JP7489378B2 - 高速変調サンプルイメージング装置及び方法 - Google Patents
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Description
このPCT出願は、その全体の内容が全ての目的のために参照により本願に組み入れられる2018年9月10日に出願された米国仮特許出願第62/729,241号及び2019年4月2日に出願された米国仮特許出願第62/828,251号の優先権を主張する。
(i)サンプルから材料を除去するとともに、前記材料をイオン化して元素イオンを形成するためのサンプリング・イオン化システムであって、レーザー源、レーザー走査システム、及び、サンプルステージを備える、サンプリング・イオン化システムと、
(ii)前記サンプリング・イオン化システムから元素イオンを受けるとともに、前記元素イオンを検出するための検出器と、
を備える装置を提供する。
(i)サンプルステージ上でサンプルのレーザーアブレーションを行なうステップであって、レーザー放射線がレーザー走査システムを使用してサンプルへと方向付けられ、複数のプルームを形成するためにアブレーションが複数の既知の位置で行なわれる、ステップと、
(ii)プルームをイオン化及び質量分析に晒すステップであって、プルーム内の原子の検出がサンプルの画像の構築を可能にする、ステップと、
を含む方法を提供する。
(i)サンプル中の複数の異なる標的分子を1つ以上の異なる標識原子で標識化して、標識サンプルをもたらすステップと、
(ii)サンプルステージ上のサンプルのレーザーアブレーションを行なうステップであって、レーザー放射線がレーザー走査システムを使用してサンプルへと方向付けられ、複数のプルームを形成するためにアブレーションが複数の位置で行なわれる、ステップと、
(iii)プルームをイオン化及び質量分析に晒すステップであって、プルーム内の原子の検出がサンプルの画像の構築を可能にし、随意的に、複数の位置が複数の既知の位置である、ステップと、
を含む方法も提供する。
(i)レーザー放射線を使用してサンプル材料のスラグを脱着するステップであって、レーザー放射線が、レーザー走査システムを使用してサンプルステージ上のサンプルに向けられる、ステップと、
(ii)サンプル材料のスラグをイオン化し、質量分析によってスラグ内の原子を検出するステップと、
を含む方法も提供する。
(i)サンプル中の複数の異なる標的分子を1つ以上の異なる標識原子で標識化して、標識サンプルを与えるステップと、
(ii)レーザー放射線を使用してサンプル材料のスラグを脱着するステップであって、レーザー放射線が、レーザー走査システムを使用してサンプルステージ上のサンプルへと方向付けられる、ステップと、
(iii)サンプル材料のスラグをイオン化して、質量分析によってスラグ内の原子を検出するステップと、
を含む方法である。
1.サンプリング・イオン化システム
a.レーザーアブレーションサンプリング及びイオン化システム
レーザーアブレーションベースの分析器は、一般に、3つの構成要素を備える。第1の構成要素は、分析用のサンプルから蒸気状及び粒子状材料のプルームを生成するためのレーザーアブレーションサンプリングシステムである。アブレーションされたサンプル材料のプルーム内の原子(以下で説明する検出可能な標識原子を含む)を検出器システム-質量分析計構成要素(MS構成要素;第3の構成要素)-により検出できる前に、サンプルをイオン化(及び霧化)しなければならない。したがって、装置は、原子をイオン化して元素イオンを形成し、質量/電荷比に基づいてMS構成要素によるそれらの検出を可能にするイオン化システムである第2の構成要素を備える(サンプル材料のいくらかのイオン化は、アブレーションのポイントで起こり得るが、空間電荷効果が電荷のほぼ即時の中和をもたらす)。レーザーアブレーションサンプリングシステムは、移送導管によってイオン化システムに接続される。
簡単に言えば、レーザーアブレーションサンプリングシステムの構成要素は、サンプルに向けられるレーザー放射線のビームを放出するレーザー源を含む。サンプルは、レーザーアブレーションサンプリングシステムのチャンバ(サンプルチャンバ)内のステージ上に位置される。ステージは通常は並進ステージであるため、レーザー放射線のビームに対してサンプルを移動させることができ、これにより、サンプル上の様々な場所を分析のためにサンプリングできる(例えば、レーザービーム内での相対移動の結果としてアブレーションされ得るよりも互いから遠く離れた場所を本明細書中に記載されるレーザー走査システムによって誘導することができる)。以下で更に詳しく説明するように、ガスがサンプルチャンバを通じて流され、また、ガスの流れは、レーザー源がサンプルをアブレーションするときに生成されるエアロゾル化された材料のプルームを、その元素組成(元素タグからの標識原子などの標識原子を含む)に基づくサンプルの画像の分析及び構築のために運び去る。以下で更に説明するように、別の作用形態では、レーザーアブレーションサンプリングシステムのレーザーシステムを使用して、サンプルから材料を脱着させることもできる。
レーザーシステムは、単一又は複数(すなわち、2つ以上)の波長のレーザー放射線を生み出すようにセットアップされ得る。一般に、論じられるレーザー放射線の波長は、最も高い強度を有する波長(「ピーク」波長)を指す。システムが異なる波長を生み出す場合には、それらの波長を、様々な目的で、例えば、サンプル内の様々な材料を標的にするために使用できる(ここで、標的にするとは、選択される波長が材料によってうまく吸収される波長であることを意味する)。
本発明は、サンプリング・イオン化システムにおけるレーザー走査システムの適用によって現在のIMS及びIMCの装置及び方法に優る改善をもたらす。レーザー走査システムは、アブレーションされるべきサンプルへとレーザー放射線を方向付ける。レーザースキャナは、静止したレーザービームに対してサンプルステージを移動させるよりもはるかに急速にサンプル上のレーザー焦点の位置を変向させることができる(走査システムの動作構成要素における慣性がはるかに低い又は全くないことに起因する)ため、サンプル上の別個のスポットのアブレーションをより迅速に行なうことができる。このより急速な速度により、非常に大きな領域をアブレーションして単一のピクセルとして記録することができる、或いは、レーザースポット移動の速度が簡単に例えばピクセル取得速度の増大に変換し得る、或いは、これらの両方の組み合わせになり得る。更に、レーザー放射線のパルスを向けることができるスポットの位置の急速な変化は、任意のパターンのアブレーションを可能にし、それにより、例えば、レーザー走査システムによってサンプル上の位置に向けられる急速連続状態のレーザー放射線のパルス/ショットのバーストによって不均一な形状の細胞全体がアブレーションされ、その後、該細胞がイオン化されて単一の材料群として検出され、したがって、単一細胞分析が可能になる(28頁以降の「レーザーアブレーションサンプリングシステムのサンプルチャンバ」の節を参照)。同様の急速バースト技術は、55頁以降の装置及び方法に関してより詳しく説明されるように、脱着を使用してサンプルキャリアからサンプル材料を除去する方法、すなわち、細胞LIFTing(Laser Induced Forward Transfer(レーザー誘起前方転写))においても展開され得る。
(i)サンプルから材料を除去するとともに、前記材料をイオン化して元素イオンを形成するためのサンプリング・イオン化システムであって、レーザー走査システム及びサンプルステージを備える、サンプリング・イオン化システムと、
(ii)前記サンプリング・イオン化システムから元素イオンを受けるとともに、前記元素イオンを検出するための検出器と、
を備える装置を提供する。
レーザー放射線をサンプル上の様々な位置に迅速に向けることができる任意の構成要素をレーザー走査システムにおけるポジショナとして使用できる。以下に論じる様々なタイプのポジショナは、市販されているとともに、それぞれが固有の長所及び制限を有するので、装置が使用されるべき特定の用途に適するように当業者により選択され得る。本発明の態様の幾つかの実施形態では、以下で提示されるように、後述する複数のポジショナを単一のレーザー走査システムに組み合わせることができる。ポジショナは、一般に、レーザービームに相対的な動きを導入するために可動構成要素に依存するもの(その例としては、ガルバノメーターミラー、圧電ミラー、MEMSミラー、ポリゴンスキャナなどが挙げられる)とそうでないもの(その例としては、そのような音響光学デバイス及び電気光学デバイスが挙げられる)とにグループ化され得る。前の文に挙げられたタイプのポジショナは、レーザー放射線のビームを様々な角度に制御可能に偏向させるように作用し、その結果、アブレーションスポットの並進がもたらされる。レーザー走査システムは、単一のポジショナを備えてもよく、或いは、ポジショナ及び第2のポジショナを備えてもよい。レーザー走査システムに2つのポジショナが存在する「ポジショナ」及び「第2のポジショナ」の記述は、レーザー放射線のパルスがレーザー源からサンプルまでのその経路上でポジショナに衝突する順序を規定しない。
