至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9或者10个或更多个点。通常，每个点进行至少3个重复。
在本发明的一些实施方式中，样品载体可以包含多于一种融合参考颗粒，例如，样品载体可以包括2、3、4、5、6、7或8组至少一种融合参考颗粒，其中每组至少一种融合参考颗粒包含不同量的相同参考原子。本发明的校准成像质谱细胞计数仪的方法可以因此包含采样每组至少一种融合参考颗粒，对每组确定每个融合参考颗粒的平均积分信号强度和绘制校准曲线的步骤。在本发明的一些实施方式中，样品载体包含多于一个离散区域，例如，其中样品载体包含至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7或至少8个离散区域，并且其中每个离散区域中的融合参考颗粒包含不同量的相同的至少一种参考原子。换言之，产生了将已知水平与离子计数相关联的校准曲线。
可以在样品分析之前，样品分析期间或者样品分析之后确定校准曲线。在一些情况下，可以在样品分析之前和之后，之前和期间，期间和之后或之前，期间和之后进行校准。
在一些实施方式中，用不同的颗粒校准每个不同的质量通道(即每组参考颗粒包含不同的参考原子)。在一些实施方式中，每个参考颗粒包含多于一种参考原子，从而可以同时对多个质量通道产生校准曲线以使程序效率最大化。在一些情况下，实验中的所有质量通道可以得自相同组的掺杂珠。
一旦产生校准，则可以通过将对于参考颗粒分析物所检测的信号强度与对于对应于分析物的参考颗粒质量通道所绘制的校准曲线相比较来定量存在于样品中的分析物的量。如上所述，与采样已知数目的特定参考原子有关的积分信号可以不同于与采样相同数目的不同参考原子(例如，由于参考原子行为，例如，离子化效率的差异)有关的积分信号。因此，可以选择存在于融合参考颗粒中的参考原子的量，从而为对于归一化/校准的每个质量通道所检测的每个参考原子提供基本一致的信号强度。也就是说，如果第一参考原子的相同绝对原子数目在检测器提供了比第二参考原子低的信号，则应在参考颗粒中提供更大的绝对数量。因此，在一些实施方式中，当参考颗粒中存在不同的参考原子时，当对参考颗粒采样时，对每种不同的参考原子检测到相当的信号。
本发明的定量方法的应用
本发明甚至可以从含有大量其它生物分子的样品和混合物中定量一种或多种所关心的分析物。照此，本发明对于从通常含有大量其它物质的生物样品中定量分析物是特别有用的；如从生物样品验证或定量生物标志物。
如本文所使用的“生物标志物”是指如与来自不具有所述基因型或者表型和/或未暴露于所述条件的对照对象的等价样品相比，差异存在于来自具有所关心的基因型或表型和/或已暴露于所关心的条件的对象的样品中的蛋白或多肽。
特别相关的表型可以是患者中的病理学状况，诸如，例如癌症、炎性疾病、自体免疫疾病、代谢疾病、CNS疾病、眼部疾病、心脏病、肺病、肝病、胃肠疾病、神经退行性疾病、遗传疾病、传染性疾病或病毒感染；相对于其在健康对照中不存在。可以在来自例如应激与非应激状况/对象，药物治疗与非药物治疗的状况/对象，良性与恶性疾病，粘附与非粘附状况，感染与非感染状况/对象，转化与未转化的细胞或组织，不同发育阶段，一种或多种基因的过表达与正常表达状况，一种或多种基因的沉默或敲除与正常表达状况的样品之间设想其它比较。
例如，如果一个样品或一个样品组中的蛋白的量是另一个样品或另一个样品组中它的量的至少约1.2倍，至少约1.3倍，至少约1.5倍，至少约1.8倍，至少约2倍，至少约3倍，至少约5倍，至少约7倍，至少约9倍或者至少约10倍；或者如果蛋白在一个样品或一个样品组中是可检测的，而在另一个样品或另一个样品组不是可检测的，则可以将蛋白表示为在两个样品或两个样品组之间差异存在。
因此，本发明提供了诊断受试者中的病况或疾病的方法，其包括以下步骤：
a.在本发明的成像质谱校准物上提供得自受试者的样品，其中样品已用对疾病的一个或多个生物标志物特异的一个或多个质量标签化SBP标记；
b.对样品实施质谱细胞术以确定一个或多个质量标签中的一个或多个标记原子的水平；
c.将一个或多个标记原子的水平与从健康对照确定的水平相比较，
其中受试者和对照之间的一个或多个标记原子水平的差异表示受试者患有疾病或病况。在一些实施方式中，所述方法还包括对成像质谱校准物上的融合颗粒采样以归一化和/或校准一个或多个标记原子的水平。在一些情况下，通过相对于健康对照的生物标志物水平的升高来指示疾病状态。在一些情况下，通过相对于健康对照的生物标志物水平的降低来指示疾病状态。如本领域技术人员将理解的，特定的差异将是不同的(升高或降低)并且将取决于生物标志物和疾病两者。在一些情况下，将基于至少3，如至少5个生物标志物的相对水平做出结论。
因此，本发明提供了预测对于疾病的治疗将在受试者中获得成功的可能性的方法，其包括以下步骤：
a.在本发明的成像质谱校准物上提供得自受试者的样品，其中样品已用对疾病的一个或多个生物标志物特异的一个或多个质量标签化SBP标记；
b.对样品实施质谱细胞术以确定质量标签中的一个或多个标记原子的水平；
c.将一个或多个标记原子的水平与从治疗反应性对照确定的水平相比较，
其中受试者和对照之间的一个或多个标记原子水平的差异表示受试者不太可能对治疗起反应。在一些实施方式中，所述方法还包括对成像质谱校准物上的融合颗粒采样以归一化和/或校准一个或多个标记原子的水平。在一些情况下，样品和对照之间的水平可以是不同的，其中将对照水平设置上限或下限，其用于确定有效治疗的可能性。例如，在一些实施方式中，如果生物标志物的水平与反应性对照的水平相同或更低，则可以认为样品表示治疗将在受试者中有效。在一些实施方式中，如果生物标志物的水平与反应性对照的水平相同或更高，则可以认为样品表示治疗将在受试者中有效。在一些情况下，将基于至少3，如至少5个生物标志物的相对水平做出结论。
本发明还提供了确定疗法在受试者中的疾病或病况的治疗中的效力的方法，其包括以下步骤：
a.在成像质谱校准物上提供得自受试者的样品，其中样品已用对疾病的一个或多个生物标志物特异的质量标签化SBP标记；
b.对样品实施质谱细胞术以确定质量标签中的一个或多个标记原子的水平；
c.将一个或多个标记原子的水平与在疗法的较早时间(如疗法开始前)确定的水平相比较，
其中一个或多个标记原子的水平随时间的差异表示受试者对疗法的反应。在一些实施方式中，所述方法还包括对成像质谱校准物上的融合颗粒采样以归一化和/或校准一个或多个标记原子的水平。在一些情况下，通过生物标志物水平随时间的升高表示对疗法的反应。在一些情况下，通过生物标志物水平随时间的降低来表示疾病状态。如本领域技术人员将理解的，特定的差异将是不同的(升高或降低)并且将取决于治疗和疾病两者。在一些情况下，将基于至少3，如至少5个生物标志物的相对水平做出结论。
质量标签化检测试剂
如本文所使用的质量标签化检测试剂包含许多组分。第一组分是SBP。第二组分是质量标签。质量标签和SBP通过接头连接，通过质量标签和SBP的缀合至少部分形成。SBP和质量标签之间的连接还可以包括间隔臂(spacer)。质量标签和SBP可以通过一系列反应化学缀合在一起。示例性的缀合反应化学包括巯基马来酰亚胺、NHS酯和胺或点击化学反应性(优选地，无铜(I)化学)，如张力炔烃和叠氮化物、张力炔烃和硝酮以及张力烯烃和四嗪。
质量标签
在本发明中使用的质量标签可以采取许多形式。通常，标签包括至少一种标记原子。本文以下讨论了标记原子。
因此，以其最简单的形式，质量标签可以包含金属螯合部分，它是在配体中具有配位的金属标记原子的金属螯合基团。在一些情况下，每个质量标签仅检测单个金属原子可以是足够的。然而，在其它情况下，可以期望每个质量标签包含多于一种标记原子。如以下所讨论的，这可以以多种方式实现。
产生可以含有多于一个标记原子的质量标签的第一方式是包含连接至聚合物的多于一个亚基的金属螯合配体的聚合物的使用。能够结合聚合物中的至少一个金属原子的金属螯合基团的数目可以在约1至10,000之间，如5-100，10-250，250-5,000，500-2,500或500-1,000。至少一个金属原子可以结合至至少一个金属螯合基团。聚合物可以具有约1至10,000之间，如5-100，10-250，250-5,000，500-2,500或500-1,000的聚合度。因此，聚合物类质量标签可以包含约1至10,000，如5-100，10-250，250-5,000，500-2,500或500-1,000个标记原子。
聚合物可以选自由下述组成的组：线性聚合物、共聚物、支化聚合物、接枝共聚物、嵌段聚合物、星形聚合物和超支化聚合物。聚合物的主链可以衍生自取代的聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯或聚甲基丙烯酰胺并且可以是丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的均聚物或共聚物的取代衍生物。可以通过由可逆加成断裂聚合(RAFT)、原子转移自由基聚合(ATRP)、阴离子聚合(包括单电子活性自由基聚合)、硝基氧介导的聚合(NMP)和光引发转移终止剂介导的聚合(PIMP)组成的组合成聚合物。提供聚合物的步骤可以包括聚合物从选自由下列组成的组的化合物的合成：N-烷基丙烯酰胺、N,N-二烷基丙烯酰胺、N-芳基丙烯酰胺、N-烷基甲基丙烯酰胺、N,N-二烷基甲基丙烯酰胺、N-芳基甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯及其功能等价物。
聚合物可以是水溶性的。该部分不受限于化学含量。然而，如果骨架具有相对可重复的尺寸(例如，长度、标签原子个数、可重复的树枝状聚合物性质等)，则它简化了分析。还考虑了对于稳定性、溶解度和无毒性的要求。因此，通过沿主链放置多个官能团加上不同的反应基团(连接基团)的合成策略(其可以用于通过接头和任选地间隔臂将聚合物连接至分子(例如，SBP))，进行了功能性水溶性聚合物的制备和表征。通过控制聚合反应，聚合物的尺寸是可控制的。通常，将选择聚合物的尺寸，从而使得聚合物的回旋辐射尽可能小，如2至11纳米之间。IgG抗体(示例性SBP)的长度为约10纳米，并因此相对于SBP尺寸，过大的聚合物标签可能会对结合至其靶标的SBP产生空间位阻。
能够结合至少一个金属原子的金属螯合基团可以包含至少4个乙酸基团。例如，金属螯合基团可以是二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)基团或1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)基团。替代基团包括乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)。
金属螯合基团可以通过酯或通过酰胺连接至聚合物。适合的金属螯合聚合物的实例包括得自Fluidigm Canada,Inc.的X8和DM3聚合物。
聚合物可以是水溶性的。由于它们的水解稳定性，可以使用N-烷基丙烯酰胺、N-烷基甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯或其功能等价物。约1至1000(1至2000个主链原子)的聚合度(DP)涵盖了大部分所关心的聚合物。具有相同官能性的较大的聚合物在本发明的范围内，并且是可能的，如本领域技术人员将理解的。通常，聚合度将在约1至10,000之间，如5-100，10-250，250-5,000，500-2,500或500-1,000。聚合物可以符合通过导致相对窄的聚合物分散性的路线的合成。可以通过原子转移自由基聚合(ATRP)或可逆加成断裂(RAFT)聚合合成聚合物，其应导致在1.1至1.2的范围内的Mw(重均分子量)/Mn(数均分子量)值。替代策略包括活性阴离子聚合，其中具有约1.02至1.05的Mw/Mn的聚合物是可获得的。两种方法允许通过引发剂或终止剂的选择来控制末端基团。这使得能够合成可以将接头连接至其的聚合物。可以采用制备在重复单元中含有官能性侧基的聚合物的策略，其中所连接的过渡金属单元(例如Ln单元)可以在之后的步骤中连接至所述重复单元。这种实施方式具有几种优势。它避免了由于实施含有配体的单体的聚合反应所产生的复杂性。
为了使侧基之间的电荷斥力最小，(M3+)的靶标配体应赋予螯合物-1的净电荷。
在本发明中使用的聚合物包括：
-无规共聚物聚(DMA-共-NAS)：在Relógio等人,(2004)(Polymer,45,8639-49)中报道了通过RAFT的N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)与N,N-二甲基丙烯酰胺(DMA)的75/25摩尔比的无规共聚物的合成，其具有高转化，在5000至130,000的范围内的优良摩尔质量控制并且具有Mw/Mn≈1.1。活性NHS酯与具有反应性氨基的金属螯合基团反应以获得通过RAFT聚合反应合成的金属螯合共聚物。
-聚(NMAS)：可以通过ATRP聚合NMAS，从而获得平均摩尔质量在12至40KDa的范围内，Mw/Mn为约1.1的聚合物(参见，例如，Godwin等人,2001；Angew.Chem.Int.Ed,40:594-97)。
-聚(MAA)：可以通过其叔丁基或三甲基甲硅烷基(TMS)酯的阴离子聚合制备聚甲基丙烯酸(PMAA)。
-聚(DMAEMA)：可以通过ATRP制备聚(甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)(PDMAEMA)(参见Wang等人,2004,J.Am.Chem.Soc,126,7784-85)。这是熟知的聚合物，其方便地制备具有在2至35KDa的范围内的平均Mn值和约1.2的Mw/Mn。还可以通过阴离子聚合合成具有窄粒径分布的这种聚合物。
-聚丙烯酰胺或者聚甲基丙烯酰胺。
可以通过本领域技术人员已知的方法将金属螯合基团连接至聚合物，例如，可以通过酯或通过酰胺连接侧基。例如，对于基于甲基丙烯酸酯的聚合物，可以首先通过聚合物与乙二胺在甲醇中的反应，然后通过DTPA酸酐在碱性条件下在碳酸盐缓冲液中的后续反应，将金属螯合基团连接至聚合物骨架。
第二种方式是产生可以起质量标签作用的纳米颗粒。产生这些质量标签的第一种途径是已在聚合物中涂覆的金属纳米颗粒的使用。在本文中，金属通过聚合物与环境隔离并被屏蔽，并且当例如通过引入聚合物壳体的官能团可以使聚合物壳体反应时，所述金属不反应。官能团可以与接头组分(任选地引入间隔臂)反应以连接点击化学试剂，从而允许这类质量标签以简单、模块化方式插入以上所讨论的合成策略。
接枝至和接枝出是产生围绕纳米颗粒的聚合物刷的两种原理机制。在接枝至中，单独合成聚合物，并因此合成不受需要保持纳米颗粒胶体稳定的限制。在本文中，由于单体的多种多样和易于官能化，可逆加成-断裂链转移(RAFT)合成是优越的。可以容易地将链转移剂(CTA)用作官能团本身，可以使用官能化的CTA或者聚合物链可以是后官能化的。使用化学反应或物理吸附将聚合物连接至纳米颗粒。接枝至的一个缺点在于接枝密度通常较低，这是由于在向颗粒表面连接期间，螺旋状聚合物链的位阻排斥所造成的。所有接枝至的方法具有以下缺点：需要严格检查以从官能化的纳米复合颗粒上除去过量的游离配体。这通常通过选择性沉淀和离心来实现。在接枝出的方法中，将分子，如用于原子转移自由基聚合(ATRP)的引发剂或者用于(RAFT)聚合反应的CTA固定在颗粒表面上。这种方法的缺点在于新的引发剂偶联反应的发展。此外，与接枝至相反，颗粒必须在聚合反应条件下是胶体稳定的。
产生质量标签的其它方式是通过掺杂珠的使用。可以在微乳化聚合反应中使用螯合镧系(或其它金属)离子以产生具有嵌入聚合物中的螯合镧系离子的聚合物颗粒。如本领域技术人员已知的，以金属螯合物将在水中具有可忽略的溶解度，但在用于微乳化聚合反应的单体中具有合理的溶解度的方式选择螯合基团。可以使用的典型单体是苯乙烯、甲基苯乙烯、多种丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯等，如本领域技术人员已知的。对于机械稳健性，金属标签化颗粒具有高于室温的玻璃化转变温度(Tg)。在一些情况下，使用核-壳颗粒，其中将通过微乳化聚合反应制备的含金属的颗粒用作种子乳液聚合法的种子颗粒以控制表面官能团的性质。可以通过用于该第二阶段聚合反应的适当单体的选择来引入表面官能团。另外，相比于聚苯乙烯颗粒，丙烯酸酯(和可能的甲基丙烯酸酯)聚合物是有利的，因为酯基可以结合至或稳定镧系络合物上不饱和的配体位点。用于制备这些掺杂珠的示例性方法是：(a)将含有至少一种标记原子的络合物并入溶剂混合物中，所述溶剂混合物包含其中含有至少一种标记原子的络合物是可溶性的至少一种有机单体(如，在一个实施方式中，苯乙烯和/或甲基丙烯酸甲酯)以及其中所述有机单体和所述含有至少一种标记原子的络合物不太可溶的至少一种不同的溶剂，(b)将步骤(a)的混合物乳化足以提供均一乳液的一段时间；(c)起始聚合反应并继续反应直至大部分单体转化为聚合物；和(d)将步骤(c)的产物温育足以获得聚合物颗粒与引入其中的颗粒中或上的含有至少一种标记原子的络合物的乳胶悬浮液的一段时间，其中选择所述含有至少一种标记原子的络合物，从而一旦探询聚合物质量标签，则从所述至少一种标记原子获得明显的质量信号。通过使用包括不同标记原子的两种或更多种络合物，可以制备包含两种或更多种不同标记原子的掺杂珠。此外，控制包含不同标记原子的络合物的比使得能够产生具有不同标记原子比的掺杂珠。通过使用多个标记原子和以不同的比使用，提高了明显可辨认的质量标签的数目。在核-壳珠中，这可以通过将含有第一标记原子的络合物引入核中，并将含有第二标记原子的络合物引入壳中来实现。
其它方式是产生在聚合物主链中包括而不是作为配位金属配体包括标记原子的聚合物。例如，Carerra和Seferos(Macromolecules 2015,48,297-308)公开了在聚合物主链中包括碲。其它聚合物引入了能够用作标记原子的原子，锡-、锑-和铋-引入聚合物。尤其，在Priegert等人,2016(Chem.Soc.Rev.,45,922-953)中讨论了这些分子。
因此，质量标签可以包含至少两种组分：标记原子和聚合物，其螯合，含有或掺杂了标记原子。另外，质量标签包含连接基团(当未缀合至SBP时)，其在根据以上讨论的点击化学反应中，在双组分反应后，在质量标签和SBP之间形成了化学键的一部分。
标记原子
可以根据本公开使用的标记原子包括通过MS或OES可检测并且在未标记的组织样品中基本不存在的任何物质。因此，例如，12C原子将不适合作为标记原子，因为它们是天然大量存在的，而在理论上11C可以用于MS，因为它是非天然存在的人造同位素。通常，标记原子是金属。然而，在优选的实施方式中，标记原子是过渡金属，如稀土金属(15个镧系加钪和钇)。这些17个元素(可以通过OES和MS区分)提供了可以容易地(通过MS)区分的多种不同的同位素。多种这些元素以富集的同位素的形式可用，例如，钐具有6种稳定同位素，钕具有7种稳定同位素，其全部以富集形式可用。15个镧系元素提供了具有非冗余的唯一质量的至少37种同位素。适合用作标记原子的元素的实例包括镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钪(Sc)和钇(Y)。除稀土金属之外，其它金属原子适合于检测，例如，金(Au)、铂(Pt)、铱(Ir)、铑(Rh)、铋(Bi)等。放射性同位素的使用不是优选的，因为它们不太便于处理并且是不稳定的，例如，Pm不是镧系中的优选标记原子。
为了有利于飞行时间(TOF)分析(如本文所讨论的)，使用原子量在80-250的范围内，例如，80-210的范围内或者100-200的范围内的标记原子将是有帮助的。该范围包括所有的镧系，但是不包括Sc和Y。100-200的范围允许通过使用不同的标记原子，同时利用TOFMS的高光谱扫描速率的优势来进行理论101-复(plex)分析。如上所述，通过选择其质量位于高于未标记样品中所观察到的那些的窗口中的标记原子(例如，在100-200的范围内)，TOF检测可以用于提供生物学显著水平的快速成像。
基于所使用的质量标签(并因此，每个质量标签的标记原子数)和连接至每个SBP的质量标签数)，可以将不同数目的标记原子连接至单一SBP成员。当将更多的标记原子连接至任何SBP成员时，可以实现更大的灵敏度。例如，可以将大于10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个标记原子连接至SBP成员，如多达10,000，例如，如5-100、10-250、250-5,000、500-2,500或者500-1,000个标记原子。如上所述，可以使用具有窄分子量分布，含有多个单体单元的聚合物，其分别含有螯合剂，如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或DOTA。例如，DTPA结合3+镧系离子，其解离常数为约10-6M。这些聚合物可以以巯基为末端，所述巯基可以用于根据以上所讨论的那些，通过它与马来酰亚胺的反应以连接点击化学反应性来连接至SBP。其它官能团也可以用于缀合这些聚合物，例如，胺-反应基团，如N-羟基琥珀酰亚胺酯，或者对羧基或对抗体糖基化具有反应性的基团。任何数目的聚合物可以结合至每个SBP。可以使用的聚合物的具体实例包括直链(“X8”)聚合物或第三代树枝状(“DN3”)聚合物，两者均作为MaxParTM试剂可得。金属纳米颗粒的使用还可以用于提高标签中的原子数目，还如以上所讨论的。
在一些实施方式中，质量标签中的所有标记原子具有相同的原子量。作为另外一种选择，质量标签可以包含具有不同原子量的标记原子。因此，在一些情况下，可以用一系列质量标签化SBP标记所标记的样品，每个质量标签化SBP仅包含单一类型的标记原子(其中每个SBP结合其同源靶标并因此每种质量标签在样品上局限于特定例如抗原)。作为另外一种选择，在一些情况下，可以用一系列质量标签化SBP标记所标记的样品，每个质量标签化SBP包含标记原子的混合物。在一些情况下，用于标记样品的质量标签化SBP可以包含具有单个标记原子质量标签的那些的混合物和它们的质量标签中的标记原子的混合物。
间隔臂
如上所述，在一些情况下，SBP通过包含间隔臂的接头缀合至质量标签。在SBP和点击化学试剂之间(例如，在SBP和张力环炔(或叠氮化物)之间；张力环烯(或四嗪)；等之间)可以存在间隔臂。在质量标签和点击化学试剂之间(例如，在质量标签和叠氮化物(或张力环炔)；四嗪(或张力环烯)；等之间)可以存在间隔臂。在一些情况下，在SNP和点击化学试剂以及在点击化学试剂和质量标签之间可以存在间隔臂。
间隔臂可以是聚乙二醇(PEG)间隔臂、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)间隔臂、聚甘油(PG)间隔臂、聚(N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺)间隔臂或聚噁唑啉(POZ，如聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉或聚丙基噁唑啉)或者C5-C20非环状烷基间隔臂。例如，间隔臂可以是具有3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个，6个或更多个，7个或更多个，8个或更多个，9个或更多个，10个或更多个，11个或更多个，12个或更多个，15个或更多个或者20个或更多个EG(乙二醇)单元的PEG间隔臂。PEG接头可以具有3至12个EG单元，4至10或者可以具有4、5、6、7、8、9或10个EG单元。接头可以包括胱胺或其衍生物，可以包括一个或多个二硫基，或者可以是本领域技术人员已知的任何其它适合的接头。
间隔臂可以有益于所缀合的SBP上的质量标签的位阻效应最小。亲水间隔臂，如PEG类间隔臂，还可以起作用以改善质量标签化SBP的溶解度和起作用以防止团聚。
SBP(特异性结合对成员)
