CN114599968A - 改进型质谱流式细胞术 - Google Patents

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Abstract

本发明的实施方式涉及用新的激光电离系统代替早先的基于ICP的电离系统，提供了改进的基于质谱仪的设备和使用该设备来分析样品的方法，尤其是质谱分析法、质谱流式细胞术、成像质谱分析法和成像质谱流式细胞术在分析生物样品中的用途。因此，本发明的实施方式提供了一种设备、例如质谱流式细胞仪，该设备包括：1)采样器；2)激光电离系统，以接收通过采样器从样品去除的材料，其中，激光电离系统包括电离系统导管和脉冲激光器，该脉冲激光器适于将穿过或离开电离系统导管的样品材料进行电离；以及3)质谱仪，以从所述电离系统接收元素离子并分析所述元素离子。

Description

改进型质谱流式细胞术
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年6月18日递交的美国临时申请第62/862,849号的优先权的权益，其内容通过引用合并于本文以用于所有目的。
技术领域
实施方式涉及使用质谱流式细胞术和/或元素质谱分析法对样品进行分析。
背景技术
分析单细胞(或诸如单珠的其他粒子)的能力是有用的，因为它允许群体的每个成员的特性具有其各自确定的特性。因此，该分析提供了比单一测量更强的洞察力，该单一测量仅仅是群体的每个成员特性的平均值。
荧光激活细胞分类器(fluorescence activated cell sorter,FACS)可以通过当细胞或粒子穿过激光束时对细胞或粒子进行扫描来测定细胞或粒子的特性。通过利用对细胞成分(例如，细胞表面上的受体和细胞核的DNA)具有特异性的荧光染料来标识细胞或粒子，当粒子或细胞横穿激发光束时，可以将标识成分的量检测为荧光。由于发射的荧光的量与结合细胞/抗原的荧光探针的量成正比，因此与荧光染料偶联的抗体惯常用作定性且定量地测量细胞表面上和细胞中的抗原的试剂。这种方法的缺陷与细胞染色方法的局限性和困难以及荧光染料的光谱重叠有关。换句话说，所检测到的荧光染料的发射并不都处于特定的波长，这意味着当使用多个标识(label)时，一些所检测到的发射的光可能会被错误地分配至不正确的标识。因此，这限制了该技术的辨识能力。
克服该问题的技术是质谱流式细胞术。与流式细胞术类似之处在于标签特异性地附接至被分析的材料。使用特异性结合配偶体(例如抗体)将标识特异性靶向至细胞或粒子上的抗原。该标识在流式细胞术和质谱流式细胞术之间是不同的。在质谱流式细胞术中，该一个或多个可检测的标识是已知特定质量的原子，通常为过渡金属，诸如稀土金属。因此，当通过MS检测到可检测的标识原子时，能够推断出特异性结合的配偶体的靶标存在于被分析的样品中。
相关技术为成像质谱流式细胞术(imaging mass cytometry,IMC)。本文中，并不是将液体悬浮液中的细胞作为悬浮液而引入质谱流式细胞仪中，而是将材料从例如组织样品的生物样品中烧蚀，并且通过质谱分析法来分析烧蚀的材料。以相同的方式，可以通过MS检测到用于标记(tag)样品上特定靶标的元素标识，并且可以推断出在烧蚀的材料中存在元素标识。通过记录在样品上执行烧蚀的位置以及检测到的元素标记的数量，能够构建样品中靶标分布的图像。类似地，如同液体样品的质谱流式细胞术，能够使用MS同时检测到许多不同的元素标记，这意味着可以执行高度多路复用(multiplexed)成像。
与此同时，还可以通过成像质谱分析法(诸如通过组织切片的激光烧蚀的ICP-MS)，来记录存在于组织自然状态中的元素的图谱。
具体实施方式
在实施方式中，例如质谱仪、质谱流式细胞仪、成像质谱仪或成像质谱流式细胞仪的设备通常包括三个核心组件。
第一个为采样器，该采样器用于将来自样品的材料引入到设备的其他组件中。在已经将材料带入到设备中之后，在样品中的原子(包括可检测的标识原子)可以由质谱仪组件(MS组件；第三组件)检测到之前，必须将样品电离。因此，设备包括第二组件，该第二组件为电离系统，该电离系统将原子电离以使得它们能够被基于质量/电荷比的MS组件检测到。因此，被带入到设备中样品由离子源电离，并且样品的离子进入MS组件中。尽管MS组件可以检测许多离子，并且在某些应用中可以适于如此操作，但是这些中的大多数将是自然构成样品的原子的离子。在一些应用(例如分析矿物质)中，诸如在地质学或考古学应用中，这是足够的。
在一些情况下，例如当分析生物样品时，样品的天然元素组成可能无法适当提供信息。这通常是因为所有蛋白质和核酸包括相同的主要构成原子，所以尽管能够区分包含蛋白质/核酸的区域与不包含此类蛋白质或核酸材料的区域，但是无法将特定的蛋白质与全部其他蛋白质区分开来。然而，通过在正常条件下用分析材料中不存在的原子标识样品，或至少是并未大量存在的(例如某些过渡金属原子，诸如稀土金属；关于进一步详细内容，参见下面关于标识的部分)，可以测定样品的特定特征。与IHC和FISH一样，可检测的标识可以附接至样品上或样品中(例如载玻片上的固定细胞或组织样品)的特定靶标，尤其是通过使用靶向样品上或样品中的分子的SBP，诸如抗体、核酸或凝集素等。为了检测到电离的标识，使用检测器系统，因为检测器系统将从天然存在于样品中的原子检测到离子。通常，在分析液体样品进行情况下，将溶液中的粒子(诸如细胞)一次一个引入到电离系统中，从而确保由MS组件检测到的原子可以分配给特定粒子，进而能够单独表征样品的每个分析部分。然而，有时，在液体样品上执行质谱流式细胞术的情况下，溶液中多个粒子被特意电离并同时被检测到。在样品为固体生物样品的情况下，诸如组织样品，则激光烧蚀通常用于从组织样品中产生材料羽流(plume)、以引入电离系统并随后通过MS组件检测离子。本文中，与在液体样品中每个粒子单独地逐个粒子分析的方式相同，从固体样品产生的每个羽流被逐个羽流地(plume-by-plume)分析。先前已经报道了通过LA-ICP-MS对生物样品进行成像，用于以细胞分辨率成像。
包括目前质谱流式细胞仪的许多目前的质谱分析法设备在将电离材料引入MS中之前、使用电感耦合等离子体(inductively coupled plasma,ICP)作为电离电离系统。将ICP保持在ICP炬管(torch)中，如图1所示。质谱仪可以分辨由电离系统产生的离子，离子以一个原子质量单位间隔开，在质量通道之间具有最小干扰。所有类型的质谱仪可以用作本文所讨论的系统的质谱仪组件，例如，飞行时间(time of flight,TOF)检测器是有用的。
本发明的实施方式涉及用新的激光电离系统代替早先基于ICP的电离系统，提供了改进的基于质谱仪的设备以及使用该设备分析样品的方法，尤其是质谱分析法、质谱流式细胞术、成像质谱分析法和成像质谱流式细胞术在分析生物样品中的用途。因此，本发明的实施方式提供了一种设备(例如质谱流式细胞仪)，该设备包括：
1)采样器；
2)激光电离系统，以接收通过采样器从样品去除的材料，其中，激光电离系统包括电离系统导管和脉冲激光器，该脉冲激光器适于将穿过或离开电离系统导管的样品材料进行电离；以及3)质谱仪，以从所述电离系统接收元素离子并分析所述元素离子。
参考图2，图2陈述了设备的一个实施方式，设备包括采样器(100)，采样器(100)提供了用于通过激光电离系统(200)进行电离的样品材料。采样器(100)与激光电离系统(200)联通，并且样品材料通过导管从采样器(100)到达激光电离系统(220)。样品材料可以为液态的和/或气态的。样品材料至少部分地沿着导管由载气(诸如载气中的气态材料云或载气中的液滴)运送。激光电离系统(200)包括电离导管(210)和激光器(220)。材料在导管(210)中由来自激光器(220)的激光(221)而电离。在一些系统中，激光器(220)为脉冲激光器，诸如飞秒激光器。电离之后，由质谱仪(300)检测离子。许多类型的质谱分析器(例如TOF检测器)适用于该设备。
样品引入
该设备的采样器可以采用许多形式，以适于被分析的样品。
当样品为液态时，则将样品引入到激光电离系统中的采样器可以为样品环。样品环用于存储由使用者手动注射到质谱流式细胞仪中的液体，并且随后泵可以将样品驱动到激光电离系统中，以进行电离以及后续的分析。液体样品通常包含粒子、例如细胞(原核或真核)或病毒，粒子被引入到激光电离系统中。在使用者希望快速将样品引入到质谱流式细胞仪中的情况下，使用环是有利的。
在本发明的实施方式的一些质谱流式细胞仪中，将自动采样器用作采样器。自动采样器自动进行将样品送入质谱流式细胞仪中以用于后续分析的过程。自动采样器为机械组件，该机械组件从系统外部的一个或多个容器中将准确体积(可以由使用者限定)的样品送入系统。因此，自动采样器使多个样品能够在无需由使用者监督系统的情况下经受质谱流式细胞术，并且比手动样品引入具有更高的准确性和可重复性。
自动采样器可商购，例如用于气相或液相色谱分析(例如，来自安捷伦(Agilent)或赛默科技(Thermo Scientific))，和流式细胞术(例如，来自智力(Intellicyt)的
Figure BDA0003495048130000041
自动采样器，或来自生命技术(Life Technologies)的Attune自动采样器等)。
在一些实施方式中，所分析的样品为固体样品，诸如地质矿物样品等或在固体基质上的生物样品(例如，如在下面更详细讨论的，诸如已经将细胞悬浮液分散到显微镜载物片上的情况下的组织切片或单层细胞或单个细胞)。通过激光烧蚀(laser ablation,LA)系统而将这些样品引入到激光电离系统中。因此，在一些实施方式中，采样器为LA系统。使用LA系统允许对样品进行成像。样品中不同靶标分子用不同标识原子进行标识，并且随后在横跨标识的组织样品的多个细胞之上执行激光烧蚀。通过将检测到的信号与产生这些信号的激光烧蚀的已知位置进行关联，该方法允许将标识的靶标分子定位到样品上的特定位置，并从而构造样品的图像。
成像设备的组件，所述成像设备诸如LA-质谱流式细胞仪
激光烧蚀采样系统
简单总结，激光烧蚀采样系统的组件包括发射激光辐射光束的激光源，该激光辐射光束被引导到样品上。样品放置在激光烧蚀采样系统中的腔室(样品腔室)内的台(stage)上。该台通常为平移台，使得可以相对于激光辐射的光束移动样品，借此可以对样品上的不同位置进行采样以进行分析。如下面更详细地讨论的，气体流过样品腔室，并且当激光源烧蚀样品时，气流将产生的气溶胶化材料的羽流带走，以基于其元素组成(包括标识原子，诸如来自元素标记的标识原子)来分析并构建样品的图像。如下面进一步解释的，在替代的作用模式中，激光烧蚀采样系统的激光器系统还可以用于从样品中解吸材料。
特别是对于生物样品(细胞、组织切片等)，样品经常为非均质的(尽管非均质样品在本公开的其他应用领域中是已知的，即非生物性质的样品)。非均质样品为包含由不同材料构成的区域的样品，并且因此样品的一些区域可以在给定波长下以比其他区域更低的阈值通量(fluence)进行烧蚀。影响烧蚀阈值的因素为材料的吸光系数和材料的机械强度。对于生物组织，吸光系数将具有显著的影响，因为它可能会随着激光辐射波长而变化几个数量级。例如，在生物样品中，当采用纳秒激光脉冲时，包含蛋白质材料的区域将在200-230nm的波长范围内更容易吸收，而主要包含DNA的区域将在260-280nm的波长范围内更容易吸收。
能够以接近样品材料烧蚀阈值的通量进行激光烧蚀。以此方式进行的烧蚀经常改进气溶胶形成，进而可以有助于改进分析后的数据质量。通常为了获得最小的熔坑(crater)，为了最大化所得图像的分辨率，采用高斯光束。横跨高斯光束的截面记录了具有高斯分布的能量密度分布。在那种情况下，光束的通量随着距中心的距离而变化。因此，烧蚀光斑尺寸的直径是以下两个参数的函数：(i)高斯束腰(Gaussian beam waist)(1/e2)，以及(ii)所施用的通量和阈值通量之间的比例。
因此，为了确保用每个烧蚀激光脉冲一致地去除可再生量的材料，并从而使成像数据的质量最大化，保持一致的烧蚀直径是有用的，这进而意味着调整由激光脉冲供应给靶标的能量与被烧蚀材料的烧蚀阈值能量的比率。在烧蚀阈值烧蚀能量在样品中变化的非均质样品(例如DNA和蛋白质材料的比例变化的生物组织或者在阈值烧蚀能量随着样品区域中矿物的特定组成而变化的地质样品)时，该要求成为一个问题。为了解决这个问题，可以将多于一个波长的激光辐射聚焦到样品上的相同烧蚀位置，以基于该位置处样品的组成更有效地烧蚀样品。
激光
通常，用于烧蚀样品的激光的波长和能量的选择可以遵循细胞分析中的常规用途。激光必须具有足够的通量以使烧蚀达到所需的深度，而不会显著地烧蚀样品载体。0.1-5J/cm2之间的激光通量通常是合适的，例如，从3-4J/cm2或约3.5J/cm2，并且激光器理想地能够以200Hz以上(200Hz或更多)的速率产生具有该通量的脉冲。在一些情况下，来自此类激光器的单个激光脉冲应当足以烧蚀细胞材料以用于分析，使得激光脉冲频率与产生烧蚀羽流的频率匹配。通常，为了成为对生物样品成像有用的激光器，该激光器应当产生具有低于100ns(优选低于1ns)持续时间的脉冲，例如，该脉冲可以聚焦到本文所讨论的特定光斑尺寸。