ミラーが装着されるシャフト上のガルバノメーターモータを使用して、レーザー放射線をサンプル上の様々な位置へと偏向させることができる。動きは、固定磁石及び可動コイル、或いは、固定コイル及び可動磁石を使用して実現できる。固定コイル及び可動磁石の配置がより急速な応答時間をもたらす。一般に、シャフト及びミラーの位置を感知するためにセンサがモータに存在し、それにより、モータのコントローラにフィードバックが与えられる。1つのガルバノメーターミラーが1つの軸内にレーザービームを方向付けることができるため、この技術を使用してx軸及びY軸の両方でビームの方向付けを可能にするべくガルバノミラーの対が使用される。
同様に、ミラーが装着されるシャフト上の圧電アクチュエータをポジショナとして使用して、レーザー放射線をサンプル上の様々な位置へと偏向させることができる。この場合も先と同様に、質量のある構成要素の動きに基づくミラーポジショナとして、本質的に慣性があり、したがって、この構成要素によるミラーの動きに固有の時間オーバーヘッドがある。したがって、このポジショナは、当業者には、レーザー走査システムのナノ秒応答時間が必須ではない特定の実施形態に適用されることが理解される。同様に、圧電ミラーポジショナは、ミラーに基づいているので、レーザー放射線ビームの品質を低下させて、アブレーションスポットサイズを増大させ、したがって、この場合も先と同様に、ビームへのそのような影響を許容する状況で最も適切であることが当業者によって理解される。
レーザー放射線をサンプルに向ける表面の物理的な動きに依存する第3の種類のポジショナは、MEMS(Micro-Electro Mechanical System)ミラーである。この構成要素におけるマイクロミラーは、静電効果、電気機械効果、及び、圧電効果によって作動され得る。このタイプの構成要素の多くの長所は、軽量、装置内での位置決めの容易さ、低消費電力など、それらのサイズが小さいことに由来する。しかしながら、レーザー放射線の偏向は、最終的には依然として構成要素内の部品の動きに基づいているため、部品が慣性を受ける。前と同じように、MEMSミラーポジショナは、ミラーに基づいているため、レーザー放射線ビームの品質を低下させ、アブレーションスポットサイズを大きくし、したがって、この場合も当業者であれば分かるように、そのようなスキャナ構成要素は、レーザー放射線へのそのような影響を許容する状況に適用できる。
レーザー放射線をサンプルに向ける表面の物理的な動きに依存する更なる種類のポジショナは、ポリゴンスキャナである。ここでは、反射ポリゴン又は多面ミラーが機械軸上で回転し、また、ポリゴンの平坦なファセットが入射ビームを横切るたびに、角度偏向された走査ビームが生成される。ポリゴンスキャナは、1次元スキャナであり、走査されたラインに沿ってレーザービームを方向付けることができる(したがって、サンプルに対する第2の相対移動をレーザービームに導入するために、2次ポジショナが必要であり、又は、サンプルがサンプルステージ上で移動される必要がある)。例えばガルバノメーターベースのスキャナの前後の動きとは対照的に、ラスタースキャンの1つのラインの終わりに達した時点で、ビームが走査横列の元の開始位置へと向けられる。ポリゴンは、用途に応じて、規則的又は不規則であってもよい。スポットサイズは、ファセットのサイズと平坦度、及び、幾つかのファセット上走査ラインの長さ/走査角度に依存する。非常に高い回転速度を実現できるため、走査速度が速くなる。しかしながら、この種のポジショナには、ファセットの製造公差と軸方向のぐらつきによる位置決め/フィードバック精度の低下、及び、ミラー表面からの波面歪みの可能性という点で欠点がある。したがって、この場合も当業者であれば分かるように、そのようなスキャナ構成要素は、レーザー放射線に対するそのような影響を許容する状況に適用可能である。
レーザースキャナシステム構成要素の前述のタイプとは異なり、EODは固体構成要素である-つまり、EODは可動部品を備えない。したがって、EODは、レーザー放射線を偏向させる際に機械的慣性を受けず、したがって、1ns程度の非常に速い応答時間を有する。また、EODは、機械部品のように摩耗することもない。EODは、屈折率がその両端に印加される電界に応じて変化する光学的に透明な材料(結晶など)で形成され、この屈折率は、媒体に電圧を印加することによって制御される。レーザー放射線の屈折は、ビームの断面全体に位相遅延が導入されることによって引き起こされる。屈折率が電界に比例して変化する場合、この効果はポッケルス効果と称される。屈折率が電界強度に応じて二次関数的に変化する場合、それはカー効果と称される。カー効果は、通常、ポッケルス効果よりもはるかに弱い。2つの典型的な形態は、光学プリズムの界面での屈折に基づくEOD、及び、レーザー放射線の伝搬方向に垂直に存在する屈折率勾配による屈折に基づくEODである。EOD全体に電界をかけるために、電極は、媒体として作用する光学的に透明な材料の反対側に結合される。対向する電極のセットを結合すると、1次元の走査型EODがもたらされる。電極の第2のセットを第1のセットの電極に直交して結合すると、2次元(X、Y)スキャナがもたらされる。
このクラスのポジショナも固体構成要素である。構成要素の偏向は、周期的に変化する屈折率を誘発するために光学的に透明な材料内で音波を伝搬することに基づいている。屈折率の変化は、材料を通じて伝搬する音波に起因する材料の圧縮及び希薄化(つまり密度の変化)が原因で発生する。周期的に変化する屈折率は、光学格子のように作用することにより材料を通過するレーザービームを回折する。
前の段落では、2つのタイプのレーザー走査システムポジショナ、すなわち、可動部品を備えるミラーベース及び固体ポジショナが説明される。前者は、撓み角が大きいという特徴があるが、慣性に起因して応答時間が比較的遅い。対照的に、固体ポジショナの偏向角範囲は狭くなるが、応答時間ははるかに速くなる。したがって、本発明の態様の幾つかの実施形態において、レーザー走査システムは、ミラーベースの構成要素及び固体構成要素の両方を直列に含む。この配置は、両方の長所、例えば、ミラーベースの構成要素によって与えられる広い範囲であるが、ミラーベースの構成要素の慣性に対応するという長所を利用する。例えば、Matsumoto et al.、2013(Journal of Laser Micro/Nanoengineering 8:315:320)を参照されたい。
レーザー走査システムのポジショナを制御するために、レーザー走査システムは、Y軸及び/又はX軸におけるポジショナの動きをサンプルステージの動きと調整するスキャナ制御モジュール(コンピュータ又はプログラムされたチップなど)を備えてもよい。前後のラスタライズなど、場合によっては、適切なパターンがチップに事前にプログラムされる。しかしながら、他の例では、制御モジュールによって逆運動学を適用して、従うべき適切なアブレーションパターンを決定することができる。逆運動学は、アブレーションされるべき複数の及び/又は不規則な形状の細胞間の最良のアブレーションコースをプロットするために、例えば、任意のアブレーションパターンを生成する際に特に有用となり得る。また、スキャナ制御モジュールは、例えば、パルスピッカーの動作も調整することにより、レーザー放射線のパルスの放出を調整してもよい。
一般に、サンプルのアブレーションに使用されるレーザーの波長及び出力の選択は、細胞分析での通常の使用法に従うことができる。レーザーは、サンプルキャリアを実質的にアブレーションすることなく、所望の深さまでアブレーションを引き起こすのに十分なフルエンスを持たなければならない。一般に、0.1~5 J/cm2、例えば、3~4 J/cm2又は約3.5J/cm2のレーザーフルエンスが適しており、また、レーザーは、理想的には、200Hz以上の速度においてこのフルエンスでパルスを生成することができる。場合によっては、そのようなレーザーからの単一のレーザーパルスは、アブレーションプルームが生成される周波数とレーザーパルス周波数が一致するように、分析のために細胞材料をアブレーションするのに十分であるべきである。一般に、生物学的サンプルのイメージングに有用なレーザーであるためには、レーザーは、例えば、以下で論じる特定のスポットサイズに焦点を合わせることができる100ns未満(好ましくは1ns未満)の持続時間を伴うパルスを生成すべきである。本発明の幾つかの実施形態では、上記のレーザー走査システムの使用をうまく利用するために、アブレーション速度(すなわち、レーザーがサンプルの表面上のスポットをアブレーションする速度)は、200Hz以上、例えば、500Hz以上、750Hz以上、1kHz以上、1.5kHz以上、2kHz以上、2.5kHz以上、3kHz以上、3.5kHz以上、4kHz以上、4.5kHz以上、5kHz以上、10kHz以上、100kHz以上、1MHz以上、10MHz以上、又は、100MHz以上である。多くのレーザーは、レーザーアブレーション周波数を超える繰り返しレートを有するため、パルスピッカーなどの適切な構成要素を使用して、必要に応じてアブレーションの速度を制御できる。したがって、幾つかの実施形態において、レーザー繰り返しレートは、少なくとも1kHz、例えば、少なくとも10kHz、少なくとも100kHz、少なくとも1MHz、少なくとも10MHz、約80MHz、又は、少なくとも100MHzであり、随意的に、サンプリングシステムはパルスピッカーを更に備え、例えば、パルスピッカーは、サンプルステージ及び/又はレーザー走査システムのポジショナの動きも制御する制御モジュールによって制御される。他の例では、複数の間隔が短いパルスバースト(例えば、3つの間隔が短いパルスの列)を使用して、1つの単一スポットをアブレーションすることができる。一例として、10×10μmの領域は、各スポットで3つの間隔が短いパルスの100バーストを使用してアブレーションされてもよく、これは、アブレーションの深さが制限されているレーザー、例えばフェムト秒レーザーにおいて有用となり得るとともに、分解能を失うことなく、アブレーションされた細胞材料の連続的なプルームを生成できる。したがって、幾つかの実施形態において、レーザー走査システムは、3つの時間的に近いパルス(例えば、パルスが1μs未満、例えば、1ns未満、又は1ps未満離れている)を使用してサンプル上の各スポットをアブレーションする方法を使用してサンプルをアブレーションするようになっている。