质谱细胞术，包括成像质谱细胞术基于特异性结合对成员之间的特异性结合的原理。将质量标签连接至特异性结合对成员，并且这将质量标签局限于作为所述对的另一个成员的靶标/分析物。然而，不要求特异性结合仅结合至一种分子物质，而排斥其它物质。而是，它定义所述结合不是非特异性的，即不是随机相互作用。因此，结合至多个靶标的SBP的实例将是识别一些不同蛋白之间的共同表位的抗体。在本文中，结合将是特异的并通过抗体互补决定区(CDR)介导，但是通过抗体将检测多个不同的蛋白。共同表位可以是天然存在的，或者共同表位可以是人工标签，如FLAG标签。类似地，对于核酸，具有限定序列的核酸可以不仅仅结合至完全互补的序列，而是可以在具有不同严格性的杂交条件的使用下，引入不同的错配耐受性，如本领域技术人员将理解的。然而，这种杂交不是非特异性的，因为它是通过SBP核酸和靶向分析物之间的同源性介导的。类似地，配体可以特异性结合至多个受体，易见的实例是结合至TNFR1和TNFR2两者的TNFα。
SBP可以包含以下任何：核酸双螺旋；抗体/抗原复合物；受体/配体对；或者适配体/靶标对。因此，标记原子可以连接至核酸探针，然后与组织样品接触，从而探针可以杂交至其中的互补核酸例如以形成DNA/DNA双螺旋、DNA/RNA双螺旋或者RNA/RNA双螺旋。类似地，标记原子可以连接至抗体，然后与组织样品接触，从而它可以结合至其抗原。标记原子可以连接至配体，然后与组织样品接触，从而它可以结合至其受体。标记原子可以连接至适配体配体，然后与组织样品接触，从而它可以结合至其靶标。因此，标记的SBP成员可以用于检测样品中的多种靶标，包括DNA序列、RNA序列、蛋白、糖、脂质或代谢产物。
因此，质量标签化SBP可以是蛋白或肽或者多核苷酸或寡核苷酸。
蛋白SBP的实例包括抗体或其抗原结合片段、单克隆抗体、多克隆抗体、双重特异性抗体、多重特异性抗体、抗体融合蛋白、scFv、抗体模拟物、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、中性抗生物素蛋白、生物素或它们的组合，其中任选地抗体模拟物包括纳米抗体、亲和体(affibody)、泛素(affilin)、粘合素、阿非廷(affitin)、阿尔法体、抗运载蛋白、高亲和性多聚体(avimer)、DARPin、飞诺莫(Fynomer)、库尼兹(kunitz)结构域肽、单体或它们的任意组合、受体，如受体-Fc融合、配体，如配体-Fc融合、凝集素(lectin)，例如，凝集素(agglutinin)，如麦胚凝集素。
肽可以是直链肽或者环肽，如双环肽。可以使用的肽的一个实例为鬼笔环肽。
多核苷酸或寡核苷酸一般是指含有通过3'-5'磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的核苷酸的单链或双链聚合物以及多核苷酸类似物。核酸分子包括但不限于DNA、RNA和cDNA。多核苷酸类似物可以具有天然多核苷酸中存在的标准磷酸二酯键以外的主链，和任选地，除核糖或脱氧核糖以外的修饰的糖部分。多核苷酸类似物含有能够通过沃森-克里克碱基配对氢键键合至标准多核苷酸碱基的碱基，其中类似物主链以允许在寡核苷酸类似物分子和标准多核苷酸中的碱基之间以序列特异性方式产生这种氢键键合的方式提供碱基。多核苷酸类似物的实例包括但不限于异核酸(XNA)、桥核酸(BNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、yPNA、吗啉代多核苷酸、锁核酸(LNA)、苏糖核酸(TNA)、2'-0-甲基多核苷酸、2'-0-烷基核糖基取代的多核苷酸、硫代磷酯多核苷酸和硼磷酸酯多核苷酸。多核苷酸类似物可以具有嘌呤或嘧啶类似物，包括例如7-去氮嘌呤类似物、8-卤代嘌呤类似物、5-卤代嘧啶类似物，或者可以与任何碱基配对的通用碱基类似物，包括次黄嘌呤、硝基唑、异喹诺酮类似物、唑羧酰胺和芳族三唑类似物或者具有其它官能性的碱基类似物，如用于亲合结合的生物素部分。
抗体SBP成员
在典型的实施方式中，标记的SBP成员是抗体。可以通过使用例如NHS-胺化学、巯基-马来酰亚胺化学或点击化学(如张力炔烃和叠氮化物、张力炔烃和硝酮、张力烯烃和四嗪等)的质量标签连接，通过一种或多种标记原子结合分子与抗体的缀合来实现抗体的标记。识别用于成像的细胞蛋白的抗体已广泛可用于IHC使用，并且通过使用标记原子而不是当前的标记技术(例如，荧光)，这些已知的抗体可以容易地适合于在本文所公开的方法中使用，但是具有提高多路复用能力的益处。抗体可以识别细胞表面上的靶标或者细胞内的靶标。抗体可以识别多个靶标，例如，它们可以特异性识别单个蛋白，或者可以识别共有共同表位的多个相关蛋白或者可以识别蛋白上的特异性翻译后修饰(例如，区分所关心的蛋白上的酪氨酸和磷-酪氨酸，区分赖氨酸和乙酰基-赖氨酸，以检测泛素化等)。在与其靶标结合后，可以检测缀合至抗体的标记原子以显示样品中靶标的位置。
标记的SBP成员通常将与样品中的靶标SBP成员直接相互作用。在一些实施方式中，然而，标记的SBP成员有可能与靶标SBP成员间接相互作用，例如，第一抗体可以结合至靶标SBP成员并且标记的第二抗体可以然后以夹心测定的方式结合至第一抗体。通常，然而，所述方法依赖于直接相互作用，因为这可以更容易地实现并且允许更高的多路复用。在两种情况下，然而，样品与可以结合至样品中的靶标SBP成员的SBP成员接触，并且在随后的阶段，检测连接至靶标SBP成员的标记。
核酸SBP和标记方法修饰
RNA是另一种生物分子，本文所公开的方法和设备能够以特异、灵敏且(如果需要)定量的方式检测所述RNA。以与以上对于蛋白分析所述的相同方式，可以通过使用用元素标签标记的SBP成员检测RNA，所述元素标签特异性结合至RNA(例如，如以上所讨论的互补序列的多核苷酸或寡核苷酸，包括互补序列的锁核酸(LNA)分子、互补序列的肽核酸(PNA)分子、互补序列的质粒DNA、互补序列的扩增DNA、互补序列的RNA片段和互补序列的基因组DNA片段)。RNA不仅包括成熟mRNA，而且还包括RNA加工中间体和新生前体mRNA转录本。
在某些实施方式中，使用所主张的发明的方法检测RNA和蛋白两者。
为了检测RNA，可以制备如本文所讨论的生物样品中的细胞，从而使用本文所述的方法和设备分析RNA和蛋白质含量。在某些方面，在杂交步骤之前固定和透性化细胞。可以作为固定和/或透性化提供细胞。可以通过交联固定剂，如甲醛、戊二醛固定细胞。作为另外一种选择或者另外，可以使用沉淀固定剂，如乙醇、甲醇或丙酮固定细胞。可以通过去污剂，如表面活性剂，包括聚乙二醇(例如，Triton X-100、吐温-20)、皂苷(一组两亲性糖苷)或化学品，如甲醇或丙酮使细胞透性化。在某些情况下，可以使用相同的试剂或试剂组进行固定和透性化。固定和透性化技术通过Jamur等人在“Permeabilization of Cell Membranes”(Methods Mol.Biol.,2010)中得到讨论。
先前已使用荧光团标签化寡核苷酸探针进行了细胞中靶标核酸的检测或“原位杂交”(ISH)。如本文所讨论的，质量标签化寡核苷酸结合电离和质谱，可以用于检测细胞中的靶标核酸。原位杂交方法在本领域中是已知的(参见Zenobi等人“Single-CellMetabolomics:Analytical and Biological Perspectives,”Science 342卷,6163期,2013)。还在美国专利号5,225,326和美国公开号2010/0092972和2013/0164750中描述了杂交规程，以上专利作为参考并入本文。
在杂交前，如之前所讨论的，可以将存在于悬浮液中或者固定在固体支持物上的细胞固定和透性化。透性化可以允许细胞保留靶标核酸，同时允许靶向杂交核苷酸、扩增寡核苷酸和/或质量标签化寡核苷酸进入细胞。可以在任何杂交步骤之后，例如，在靶向杂交寡核苷酸与核酸靶标的杂交之后，在扩增寡核苷酸的杂交之后和/或在质量标签化寡核苷酸的杂交之后，清洗细胞。
对于所述方法的全部或大部分步骤，细胞可以是悬浮的，以便于处理。然而，所述方法还适用于实体组织样品(例如，组织切片)中的细胞和/或固定在固体支持物(例如，载玻片或其它表面)上的细胞。因此，有时，细胞可以在样品中和在杂交步骤期间悬浮。其它时间，细胞在杂交期间固定在固体支持物上。
靶标核酸包括在通过主题方法检测的细胞中所关心且具有足够丰度的任何核酸。靶标核酸可以是RNA，其中多个拷贝存在于细胞内。例如，10个或更多个，20个或更多个，50个或更多个，100个或更多个，200个或更多个，500个或更多个或者1000个或更多个靶标RNA的拷贝可以存在于细胞中。靶标RNA可以是信使NA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)，小核RNA(snRNA)、小干扰RNA(siRNA)、长非编码RNA(IncRNA)或者本领域中已知的任何其它类型的RNA。靶标RNA可以为20个核苷酸或更长，30个核苷酸或更长，40个核苷酸或更长，50个核苷酸或更长，100个核苷酸或更长，200个核苷酸或更长，500个核苷酸或更长，1000个核苷酸或更长，20至1000个核苷酸，20至500个核苷酸长，40至200个核苷酸长等。
在某些实施方式中，质量标签化寡核苷酸可以直接杂交至靶标核酸序列。然而，其它寡核苷酸的杂交可以使得能够改善特异性和/或信号放大。
在某些实施方式中，两种或更多种靶标杂交寡核苷酸可以杂交至靶标核酸上的近端区并且可以一起提供用于杂交方案中其它寡核苷酸的杂交的位点。
在某些实施方式中，质量标签化寡核苷酸可以直接杂交至两个或更多个靶标杂交寡核苷酸。在其它实施方式中，可以同时或顺序添加一个或多个扩增寡核苷酸，从而杂交两个或更多个靶标杂交寡核苷酸并提供质量标签化寡核苷酸可以结合的多个杂交位点。可以作为能够杂交至两个或更多个靶标杂交寡核苷酸的多聚体提供具有或不具有质量标签化寡核苷酸的一个或多个扩增寡核苷酸。
尽管两个或更多个靶向杂交寡核苷酸的使用改善了特异性，但是扩增寡核苷酸的使用提高了信号。两个靶标杂交寡核苷酸杂交至细胞中的靶标RNA。两个靶标杂交寡核苷酸一起提供了扩增寡核苷酸可以结合的杂交位点。可以在允许两个相邻靶标杂交寡核苷酸杂交，但是高于扩增寡核苷酸仅与一个靶标杂交寡核苷酸杂交的解链温度的温度下进行扩增寡核苷酸的杂交和/或后续清洗。第一扩增寡核苷酸提供了第二扩增寡核苷酸可以结合的多个杂交位点，从而形成了支化模式。质量标签化寡核苷酸可以结合至通过第二扩增核苷酸所提供的多个杂交位点。总体上，这些扩增寡核苷酸(具有或不具有质量标签化寡核苷酸)在本文中被称为“多聚体”。因此，术语“扩增寡核苷酸”包括提供具有其它寡核苷酸可以与之退火的相同结合位点的多个拷贝的寡核苷酸。通过提高其它寡核苷酸的结合位点数，提高了可以发现的靶标的最终标记数。因此，多个标记的寡核苷酸间接杂交至单个靶标RNA。这使得能够通过提高每个RNA所使用的元素的可检测原子数来检测低拷贝数RNA。
用于实施这种扩增的一种具体方法包括使用来自Advanced cell diagnostics的
Figure BDA0003056852520000631
法，如以下更详细地讨论的。其它替代是使用适合于
Figure BDA0003056852520000632
FlowRNA法(Affymetrix eBioscience)的方法。该测定基于具有分支DNA(bDNA)信号放大的寡核苷酸对探针设计。产品目录中有超过4,000种探针，或者可以请求定制组而无另外收费。根据前一段落，所述方法通过以下步骤工作：靶标杂交寡核苷酸与靶标杂交，然后形成包含第一扩增寡核苷酸的分支结构(在
Figure BDA0003056852520000633
法中被称为扩增前的寡核苷酸)，以形成多个第二扩增寡核苷酸可以与之退火的柄(在
Figure BDA0003056852520000634
法中被简单地称为扩增寡核苷酸)。然后，多个质量标签化寡核苷酸可以结合。
RNA信号扩增的另一种方式依赖于扩增的滚环方式(RCA)。存在多种可以将该扩增系统引入扩增过程中的方式。在第一种情况下，将第一核酸用作杂交核酸，其中第一核酸是环形的。第一核酸可以是单链的或者可以是双链的。它包括与靶标RNA互补的序列。在第一核酸与靶标RNA杂交后，与第一核酸互补的引物杂交至第一核酸并用于使用(通常外源添加至样品)聚合酶和核酸的引物延伸。在一些情况下，然而，当将第一核酸加入至样品时，它可能已具有与之杂交的用于延伸的引物。由于第一核酸是环形的，因此一旦引物延伸完成一轮完整复制，则聚合酶可以替换引物并继续延伸(即无5’→3’核酸外切酶活性)，从而产生了连接的更进一步的第一核酸的互补物的成链拷贝，借此扩增该核酸序列。如以上所讨论的包含元素标签(RNA或DNA，或LNA或PNA等)的寡核苷酸因此可以杂交至第一核酸的互补物的成链拷贝。因此，可以通过调拨给环状核酸的扩增步骤的时间长度来控制RNA信号的放大程度。
在RCA的另一种应用中，而不是第一，例如，杂交至环形靶标RNA的寡核苷酸，它可以是直链的并且包含具有与其靶标互补的序列的第一部分和用户选择的第二部分。具有与该第二部分同源的序列的环形RCA模板然后可以杂交至该第一寡核苷酸，并如上进行RCA扩增。第一，例如，具有靶标特异性部分和用户选择部分的寡核苷酸的使用在于可以选择所述用户选择部分，从而在多种不同探针之间是共用的。这是试剂有效的，因为可以在检测不同靶标的一系列反应中使用相同的后续扩增试剂。然而，如技术人员所理解的，当使用这种策略时，对于多路复用反应中的特异性RNA的单个检测，杂交至靶标RNA的每个第一核酸将需要具有唯一的第二序列并且反过来每个环形核酸应含有可以通过标记的寡核苷酸杂交的唯一序列。以这种方式，可以特异性放大并检测来自每个靶标RNA的信号。
引起RCA分析的其它配置将是技术人员已知的。在一些情况下，为了防止第一，例如，寡核苷酸在后续扩增和杂交步骤期间与靶标解离，可以将第一，例如，寡核苷酸在杂交后固定(如通过甲醛)。
此外，杂交链式反应(HCR)可以用于放大RNA信号(参见，例如，Choi等人,2010,Nat.Biotech,28:1208-1210)。Choi解释HCR扩增分子(amplifier)由在不存在引发剂的情况下不聚合的两个核酸发夹物质组成。每个HCR发夹由具有暴露的单链支点(toehold)的输入域和具有隐藏在折叠发卡中的单链支点的输出域组成。引发剂与两个发夹之一的输入域的杂交打开发夹以暴露其输出域。该(先前隐藏的)输出域与第二发夹的输入域的杂交打开发夹以暴露与引发剂序列相同的输出域。引发剂序列的再生为交替的第一和第二发夹聚合步骤的链式反应提供了基础，从而导致缺口双链‘聚合物’的形成。可以在本文所公开的方法和设备的应用中用元素标签标记第一和第二发夹中的任一种或两种。由于扩增程序依赖于特定序列的输出域，因此可以使用单独的发夹组在相同方法中单独实施多种单独的扩增反应。因此，这种扩增还允许多种RNA物质的多路复用分析中的扩增。如Choi所提及的，HCR是等温引发的自组装过程。因此，在经历原位引发的自组装之前，发夹应穿透样品，从而表明深样品穿透和高信背比的潜力。
杂交可以包括将细胞与一种或多种寡核苷酸，如靶标杂交寡核苷酸、扩增寡核苷酸和/或质量标签化寡核苷酸接触，并提供可以发生杂交的条件。杂交可以在缓冲溶液，如柠檬酸钠(SCC)缓冲盐水，磷酸盐缓冲盐水(PBS)，磷酸钠-EDTA(SSPE)缓冲盐水，TNT缓冲液(具有Tris-HCl、氯化钠和吐温20)或者任何其它适合的缓冲液中进行。可以在一个或多个寡核苷酸的杂交的解链温度附近或低于其的温度进行杂交。
可以通过在杂交后实施一次或多次清洗来改善特异性，以除去未结合的寡核苷酸。提高清洗的严格性可以改善特异性，但是降低了整体信号。可以通过提高或降低清洗缓冲液的浓度，提高温度和/或提高清洗的持续时间来提高清洗的严格性。可以在任何或全部杂交温育和后续清洗中使用RNA酶抑制剂。
可以使用第一组杂交探针，包括一种或多种靶标杂交寡核苷酸、扩增寡核苷酸和/或质量标签化寡核苷酸标记第一靶标核酸。另外的组的杂交探针可以用于标记另外的靶标核酸。每组杂交探针可以对于不同的靶标核酸是特异的。可以设计其它组杂交探针，杂交并清洗以减少或防止不同组寡核苷酸之间的杂交。另外，每组质量标签化寡核苷酸可以提供唯一的信号。照此，多组寡核苷酸可以用于检测2、3、5、10、15、20或更多个独特的核酸靶标。
有时，所检测的不同核酸是单个基因的剪接变体。可以设计质量标签化寡核苷酸以在外显子序列内(直接或通过其它寡核苷酸间接，如以下解释的)杂交，以检测含有该外显子的所有转录本，或者可以对其进行设计以桥连剪接点以检测特异性变体(例如，如果基因具有3个外显子和2个剪接变体-外显子1-2-3和外显子1-3，则两者是可以区分的：可以通过杂交至外显子2特异性检测变体1-2-3，并且通过在外显子1-3接合点杂交可以特异性检测变体1-3。
组织化学染色
具有一个或多个内源金属原子的组织化学染色剂可以与如本文所述的其它试剂和使用方法组合。例如，组织化学染色可以与含金属药物、金属标记的抗体和/或积累的重金属共定位(例如，以细胞或亚细胞分辨率)。在某些方面，可以以比用于其它成像方法(例如，荧光显微术、光学显微术或电子显微术)的浓度低的浓度(例如，小于一半、四分之一、十分之一等)使用一种或多种组织化学染色。
为了显像和识别结构，广谱的组织学染色剂和指示剂是可用且良好鉴别的。含金属染色剂具有影响病理学家对成像质谱细胞术的接受度的潜力。某些含金属染色剂对于显示细胞组分是熟知的并且适合于在本发明中使用。另外，可以在数字图像分析中使用明确定义的染色剂，从而为特征识别算法提供对比度。这些特征对于成像质谱细胞术的发展在策略上是重要的。
通常，可以使用亲合产品，如抗体使组织切片的形态结构产生对比度。与使用组织化学染色相比，它们是昂贵的并且需要使用含金属的标签的另外标记程序。这种方法在使用通过可得的镧系同位素标记的抗体，对成像质谱细胞术的开创性工作中使用，因此消除了用于功能性抗体的质量(例如，金属)标签以回答生物学问题。
本发明扩大了可用的同位素的目录，包括如Ag、Au、Ru、W、Mo、Hf、Zr的元素(包括用于识别粘液性基质的化合物，如钌红，用于鉴别胶原蛋白纤维的三色染色，作为细胞复染的四氧化锇)。在染色体组分型中使用银染色。硝酸银对核仁组织区(NOR)-相关蛋白染色，从而产生了其中银沉积的暗区并且指示了rRNA基因在NOR内的活性。对IMC的修改可以需要对于使用低浓度银溶液，例如，小于0.5％、0.01％或0.05％的银溶液修改的规程(例如，期间使用高锰酸钾的氧化和1％的银浓度)。
金属自显影扩增技术已发展成组织化学中的重要工具。一些内源和毒性重金属形成硫醚或硒化物纳米晶体，其可以通过与Ag离子的反应自催化扩增。较大的Ag纳米簇然后可以容易地通过IMC显像。目前，已建立了用于Zn-S/Se纳米晶体的银放大检测的稳健规程以及通过银-硒纳米晶体的形成的硒检测。另外，可商购的量子点(Cd的检测)也是自催化活性的并且可以用作组织化学标记。
本发明的方面可以包括组织化学染色以及它们在通过元素质谱的成像中的使用。可以在本发明中使用通过元素质谱可分辨的任何组织化学染色。在某些方面，组织化学染色包括质量大于用于样品成像的质谱仪的检测器的截止质量下限，如大于60amu，80amu，100amu或120amu的一个或多个原子。例如，组织化学染色可以包括如本文所述的金属标签(例如，金属原子)。金属原子可以螯合至组织化学染色剂或者在组织化学染色剂的化学结构内共价结合。在某些方面，组织化学染色剂可以是有机分子。组织化学染色剂可以是极性的，疏水性的(例如，亲脂性的)，离子的或者可以包含具有不同性质的基团。在某些方面，组织化学染色剂可以包含多于一种化学剂。
组织化学染色剂包括小于2000、1500、1000、800、600、400或200amu的小分子。组织化学染色剂可以通过共价或非共价(例如，离子或疏水性)相互作用结合至样品。组织化学染色剂可以提供对比度以分辨生物样品的形态，例如，帮助识别各个细胞，胞内结构和/或胞外结构。可以通过组织化学染色分辨的胞内结构包括细胞膜、细胞质、核、高尔基体、ER、线粒体和其它细胞器。组织化学染色剂可以对一类生物分子，如核酸、蛋白、脂质、磷脂或碳水化合物具有亲合力。在某些方面，组织化学染色可以结合除DNA以外的分子。适合的组织化学染色剂还包括结合胞外结构(例如，胞外基质结构)，包括基质(例如，粘液性基质)、基底膜、间质基质，蛋白，如胶原蛋白或弹性蛋白、蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖、胞外囊泡、纤连蛋白、层粘连蛋白等的染色剂。
在某些方面，组织化学染色剂和/或代谢探针可以表示细胞或组织的状态。例如，组织化学染色剂可以包括活体染色剂，如顺铂、伊红和碘化丙啶。其它组织化学染色剂可以对缺氧染色，例如，可以仅在缺氧条件下结合或沉积。探针，如碘代脱氧尿苷(IdU)或其衍生物可以对细胞增殖染色。在某些方面，组织化学染色可以不表示细胞或组织的状态。在任何主题方法中使用检测细胞状态(例如，存活力、缺氧和/或细胞增殖)，但体内施用(例如，施用至活动物或细胞培养物)的探针，但是其不具有作为组织化学染色剂的资格。
组织化学染色剂可以对一类生物分子，如核酸(例如，DNA和/或RNA)、蛋白、脂质、磷脂、碳水化合物(例如，糖，如单糖或二糖或多元醇；寡糖；和/或多糖，如淀粉或糖原)、糖蛋白和/或糖脂具有亲合力。在某些方面，组织化学染色剂可以是复染。
以下是具体的组织化学染色的实例以及它们在主题方法中的使用：
可以如下所示使用作为用于粘液性基质检测的含金属染色剂的钌红染色剂：可以用0.0001-0.5％、0.001-0.05％、小于0.1％、小于0.05％或约0.0025％的钌红处理免疫染色组织(例如，脱蜡FFPE或冰冻切片)(例如，在4-42℃或在约室温处理至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟或约30min)。可以漂洗生物样品，例如，用水或缓冲溶液漂洗。然后，可以在通过元素质谱成像前干燥组织。
磷钨酸(例如，作为三色染色剂)可以用作用于胶原蛋白纤维的含金属染色剂。可以将载玻片上的组织切片(脱蜡FFPE或者冷冻切片)在布安液中固定(例如，在4-42℃或在约室温固定至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟或约30min)。然后，可以用0.0001％-0.01％、0.0005％-0.005％或者约0.001％的磷钨酸处理切片(例如，在4-42℃或在约室温处理至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟或约15分钟)。然后，可以用水和/或缓冲溶液漂洗样品，并任选地在通过元素质谱成像之前干燥。与用于通过光学(例如，荧光)显微镜成像的浓度相比，可以稀释使用三色染色剂(例如，5倍、10倍、20倍、50倍或更大的稀释)。
在一些实施方式中，组织化学染色剂可以是有机分子。在一些实施方式中，第二金属是共价结合的。在一些实施方式中，第二金属是螯合的。在一些实施方式中，组织化学染色剂特异性结合细胞膜。在一些实施方式中，组织化学染色剂是四氧化锇。在一些实施方式中，组织化学染色剂是亲脂性的。在一些实施方式中，组织化学染色剂特异性结合胞外结构。在一些实施方式中，组织化学染色剂特异性结合胞外胶原蛋白。在一些实施方式中，组织化学染色剂是包含磷钨酸/磷钼酸的三色染色剂。在一些实施方式中，在样品与抗体接触后，使用三色染色剂，如以比用于光学成像的浓度低的浓度，例如，其中所述浓度是三色染色剂的50倍或更大的稀释液。
含金属药物
药物中的金属是药学中新的且令人兴奋的领域。对于在掺入金属蛋白质、核酸、金属络合物或含金属药物前，参与短暂储存金属离子的细胞结构以及一旦蛋白或药物降解，金属离子的去向知之甚少。朝着揭示参与微量金属转运、储存和分布的调控机制的重要第一步是金属的鉴别和定量，理想地，在组织、细胞或甚至在各个细胞器和亚细胞区室的水平，在它们天然生理环境的背景中。通常对薄组织切片或用培养细胞进行组织学研究。
一些含金属药物正用于治疗多种疾病，然而对它们的作用机制或生物分布的了解尚不足：顺铂、钌咪唑、具有Mo的茂金属基抗癌剂、具有W的茂钨(tungstenocenes)，具有Hf或Zr的B-二酮络合物、具有Au的金诺芬、聚氧钼酸盐药物。多种金属络合物用作MRI造影剂(Gd(lll)螯合物)。金属基抗癌药物的吸收和生物分布的鉴定对于理解和最大程度降低潜在毒性是至关重要的。