例如，激光系统烧蚀的频率在200Hz-100 Hz、200Hz-10 MHz、200Hz-1MHz、200Hz-100kHz的范围内，在500-50kHz的范围内，或者在1kHz-10kHz的范围内。
在这些频率下，如果期望单独解析每个烧蚀的羽流(如下面所陈述的，当对样品发射脉冲串(burst of pulses)时可能不一定期望)，则仪器必须能足够快地分析烧蚀的材料以避免连续烧蚀之间的大量信号重叠。优选地，源自连续羽流的信号之间的重叠强度＜10％，更优选＜5％，且理想地＜2％。分析羽流所需的时间将取决于样品腔室的洗涤时间(参见下面的样品腔室部分)、羽流气溶胶到达并通过激光电离系统的传送时间、以及分析电离材料所花费的时间。如下面更详细地讨论的，每个激光脉冲可以与随后建立的样品图像上的像素相关。
在一些实施方式中，激光源包括具有纳秒脉冲持续时间的激光器或超快激光器(1ps(10-12s)或更快的脉冲持续时间)，诸如飞秒激光器。超快脉冲持续时间提供了许多优势，因为它们限制了来自烧蚀区域的热扩散，并进而提供了更精确且可靠的烧蚀熔坑，以及最小化了每次烧蚀事件造成的碎片散射。飞秒激光器在系统和设备以及本文描述的设备中特别有用。
在一些情况下，将飞秒激光器用作激光源。飞秒激光器是发射具有低于1ps持续时间的光脉冲的激光器。这种短脉冲的产生通常采用无源锁模技术。可以采用许多类型的激光器产生飞秒激光。使用无源锁模固态体激光器可以实现30fs和30ps之间的常规持续时间。类似地，例如基于钕掺杂或镱掺杂增益介质的各种二极管泵浦激光器在该状态(regime)中运行。具有高级色散补偿的钛-蓝宝石激光器甚至适用于低于10fs的脉冲持续时间，在极端情况下可低至约5fs。在大多数情况下脉冲重复频率在10MHz和500MHz之间，尽管对于较高的脉冲能量、存在重复频率为几兆赫兹的低重复频率版本(可从例如鲁门特姆(Lumentum)(加利福尼亚州，美国)、辐射(Radiantis)(西班牙)、相干(Coherent)(加利福尼亚州，美国)购得)。此类型的激光器可以配备增加脉冲能量的放大器系统。
还有各种类型的超快光纤激光器，这些超快光纤激光器在大多数情况下也是无源锁模的，通常提供50fs与500fs之间的脉冲持续时间，以及10MHz与100MHz之间的重复频率。这样的激光器可从例如NKT光子(NKT Photonics)(丹麦；前称飞龙(Fianium)公司)、振幅系统(Amplitude Systems)(法国)、激光飞秒(Laser-Femto)(加利福尼亚州，美国)商业购得)。此类型的激光器的脉冲能量还可以通过放大器来增加，放大器通常为集成光纤放大器的形式。
一些锁模二极管激光器可以产生具有飞秒持续时间的脉冲。直接在激光输出处，脉冲持续时间通常为几百飞秒左右(例如可从相干(加利福尼亚州，美国)购得)。
在一些情况下，使用皮秒激光器。在前述段落中已经讨论的许多类型的激光器也可以适于产生皮秒范围持续时间的脉冲。最常见的源是有源锁模固态体激光器或无源锁模固态体激光器，例如无源锁模Nd掺杂YAG、玻璃或钒酸盐激光器。同样地，皮秒锁模激光器和激光器二极管为可商购的(例如NKT光子(丹麦)，EKSPLA(立陶宛))。
可替代地，可以使用连续波激光器，外部调制以产生纳秒或更短持续时间的脉冲。
通常，本文所讨论的用于在激光系统中用于烧蚀的激光光束即在采样位置处具有100μm以下，诸如50μm以下、25μm以下、20μm以下、15μm以下、或10μm以下，诸如约3μm以下、约2μm以下、约1μm以下的光斑尺寸。被称为光斑尺寸的距离对应于光束的最长内部尺寸，例如对于圆形光束则为光束直径，对于正方形光束则对应于相对的角之间的对角线长度，对于四边形则为最长对角线的长度等(如上面所记录的，具有高斯分布的圆形光束的直径被定义为通量减少至峰值通量的1/e2倍的点之间的距离)。作为高斯光束的替代，可以采用光束整形和光束掩蔽来提供期望的烧蚀光斑。例如，在一些应用中，具有顶帽(top hat)能量分布的正方形烧蚀光斑可能是有用的，(即，与高斯能量分布相反，光束具有接近均匀的通量)。这种配置减少了烧蚀光斑尺寸对高斯能量分布的峰值处通量与阈值通量之间的比率的依赖性。接近阈值通量的烧蚀提供了更可靠的烧蚀熔坑的生成，并控制了碎片的生成。因此，激光系统可以包括光束掩蔽和/或光束整形组件，例如，衍射光学元件，该衍射光学元件布置在高斯光束中，以使光束重新黯然(re-shame)并产生均匀或接近均匀的通量的激光焦斑，例如，在光束上的通量变化小于±25％，例如，小于±20％、±15％、±10％或小于±5％。有时，激光光束具有正方形截面形状。有时，光束具有顶帽能量分布。如上所述，在本发明的实施方式的上下文中，被称为光斑尺寸的距离是采样位置处光束的最长内部尺寸，即光斑尺寸是光束的横向尺寸，所以，例如，圆形光束的光斑尺寸是直径。然而，本领域技术人员将领会的是，物镜的焦斑是三维体积，并且聚斑尺寸的轴向尺寸通常比横向尺寸长，使得在一些情况下，焦斑的轴向尺寸可能比在本发明的实施方式的上下文中称为“光斑尺寸”的距离长。
当用于分析生物样品时，为了分析个体细胞，所用激光光束的光斑尺寸将取决于细胞的尺寸和间距。例如，在细胞彼此紧密堆积的情况下(例如，在组织切片中)，激光系统中的一个或多个激光源可以具有不大于这些细胞的光斑尺寸。该尺寸将取决于样品中的特定细胞，但通常激光光斑的直径小于4μm，例如，约3μm以下、约2μm以下、约1μm以下。为了以亚细胞分辨率分析给定的细胞，该系统使用不大于这些细胞的激光光斑尺寸，更具体地，使用能够以亚细胞分辨率烧蚀材料的激光光斑尺寸。光斑尺寸越小，所得的图像分辨率越大。有时，单细胞分析可以使用大于细胞尺寸的光斑尺寸来执行，例如，在细胞在载玻片上铺开的情况下，细胞之间留有空间。在此处、可以使用较大的光斑尺寸，并且实现单细胞表征，因为目标细胞周围的额外烧蚀区域不包括额外的细胞。因此，可以根据被分析细胞的尺寸来适当选择所使用的特定光斑尺寸。在生物样品中，细胞将罕有全部是相同的尺寸，因此如果需要亚细胞分辨率成像，如果在整个烧蚀过程中保持恒定的光斑尺寸，则烧蚀光斑尺寸应当小于最小的细胞。使用激光光束聚焦可以实现小的光斑尺寸。1μm的激光光斑直径对应于1μm的激光焦点(即，激光光束在光束焦点处的直径)，但是由于目标上能量的空间分布(例如，高斯光束形状)和总激光能量相对于烧蚀阈值能量的变化，激光焦点可以改变+20％以上。
激光烧蚀焦点
为了最大化激光从样品烧蚀材料的效率，样品应该相对于激光焦点处于合适的位置，例如，在焦点处，因为焦点是激光光束将具有最小直径并因此能量最集中之处。这可以通过许多方式来实现。第一种方式是，样品可以在指向它的激光的轴上移动(即激光的路径向上和向下/朝向和远离激光源)到期望的点，在该点处、光具有足够的强度来实现期望的烧蚀。可替代地或另外地，透镜可以用于移动激光的焦点，因此提高例如通过缩倍(demagnification)在样品位置处烧蚀材料的有效能力。将一个或多个透镜放置在激光器和样品台之间。第三种方式为改变激光器的位置，该第三中方式可以单独使用，也可以与前述两种方式中任一种或两种结合使用。
为了帮助系统的使用者将样品放置在最合适的位置，以从样品烧蚀材料，可以将相机定向保持样品的台(下面将更详细地讨论)。因此，本公开提供了一种激光烧蚀采样系统，该激光烧蚀采样系统包括定向样品台的相机。由相机检测到的图像可以聚焦至激光聚焦的同一点。这可以通过对激光烧蚀和光学成像使用相同的物镜来实现。通过使两者的焦点一致，使用者可以确定当光学图像对焦时，激光烧蚀将是最有效的。通过使用压电激励器(activator)可以实现台的精确移动以使样品聚焦，该压电激励器可以从物理仪器(PhysikInstrumente)、赛睿德科技(Cedrat technologies)、索雷博(Thorlabs)及其他供应商处购得。
激光烧蚀采样系统的样品腔室
当样品经受激光烧蚀时，将样品放置在样品腔室中。样品腔室包括台，该台保持样品(通常样品在样品载体上)。当烧蚀时，样品中的材料形成羽流，并且从气体入口穿过样品腔室到气体出口的气流带走气溶胶化材料的羽流，包括在烧蚀位置的任何标识原子。气体将材料带至电离系统，该电离系统将材料电离从而能够通过检测器进行检测。样品中的包括标识原子的原子可以通过检测器进行区分，并因此它们的检测揭示了羽流中存在或不存在多个靶标，并因此确定了样品上烧蚀位置处存在哪些靶标。因此，样品腔室起到容纳被分析的固体样品以及作为将气溶胶化材料传送至电离和检测系统的起始点的双重作用。这意味着通过腔室的气流可以影响经烧蚀的材料羽流在通过系统时将如何扩散。烧蚀羽流如何扩散的度量是样品腔室的洗涤时间。该数值是从样品中经烧蚀的材料被流经样品腔室的气体带出样品腔室所需时间的度量。
以这种方式自激光烧蚀产生的信号的空间分辨率(即，如下所述，当烧蚀用于成像而不是专门用于清除时)取决于以下因素，包括：(i)当信号在烧蚀的总面积上集成时，激光的光斑尺寸；以及与样品相对于激光的运动相比产生羽流的速度，以及(ii)相对于羽流产生的速度、可以对羽流进行分析的速度，以避免来自以上提及的连续羽流的信号重叠。因此，如果需要对羽流进行单独分析，则能够在尽可能短的时间内分析羽流，将羽流重叠的可能性最小化(因此进而能够更频繁地产生羽流)。
因此，具有短洗涤时间(例如，100ms以下)的样品腔室与本文公开的设备和方法一起使用是有利的。具有长洗涤时间的样品腔室将限制可以产生图像的速度，或将导致源自连续样品光斑的信号之间的重叠(例如，Kindness等人(2003；ClinChem 49:1916-23)，具有超过10秒的信号持续时间)。因此气溶胶洗涤时间是在不减少总扫描时间的只能情况下实现高分辨率的关键限制因素。洗涤时间≤100ms的样品腔室在本领域中是已知的。例如，列维奇(Gurevich)和
Figure BDA0003495048130000101
(2007；J.Anal.At.Spectrom.,22:1043-1050)公开了一种洗涤时间低于100ms的样品腔室。在王(Wang)等人(2013；Anal.Chem.85:10107-16)(也参见WO 2014/146724)中公开的样品腔室具有30ms以下的洗涤时间，从而允许了高烧蚀频率(例如，高于20Hz)并因此允许快速分析。在WO 2014/127034中公开另外此类样品腔室。WO2014/127034中的样品腔室包括配置成可操作地靠近目标布置的样品捕获单元，该样品捕获单元包括：捕获腔和引导壁，该捕获腔具有形成在捕获单元表面中的开口，其中，捕获腔配置成通过开口接收从激光烧蚀位点喷射或产生的靶标材料，该引导壁暴露在捕获腔内并配置成将捕获腔内的载气流从入口引导至出口，使得捕获腔内接收的靶标材料的至少一部分作为样品传递到出口。WO 2014/127034的样品腔室中的捕获腔的体积小于1cm3并且可以低于0.005cm3。有时，样品腔室具有25ms以下，诸如20ms、10ms以下、5ms以下、2ms以下、1ms以下、500μs以下、200μs以下、100μs以下、50μs以下或者25μs以下的洗涤时间。例如，样品腔室可以具有10μs以上的洗涤时间。通常，样品腔室具有5ms以下的洗涤时间。
出于完整性，有时，与样品腔室的洗涤时间相比，来自样品的羽流可以更频繁地产生，并且(例如，如果最大可能的分辨率被认为对于正在进行的特定分析是不必要的)，所得的图像将相应地模糊。
样品腔室通常包括平移台，该平移台保持样品(和样品载体)并相对于激光辐射光束移动样品。当使用需要激光辐射穿过样品载体到达样品的方向的操作模式时，保持样品载体的台也应该对所使用的激光辐射透明。
因此，当激光辐射被引导到样品上时，可以将样品放置在样品载体(例如，载玻片)面向激光辐射的一侧，使得在激光辐射被引导到样品上的同一侧上释放并捕获烧蚀羽流。可替代地，当激光辐射被引导到样品上时，样品可以放置在样品载体的与激光辐射相对的一侧(即激光辐射在到达样品前穿过样品载体)，并且在激光辐射的相对侧上释放并捕获烧蚀羽流。