レーザーがサンプルから材料をアブレーションする効率を最大化するには、サンプルがレーザーの焦点に対して適切な位置に、例えば焦点にあるべきである。これは、焦点が、レーザービームが最小直径を有する、したがって、最も集中されたエネルギーを有する場所だからである。これは、様々な方法で実現され得る。第1の方法は、サンプルがそれに方向付けられたレーザー光の軸で(すなわち、レーザー光の経路を上下に/レーザー源に向かって及び離れて)所望のアブレーションを行なうのに十分な強度を光が有する所望のポイントへと移動され得る方法である。これに代えて又は加えて、レーザー光の焦点を移動させるために、レンズを使用でき、したがって、例えば縮小によって、サンプルの位置で材料をアブレーションできるレンズの効果的な能力を使用することができる。1つ以上のレンズがレーザーとサンプルステージとの間に位置される。単独で或いは2つの方法のいずれか又は両方と組み合わせて使用され得る第3の方法は、レーザーの位置を変更することである。
決まり切った配置の問題として、光学部品を使用して、随意的に異なる波長のレーザー放射線を異なる相対位置に向けることができる。光学部品は、随意的に異なる波長のレーザー放射線を異なる方向からサンプルに向けるために配置することもできる。例えば、1つ以上の波長を上からサンプルに向けることができ、1つ以上の波長のレーザー放射線(随意的に異なる波長)を下から(つまり、サンプルキャリアとも称される、サンプルを支持する顕微鏡スライドなどの基板を通じて)向けることができる。これにより、同じ装置で複数の動作モードが可能になる。したがって、レーザーシステムは、随意的に異なる波長のレーザー放射線を異なる方向からサンプルに向けるように配置された光学部品の配置を備えることができる。したがって、光学部品は、その配置が随意的に異なる波長のレーザー放射線を反対方向からサンプルに向けるように配置されてもよい。この文脈における「反対の」方向は、上下からサンプルに垂直に向けられたレーザー放射線(これは180°反対になる)に限定されず、サンプルに垂直以外の角度でサンプルにレーザー放射線を向ける配置を含む。異なる方向からサンプルに向けられたレーザー放射線が平行である必要はない。時として、サンプルがサンプルキャリア上にあるとき、反射器の配置は、第1の波長のレーザー放射線をサンプルに直接に向け、第2の波長のレーザー放射線をサンプルキャリアを通じてサンプルに向けるように配置され得る。
特定の態様において、本方法及びシステムのサンプルチャンバは、高NA対物レンズ(例えば、レンズ)を備えてもよい。例えば、図12のサンプルチャンバ1206は、高NA対物レンズ1205を示す。レーザー放射線1216は、高NA対物レンズによって、サンプル支持体1207上のサンプル1215に集束され、その後、サンプル材料が質量分析器に送出される。高NA対物レンズは、空気レンズ、油浸レンズ、又は固体液浸レンズであってもよい。したがって、媒体1207は、空気(又は低圧真空)、油、又は、固体の透明な材料であってもよい。図12に示されるように、レーザー放射線1216及び高NA対物レンズは、サンプル1215からサンプル支持体1207の反対側に位置されてもよい。
サンプルは、レーザーアブレーションを受けるときにサンプルチャンバに入れられる。サンプルチャンバは、サンプルを保持するステージを備える(通常、サンプルはサンプルキャリア上にある)。アブレーションされると、サンプル内の材料はプルームを形成し、また、ガス入口からガス出口へ向けてサンプルチャンバを通過するガスの流れは、アブレーションされた位置にあった標識原子を含むエアロゾル化された材料のプルームを運び去る。ガスは材料をイオン化システムに運び、イオン化システムが材料をイオン化して検出器による検出を可能にする。サンプル内の標識原子を含む原子は、検出器によって区別できるため、それらの検出により、プルーム内の複数の標的の有無が明らかになり、サンプル上のアブレーションされた軌跡にどの標的が存在したかが判別される。したがって、サンプルチャンバは、分析される固体サンプルをホストすることにおいて二重の役割を果たすが、イオン化及び検出システムへのエアロゾル化された材料の移動の開始点でもある。このことは、チャンバを通るガスの流れが、システムを通過するときにアブレーションされた材料のプルームがどのように広がるかに影響を与える可能性があることを意味する。アブレーションされたプルームがどのように広がるかの尺度は、サンプルチャンバのウォッシュアウト時間である。この数値は、サンプルからアブレーションされた材料が、サンプルチャンバを流れるガスによってサンプルチャンバから運び出されるまでにかかる時間の尺度である。
レーザーアブレーションのためのサンプルの最も効果的な位置取りを特定することに加えて、カメラ(帯電結合デバイスイメージセンサベース(CCD)カメラ又はアクティブピクセルセンサベースのカメラなど)又はその他の光検出手段をレーザーアブレーションサンプリングシステムに含めることにより、様々な更なる分析及び技術が可能になる。CCDは、光を検出し、それを画像の生成に使用できるデジタル情報に変換するための手段である。CCDイメージセンサには、光を検出する一連のコンデンサがあり、各コンデンサは決定された画像上のピクセルを表わす。これらのコンデンサは、入ってくる光子を電荷に変換することを可能にする。次に、CCDを使用してこれらの電荷を読み取り、記録された電荷を画像に変換できる。アクティブピクセルセンサ(APS)は、ピクセルセンサのアレイを含む集積回路から成るイメージセンサ、例えばCMOSセンサであり、各ピクセルは光検出器とアクティブ増幅器とを含む。
先と同様に、重要な位置のみを分析の対象にすることができるため、速度が向上される。したがって、複数の細胞を含む生物学的サンプルをイメージングする際にこの戦略を適用すると、以下のステップ、すなわち、(i)サンプル中の複数の異なる標的分子を1つ以上の異なる標識原子及び1つ以上の蛍光標識で標識化して、標識サンプルをもたらすステップと、(ii)1つ以上の蛍光標識を励起するためにサンプルの既知の位置を光で照らすステップと、(iii)その位置に蛍光があるかどうかを観察して記録するステップと、(iv)蛍光がある場合には、その位置にレーザーアブレーションを方向付けてプルームを形成するステップと、(v)プルームを誘導結合プラズマ質量分析に晒すステップと、(vi)サンプル上の1つ以上の更なる既知の位置に関してステップ(ii)~(v)を繰り返すステップであって、プルーム内の標識原子の検出が、アブレーションされた領域のサンプルの画像の構築を可能にする、ステップと、を実行することができる。
別のイメージング技術は、2光子励起顕微鏡法(非線形又は多光子顕微鏡法とも称される)である。この技術は、一般に、近赤外光を使用してフルオロフォアを励起する。IR光の2つの光子は、それぞれの励起事象ごとに吸収される。組織内の散乱はIRによって最小限に抑えられる。更に、多光子吸収により、バックグラウンド信号が強く抑制される。最も一般的に使用されるフルオロフォアは、400~500nmの範囲の励起スペクトルを有するが、2光子蛍光を励起するために使用されるレーザーは近赤外範囲にある。フルオロフォアが2つの赤外線光子を同時に吸収する場合、フルオロフォアは励起状態に引き上げられるのに十分なエネルギーを吸収する。次に、フルオロフォアは、その後に検出され得る使用されたフルオロフォアのタイプに依存する波長の単一光子を放出する。
レーザースキャナシステム自体の説明で前述したように、システムはサンプル全体のレーザービームの迅速な走査を可能にし、それにより、サンプルをアブレーション及び分析できる速度を上げることができるだけでなく、任意の形状のアブレーションも可能にし、そのため、隣接する領域/細胞から材料をアブレーションすることなく、不規則な形状の細胞を含む特定の個々の領域をアブレーションできる。
(i)サンプルのレーザーアブレーションを行なうステップであって、レーザー放射線がレーザー走査システムを使用してサンプルステージ上のサンプルへと方向付けられ、複数のプルームを形成するためにアブレーションが複数の位置で行なわれる、ステップと、