存在于药物中的某些金属的原子量在质谱细胞术的范围内。具体地，具有Pt络合物的顺铂及其它药物(异丙铂、洛铂)广泛用作用于治疗广泛的癌症的化学治疗药物。铂基抗癌药物的肾中毒性和骨髓中毒性是熟知的。通过本文所述的方法和试剂，目前可以检验它们在组织切片内的亚细胞定位以及与质量-(例如，金属-)标签化抗体和/或组织化学染色剂的共定位。化学治疗药物可以通过直接DNA损伤、抑制DNA损伤修复途径、放射性等，对某些细胞，如增殖细胞具有毒性。在某些方面，化学治疗药物可以通过抗体中间体靶向肿瘤。
在某些方面，含金属药物是化学治疗药物。主题方法可以包括在获得生物样品之前，向如前所述的活体动物，如动物研究模型或人患者施用含金属药物。生物样品可以是例如癌性组织或原代细胞的活组织检查。作为另外一种选择，可以直接将含金属药物添加至生物样品，其可以是无限增殖化细胞系或原代细胞。当动物为人患者时，主题方法可以包括基于对含金属药物的分布的检测，调整包括含金属药物的治疗方案。
检测含金属药物的方法步骤可以包括通过元素质谱对含金属药物亚细胞成像，并且可以包括检测含金属药物在胞内结构(如膜、细胞质、核、高尔基体、ER、线粒体和其它细胞器)和/或胞外结构(如，包括基质、粘液性基质、基底膜、间质基质，蛋白，如胶原蛋白或弹性蛋白、蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖、胞外囊泡、纤连蛋白、层粘连蛋白等)中的保留。
分辨(例如，结合至)一个或多个上述结构的组织化学染色剂和/或质量-(例如，金属-)标签化SBP可以与含金属药物共定位以检测药物在特定胞内或胞外结构的保留。例如，化学治疗药物，如顺铂可以与结构，如胶原蛋白共定位。作为另外一种选择或另外，药物的定位可以与细胞存活力、细胞增殖、缺氧、DNA损伤反应或免疫应答标志物的存在有关。
在一些实施方式中，含金属药物包含非内源金属，如其中非内源金属是铂、钯、铈、镉、银或金。在某些方面，含金属药物是顺铂、钌咪唑、具有Mo的茂金属基抗癌剂、具有W的茂钨，具有Hf或Zr的B-二酮络合物、具有Au的金诺芬、聚氧钼酸盐药物、具有Pd的N-十四烷基转移酶-1抑制剂(三(二苄叉基丙酮)二钯)或其衍生物之一。例如，药物可以包含Pt，并且可以是例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、异丙铂、洛铂或其衍生物。含金属药物可以包括非内源金属，如铂(Pt)、钌(Ru)，钼(Mo)、钨(W)、铪(Hf)、锆(Zr)、金(Au)、钆(Gd)、钯(Pd)或其同位素。可以在组织切片中识别用于抗癌光热疗法的金化合物(例如金诺芬)和金纳米颗粒生物缀合物。
积累的重金属
可以通过食品或水的摄入，通过皮肤接触或气溶胶吸入发生重金属的暴露。重金属可以在身体的软组织中积累，从而长时间暴露具有严重的健康影响。在某些方面，重金属可以通过控制暴露在动物研究模型中或者通过环境暴露在人患者中体内积累。重金属可以是毒性重金属，如砷(As)、铅(Pb)、锑(Sb)、铋(Bi)、镉(Cd)、锇(Os)、铊(Tl)或汞(Hg)。
主题方法可以用于诊断和/或鉴定人患者中的重金属中毒，确定人患者的治疗方案或者鉴定动物研究模型中的重金属积累和/或治疗。
样品
本公开的某些方面提供了分析生物样品的方法，如生物样品成像。这些样品可以包含多个细胞，可以对多个这些细胞进行质谱成像，如成像质谱细胞术(IMC)以提供样品中这些细胞的图像。通常，本发明可以用于分析目前通过FACS或免疫组织化学(IHC)技术研究的组织样品，但是通过使用适合于通过质谱(MS)或发射光谱(OES)检测的标记原子。
任何适合的组织样品可以用于本文所述的方法。例如，组织可以包括来自以下中的一种或多种的组织：上皮细胞、肌肉、神经、皮肤、肠、胰脏、肾、脑、肝脏、血液、骨髓、口腔拭子、宫颈拭子或任何其它组织。其它体液也可以是样品，如腹水、肺液、脊髓液、羊膜水、血浆、血清、细胞外液、渗出液、粪便、尿。还可以分析细胞裂解液，以及可以分析细胞培养上清液、细菌培养物和/或裂解液、病毒培养物和/或培养上清液。生物样品可以是得自活体的无限增殖化细胞系或原代细胞。出于诊断、预后或实验(例如，药物开发)的目的，组织可以来自肿瘤。在一些实施方式中，样品可以来自已知的组织，但是它可以是未知的，无论样品是否含有肿瘤细胞。成像可以显示表示肿瘤存在的靶标的存在，因此有利于诊断。来自肿瘤的组织可以包含也通过主题方法所鉴定的免疫细胞，并且可以提供对肿瘤生物学的理解。组织样品可以包含福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织。组织可以得自任何活的多细胞机体，如哺乳动物、动物研究模型(例如，患有特定疾病，如具有人肿瘤异种移植的免疫缺陷型啮齿类动物)或人患者。
样品还可以由已从溶液固定化至样品载体(例如，以阵列形式)的分析物组成或者包含所述分析物。因此，样品可以包括细胞、细胞群体、蛋白溶液、肽溶液、核酸溶液和碳水化合物溶液、包含多种大分子类型的溶液，例如，蛋白和核酸的溶液和蛋白、核酸和碳水化合物的溶液，和包含多种大分子类型和细胞的溶液，例如，蛋白、核酸和细胞的溶液和蛋白、核酸、碳水化合物和细胞的溶液。因此，样品可以是组织匀浆、组织液、体液、腹水、肺液、脊髓液、羊膜水、骨髓吸出物、血浆、血清、渗出液、粪便、尿、细胞裂解液、细胞培养上清液、细胞外液、细菌裂解液、病毒上清液、其任何组合或其它生物流体。
组织样品可以是例如厚度在2-10μm范围内，如4-6μm之间的切片。制备这些切片的技术是IHC领域熟知的，例如，使用切片机，包括脱水步骤、固定、包埋、透化、切片等。因此，可以化学固定组织，然后可以在所期望的平面制备切片。低温切片或激光捕获显微切片也可以用于制备组织样品。可以使样品透化，例如，以允许试剂标记胞内靶标(参见上文)。
要分析的组织样品的大小类似于当前的IHC法，尽管最大尺寸将取决于激光烧蚀设备，并且具体地，可以装入其样品室的样品尺寸。多达5mm×5mm的尺寸是典型的，但是较小的样品(例如，1mm×1mm)也是有用的(这些尺寸表示切片大小，而不是它的厚度)。
除对于组织样品成像有用外，作为替代，本公开可以用于细胞样品成像，如贴壁细胞单层或固定在固体表面上的细胞单层(如常规免疫细胞化学中的一样)。这些实施方式对于用于细胞悬浮液质谱细胞术的不可以容易地溶解的贴壁细胞的分析是特别有用的。因此，本公开可以用于提高免疫细胞化学，并且对于提高当前免疫组织化学分析是有用的。
如上所述，抗体和/或组织化学染色可以允许监测组织状态，如细胞增殖(例如，使用靶标Ki-67或标志物IdU)、DNA损伤反应(例如，使用标志物，如γH2AX)、缺氧(例如，使用示踪剂EF5，作为含金属衍生物或与金属标签化EF5特异性抗体偶联)。如下所述，组织状态可以与含金属药物或积累的重金属的存在和/或分布相关。
当如下所述检测含金属药物和/或积累的重金属时，生物样品可以得自动物受试者。具体地，动物受试者可以是哺乳动物(例如，啮齿类或人)，如动物研究模型或人患者。
动物研究模型包括引起患病状态，如癌症或重金属中毒的任何动物基因工程和/或植入下方(put under)条件(例如，人肿瘤的异种移植，暴露于致癌物或暴露于毒性重金属)。在其它实施方式中，生物样品得自人患者，如已经或正在测试癌症或对重金属的毒性暴露的人。在任一种情况下，在从动物受试者获得生物样品前，可以将动物受试者暴露于化学治疗药物或重金属。
如本文所述，可以在脉冲追踪型实验中使用金属标签的多路复用检测。具体地，活的动物或生物样品在不同时间点对包含相同元素的不同金属同位素的含金属药物或毒性重金属的暴露可以用于监测金属保留和/或清除的进展。在某些方面，治疗或暴露的变化可以与一个或多个时间点一致。
组织样品的标记
本公开产生了已用标记原子，例如，多种不同的标记原子标记的样品，其中通过能够采样样品的特异性，优选地亚细胞区的设备检测标记原子(标记原子因此代表元素标签)。对多种不同原子的提及表示使用不止一种原子种类标记样品。可以使用质量检测器区分这些原子种类(例如，它们具有不同的m/Q比)，从而羽流内两种不同的标记原子的存在导致产生了两种不同的MS信号。还可以使用光谱仪区分原子种类(例如，不同的原子具有不同的发射光谱)，从而羽流内两种不同的标记原子的存在导致产生了两种不同的发射光谱信号。
本文中的方法适合于同时检测远远大于2种不同的标记原子，从而允许多路复用标记检测，例如，至少3、4、5、10、20、30、32、40、50或甚至100种不同的标记原子。如果可以单个分辨标记原子的组合，则标记原子还可以以组合的方式用于甚至进一步提高可区分标记的数目。Giesen等人,2014证实了32种不同的标记原子在成像方法中的使用，但是激光烧蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)固有地适合于更高数目的不同原子，例如，甚至超过100种不同的原子种类的并行检测，如本文所讨论的其它技术一样。通过用不同的标记原子标记不同的靶标，有可能在单一图像中确定多个靶标的细胞位置。
标记组织样品通常需要将标记原子连接至特异性结合对(SBP)的一个成员。将该标记的SBP与组织样品接触，从而它可以与SBP的另一个成员(靶标SBP成员)相互作用(如果存在)，借此将标记原子定位至样品中的特定位置。然后，本公开的方法检测标记原子在该特定位置的存在，并将该信息转化为其中在该位置存在靶标SBP成员的图像。可以通过已知技术将稀土金属及其它标记原子缀合至SBP成员，例如，Brückner等人(2013；Anal.Chem.86:585-91)描述了用于ICP-MS检测的镧系原子与寡核苷酸探针的连接，Gao&Yu(2007；Biosensor Bioelectronics 22:933-40)描述了使用钌标记寡核苷酸，并且Fluidigm Canada出售MaxParTM金属标记试剂盒，其可以用于将超过30种不同的标记原子缀合至蛋白(例如，包括其片段的抗体)。
如上所述，将包含一种或多种标记原子的质量标签连接至SBP成员，并且该质量标签化SBP成员与组织样品接触，其中它可以找到靶标SBP成员(如果存在)，借此形成标记的靶标SBP(也称为标记的分析物)。靶标成员可以包含根据本公开，适合于连接至标记原子，然后适合于成像的任何化学结构。
一般地说，本公开的方法可以基于任何SBP，其已知用于确定靶标分子在组织样品中的位置(例如，如IHC或荧光原位杂交，FISH中所使用的)，但是与样品接触的SBP成员将具有通过如上所述的检测器系统可检测的标记原子。因此，仅通过修饰先前已用于例如修饰FISH探针以具有可以检测的标记的标记，可以容易地通过使用可用的IHC和FISH试剂实施本公开。
就当在多路复用反应中共同配置不同的质量标签化SBP时，确保质量标签相当程度的离子化以产生元素离子来说，由用于缀合SBP和质量标签的反应化学的共同性所产生的质量标签化SBP的通用结构也可以具有优势。由于不同的标记原子可以更易于连接至不同类型的SBP，从而使得能够进行更可定制和灵活的测定设计，因此常规缀合化学的使用有益于通过成像质谱细胞术所唯一提供的高度多路复用的分析。因此，本发明使得能够产生标记的样品，其中两种或更多种质量标签化SBP试剂在质量标签和试剂的SBP组分之间具有相同的连接。因此，本发明提供了标记的样品，其中两种或更多种质量标签化SBP试剂在质量标签和试剂的SBP组分之间具有相同的连接。有时，用于对染色样品进行染色的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少20，至少30，至少40，至少50或至少100种质量标签化SBP在质量标签和试剂的SBP组分之间具有相同的连接。
靶标元素和检测质量(例如，金属)标签的分布
方法可以包括检测如本文所述的质量(例如，金属)标签的分布。在某些方面，检测可以包括构建提供质量(例如，金属)标签的空间分布的图像(如本文中进一步描述的)。
某些方法、试剂盒和/或生物样品可以包括多个质量(例如，金属)标签，如3个或更多个，5个或更多个，10个或更多个，20个或更多个，30个或更多个，40个或更多个或者50个或更多个金属标签。
在成像质谱的上述总结中，一种或多种靶标元素(即元素或元素同位素)的分布可以是所关心的。在某些方面，靶标元素是如本文所述的标记原子。在其它情况下，靶标元素可以是天然存在于样品中的原子，例如，靶标元素可以是在某些酶的活性位点中天然配位的金属。可以将标记原子直接单独添加至样品或者共价结合至生物活性分子或者在生物活性分子内结合。在某些实施方式中，标记原子(例如，金属标签)可以缀合至特异性结合对(SBP)成员，如(结合至其同源抗原的)抗体、用于杂交至DNA或RNA靶标的适配体或寡核苷酸，如本文中所述的。通过本领域中已知的任何方法，可以将标记原子连接至SBP。在一些实施方式中，标记原子是金属元素，如镧系或过渡元素，或者如本文所述的另一种金属标签。金属元素可以具有大于60amu，大于80amu，大于100amu或者大于120amu的质量。本文所述的质谱仪可以消除低于金属元素质量的元素离子，从而大量较轻的元素不产生空间电荷效应和/或使质量检测器无法承受。
多路复用分析
本公开的一个特征是其检测样品中多个(例如，10个或更多个，20个或更多个，30个或更多个，40个或更多个或50个或更多个并且甚至100个或更多个)不同的靶标SBP成员的能力，例如，检测多个不同的蛋白和/或多个不同的核酸序列的能力。为了允许这些靶标SBP成员的差异检测，它们的各个SBP成员应具有不同的标记原子，从而可以区分它们的信号。例如，当检测10种不同的蛋白时，可以使用10种不同的抗体(分别对不同的靶标蛋白特异)，它们中的每一个具有唯一的标记，从而可以区分来自不同抗体的信号。在一些实施方式中，期望使用抗单一靶标的多个不同抗体，例如，其识别相同蛋白上的不同表位。因此，由于这种类型的冗余度，方法可以使用比靶标更多的抗体。通常，然而，本公开将使用多种不同的标记原子来检测多种不同的靶标。
如果将不止一种标记抗体用于本公开，则优选地，抗体对于它们各个的抗原应具有类似的亲合力，因为这帮助确保所检测的标记原子的量和组织样品中靶标抗原的丰度之间的关系将在不同的SBP之间更加一致(特别是在高扫描频率下)。类似地，优选地，如果多种抗体的标记具有相同的效率，则抗体分别具有相当的量的标记原子。
在一些情况下，SBP可以具有荧光标记以及元素标签。然后，样品的荧光可以用于确定包含所关心的材料(然后，可以对所述材料进行采样以用于标记原子的检测)的样品，例如，组织切片的区域。例如，可以将荧光标记缀合至结合至癌细胞上大量存在的抗原的抗体，并且然后，可以靶向任何荧光细胞以确定缀合至标记原子的SBP周围的其它细胞蛋白的表达。当SBP具有质量标签以外的荧光标签时，荧光和质量标签可以通过不同的化学性质缀合至SBP。例如，可以使用点击化学反应缀合质量标签；并且可以通过现有技术的马来酰亚胺化学将荧光标签缀合至SBP上的巯基来缀合荧光标签。作为另外一种选择，可以通过点击化学将荧光和质量标签两者缀合至SBP。如果靶标SBP成员位于胞内，则通常必需在样品与标记接触之前或期间使细胞膜透性化。例如，当靶标是DNA序列，但是标记的SBP成员不可以穿透活细胞的膜时，可以将组织样品的细胞固定并透性化。然后，标记的SBP成员可以进入细胞并与靶标SBP成员形成SBP。在这方面，使用了用于与IHC和FISH一起使用的已知规程。
方法可以用于检测至少一种胞内靶标和至少一种细胞表面靶标。在一些实施方式中，然而，本公开可以用于检测多种细胞表面靶标，同时忽略胞内靶标。整体上，将通过来自所述方法的所期望的信息确定靶标的选择，因为本公开将提供所选择的靶标在样品中的位置的图像。
如本文中进一步所描述的，包含标记原子的特异性结合伴侣(即亲合试剂)可以用于染色(接触)生物样品。适合的特异性结合伴侣包括抗体(包括抗体片段)。标记原子可以是通过质谱可区分的(即可以具有不同的质量)。当它们包括一种或多种金属原子时，在本文中标记原子可以称为质量(例如，金属)标签。质量(例如，金属)标签可以包括具有碳主链和分别结合金属原子的多个侧基(即负载了金属原子的金属螯合基团)的聚合物。作为另外一种选择或者另外，金属标签可以包括金属纳米颗粒。可以通过共价或未共价相互作用，用质量(例如，金属)标签使抗体标签化。
抗体染色剂可以用于在细胞或亚细胞分辨率使蛋白成像。本发明的方面包括将样品与特异性结合生物样品细胞所表达的蛋白的一种或多种抗体接触，其中用第一质量(例如，金属)标签使抗体标签化。例如，样品可以与5个或更多个，10个或更多个，15个或更多个，20个或更多个，30个或更多个，40个或更多个，50个或更多个抗体接触，其分别具有可区分的质量(例如，金属)标签。样品还可以在用抗体染色样品之前，期间(例如，以便于工作流程)或者之后(例如，以避免改变抗体的抗原靶标)与一种或多种组织化学染色剂接触。样品还可以包含如本文所述的一种或多种含金属药物和/或积累的重金属。
用于在本发明中使用的质量-(例如，金属-)标签化抗体可以特异性结合不包含金属的代谢探针(例如，EF5)。其它质量-(例如，金属-)标签化抗体可以特异性结合在荧光和光学显微术中使用的常规染色剂的(例如，上皮组织、基质组织、核等)靶标。这些抗体包括抗钙粘素、抗胶原蛋白、抗角蛋白、抗EFS、抗组蛋白H3抗体和本领域中已知的一些其它抗体。
作为另外一种选择或者另外，检测质量(例如，金属)标签的分布可以包括测量两种或更多种质量(例如，金属)标签的共定位程度(例如，为质量(例如，金属)标签占据相同或类似位置的程度赋值)。这些分析可以用于识别积累质量(例如，金属)标签的亚细胞结构，其可以为质量(例如，金属)标签(或者含有质量(例如，金属)标签的化学品)的暴露的生物学提供理解。在一些实施方式中，质量(例如，金属)标签的空间分布的检测可以处于亚细胞分辨率。在一些实施方式中，对于生物样品，一些或全部质量(例如，金属)标签可以不是内源的。
单细胞分析
本公开的方法包括样品中多个细胞的激光烧蚀，并因此分析来自多个细胞的羽流并且将它们的含量定位至样品中的具体位置以提供图像。在大多数情况下，所述方法的用户将需要将信号定位至样品内的具体细胞，而不是作为整体的样品。为了实现这种情况，可以区别样品中的细胞边界(例如，质膜，或者在一些情况下，细胞壁)。
可以通过多种方式实现细胞边界的区别。例如，可以使用可以区别细胞边界的常规方法，如以上所讨论的显微镜学来研究样品。当实施这些方法时，因此，如以上所讨论的包括照相机的分析系统是特别有用的。然后，可以使用本公开的方法制备这种样品的图像，并且可以将这种图像置于先前结果之上，借此使得能够将所检测的信号定位至具体细胞。的确，如以上所讨论的，在一些情况下，可以将激光烧蚀仅导向至样品中通过使用基于显微镜的技术确定为所关心的细胞亚型。
然而，为了避免对使用多种技术的需要，有可能作为本公开的成像方法的一部分来区别细胞边界。这些边界区别策略是IHC和免疫细胞化学所常见的，并且可以通过使用可以检测的标记来修改这些方法。例如，所述方法可以包括标记已知位于细胞边界的靶标分子，并且来自这些标记的信号可以然后用于边界区别。适合的靶标分子包括大量或通用的细胞边界标志物，如粘附复合物成员(例如，β-联蛋白或E-钙粘素)。一些实施方式可以标记不止一种膜蛋白以提高区别。
除通过包括适合的标记来区别细胞边界外，还可能以这种方式区别特定细胞器。例如，抗原，如组蛋白(例如，H3)可以用于识别核，并且还可能标记线粒体-特异性抗原、细胞骨架-特异性抗原、高尔基体-特异性抗原、核糖体-特异性抗原等，借此允许通过本公开的方法分析细胞超微结构。
可以通过肉眼评价，或者可以通过使用图像处理的计算机分析区别细胞(或细胞器)边界的信号。对于其它成像技术，这些技术在本领域中是已知的，例如，Arce等人(2013；Scientific Reports 3,article 2266)描述了使用空间过滤来确定荧光图像的细胞边界的分割方案，参考文献Ali等人(2011；Mach Vis Appl 23:607-21)公开了确定明视野显微镜图像的边界的算法，参考文献Pound等人(2012；The Plant Cell 24:1353-61)公开了从共聚焦显微镜图像提取细胞几何形状的CellSeT方法，并且参考文献Hodneland等人(2013；Source Code for Biology and Medicine 8:16)公开了用于荧光显微镜图像的CellSegmMATLAB工具箱。对于本公开有用的方法使用了流域变换和高斯模糊。可以单独使用这些图像处理技术或者可以使用它们，然后肉眼检查。
一旦已区别了细胞边界，则有可能将来自具体靶标分子的信号分配至各个细胞。例如，通过对定量标准品校准所述方法，定量各个细胞中的靶标分析物的量也可以是可能的。
样品载体
在某些实施方式中，可以将样品固定在固体支持物(即样品载体)上，以将其定位用于成像质谱。样品载体可以是光学透明的，例如，由玻璃或塑料制成。当样品载体是光学透明的时，它使得能够通过支持物烧蚀样品材料。例如，固体支持物可以包括组织载玻片。有时，样品载体将包含起到用于本文所述的设备和方法使用的参考点的作用的特征，例如，以允许计算要烧蚀或解吸和分析的所关心的的特征/区域的相对位置。
用于本发明使用的设备和技术
一般地说，本文所公开的质谱成像设备包括两种用于实施成像元素质谱的广泛鉴定的系统。
第一种是采样和离子化系统。该系统含有样品室，它是其中当进行分析时放置样品的组件。样品室包括台，其保持样品(通常样品位于样品载体上，如显微镜载玻片，例如，组织切片、细胞或各个细胞的单层，如其中已将细胞悬液滴在显微镜载玻片上并将载玻片置于所述台上)。采样和离子化系统起作用以从样品室中的样品除去材料(在本文中将所除去的材料称为样品材料)，作为导致材料从样品除去的过程的一部分或者通过采样系统下游的单独的离子化系统，将其转化为离子。
然后，通过作为检测器系统的第二系统分析离子化材料。基于要确定的离子化样品材料的具体特征，例如，基于质谱和基于光谱仪的质谱成像设备中分别的质量检测器或发光检测器，检测器系统可以采取不同的形式。
因此，在操作中，将样品采集到设备中，采样以产生离子化材料(采样可以产生蒸汽/具体材料，随后通过离子化系统使其离子化)，并使样品材料离子通过检测器系统。尽管检测器系统可以检测多种离子，但是这些中的大部分将是天然组成样品的原子的离子。在一些应用中，例如，矿物质分析，如地质学或考古学应用中的矿物质分析，这可以是足够的。
在一些情况下，例如，当分析生物样品时，样品的天然元素组成可以不是适合的信息。这是因为通常所有蛋白和核酸由相同的主要成分原子组成，并因此尽管有可能将含有蛋白/核酸的区域与不含这些蛋白或核酸材料的区域相区分，但是不可能将特定的蛋白与所有其它蛋白相区分。然而，通过用在正常情况下所分析的材料中不存在或至少不大量存在的原子(例如，某些过渡金属原子，如稀土金属；有关进一步详细描述，参见以下标记部分)标记样品，可以确定样品的具体特征。与IHC和FISH一样，可以将可检测标记连接至样品(如载玻片上固定的细胞或组织样品)上或样品中的特异性靶标，特别是通过使用靶向样品上或样品中的分子的SBP，如抗体核酸或凝集素等。为了检测离子化标记，使用了检测器系统，因为它将检测来自天然存在于样品中的原子的离子。通过将检测信号与产生那些信号的已知的样品采样位置相联系，有可能产生存在于每个位置的原子(天然元素组成和任何标记原子)的图像。在其中在检测前消除样品中的天然元素组成的方面，所述图像可以仅具有标记原子。所述技术允许同时分析多个标记(也称为多路复用)，这在生物样品分析中具有极大优势。
因此，可以在本公开的实践中使用多种类型的质谱成像设备，以下将详细讨论其中的一些设备。
基于质量-检测的质谱成像设备
1.采样和离子化系统
a.激光烧蚀采样和离子化系统
激光烧蚀基分析器通常包括三个组件。第一个是用于从样品产生蒸汽和颗粒材料羽流进行分析的激光烧蚀采样系统。在可以通过检测器系统-质谱仪组件(MS组件；第三组件)检测烧蚀样品材料(包括如以下所讨论的任何可检测的标记原子)的羽流中的原子之前，样品必须离子化(和雾化)。因此，设备包括第二组件，它是使原子离子化以形成元素离子从而使得它们能够基于质/荷比被MS组件检测的离子化系统(样品材料的一些离子化可以发生在烧蚀点，但是空间电荷效应导致电荷几乎立即中和)。通过传输管，将激光烧蚀采样系统连接至离子化系统。