样品腔室的一个特征在于宽的移动范围，样品在该宽的移动范围中可以相对于激光在x轴和y轴(即水平)上移动(其中，激光束在z轴上被引导到样品上)，x轴和y轴相互垂直，这个特征在烧蚀样品的各种离散区域中的特定部分具有特定用途。通过在样品腔室内移动台并保持激光器在设备的激光烧蚀采样系统中的位置固定，可以实现更可靠且更精确的相对位置。移动范围越大，离散烧蚀区域距彼此的距离越大。通过移动其上放置有样品的台，样品相对于激光移动。因此，样品台可以在样品腔室内的移动范围在x轴和y轴上至少为10mm，诸如在x轴和y轴上为20mm、在x轴和y轴上为30mm、在x轴和y轴上为40mm、在x轴和y轴上为50mm，诸如在x轴和y轴上为75mm。有时，移动的范围使得其允许在腔室内分析标准的25mm×75mm显微镜载片的整个表面。当然，为了能够实现亚细胞烧蚀，除了宽范围的移动外，该移动还应当是精确的。因此，台可以配置成在x轴和y轴上以小于10μm的增量来移动样品，该增量诸如小于5μm、小于4μm、小于3μm、小于2μm、1μm或小于1μm、小于500nm、小于200nm、小于100nm。例如，台可以配置成以至少50nm的增量来移动样品。精确的台移动可以以大约1μm(诸如1μm±0.1μm)的增量进行。可以使用可商购的显微镜台，例如可从索雷博(Thorlabs)、优瑞科技(Prior Scientific)和应用科学仪器(Applied ScientificInstrumentation)购得。可替代地，电动台可以由基于定位器的组件构建，该定位器提供期望的移动范围和适当精细的精确移动，诸如来自斯梅克(Smaract)的SLC-24定位器。样品台的移动速度也可以影响分析速度。因此，样品台的操作速度大于1mm/s，诸如10mm/s、50mm/s或者100mm/s。
自然，当样品腔室中的样品台具有宽的移动范围时，样品腔室尺寸必须适当，以配合台的移动。因此样品腔室的尺寸取决于所涉及样品的尺寸，这进而决定了移动样品台的尺寸。样品腔室的示例性尺寸具有10×10cm、15×15cm或20×20cm的内部腔室。腔室的深度可以为3cm、4cm或5cm。技术人员将能够遵循本文的教导选用适当的尺寸。使用激光烧蚀采样器分析生物样品的样品腔室的内部尺寸必须大于样品台的移动范围，例如，至少5mm、诸如至少10mm。这是因为如果腔室的壁太靠近台的边缘，则将材料的烧蚀羽流从样品带走并带入电离系统的穿过腔室的载气可能变为湍流。湍流扰乱了烧蚀的羽流，因此，在材料羽流被烧蚀并被带到设备的电离系统后，材料羽流开始扩散，而不是保持为紧密的烧蚀材料云。烧蚀材料的更宽的峰对电离和检测系统产生的数据具有负面影响，因为由于峰重叠它会而导致干扰，并因此最终导致更低的空间分辨率数据，除非烧蚀速率降低到不再是实验上目标的速率。
如上所记录的，样品腔室包括气体入口和将材料带到电离系统的气体出口。然而，它还可以包含用作入口或出口的其它端口，以引导腔室中的气流和/或向腔室提供气体混合物，这由技术人员根据所进行的特定烧蚀过程来确定。
相机
除了识别用于激光烧蚀的样品的最有效定位之外，在激光烧蚀采样系统中包括相机(例如，基于电荷耦合器件的图像传感器(charged coupled device image sensorbased,CCD)相机或基于有源像素传感器的相机)或任何其他光检测装置，能够实现各种进一步的分析和技术。CCD是用于检测光并将其转化成可以用于生成图像的数字信息的装置。在CCD图像传感器中，存在一系列检测光的电容器，并且每个电容器表示确定图像上的一个像素。这些电容器可以将入射光子转化为电荷。然后使用CCD读出这些电荷，并且可以将记录的电荷转换成图像。有源像素传感器(active-pixel sensor,APS)是由包含像素传感器阵列的集成电路组成的图像传感器，每个像素包含光电检测器和有源放大器，例如，CMOS传感器。
激光烧蚀
通常，根据本文相关的变型(例如，并不强制使用ICP将样品材料电离，也不强制使用TOF MS检测器)，激光烧蚀以前面陈述的方式进执行，例如，在Giesen等人在2014的WO2014169394中陈述的电离。例如，还可以执行该方法，但用OES检测来代替质谱分析法检测，如下面所讨论的。
激光电离系统
前述质谱流式细胞术设备和许多前述质谱仪设备已经采用了电感耦合等离子体(ICP)作为用于使来自样品的材料电离的系统(即作为由MS检测的离子的离子源)。然而，ICP-MS中的离子传输效率远低于统一水平。也就是说，从引入到ICP的材料检测出的离子数量远低于材料完全电离所期望的数量。低传输效率低与由载气(通常为氩气)离子生成的空间电荷问题有关。如下解释，空间电荷效应可以导致密集堆积的离子的排斥，或者在存在具有相反类型电荷的粒子时，空间电荷会导致中性物质的形成，而中性物质进而无法被质谱仪检测到。ICP中的许多离子来自用于在炬管的端部维持等离子体的氩气(注意除了运送用于电离的材料的气流，流入图1的炬管中的额外的氩气(用*标识))。在不存在大量氩载体离子以及源自载气的电子的情况下产生元素离子的方法可以促进更好的仪器灵敏度。
本发明人已经确定，代替使用ICP作为用于质谱流式细胞术和质谱分析法的电离系统，如在标准质谱流式细胞仪中，反而可以使用激光电离系统来使样品电离。本发明人已经确定影响以气溶胶或蒸汽形式存在的样品材料转化成元素离子的任何激光器都可以用于激光电离系统中，只要其不会从载气中产生过多离子，并且皮秒激光器和飞秒激光器在本发明的实施方式的激光电离系统中是有用的(飞秒激光器尤其有用)。激光电离提供了优势，因为激光中的能量破碎、雾化并电离样品材料，而不会向离子光束添加大量的载气离子。电离系统与液态样品和固态样品是兼容的。
该方法可能特别具有优势的应用包括通过成像质谱流式细胞术对生物样品进行成像。在这些应用中，生物样品通过激光脉冲(最可能来自设置中的第二激光器)进行测定(interrogate)，为生物样品上的每个目标像素生成烧蚀材料的羽流。所生成的羽流通常携带来自测定区域的蒸汽和纳米级气溶胶。根据本发明的实施方式，蒸汽和气溶胶可以直接通过使蒸汽和气溶胶经受足够强度的激光辐射而被电离，以从羽流材料生成元素离子，如下更详细地解释。
通过参照图2，通常，激光电离系统(200)包括电离系统导管(210)和激光器系统(220)，布置成使得激光器系统被引导到电离系统导管(210)中，以使得从激光器(220)发射的激光(221)能够使穿过电离系统导管的材料电离。电离系统导管的一端与设备的采样器(100)连通，并且该导管的另一端与设备的质谱仪(300)连通。因此，来自采样器的材料在材料被带入质谱仪时而通过激光进行电离。
激光电离系统的激光器
通常，可用于电离的激光器包括每脉冲几微焦耳量级提供能量的激光器，但他们能够生成那些具有高频率的脉冲。激光器用于从样品材料产生元素离子。随后，所产生的元素离子可以通过设备中的质谱仪进行分析。激光器可以是皮秒激光器或飞秒激光器。在一些实施方式中，激光器是飞秒激光器。
飞秒激光器可以为固态激光器。无源锁模固态体激光器可以发射高质量的超短脉冲，通常持续时间在30fs和30ps之间。此类激光器的实施例包括二极管泵浦激光器，诸如那些基于钕掺杂或镱晶体掺杂的激光器。钛-蓝宝石激光器可以用于持续时间低于10fs的脉冲，在极限情况下低至约5fs(例如，奥克塔维厄斯(Octavius)Ti：蓝宝石激光器，可以从索雷博购得)。在大多数情况下，脉冲重复频率在1kHz和500MHz之间。
飞秒激光器可以为光纤激光器(fiber laser)。也可以是无源锁模的各种类型的超快光纤激光器，通常提供50fs和500fs之间的脉冲持续时间、在0.10MHz和100MHz之间的重复频率以及几豪瓦特和几瓦特之间的平均功率(飞秒光纤激光器可以从托皮蒂卡、IMRA美国、相干公司进行商购)。
飞秒激光器可以为半导体激光器。一些锁模二极管激光器可以产生具有飞秒持续时间的脉冲。直接在激光输出处，脉冲持续时间常常为至少几百飞秒，但利用外部脉冲压缩，可以实现更短的脉冲持续时间。
还可以是无源锁模垂直外腔面发射激光器(vertical external-cavitysurface-emitting lasers，VECSEL)；这些特别令人感兴趣，因为它们递送短脉冲持续时间、高脉冲重复频率以及有时高平均输出功率的组合，但是它们不适于高脉冲能量。
适于在系统中使用的飞秒激光器和本文公开的方法包括色心激光器和自由电子激光器。
在一些实施方式中，激光器适于产生纳秒、皮秒或飞秒量级脉冲持续时间的脉冲。例如，激光器的持续时间可以为500fs以下，诸如400fs以下、300fs以下、200fs以下、100fs以下、50fs以下、45fs以下、25fs以下、20fs以下或者10fs以下。飞秒激光器适于产生具有小于1ps的持续时间的脉冲。
在一些实施方式中，激光器适于具有至少100,000Hz的脉冲重复频率，诸如至少1MHz、至少2MHz、至少3MHz、至少4MHz、至少5MHz、至少10MHz、至少20MHz、至少50MHz、至少100MHz、至少200MHz、至少500MHz或者1GHz以上。
在一些实施方式中，激光器适于在其焦点处具有100μm以下的光束宽度(1/e2)，诸如50μm以下、20μm以下、10μm以下、或者5μm以下。激光器的焦点是光束能量最集中的地方，因此也是实现最大电离的地方。
在一些实施方式中，激光器适于具有1纳焦耳至高达50毫焦耳之间的脉冲能量。用于辅助材料溅射或用于材料烧蚀的激光器可以适于具有1纳焦耳与100微焦耳之间的脉冲能量，诸如在10纳焦耳与100微焦耳之间、在100纳焦耳与10微焦耳之间、在500纳焦耳与5微焦耳之间，诸如约1微焦耳、约2微焦耳、约3微焦耳或约4微焦耳。用于后电离的激光器可以适于具有1毫焦耳与50毫焦耳之间的脉冲能量，诸如，5毫焦耳与40毫焦耳之间、10毫焦耳与30毫焦耳之间、20毫焦耳与35毫焦耳之间，或约25毫焦耳或35毫焦耳。
在一些实施方式中，激光器适于具有约1毫焦耳的脉冲能量，适于具有至少10Mhz的脉冲重复频率，并适于产生具有持续时间少于100fs的脉冲，诸如50fs以下、45fs以下、25fs以下、20fs以下或10fs以下。
除了减少来自载气的离子数量的优势外，激光电离系统还可以适于通过避免由其他机制的空间电荷效应来进一步增加电离效率。例如，激光电离系统可以适于利用电离激光器的多个激光脉冲使单个羽流或粒子的包含物(content)电离。如果使用多个脉冲，则会减少由任一个脉冲产生的离子的量。
如上所记录的，如果在小体积中生成大量的正电荷和负电荷，则形成的离子的运动将受到由离子和电子诱导的空间电荷产生的局部场控制。如果在小体积中存在太多带电离子，则外部场(质谱仪中存在的自于将所得的离子引导至检测器以进行检测的离子光学的场)将无法有效分离正负电荷，并且此类离子云最终将会中和，进而降低电离效率。例如，包含10000个元素电荷的10μm(直径)尺寸的电子云产生约3V的静电势。由于几eV是将电子保持在原子上的能量，因此它也是电离之后自由电子可能的能级。因此，在10微米尺寸的体积中，10000个离子量级的离子密度接近空间电荷行为开始占主导地位的极限。
除了使用更多脉冲以使单个羽流或粒子的包含物电离，本发明人还确定了通过控制由电离激光器的脉冲电离的材料量来解决该问题的其他技术和调整。这些技术可以单独使用、彼此结合使用，并且可选地，与使用电离激光器的多个脉冲一起使用，以使单个羽流或粒子的包含物电离。这导致产生更少的离子，并因此意味着离子光子可以在电荷重组以及中和之前分离电荷。
在采样器为激光烧蚀系统的情况下，则每羽流的材料量可以通过仅烧蚀小量材料来以产生用于通过激光电离系统电离的每个羽流来控制。有两种主要方法可以做到这一点。第一种是烧蚀来自样品的材料的小光斑以产生每个羽流，例如，小于4μm，诸如小于3μm、小于2μm、小于1μm、小于500nm、小于400nm、小于300nm、小于200nm或者100nm以下。一般光斑尺寸为1μm以下。第二种是例如通过调节每脉冲功率、适当配置烧蚀激光器来控制烧蚀光斑的深度。所得的熔坑的深度可以为小于500nm、小于400nm、小于300nm、小于200nm、小于100nm、小于50nm或者20nm以下(即每个激光脉冲从激光脉冲的光斑直径内的样品烧蚀500nm、小于400nm、小于300nm、小于200nm、小于100nm或者50nm以下的材料)。如果样品的总深度大于每激光脉冲所烧蚀的样品深度，则可以将超过一个脉冲引导到样品上的相同位置处，以将样品的该位置处完全烧蚀。
烧蚀至100nm深度的源自1×1μm的光斑的羽流将包含约1010个原子。在此情况下，1010个原子可以细分为个106部分，每个部分包含104个原子。在那种情况下，每个部分可以通过电离直接激光电离(诸如基于隧道效应或多光子效应的飞秒激光电离)而进行电离。此类电离可能导致接近100％的电离效率，因此意味着可以从104个原子产生104个离子。这个数量的离子仍然在空间电荷边界内，进而确保分离正负粒子的合理效率。减少烧蚀的材料量将提供更进一步的优势，因为对于烧蚀光斑为300nm×300nm和100nm厚的样品，烧蚀材料量减少10倍，并且电离烧蚀羽流所需的电离激光脉冲数量减少至105。
如果这种设置用于成像质谱流式细胞术或成像质谱分析法，则从样品产生羽流的烧蚀激光器的一个脉冲将伴随电离激光器的105个脉冲，以使烧蚀羽流电离，预计会实现样品的接近完全的电离。较小直径的烧蚀光斑和/或较浅深度的烧蚀将减少烧蚀经烧蚀的羽流所需的来自激光电离系统的激光器的脉冲数量。因此，在一些实施方式中，激光电离系统的激光器配置成以比激光烧蚀系统的重复频率大103倍的重复频率产生脉冲，诸如104倍以上、5×104倍以上、105倍以上、5×105倍以上、106倍以上或超过106倍更大。