(ii)プルームをイオン化及び質量分析に晒すステップであって、プルーム内の原子の検出がサンプルの画像の構築を可能にし、随意的に、複数の位置が複数の既知の位置である、ステップと、
を含む方法を提供する。
(i)サンプル中の複数の異なる標的分子を1つ以上の異なる標識原子で標識化して、標識サンプルをもたらすステップと、
(ii)サンプルのレーザーアブレーションを行なうステップであって、レーザー放射線がレーザー走査システムを使用してサンプルステージ上のサンプルへと方向付けられ、複数のプルームを形成するためにアブレーションが複数の位置で行なわれる、ステップと、
(iii)プルームをイオン化及び質量分析に晒すステップであって、プルーム内の原子の検出がサンプルの画像の構築を可能にし、随意的に、複数の位置が複数の既知の位置である、ステップと、
を含む方法も提供する。
(i)サンプル上の対象の1つ以上の特徴を特定するステップと、
(ii)サンプル上の対象の1つ以上の特徴の位置情報を記録するステップと、
(iiI)サンプルのレーザーアブレーションを実行するステップであって、複数のプルームを形成するために、対象の1つ以上の特徴の位置情報を用いて、レーザー放射線が、レーザー走査システムを使用してサンプルステージ上のサンプルに方向付けられるステップと、
(iv)プルームをイオン化及び質量分析に晒すステップであって、プルーム内の原子の検出がサンプルの画像の構築を可能にする、ステップと、
を含む。
(i)サンプル中の複数の異なる標的分子を1つ以上の異なる標識原子で標識化して、標識サンプルをもたらすステップと、
(ii)サンプル上の対象の1つ以上の特徴を特定するステップと、
(ii)サンプル上の対象の1つ以上の特徴の位置情報を記録するステップと、
(iiI)サンプルのレーザーアブレーションを実行するステップであって、複数のプルームを形成するために、対象の1つ以上の特徴の位置情報を用いて、レーザー放射線が、レーザー走査システムを使用してサンプルステージ上のサンプルに方向付けられるステップと、
(iv)プルームをイオン化及び質量分析に晒すステップであって、プルーム内の原子の検出がサンプルの画像の構築を可能にする、ステップと、
を含む。
特定の態様において、移送導管(注入器とも称される)は、レーザーアブレーションサンプリングシステムとイオン化システムとの間にリンクを形成するとともに、サンプルのレーザーアブレーションによって生成されたサンプル材料のプルームをレーザーアブレーションサンプリングシステムからイオン化システムへ輸送できる。移送導管の一部(又は全て)は、例えば、適切な材料をドリルで貫通して、プルームを通過させるためのルーメン(例えば、円形、長方形、又は他の断面を有するルーメン)を生成することによって形成されてもよい。移送導管は、時として、0.2mm~3mmの範囲の内径を有する。時として、移送導管の内径はその長さに沿って変化し得る。例えば、移送導管は、端部が先細になっていてもよい。移送導管の長さは、1センチメートル~100センチメートルの範囲であってもよい。場合によっては、長さが10センチメートル以下(例えば、1~10センチメートル)、5センチメートル以下(例えば、1~5センチメートル)、又は、3センチメートル以下(例えば、0.1~3センチメートル)である。時として、移送導管のルーメンは、アブレーションシステムからイオン化システムまでの全距離又はほぼ全距離に沿って真っ直ぐである。また、時として、移送導管のルーメンは、距離全体にわたって真っ直ぐではなく、向きが変わる。例えば、移送導管は、漸進的な90度巻回部を形成してもよい。この構成により、レーザーアブレーションサンプリングシステムでのサンプルのアブレーションによって生成されたプルームは、移送導管入口の軸が真上を向いている間、最初は垂直面内を移動でき、イオン化システム(例えば、対流冷却を利用するために一般的に水平に向けられたICPトーチ)に近づくにつれて水平方向に移動できる。移送導管は、プルームが入るか又は形成される入口開口から少なくとも0.1センチメートル、少なくとも0.5センチメートル、又は、少なくとも1センチメートルの距離にわたって真っ直ぐであってもよい。大まかに言えば、一般に、移送導管は、レーザーアブレーションサンプリングシステムからイオン化システムに材料を移送するのにかかる時間を最小限に抑えるように適合される。
移送導管は、レーザーアブレーションサンプリングシステム内の入口を含んでもよい(特に、レーザーアブレーションサンプリングシステムのサンプルチャンバ内であり、したがって、その入口は、サンプルチャンバの主要なガス出口にも相当する)。移送導管の入口は、レーザーアブレーションサンプリングシステム内のサンプルからアブレーションされたサンプル材料を受けて、それをイオン化システムに移送する。場合によっては、レーザーアブレーションサンプリングシステムの入口は、イオン化システムへの移送導管に沿った全てのガス流の供給源である。場合によっては、レーザーアブレーションサンプリングシステムから材料を受けるレーザーアブレーションサンプリングシステムの入口は、第2の「移送」ガスが別個の移送流入口から流れる導管の壁の開口である(例えば、国際公開第2014146724号パンフレット及び国際公開第2014147260号パンフレットに開示されているように)。この場合、移送ガスはかなりの割合を占め、多くの場合、ガスの大部分がイオン化システムに流れる。レーザーアブレーションサンプリングシステムのサンプルチャンバはガス入口を含む。この入口を通ってチャンバにガスを流すと、移送導管の入口を通ってチャンバから出るガスの流れが生じる。このガスの流れは、アブレーションされた材料の個々のプルームを捕捉することができるとともに、プルームが移送導管(例えば、移送導管の開口を貫通して、本明細書ではサンプルコーンと称される円錐の形状を成してもよい)に入ってサンプルチャンバから出てチャンバの上方を通過する導管内へ入る際にプルームを同伴することができる。この導管は、別個の移送流入口(移送流矢印で示される図の左側)から導管内へ流れるガスも有する。移送流入口、レーザーアブレーションサンプリングシステム入口を備えるとともにアブレーションされたサンプル材料をイオン化システムに向けて運ぶ移送導管を開始する構成要素は、フローセルとも称され得る(国際公開第2014146724号パンフレット及び国際公開第2014147260号パンフレットにあるように)。
内径が小さいチューブでは、同じ流量のガスがより高速で移動する。したがって、より小さな内径を有するチューブを使用することにより、ガス流で運ばれるアブレーションされたサンプル材料のプルームは、所定の流量でより迅速に所定の距離にわたって輸送され得る(例えば、レーザーアブレーションサンプリングシステムから移送導管内のイオン化システムへ)。個々のプルームをどれだけ迅速に分析できるかを決める重要な要因の1つは、アブレーションによる生成から装置の質量分析計構成要素で成分イオンが検出されるまでの時間(検出器での過渡時間)にプルームがどれだけ拡散したかである。したがって、狭い移送導管を使用することにより、アブレーションと検出との間の時間が短縮され、それにより、拡散が発生する可能性のある時間が少なくなるため、拡散が減少し、最終的に、検出器での各アブレーションプルームの過渡時間が削減される。過渡時間が短いということは、単位時間当たりにより多くのプルームを生成及び分析でき、それにより、より高品質及び/又はより高速の画像を生成できることを意味する。
より高い流量では、導管で乱流が発生するリスクが高まる。これは、特に、移送導管の内径が小さい(例えば1mm)場合に当てはまる。しかしながら、従来使用されているアルゴンの代わりにヘリウムや水素などの軽質ガスを使用がガスの移送流として使用されれば、内径の小さい移送導管で高速移送(最大で300m/s及び300m/sを超えて)を実現することができる。
元素イオンを生成するには、噴霧されたサンプルを気化、噴霧、及び、イオン化できるハードイオン化技術を使用する必要がある。
一般に、分析されるべき材料をそれが分析のために質量検出器に通される前にイオン化するために誘導結合プラズマが使用される。誘導結合プラズマは、電磁誘導によって生成される電流によってエネルギーが供給されるプラズマ源である。誘導結合プラズマは、複数(例えば、3つ)の同心円管から成ってもよいトーチ内で維持され、最も内側の管が注入器として知られている。
[ii]Hutchinson et al.(2005)Anal.Biochem.346:225-33.
[iii]Seuma et al.(2008)Proteomics 8:3775-84.
[iv]Giesen et al.(2011)Anal.Chem.83:8177-83.
[v]Giesen et al.(2014)Nature Methods.11:417-422.
[vi]Kindness et al.(2003)Clin Chem 49:1916-23.
[vii]Gurevich&Hergenroder(2007)J.Anal.At.Spectrom.、22:1043-1050.
[viii]Wang et al.(2013)Anal.Chem.85:10107-16.