激光烧蚀采样系统
简言之，激光烧蚀采样系统的组件包括发射导向样品上的激光照射束的激光源。将样品置于激光烧蚀采样系统的室(样品室)内的台上。所述台通常是平移台，因此样品可以相对于激光照射束移动，借此可以对样品上的不同位置采样进行分析。如以下更详细地讨论的，气体流过样品室，并且气流将激光源烧蚀样品时所产生的气溶胶化材料的羽流带走进行分析并基于其元素组成(包括标记原子，如来自元素标签的标记原子)构建样品图像。如以下进一步解释的，在替代作用模式中，激光烧蚀采样系统的激光系统还可以用于使材料从样品解吸。
对于生物样品(细胞、组织切片等)，具体地，样品通常是不均匀的(尽管不均匀样品在本公开的其它应用领域中是已知的，即非生物性质的样品)。不均匀样品是含有由不同材料组成的区域的样品，并且样品的一些区域可以在低于其它的阈值注量下在给定波长烧蚀。影响烧蚀阈值的因素是材料的吸收系数和材料的机械强度。对于生物组织，吸收系数将具有主要影响，因为它可以随激光照射波长而变化几个数量级。例如，在生物样品中，当使用纳秒激光脉冲时，含有蛋白质材料的区域将在200-230nm波长范围内更易于吸收，而主要含有DNA的区域将在260-280nm的波长范围内更易于吸收。
有可能以样品材料的烧蚀阈值附近的注量实施激光烧蚀。通常，以这种方式烧蚀改善了气溶胶形成，其反过来可以帮助改善分析后的数据质量。通常，为了获得最小的弹坑(crater)，为了使所得图像的分辨率最高，使用了高斯射束。跨过高斯射束的横截面记录了具有高斯分布的能量密度谱图。在那种情况下，所述束的注量随距中心的距离而改变。因此，烧蚀光斑尺寸是双参数函数：(i)高斯射束束腰(1/e2)和(ii)所应用的注量和阈值注量之间的比值。
因此，为了确保每次烧蚀激光脉冲一致除去可重复的量的材料并因此使图象数据质量最优，维持一致的烧蚀直径将是有用的，其反过来表示调整激光脉冲所提供给靶标的能量与要烧蚀的材料的烧蚀阈值能量的比值。这一要求代表了当烧蚀不均匀样品(其中整个样品的阈值烧蚀能量不同)时的问题，如其中DNA和蛋白材料的比值不同的生物组织或者地质学样品，其中它随着样品区域中的矿物质的具体组成改变。为了解决该问题，可以将不止一种激光照射波长聚焦至样品上的相同烧蚀位置，以更有效地基于该位置的样品组成烧蚀样品。
激光
一般地，用于样品烧蚀的激光的波长和功率的选择可以遵循细胞分析中的正常使用。激光必须具有足够的注量以烧蚀至所期望的深度，同时不会显著烧蚀样品载体。0.1-5J/cm2之间的激光注量通常是适合的，例如，3-4J/cm2或者约3.5J/cm2，并且激光将理想地能够通过该注量产生200Hz或更大速率的脉冲。在一些情况下，来自该激光的单一激光脉冲应足以烧蚀细胞材料对于分析，从而激光脉冲的频率与产生烧蚀羽流的频率相匹配。通常，作为对于生物样品成像有用的激光，激光应产生持续时间低于100ns(优选地低于1ns)的脉冲，其可以聚焦至例如以下所讨论的具体光斑尺寸。在本发明的一些实施方式中，烧蚀速率(即激光烧蚀样品表面上的光斑的速率)为200Hz或更大，如500Hz或更大，750Hz或更大，1kHz或更大，1.5kHz或更大，2kHz或更大，2.5kHz或更大，3kHz或更大，3.5kHz或更大，4kHz或更大，4.5kHz或更大，5kHz或更大，10kHz或更大，100kHz或更大，1MHz或更大，10MHz或更大或者100MHz或更大。多种激光具有超过激光烧蚀频率的重复速率，并因此根据情况，适当的组件，如脉冲选择器等可以用于控制烧蚀速率。因此，在一些实施方式中，激光重复速率为至少1kHz，如至少10kHz，至少100kHz，至少1MHz，至少10MHz，约80MHz或者至少100MHz，任选地其中采样系统还包括脉冲选择器，如其中通过也控制样品台的移动的控制模块控制脉冲选择器。在其它情况下，多个小间距脉冲群(例如，一列3个小间距脉冲)可以用于烧蚀一个单一光斑。举例来说，可以通过在每个光斑使用100个由3个小间距脉冲所组成的群烧蚀10×10μm的区域；这对于具有有限烧蚀深度的激光，例如，飞秒激光可以是有用的，并且可以产生连续的烧蚀细胞材料羽流，而不会损失分辨率。
例如，激光系统的烧蚀频率在200Hz-100MHz，200Hz-10MHz，200Hz-1MHz，200Hz-100kHz的范围内，在500-50kHz的范围内或者在1kHz-10kHz的范围内。
在这些频率下，如果期望单独分辨每个烧蚀羽流(如下所述，当在样品射出脉冲群时，这可能不一定是所期望的)，则仪器必须能够足够快速地分析烧蚀材料以避免连续烧蚀之间的显著信号重叠。优选地，来源于连续羽流的强度信号之间的重叠为<10％，更优选地<5％，并且理想地<2％。羽流分析所需的时间将基于样品室的冲洗时间(参见以下样品室部分)，羽流气溶胶转移至并通过激光离子化系统的时间和分析离子化材料所花的时间。可以将每个激光脉冲与随后构建的样品图像上的像素相关，如以下更详细地讨论的。
在一些实施方式中，激光源包括具有纳秒脉冲持续时间的激光或超快激光(脉冲持续时间1ps(10-12s)或更快的激光，如飞秒激光。超快脉冲持续时间提供了一些优势，因为它们限制了来自烧蚀区的热传递，并借此提供了更准确和可靠的烧蚀弹坑，并且使来自每个烧蚀事件的碎片散布最小。
在一些情况下，将飞秒激光用作激光源。飞秒激光是发射持续时间低于1ps的光学脉冲的激光。这些短脉冲的产生通常使用了被动锁模技术。可以使用一些类型的激光产生飞秒激光。可以使用被动锁模固态体激光器实现典型的30fs至30ps之间的持续时间。类似地，以该方式运行多种二级管泵浦激光器，例如，基于掺钕或掺镱增益介质。具有先进色散补偿的钛-蓝宝石激光器特别适合于低于10fs，在极个别情况下低至约5fs的脉冲持续时间。在大多数情况下，脉冲重复速率在10MHz至500MHz之间，尽管对于高脉冲能量，存在重复速率为几兆赫的低重复速率形式(得自例如Lumentum(CA,USA)、Radiantis(西班牙)、Coherent(CA,USA))。这类激光器可以从提高脉冲能量的放大器系统开始。
还存在多种类型的超快纤维激光器，在大多数情况下，它们也是被动锁模的，通常提供50至500fs之间的脉冲持续时间和10至100MHz之间的重复速率。这些激光器可商购自例如NKT Photonics(丹麦；先前为Fianium)、Amplitude Systems(法国)、Laser-Femto(CA,USA)。还可以通过通常处于集成纤维放大器形式的放大器来提高这类激光器的脉冲能量。
一些锁模二极管激光器可以产生具有飞秒持续时间的脉冲。直接在激光输出处，脉冲持续时间通常为约几百飞秒(可得自例如Coherent(CA,USA))。
在一些情况下，使用皮秒激光器。已在以上段落中讨论的多种类型的激光器还可以适合于产生皮秒范围持续时间的脉冲。最常见的来源是主动或被动锁模固态体激光器，例如，被动锁模Nd-掺杂YAG、玻璃或钒酸盐激光器。同样地，皮秒锁模激器和激光二极管是可商购的(例如，NKT Photonics(丹麦)、EKSPLA(立陶宛))。
纳秒脉冲持续时间激光器(增益开关和Q开关)还可以在具体设备装置(Coherent(CA,USA)、Thorlabs(NJ,USA))中获得应用。
作为另外一种选择，可以使用连续波激光器，其外部调制以产生纳秒或短持续时间脉冲。
通常，在本文所讨论的激光系统中用于烧蚀的激光束具有100μm或更小，如50μm或更小，25μm或更小，20μm或更小，15μm或更小或者10μm或更小，如约3μm或更小，约2μm或更小，约1μm或更小，约500nm或更小，约250nm或更小的光斑尺寸(即在采样位置)。称为光斑尺寸的距离对应于束的最长内部尺寸，例如，对于圆束，它是光束直径，对于正方形束，它对应于对角间对角线的长度，对于四边形，它是最长对角线的长度等(如上所述，将具有高斯分布的圆束直径定义为注量降低至峰值注量的1/e2倍处的点之间的距离)。作为高斯射束的替代，可以使用射束成形和射束遮拦以提供所期望的烧蚀光斑。例如，在一些应用中，具有平顶(top hat)能量分布的正方形烧蚀光斑可以是有用的(即与高斯能量分布相反，具有附近均一注量的束)。这种布置降低了烧蚀光斑尺寸对高斯能量分布峰值注量和阈值注量之间比值的依赖。接近于阈值注量的烧蚀提供了更可靠的烧蚀弹坑产生并且控制了碎片产生。因此，激光系统可以包括布置在高斯射束中的射束遮拦和/或射束成形组件，如衍射光学元件，以使射束再成形并产生具有均一或接近均一的注量的激光焦点，如整个射束的注量改变小于±25％，如小于±20％、±15％、±10％或小于±5％。有时，激光束具有正方形横截面形状。有时，射束具有平顶能量分布。
当用于分析生物样品时，为了分析各个细胞，所使用的激光束的光斑尺寸将取决于细胞的尺寸和间距。例如，当细胞彼此紧密包装(如在组织切片中)时，激光系统中的一个或多个激光源可以具有不大于这些细胞的光斑尺寸。该尺寸将取决于样品中具体的细胞，但是通常激光光斑将具有小于4μm，例如，约3μm或更小，约2μm或更小，约1μm或更小，约500nm或更小，约250nm或更小或者300nm至1μm之间的直径。为了以亚细胞分辨率分析给定细胞，所述系统使用了不大于这些细胞的激光光斑尺寸，并且更具体地使用了可以以亚细胞分辨率烧蚀材料的激光光斑尺寸。有时，可以使用大于细胞尺寸的光斑尺寸进行单细胞分析，例如，当细胞在载玻片上铺展时(细胞间存在间距)。在本文中，可以使用较大的光斑尺寸并实现单细胞鉴定，因为所关心的细胞周围的其它烧蚀区域不包括其它细胞。因此，可以基于要分析的细胞尺寸，适当地选择所使用的具体光斑尺寸。在生物样品中，细胞将很少全部具有相同尺寸，并因此如果需要亚细胞分辨率成像，则烧蚀光斑尺寸应小于最小的细胞，如果在整个烧蚀程序期间维持恒定的光斑尺寸的话。可以使用激光束聚焦实现小光斑尺寸。1μm的激光光斑尺寸对应于1μm的激光器焦点(即所述束的焦点处的激光束直径)，但是激光器焦点可以由于能量在靶标上的空间分布(例如，高斯射束形状)和相对于烧蚀阈值能量的总激光能量变化而改变+20％或更多。适合于聚焦激光束的物镜包括反射物镜，如Schwarzschild Cassegrain设计的物镜(reverse Cassegrain)。还可以使用折射物镜，也可以使用组合反映-折射物镜。单一非球面透镜也可以用于实现所要求的聚焦。固体浸没透镜或衍射光学器件也可以用于聚焦激光束。可以单独或与上述物镜组合使用的用于控制激光器光斑尺寸的另一种方式是在聚焦前使所述束通过孔。可以通过使所述束通过具有来自一系列直径的不同直径的孔来实现不同的光束直径。在一些情况下，存在具有可变尺寸的单一孔，例如，当所述孔是光阑孔时。有时，所述光阑孔是可变光阑。还可以通过光学器件的抖动实现光斑尺寸的变化。将一个或多个透镜和一个或多个孔定位在激光器和样品台之间。
为完整起见，如本领域中已知的(例如，[5])，用于亚细胞分辨率的LA的标准激光器是受激准分子或复合受激态激光器。可以使用氟化氩激光器(λ＝193nm)获得适合的结果。使用这些激光器的10-15ns的脉冲持续时间可以实现充分烧蚀。
整体上，与MS检测器的响应特性组合，选择激光脉冲频率和强度以允许清楚检测各个激光烧蚀羽流。与使用小激光焦点和具有短冲洗时间的样品室组合，快速且高分辨率成像是目前可行的。
激光烧蚀焦点
为了使激光器烧蚀来自样品的材料的效率最大，样品应相对于激光器的焦点处于适合的位置，例如，处于焦点，因为焦点是激光束将具有最小直径并因此能量最集中的位置。这可以以多种方式实现。第一种方式是样品可以沿导向它的激光的轴移动(即沿激光光路上下/朝向和远离激光源移动)至光具有足够强度以实现所期望的烧蚀的所期望的点。作为另外一种选择或另外，透镜可以用于移动激光的焦点并因此例如通过缩小，改变其在样品位置烧蚀材料的有效能力。将一个或多个透镜定位在激光器和样品台之间。可以单独或与之前两种方式之一或两者组合使用的第三种方式是改变激光器的位置。
为了辅助系统用户将样品置于对于从中烧蚀材料最适合的位置，可以将照相机对准保持样品的台(如以下更详细地讨论的)。因此，本公开提供了包括对准样品台的照相机的激光烧蚀采样系统。通过照相机所检测的图像可以聚焦至激光器所聚焦的相同点。这可以通过使用用于激光烧蚀和光学成像两者的相同物镜完成。通过使两者的焦点对准，用户可以确保当光学图像在焦点上时，激光烧蚀将是最有效的。可以通过使用压电激活器，如得自Physik Instrumente,Cedrat-technologies,Thorlabs及其它供应商的压电激活器实现所述台的精确移动以使样品处于焦点。
在其它操作模式中，使激光烧蚀通过样品载体对准样品。在这种情况下，应选择样品支持物，从而它对用于烧蚀样品的激光照射频率是(至少部分)透过的。通过样品的烧蚀可以在特定情况下具有优势，因为这种烧蚀模式可以赋予从样品烧蚀的材料羽流额外的动能，从而驱动烧蚀材料远离样品表面，因此有利于将烧蚀材料输送远离样品以用于在检测器中进行分析。同样地，还可以通过穿过载体的激光照射来介导除去样品材料段(slugs)的解吸基方法。提供给解吸材料段的额外动能可以帮助将所述段弹射远离样品载体，并因此有利于在流过样品室的载气中夹带所述段。
为了实现样品的3D-成像，可以将样品或其限定区域烧蚀至第一深度，这不是完全穿过样品。在此之后，可以将相同区域再次烧蚀至第二深度，并因此烧蚀至第三、第四深度等。以用这种方法，可以构建样品的3D图像。在一些情况下，可以优选地将所有烧蚀区域烧蚀至第一深度，然后继续烧蚀至第二深度。作为另外一种选择，可以在相同焦点进行重复烧蚀以烧蚀穿过不同深度，然后在该烧蚀区域继续至下一个位置。在两种情况下，可以通过成像软件实施在MS所得的信号向样品的位置和深度的反卷积。
用于多种操作模式的激光系统光学器件
作为常规布置，光学组件可以用于将任选地具有不同波长的激光照射对准不同的相对位置。还可以按顺序布置光学组件，从而将任选地具有不同波长的激光照射从不同方向对准样品。例如，可以将一个或多个波长从上方对准样品，并且可以将一个或多个激光照射波长(任选地不同的波长)从下方(即通过基底，如显微镜载玻片，其具有样品，也称为样品载体)对准，或者的确可以从上方和/或下方对准相同波长。这使得能够对相同设备进行多种操作模式。因此，激光系统可以包括光学组件布置，其布置以将任选地具有不同波长的激光照射从不同方向对准样品。因此，可以布置光学组件，从而所述布置将任选地具有不同波长的激光照射从相反方向对准样品。在上下文中，“相反”方向不局限于从上方和下方垂直对准样品的激光照射(这将是180°相反的)，而是包括以垂直于样品以外的角度将激光照射对准样品的布置。不要求从不同方向对准样品的激光照射是平行的。有时，当样品位于样品载体上时，可以安排反射器布置，从而将具有第一波长的激光照射直接对准样品并且将具有第二波长的激光照射穿过样品载体对准样品。
将激光照射穿过样品载体对准样品可以用于烧蚀样品。在一些系统中，然而，使激光照射穿过载体对准可以用于“LIFTing”操作模式，如以下相对于解吸基采样系统更详细地讨论的(尽管如本领域技术人员将理解的，可以通过相同设备实施烧蚀和LIFTing，并因此在本文中所谓的激光烧蚀采样系统还可以起解吸基采样系统的作用)。用于将激光照射从第一方向聚焦至样品的透镜的NA(数值孔径)可以不同于用于将激光照射(任选地，以不同波长)从第二方向聚焦至样品的透镜的NA。lifting操作(例如，其中穿过样品载体对准激光照射)通常使用具有比实施烧蚀时更大的直径的光斑尺寸。
激光烧蚀采样系统的样品室
当进行激光烧蚀时，将样品置于样品室。样品室包括台，其保持样品(通常样品位于样品载体上)。当烧蚀时，样品中的材料形成羽流，并且从气体入口至气体出口穿过样品室的气流带走了气溶胶化材料羽流，包括处于烧蚀位置的任何标记原子。气体将所述材料携带至离子化系统，所述离子化系统使所述材料离子化以使得能够通过检测器检测。可以通过检测器识别样品中的原子，包括标记原子，并因此它们的检测显示了羽流中多种靶标的存在与否，并因此确定了在样品烧蚀位置存在哪些靶标。因此，样品室在容纳所分析的固体样品中起到双重作用，而且起到了作为向离子化和检测系统输送气溶胶化材料的起点的作用。这表示穿过所述室的气流可以影响烧蚀材料羽流在穿过所述系统时如何展开。烧蚀羽流如何展开的量度是样品室的冲洗时间。该值是通过流过它的气流将来自样品的烧蚀材料带出样品室所花的时间的量度。
以这种方式从激光烧蚀产生的信号的空间分辨率(即当将烧蚀用于成像时，而不是仅用于清除，如以下所讨论的)取决于以下因素，其包括：(i)激光器的光斑尺寸，因为对总烧蚀面积积分信号；并且羽流产生的速度相对于样品相对于激光器的移动，和(ii)相对于羽流产生的速度，可以分析羽流的速度，如上所述以避免来自后续羽流的信号重叠。因此，如果期望单个分析羽流，则能够在尽可能短的时间内分析羽流使得羽流重叠的可能性最小(并因此反过来使得羽流能够更频繁地产生)。
因此，具有短冲洗时间(例如，100ms或更短)的样品室对于用于本文所公开的设备和方法的使用是有利的。具有长清洗时间的样品室将限制可以产生图像的速度或将导致来源于后续样品焦点的信号之间的重叠(例如，Kindness等人(2003；Clin Chem 49:1916-23)，其具有超过10秒的信号持续时间)。因此，气溶胶冲洗时间是实现高分辨率，但不提高总扫描时间的重要限制因素。冲洗时间≤100ms的样品室在本领域中是已知的。例如，Gurevich&
Figure BDA0003056852520000861
(2007；J.Anal.At.Spectrom.,22:1043-1050)公开了冲洗时间小于100ms的样品室。在Wang等人(2013；Anal.Chem.85:10107-16)(还参见WO 2014/146724)中公开了样品室，其具有30ms或更短的冲洗时间，借此允许高烧蚀频率(例如，大于20Hz)并因此允许快速分析。在WO 2014/127034中公开了另一种这种样品室。WO 2014/127034中的样品室包括配置以可操作地布置在靶标附近的样品捕获池，所述样品捕获池包括：具有在捕获池表面中形成的开口的捕获腔，其中所述捕获腔配置以穿过所述开口接收从激光烧蚀位点和在所述捕获腔内暴露且配置以将载气流在所述捕获腔内从入口导向至出口的导流壁喷射或产生的靶标材料，从而使得在所述捕获腔内接受的靶标材料中的至少一部分作为样品可转移至出口。WO 2014/127034的样品室中的捕获腔的体积小于1cm3并且可以小于0.005cm3。有时，样品室具有25ms或更短，如20ms，10ms或更短，5ms或更短，2ms或更短，1ms或更短或者500μs或更短，200μs或更短，100μs或更短，50μs或更短或者25μs或更短的冲洗时间。例如，样品室可以具有10μs或更长的冲洗时间。通常，样品室具有5ms或更短的冲洗时间。
为完整起见，有时可以比样品室的冲洗时间更频繁地产生来自样品的羽流，并因此将所得图像涂片(例如，如果不认为最高可能的分辨率是正在进行的具体分析所必需的)。
样品室通常包括保持样品(和样品载体)并相对于激光照射束移动样品的平移台。当使用需要穿过样品载体达到样品的激光照射方向的操作模式时，例如，如在本文所讨论的lifting方法中，则保持样品载体的台也应对所使用的激光照射是透过的。
因此，可以将样品布置在当对准样品时，面对激光照射的样品载体(例如，载玻片)的侧面，从而使得从激光照射对准样品的相同侧面释放烧蚀羽流并从所述相同侧面捕获烧蚀羽流。作为另外一种选择，可以将样品布置在当对准样品时，与激光照射相反的样品载体的侧面(即激光照射在到达样品之前穿过样品载体)，从而使得从激光照射的对侧释放烧蚀羽流并从所述对侧捕获烧蚀羽流。
在烧蚀样品的多个分散区域的特定部分中具有特定用途的样品室的一个特征在于大范围移动，其中样品可以相对于激光器(其中激光束在z轴对准样品)在x和y(即水平)轴移动，其中x和y轴彼此垂直。通过在样品室内移动所述台并且在设备的激光烧蚀采样系统中保持激光器位置固定，实现了更可靠且准确的相对位置。移动范围越大，则分散的烧蚀区域可以彼此相距的距离越远。通过移动在其上放置了样品的台，样品相对于激光器移动。因此，样品台可以在样品室内具有在x和y轴至少10mm的移动范围，如在x和y轴至少20mm，在x和y轴至少30mm，在x和y轴至少40mm，在x和y轴至少50mm，如在x和y轴75mm的移动范围。有时，移动范围使得它能够在所述室内分析标准25mm乘75mm显微镜载玻片的整个表面。当然，为了使得能够实现亚细胞烧蚀，除大范围移动之外，移动应是准确的。因此，可以将所述台配置以在x和y轴上以小于10μm，如小于5μm，小于4μm，小于3μm，小于2μm，1μm或小于1μm，如小于500nm，小于200nm，小于100nm的增量移动样品。例如，可以配置所述台以将样品以至少50nm的增量移动。台的准确移动可以处于约1μm，如1μm±0.1μm的增量。可以使用可商购的显微镜台，例如，如得自Thorlabs、Prior Scientific和Applied ScientificInstrumentation。作为另外一种选择，可以基于提供所期望的移动范围和适当精细的准确移动的定位器，如来自Smaract的SLC-24定位器，从组件构建机动台。样品台的移动速度也可以影响分析速度。因此，样品台的操作速度大于1mm/s，如10mm/s，50mm/s或100mm/s。
天然地，当样品室中的样品台具有大范围移动时，样品尺寸必需适合于承受所述台的移动。因此，样品室的尺寸大小依赖于所涉及的样品的尺寸，其反过来决定了可移动的样品台的尺寸。示例性的样品室的尺寸具有10×10cm，15×15cm或者20×20cm的内室。所述室的深度可以为3cm、4cm或5cm。技术人员将能够根据本文的教导选择适当的尺寸。使用激光烧蚀采样器，用于分析生物样品的样品室的内部尺寸必须大于样品台的移动范围，例如，至少5mm，如至少10mm。这是因为如果所述室的壁过于接近所述台的边缘，则将烧蚀材料羽流从样品带走并进入离子化系统的通过所述室的载气流可以变成湍流。湍流干扰烧蚀羽流，并因此在烧蚀并携带至设备的离子化系统之后，材料羽流开始展开，而不再保持致密的烧蚀材料云。除非将烧蚀速率降低至它不再是实验中所关心的速率，否则更宽的烧蚀材料峰对通过离子化和检测系统所产生的数据具有不利影响，因为它导致产生了由于峰重叠所造成的干扰，并因此最终，产生了空间分辨率低的数据。
如上所述，样品室包括气体入口和将材料携带至离子化系统的气体出口。然而，它可以包含起到出口或入口作用的其它口以导向气体在室内的流动和/或提供进入所述室的气体混合物，如技术人员对于正在进行的具体烧蚀过程确定为适合的。
照相机
除识别对于激光烧蚀最有效的样品定位外，在激光烧蚀采样系统中包括照相机(如电荷耦合装置图象传感器基(CCD)照相机或者有源像素传感器基照相机)或者任何其它光学检测方式使得能够进行多种其它分析和技术。CCD是检测光并将其转化为可以用于产生图像的数字信息的方式。在CCD图象传感器中，存在一系列检测光的电容器，并且每个电容器代表所确定的图像上的像素。这些电容器允许进入的光子转化为电荷。然后，将CCD用于读取这些电荷，并且可以将所记录的电荷转化为图象。有源像素传感器(APS)是由含有像素传感器阵列的集成电路组成的图像传感器，每个像素含有光检测器和有源放大器，例如，CMOS传感器。
可以将照相机引入本文所讨论的任何激光烧蚀采样系统或者激光解吸电离系统。照相机可以用于扫描样品以识别特别关心的细胞或者特别关心的区域(例如，具有特定形态的细胞)或者对抗原或胞内或结构特异的荧光探针。在某些实施方式中，所述荧光探针是还包含可检测的质量标签的组织化学染色剂或抗体。一旦已识别了这些细胞，则可以将激光脉冲对准这些具体的细胞以烧蚀材料用于分析，例如在自动(其中所述系统识别并烧蚀所关心的特征/区域，如细胞)或半自动方法(其中系统用户，例如临床病理学家识别所关心的特征/区域，然后系统以自动方式烧蚀它们)中。这使得能够显著提高可以实施分析的速度，因为可以特异性烧蚀所关心的细胞，而不是需要烧蚀整个样品来分析具体细胞。就实施烧蚀所花的时间来说，并且具体地在解释来自烧蚀的数据中所花的时间(就从它构建图像来说)，这导致在分析生物样品的方法中产生了效率。从数据构建图像是成像程序中最耗时的部分之一，并因此通过使采集至来自样品相关部分的数据的数据最少，提高了整体分析速度。