如果较低程度的电离是可以接受的，例如10％电离，则电离激光器的相应脉冲频率可以降低。例如，当分析生物样品时，在超过一个元素标记拷贝用于标志(mark)靶标分子的情况下，降低的电离程度是可以接受的。例如，如果10个以上元素标记拷贝共价连接至抗体(该抗体结合至靶标抗原)，则10％的电离是可以接受的，因为元素标记中的至少一个将被电离并因此被检测到。
电离系统导管
为了将电离最大化，可以扩大(broaden)烧蚀产生的羽流，使得羽流可以被来自电离激光器的一系列脉冲电离。可以采用几个参数以增加羽流的体积。因此，在本设备的一个实施方式中，采样器包括激光烧蚀系统，该激光烧蚀系统配置成生成羽流，并且其中，设备包括在激光电离之前增加羽流体积的装置。
一个参数为烧蚀系统的烧蚀腔室中的压力。当烧蚀样品时，所得的烧蚀羽流的体积在其停止膨胀时与烧蚀腔室(电离系统导管从该烧蚀腔室中携带经烧蚀的羽流)中的压力成反比。因此，烧蚀腔室可以维持在低于大气压力。例如，在0.5个大气压下操作而不是在1个大气压下操作会导致在羽流进入电离系统导管之前烧蚀羽流的气态体积增加2倍。烧蚀腔室可以在低于0.5个大气压下操作，例如低于0.1或者低于0.05个大气压。
第二个参数是样品在电离系统导管中、在烧蚀腔室和发生电离的点之间电离的驻留时间。当烧蚀羽流从烧蚀腔室沿着导管被携带时，烧蚀羽流扩散，并且扩散的程度与羽流在气流中花费的时间(羽流的驻留时间)成正比。因此，较长的导管会导致更多的扩散，进而导致更广泛的羽流，这应当更适于有效地电离(当较多扩散羽流被电离时，每单位体积产生更少的离子，并因此减少了电荷中和效应的影响)。同样地，气体在导管中缓慢流动会增加驻留时间，并因此允许烧蚀羽流更大的扩散。这又可以通过每单位时间引入到质谱流式细胞仪或质谱仪中的气体体积、以及烧蚀腔室和电离系统之间的导管的直径进来控制。技术人员容易执行这些参数的变化以适当地控制扩散。
在一些实施方式中，可以执行待电离的样品材料羽流的再成形，以及或代替依赖扩散而减少空间电荷效应。分析来自事件(例如单个烧蚀羽流)的材料所花费的时长取决于材料羽流如何扩散，并且因此所得的离子云如何扩散，更多的云扩散，则分析所花费的时间越长。
由于可以通过飞秒激光器电离的体积的尺寸通常在微米的量级(因此，例如通常小于由烧蚀所产生的羽流，1μm的光斑)，因此气态样品材料可以通过扩散产生的球形再成形为直径只有几微米的细长线(elongated string)的形状，以将电离效率最大化。
对样品材料个羽流再成形的简单方法是利用朝输出端渐缩的电离系统导管。这在图3A至图3D中示出。在该图中，示出了电离在沿导管流动的载气中沿着电离系统导管行进的样品材料(400)的羽流。当云穿入到电离系统导管(210)的锥形部(420)时，其宽度变窄，但其长度增加。例如，电离系统导管内部直径在导管的输入端可以为xμm，但在接近输出端可以减缩至x/10μm(例如在输入端为300μm，在输出端为30μm)。锥形部可以为沿着电离系统导管的长度，或者锥形部可以仅为导管的一部分(也就是说，导管在其长度的第一部分具有相同的内径，然后是内径减小的第二部分)。如果电离系统导管中的羽流在第一部分中直径膨胀至100μm，则在羽流通过锥形部时将保持几乎相同的直径比。因此，如果在锥形部开始处的直径比锥形部端处的直径大10倍，则锥形部后的羽流直径将为10μm。与此同时，在该情况下，由于羽流体积守恒，因此羽流长度将从100μm增加到10mm。因此，在一些实施方式中，电离系统导管包括锥形部，其中，导管的内部直径在锥形部之上减少2倍以上，诸如2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上或50倍以上。内部直径是通过导管的最长截面的量度。例如，如果导管为圆形，则内部直径则简单地为该圆形的直径，但如果导管为矩形，则为直径。
在一些实施方式中，锥形部中的载气流几乎为音速或甚至为超音速的。这为伸展(stretching)羽流提供了最高速度的流动。它还减少了在锥形部的驻留时间，这进而将不期望的扩散扩宽最小化，该不期望的扩散扩宽可能会导致设备的该部分中一些离子损失。在一些实施方式中，电离激光器布置成在最窄的点处(在该点处气体在锥形部中为最高速度)对样品进行电离。更快的流速使得用于电离样品材料的激光的重复率更快，而不会撞击已被先前脉冲电离的样品部分。通过这样做，如上所讨论的，可以将羽流细分为更小的部分，以适于使导致电离后中和的空间电荷效应最小化。
最大化激光使用效率
通过激光光学和电离系统导管的适当设计，可以引导激光电离系统的激光器，使得光通过穿过和/或离开电离系统导管的样品材料反射回来。因此激光可以多次聚焦在样品材料中，从而最有效地利用激光来电离穿过导管和/或离开导管的样品材料。
因此，在一些实施方式中，激光电离系统还包括反射器装置以使得由激光器产生的激光多次穿过样品。有时，反射器装置包括一个或多个反射器，该一个或多个反射器成形为在电离导管内提供多个焦点，并且有时，一个或多个反射器布置成在电离导管的出口(通常是在样品材料尚未从其被电离系统导管迫成形的窄直径形状膨胀的地方)处提供多个焦点。这在图4和图5中示出。在图4中，示出了激光在电离导管(210)内、在锥形部(420)后电离被反射器反射，反射器被布置成使得沿着导管形成多个焦点(430)。
为了使得激光的使用最大化，可以将光引入多通道单元。常规的多通道单元利用凸面反射器(500)，该凸面反射器布置成光通过电离导管(210)中的相同空间多次反射以对沿着导管穿过的样品材料(400)进行电离。这样做，激光可以在导管和MS(520)的分离器(skimmer)或采样器锥体(cone)之间的、电离导管内(图5A)在多个焦点处或导管的锥形端的出口处(图5B)聚焦，因此，可以使用相同的激光实现多次样品材料的电离，以最大化样品吸收，从而产生元素离子以用于下游的MS的分析。因此，在一些实施方式中，反射器装置包括至少一个凸面反射器。如图5中示意性示出的多个凸面反射器装置可以沿着电离导管的长度布置，以增加焦点的数量。焦点并未在图5中标识，但类似在图4中，反射器布置成使得焦点位于导管的中心，在那里待电离的材料量最大。
在一些实施方式中，激光在导管(起到波导作用)的宽部处发射，使得能量密度仅到达适于在锥形部中电离的水平。这在图6中示出。在此，激光(211)离开激光器(210)并在其变窄时从锥形部的内表面反射，直到朝向锥形部的窄端达到可以电离样品材料(610)的激光密度。
参照图7，在一些实施方式中，锥形导管在其变窄后呈喇叭口(flare out)。激光(221)从喇叭口侧在锥形的端部处发射(电离激光器定位成从锥形部的喇叭口侧进行引导激光)。喇叭口的角度可以定制成适应用于聚焦激光的物镜的数值孔径。更宽的角度允许使用更高数值孔径的透镜，这有助于最小化激光焦点的直径。电离产生的离子沿气流方向继续流动。随后，所得的离子可以被离子光学偏转，以从气流方向改变它们的轨迹，以避免撞击物镜。在一些实施方式中，物镜可以在中间具有孔，以允许离子穿过。
通过多个激光系统电离液体样品
在样品为液体样品的一些情况下，诸如细胞或病毒的粒子通过电离激光器上游的第一激光器而破碎成更小的粒子。随后电离激光器可以用于电离粒子以产生符合以上描述的元素离子。激光器可以在细胞仍处于液体中时使它们破碎。可替代地，细胞可以在气相中碎片化。本文中，可以将液体样品雾化以产生气相细胞，并且由第一激光器破碎成碎片的气相细胞随后可以由电离激光器进行电离。在气相中的另一碎片化方式是使用按需滴定装置将细胞引入气流中(http://www.microfab.com/dispensing-devices,http:// www.polypico.com/wp-content/uploads/2015/06/Poly-Pico_Brochure_-2015.pd对于基于喷墨式打印机针头的设备)。在一些实施方式中，使用超过一个激光器将细胞破碎成碎片，该碎片随后被电离激光器电离，使用诸如两个、三个、四个或五个以上的激光器。例如，第一激光器可以将样品破碎成具有第一直径的碎片，且放置在第一激光器的下游的第二激光器可以用于将第一直径的碎片破碎成甚至更小直径的碎片。在激光器的数量大于两个的情况下，同样的原理也适用，每个激光器将碎片破碎成更小的碎片。电离之前碎片将在材料的云中，该材料的云可以以与上述羽流相同的方式来操作，尤其是讨论使用激光烧蚀实施方式作为实施例例的锥形导管时。以上关于设备所讨论的全部特征同样地可以例如在质谱流式细胞仪中应用于分析液体样品中的单个细胞或粒子。
激光烧蚀与激光电离
如上所讨论的，当采样器为激光烧蚀系统是，采样器配置成产生样品材料的羽流，激光烧蚀系统配置成进行电离。在一些实施方式中，激光电离系统配置成产生用于电离单个羽流的多个激光脉冲。在一些实施方式中，激光电离系统配置成产生比激光烧蚀系统的重复频率大103倍的重复频率的脉冲，诸如大104倍以上、大5×104倍以上、大105倍以上、大5×105倍以上、大106倍或大超过106倍。
在一些实施方式中，设备包括单个激光器，该单个激光器适于烧蚀固体样品以产生羽流，并且该单个激光器是电离样品羽流的激光电离系统的激光器。在该装置中，激光电离系统中的激光脉冲的重复频率必须经常比烧蚀腔室中的激光器的重复频率大几个数量级，以产生随后被电离的材料的羽流。因此，在将相同的激光器用于烧蚀和电离的实施方式中，设备还包括脉冲选择器(可从德尔光子(Del Mar photonics)、KMLab、EKSMA光学(EKSMAOptics)购得)，该脉冲选择器配置成控制引导至烧蚀腔室的激光脉冲。在一些实施方式中，设备包括激光脉冲功率控制器模块，该激光脉冲功率控制器模块编程为控制激光脉冲的功率以用于烧蚀和用于电离。在一些实施方式中，设备包括两个光学衰减器(可从索雷博、纽波特(Newport)等商购)，一个用于烧蚀激光脉冲，一个用于电离激光脉冲，以单独控制每种类型的脉冲频率。
质量检测器系统
质量检测器系统的示例性类型包括四极杆、飞行时间(TOF)、扇形磁场(magneticsector)、高分辨率、基于单收集器或多收集器的质谱仪。扇形磁场仪器特别适于每秒1兆像素及以上的高速记录。
分析电离材料所花费的时间取决于用于检测离子的质量分析仪的类型。例如，使用法拉第杯的仪器对于分析快速信号来说通常太慢。总体而言，所期望的成像速度、分辨率和多路复用程度将决定应使用的质量分析仪的类型(或者，相反地，质量分析仪的选择将确定可实现的速度、分辨率和多路复用性)。
例如，使用点离子检测器一次只能检测一种质荷比(m/Q，在MS中通常称为m/z)的离子的质谱仪器在成像检测中会给出较差的结果。首先，在质荷比之间切换所花费的时间限制了可以确定多个信号的速度，其次，如果离子处于较低丰度，那么当仪器聚焦于其他质荷比时，信号可能会丢失。因此，优选使用提供基本上同时检测具有不同m/Q值的离子的技术。
检测器类型
四极杆检测器
四极杆质量分析仪包括四个平行的杆，杆的一端处带有一个检测器。在一对杆和另一对杆之间施加交变射频电势和固定直流偏移电势，使得一对杆(每个杆彼此相对)具有与另一对杆相反的交变电势。电离的样品在平行于杆并朝向检测器的方向上穿过杆的中部。所施加的电势影响离子的轨迹，使得只有一定质荷比的离子才会具有稳定的轨迹，从而到达检测器。其他质荷比的离子会与杆碰撞。
扇形磁场检测器
在扇形磁场质谱分析法中，电离的样品朝向离子检测器穿过弯曲的飞行管。施加在飞行管之上的磁场使离子偏离它们的路径。每个离子的偏离量基于每个离子的质荷比，因此仅有一些离子将与检测器碰撞-其他离子将偏离检测器。在多收集器扇形场仪器中，检测器阵列用于检测不同质量的离子。在一些仪器中(例如，ThermoScientific NeptunePlus和Nu Plasma II)，磁扇区与静电扇区相结合，以提供一种双聚焦扇形磁场仪器，该仪器除了通过质荷比之外，还通过动能分析离子。特别是那些可以使用具有马陶-赫绍(Mattauch-Herzog)几何形状的多检测器(例如，SPECTRO MS，它可以使用半导体直接电荷检测器在单次测量中同时记录从锂到铀的所有元素)。这些仪器可以基本上同时测量多个m/Q信号。通过在检测器中包括电子倍增器，可以增加它们的灵敏度。阵列扇形仪器常常是适用的，然而，因为尽管它们对于检测增加的信号是有用的，但是当信号水平降低时它们就不太有用了，因此它们不太适合于标识以特别高的变化浓度存在的情况中。
飞行时间(TOF)检测器
飞行时间质谱仪包括样品入口、在其上施加强电场的加速室和离子检测器。电离的样品分子分组通过样品入口引入到加速室中。最初，每个电离的样品分子具有相同的动能，但是当电离的样品分子加速通过加速室时，它们由于它们的质量而分开，较轻的电离的样品分子比较重的离子行进得更快。然后，检测器在所有离子到达时对所有离子进行检测。每个粒子到达检测器所花费的时间取决于粒子的质荷比。