[ix]国際公開第2014/146724号パンフレット
[x]国際公開第2014/127034号パンフレット
注入器は、本明細書に記載のサンプルチャンバに結合されてもよい。注入器は、レーザーアブレーションによってサンプルから解放された材料が注入器へと運ばれるように、サンプル支持体の上方に位置される入口又は開口を備えてもよい。サンプルチャンバは、アブレーションプルームを注入器へと運ぶための1つ以上のガス入口を含んでもよく、また、注入器は、注入器に捕捉されたアブレーションプルームをICPトーチに輸送するための移送ガス入口(例えば、シースガス入口)を含んでもよい。特定の態様では、システムが単一のガス源を含んでもよい。
前述のように、放射線(例えば、レーザー放射線線)は、サンプル支持体を通過してサンプルに衝突してもよい。放射線は、UV、IR又は緑色レーザーなどのfsレーザーによって生成されてもよい。レーザーがUVレーザーの場合、サンプル支持体は石英又はシリカであってもよい。レーザーがIR又は緑色の場合、サンプル支持体はガラスとなり得る。緑色のfsレーザーは、依然として高分解能を可能にしつつ、コストの観点から好ましいガラス支持体(スライドガラスなど)を可能にする場合がある。
電子イオン化
電子イオン化は、気相サンプルと電子ビームとを衝突させることを伴う。電子イオン化チャンバが電子源及び電子トラップを含む。電子ビームの典型的な供給源は、通常は70電子ボルトのエネルギーで動作するレニウム又はタングステンワイヤである。電子イオン化用の電子ビーム源は、Markes Internationalから入手できる。電子ビームは電子トラップへ方向付けられ、また、電子の移動方向と平行に印加された磁場により、電子が螺旋状の経路で移動する。気相サンプルは、電子イオン化チャンバを通過して方向付けられ、電子ビームと相互作用してイオンを形成する。電子イオン化は、プロセスが一般にサンプル分子をフラグメント化させるため、イオン化の難しい方法と見なされる。市販の電子イオン化システムの例としては、Advanced Markus Electron Ionisation Chamberが挙げられる。
イオン偏向器
質量分析計は、イオンが検出器の表面に当たるとイオンを検出する。イオンと検出器との衝突は、検出器表面からの電子の解放を引き起こす。これらの電子は、検出器を通過するときに増大される(最初に解放された電子は、検出器内の更なる電子をたたき出し、これらの電子は、その後、二次プレートに衝突し、それにより、電子の数が更に増幅する)。検出器のアノードに当たる電子の数が電流を生成する。アノードに当たる電子の数は、二次プレートに印加される電圧を変更することによって制御され得る。電流は、アナログ-デジタル変換器によって検出器に当たるイオンの計数に変換され得るアナログ信号である。検出器が線形範囲で動作している場合、電流をイオンの数に直接に相関させることができる。一度に検出できるイオンの量には限界がある(1秒当たりに検出できるイオンの数として表わされ得る)。このポイントを超えると、検出器に当たるイオンによって解放される電子の数は、もはやイオンの数と相関しなくなる。したがって、これは検出器の定量的能力に上限を課す。
脱着ベースの分析器は、一般に、3つの構成要素を備える。第1の構成要素は、分析用のサンプルからサンプル材料のスラグを生成するための脱着システムである。脱離したサンプル材料のスラグ内の原子(以下で説明する任意の検出可能な標識原子を含む)を検出できる前に、サンプルをイオン化(及び霧化)しなければならない。したがって、装置は、原子をイオン化して元素イオンを形成することにより質量/電荷比に基づいてMS検出器構成要素(第3の構成要素)によるそれらの検出を可能にするイオン化システムである第2の構成要素を備える。脱着ベースのサンプリングシステム及びイオン化システムは、移送導管によって接続される。多くの場合、脱着ベースのサンプリングシステムは、レーザーアブレーションベースのサンプリングシステムでもある。
場合によっては、サンプル材料の粒子状及び/又は気化したプルームを生成するためにレーザーアブレーションが使用されるのではなく、サンプル材料のバルク塊が、サンプルの実質的な崩壊及びサンプルの小さな粒子及び/又は蒸気への変換を伴うことなく、それが配置されるサンプルキャリアから脱着される(例えば、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第2016109825号パンフレットの図8、及び付随する説明を参照)。本明細書中において、スラグという用語は、この脱着された材料(本明細書で論じられるサンプル材料のパケットの1つの特定の形態)を指すために使用される。スラグは、10nm~10μm、100nm~10μm、場合によっては1μm~100μmの寸法を有し得る。このプロセスは、サンプルカタパルティングと称され得る。一般に、スラグは単一の細胞に相当する(この場合、プロセスを細胞カタパルティングと称することができる)。
サンプル材料は、熱エネルギー、機械的エネルギー、運動エネルギー、及び、先のいずれかの組み合わせによってサンプルから脱着され得る。この種のサンプリングは、特に生物学的サンプルの分析に役立つ。
(i)レーザー放射線を使用してサンプル材料のスラグを脱着するステップであって、レーザー放射線が、レーザー走査システムを使用してサンプルステージ上のサンプルに向けられる、ステップと、
(ii)サンプル材料のスラグをイオン化し、質量分析によってスラグ内の原子を検出するステップと、
を含む方法を提供する。
(i)サンプル中の複数の異なる標的分子を1つ以上の異なる標識原子で標識化して、標識サンプルをもたらすステップと、
(ii)対象の1つ以上の特徴を特定するためにサンプルを照らすステップと、
(iii)サンプル上の対象の1つ以上の特徴の位置情報を記録するステップと、
(iv)対象の特徴の位置情報を使用して、対象の特徴からサンプル材料のスラグを脱着するステップであって、サンプル材料のスラグがレーザー放射線を使用して位置から脱着される前に、レーザー放射線を使用して対象の特徴を取り囲むサンプル材料を除去するべく最初にレーザーアブレーションを実行することを含み、レーザー放射線がレーザー走査システムを使用してサンプルへと方向付けられる、ステップと、
(v)サンプル材料の脱着されたスラグをイオン化するステップと、
(vi)サンプル材料中の標識原子の検出のために、イオン化されたサンプル材料を質量分析に晒すステップと、
を含む方法も提供する。
(i)サンプル中の複数の異なる標的分子を1つ以上の異なる標識原子及び1つ以上の蛍光標識で標識化して、標識サンプルをもたらすステップと、
(ii)1つ以上の蛍光標識を励起するためにサンプルにレーザー放射線を照射するステップと、
(iii)蛍光のパターンに基づいてサンプルの1つ以上の位置の位置情報を記録するステップと、
(iv)蛍光のパターンに基づく位置情報を使用して、対象の特徴からサンプル材料のスラグを脱着するステップであって、サンプル材料のスラグがレーザー放射線を使用して位置から脱着される前に、レーザー放射線を使用して対象の特徴を取り囲むサンプル材料を除去するべく最初にレーザーアブレーションを実行することを含み、レーザー放射線がレーザー走査システムを使用してサンプルへと方向付けられる、ステップと、
(v)サンプル材料の脱着されたスラグをイオン化するステップと、
(vi)サンプル材料中の標識原子の検出のために、イオン化されたサンプル材料を質量分析に晒すステップと、
を含む方法も提供する。
脱着ベースのサンプリングシステムで使用されるカメラは、レーザーアブレーションベースのサンプリングシステムについて前述したようにすることができ、また、レーザーアブレーションベースのサンプリングシステムのカメラに関する議論がここで読まれるべきである。
脱着ベースのサンプリングシステムで使用されるサンプルチャンバは、レーザーアブレーションベースのサンプリングシステムについて前述した通りにすることができる。サンプル材料の大きなスラグのサンプリングが行なわれている場合、熟練した開業医は、材料のスラグがガスの流れに同伴されてイオン化システムへの輸送のために移送導管に運ばれるようにするべくガス流量を増大させる必要があり得ることを理解し得る。
脱着ベースのサンプリングシステムで使用されるサンプルチャンバは、レーザーアブレーションベースのサンプリングシステムについて前述した通りにすることができる。サンプル材料の大きなスラグのサンプリングが行なわれている場合、熟練した開業医は、スラグがルーメンの側面に接触することなく任意のスラグを受け入れるように導管のルーメンの直径を適切に寸法付ける必要があることを理解し得る(接触すると、スラグが断片化し、信号が重なり合う場合がある-この場合、n番目の脱離事象に伴うスラグからの原子が、n+1番目以降のスラグのための検出ウインドウへと拡散される)。
多くの場合、前述のlifting技術は、粒子状及び蒸気状の材料に変換されなかったサンプル材料の比較的大きなスラグ(10nm~10μm、100nm~10μm、場合によっては1μm~100μm)の除去を伴う。したがって、この比較的大量の材料を気化及び噴霧することができるイオン化技術が必要とされる。
そのような適切なイオン化システムの1つは、レーザーアブレーションベースのサンプリング・イオン化システムに関連して49頁から始まる節で既に説明したように、誘導結合プラズマである。
イオン偏向器