照相机可以记录来自共聚焦显微镜的图象。共聚焦显微镜检查是提供了一些优势，包括降低远离焦平面的背景信息(光)干扰的能力的光学显微形式。这是通过除去离焦的光或眩光发生的。共聚焦显微镜检查可以用于评价未染色样品以用于细胞形态，或者评价细胞是分散的细胞还是细胞团块的一部分。通常，用荧光标志物特异性标记样品(如通过标记抗体或通过标记核酸)。这些荧光标志物可以用于染色特异性细胞群体(例如，表达某些基因和/或蛋白)或细胞上的特异性形态特征(如核或线粒体)并且当用适当波长的光照射时，样品的这些区域是特异性可识别的。因此，本文所述的一些系统可以包括用于激发用于标记样品的标记中的荧光团的激光器。作为另外一种选择，LED光源可以用于激发荧光团。非共聚焦(例如，广视野)荧光显微镜也可以用于识别生物样品的某些区域，但是分辨率比共聚焦显微镜检查低。
替代成像技术是双光子激发显微镜(也称为非线性或多光子显微镜)。该技术通常使用近-IR光来激发荧光团。对于每个激发事件，吸收IR光的两个光子。通过IR使组织中的散射最小化。此外，由于多光子吸收，强烈抑制背景信号。最常用的荧光团在400-500nm范围内具有激发光谱，然而用于激发双光子荧光的激光器处于近-IR范围。如果荧光团同时吸收两种红外光子，则它将吸收足够的能量以跃迁至激发态。然后，荧光团将发出单个光子，其波长取决于然后可以检测的所使用的荧光团类型。
当将激光器用于激发荧光团以用于荧光显微术时，有时这种激光器与产生用于从生物样品烧蚀材料的激光的激光器相同，但是以不足以引起从所述样品烧蚀材料的功率使用。有时，通过激光器用于烧蚀样品的波长的光激发荧光团。在其它情况下，可以使用不同的波长，例如通过产生不同的激光器的谐波以获得具有不同波长的光，或者如以上所讨论的，除了用于烧蚀样品的谐波外，利用在谐波产生系统中产生的不同的谐波。例如，如果使用Nd:YAG激光器的第四和/或第五谐波，则基波或第二至第三谐波可以用于荧光显微术。
举例来说，所述技术组合了荧光和激光烧蚀，从而有可能用缀合至荧光部分的抗体或核酸标记生物样品中的细胞核。因此，通过激发荧光标记，然后使用照相机观察并记录荧光的位置，则有可能将烧蚀激光器特异地对准核或者不包括核材料的区域。将样品分成核和胞质区域将在细胞化学领域具有具体的应用。通过使用图像传感器(如CCD检测器或有源像素传感器，例如，CMOS传感器)，有可能通过使用将荧光位置与样品的x,y坐标相关联，然后将烧蚀激光器对准该位置的控制模块(如计算机或程序化芯片)，将识别所关心的特征/区域，然后烧蚀它们的过程完全自动进行。作为该方法的一部分，通过图像传感器采集的第一图像可以具有低物镜放大率(低数值孔径)，这使得能够研究大的样品区域。在此之后，向高倍物镜的切换可以用于对准已通过高倍光学成像确定发荧光的所关心的具体特征。然后，可以通过激光器烧蚀记录发荧光的这些特征。首先使用低数值孔径透镜具有提高景深的进一步优势，因此这表示可以以比从开始使用高数值孔径透镜的筛选更大的灵敏度检测埋在样品内的特征。
在其中使用荧光成像的方法和系统中，荧光从样品至照相机的发射光路可以包括一个或多个透镜和/或一个或多个滤光器。通过包括适合于排除来自一个或多个荧光标记物的所选光谱带宽的滤光器，该系统适合于处理与来自所述荧光标记物的发射有关的色差。色差是透镜不能将不同波长的光聚焦至相同焦点的结果。因此，通过包括滤光器，光学系统中的背景降低，并且所得光学图像具有高分辨率。使到达照相机的不希望的波长的发射光的量最小的其它方式是与WO 2005/121864中所解释的系统类似，通过使用一系列设计用于通过滤光器透射的波长的光的透射和聚焦的透镜，故意利用透镜色差。
在光学技术与激光烧蚀采样的这种偶联中，高分辨率光学图像是有利的，因为光学图像的准确度决定了可以将烧蚀激光器对准以烧蚀样品的精确度。
因此，在本文所公开的一些实施方式中，本发明的设备包括照相机。可以在线使用这种照相机以识别样品的特征/区域，例如，具体的细胞，然后可以将其烧蚀(或者通过LIFTing解吸，参见下文)。
在组合了荧光分析和激光烧蚀采样两者的其它操作模式中，不再在将激光烧蚀靶向那些位置之前分析整个载玻片的荧光，而是有可能将来自激光器的脉冲在样品焦点上射出(以低能量，从而仅激发样品中的荧光部分而不是烧蚀样品)并且如果检测到预期波长的荧光发射，则可以通过在该焦点以全部能量射出激光来烧蚀该焦点处的样品，并通过检测器分析所得羽流，如下所述。这具有以下优势：维持光栅化分析模式，但是速度提高，因为有可能脉冲和测试荧光并立即从荧光获得结果(而不是花时间分析和解释来自检测器的离子数据以确定该区域是否是所关心的)，从而再次仅使得靶向重要位点进行分析。因此，通过在包含多个细胞的生物样品的成像中应用该策略，则可以实施以下步骤：(i)用一种或多种不同的标记原子和一种或多种荧光标记物标记样品中多种不同靶标分子以提供标记样品；(ii)用光照射样品的已知位置以激发一种或多种荧光标记物；(iii)观察并记录该位置是否存在荧光；(iv)如果存在荧光，则将激光烧蚀对准该位置以形成羽流；(v)对所述羽流进行电感耦合等离子体质谱和(vi)对样品上的一个或多个其它已知位置重复步骤(ii)-(v)，借此羽流中标记原子的检测使得能够构建已烧蚀区域的样品图像。
在一些情况下，可以改变样品或样品载体以包含处于特定位置的光学可检测的(例如，通过光学或荧光显微镜)部分。然后，荧光位置可以用于在所述设备中位置定位样品。这些标志物位置的使用具有应用，例如，当可以“离线”目视检查样品时，即在除了本发明的设备的一台设备中。在将具有突出显示的所关心的特征/区域的光学图像和样品转移至根据本发明的设备之前，通过即医师用对应于特定细胞的所关心的特征/区域标记该光学图像。在本文中，通过参考注释光学图像中的标志物位置，本发明的设备可以通过使用照相机识别相应荧光位置并因此计算激光脉冲位置的烧蚀和/或解吸(LIFTing)方案。因此，在一些实施方式中，本发明包含能够实施以上步骤的取向控制器模块。
在一些情况下，基于本发明的设备的照相机所采集的样品图像，可以使用本发明的设备实施所关心的特征/区域的选择。
传输管
传输管在激光烧蚀采样系统和离子化系统之间形成连接，并使得通过样品激光烧蚀所产生的样品材料的羽流从激光烧蚀采样系统传输至离子化系统。可以例如通过将适合的材料钻通以产生用于传输羽流的腔(例如，具有圆形、长方形或其它横截面的腔)来形成部分(或全部)传输管。有时，传输管具有0.2mm至3mm的范围内的内径。有时，传输管的内径可以沿其长度改变。例如，传输管的末端可以是锥形的。传输管有时具有1厘米至100厘米的范围内的长度。有时，长度不超过10厘米(例如，1-10厘米)，不超过5厘米(例如，1-5厘米)或者不超过3厘米(例如，0.1-3厘米)。有时，传输管腔沿从烧蚀系统至离子化系统的整个距离或接近整个距离是直线的。其它时间，传输管腔对于整个距离不是直线的并且改变取向。例如，传输管可以制备平缓的90度转角。这种配置使得在激光烧蚀采样系统中通过样品烧蚀所产生的羽流一开始在垂直面中移动，而传输管入口处的轴将竖直朝上，并随着它接近离子化系统而水平移动(例如，通常水平取向的ICP焰炬采取了对流冷却的优势)。传输管可以对于距通过它羽流进入或形成的入口孔至少0.1厘米，至少0.5厘米或至少1厘米的距离是直的。一般地说，通常，传输管适合于使将材料从激光烧蚀采样系统传输至离子化系统所花的时间最小化。
传输管入口，包括样品锥体
传输管包括激光烧蚀采样系统中的入口(具体地在激光烧蚀采样系统的样品室内；因此，它也代表了样品室的主要气体出口)。传输管入口接收在激光烧蚀采样系统中从样品烧蚀的样品材料，并将其传输至离子化系统。在一些情况下，激光烧蚀采样系统入口是所有气流沿传输管至离子化系统的来源。在一些情况下，从激光烧蚀采样系统接收材料的激光烧蚀采样系统入口是管壁中的孔，第二“传输”气体沿所述管从单独的传输气流入口流动(如，例如，WO2014146724和WO2014147260中所公开的)。在这种情况下，传输气体形成了显著比例的，并且在多种情况下，大部分的流向离子化系统的气流。激光烧蚀采样系统的样品室含有气体入口。气体通过该入口流入所述室内产生了通过传输管入口离开所述室的气流。该气流捕获了烧蚀材料羽流，并随着它进入传输管(通常传输管的激光烧蚀采样系统入口处于圆锥形状，因此在本文中称为样品锥体)和离开样品室进入从所述室上方通过的管中而夹带它。该管也具有从单独的传输气流入口流入所述管中的气流。包括传输气流入口、激光烧蚀采样系统入口并且开始将烧蚀样品材料朝着离子化系统携带的传输管的组件也可以称为流通池(如WO2014146724和WO2014147260中一样)。
传输气流满足至少3个作用：它将羽流朝着离子化系统的方向冲入传输管并防止羽流材料接触传输管侧壁；它在样品表面上方形成“保护区”并确保在受控气氛下进行烧蚀；和它提高了传输管中的流速。通常，捕获气体的粘度小于主要转输气体的粘度。这有助于将捕获气体中的样品材料羽流限制在传输管中心并最大程度减小激光烧蚀采样系统下游的样品材料羽流的扩散(因为在气流中心，传输速度更恒定并且是接近平的)。所述气体可以例如且无限制地为氩气、氙气、氦气、氮气或者这些的混合物。常见的转输气体是氩气。氩气特别适合于在其到达传输管壁前终止羽流扩散(并且它也将帮助改善其中离子化系统是氩气基ICP的设备中的仪器灵敏度)。捕获气体优选地为氦气。然而，可以通过其它气体，例如，氢气、氮气或水蒸汽来替代捕获气体，或者捕获气体可以含有其它气体。在25℃，氩气的粘度为22.6μPas，然而氦气的粘度为19.8μPas。有时，捕获气体是氦气并且转输气体是氩气。
如WO2014169394中所述，样品锥体的使用最大程度减小了靶标和传输管激光烧蚀采样系统入口之间的距离。由于样品与通过它捕获气体可以锥体流动的所述锥体的点之间的距离减小，这导致样品材料的捕获改善并具有较少紊流，并因此减少了烧蚀样品材料羽流的扩散。因此，传输管入口是样品锥体尖处的孔。锥体伸入样品室中。
样品锥体的任选改变是为了使其不对称。当锥体对称时，则在正中心，来自所有方向的气流中和，从而气体在样品锥体轴向上沿样品表面的整体流动为零。通过使所述锥体不对称，沿样品表面产生了非零速度，这有助于从激光烧蚀采样系统的样品室冲洗掉羽流材料。
实际上，可以使用导致在锥体轴向上沿样品表面产生非零载体气流(vector gasflow)的样品锥体的任何改变。例如，不对称锥体可以包括适合于在锥体轴向上沿样品表面产生非零载体气流的凹口或一系列凹口。不对称锥体可以包括位于锥体侧面的孔口，其适合于在锥体轴向上沿样品表面产生非零载体气流。该孔口将使围绕所述锥体的气流不平衡，借此再次在靶标处在锥体轴向上沿样品表面产生非零载体气流。锥体的侧面可以包括不止一个孔口并且可以包括一个或多个凹口和一个或多个孔口两者。凹口和/或孔口的边缘通常是光滑、磨圆或倒角的，以避免或最大程度减小紊流。
基于捕获和传输气体的选择及其流速，所述锥体的不对称性的不同取向将适合于不同情况，并且适当识别每个取向的气体和流速的组合在技术人员的能力范围内。
上述所有改变可以存在于如本发明中所使用的单一不对称样品锥体中。例如，所述锥体可以是不对称平截的并且由两个半个不同的椭圆锥体形成，所述锥体可以是不对称平截的并且包括多个孔口之一等。
因此，样品锥体适合于捕获激光烧蚀采样系统中从样品烧蚀的材料羽流。在使用中，将样品锥体可操作地布置在样品附近，例如，通过在激光烧蚀采样系统内在可移动样品载体托架上操纵样品，如上所述。如上所述，烧蚀样品材料的羽流通过样品锥体窄端的孔进入传输管。所述孔的直径可以是a)可调节的；b)尺寸能够在烧蚀羽流进入传输管时防止其扰动的；和/或c)大致等于烧蚀羽流的截面直径。
锥形管
在具有较小内径的管内，相同流速的气体以更高的速度移动。因此，通过使用具有较小内径的管，气流中所携带的烧蚀样品材料羽流可以在给定流速下更快速地传输穿过限定的距离(例如，在传输管中从激光烧蚀采样系统至离子化系统)。可以多快分析单个羽流的关键因素之一是在从其通过烧蚀产生的时间到在设备的质谱仪组件检测到其组成离子的时间(在检测器的瞬态时间)期间，有多少羽流扩散。因此，通过使用窄传输管，烧蚀和检测之间的时间减少，借此表示扩散减小，因为其中它可以发生的时间较少，其最终结果是每个烧蚀羽流在检测器的瞬态时间减小。较短的瞬态时间表示单位时间可以产生和分析更多的羽流，因此产生了高质量和/或更快速的图像。
锥形可以包括沿传输管长度的所述部分传输管的内径的逐渐变化(即管的内径是通过它所采取的横截面，其沿着从所述部分末端朝向入口(在激光烧蚀采样系统末端)至出口(在离子化系统末端)的部分减小)。通常，发生烧蚀的位置附近的管的区域具有相对宽的内径。在所述锥形之前的管的较大体积有利于限制通过烧蚀所产生的材料。当烧蚀颗粒从烧蚀焦点飞出时，它们高速移动。气体中的摩擦使这些颗粒减缓，但是羽流仍可以在亚毫米至毫米水平扩散。使距离壁的距离足够将有助于将羽流限制在气流中心附近。
如果羽流在具有窄内径的传输管的较长部分中花费较多时间，则由于宽内径部分较短(1-2mm左右)，因此它不会显著有助于整体瞬态时间。因此，将较大的内径部分用于捕获烧蚀产物，并且将较小的内径管路用于将这些颗粒快速输送至离子化系统。
窄内径部分的直径受对应于发生紊流的直径的限制。可以对圆管和已知流体计算雷诺数。通常，大于4000的雷诺数将表示湍流，并因此应避免。大于2000的雷诺数将表示过渡流(非湍流和湍流之间)，并因此也可以期望避免。对于给定气体质量流量，雷诺数与管路直径成反比。传输管的窄内径部分的内径通常比2mm更窄，例如，比1.5mm更窄，比1.25mm更窄，比1mm更窄，但是大于在管中以4升每分钟流动的氦气具有大于4000的雷诺数时的直径。
在传输管的恒定直径部分与锥形之间的过度中的粗糙或甚至尖锐的边缘可以在气流中引起紊流并通常要避免。
弃流
在更高流速，在管中发生紊流的风险升高。具体地，这是其中传输管具有小内径(例如，1mm)的情况。然而，如果使用较轻的气体，如氦气或氢气，而不是通常用作传输气流的氩气，则有可能在具有小内径的传输管中实现高速传输(高达并超过300m/s)。
高速转输所存在的问题在于它可以使烧蚀样品材料羽流通过离子化系统，但不发生可接受的程度的离子化。由于冷却气体流速升高，从而降低了焰炬末端等离子体的温度，因此离子化水平可以降低。如果样品材料羽流未离子化至适合的水平，则信息从烧蚀样品材料丢失，这是因为不可以通过质谱仪检测其组分(包括任何标记原子/元素标签)。例如，样品可以过于快速地通过ICP离子化系统中焰炬末端的等离子体，从而所述等离子体离子不具有足够的时间以作用于样品材料，从而使其离子化。可以通过在传输管出口引入弃流系统来解决由窄内径传输管中的高流动、高速传输所引起的这一问题。弃流系统适合于从传输管接收气流，并仅使该气流的一部分(包含任何烧蚀样品材料羽流的气流的中间部分)向前进入通向离子化系统的注入器(injector)。为了有利于气体在弃流系统中从传输管的分散，传输管出口可以是拉直的。
将所述弃流系统靠近离子化系统定位，从而从弃流系统通向离子化系统的管(例如，注入器)的长度较短(例如，～1cm长；与通常约数十cm，如～50cm长度的传输管的长度相比)。因此，从弃流系统通向离子化系统的管内较低的气体速度不会显著影响总传输时间，因为整体输送系统的相对较慢的部分要短得多。
在大部分布置中，不期望或者在一些情况下不可能显著提高从弃流系统到离子化系统的管(例如，注入器)的直径来作为降低气体以体积流量计的速度的方式。例如，当离子化系统是ICP时，来自弃流系统的管在ICP焰炬中心形成注入器管。当使用宽内径注入器时，信号质量降低，因为不可以将烧蚀样品材料羽流准确注入等离子体中心(它是最热的并因此是等离子体最有效离子化的部分)。1mm或甚至更窄(例如，800μm或更小的内径，如600μm或更小，500μm或更小或者400μm或更小)内径的注入器是最优选的。其它离子化技术依赖于在三维空间中的相对小体积内离子化的材料(因为仅可以在小体积中实现离子化所必需的能量密度)，并因此具有更宽内径的管表示通过所述管的大部分样品材料在其中能量密度足以使样品材料离子化的区域之外。因此，还在具有非ICP离子化系统的设备中使用从弃流系统到离子化系统的窄直径管。如上所述，如果样品材料羽流未离子化至适合的水平，则信息从烧蚀样品材料丢失，这是因为不可以通过质谱仪检测其组分(包括任何标记原子/元素标签)。
泵可以用于帮助确保弃流和进入离子化系统入口的流体之间所期望的分流比。因此，有时，弃流系统包括连接至弃流出口的泵。可以将受控限流器添加至泵以控制弃流。有时，弃流系统还包括适合于控制限流器的质量流量控制器。
当使用昂贵气体时，可以使用已知的气体纯化方法来清洁从弃流出口泵出的气体并将其循环回到相同系统中。氦气特别适合作为如上所述的输送气体，但是它是昂贵的；因此，减少氦气在系统中的损失(即当它通过离子化系统并离子化时)将是有利的。因此，有时，将气体纯化系统连接至弃流系统的弃流出口。
离子化系统
为了产生元素离子，必须使用能够使雾化样品蒸发、雾化和离子化的硬离子化技术。
电感耦合等离子体焰炬
通常，在送至质量检测器用于分析之前，将电感耦合等离子体用于使要分析的材料离子化。它是其中通过电磁感应所产生的电流提供能量的等离子源。电感耦合等离子体维持在由3个同心管组成的焰炬中，其中最内部的管被称为注入器。
提供维持等离子体的电磁能的感应线圈位于焰炬输出端周围。交变电磁场每秒将极性倒转数百万次。在两个最外层同心管之间提供氩气。通过放电引入自由电子，然后将其在交变电磁场中加速，于是它们与氩气原子碰撞并使它们离子化。在稳态，等离子体由大部分的氩气原子以及小部分的自由电子和氩气离子组成。
ICP可以保留在焰炬中，因为两个最外层管之间的气流使等离子体远离焰炬壁。在注入器(中心管)和中间管之间引入的第二氩气流使注入器不含等离子体。将第三气流在焰炬中心引入注入器。将要分析的样品通过注入器引入等离子体。
ICP可以包括内径小于2mm并且大于250μm的注入器以用于将材料从样品引入等离子体。注入器直径是指注入器邻近等离子体末端的内径。远离等离子体延伸，注入器可以具有不同的直径，例如，更宽的直径，其中通过直径的阶梯式升高或者因为注入器沿其长度是锥形的，从而实现了直径的差异。例如，注入器的内径可以在1.75mm至250μm之间，如直径在1.5mm至300μm之间，直径在1.25mm至300μm之间，直径在1mm至300μm之间，直径在900μm至300μm之间，直径在900μm至400μm之间，例如直径为约850μm。内径小于2mm的注入器的使用提供了优于具有较大直径的注入器的显著优势。该特征的一个优势在于当样品材料羽流引入等离子体时，通过窄注入器减小了质量检测器中所检测的信号瞬态(样品材料羽流是通过激光烧蚀采样系统从样品中除去的特定、蒸汽状材料云)。因此，缩短了分析样品材料羽流从它引入到ICP中进行离子化直至所产生的离子在质量检测器中被检测所花的时间。这种分析样品材料羽流所花时间的缩短使得能够在任何给定时间段内检测更多的样品材料羽流。另外，具有较小内径的注入器导致样品材料向电感耦合等离子体中心更准确的引入，其中发生了更有效的离子化(与可以更加朝向等离子体边缘引入样品材料的大直径注入器相反，其中离子化不太有效)。
ICP焰炬(Agilent、Varian、Nu Instruments、Spectro、Leeman Labs、PerkinElmer、Thermo Fisher等)和注入器(例如，来自Elemental Scientific andMeinhard)是可获得的。
其它离子化技术
电子离子化
电子离子化包括用电子束轰击气-相样品。电子离子化室包括电子源和电子阱。典型的电子束源是铼或钨丝，其通常在70电子伏能量下运行。电子离子化的电子束源可得自Markes International。电子束指向电子阱，并且平行于电子移动方向所施加的磁场导致电子以螺旋路径移动。引导气相样品通过电子离子化室并使所述样品与电子束相互作用以形成离子。电子离子化被认为是硬离子化方法，因为该方法通常导致样品分子断裂。可商购的电子离子化系统的实例包括Advanced Markus电子离子化室(Advanced MarkusElectron Ionisation Chamber)。
激光烧蚀基采样和离子化系统的任选其它组件
离子偏转器
当撞击它们的检测器表面时，质谱仪检测到离子。离子与检测器的碰撞导致电子从检测器表面释放。随着它们通过检测器，这些电子倍增(第一个释放的电子敲出检测器中的其它电子，这些电子然后撞击次级板，其进一步放大电子数目)。撞击检测器阳极的电子数目产生电流。可以通过改变施加至次级板的电压来控制撞击阳极的电子数目。电流是模拟信号，然后可以通过模拟数字转换器将其转换为撞击检测器的离子计数。当在其线性范围运行检测器时，电流可以直接与离子数目相关。可以立刻检测的离子的量具有限制(其可以表示为每秒可检测的离子数目)。在该点以上，通过撞击检测器的离子所释放的电子数不再与离子数相关。因此，这对检测器的定量能量设置了上限。
当离子撞击检测器时，其表面由于污染而受损。随着时间的推移，这种不可逆的污染损害当离子撞击检测器时，导致检测器表面释放的电子较少，其最终结果是需要更换检测器。这被称为“检测器老化”并且是MS中众所周知的现象。
因此，可以通过避免向MS中引入过量离子来延长检测器寿命。如上所述，当撞击MS检测器的离子总数超过检测上限时，信号不再像离子数低于上限时一样提供信息，因为它不再是定量的。因此，期望避免超过检测上限，因为它导致检测器加速老化，同时不产生有用的数据。
通过质谱分析大量离子涉及正常质谱中不存在的一组特殊困难。具体地，典型的MS技术包括向检测器引入低水平或恒定水平的材料，其不应接近检测上限或引起检测器加速老化。另一方面，激光烧蚀-和解吸-基技术在MS中在极短的时窗中分析了相对大量的材料：例如，来自组织样品的细胞尺度片(cell-sized patch)的离子比通常在MS中分析的少量离子要大得多。实际上，它是由烧蚀或lifting所产生的所分析的离子包对检测器有意的几乎过载。在分析事件之间，信号处于基线(接近于零的信号，因为无来自标记原子的离子从采样和离子化系统有意地进入MS；将不可避免地检测到一些离子，因为MS不是绝对真空的)。
因此，在本文所述的设备中，检测器加速老化的风险升高，因为来自用大量可检测的原子标记的离子化样品材料包的离子可以超过检测上限并损害检测器，同时不提供有用的数据。
为了解决这些问题，所述设备可以包括位于采样和离子化系统以及检测器系统(质谱仪)之间的离子偏转器，其可操作地控制离子向质谱仪的进入。在一种布置中，当离子偏转器打开时，从采样和离子化系统所接收的离子偏转(即离子路径改变并因此它们不到达检测器)，但是当所述偏转器关闭时，离子不偏转并到达检测器。如何布置离子偏转器将取决于所述设备的采样和离子化系统以及MS的布置。例如，如果通过其离子进入MS的入口不直接与离子离开采样和离子化系统的路径在一条直线上，则缺省条件下，正确布置的离子偏转器将打开，以引导离子从采样和离子化系统进入MS。当检测到认为可能使MS过载的由离子化样品材料的离子化包所产生的事件(参见下文)时，关闭离子偏转器，从而来自该事件的其余离子化材料不偏转至MS中，并且作为替代可以简单地撞击系统内表面，借此保持MS检测器的寿命。在已阻止来自损伤事件的离子进入MS后，离子偏转器回到其初始状态，借此允许来自后续离子化样品材料包的离子进入MS并得到检测。
作为另外一种选择，在其中(在正常操作条件下)在它们进入MS之前，从采样和离子化系统出现的离子方向无变化的布置中，将关闭离子偏转器，并且来自采样和离子化系统的离子将从中穿过以在MS中分析。当检测到检测器的潜在过载时，为了防止损伤，在这种配置中，打开离子偏转器，并因此使离子转向，从而它们不进入检测器以避免对检测器的损伤。
进入MS的来自样品材料离子化的离子(如通过激光烧蚀或解吸所产生的材料羽流)不全部同时进入MS，但是作为替代，作为具有符合围绕最大频率的概率分布曲线的频率的峰进入：从基线开始，首先少量离子进入MS并进行检测，然后离子频率升高至最大，接着数目再次降低并缩小至基线。可以识别可能损坏检测器的事件，因为撞击检测器的离子计数极快速增加，而不是离子在峰前缘的频率缓慢增加。