因此，TOF检测器可以准同时(quasi-simultaneouly)记录单个样品中的多个质量。理论上，因为ICP离子源的空间电荷特性、TOF技术并不理想地适用于ICP离子源，但TOF仪器实际上可以足够快速和灵敏地分析ICP离子气溶胶，以允许可行的单细胞成像。尽管TOF质量分析仪因为处理TOF加速器和飞行管中的空间电荷效应所需要的折衷、通常不受原子分析的欢迎，但是根据本公开的组织成像可以通过仅检测标识原子而有效，因此可以去除其他原子(例如，那些原子质量低于100的原子)。这导致低密度的离子束，富集在(例如)100-250道尔顿区域的质量中，这可以更有效地操纵和聚焦，从而促进TOF检测并利用TOF的高光谱扫描速率。因此，可以通过将TOF检测与选择样品中不常见的标识原子相结合、并理想地例如通过使用更高质量的过渡元素来具有高于未标识的样品中所见的质量来实现快速成像。因此，使用标识质量的更窄窗口意味着TOF检测可用于有效成像。
合适的TOF仪器可从托福克(Tofwerk)、GBC科学仪器(GBC ScientificEquipment)(例如，Optimass 9500ICP-TOFMS)和加拿大富鲁达(Fluidigm Canada)(例如，CyTOFTM和CyTOFTM2仪器)购得。这些CyTOFTM仪器的灵敏度比托福克和GBC仪器更高，并且因为它们能够快速且灵敏地检测稀土金属质量范围内的离子(特别是m/Q范围为100-200；参见Bandura等人(2009年；Anal.Chem.81：6813-22))而已知用于质谱流式细胞术中。因此，这些是与本公开一起使用的优选仪器，并且它们可以用于利用本领域中已知的仪器设置进行成像，例如，Bendall等人(2011；Science 332，687-696)以及Bodenmiller等人(2012；Nat.Biotechnol.30：858-867)。其质量分析仪可以在高频激光烧蚀或样品解吸的时间尺度上以高质谱采集频率准同时地检测大量标志物(marker)。它们可以测量标识原子的丰度，每个细胞的检测限度约为100，从而允许灵敏地构建组织样品的图像。由于这些特点，现在可以使用质谱流式细胞术来满足亚细胞分辨率下组织成像的灵敏度和多路复用的需求。通过将质谱流式细胞术仪器与高分辨率激光烧蚀采样系统和快速运输低色散样品腔室相结合，可以允许在实际时间尺度上以高多路复用来构建组织样品的图像。
TOF可以与质量分配校正器耦接。绝大多数电离事件产生M+离子，其中，从原子中敲除(knock out)单个电子。由于TOF MS的操作模式，有时，一个质量(M)的离子泄漏(或串扰(cross-talk))到相邻质量(M±1)的通道中，特别是在大量质量M的离子进入检测器的情况下(即，如果该设备包括这样的离子偏转器，则离子计数高，但没有高到使得位于采样电离系统和MS之间的离子偏转器会阻止它们进入MS)。由于每个M+离子到达检测器的时间遵循关于平均值的概率分布(这对于每个M是已知的)，当质量为M+的离子数量高时，则一些离子将在通常与M-1+或M+1+离子相关的时间到达。然而，由于每个离子在进入TOF MS时具有已知的分布曲线，所以基于质量为M的通道中的峰，可以(通过与已知的峰形状进行比较)确定质量为M的离子进入M±1通道的重叠。该计算特别适用于TOF MS，因为TOF MS中检测到的离子峰是不对称的。因此，可以校正M-1、M和M+1通道的读数，以将所有检测到的离子适当地分配给M通道。由于采样和电离系统产生的大离子分组的性质，这种校正在校正成像数据中具有特定用途，例如，本文公开的涉及激光烧蚀(或如下所讨论的解吸)的系统，作为从样品中去除材料的技术。WO2011/098834、美国专利8723108和WO2014/091243中讨论了通过对TOFMS的数据进行去卷积(de-convoluting)来提高数据质量的程序和方法。
构建图像
上述设备可以为从样品中去除的电离样品材料分组中的多个原子提供信号。对样品材料分组中的原子进行检测揭示了该原子存在于烧蚀位置处，这可能是因为原子天然存在于样品中，或者可能是因为原子已经由标识实际定位在该位置。通过从样品表面的已知空间位置产生一系列电离的样品材料分组，检测器信号揭示了样品上原子的位置，因此这些信号可用于构建样品的图像。通过用可区分的标识对多个目标进行标识，可以将标识原子的位置与同源目标的位置相关联，因此该方法可以建立复杂的图像，达到远超过使用诸如荧光显微镜检查等传统技术可实现的多路复用水平。
将信号组装成图像将使用到计算机，并且可以使用已知的技术和软件包来实现。例如，可以使用来自凯尔班克软件(Kylebank Software)的GRAPHIS包，或者也可以使用其他诸如TERAPLOT的包。使用来自诸如MALDI-MSI的技术的MS数据成像在本领域中是已知的，例如，Robichaud等人(2013；J Am Soc Mass Spectrom 24 5:718-21)公开了在Matlab平台上查看并分析MS成像文件的‘MSireader’界面，并且Klinkert等人(2014；Int J MassSpectrom http://dx.doi.org/10.1016/j.ijms.2013.12.012)公开了两种软件工具，用于在全空间和光谱分辨率下对2D和3D MSI数据集进行快速数据勘探和可视化，例如，“Datacube Explorer”程序。
使用本文公开的方法获得的图像可以例如以与分析IHC结果相同的方式进行进一步分析。例如，该些图像可用于描绘样品中的细胞亚群，并可提供对临床诊断有用的信息。类似地，SPADE分析可用于从本公开的方法提供的高维细胞计数数据中提取细胞层级(cellular hierarchy)(Qiu等人(2011；Nat.Biotechnol.29:886–91))。
样品
本公开某些方面提供了对生物样品成像的方法。此类样品可以包括多个细胞，该多个细胞可以经受成像质谱流式细胞术(IMC)以便提供样品中这些细胞的图像。本发明的实施方式可以用于分析目前由免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)技术所研究的组织样品，但是使用了适于通过质谱分析法(mass spectrometry,MS)或发射光谱分析法(optical emission spectrometry,OES)检测的标识原子。此外，本发明的实施方式提供了用于制备组织样品的各种技术以便提供比使用传统方式制备的样品的IMC和IMS技术改进的分辨率。具体地，本发明的实施方式提供了用于制备适于由电子显微镜成像的样品、用于制备超薄样品及它们结合的技术。这些方法在本文中进一步描述。
在本文描述的方法中可以使用任何适当的组织样品。例如，组织可以包括来自以下的一个或多个组织：上皮、肌肉、神经、皮肤、肠、胰腺、肾脏、大脑、肝脏、血液(例如血液涂片)、骨髓、口腔黏膜(buccal swipe)、子宫黏膜(cervical swipe)或任何其他组织。生物样品可以是永生细胞系或从活体获得的原代细胞。出于诊断、预后或实验(例如，药物开发)的目的，组织可以来自肿瘤。在一些实施方式中，样品可以来自已知的组织，但是可能不知道样品是否包含肿瘤细胞。成像可以揭示指示存在肿瘤的靶标的存在，从而便于诊断。来自肿瘤的组织可以包括免疫细胞，该免疫细胞也由本主题方法进行表征，并可提供对肿瘤生物学的洞察。组织样品可以包括福尔马林固定的、石蜡包埋的(paraffin-embedded,FFPE)组织。可以从任何活的多细胞生物体(诸如哺乳动物、动物研究模型(例如，特定疾病，诸如具有人肿瘤异种移植物的免疫缺陷啮齿动物)或人类患者)中获得组织。
组织样品可以是切片，厚度例如在2-10μm范围内，例如，在4-6μm之间。制备这种切片的技术在IHC领域是众所周知的，例如，使用切片机，该技术包括脱水步骤、固定、包埋、透化、切片等。因此，组织可以被化学固定，然后可以在期望平面中制备切片。冷冻切片或激光捕获显微切片也可用于制备组织样品。样品可以是透化性的(permeabilised)，例如，以允许摄取用于标识细胞内靶标的试剂(参见上文)。
待分析的组织样品的尺寸将类似于目前的IHC方法，尽管最大尺寸将由激光烧蚀设备决定，特别是由能够适配到激光烧蚀设备的样品腔室中的样品尺寸确定。高达5mm×5mm的尺寸是常规的，但是较小的样品(例如，1mm×1mm)也是有用的(这些大小是指切片的尺寸，而不是其厚度)。
除了用于对组织样品成像之外，本公开还可以代替用于对细胞样品成像，诸如，粘附细胞(adherent cell)或固定在固体表面上的细胞(如在常规免疫细胞化学中)的单层。这些实施方式对于分析不容易溶解以用于细胞悬液质谱流式细胞术的粘附细胞特别有用。因此，除了可用于增强当前的免疫组织化学分析之外，本公开还可用于增强免疫细胞化学。
超薄样品
如上所述，传统的IMC和IMS技术使用几微米厚的组织样品。
因此，本发明的实施方式提供了一种制备用于分析的生物样品的方法，该方法包括用标识原子(在本文中进一步描述标识原子)来标识样品以及将样品切片成薄切片，可选地，其中，将样品切片成厚度小于10微米以下的切片，诸如1微米以下、或100nm以下、或50nm以下或30nm以下。本发明的实施方式还提供了一种制备用于分析的生物样品的方法，该方法包括将样品切片成薄切片并使用标识原子(在本文中进一步描述标识原子)来标识样品进，可选地，其中，将样品切片成厚度小于10微米以下的切片，诸如1微米以下、或100nm以下、或50nm以下或30nm以下。可以使用诸如可从RM伯克勒(Boeckeler)购得的ATUMtome的自动切片机来将样品切片成厚度与本文描述的方法一致的切片。超薄切片可以有助于从样品中烧蚀更小的材料羽流，这有助于提高电离导管中的电离效率。
根据以上陈述的方法制备的样品可以与本文描述的任何IMC和IMS技术一起使用。然而根据以上陈述的方法制备的样品特别适于通过激光电离进行分析。
样品载体
在某些实施方式中，样品可以固定在固体支承物(即样品载体)上，以将其定位用于成像质谱分析法。固体支承物可以为光学透明的，例如由玻璃或塑料制成。
有时，样品载体将包括用作参考点的特征，以与本文所述的设备和方法一起使用，例如，以允许计算待烧蚀或解吸、和分析的目标的特征/区域的相对位置。参考点可以是光学可分辨的，或者可以通过质量分析来进行分辨。
靶标元素
在成像质谱分析法中，一个或多个靶标元素(即元素或元素同位素)的分布可能是令人感兴趣的。在某些方面，靶标元素为本文描述的标识原子。标识原子可以直接单独加入到样品中或共价结合至生物活性分子或在生物活性分子内共价结合。在某些实施方式中，标识原子(例如金属标记)可以与特异性结合对(specific binding pair,SBP)的元件偶联，诸如用于与DNA或RNA靶标杂交的抗体(与其同源抗原结合的抗体)、适体或寡核苷酸，如下详细描述的。标识原子可以通过本领域已知的任何方法而附接至SBP。在某些方面，标识原子为金属元素，诸如镧系元素或过渡元素或本文描述的其他金属标记。金属元素可能具有大于60amu、大于80amu、大于100amu或者大于120amu的质量。本文描述了质谱仪可以耗尽低于金属元素质量的元素离子，使得大量较轻的元素不会产生空间电荷效应和/或充溢(overwhelm)质量检测器。
组织样品的标识
本公开产生已经用标识原子(例如多个不同的标识原子)标识的样品的图像，其中，标识原子由能够对样品的特定区域、优选亚细胞区域进行采样的设备来检测(因此标识原子表示元素标记)。引用多个不同的原子意味着将多于一种的原子种类用于标识样品。可以使用质量检测器来区分这些原子种类(例如，它们具有不同的m/Q比)，使得羽流中两种不同标识原子的存在产生两种不同的MS信号。还可以使用光谱仪来区分这些原子种类(例如，不同原子具有不同的发射光谱)，使得羽流中两种不同标识原子的存在产生两种不同的发射光谱信号。
质量标记的试剂
本文使用的质量标记的试剂包括许多组分。第一个为SBP。第二个为质量标记。质量标记和SBP通过连接物进行连接，该连接物至少部分由质量标记和SBP的偶联形成。SBP和重量标记之间的连接物还可以包括间隔物。质量标记和SBP可以通过一系列反应化学物而偶联在一起。示例性的偶联反应化学物包括硫醇马来酰亚胺、NHS酯和胺或点击化学反应物(优选不含Cu(I)的化学物)，该点击化学反应物为诸如应变炔和叠氮化物、应变炔和硝酮以及应变烯烃和四嗪。
质量标记
本发明的实施方式中所使用的质量标记可以采用多种形式。通常，标记包括至少一种标识原子。本文下面讨论标识原子。
因此，在质量标记的最简单的形式中，质量标记可以包括金属螯合部分(metal-chelating moiety)，该金属螯合部分是具有在配体中配位(co-ordinated)的金属标识原子的金属螯合基团。在一些情况下，各质量标记仅检测单个金属原子可以是足够的。然而，在其他情况下，可能希望每个质量标记包含超过一个标识原子。这可以通过许多方式来实现，如下讨论的。