脱着ベースのサンプリングシステムで使用されるイオン偏向器は、レーザーアブレーションベースのサンプリングシステムについて前述した通りにすることができる。サンプル材料の無傷の大きなスラグを除去するための脱離ベースのサンプリングの可能性を考えると、イオン偏向器は、検出器を保護するためのこの種のシステムで特に有用となり得る。
質量検出器システムの典型的なタイプとしては、四重極、飛行時間(TOF)、磁気セクター、高分解能、シングル又はマルチコレクターベースの質量分析計が挙げられる。
四重極検出器
四重極質量分析計は、一端に検出器を伴う4本の平行ロッドを備える。交番RF電位及び所定のDCオフセット電位が、一方の対のロッドと他方の対との間に印加され、それにより、一方の対のロッド(互いに反対のロッドのそれぞれ)が、他方の対のロッドに対して反対の代替電位を有するようにする。イオン化されたサンプルは、ロッドに平行な方向で、検出器に向かって、ロッドの中央に通される。印加された電位はイオンの軌道に影響を与え、それにより、特定の質量電荷比のイオンのみが、安定した軌道を持ち、検出器に到達する。他の質量電荷比のイオンはロッドと衝突する。
磁気セクター質量分析では、イオン化されたサンプルが湾曲したフライトチューブを通過してイオン検出器に向かう。フライトチューブ全体に磁場を印加すると、イオンはその経路から偏向する。各イオンの偏向量は、各イオンの質量電荷比に基づいているため、一部のイオンのみが検出器に衝突し、他のイオンは検出器から偏向される。マルチコレクターセクターフィールド機器では、検出器のアレイを使用して、様々な質量のイオンを検出する。ThermoScientific Neptune PlusやNu Plasma IIなどの一部の機器では、磁気セクターを静電セクターと組み合わせて、質量電荷比に加えて、運動エネルギーによってイオンを分析する二重集束磁気セクター機器を提供する。特に、Mattauch-Herzog形状を有するマルチ検出器を使用できる(例えば、半導体直接電荷検出器を使用した1回の測定でリチウムからウランまでの全ての元素を同時に記録できるSPECTRO MS)。これらの機器は、複数のm/Q信号を実質的に同時に測定できる。それらの感度は、検出器に電子増倍管を含めることによって高められ得る。アレイセクター機器は、常に適用可能であるが、それらが増大する信号の検出に役立つものの信号レベルが減少しているときにあまり有用ではないため、標識が特に非常に変動する濃度で存在する状況ではあまり適さない。
飛行時間型質量分析計は、サンプル注入口、強電界が印加された加速チャンバ、及び、イオン検出器を備える。イオン化されたサンプル分子のパケットが、サンプル注入口を通じて加速チャンバに導入される。最初に、イオン化されたサンプル分子はそれぞれ同じ運動エネルギーを有するが、イオン化されたサンプル分子が加速チャンバを通じて加速されると、それらのサンプル分子がそれらの質量によって分離され、その場合、軽いイオン化されたサンプル分子が重いイオンよりも速く移動する。次に、検出器は、到着した全てのイオンを検出する。各粒子が検出器に到達するのにかかる時間は、粒子の質量電荷比によって決まる。
前述のように、MS内の信号は、イオンと検出器との間の衝突、及び、イオンが当たった検出器の表面からの電子の解放に基づいて検出される。多数のイオンがMSによって検出され、多数の電子が放出されると、MSの検出器が一時的に疲労し、その結果、検出器から出力されるアナログ信号がイオンの後続のパケットのうちの1つ以上に関して一時的に抑制される。言い換えると、イオン化されたサンプル材料のパケット内のイオンの数が特に多いと、イオン化されたサンプル材料のパケットからイオンを検出するプロセスで、検出器の表面と二次乗算器から多くの電子が放出され、それにより、イオン化されたサンプル材料の後続のパケット内のイオンが検出器に当たると、検出器表面と二次増幅器内の電子が補充されるまで、解放されるべく利用できる電子が少なくなる。
1.サンプリング・イオン化システム
a.レーザーアブレーションベースのサンプリング・イオン化システム
質量ベースの分析器に関連して前述したレーザー走査システムを備えるレーザーアブレーションサンプリングシステムは、OES検出器ベースのシステムで使用することができる。原子発光スペクトルの検出に関しては、ICPを使用してサンプルから除去されたサンプル材料をイオン化するが、元素イオンを生成できる任意のハードイオン化技術を使用できる。
レーザー走査システムを備える質量ベースの分析器に関連して前述した脱着ベースのサンプリングシステムは、OES検出器ベースのシステムで使用することができる。原子発光スペクトルの検出に関しては、ICPを使用してサンプルから除去されたサンプル材料をイオン化するが、元素イオンを生成できる任意のハードイオン化技術を使用できる。
レーザー脱離/イオン化ベースの分析器は、一般に、2つの構成要素を備える。第1の構成要素は、分析用のサンプルからイオンを生成するシステムである。この装置において、これは、レーザービームをサンプルに方向付けてイオンを生成することによって達成され、本明細書では、それがレーザー脱離イオン生成システムと呼ばれる。これらの放出されたサンプルイオン(以下で説明するように、標識原子からの検出可能なイオンを含む)は、検出器システム(第2の構成要素)、例えば質量分析計によって検出され得る(検出器については以下で更に詳しく説明する)。この技術は、レーザー脱離/イオン化質量分析(LDI-MS)として知られている。LDIは、以下で詳しく説明する脱着ベースのサンプリングシステムとは異なる。これは、脱着ベースのサンプリングシステムでは、その後にイオン化されて元素イオンを形成する電荷中性の材料のスラグとしてサンプル材料が脱着されるからである。それどころか、ここでは、レーザーによるサンプルの照射の結果としてイオンが直接生成され、別個のイオン化システムは必要ない。
必要に応じてイオンの脱離を可能にするようになっている、レーザーアブレーションサンプリングシステムのレーザーに関連して前述したような市販のレーザーを含む、様々な異なるレーザーをLDIのために使用することができる。したがって、幾つかの実施形態において、装置は、サンプルから材料を脱着及びイオン化して元素イオンを形成するようになっているレーザーを備え、また、この場合、検出器は、前記サンプリング・イオン化システムから元素イオンを受けて前記元素イオンを検出する。時として、装置は、サンプルから材料を脱着及びイオン化して元素イオンを形成するようになっているレーザーを備え、また、この場合、検出器は、前記サンプリング・イオン化システムから分子イオンを受けて前記分子イオンを検出するようになっている。他の場合には、装置は、サンプルから材料を脱着及びイオン化して元素イオン及び分子イオンの両方を形成するようになっているレーザーを備え、また、この場合、検出器は、前記サンプリング・イオン化システムからイオンを受けて前記元素及び前記分子イオンの両方を検出するようになっている。
LDIシステムのサンプルチャンバは、前述のレーザーアブレーションベース及び脱着ベースのサンプリングシステムのサンプルチャンバと共通する多くの特徴を共有する。サンプルチャンバは、サンプルを支持するためのステージを備える。ステージは、x-y軸又はx-y-z軸で移動可能な並進ステージであってもよい。また、サンプルチャンバは、レーザー放射線によってサンプルから除去された材料を方向付けることができる出口も備える。出口は検出器に接続され、それにより、サンプルイオンの分析が可能である。
サンプルイオンビームは、当技術分野では抽出電極として知られている、サンプルの近くに位置された静電プレートを介してサンプルから捕捉される。抽出電極は、レーザーアブレーションによって脱離したサンプルイオンをサンプルの局所性から除去する。これは、一般に、作用するプレート上に位置されたサンプルと電極(サンプル電極)、及び電位差が大きい抽出電極によって実現される。抽出電極に対するサンプルの極性に応じて、正又は負に帯電した二次イオンが抽出電極によって捕捉される。
また、本発明の態様は、LDIを使用して生物学的サンプルを分析するための方法を提供する。この分析では、細胞は標識で標識化され、これらの標識は、サンプルのLDIに続いて生成されたイオンで検出される。したがって、本発明の態様は、複数の細胞を含むサンプルに関してマスサイトメトリーを実施するための方法において、a.サンプル中の1つ以上の異なる標的分子を1つ以上の質量タグで標識化して、標識サンプルをもたらすステップと、b.サンプルのレーザー脱離イオン化を実行するステップであって、複数の個々のイオン雲を形成するべくレーザー脱離/イオン化が複数の位置で行なわれる、ステップと、c.イオン雲を個別に質量分析に晒すステップであって、プルーム内の標識の検出がサンプルの画像の構築を可能にし、随意的に、複数の位置が複数の既知の位置である、ステップとを含む、方法を提供する。
1.サンプルを分析するための装置であって、a.サンプルを収容するためのサンプルチャンバ;b.サンプルから材料を脱離及びイオン化してイオンを形成するようになっているレーザー;c.脱離イオン化によって形成されたイオンをサンプリングし、それらをサンプルから離れるように検出器に向けて方向付けるようになっているイオン光学素子;d.前記イオン光学素子からイオンを受けて前記イオンを分析するための検出器を備え、随意的に、装置が本発明の態様のレーザー走査システムを備える、装置。
光検出器の典型的なタイプは、光電子増倍管及び電荷結合デバイス(CCD)を含む。光検出器を使用して、元素質量分析によるイメージングの前に、サンプルをイメージングする及び/又は対象の特徴/関心領域を特定してもよい。