撞击TOF MS检测器(如以下所讨论的，特定类型的检测器)的离子流在离子化样品材料包中的离子分析期间不是持续的。TOF包括将离子以脉冲组定期释放到TOF MS的飞行室中的脉冲发生器。通过在已知的相同时间释放所有离子，使得能够确定飞行时间质量。用于飞行时间质量确定的离子脉冲释放之间的时间被称为TOF MS的提取(extraction)或推动(push)。推动是约微秒级的。因此，来自一个或多个来自采样和离子化系统的离子包的信号覆盖了一些推动。
因此，当在一次推动(即来自特定离子化样品材料包的离子的第一部分)内，离子计数读数从基线跳至极高计数时，则可以预测由样品材料包的离子化所产生的离子主体将更大，并因此超过检测上限。此时，可以操作离子偏转器以确保将离子的损伤主体引导远离检测器(通过激活或失活，基于系统布置，如以上所讨论的)。
基于四极的适合的离子偏转器在本领域中是可用的(例如，来自ColutronResearch Corporation和Dreebit GmbH)。
b.解吸基采样和离子化系统
解吸基分析器通常包括三个组件。第一个是用于从样品产生样品材料段进行分析的解吸系统。在可以检测解吸样品材料段中的原子(包括任何可检测的标记原子，如以下所讨论的)之前，样品必须离子化(和雾化)。因此，所述设备包括第二组件，它是使原子离子化以形成元素离子，从而使它们能够基于质/荷比被MS检测器组件(第三组件)检测的离子化系统。通过传输管将解吸基采样系统和离子化系统相连。在多种情况下，解吸基采样系统也是激光烧蚀基采样系统。
解吸采样系统
在一些情况下，从样品材料所在的样品载体解吸大质量的样品材料，同时样品不会明显崩解并且不会出现它向小颗粒的转化和/或蒸汽化(参见，例如，WO2016109825的图8和附图，其作为参考并入本文)，而不是使用激光烧蚀产生颗粒和/或蒸发的样品材料羽流。在本文中，术语段用于表示这种解吸材料(本文所讨论的样品材料包的一种特殊形式)。所述段可以具有10nm至10μm，100nm至10μm的尺寸，并且在某些情况下，1μm至100μm的尺寸。该过程可以称为样品弹射(sample catapulting)。通常，所述段表示单细胞(在此情况下，该过程可以被称为细胞弹射(cell catapulting))。
在解吸步骤之前，任选地在将样品插入所述设备之前的过程中，从样品释放的样品材料段可以是已切成用于解吸的单个段的样品部分。在分析前被分成分散的段的样品被称为结构化样品。因此，这些各个段中的每一个表示可以在所述设备中吸收、离子化和分析的样品的分散的部分。通过来自分散位点的段的分析，以与通过如上所述的激光烧蚀采样系统烧蚀的样品位置相同的方式，可以通过代表图像像素的每个段来构建图像。
可以通过多种方法制备结构化样品。例如，可以使用配置以切割生物样品的包含形貌特征的样品载体。在本文中，将生物样品应用于载体表面，这导致形貌特征切割和切断样品，其反过来导致通过所述特征之间的多个分散位点保留生物材料部分以提供结构化生物样品。作为另外一种选择，所述样品载体可以不包括这些形貌特征(实际上，平面，如显微镜载玻片，任选地官能化的，如以下所讨论的)，在这种情况下，样品可以应用于样品载体，并且可以将样品切断以限定可以被吸收用于离子化和分析的样品段。如果所述样品是组织切片，则可以通过机械工具，如刀片或压杵(stamps)实现样品的切断。作为另外一种选择，可以在相同或单独的样品制备装置中通过激光烧蚀除去要解吸的样品切片周围的材料。在某些技术中，可以通过使用聚焦电子或离子束的装置除去材料。所述聚焦电子或离子束可以通向亚部分(subsection)之间特别窄的切口(潜在地，在10nm的尺度上)，从而导致了约1μm，或者在某些情况下，100nm的像素大小。
可以从载体释放样品材料段，并且将样品材料的每个分散的部分顺序引入检测器以作为离散事件用于分析(通过以下所讨论的技术，产生图象像素)。与常规质谱细胞术或质谱中的生物样品的随机引入相反，分散材料的顺序引入的益处包括更高的样品处理速率。这是因为优选地，将段作为整个物体从样品室输送至离子化系统，并因此由于烧蚀材料羽流将处于气流(具体地，其中存在一定紊流的气流)中而不可以扩散开。
用于采样的解吸
可以通过热能、机械能、动能和任何上述的组合使样品材料从样品解吸。这类采样在生物样品分析中特别有用。
在某些情况下，可以通过热机制从样品释放样品材料。例如，样品载体表面变得足够热以解吸样品材料段。可以涂覆样品载体以有利于整体解吸过程，例如，用聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)聚合物或PMMA聚合物膜涂覆。可以通过辐射源，如激光器(如以上所讨论的激光烧蚀采样系统的激光器)提供热。施加至表面的能量应足以解吸生物材料，优选地不改变样品材料，如果它来自生物样品。可以使用任何适合的辐射波长，其可以部分取决于样品载体的吸收性质。可以用吸收激光辐射以用于转化为热的吸收剂涂覆样品载体表面或层或者其可以包含所述吸收剂。可以将辐射递送至其上放置样品的表面以外的载体表面，或者可以将其递送至携带样品的表面，如穿过载体厚度。所述加热表面可以是表面层，或者可以是样品载体的多层结构的内层。激光辐射能量的使用的一个实例是称为lifting(激光诱导向前转移；参见，例如，Doraiswamy等人,2006,Applied Surface Science,52:4743–4747；Fernández-Pradas,2004,Thin Solid Films 453-454:27–30；Kyrkis等人,在RecentAdvances in Laser Processing of Materials中,Perriere等人主编,2006,Elsivier)的技术，其中所述样品载体可以包含解吸膜层。解吸膜可以吸收辐射以导致解吸膜和/或生物样品释放(例如，在一些情况下，样品膜与生物样品一起从样品载体解吸，在其它情况下，所述膜保持连接至样品载体，而生物样品从解吸膜上解吸)。
基于用于解吸的激光器，可以在纳秒、皮秒或飞秒时间尺度上发生通过加热的解吸。
可以在通过施加电流加热的电导体层的作用下解吸样品。从中解吸样品材料的这些位点电气连接至电极并且这些位点是各个可访问的。
样品可以通过可切割的光反应性部分连接至样品载体。通过用(例如，来自光烧蚀采样系统的激光系统中的激光器的)辐射辐射可切割的光反应性部分，可以切割所述光反应性部分以释放样品材料。所述样品载体可以包含(i)将样品与样品载体偶联的可切割光反应性部分和(ii)如以上所讨论的解吸膜。在这种情况下，第一激光辐射脉冲可以用于引起光反应性部分切割，而第二激光辐射脉冲可以用于靶向解吸膜以通过lifting使样品与样品载体分离(或者通过其它方式引入的热能脉冲可以用于加热解吸膜并因此导致样品材料与样品载体分离)。所述第一和第二脉冲可以具有不同波长。因此，在一些方法(例如，包括烧蚀和解吸两者)中，样品与样品载体的分离可以包括具有不同波长的多个激光脉冲。在一些情况下，可以通过相同激光脉冲实现光反应性部分的切割和lifting。
样品载体可以包括赋予样品动能以使样品从表面释放的化学反应性物质的涂层或层。例如，化学反应性物质可以释放气体，如，例如H2、CO2、N2或氯氟烃。这些化合物的实例包括发泡剂和起泡剂，其通过加热释放气体。气体的产生可以用于赋予解吸样品材料动能，其可以改善材料释放的可重复性和方向。
样品载体可以包括经历放热反应以产生用于解吸样品材料的热的光引发化学反应剂。上述段落中讨论的，(通过激光器辐射以从载体释放样品材料段的)载体涂层，或者该载体中的特定化学键是可以通过激光辐射波长靶向的材料的实例。
可以将样品材料段将从中解吸的样品载体上的位点安装和/或偶联至MEMS装置，其配置以有利于生物材料从载体上分散的位点释放。
可以使用纳米加热器、气泡喷射、压电体、超声波、静电或任何上述的组合将样品段从分散的位点释放或解吸。
这些技术中的每一种或组合允许样品材料段从样品载体上有序分离。然而，通常，所关心的样品上的位置不代表在可以在分离中容易地解吸的分散的位点处的分散的实体，如单个细胞。相反，可以通过其它细胞或材料围绕所关心的细胞，对于它的分析是不需要或不期望的。因此，设法实施所关心的特征/区域的解吸(例如，lifting)因此可以使所关心的细胞和周围材料一起解吸。除所关心的特定特征/区域(例如，细胞)外，在解吸材料段中携带的来自样品周围区域(例如，来自已标记的其它细胞)的原子，如在元素标签(参见以下的讨论)中使用的标记原子因此可以污染所关心位置的读数。
可以在单一方法中组合烧蚀和解吸技术(如通过lifting)。例如，为了实施样品载体上的生物样品(例如，组织切片样品或细胞悬液分散系)上的所关心特征/区域(例如，细胞)的准确解吸，激光烧蚀可以用于烧蚀所关心的细胞周围的区域以将其从其它材料清除。在通过烧蚀清除周围区域后，然后可以从样品载体解吸所关心的特征/区域，并且随后使其离子化并根据标准质谱细胞术或质谱程序，通过质谱分析。根据上述讨论，任选地在已将烧蚀用于清除将解吸的位置周围的区域之后，热、光解、化学或物理技术可以用于从所关心的特征/区域解吸材料。通常，将使用lifting，将材料段与样品载体分离(例如，已用解吸膜涂覆以辅助lifting程序的样品载体，如以上对于分散的样品材料段的解吸所讨论的)。
可以在实施激光烧蚀和解吸(例如，通过lifting)之前通过另一种技术识别所关心的特征/区域。照相机(如电荷耦合装置图象传感器基(CCD)照相机或CMOS照相机或有源像素传感器基照相机)或者如以上部分中所述的任何其它光学检测方式的包括是使得对于在线和离线分析两者能够实施这些技术的一种方式。照相机可以用于扫描样品以识别特别关心的细胞或者特别关心的特征/区域(例如，具有特定形态的细胞)。一旦识别了这些位置，可以在将激光脉冲对准所关心的特征/区域周围的区域之后，提升所述位置，从而在所述位置(例如，细胞)提升前，通过烧蚀清除其它材料。该过程可以是自动的(其中系统识别，烧蚀和提升所关心的特征/区域)或者是半自动过程(其中系统用户，例如临床病理学家识别所关心的特征/区域，然后系统实施烧蚀并以自动方式提升)。这使得能够显著提高可以实施分析的速度，因为可以特异性烧蚀所关心的细胞，而不是需要烧蚀整个样品来分析具体细胞。
照相机可以记录显微镜(例如，共聚焦显微镜)的图像。识别可以通过光学显微术，例如，通过检验细胞形态或细胞大小或者基于所述细胞是否是分散的单细胞(与细胞团块成员相反)。有时，可以特异地标记所述样品以识别所关心的特征(例如，细胞)。通常，将荧光标志物用于特异性染色所关心的细胞(如通过使用标记抗体或标记核酸)，如以上相对于烧蚀目视-识别的所关心的特征/区域的方法所讨论的；为简短起见，在本文中不再完全重复该部分，但是本领域技术人员将立即理解那些方法的特征可以应用于解吸基方法并且这在本文档的技术教导内容内。在光学技术与lifting的这种偶联中，高分辨率光学图像是有利的，因为光学图像的准确度将决定可以将烧蚀激光源对准以烧蚀随后可以烧蚀的所关心的细胞周围的区域的精确度。
有时，从为了清除要解吸的位置(例如，所关心的细胞)周围区域所实施的烧蚀中未记录到数据。有时，从周围区域的烧蚀记录数据。可以得自周围区域的有用信息包括在周围细胞和细胞间环境中存在哪些靶标分子，如蛋白和RNA转录本。当实体组织样品成像时，这可以是特别关心的，其中直接细胞-细胞相互作用是常见的并且在周围细胞中表达哪些蛋白等可以是有关所关心的细胞状态的信息。
照相机
在解吸基采样系统中使用的照相机可以如以上对于激光烧蚀基采样系统所述，并且应在本文中阅读对于激光烧蚀基采样系统的照相机的讨论。
样品室
在解吸基采样系统中使用的样品室可以如以上对于激光烧蚀基采样系统所述。在其中正在进行大样品材料段采样的情况下，技术人员将理解可能需要提高气流体积以确保在气流中夹带材料段并将其携带至传输管以用于输送至离子化系统。
转输管
在解吸基采样系统中使用的样品室可以如以上对于激光烧蚀基采样系统所述。在其中正在进行大样品材料段采样的情况下，技术人员将理解所述管的腔的直径将需要处于适当尺寸以容纳任何段，而不使所述段与腔的侧面接触(因为任何接触都可能导致段的断裂和信号重叠，其中来自导致第n个解吸事件的段的原子将扩散到第n+1个或后续段的检测窗)。
解吸基系统的离子化系统
在多种情况下，以上所讨论的lifting技术包括除去相对较大的样品材料段(10nm至10μm，100nm至10μm，并且在某些情况下，1μm至100μm)，其未转化为颗粒和蒸汽材料。因此，需要能够蒸发和雾化这种相对大量的材料的离子化技术。
电感耦合等离子体焰炬
一种这种适合的离子化系统是电感耦合等离子体，如以上已在从第95页开始的部分中相对于激光烧蚀基采样和离子化系统所讨论的。
解吸基采样和离子化系统的任选其它组件
离子偏转器
在解吸基采样系统中使用的离子偏转器可以如以上对于激光烧蚀基采样系统所述。考虑到解吸基采样除去完整的大样品材料段的潜力，离子偏转器可以在这类系统中特别有用以用于保护所述检测器。
c.激光解吸/离子化系统
激光解吸/离子化基分析器通常包括两个组件。第一个是用于从样品产生离子进行分析的系统。在这种设备中，这是通过将激光束对准样品以产生离子来实现的；在本文中，将其称为激光解吸离子产生系统。可以通过检测器系统(第二组件)，例如质谱仪(以下更详细地讨论了检测器)检测这些喷射的样品离子(包括来自如以下所讨论的标记原子的任何可检测的离子)。这种技术被称为激光解吸/离子化质谱(LDI-MS)。LDI不同于以下更详细地讨论的解吸基采样系统，因为在解吸基采样系统中，样品材料作为随后离子化以形成元素离子的电荷中性材料段解吸。相反地，在本文中，由于激光对样品的辐射而直接产生离子，并且不需要单独的离子化系统。
激光解吸离子产生系统包括：激光器；用于放置样品的样品室，其中来自激光器的辐射对准所述样品；和采集从样品产生的离子并将它们导向至检测器进行分析的离子光学器件。因此，本发明提供了用于分析样品的设备，其包括：a.放置样品的样品室；b.激光器，其适合于从样品解吸和电离材料，从而形成离子；c.离子光学器件，其布置以采集通过解吸离子化所形成的离子并将其引导远离样品，并朝向检测器；和d.从所述离子光学器件接收离子并分析所述离子的检测器。在一些实施方式中，所述设备包括适合于从样品解吸和电离材料，从而形成元素离子的激光器，并且其中所述检测器接收来自所述采样和离子化系统的元素离子并分析所述元素离子。
在该方法中，一些分子达到它们从样品解吸并变成离子化的能量水平。离子可能由于激光辐射而直接作为初级离子产生，或者作为通过电荷中性物质与初级离子的碰撞(例如，质子传递、阳离子化和电子俘获)所形成的二次离子产生。在一些情况下，通过在样品制备时，添加至样品的化合物(例如，基质)辅助离子化，如以下所讨论的。
对于本领域技术人员显而易见的是，当样品成像时，除了采样质量标签外，激光解吸电离可以用于对融合参考颗粒采样。然而，还将显而易见地，将需要根据采样材料改变激光强度。因此，由于融合参考颗粒比采样的样品材料层显著更厚，因此在激光解吸电离期间可能需要高得多的激光强度以使所有参考颗粒材料解吸和离子化，以使得能够获得对应于完整融合颗粒中的所有材料的积分信号强度。作为另外一种选择，多个低能量激光发射可以在相同焦点射出以替代烧蚀穿过融合颗粒。
2.质量检测器系统
质量检测器系统的示例性类型包括四极、飞行时间(TOF)、扇形磁场、高分辨率单或多集电极基质谱仪。
分析离子化材料所花的时间将取决于用于离子检测的质量分析器的类型。例如，使用法拉第杯的仪器通常对于快速信号的分析是过于缓慢的。整体上，所期望的成像速度、分辨率和多路复用程度将决定应使用的质量分析器的类型(或相反，质量分析器的选择将决定可以实现的速度、分辨率和多路复用)。
每次仅以1个质荷比(m/Q，通常在MS中称为m/z)检测离子的质谱仪(例如，使用点离子检测器)将提供不良的成像检测结果。首先，质荷比之间切换所花的时间限制了可以确定多个信号的速度，并且第二，如果离子处于低丰度，则当仪器集中在其它质荷比时，可能会错过信号。因此，优选地使用提供基本同时检测具有不同m/Q值的离子的技术。
检测器类型
四极检测器
四极质量分析器包括4个检测器位于一端的平行杆。在一对杆和另一对杆之间施加交变RF电位和固定DC偏移电位，从而一对杆(每个杆彼此相对)具有与另一对杆相反的交变电位。将离子化样品以平行于所述杆的方向并且朝着检测器从杆中间通过。所施加的电位影响离子轨迹，从而仅具有特定质-荷比的离子将具有稳定轨迹并到达检测器。具有其它质-荷比的离子将与杆碰撞。
扇形磁场检测器
在扇形磁场质谱中，离子化样品通过曲线飞行管朝向离子检测器移动。在整个飞行管所施加的磁场导致离子偏离它们的路径。每个离子的偏转量将基于每个离子的质荷比，并因此仅一些离子将与检测器碰撞，其它离子将偏转远离检测器。在多集电极扇形场仪器中，将检测器阵列用于检测具有不同质量的离子。在一些仪器，如ThermoScientificNeptune Plus和Nu Plasma II中，扇形磁场与扇形静电场组合以提供除质荷比外，通过动能分析离子的双重-聚焦扇形磁场仪器。具体地，可以使用具有Mattauch-Herzog几何形状的那些多检测器(例如，SPECTRO MS，其可以使用半导体直接电荷检测器(semiconductordirect charge detector)在单次测量中同时记录从锂至铀的所有元素)。这些仪器可以基本同时测量多个m/Q信号。可以通过在检测器中包含电子倍增器来提高它们的灵敏度。然而，阵列扇形仪器总是适用的，因为尽管它们对检测正在增大的信号有用，但是当信号水平正在减小时，它们不太有用，并因此它们不能很好地适合于其中标记物以高度变化的浓度存在的情况。
飞行时间(TOF)检测器
飞行时间质谱包括样品入口、具有在整个加速室上所施加的强电场的加速室和离子检测器。将离子化样品分子包引入通过样品入口并进入加速室。起初，每个离子化样品分子具有相同动能，但是随着离子化样品分子加速通过加速室，它们通过它们的质量分开，其中较轻的离子化样品分子比较重的离子移动的更快。然后，当它们到达时，检测器检测到所有的离子。每个颗粒到达检测器所花的时间基于所述颗粒的质荷比。
因此，TOF检测器可以准-同时记录单个样品中的多个质量。理论上，由于它们的空间电荷特征，TOF技术并不理想地适合于ICP离子源，但事实上TOF仪器可以足够快速地和足够灵敏地分析ICP离子气溶胶，以允许可行的单细胞成像。然而，由于处理TOF加速器和飞行管中的空间电荷效应所需的折衷，TOF质谱分析仪对于原子分析来说通常是不流行的，根据本发明公开的组织成像可以通过仅检测标记原子而是有效的，并因此可以除去其它原子(例如，原子量低于100的那些)。这导致产生了在例如100-250道尔顿区域中的质量富集的低密度离子束，其可以更有效地操纵和聚集，从而有利于TOF检测并利用TOF的高光谱扫描速率。因此，可以通过TOF检测与选择样品中不常见的标记原子以及例如通过使用较高质量的过渡元素，理想地使质量高于未标记样品中所见的质量向结合来实现快速成像。因此，使用标记质量的窄窗口意味着TOF检测将用于有效成像。
合适的TOF仪器可得自Tofwerk、GBC科学仪器(例如，Optimass 9500ICP-TOFMS)和Fluidigm Canada(例如，CyTOFTM和CyTOFTM2仪器)。这些CyTOFTM仪器具有比Tofwerk和GBC仪器更大的灵敏度，并且由于它们可以快速且灵敏地检测稀土金属的质量范围中的离子(具体地，100-200的m/Q范围；参见Bandura等人(2009；Anal.Chem.,81:6813–22))，从而已知用于在质谱细胞术中的使用。因此，这些是用于本公开的优选仪器，并且它们可以用于通过本领域中已知的仪器设置进行成像，例如Bendall等人(2011；Science 332,687–696)&Bodenmiller等人(2012；Nat.Biotechnol.30:858–867)。它们的质量分析器可以在高频激光烧蚀或样品解吸的时间尺度上以高质谱采集频率准同时检测大量标志物。它们可以测量标记原子的丰度，其中每个单元(cell)的检测限为约100，从而允许灵敏构建组织样品图像。由于这些特征，质谱细胞术现在可以用于满足亚细胞分辨率的组织成像所需的灵敏度和多路复用。通过使质谱细胞术仪器与高分辨率激光烧蚀采样系统和快速渡越低分散样品室结合，有可能允许在实际的时间尺度上以高多路复用来构建组织样品图像。
TOF可以与质量指定修正器偶联。绝大多数离子化事件产生M+离子，其中已从原子中敲除了单电子。由于TOF MS的操作模式，有时存在具有一种质量(M)的离子向相邻质量(M±1)的通道中一定流失(或串道)，具体地当大量质量M的离子进入检测器时(即高离子计数，但又不高到定位在采样离子化系统和MS之间的离子偏转器将阻止它们进入MS的程度，如果设备将包括这种离子偏转器的话)。由于每个M+离子到达检测器的时间符合围绕平均值(这对于每个M是已知的)的概率分布，因此当质量M+的离子数较高时，则一些将在通常将与M-1+或M+1+离子有关的时间到达。然而，由于一旦进入TOF MS，基于质量M通道中的峰，每个离子具有已知的分布曲线，因此有可能确定质量M的离子在M±1通道中的重叠(通过与已知峰形相比较)。所述计算特别适用于TOF MS，因为在TOF MS中检测的离子的峰是不对称的。因此，有可能修正对M-1、M和M+1通道的读数，从而将所有所检测的离子正确分配至M通道。由于通过作为从样品中除去材料的技术的采样和离子化系统(如本文所公开的那些，包括激光烧蚀(或如以下所讨论的解吸))所产生的大离子包的性质，这些修正在修正成像数据中特别有用。在WO2011/098834、美国专利8723108和WO2014/091243中讨论了通过对来自TOF MS的数据去卷积，用于改善数据质量的程序和方法。
死时间修正器
如上所述，基于离子和检测器之间的碰撞以及通过离子撞击的检测器表面的电子释放，检测MS中的信号。当通过MS检测导致电子大量释放的高离子计数时，MS检测器可以变得暂时疲劳，从而对于一个或多个后续离子包，检测器的模拟信号输出暂时降低。换言之，在检测来自该离子化样品材料包的离子的过程中，离子化样品材料包中特别高的离子计数导致大量电子从检测器表面和第二倍增器中释放，这意味着当后续离子化样品材料包中的离子撞击检测器时，可用于释放的电子较少，直至检测器表面和第二倍增器中的电子得到补充。
基于对检测器行为的鉴别，有可能补偿这种死时间现象。第一步将分析通过检测器对第n个离子化样品材料包的检测所产生的模拟信号中的离子峰。可以通过峰高，通过峰面积或通过峰高和峰面积的组合确定峰的幅度。
然后，比较峰幅度以观察它是否超过预定阈值。如果幅度小于该阈值，则无需修正。如果幅度大于该阈值，则将对来自至少一个后续离子化样品材料包的数字信号进行修正(至少第(n+1)个离子化样品材料包，但是有可能对其它离子化样品材料包，如第(n+2)个、第(n+3)个、第(n+4)个等进行)以补偿由第n个离子化样品材料包所引起的检测器疲劳所造成的来自这些离子化样品材料包的模拟信号的暂时性降低。第n个离子化样品材料包的峰的幅度越大，则将需要修正的后续离子化样品材料包的峰越多并且将需要修正的幅度越大。在Stephan等人(1994；Vac.Sci.Technol.12:405)、Tyler和Peterson(2013；.SurfInterface Anal.45:475–478)、Tyler(2014；Surf Interface Anal.46:581–590)、WO2006/090138和美国专利6229142中讨论了用于修正该现象的方法，并且可以通过死时间修正器将这些方法应用于数据，如本文所述。
基于发射光谱检测的质量成像
1.采样和离子化系统
a.激光烧蚀基采样和离子化系统
可以在OES检测器-基系统中使用以上相对于质量基分析器所述的激光烧蚀采样系统。对于原子发射光谱的检测，最优选地，将ICP用于使从样品除去的样品材料离子化，但是可以使用可以产生元素离子的任何硬离子化技术。
如本领域技术人员将理解的，以上相对于避免质量基检测器过载所述的激光烧蚀基采样和离子化系统的某些任选的其它组件可能不适用于所有OES检测器-基系统并且如果不合适，技术人员将不会引入。此外，技术人员将理解尽管OES可以检测元素，但是它不可以区分元素的同位素。因此，当要区别分析靶标SBP/分析物时，应通过使用不同元素，而不是相同元素的同位素标记的试剂进行OES。