产生可以包含超过一个标识原子的质量标记的第一种方法是使用包括附接到聚合物的超过一个亚单元上的金属螯合配体的聚合物。能够结合聚合物中至少一个金属原子的金属螯合基团的数量可以在约为1和10000之间，诸如5-100、10-250、250-5000或者500-1000。至少一个金属原子可以结合至少一个金属螯合基团。聚合物可以具有约1和10000之间的聚合度，诸如5-100、10-250、250-5000、500-2500或者500-1000。因此，基于聚合物的质量标记可以包括约1个和10000个之间的标识原子，诸如5-100个、10-250个、250-5000个、500-2500个或者500-1000个。
用于质谱流式细胞术应用的样品的标识
在一些实施方式中，如上描述的，设备和方法检测已经加入到样品中的(即，通常不存在的)原子。此类原子称为标识原子。在一些实施方式中，同时检测许多超过一个标识原子，能够允许多路复用标识检测例如至少3个、4个、5个、10个、20个、30个、32个、40个、50个或者甚至100个不同的标识原子。标识原子还可以以组合的方式使用，以进一步增加可区分标识的数量。通过标识具有不同标识原子的不同靶标可以确定单个细胞上多个靶标的存在。
可以在实施方式中使用的标识原子包括可通过MS或OES检测并基本上不存在于未标识的组织样品的任何种类。因此，例如12C原子将不适于作为标识原子，因为它们是天然丰富的，而理论上11C可以用于MS，因为它是人工同位素，不是天然不存在的。一般标识原子为金属。然而，在优选的实施方式中，标识原子为过渡金属，诸如稀土金属(15种镧系元素、加上钪和钇)。这17个元素(可以通过OES和MS进行区分)提供了(通过MS)可以容易地进行区分的许多不同的同位素。这些元素中的多种可以以富集同位素的形式获得，例如钐具有6种稳定同位素，且钕具有7中稳定同位素，这些全部可以以富集的形式获得。15个镧系元素提供了非冗余唯一质量的至少37种同位素。适于用作标识原子的元素的实施例包括镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钪(Sc)和钇(Y)。除了稀土金属外，其他金属原子也适于检测，例如金(Au)、铂(Pt)、铱(Ir)、铑(Rh)、铋(Bi)等。放射性同位素的使用并非是优选的，因为它们不便于处理，并且不稳定，例如Pm在镧系金属中并不是优选的标识原子。
为了便于飞行时间(TOF)分析(如本文所讨论的)，使用原子质量在80-250的范围内的标识原子是有帮助的，例如在80-210的范围内、或者在100-200的范围内。该范围包括全部的镧系金属，但不包括Sc和Y。100-200的范围允许在利用TOF MS的高光谱扫描速率的情况下，通过使用不同的标识原子进行理论101-plex分析。如上所提及的，通过选择其质量位于未标识的样品中看见的窗口(window)之上的标识原子(例如在100-200的范围内)，TOF检测可以在生物学显著水平上提供快速成像。
根据所使用的质量标记(并因而各质量标记的标识原子数量)以及附接至各SBP的质量标记数量，可以将不同数量的标识原子附接至单个SBP元件上。当更多的标识原子附接至任何SBP元件上时，可以实现更高的灵敏度。例如，可以将大于10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个的标识原子附接至SBP元件，诸如多达10000个，例如5-100个、10-250个、250-5000个、500-2500个或500-1000个标识原子。如上记载的，可以使用包含多个单体单元的单分散聚合物，每个单体单元包含诸如二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid,DTPA)或DOTA的螯合剂。例如，DTPA以约10-6M的解离常数结合3+镧系离子。这些聚合物可以以硫醇终止(terminate)，硫醇可以用于通过其与马来酰胺的反应而附接至SBP，从而附接与以上讨论一致的点击化学反应物。其他官能团还可以用于这些聚合物的偶联，例如诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯的胺反应性基团，或者对羧基或对抗体糖基化反应的基团。任何数量的聚合物可以与每个SBP结合。可以使用的聚合物的具体实施例包括直链(“X8”)聚合物或第三代树突状(“DN3”)聚合物，这两者可作为MaxParTM试剂购得。金属纳米粒子的使用还可以用于增加标识中的原子数量，如上所讨论的。
在一些实施方式中，质量标记中的所有标识原子具有相同的原子质量。可替代地，质量标记可以包括不同原子质量的标识原子。因此，在一些情况下，可以用一系列质量标记的SBP来对标识的样品进行标识，每个SBP仅包括单一类型的标识原子(其中，每个SBP结合其同源靶标，并因此每种类型的质量标记在样品上定位于特定的例如抗原)。可替代地，在一些情况下，可以利用一系列质量标记的SBP对标识的样品进行标识，每个SBP包括标识原子的混合物。在一些情况下，用于标识样品的质量标记SBP可以包括具有单个标识原子质量标记的混合物、以及在其质量标记中标识原子的混合物。
间隔物
如上所记录的，在一些情况下，SBP通过包括间隔物的连接物而偶联至质量标记。在SBP和点击化学试剂之间(例如在SBP和应变环炔(或叠氮化物)；应变环烯(或四嗪)等之间)可能存在间隔物。在质量标记和点击化学试剂之间(例如质量标记和叠氮化物(或应变环炔)；四嗪(或应变环烯)等之间)可能存在间隔物。在一些情况下，在SNP和点击化学试剂之间、以及点击化学试剂和质量标记之间都可能存在间隔物。
间隔物可以为聚乙二醇(PEG)间隔物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)间隔物、聚甘油(PG)间隔物、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)间隔物、或聚恶唑啉(POZ，诸如聚甲基恶唑啉、聚乙基恶唑啉或聚丙基恶唑啉)或者C5-C20非环烷基间隔物。例如，间隔物可以为具有3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10个以上、11个以上、12个以上、15个以上或者20个以上的EG(乙二醇)单元的PEG间隔物。PEG连接物可以具有3个至12个EG单元、4个至10个EG单元，或者可以具有4个、5个、6个、7个、8个、9个或者10个EG单元。连接物可以包括胱氨(cystamine)或其衍生物，可以包括一个或多个二硫化物基团，或者可以为本领域技术人员已知的任何其他适当的连接物。
间隔物可以有利于最小化SBP上的质量标记的位阻效应，该质量标记与SBP偶联。亲水性间隔物(诸如基于PEG的间隔物)也可以用于改进质量标记的SBP的溶解度并用于防止聚集。
SBP
包括成像质谱流式细胞术的质谱流式细胞术是基于特异性结合对的元件之间的特异性结合的原理。质量标记连接至特异性结合对元件，并且这将质量标记定位至靶标/分析物，该靶标/分析物是该对的另一元件。然而，特异性结合并不要求仅结合至一种分子种类而排除其他种类。相反，定义了该结合不是非特异性的，即不是随机相互作用。因此，与多个目标结合的SBP的一个实施例是识别许多不同蛋白质之间共有的表位的抗体。在此，结合将是特异性的，并由抗体的CDR介导，但抗体将可以检测到多种不同的蛋白质。共同表位可以是天然存在的，或者共同表位可以是人工标记，例如，FLAG标记。类似地，对于核酸来说，限定序列的核酸可能并不专有地与完全互补的序列结合，但是在使用不同严格性的杂交条件下可以引入不同的错配容限(tolerance of mismatch)，正如本领域技术人员所理解的。然而，这种杂交不是非特异性的，因为它是由SBP核酸和靶标分析物之间的同源性介导的。类似地，配体可以特异性结合至多种受体，一个简单的示例是结合至TNFR1和TNFR2的TNFα。
SBP可以包括以下任何一种：核酸双链体(duplex)；抗体/抗原复合物；受体/配体对；或者适体/靶标对。因此，标识原子可以附接至核酸探针上，核酸探针随后与组织样品接触，使得探针可以与组织样品的互补核酸杂交，例如，以形成DNA/DNA双链体、DNA/RNA双链体或RNA/RNA双链体。类似地，标识原子可以附接至抗体，抗体随后与组织样品接触，使抗体可以与其抗原结合。标识原子可以附接至配体，该配体随后与组织样品接触，使配体可以与其受体结合。标识原子可以附接至适体配体上，该适体配体随后与组织样品接触，使适体配体可以与其靶标结合。因此，标识的SBP元件可以用于检测样品中的多种靶标，包括DNA序列、RNA序列、蛋白质、糖、脂肪、或代谢物。
因此，质量标记的SBP可以为蛋白质或肽、或者多核苷酸或寡核苷酸。
蛋白质SBP的实施例包括抗体或其抗原结合片段、单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白、scFv、抗体模拟物、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、生物素或其组合，其中，可选地，抗体模拟物包括纳米体(nanobody)、亲合体(affibody)、亲和物(affilin)、亲和多聚体(affimer)、亲和素(affitin)、α体(alphabody)、抗运载蛋白(anticalin)、阿维默(avimer)、DARPin、Fynomer、库尼茨(kunitz)结构域肽、单体或它们的任何组合、受体(诸如受体-Fc融合物)、配体(诸如配体Fc融合物)、外源凝聚素(例如凝聚素，诸如麦胚凝集素)。
肽可以为线性肽，或环状肽、诸如双环肽。可以使用的肽的一个示例为鬼笔环肽(Phalloidin)。
多核苷酸或寡核苷酸通常是指包含通过3'-5'磷酸二酯键连接的脱氧核糖核酸或核糖核酸的单链或双链核苷酸聚合物、以及多核苷酸类似物。核酸分子包括但不限于DNA、RNA和cDNA。多核苷酸类似物可以具有除了在天然多核苷酸中发现的标准磷酸二酯键外的主链，以及可选地，修饰的糖部分或除了核糖或脱氧核糖外的部分。多核苷酸类似物包含能够通过非沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与标准多核苷酸碱基形成氢键的碱基，其中，类似物主链以允许寡核苷酸类似物分子和标准多核苷酸中的碱基之间以序列特异性方式形成这种氢键的方式提供碱基。多核苷酸类似物的实施例包括但不限于异种核酸(xenonucleic acid,XNA)、桥接核酸(bridged nucleic acid,BNA)、乙二醇核酸(glycolnucleic acid,GNA)、肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)、yPNA、吗啉代多核苷酸、锁核酸(locked nucleic acid,LNA)、苏糖核酸(threose nucleic acid,TNA)、2'-0-甲基多核苷酸、2'-0-烷基核糖基取代多核苷酸、硫代磷酸多核苷酸、和硼磷酸多核苷酸。多核苷酸类似物可以具有嘌呤或嘧啶类似物，例如包括7-去氮嘌呤类似物、8-卤代嘌呤类似物、5-卤代嘧啶类似物，或者可以与任何碱基配对的通用碱基类似物，包括次黄嘌呤、硝基唑类、异喹诺酮类似物、唑甲酰胺和芳族三唑类似物，或者具有额外官能性的碱基类似物，诸如用于亲和结合的生物素部分。
抗体SBP元件
在常规的实施方式中，标识的SBP元件为抗体。可以通过将一个或多个标识原子结合分子与抗体偶联、通过使用例如NHS-氨基化学物、巯基马来酰亚胺化学物或点击化学物(诸如应变炔和叠氮化物、应变炔和硝酮、应变烯烃和四嗪等)附接质量标记来实现抗体的标识。识别对于成像有用的细胞蛋白质的抗体已经可广泛购得以供IHC使用，并且通过使用标识原子代替目前的标识技术(例如荧光)，这些已知的抗体可以容易的适于在本文公开的方法中使用，但是具有增加多路复用能力的益处。抗体可以识别细胞表面上的靶标或细胞内的靶标。抗体可以识别多种靶标，例如，它们可以特异性识别各个蛋白质，或者可以识别共享共同表位的多个相关蛋白质，或者可以识别蛋白质上的特定转译后修饰物(例如，以区分靶标蛋白质上的酪氨酸和磷光体-酪氨酸，以区分赖氨酸和乙酰赖氨酸，以检测泛素化等)。在结合至其靶标之后，可以检测与抗体偶联的标识原子以揭示样品中该靶标的位置。
经标识的SBP元件通常将与样品中的靶标SBP元件直接相互作用。然而，在一些实施方式中，经标识的SBP元件可以与靶标SBP元件间接相互作用，例如一次抗体可以与靶标SBP元件结合，且随后经标识的二次抗体可以以夹心式测定的方式与一次抗体结合。然而，一般该方法依赖于直接相互作用，因为这样可以更容易实现并且允许了更高的多路复用。然而，在这两种情况下，样品与SBP元件接触，该SBP元件可以结合至样品中的靶标SBP元件，并在稍后阶段检测到附接到靶标SBP元件的标识。
核酸SBP，以及标识方法论修饰物