上記の装置は、サンプルから除去されたイオン化されたサンプル材料のパケット内の複数の原子に信号を与えることができる。サンプル材料のパケット内の原子の検出は、原子がサンプル内に自然に存在するため、又は原子が標識試薬によってその位置に局在化されているため、アブレーションの位置にその存在を明らかにする。サンプルの表面の既知の空間位置からイオン化されたサンプル材料の一連のパケットを生成することにより、検出器信号はサンプル上の原子の位置を明らかにするため、信号を使用してサンプルの画像を構築できる。複数の標的を特定可能な標識で標識化することにより、標識原子の位置を同族の標的の位置に関連付けることができるため、この方法では複雑な画像を作成でき、蛍光顕微鏡法などの従来の手法を使用して達成できるレベルをはるかに超える多重化レベルに到達できる。
複数のイメージングモダリティを使用して、1つ以上の組織切片をイメージングすることができる。場合によっては、同じ組織からの切片がそれぞれ、その後に位置合わせされる異なるモダリティによってイメージングされてもよい(例えば、同じ座標系にマッピングされ、積み重ねられ、重ね合わされ、及び/又は、組み合わされて、より高いレベルの特徴を特定する)。
本開示の特定の態様は、生物学的サンプルをイメージングする方法を提供する。そのようなサンプルは、サンプル中のこれらの細胞の画像を提供するためにイメージングマスサイトメトリー(IMC)に晒され得る複数の細胞を含むことができる。一般に、本発明の態様は、免疫組織化学(IHC)技術によって現在研究されている組織サンプルを分析するために使用できるが、質量分析(MS)又は発光分光分析(OES)による検出に適した標識原子の使用を伴う。
特定の態様において、組織の連続切片は、イメージングマスサイトメトリーによって分析されてもよい。連続切片は、同じように染色されるか、異なるマーカーで染色されてもよい。例えば、第1の連続切片は、タンパク質マーカー(又は主にタンパク質マーカー)に関して染色されてもよく、第2の連続切片は、RNAマーカー(又は主にRNAマーカー)に関して染色されてもよい。これは、あるセットのマーカー(タンパク質マーカーの抗原検索など)のサンプル調製が、別のセットのマーカー(RNAマーカーなど)を検出する機能を損傷又は損なう可能性がある場合に特に有用である。
特定の実施形態において、サンプルは、イメージング質量分析のためにサンプルを位置決めするために、固体支持体(すなわち、サンプルキャリア)上に固定化されてもよい。固体支持体は、光学的に透明で、例えばガラス又はプラスチックから形成されてもよい。サンプルキャリアが光学的に透明である場合、図5に示すように、支持体を介したサンプル材料のアブレーションが可能になる。時として、サンプルキャリアは、例えば、アブレーション又は脱着及び分析されるべき対象の特徴/関心領域の相対位置の計算を可能にするために、本明細書に記載の装置及び方法と共に使用するための基準点として作用する特徴を含む。基準点は、光学的に分解可能であってもよく、或いは、質量分析によって分解可能であってもよい。
イメージング質量分析では、1つ以上の標的元素(つまり、元素又は元素同位体)の分布が重要となり得る。特定の態様において、標的要素は、本明細書に記載されるように標識原子である。標識原子は、サンプルに直接に単独で加えられてもよく或いは生物学的に活性な分子に又は分子内に共有結合されてもよい。特定の実施形態において、標識原子(例えば、金属タグ)は、以下でより詳細に説明するように、DNA又はRNA標的にハイブリダイズするための抗体(その同族抗原に結合する)、アプタマー、又は、オリゴヌクレオチドなどの特異的結合対(SBP)の要素にコンジュゲートされてもよい。標識原子は、当技術分野で知られている任意の方法によってSBPに結合されてもよい。特定の態様において、標識原子は、ランタニド又は遷移元素などの金属元素又は本明細書に記載の別の金属タグである。金属元素は、60amuを超える、80amuを超える、100amuを超える、又は、120amuを超える質量を有してもよい。本明細書に記載の質量分析計は、金属元素の質量より下の元素イオンを枯渇させる場合があり、それにより、豊富なより軽い元素が空間電荷効果を生み出さない及び/又は質量検出器を圧倒しない。
本開示は、標識原子、例えば複数の異なる標識原子で標識化されたサンプルの画像を生成し、この場合、標識原子は、サンプルの特定の、好ましくは細胞内の領域をサンプリングすることができる装置によって検出される(したがって、標識原子が元素タグに相当する)。複数の異なる原子への言及は、複数の原子種がサンプルを標識化するために使用されることを意味する。質量検出器を使用してこれらの原子種を区別でき(例えば、原子種が異なるm/Q比を有する)、それにより、プルーム内に2つの異なる標識原子が存在すると、2つの異なるMS信号が発生する。光学分光計を使用して原子種を区別することもでき(例えば、異なる原子は異なる発光スペクトルを有する)、それにより、プルーム内に2つの異なる標識原子が存在すると、2つの異なる発光スペクトル信号が発生する。
本明細書で使用される質量タグ付き試薬は、幾つかの成分を含む。第1の成分はSBPである。第2の成分は質量タグである。質量タグ及びSBPは、少なくとも部分的に質量タグとSBPとのコンジュゲーションによって形成されたリンカーによって結合される。また、SBPと質量タグとの間の結合は、スペーサを備えてもよい。質量タグ及びSBPは、様々な反応化学反応によってコンジュゲートされ得る。典型的なコンジュゲーション反応化学としては、チオールマレイミド、NHSエステル及びアミン、又はクリックケミストリー反応性(好ましくは、Cu(I)フリーケミストリー)、例えば歪みアルキン及びアジド、歪みアルキン及びニトロン、及び、歪みアルケン及びテトラジンが挙げられる。
本発明で使用される質量タグ(元素タグとも称される)は、幾つかの形態をとることができる。一般に、タグは少なくとも1つの標識原子を含む。標識原子については、以下で説明する。
-ランダム共重合体ポリ(DMA-co-NAS):Mw/Mnが約1.1で、5000~130,000の範囲で高変換の優れたモル質量制御を伴うRAFTによるN-アクリルオキシスクシンイミド(NAS)とN、N-ジメチルアクリルアミド(DMA)との75/25モル比ランダム共重合体の合成が、Relogio et al.(2004)(Polymer,45,8639-49)で報告される。活性NHSエステルは、反応性アミノ基を有する金属キレート基と反応して、RAFT重合によって合成された金属キレートコポリマーを生成する。
本開示で使用することができる標識原子は、MS又はOESによって検出可能であるとともに標識化されない組織サンプルには実質的に存在しない任意の種を含む。したがって、例えば、12C原子は、天然に豊富であるため、標識原子としては不適切であるが、11Cは、天然に存在しない人工同位体であるため、理論的にはMSに使用できる。多くの場合、標識原子は金属である。しかしながら、好ましい実施形態において、標識原子は、希土類金属(15個のランタニドに加えてスカンジウム及びイットリウム)などの遷移金属である。これらの17個の元素(OES及びMSによって区別できる)は、(MSにより)簡単に区別できる多くの異なる同位体をもたらす。これらの様々な元素は、濃縮された同位体の形で入手でき、例えば、サマリウムは6つの安定同位体を有し、ネオジムは7つの安定同位体を有し、これらは全て濃縮された形で入手できる。15個のランタニド元素は、非冗長に固有の質量を持つ少なくとも37個の同位体をもたらす。標識原子としての使用に適した元素の例としては、ランタン(La)、セリウム(Ce)、プラセオジミウム(Pr)、ネオジミウム(Nd)、プロメチウム(Pm)、サマリウム(Sm)、ユーロピウム(Eu)、ガドリニウム(Gd)、テルビウム(Tb)、ジスプロシウム(Dy)、ホルミウム(Ho)、エルビウム(Er)、ツリウム(Tm)、イッテルビウム(Yb)、ルテチウム(Lu)、スカンジウム(Sc)、及び、イットリウム(Y)が挙げられる。希土類金属に加えて、他の金属原子、例えば、金(Au)、白金(Pt)、イリジウム(Ir)、ロジウム(Rh)、ビスマス(Bi)などが検出に適している。放射性同位元素の使用は、取り扱いが不便で不安定であるため、好ましくなく、例えば、Pmは、ランタニドの中で好ましい標識原子ではない。
前述のように、場合によっては、SBPは、スペーサを含むリンカーを介して質量タグにコンジュゲートされる。SBPとクリック化学試薬との間(例えば、SBPと歪みシクロアルキン(又はアジド);歪みシクロアルケン(又はテトラジン)などとの間)にスペーサがあってもよい。質量タグとクリック化学試薬との間(例えば、質量タグとアジド(又は歪みシクロアルキン);テトラジン(又は歪みシクロアルケン)などとの間)にスペーサがあってもよい。場合によっては、SNPとクリックケミストリー試薬との間及びクリックケミストリー試薬と質量タグとの間の両方にスペーサが存在してもよい。