b.解吸基采样和离子化系统
可以在OES检测器-基系统中使用以上相对于质量基分析器所述的解吸-基采样系统。对于原子发射光谱的检测，最优选地，将ICP用于使从样品除去的样品材料离子化，但是可以使用可以产生元素离子的任何硬离子化技术。
如本领域技术人员将理解的，以上相对于避免质量基检测器过载所述的解吸基采样和离子化系统的某些任选的其它组件可能不适用于所有OES检测器-基系统并且如果不合适，技术人员将不会引入。
2.光检测器
光检测器的示例性类型包括光电倍增器和电荷耦合器件(CCD)。光检测器可以在通过元素质谱成像之前用于样品成像和/或识别所关心的区域。
光电倍增器包括包含光阴极、几个倍增电极和阳极的真空室。由于光电效应，在光阴极上入射的光子导致光阴极发射电子。由于二次发射过程产生倍增电子流，通过倍增电极使电子倍增，然后通过阳极检测倍增电子流以提供对光阴极上入射的电磁辐射的检测的量度。光电倍增器可得自例如ThorLabs。
CCD包含含有光敏像素阵列的硅芯片。在对光暴露期间，与像素上入射的光强度成比例，每个像素产生电荷。在暴露后，控制电路导致一系列电荷转输以产生一系列电压。然后，可以分析这些电压以产生图象。适合的CCD可得自例如Cell Biosciences。
构建图像
以上设备可以提供(通过烧蚀、离子轰击或任何其它技术)从样品除去的离子化样品材料包中的多个原子的信号。样品材料包中的原子的检测显示其在烧蚀位置存在，这是因为原子天然存在于样品中或者因为原子已通过标记试剂局限在该位置。通过从样品表面上的已知空间位置产生一系列离子化样品材料包，检测器信号显示了所述原子在样品上的位置并因此所述信号可以用于构建样品图象。通过用可分辨标记物标记多个靶标，有可能将标记原子的位置与同源靶标的位置相关联，因此所述方法可以构建复合图像，从而达到远超使用现有技术可实现的那些的多路复用水平。通过所述方法所产生的图象可以复现染色图案和如通过IFM所确定的表达给定标志物的细胞比例，借此确认所述方法对于成像的适合性。
信号向图像的汇编将使用计算机并且可以使用已知技术和软件包实现。例如，可以使用来自Kylebank Software的GRAPHIS软件包，或者还可以使用如TERAPLOT的其它软件包。使用来自如MALDI-MSI的技术的MS数据成像在本领域中是已知的，例如，Robichaud等人(2013；J Am Soc Mass Spectrom 24 5:718-21)公开了在Matlab平台上查看和分析MS成像文件的“MSiReader”界面，并且Klinkert等人(2014；Int J Mass Spectrom http://dx.doi.org/10.1016/j.ijms.2013.12.012)公开了用于快速数据搜索和2D和3D MSI数据组在完整空间和光谱分辨率中的可视化的两种软件仪器，例如，‘Datacube Explorer’程序。
可以进一步分析使用本文所公开的方法获得的图象，例如，与分析IHC结果相同的方式。例如，所述图象可以用于描绘样品内的细胞亚群，并且可以提供对于临床诊断有用的信息。类似地，SPADE分析可以用于从高维度细胞计数数据提取细胞层级，本公开提供了所述方法(Qiu等人(2011；Nat.Biotechnol.29:886–91))。
本文所公开的方法的计算机控制
还可以作为计算机程序产品提供本文所公开的方法，其包括非暂存机器可读媒介，其存储了可以用于使计算机(或者其它电子设备)程序化以实施本文所述的方法的命令。机器可读媒介可以包括但不限于硬盘、软盘、光盘、CD-ROM、DVD-ROM、ROM、RAM、EPROM、EEPROM、磁卡和光卡、固态存储器装置或适合于存储电子命令的其它类型的媒介/计算机-可读媒介。因此，本发明还提供了包含用于实施如本文所公开的方法的命令的机器可读媒介。
定义
术语“包含”涵盖了“包括”和“由…组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或者可以包括其它事物，例如，X+Y。
相对于数值x的术语“约”是任选的并且表示，例如，x+10％。
词“基本上”不排除“完全”，例如，“基本不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，可以从本公开的定义中省略单词“基本上”。
通过在室温下，以0.2M NaNO3作为洗脱液所实施的水性凝胶渗透色谱(GPC)获得分子量(Mn)和聚合物的分散指数(PDI＝Mw/Mn)。分子量参考聚乙二醇(PEG)标准品。
实施例
实施例1-在样品成像之前，融合参考颗粒的固定和采样
根据以下方法制备本发明的成像样品载体。首先，使用本领域中已知的方法在样品载体上制备脾脏样品。用SBP-质量标签标记脾脏样品(SBP靶标为αSMA、VIM、CD11b、CD45、CD4、CD68、CD20、CD8a、胶原蛋白1、CD3、组蛋白H3、DNA1、DNA3，得自Fluidigm Canada)。然后，将样品插入HTI45成像质谱细胞计数仪，并烧蚀500×500μm的区域。从成像质谱细胞计数仪除去样品载体。在单独的1.5mL离心管中，在300μL DIW中稀释2μL EQ4珠的浓缩悬浮液(1.3×1010个颗粒每ml PN：F00306，批次：X13H2302)并涡旋。然后，将2μL稀释的EQ4珠溶液移液至与脾脏样品分离的载玻片区域。将移液器尖头用于样品涂片以有利于水溶剂蒸发。然后，在显微镜下检查载玻片以确认所述珠在载玻片上各个分离。然后，将样品载体置于设定在200℃的电炉上，并将结晶皿置于载玻片顶部上方。然后，将载玻片在200℃加热10分钟。然后，从电炉除去样品载体并使其冷却。然后，使用光学显微镜再次检查参考颗粒以确认所述珠已融合至载玻片(通过参考颗粒直径的升高表示)。
实施例2-参考颗粒在样品载体上的融合对生物样品的影响
实施实验以评价参考颗粒在样品载体上的融合过程是否将影响在样品载体载玻片上所制备的生物样品。因此，根据实施例1中详细描述的方法，制备了包含样品的成像质谱校准物。然后，将所述样品负载到成像质谱细胞计数仪中并成像。采集样品图像，并且对于标记样品的质量标签中的每个标记原子检测最大信号强度。按照实施例1中所公开的方法，从仪器除去样品载体并将不包含样品的样品载体部分与参考颗粒的悬浮液接触。然后，还使用实施例1中所公开的方法，将参考颗粒融合至样品载体。在参考颗粒与样品载体融合后，将脾脏样品再次引入成像质谱细胞计数仪并再次成像。如图1所示，在样品载体加热后，观察从每个质量标签所检测的最大信号强度以保持基本恒定。这表明参考颗粒向样品载体的融合方法不会显著影响样品，从而根据本发明所述的方法制备的成像质谱校准物可以提供分离自组织的样品的准确图像，并且提供存在于样品中的分析物的拷贝数的绝对定量。
实施例3-在使用成像质谱细胞计数仪校准物的成像期间，成像质谱细胞计数仪的稳定性评价。
使用本发明的成像质谱校准物评价了成像质谱细胞计数仪的稳定性。在根据实施例1中详细描述的方法制备成像质谱校准物之后，将样品载体插入成像质谱细胞计数仪并且烧蚀6个完整的珠并计算每个融合珠的平均积分信号强度。然后，对750μm×750μm的样品区域成像，这需要约1小时的成像时间。在所述区域已成像后，烧蚀另外6个珠，并在此时计算每个融合珠的平均积分强度。然后，继续该过程，其中进一步对750μm×750μm的样品区域成像，然后烧蚀另外6个珠。因此，在成像的每个样品区域之间烧蚀6个珠，直至烧蚀了23个组织区域和24组的6个珠，这需要约24小时的总成像时间。如图2所示，在样品成像期间，对于检测器的质量通道中所检测的每种标记原子，观察到平均积分信号强度无显著变化。结果表明如何可以将本发明的成像质谱校准物用于监测成像质谱细胞计数仪的性能，在这种情况下，在24小时内未观察到仪器灵敏度的变化。此外，在24小时的时间段内，对所采样的每组珠所检测的平均积分信号强度的标准偏差小于15％，进一步表明运行期间优良的仪器稳定性。在成像运行过程期间，检测了平均积分信号强度和它们的标准偏差，如表1所列。
Figure BDA0003056852520001121
Figure BDA0003056852520001131
表1.每个融合参考颗粒(6个珠)的平均积分信号强度和成像运行期间对所采样的每组珠所检测的标准偏差。
实施例4-将EQ珠可控分散在样品载体上
研究了适合于金属掺杂珠与样品载体接触以确保所述珠中的大多数分散定位在样品上的潜在溶剂和条件。因此，在两种不同溶剂中制备了浓缩EQ4溶液(PN：F00306，批次：X13H2302)的两种稀释液。因此，将2μL浓缩EQ4珠溶液加入至200μL去离子水(DIW)中：悬浮液的表示＝DIW-1。另外，将2μL浓缩EQ4珠溶液加入至200μL乙醇(EtOH)中：悬浮液的表示＝EtOH-1。此外，将100μL DIW-1悬浮液加入至100μL DIW中。溶液的表示＝DIW-2。最终，将100μL EtOH-1悬浮液加入至100μL EtOH。溶液的表示＝EtOH-2。
然后，将2μL每种溶液移液至样品载体上(载玻片)。
对于DIW悬浮液，在将2μL DIW-1或DIW-2悬浮液移液至矩形区域中间之前，在样品载体背部画出矩形区域(～8mm×～14mm)。然后，将移液器尖头用于将水滴围绕矩形区域涂片以有利于蒸发。
对于EtOH悬浮液，在一开始将2μL EtOH-1或EtOH-2悬浮液移液至矩形底部附近，并且在将移液器尖头朝着矩形顶部移动的同时，悬浮液缓慢分配之前，在样品载体背部画出矩形区域(～8mm×～14mm)。EtOH快速蒸发。
然后，在显微镜下检查根据这些方法制备的每个载玻片以确认样品已干燥，并且所述珠在整个载玻片上足够均一地扩散，其中大部分的珠位于分散的位置，从而使得珠彼此分开。
发现所述珠在所测试的两种溶剂中的两种稀释液提供了所述珠在所述载玻片上足够均一的分布，其中大部分的珠作为单个珠分开。在将这些珠融合至载玻片后，因此可以容易地烧蚀单独定位的那些珠，从而使得能够准确定量每个融合参考颗粒的平均积分信号强度。
图3是使用上述方法在样品载体上定位的珠的光学显微镜图象。在所述珠融合至样品载体之前，采集图像。使用ImageJ Detect Circles插件，从所测量的38个珠计算出3.2μm的平均珠直径(体积＝17.2μm3)。
实施例5-将EQ4参考颗粒融合至样品载体的条件
根据实施例4中列举的方法，使用珠的EtOH-2悬浮液，制备了包含样品载体的成像质谱校准物。然后，将样品载体在设定温度范围的电炉上放置10-30分钟。加热后，从电炉除去样品载体并使其冷却。然后，在光学显微镜下检查样品载体以确定所述参考颗粒是否融合至样品载体。表2提供了对于在不同温度加热包含EQ4珠的样品载体的影响的研究结果。
Figure BDA0003056852520001141
表2-温度对样品载体上的EQ4参考颗粒的影响
实施例6-加热持续时间的影响研究
根据实施例4中列举的方法，制备了包含样品载体的成像质谱校准物。将样品载体在设定为200C的电炉上放置10、20或30分钟。加热后，从电炉除去样品载体并使其冷却。
图4显示了根据实施例3中列举的方法制备的样品载体上的珠的SEM/TEM图像，其已在175℃加热了10、20或30分钟(电炉设定在200℃)。然后，在光学显微镜下检查样品载体以确定所述参考颗粒是否融合至样品载体。当使用ImageJ Detect Circles插件观察到参考颗粒直径增加时，判断参考颗粒融合至样品载体。对每个样品载体计算参考颗粒的平均直径。发现所述珠的参考颗粒直径从加热前的平均3.2μm(体积＝17.2μm3)升高至在175℃加热10分钟后的平均5.3μm，加热20分钟后的平均8.4μm和加热30分钟后的平均12.4μm。
此外，在加热后，对样品载体确定所述珠的平均积分信号强度。发现平均积分信号强度随加热时间的升高而降低。表3中提供了结果。
Figure BDA0003056852520001151
表3-加热时间对所检测的平均最大和积分信号强度的影响。
表4提供了加热对珠直径、每个融合珠的平均积分信号强度(对于Lu175质量通道)和完全烧蚀珠所需的平均激光能量的影响比较。
Figure BDA0003056852520001152
表4-加热持续时间对珠直径、每个融合珠的平均积分信号强度和完全烧蚀珠所需的平均激光能量的影响。

Claims (135)

1.一种成像质谱校准物，包含样品载体，至少一种参考颗粒融合至所述样品载体，并且其中，所述至少一种参考颗粒包含至少一种参考原子。
2.根据权利要求1所述的成像质谱校准物，其中，所述样品载体包含至少2个融合的参考颗粒，如至少3个、至少5个、至少10个、至少50个、至少100个、至少500个、至少1000个、至少2000个、至少5,000个或至少10,000个融合的参考颗粒。
3.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，包含多于一组融合的参考颗粒，例如，其中，所述样品载体包含至少一种融合的参考颗粒的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少十个组。
4.根据权利要求3所述的成像质谱校准物，其中，至少一种融合的参考颗粒的每个组包含具有不同原子量的不同参考原子。
5.根据权利要求3所述的成像质谱校准物，其中，至少一种融合的参考颗粒的每个组包含不同量的相同参考原子。
6.根据权利要求1所述的成像质谱校准物，其中，至少一种融合的参考颗粒包含具有不同原子量的多于一种参考原子，例如，其中，所述至少一种参考颗粒包含具有不同原子量的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种不同的参考原子。
7.根据权利要求6所述的成像质谱校准物，其中，具有不同原子量的每种参考原子以不同的量存在。
8.根据权利要求6或7所述的成像质谱校准物，包含至少一种融合的参考颗粒的多于一个组，例如，至少一种融合的参考颗粒的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少十个组；其中，至少一种融合的参考颗粒的每个组包含不同量的具有不同原子量的多于一种参考原子中的每一种。
9.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，融合的参考颗粒包含n×10-5-n×105个每种类型的参考原子，如n×10-4-n×104个每种类型的参考原子，n×10-3-n×103个每种类型的参考原子，n×10-2-n×102个每种类型的参考原子或n×10-1-n×101个每种类型的参考原子；其中，n＝10,000,000-30,000,000。
10.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，所述至少一种参考颗粒总计包含1,000-300,000,000、2,000-200,000,000、5,000-175,000,000、50,000-150,000,000、100,000-125,000,000、200,000-110,000,000、1,000,000-100,000,000、10,000,000-95,000,000、30,000,000-90,000,000、40,000,000-80,000,000或50,000,000-70,000,000个参考原子。
11.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，至少一种融合的参考颗粒包含1,000-100,000,000、5,000-50,000,000、50,000-40,000,000、100,000-30,000,000、200,000-20,000,000、1,000,000-20,000,000、10,000,000-20,000,000或12,000,000-18,000,000个每种类型的参考原子。
12.根据权利要求3至11所述的成像质谱校准物，其中，所述样品载体包含至少两个离散区域，如至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少8个、至少10个离散区域，其中，每个离散区域包含至少一种融合的参考颗粒的不同组。
13.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，在连续操作下，每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度的变化在24小时内小于15％，在24小时内小于12％，小于10％，小于8％，小于5％。
14.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，融合的参考颗粒具有至少80℃的玻璃化转变温度，如至少100℃、至少120℃、至少140℃、至少160℃、至少180℃或至少200℃的玻璃化转变温度。
15.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，融合的参考颗粒包含聚酯、聚醚、聚酰胺、聚氨酯、聚苯胺、聚烯烃、聚酰亚胺、聚硅氧烷、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酰胺，还包括但不限于聚(环戊二烯)、聚(偏二氟乙烯)、尼龙、聚(四氟乙烯)、聚(二甲基硅氧烷)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚苯乙烯、聚(乙烯基吡啶)、它们的组合等。
16.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，融合的参考颗粒包含聚苯乙烯。
17.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，融合的参考颗粒包含珠。
18.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，至少一种融合的参考颗粒是金属掺杂的珠，例如，其中，所述融合的参考颗粒是金属掺杂的聚合物珠，任选地其中，所述融合的参考颗粒是金属掺杂的聚苯乙烯珠，任选地其中，所述珠为EQ4珠或DM7珠。
19.根据权利要求18所述的成像质谱校准物，其中，所述金属掺杂的聚合物珠通过分散或乳液聚合来产生。
20.根据权利要求1至17所述的成像质谱校准物，其中，至少一种融合的参考颗粒是聚合物涂覆的金属纳米颗粒。
21.根据权利要求1至17所述的成像质谱校准物，其中，至少一种融合的参考颗粒包含聚合物并且所述至少一种参考原子共价连接至所述聚合物的主链。
22.根据权利要求1至17所述的成像质谱校准物，其中，至少一种融合的参考颗粒包含聚合物，所述聚合物包含金属螯合部分。
23.根据权利要求22所述的成像质谱校准物，其中，所述金属螯合部分是：
a.具有在约1和10,000之间，如5-100、10-250、250-5,000、500-2,500或500-1,000的聚合度的聚合物；和/或
b.包含在约1和10,000之间，如5-100、10-250、250-5,000、500-2,500或500-1,000个金属螯合基团的聚合物，如其中每个金属螯合基团包含至少四个乙酸基，例如，其中，所述金属螯合基团为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或它们的组合，任选地其中，每个金属螯合基团连接至聚合物亚基，所述聚合物亚基衍生自取代的聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯或聚甲基丙烯酰胺，
c.例如，其中，方法还包括将至少一种金属参考原子负载到所述聚合物上的步骤，以产生包含含有在约1和10,000之间，如5-100、10-250、250-5,000、500-2,500或500-1,000个螯合金属参考原子的聚合物的参考颗粒。
24.根据权利要求22至23所述的成像质谱校准物，其中，所述聚合物是还包含金属螯合基团的聚苯乙烯，例如，其中，所述聚合物是聚苯乙烯-聚丙烯酸酯共聚物、聚苯乙烯-聚丙烯酰胺共聚物、聚苯乙烯-聚甲基丙烯酸酯共聚物或聚苯乙烯-聚甲基丙烯酰胺共聚物；其中，每个金属螯合基团连接至聚合物亚基，所述聚合物亚基衍生自所述聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯或聚甲基丙烯酰胺。
25.根据权利要求21至24所述的成像质谱校准物，其中，所述金属螯合部分形成颗粒上的一部分表面。
26.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，所述样品载体还包含样品。
27.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，至少一种融合的参考颗粒包含荧光标签。
28.根据权利要求27所述的成像质谱校准物，其中，所述荧光标签识别所述融合的参考颗粒。
29.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，所述至少一种参考原子具有80-250范围内的原子量。
30.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，所述至少一种参考原子选自由下述组成的组：镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥。
31.根据权利要求3至30所述的成像质谱校准物，其中，至少一种参考颗粒的每个组包含不同的编码原子。
32.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，样品载体基底选自无机和有机材料、金属、贵金属、金属氧化物、云母、二氧化硅、陶瓷、玻璃，例如，铝、纤维素、壳聚糖、铟锡氧化物(ITO)、氧化铝(Al2O3)、磁铁矿(Fe3O4)、CuOx、赤铁矿(c-Fe2O3)、锰螺旋铁氧体(MnFe2O4)、氢氧化镁(Mg(OH)2)、氧化锌(ZnO)、膦酸锆、埃洛石、蒙脱石、钢、蓝宝石、硒化镉(CdSe)、硫化镉(CdS)、砷化镓(GaAs)、云母、炭黑、金刚石、单壁碳纳米管、多壁碳纳米管或石墨烯。
33.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，所述样品载体包括载玻片，如平面显微镜载玻片。
34.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，融合的参考颗粒具有至少3μm、至少5μm、至少8μm或至少10μm的直径。
35.根据任一前述权利要求所述的成像质谱校准物，其中，融合的参考颗粒具有小于30μm、小于20μm、小于15μm或小于10μm的直径。
36.一种用于制备成像质谱细胞术校准物的方法，包括以下步骤
a.将样品载体与包含至少一种参考颗粒的悬浮液接触，其中，所述至少一种参考颗粒包含至少一种参考原子；和
b.将所述至少一种参考颗粒融合到所述样品载体上。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，步骤a)还包括使样品干燥。
38.根据权利要求36至37所述的方法，其中，将所述至少一种参考颗粒悬浮在水或乙醇、其它醇和溶剂、它们的混合物等中，任选地，悬浮在甲醇、丙醇、丁醇、乙酸或丙酮中。
39.根据权利要求36至37所述的方法，其中，所述悬浮液包含多于一组参考颗粒，例如，其中，所述悬浮液包含至少一种参考颗粒的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少十个组。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，至少一种参考颗粒的每个组包含具有不同原子量的不同参考原子。
41.根据权利要求39所述的方法，其中，至少一种参考颗粒的每个组包含不同量的相同参考原子。