RNA是另一种生物分子，本文公开的该方法和设备能够以特定的、灵敏的和定量的(如果需要的话)方式来检测RNA。以与上述分析蛋白质相同的方式，可以通过使用用元素标记标识的SBP元件来检测RNA(例如，如上所讨论的，互补序列的多核苷酸或寡核苷酸，包括互补序列的锁核酸(LNA)分子、互补序列的肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)分子、互补序列的质粒DNA、互补序列的扩增DNA、互补序列的RNA片段和互补序列的基因组DNA片段)，该元素标记特异性结合至RNA。RNA不仅包括成熟的mRNA，还包括RNA加工中间体和新生的前mRNA转录物。
在某些实施方式中，RNA和蛋白质都使用本文描述的方法进行检测。
为了检测RNA，可以制备本文所讨论的生物样品中的细胞以使用本文描述的方法和设备来分析RNA和蛋白质含量。在某些方面，在杂交步骤之前将细胞固定并进行透化。细胞可以提供为固定的和/或透化的。可以通过诸如甲醛、戊二醛的交联固定剂而将细胞固定。可替代地或另外地，可以使用诸如乙醇、甲醇或丙酮的沉淀固定剂将细胞进行固定。细胞可以通过去污剂透化，去污剂诸如聚乙二醇(例如Triton X-100)、聚氧乙烯(20)去山梨糖醇月桂酸酯(吐温-20)、皂角苷(一组两亲性糖苷)、或者诸如甲醇或丙酮的化学物。在某些情况下，可以用相同试剂或试剂组执行固定和透化。固定和透化技术通过Jamur等人在“细胞膜渗透(Permeabilization of Cell Membranes)”(Methods Mol.Biol.,2010)中进行讨论。
已经预先使用荧光团标记的寡核苷酸探针执行了细胞中靶标核酸的检测、或“原位杂交”(in-situ hybridization,ISH)。如本文所讨论的，与电离和质谱耦接的质量标记的寡核苷酸可以用于检测细胞中的靶标核酸。原位杂交的方法在本领域中是已知的(参见Zenobi等人，“Single-Cell Metabolomics:Analytical and Biological Perspectives,”Science vol.342,no.6163,2013)。杂交方法在美国专利申请第5,225,326号和美国专利公开第2010/0092972号和第2013/0164750号中描述，其通过引用合并于本文。
在杂交前，可以将悬浮存在或固定在固体支承物上的细胞如先前所讨论的进行固定和透化。透化可以允许细胞保留靶标核酸，同时允许靶标杂交核苷酸、扩增寡核苷酸和/或质量标记的寡核苷酸进入细胞。在任何杂交步骤之后可以洗涤细胞，例如，在靶标杂交寡核苷酸与核苷酸靶标杂交之后、在扩增寡核苷酸杂交之后、和/或在质量标记的寡核苷酸杂交之后。
为了便于处理，对于该方法的全部或大多数步骤，细胞可以处于悬浮。然而，该方法还可以适用于固体组织样品(例如组织切片)中的细胞和/或固定在固体支承物(例如载玻片或其他表面)上的细胞。因此，有时，细胞在样品中和在杂交步骤期间可以是悬浮的。其他时间，在杂交期间，细胞可以固定在固体支承物上。
靶标核酸包括任何目标核酸，并且在细胞中具有足够的丰度以通过本主题方法进行检测。靶标核酸可以为RNA，RNA的多个拷贝存在于细胞内。例如在细胞中可以存在10个以上、20个以上、50个以上、100个以上、200个以上、500个以上或者1000个以上靶标RNA的拷贝。靶标RNA可以为信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)、小干扰RNA(siRNA)、长非编码RNA(IncRNA)或者本领域已知的任何其他类型的RNA。目标RNA的长度可以是20个核苷酸以上、30个核苷酸以上、40个核苷酸以上、50个核苷酸以上、100个核苷酸以上、200个核苷酸以上、500个核苷酸以上、1000个核苷酸以上、20到1000个核苷酸之间、20到500个核苷酸之间、40到200个核苷酸之间等。
在某些实施方式中，质量标记寡核苷酸可以直接与靶标核酸序列杂交。然而，额外的寡核苷酸杂交可以允许改进特异性和/或信号放大。
在某些实施方式中，两个以上的靶标杂交寡核苷酸可以与靶标核酸上的近侧区杂交，并且可以一起在杂交方案中提供杂交额外的寡核苷酸的位点。
在某些实施方式中，质量标记的寡核苷酸可以直接与两个以上的靶标杂交寡核苷酸进行杂交。在其他实施方式中，可以同时或连续添加一个或多个扩增寡核苷酸，以便将两种以上的靶标杂交寡核苷酸进行杂交并提供多个杂交位点，质量标记的寡核苷酸可以结合至该多个杂交位点。可以提供具有或不具有质量标记的寡核苷酸的一个或多个扩增寡核苷酸，作为能够与两个以上的靶标杂交寡核苷酸进行杂交的多聚体。
在使用两个以上的靶标杂交寡核苷酸改进特异性的情况下，使用扩增寡核苷酸增大了信号。两个靶标杂交寡核苷酸与细胞中的目标RNA进行杂交。两个目标杂交寡核苷酸一同提供了杂交位点，扩增寡核苷酸可以结合至该杂交位点。可以在允许与两个邻近靶标杂交寡核苷酸杂交、但高于将扩增寡核苷酸与仅一个靶标杂交寡核苷酸杂交的解链温度的温度下执行扩增寡核苷酸的杂交和/或后续洗涤。第一扩增寡核苷酸提供了多个杂交位点，第二扩增寡核苷酸可以结合至该多个杂交位点，从而形成分支模式(branched pattern)。质量标记的寡核苷酸可以结合至第二扩增核苷酸提供的多个杂交位点。这些扩增寡核苷酸(具有或不具有质量标记的寡核苷酸)在本文中统称为“多聚体”。因此，术语“扩增寡核苷酸”包括提供相同结合位点的多个拷贝的寡核苷酸，另外的寡核苷酸可以退火到该结合位点。通过增加其他寡核苷酸的结合位点的数量，可以发现靶标的标识的最终数量增加。因此，多个标识的寡核苷酸与单个靶标RNA间接杂交。这使得能够通过增加各RNA所用元素的可检测原子的数量来检测低拷贝数的RNA。
用于执行该扩增的一个特定方法包括使用来自先进细胞技术诊断的
Figure BDA0003495048130000341
方法，如在下面详细讨论的。进一步的替代方案是使用适应
Figure BDA0003495048130000342
FlowRNA方法(昂飞电子生物科学(Affymetrix eBioscience))的方法。该测定是基于具有分支DNA(branched DNA,bDNA)信号放大的寡核苷酸对探针设计。目录中有超过4000个探针，或者可以请求定制组而无需额外花费。根据前面段落，该方法运行以将靶标杂交寡核苷酸与靶标进行杂交、随后形成包括第一扩增寡核苷酸(在
Figure BDA0003495048130000343
方法中简称为前置扩增寡核苷酸)的分支结构，以形成多个第二扩增寡核苷酸(在
Figure BDA0003495048130000344
方法中简称为扩增寡核苷酸)可以退火的主干(stem)。随后可以结合多个质量标记的寡核苷酸。
RNA信号的扩增的另一手段依赖于滚环扩增手段(rolling circle means ofamplification,RCA)。有各种方法可以解释为什么这个扩增系统可以被引入到扩增过程中。在第一种情况下，第一核酸用作杂交核酸，其中第一核酸为环状的。第一核酸可以为单链的或者可以为双链的。第一核酸包括作为与目标RNA互补的序列。在将第一核酸与目标RNA杂交后，与第一核酸互补的引物与第一核酸进行杂交，并用于使用聚合酶和核酸进行引物延伸，通常是外源添加到样品。然而，在一些情况下，在将第一核酸添加到样品时，可能已经具有与其杂交的用于延伸的引物。由于第一核酸为环状的，因此当引物延伸已经完成一轮完整的复制时，聚合酶可以取代引物并继续延伸(即不具有5’→3’外显子酶活性)，产生第一核酸的互补序列的进一步连接和进一步链式拷贝(chained copy)，从而扩增该核酸序列。如上所讨论的，包括元素标记(RNA或DNA、或者LNA或PNA等)的寡核苷酸因此可以与第一核酸的互补序列的链式拷贝杂交。因此，RNA信号的扩增程度可以由分配给环状核酸扩增步骤的时间长度来控制。
在RCA的另一应用中，例如与靶标RNA杂交的第一寡核苷酸并非是环状的，它可以是线性的，并且包括具有与其靶标互补的序列的第一部分和使用者选择的第二部分。具有与该第二部分同源的序列的环状RCA模板随后可以与该第一寡核苷酸杂交，并如上进行RCA扩增。第一寡核苷酸(例如，具有靶标特异性部分和使用者选择部分的寡核苷酸)的用途是可以选择使用者选择部分，以便在各种不同探针之间通用。这是试剂高效的，因为相同的后续扩增试剂可以用于检测不同靶标的一系列反应。然而，如技术人员所理解的，当利用该策略时，对于在多路复用反应中的特定RNA的单独检测，与靶标RNA杂交的每个第一核酸将需要具有唯一的第二序列，进而每个环状核酸应当包含可以通过标识的寡核苷酸进行杂交的唯一序列。以此方式，可以特异性扩增并检测到来自每个靶标RNA的信号。
对于技术人员来说实现RCA分析的其他配置是已知的。在一些情况下，为了防止例如第一寡核苷酸在随后的扩增步骤和杂交步骤中从靶标解离例如第一寡核苷酸可以在杂交之后进行固定(诸如通过甲醛)。
进一步地，杂交链式反应(hybridisation chain reaction,HCR)可以用于放大RNA信号(例如参见Choi等人，2010,Nat.Biotech,28:1208-1210)。Choi解释了HCR放大器由两个核酸发夹(hairpin)物种组成，该两个核酸发夹不存在引发剂的情况下不发生聚合。每个HCR发夹由输入结构域和输出结构域组成，输入结构域具有暴露的单链趾(single-stranded toehold)，输出结构域具有隐藏在折叠发夹中的单链趾。引发剂与两个发夹之一的输入结构域杂交、打开了发夹以暴露其输出结构域。该(先前隐藏的)输出结构域与第二个发夹的输入结构域杂交、打开了发夹以暴露出序列中与引发剂相同的输出结构域。引发剂序列的再生为交替第一发夹聚合步骤和第二发夹聚合步骤的链反应提供了基础，导致形成带切口的双链“聚合物”。在本文公开的方法和设备的应用中，第一发夹和第二发夹中的任一者或二者可以用元素标记进行标识。因为扩增程序依赖于特定序列的输出结构域，因此，使用不同的发夹组的各种离散扩增反应可以在相同过程中独立执行。因此，该扩增还允许了在多种RNA种类的多路复用分析中进行扩增。如Choi所记录的，HCR是等温触发的自组装过程。因此，发夹应当在经历原位触发的自组装之前穿透样品，表明了样品深度穿透和高信噪比的可能性。
杂交可以包括将细胞与一个或多个寡核苷酸接触，诸如靶标杂交寡核苷酸、扩增寡核苷酸、和/或质量标记的寡核苷酸，并提供了可以发生杂交的条件。可以在缓冲溶液中执行杂交，诸如生理盐水柠檬酸钠(saline sodium-citrate,SCC)缓冲液、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate-buffered saline,PBS)、生理盐水-磷酸钠-EDTA(saline-sodiumphosphate-EDTA,SSPE)缓冲液、TNT缓冲液(具有Tris-HCl、氯化钠和吐温20)、或任何其他合适的缓冲液。可以在一个或多个寡核苷酸杂交的解链温度左右、或低于该解链温度下执行杂交。
通过在杂交之后执行一次或多次洗涤可以改进特异性，以便去除未结合的寡核苷酸。增加洗涤的严格性可能会改进特异性，但会降低整体信号。可以通过增加或减少洗涤缓冲液的浓度、增加温度和/或增加洗涤的持续时间来增加洗涤的严格性。RNAse抑制剂可用于任何或所有杂交温育及随后的洗涤。
包括一个或多个靶标杂交寡核苷酸、扩增寡核苷酸和/或质量标记的寡核苷酸的第一组杂交探针可以用于标识第一靶标核酸。额外的杂交探针集可以用于标识额外的靶标核酸。各杂交探针集可以特异于不同的靶标核酸。可以设计、杂交并洗涤该额外的杂交探针集，以便减少或防止不同集的寡核苷酸之间的杂交。此外，各集的质量标记寡核苷酸可以提供唯一的信号。就此而言，多个寡核苷酸集可以用于检测2个、3个、5个、10个、15个、20个或更多个不同的核酸靶标。
有时，检测到的不同核酸是单个基因的剪接变体。质量标记的寡核苷酸可以设计成在外显子序列内(通过下面解释的其他寡核苷酸直接地或间接地杂交)杂交以检测包含该外显子的全部转录物(transcript)，或者可以设计成桥接剪接接头以检测特异性变体(例如，如果基因具有三个外显子，两个剪接变体-外显子1-2-3以及外显子1-3-，则这两个可以区分：变体1-2-3可以通过与外显子2杂交而被特异性检测，且变体1-3可以通过与外显子1-3接头杂交而被特异性检测。
单个细胞分析
本公开的方法包括激光烧蚀样品中的多个细胞，并因此分析来自多个细胞的羽流，并且将它们的包含物映射到样品中的特定位置以提供图像。在大多数情况下，本方法的使用者将需要将信号定位到样品内的特定细胞，而不是定位到整个样品。为了实现这一点，可以对样品中的细胞边界(例如质膜，或者在一些情况下为细胞壁)进行界定。