42.根据权利要求36至39所述的方法，其中，所述至少一种参考颗粒包含具有不同原子量的多于一种参考原子，例如，其中，所述至少一种参考颗粒包含具有不同原子量的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或至少十种不同的参考原子。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述悬浮液包含至少一种融合的参考颗粒的多于一个组，例如，至少一种融合的参考颗粒的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少十个组；其中，至少一种融合的参考颗粒的每个组包含不同量的具有不同原子量的多于一种参考原子中的每一种。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，至少一种参考原子的每个组包含不同量的具有不同原子量的多于一种不同参考原子中的每一种。
45.根据权利要求36至44所述的方法，其中，步骤a)还包括将所述样品载体的离散区域与至少一种另外的悬浮液接触，例如，其中，步骤a)还包括将所述样品载体的离散区域与至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或至少十种另外的悬浮液接触。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，每种另外的悬浮液包含至少一种参考颗粒的一个组，其中，至少一种参考颗粒的不同组各自包含不同的参考原子。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，每种另外的悬浮液包含至少一种参考颗粒的一个组，其中，至少一种参考颗粒的不同组各自包含不同量的相同参考原子。
48.根据权利要求46所述的方法，其中，每种悬浮液包含至少一种参考颗粒的一个组，所述至少一种参考颗粒包含具有不同原子量的多于一种参考原子，例如，其中，所述至少一种参考颗粒包含两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种具有不同原子量的不同参考原子，其中，至少一种参考颗粒的每个组包含不同量的具有不同原子量的多于一种不同参考原子中的每一种。
49.根据权利要求36至48所述的方法，其中，将距所述样品载体的边缘至少1mm的所述样品载体的区域与包含至少一种颗粒的悬浮液接触，例如，距载玻片边缘至少2mm，至少3mm，至少4mm，至少10mm。
50.根据权利要求36至49所述的方法，其中，融合所述至少一种参考颗粒的步骤包括加热所述样品载体。
51.根据权利要求36至49所述的方法，其中，将所述至少一种参考颗粒与所述样品载体融合的步骤包括：在高于所述参考颗粒的玻璃化转变温度的温度下加热所述参考颗粒以及随后将所述参考颗粒冷却至低于所述参考颗粒的玻璃化转变温度。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，加热所述至少一种参考颗粒的步骤包括加热所述样品载体。
53.根据权利要求36至52所述的方法，其中，将所述至少一种参考颗粒与所述样品载体融合通过玻璃化进行。
54.根据权利要求36至48所述的方法，其中，所述至少一种参考颗粒是晶体，并且通过在高于所述参考颗粒的熔融温度的温度下加热所述样品载体来将所述参考颗粒融合至所述样品载体。
55.根据权利要求36至53所述的方法，其中，所述至少一种参考颗粒是聚苯乙烯珠，并且通过将所述样品载体加热到高于聚苯乙烯的玻璃化转变温度来实施融合所述参考颗粒的步骤。
56.根据权利要求36至55所述的方法，其中，通过将样品载体加热到至少100℃、至少120℃、至少140℃、至少150℃、至少160℃、至少180℃或至少200℃的温度来实施融合所述参考颗粒的步骤。
57.根据权利要求36至56所述的方法，其中，通过将所述样品载体加热到至少150℃或至少175℃的温度来实施融合所述参考颗粒的步骤。
58.根据权利要求51至57所述的方法，其中，加热所述样品载体，直至相对于加热之前的所述参考颗粒，所述颗粒的直径增加了至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少30％，至少50％，至少75％，至少100％或至少150％。
59.根据权利要求51至53所述的方法，其中，在高于所述参考颗粒的Tg至少10℃，如高于所述参考颗粒的Tg至少20℃、至少30℃、至少40℃、至少50℃、至少60℃、至少80℃或至少100℃进行所述样品载体的加热步骤。
60.根据权利要求36至48所述的方法，其中，将所述至少一种参考颗粒融合至所述样品载体的步骤包括：将所述至少一种参考颗粒暴露于溶剂或溶剂混合物以使所述参考颗粒部分溶剂化或溶胀。
61.根据权利要求36至50所述的方法，其中，通过利用溶剂或溶剂混合物对所述参考颗粒进行溶剂退火来实施将所述至少一种参考颗粒融合至所述样品载体的步骤。
62.根据权利要求60至61所述的方法，其中，所述溶剂或溶剂混合物处于蒸汽相。
63.根据权利要求60至62所述的方法，其中，所述溶剂或溶剂混合物具有至少2J1/2m-3/2、至少1J1/2m-3/2、至少0.6J1/2m-3/2、至少0.4J1/2m-3/2、至少0.2J1/2m-3/2、至少0.1J1/2m-3/2内的希尔德布兰德溶解度参数或基本相同的希尔德布兰德溶解度参数。
64.根据权利要求36至63所述的方法，其中，所述方法还包括在所述样品载体上制备样品的步骤，所述步骤包括：
i.将样品负载到所述样品载体上；
ii.用至少一种质量标签标记所述样品，其中，所述质量标签包含特异性结合对的一半和至少一种标记原子；
iii.清洗所述样品；和
iv.干燥所述样品。
65.根据权利要求64所述的方法，其中，所述样品载体还包含样品，从而在所述样品载体上制备所述样品之后实施步骤a)。
66.根据权利要求64所述的方法，其中，在所述样品载体上制备所述样品之前实施步骤a)和b)。
67.根据权利要求36至66所述的方法，其中，所述样品载体包括载玻片，如平面显微镜载玻片。
68.一种用于监测仪器性能的方法，包括：
a.提供成像质谱细胞术校准物，所述成像质谱细胞术校准物包含样品载体，至少一种参考颗粒融合至所述样品载体，其中，至少一种融合的参考颗粒包含至少一种标记原子，
b.确定每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度，和
c.通过采样和检测元素组成和量，监测每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度。
69.根据权利要求68所述的方法，其中，通过对来自至少一种融合的参考颗粒的样品材料进行采样和离子化来确定所述积分信号强度；其中，采样和离子化包括激光烧蚀，以及随后的样品材料的单独离子化，如在ICP中，以形成样品离子。
70.根据权利要求69所述的方法，其中，通过烧蚀完整的融合的参考颗粒来确定每个融合的参考颗粒的所述积分信号强度。
71.根据权利要求69至70所述的方法，其中，在步骤b)和c)中计算每个参考颗粒的平均积分信号强度包括：烧蚀所述至少一种融合的参考颗粒，例如，其中，计算每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度包括：烧蚀至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少十个或至少二十个融合的参考颗粒，并计算它们的平均积分强度。
72.根据权利要求69至71所述的方法，其中，步骤c)包括至少每10分钟、至少每30分钟、至少每40分钟、至少每60分钟、至少每90分钟、至少每120分钟或至少每300分钟烧蚀至少一种融合的参考颗粒以获得每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度。
73.根据权利要求69至72所述的方法，其中，步骤b)和c)还包括使用照相机来识别待采样和离子化的所述融合的参考颗粒。
74.根据权利要求69至73所述的方法，其中，激光器的光斑尺寸小于所述至少一种融合的参考颗粒的平均最长直径，例如，其中，所述光斑尺寸的直径是珠的平均最长直径尺寸的小于0.8倍，如小于0.5倍，小于0.4倍，小于0.3倍，小于0.2倍或小于0.1倍。
75.根据权利要求69至74所述的方法，其中，通过质谱仪检测所述样品离子，例如，通过四极检测器、扇形磁场检测器、飞行时间(TOF)检测器或串联质谱检测器检测所述样品离子。
76.根据权利要求69至75所述的方法，其中，通过发射光谱仪(OES)检测所述样品离子。
77.根据权利要求68至76所述的方法，其中，所述样品载体还包括含有至少一种质量标签的样品，并且在对所述样品进行数据采集之前进行步骤b)，例如，其中，步骤b)是每个融合的参考颗粒的初始平均积分信号强度。
78.根据权利要求68至77所述的方法，其中，在所述样品成像期间监测每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度。
79.根据权利要求68至78所述的方法，其中，在样品成像期间对参考颗粒采样至少两次，在样品成像期间对参考颗粒采样至少三次，至少四次，至少五次，至少十次或超过十次。
80.根据权利要求68至79所述的方法，其中，实施样品成像至少5小时，如至少10小时，至少15小时，至少20小时或至少24小时，至少48小时，至少72小时或至少96小时。
81.根据权利要求68至80所述的方法，其中，监测每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度超过1天，例如，至少两天，至少三天，至少四天，至少五天或至少一周。
82.根据权利要求68至81所述的方法，其中，每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度变化的检测指示仪器灵敏度的通量；例如，其中，大于50％、大于40％、大于30％、大于20％、大于15％或大于10％的每个融合的参考颗粒的平均像素强度变化的检测指示仪器灵敏度的通量。
83.根据权利要求82所述的方法，其中，测量了每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度变化
i.相对地，作为每个融合的参考颗粒的初始平均积分信号强度的百分比；或
ii.绝对地，包括每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度与校准曲线的比较。
84.根据权利要求81所述的方法，其中，仪器灵敏度的通量表示激光器或检测器的通量。
85.根据权利要求68至84所述的方法，其中，所述方法还包括归一化所述信号强度，包括以下步骤：
d.计算步骤c)中确定的每个融合的参考颗粒的平均像素强度与步骤b)中确定的每个融合的参考颗粒的平均像素强度的比率，和
e.将步骤d)中计算的比率乘以所检测的检测器强度。
86.根据权利要求85所述的方法，其中，实施所述信号强度的归一化
i.在单个样品成像期间；和/或
ii.在不同样品成像期间。
87.根据权利要求85至86所述的方法，其中，对于质量通道检测归一化所述信号强度；例如，其中，对于镧系，如铈、铕、钬和/或镥的检测归一化检测器强度。
88.根据权利要求87所述的方法，其中，对于与从样品采样和离子化的质量标签中的至少一种标记原子的原子量最接近的质量通道归一化所述信号强度，例如，其中，对于与从样品采样和离子化的所述质量标签中的所述至少一种标记原子相同的质量通道归一化所述信号强度，或其中对于与从样品采样和离子化的质量标签中的至少一种标记原子的原子量相差小于10个原子单位、在20个原子单位内、在30个原子单位内或在40个原子单位内的质量通道归一化所述检测器强度。
89.根据权利要求87所述的方法，其中，对于与从样品采样和离子化的至少一种标记原子的强度最接近的质量通道归一化所述检测器强度。
90.至少一种参考颗粒在制备成像质谱校准物的方法中的用途，包括以下步骤：
a.提供至少一种参考颗粒，其中，所述至少一种参考颗粒包含至少一种参考原子，
b.将所述至少一种参考颗粒与样品载体接触，
c.将所述至少一种参考颗粒融合至所述样品载体。
91.根据权利要求90所述的用途，其中，通过玻璃化将所述至少一种参考颗粒融合至所述样品载体。
92.根据权利要求90所述的用途，其中，通过溶剂退火将所述至少一种参考颗粒融合至所述样品载体。
93.根据权利要求90至92所述的用途，其中，所述至少一种参考颗粒包含n×10-5-n×105个每种类型的参考原子，如n×10-4-n×105个每种类型的参考原子，n×10-3-n×103个每种类型的参考原子，n×10-2-n×102个每种类型的参考原子或n×10-1-n×101个每种类型的参考原子；其中，n＝10,000,000-30,000,000。
94.至少一种参考颗粒，用于在制备成像质谱校准物的方法中使用，其中，所述方法包括以下步骤：
a.提供至少一种参考颗粒，其中，所述至少一种参考颗粒包含至少一种参考原子，
b.将所述至少一种参考颗粒与样品载体接触，
c.将所述至少一种参考颗粒融合至所述样品载体。
95.根据权利要求94所述的至少一种参考颗粒，其中，通过玻璃化将所述至少一种参考颗粒融合至所述样品载体。
96.根据权利要求94所述的至少一种参考颗粒，其中，通过溶剂退火将所述至少一种参考颗粒融合至所述样品载体。
97.根据权利要求94至96所述的至少一种参考颗粒，其中，所述至少一种参考颗粒包含n×10-5-n×105个每种类型的参考原子，如n×10-4-n×104个每种类型的参考原子，n×10-3-n×103个每种类型的参考原子，n×10-2-n×102个每种类型的参考原子或n×10-1-n×101个每种类型的参考原子；其中，n＝10,000,000-30,000,000。
98.至少一种参考颗粒在溶剂中的悬浮液，其中，所述至少一种参考颗粒包含至少一种参考原子，其中，所述至少一种参考颗粒能够融合至样品载体。
99.根据权利要求98所述的悬浮液，其中，所述至少一种参考颗粒能够通过玻璃化融合至所述样品载体。
100.根据权利要求98所述的悬浮液，其中，所述至少一种参考颗粒能够通过溶剂退火融合至所述样品载体。
101.根据权利要求98至100所述的悬浮液，其中，所述参考颗粒以在1×106和1×1015个颗粒每ml之间的浓度存在，例如，以1×107至1×1013个颗粒每ml、1×108至1×1013个颗粒每ml、1×109至1×1012个颗粒每ml、1×109至1×1011个颗粒每ml或约1×1010个颗粒每ml的浓度存在。
102.根据权利要求98至100所述的悬浮液，其中，所述参考颗粒以在1×106和1×1015个颗粒每ml之间的浓度存在，例如，以1×107至1×1013个颗粒每ml、1×107至1×1012个颗粒每ml、1×107至1×1010个颗粒每ml、1×107至1×109个颗粒每ml或约1×108个颗粒每ml的浓度存在。
103.根据权利要求98至102所述的悬浮液，其中，每种参考颗粒包含多于一种不同的参考原子，如至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或至少十种不同类型的参考原子。
104.根据权利要求98至103所述的悬浮液，包含多于一组参考颗粒，例如，至少两组、至少三组、至少四组、至少五组、至少六组、至少七组、至少八组或至少十组参考颗粒。
105.根据权利要求104所述的悬浮液，其中，至少一种参考颗粒的每个组包含不同浓度的每种类型的参考原子。
106.一种包含权利要求104至105所述的悬浮液的校准系列。
107.根据权利要求106所述的校准系列，包含至少一种权利要求98至103所述的悬浮液，如至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或至少十种权利要求98至103所述的悬浮液。
108.根据权利要求107所述的校准系列，其中，每种悬浮液包含含有不同数目的每种类型的参考原子的一组参考原子。
109.根据权利要求108所述的校准系列，包含含有参考颗粒的多个组的悬浮液，所述参考颗粒的多个组具有n×10-5-n×10-4个每种类型的参考原子，n×10-4-n×10-3个每种类型的参考原子，n×10-3-n×10-2个每种类型的参考原子，n×10-2-n×10-1个每种类型的参考原子，n×10-1-n×101个每种类型的参考原子，n×101-n×102个每种类型的参考原子，n×102-n×103个每种类型的参考原子，n×103-n×104个每种类型的参考原子和/或n×104-n×105个每种类型的参考原子；其中，n＝10,000,000-30,000,000。
110.权利要求106至109所述的校准系列在制备成像质谱校准物的方法中的用途，所述方法包括以下步骤：
a.将样品载体与权利要求106至109所述的校准系列接触，
b.将所述参考颗粒融合至所述样品载体。
111.一种用于制备成像质谱校准物的试剂盒，包含至少一种参考颗粒，所述至少一种参考颗粒包含至少一种参考原子，其中，所述至少一种参考颗粒能够融合至样品载体。
112.根据权利要求111所述的试剂盒，其中，所述至少一种参考颗粒悬浮在溶剂中。
113.试剂盒，包含权利要求104至105所述的悬浮液。
114.试剂盒，包含权利要求106至109所述的校准系列，其中，所述校准系列中的每种悬浮液与另一种悬浮液分开。
115.根据权利要求111至114所述的试剂盒，还包括将至少一种颗粒融合至样品载体的说明书。
116.一种用于监测仪器性能的方法，包括：
a.提供了包含样品载体的第一成像质谱细胞术校准物，所述样品载体包含第一样品和至少一种融合的参考颗粒，
b.对第一成像质谱校准物上的至少一种融合的参考颗粒采样，
c.针对至少一种融合的颗粒，确定每个融合的颗粒的平均积分信号强度，
d.提供包含样品载体的至少一种另外的成像质谱细胞术校准物，所述样品载体包含第二样品和相同的至少一种融合的参考颗粒，
e.对第二成像质谱校准物上的至少一种融合的参考颗粒采样，
f.针对至少一种融合的颗粒，确定每个融合的颗粒的平均积分信号强度，
g.将步骤b)和d)中所检测的平均积分信号强度的绝对强度进行比较，
h.将所述信号强度归一化。
117.根据权利要求116所述的方法，其中，在步骤c)和d)之间，所述方法还包括使用成像质谱细胞术使所述第一样品成像的步骤，并且在步骤f)和g)之间，所述方法还包括使所述第二样品成像的步骤。
118.根据权利要求116所述的方法，其中，重复对所述至少一种融合的参考颗粒进行采样和使所述样品成像的步骤直至使整个样品成像。
119.一种用于校准成像质谱细胞计数仪的方法，包括以下步骤：
a.提供成像质谱细胞术校准物，所述校准物包含样品载体，至少一种参考颗粒融合至所述样品载体，其中，所述至少一种参考颗粒包含至少一种标记原子，
b.对至少一种融合的参考颗粒进行采样；和
c.确定每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度。
120.根据权利要求119所述的方法，其中，相对于所述至少一种融合的参考颗粒的预期平均积分信号强度，比较所述平均积分信号强度并使其标准化。
121.根据权利要求120所述的方法，其中，所述至少一种融合的参考颗粒包含多于一种不同的参考原子，如至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或至少十种不同类型的参考原子。
122.根据权利要求121所述的方法，其中，所述样品载体包含多于一种融合的参考颗粒，例如，其中，所述样品载体包含至少一种融合的参考颗粒的两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个组；其中，至少一种融合的参考颗粒的每个组包含不同数目的每种类型的参考原子。
123.根据权利要求122所述的方法，还包括以下步骤：
d.从至少一种融合的参考颗粒的每个组对至少一种融合的参考颗粒进行采样；
e.确定每个组的每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度；
f.绘制校准曲线。
124.根据权利要求121至123所述的方法，其中，将至少一种参考颗粒的不同组置于所述样品载体的离散区域上，例如至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个离散区域。
125.根据权利要求119至124所述的方法，其中，通过对至少一种融合的参考颗粒的材料进行采样和离子化来确定每个融合的参考颗粒的平均像素强度；其中，采样和离子化包括激光烧蚀，以及随后的烧蚀材料的单独离子化，如在ICP中，以形成样品离子。
126.根据权利要求125所述的方法，其中，通过质谱仪检测所述样品离子，例如，通过四极检测器、扇形磁场检测器、飞行时间(TOF)检测器或串联质谱检测器检测所述样品离子。
127.根据权利要求125所述的方法，其中，通过发射光谱仪(OES)检测所述样品离子。
128.根据权利要求122至127所述的方法，其中，每组参考颗粒包括不同的荧光标签；所述方法还包括照射所述荧光标签以使它发荧光并基于它的荧光识别至少一种参考颗粒的特定组的步骤。
129.根据权利要求122至127所述的方法，其中，所述至少一种参考颗粒包含至少一种编码原子，其中，所述编码原子识别所述参考颗粒，其中，所述方法还包括检测所述编码原子并识别至少一种参考颗粒的组的步骤。
130.一种使样品成像的方法，包括以下步骤
a.提供成像质谱细胞术校准物，所述校准物包含样品载体，至少一种参考颗粒融合至所述样品载体，其中，至少一种融合的参考颗粒包含至少一种参考原子，并且其中，所述样品在所述样品载体上，
b.将所述样品与包含至少一种质量标签的溶液接触，其中，所述至少一种质量标签包含至少一种标记原子，
c.清洗所述样品，
d.干燥所述样品，
e.对至少一种融合的参考颗粒进行采样，
f.确定每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度，
g.对所述样品进行成像质谱细胞术以获得图像。
131.根据权利要求130所述的方法，其中，对所述样品实施成像质谱细胞术的步骤包括：对所述样品进行采样以确定一种或多种标记原子的水平，其中，所述一种或多种标记原子的水平对应于所述样品中一种或多种分析物的拷贝数。
132.一种使样品成像的方法，包括以下步骤
a.提供样品载体上的样品，
b.制备成像质谱细胞术校准物，其中，所述成像质谱细胞术校准物包含所述样品载体上的样品，其中，所述样品载体具有融合至其的至少一种参考颗粒，其中，至少一种融合的参考颗粒包含至少一种参考原子，
c.将所述样品与包含至少一种质量标签的溶液接触，其中，所述至少一种质量标签包含至少一种标记原子，
d.清洗所述样品，
e.干燥所述样品，
f.对至少一种融合的参考颗粒进行采样，
g.确定每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度，
h.对所述样品进行成像质谱细胞术以获得图像。
133.根据权利要求132所述的方法，其中，对所述样品实施成像质谱细胞术的步骤包括：对所述样品进行采样以确定一种或多种标记原子的水平，其中，所述一种或多种标记原子的水平对应于所述样品中一种或多种分析物的拷贝数。
134.权利要求1至34所述的校准物在校准质谱细胞术的方法中的用途，包括以下步骤：
a.提供权利要求1至34所述的成像质谱细胞术校准物，
b.对至少一种融合的参考颗粒进行采样，
c.确定每个融合的参考颗粒的平均积分信号强度。
135.权利要求1至34所述的成像质谱细胞术校准物在使样品成像的方法中的用途，包括以下步骤：
a.提供权利要求1至34所述的成像质谱细胞术校准物，其中，所述校准物还包含含有至少一种质量标签的样品，
b.对所述样品进行成像质谱细胞术以获得图像。
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