细胞边界的界定可以以各种方式实现。例如，可以使用能够界定细胞边界的常规技术来研究样品，诸如以上所讨论的显微镜检查。因此，当执行这些方法时，包括如上所讨论的相机的分析系统特别有用。随后可以使用本公开的方法制备该样品的图像，并且该图像可以叠加在早期结果上，从而允许将检测到的信号定位至特定细胞。实际上，如上所讨论的，在一些情况下，激光烧蚀可以仅针对样品中的通过使用基于显微镜检查的技术确定为目标的细胞子集。
然而，为了避免需要使用多种技术，作为本公开的成像方法的一部分，可以界定细胞边界。此类边界界定策略在IHC和免疫细胞化学中很常见，并且这些方法可以通过使用可以被检测到的标识进行调整。例如，该方法可以涉及对位于细胞边界处的靶标分子进行标识，并且来自这些标识的信号随后可以用于边界界定。适当的靶标分子包括丰富的或通用的细胞边界标志物，诸如，粘附复合物(adhesion complex)的成分(例如，β-连环蛋白或E钙粘蛋白)。一些实施方式可以标识超过一个膜蛋白，以便增强界定。
除了通过包括适当的标识来界定细胞边界，还可以以此方式界定特定细胞器。例如，诸如组蛋白的抗原(例如H3)可以用于识别细胞核，并且还可以标识线粒体特异性抗原、细胞骨架特异性抗原、高尔基体特异性抗原、核糖体特异性抗原等，从而允许通过本公开的方法来分析细胞超微结构。
界定细胞边界(或细胞器)的信号可以通过眼睛进行评估，或者可以通过使用图像处理的计算机进行分析。这样的技术在本领域中对于其他成像技术是已知的，例如Arce等人(2013；Scientific Reports 3,article 2266)描述了一种使用空间滤波以从荧光图像中确定细胞边界的分割方案，Ali等人(2011；Mach Vis Appl 23:607-21)公开了一种从明视场显微镜图像确定边界的算法，Pound等人(2012；The Plant Cell 24:1353-61)公开了一种从共焦显微镜图像提取细胞几何形状的细胞集(CellSeT)方法，并且Hodneland等人(2013；Source Code for Biology and Medicine 8:16)公开了一种用于荧光显微镜图像的CellSegm MATLAB工具箱。对本公开有用的方法使用分水岭变换(watershedtransformation)和高斯模糊。这些图像处理技术可以单独使用，或者可以使用它们并随后通过眼睛来检查。
当已经界定细胞边界时，可以将来自特定靶标分子的信号分配给各个细胞。例如还可以通过对照定量标准校准该方法而对单个细胞中靶标分析物的量进行定量。
参考粒子
如本文所描述的，可以将已知元素或同位素组成的参考粒子添加到样品(或样品载体)，从而在检测样品中的靶标元素离子期间用作参考。在某些实施方式中，参考离子包括金属元素或同位素，诸如过渡金属或镧系金属。例如，参考粒子可以包括质量大于60amu、大于80amu、大于100amu或大于120amu的元素或同位素。
靶标元素(诸如标识原子)可以基于从单个参考粒子检测到的元素离子而在样品运行中进行标准化。例如，本主题方法可以包括从单个参考粒子检测到的元素离子和仅检测靶标元素离子之间切换。
术语“包括”涵盖了“包含”以及“组成”，例如，组合物“包括”X可以仅由X组成或可以包括额外的物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”是可选的，并表示例如x±10％。
词汇“基本上”并不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，词汇“基本上”可以从本发明的实施方式的定义中省略。
附图的描述
图1.ICP炬管的图示。
图2.本发明的实施方式的质谱流式细胞仪的图示。
图3.通过穿过锥形导管而再成形的羽流的图示。本文中、材料的初始球形云在穿过变窄的导管时直径减小。在导管的中心流动通常是最快的，意味着当云沿着导管由流动气体携带时，云会伸长。锥形导管和气流的适当设计可以从先前的球形云产生具有非常小直径的材料的长蒸汽。
图4.反射器装置的图示。
图5.使用凸面反射器的反射器装置的图示。5A示出了通过导管的反射，且5B使出了在导管的锥形端部处的反射。
图6.在导管(起到波导作用)的宽部处引导激光、电离使得能量密度仅到达适于在锥形部中电离水平的激光电离的图示。
图7.使用包括喇叭口的电离导管的实施方式的激光电离的图示。

Claims (23)

1.一种设备，所述设备包括：
a.采样器；
b.激光电离系统，以接收通过所述采样器从样品去除的材料，其中，所述激光电离系统包括电离系统导管和脉冲激光器，所述脉冲激光器适于将穿过或离开所述电离系统导管的样品材料进行电离；以及
c.质谱仪，以从所述电离系统接收元素离子并分析所述元素离子。
2.根据权利要求1所述的设备，其中，所述激光电离系统的所述激光器为皮秒激光器或飞秒激光器。
3.根据权利要求2所述的设备，其中，所述激光电离系统的所述激光器为固态激光器、光纤激光器、半导体激光器或VECSEL。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的设备，其中，所述激光电离系统的所述激光器适于产生具有小于1ps的持续时间的脉冲。
5.根据权利要求4所述的设备，其中，所述激光电离系统的所述激光器适于产生具有500fs以下，诸如400fs以下、300fs以下、200fs以下、100fs以下、50fs以下、25fs以下、20fs以下或者10fs以下的持续时间的脉冲。
6.根据权利要求5所述的设备，其中，所述激光电离系统的所述激光器适于产生重复频率为至少100,000Hz的激光脉冲，所述重复频率诸如至少1MHz、至少2MHz、至少3MHz、至少4MHz、至少5MHz、至少10MHz、至少20MHz、至少50MHz、至少100MHz、至少200MHz、至少500MHz、或者1GHz以上。
7.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中，所述激光电离系统的所述激光器适于具有100μm以下，诸如50μm以下、20μm以下、10μm以下或者5μm以下的光束宽度。
8.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中，所述电离系统导管包括锥形部，所述导管的内径沿着所述锥形部减小。
9.根据权利要求8所述的设备，其中，所述电离系统导管直径减小大约2倍以上，诸如大约3倍以上、大约4倍以上、大约5倍以上、大约6倍以上、大约7倍以上、大约8倍以上、大约9倍以上、大约10倍或者大于10倍。
10.根据权利要求8或9所述的设备，其中，所述锥形部适于使得在所述锥形部的窄端处的气流为超音速的。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的设备，其中，所述电离系统导管包括所述锥形部下游的喇叭口，并且所述电离激光器定位成引导来自所述锥形的所述喇叭口侧的激光。
12.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中，所述激光电离系统还包括反射器装置，以使得由所述激光器产生的激光辐射多次穿过所述电离系统导管或穿过离开所述电离系统导管的材料的路径。
13.根据权利要求12所述的设备，其中，所述反射器装置包括一个或多个反射器，所述一个或多个反射器成形为在所述电离系统导管的出口内或所述电离系统导管的出口处提供多个焦点，诸如其中一个或多个反射器为凸面的。
14.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中，所述采样器为激光烧蚀系统。
15.根据权利要求14所述的设备，其中，所述激光烧蚀系统的激光器适于以下述重复频率来烧蚀所述样品，所述重复频率为大约10Hz以上，诸如大约20Hz以上、大约30Hz以上、大约50Hz以上、或者大约100Hz以上。
16.根据权利要求14或15所述的设备，其中，所述采样器配置成产生样品材料的羽流，并且所述激光电离系统配置成产生用于电离单个羽流的多个激光脉冲。
17.根据权利要求16所述的设备，其中，所述激光电离系统的所述激光器配置成以下述重复频率来产生脉冲，所述重复频率比所述激光烧蚀系统的重复频率大103倍，诸如大104倍以上、大5×104以上、大105倍以上、大5×105倍以上、大106倍、或者大超过106倍。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的设备，其中，所述激光烧蚀系统的激光器配置成烧蚀光斑尺寸直径小于4μm，诸如约3μm以下、约2μm以下、约1μm以下、约0.5μm或者小于0.5μm的样品。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的设备，其中，所述激光烧蚀系统的所述激光器配置成烧蚀样品以将样品烧蚀至每激光脉冲500nm以下、小于400nm、小于300nm、小于200nm、小于100nm、或者50nm以下的深度。
20.根据前述权利要求中任一项所述的设备，所述设备为质谱流式细胞仪。
21.一种执行质谱流式细胞术的方法，所述方法包括从采样器获得样品材料，用激光器将从所述采样器获得的样品材料电离以产生样品离子，以及通过质谱分析法检测所述样品离子。
22.一种分析样品的方法，所述方法包括从采样器获得样品材料的多个部分，用激光器将从所述采样器获得的样品材料的各部分单独电离以产生样品离子，以及通过质谱分析法检测所述样品离子，其中，通过多个激光脉冲来电离材料的各部分。
23.一种执行质谱流式细胞术的方法，所述方法使用根据权利要求1-18中任一项所述的设备或者根据权利要求19所述的质谱流式细胞仪。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5742050A (en) * 1996-09-30 1998-04-21 Aviv Amirav Method and apparatus for sample introduction into a mass spectrometer for improving a sample analysis
EP1318394B1 (en) * 2001-12-06 2008-02-13 Interuniversitair Microelektronica Centrum Vzw Method and apparatus for local surface analysis
US7161145B2 (en) * 2004-04-21 2007-01-09 Sri International Method and apparatus for the detection and identification of trace organic substances from a continuous flow sample system using laser photoionization-mass spectrometry
WO2014079802A2 (en) * 2012-11-20 2014-05-30 Ventana Medical Systems, Inc. Laser ablation inductively-coupled plasma mass spectral tissue diagnostics
US9589779B2 (en) * 2013-04-17 2017-03-07 Fluidigm Canada Inc. Sample analysis for mass cytometry
WO2015031321A1 (en) * 2013-08-26 2015-03-05 Akos Vertes Remote laser ablation electrospray ionization mass spectrometry
US20150187558A1 (en) * 2013-12-27 2015-07-02 Imra America, Inc. Pulse-burst assisted electrospray ionization mass spectrometer
US10068757B2 (en) * 2015-11-16 2018-09-04 Thermo Finnigan Llc Strong field photoionization ion source for a mass spectrometer
CN109791868A (zh) * 2016-08-02 2019-05-21 富鲁达加拿大公司 激光烧蚀系统
GB2556074A (en) * 2016-11-17 2018-05-23 Micromass Ltd Axial atmospheric pressure photo-ionization imaging source and inlet device

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