イメージングマスサイトメトリーを含むマスサイトメトリーは、特異的結合対の要素間の特異的結合の原理に基づいている。質量タグは特異的結合対要素にリンクされ、これにより、質量タグが対のもう一方の要素である標的/分析物に局在化する。しかしながら、特異的結合では、他の分子種を除いて、1つの分子種だけに結合する必要はない。むしろ、それは、結合が非特異的でない、つまり、ランダムな相互作用ではないことを規定する。したがって、複数の標的に結合するSBPの例は、多くの異なるタンパク質間で共通のエピトープを認識する抗体である。ここでは、結合は、特異的であるとともに、抗体のCDRによって媒介されるが、複数の異なるタンパク質が抗体によって検出される。一般的なエピトープが天然に存在する場合もあり、或いは、一般的なエピトープがFLAGタグなどの人工的なタグとなり得る。同様に、核酸の場合、所定の配列の核酸は、完全に相補的な配列に排他的に結合しない場合があるが、当業者であれば分かるように、異なるストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の使用下で、ミスマッチの様々な耐性を導入することができる。それにもかかわらず、このハイブリダイゼーションは、それがSBP核酸と標的分析物との間の相同性によって媒介されるため、非特異的ではない。同様に、リガンドは複数の受容体に特異的に結合することができ、簡単な例は、TNFR1及びTNFR2の両方に結合するTNFαである。
、スレオス核酸(TNA)、2’-0-メチルポリヌクレオチド、2’-0-アルキルリボシル置換ポリヌクレオチド、ホスホロチオエートポリヌクレオチド、及びボロノホスフェートポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド類似体は、例えば、7-デアザプリン類似体、8-ハロプリン類似体、5-ハロピリミジン類似体を含む、プリン又はピリミジン類似体、又は、ヒポキサンチン、ニトロアゾール、イソカルボスチリル類似体、アゾールカルボキサミド、及び芳香族トリアゾール類似体を含む任意の塩基と対を成し得るユニバーサル塩基類似体、又は、親和性結合のためのビオチン部分などの更なる機能を伴う塩基類似体を有してもよい。
典型的な実施形態では、標識化されたSBP要素が抗体である。抗体の標識化は、例えば、NHS-アミン化学、スルフヒドリル-マレイミド化学、又はクリックケミストリー(歪みアルキン及びアジド、歪みアルキン及びニトロン、歪みアルケン及びテトラジンなど)を使用する質量タグの付着により、分子を抗体に結合させる1つ以上の標識原子のコンジュゲーションを通じて達成され得る。イメージングに有用な細胞タンパク質を認識する抗体は、IHCでの使用に既に広く利用可能であり、また、現在の標識化技術(例えば蛍光)の代わりに標識原子を使用することにより、これらの既知の抗体を本明細書の開示方法で用いるのに容易に適合させることができるが、多重化機能を向上させるという利点を伴う。抗体は、細胞表面上の標的又は細胞内の標的を認識することができる。抗体は様々な標的を認識でき、例えば、抗体は、個々のタンパク質を特異的に認識でき、又は、共通のエピトープを共有する複数の関連タンパク質を認識でき、又は、タンパク質の特定の翻訳後修飾を認識できる(例えば、対象のタンパク質のチロシンとホスホチロシンとを区別するため、リジンとアセチル-リジンとを区別するため、ユビキチン化を検出するためなど)。その標的に結合した後、抗体にコンジュゲートされた標識原子を検出して、サンプル中のその標的の位置を明らかにすることができる。
RNAは、本明細書に開示される方法及び装置が特定の高感度で必要に応じて定量的な態様で検出できる他の生物学的分子である。タンパク質の分析について前述したのと同じ態様で、RNAに特異的に結合する元素タグで標識化されたSBP要素の使用によってRNAを検出できる(例えば、相補配列のロックされた核酸(LNA)分子、相補配列のペプチド核酸(PNA)分子、相補配列のプラスミドDNA、相補配列の増幅されたDNA、相補配列のRNAの断片、及び相補配列のゲノムDNAの断片を含む、前述したような相補配列のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド)。RNAは、成熟したmRNAだけでなく、RNAプロセシング中間体や新生プレmRNA転写物も含む。
1つ以上の固有の金属原子を有する組織化学的染色試薬は、本明細書に記載されるように、他の試薬及び使用方法と組み合わせることができる。例えば、組織化学的染色液は、金属含有薬物、金属標識抗体、及び/又は蓄積された重金属と共局在化されてもよい(例えば、細胞又は細胞内の分解能で)。特定の態様において、1つ以上の組織化学的染色液は、他のイメージング方法(例えば、蛍光顕微鏡法、光学顕微鏡法、又は電子顕微鏡法)のために使用されるものからより低い濃度(例えば、半分未満、1/4、1/10など)で使用されてもよい。
医学における金属は、薬理学において新規でエキサイティングな分野である。金属タンパク質、核酸金属錯体又は金属含有薬物に組み込まれる前に金属イオンを一時的に貯蔵することに関与する細胞構造、或いは、タンパク質又は薬物分解時の金属イオンの最終結果については殆ど知られていない。微量金属の輸送、貯蔵、及び分配に関与する調節メカニズムを解明するための重要な最初のステップは、理想的には組織、細胞における或いは更には個々の細胞小器官及び細胞内コンパートメントのレベルでのそれらの本来の生理学的環境との関連で、金属の特定及び定量化に相当する。組織学的研究は、一般に、組織の薄い切片又は培養細胞に関して実施される。
本開示の1つの特徴は、サンプル中の複数(例えば、10以上、更には最大100以上)の異なる標的SBP要素を検出して、複数の異なるタンパク質及び/又は複数の異なる核酸配列を検出できるその能力である。これらの標的SBP要素の差分検出を可能にするには、それらのそれぞれのSBP要素が信号を区別できるように異なる標識原子を担持する必要がある。例えば、10個の異なるタンパク質が検出されている場合には、10個の異なる抗体(それぞれが異なる標的タンパク質に特異的)を使用でき、そのそれぞれは固有の標識を有しているため、異なる抗体からの信号を区別できる。幾つかの実施形態では、例えば同じタンパク質上の異なるエピトープを認識する複数の異なる抗体を単一の標的に対して使用することが望ましい。したがって、方法は、このタイプの冗長性に起因して標的よりも多くの抗体を使用してもよい。しかしながら、一般に、本開示は、複数の異なる標識原子を使用して、複数の異なる標的を検出する。
本明細書に記載の1つ以上の固有の金属原子を有する組織化学的染色試薬及び使用方法は、本明細書に記載される他の試薬及び使用方法と組み合わされてもよい。例えば、組織化学的染色液は、金属含有薬物、金属標識抗体、及び/又は蓄積された重金属と共局在化されてもよい(例えば、細胞又は細胞内の分解能で)。特定の態様において、1つ以上の組織化学的染色液は、他のイメージング方法(例えば、蛍光顕微鏡法、光学顕微鏡法、又は電子顕微鏡法)のために使用されるものからより低い濃度(例えば、半分未満、1/4、1/10など)で使用されてもよい。
本開示の方法は、サンプル中の複数の細胞のレーザーアブレーションを含み、したがって、複数の細胞からのプルームが分析され、それらの内容物がサンプル内の特定の位置にマッピングされて、画像がもたらされる。殆どの場合、方法のユーザは、サンプル全体ではなく、サンプル内の特定の細胞に信号を局在化する必要がある。これを達成するために、サンプル内の細胞の境界(例えば、原形質膜、又は場合によっては細胞壁)を定めることができる。
特定の態様では、サンプルキャリアが元素標準を含んでもよい。本開示の方法は、元素標準をサンプルキャリアに適用することを含んでもよい。これに代えて又は加えて、本開示の方法は、本明細書で更に論じられるように、元素標準に基づいて較正を実行すること、及び/又は、元素標準に基づいてサンプルから得られたデータを正規化することを含んでもよい。元素標準を含むサンプルキャリア及び方法は、本開示の他の場所で説明される更なる態様又はステップを更に含んでもよい。
従来の光学顕微鏡法は、照明源の波長の約半分に制限されており、可能な最小分解能は約200nmである。拡大顕微鏡法は、ポリマーネットワークを使用してサンプルを物理的に拡大し、サンプルの光学的可視化の解像度を約20nmに上げる(特に生物学的サンプルに関して)サンプル調製の方法である(国際公開第2015127183号パンフレット)。拡張手順は、イメージング質量分析及びイメージングマスサイトメトリーのためにサンプルを調製するべく使用され得る。このプロセスにより、1μmのアブレーションスポット直径は、拡張されていないサンプルで1μmの分解能をもたらすが、この1μmのアブレーションスポットでは、拡張後の分解能が約100nmになる。
「備える」という用語は、「含む」及び「から成る」を包含し、例えば、Xを「備える」組成は、専らXのみから成ってもよく、或いは、更なる何か、例えばX+Yを含んでもよい。
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以下は、本発明の例である。
(例1)
生物学的サンプルを分析するための装置において、
(i)前記サンプルから材料を除去するとともに、前記材料をイオン化して元素イオンを形成するためのサンプリング・イオン化システムであって、レーザー源、レーザー走査システム、及び、サンプルステージを備える、サンプリング・イオン化システム、
を備える装置。
(例2)
(ii)前記サンプリング・イオン化システムから元素イオンを受けて前記元素イオンを検出するための検出器、
を更に備える例1に記載の装置。
(例3)
前記サンプリング・イオン化システムがサンプリングシステム及びイオン化システムを備え、前記サンプリングシステムは、前記レーザー源、前記レーザー走査システム、及び、前記サンプルステージを備え、前記イオン化システムは、前記レーザーシステムによって前記サンプルから除去された材料を受けるとともに、前記材料をイオン化して元素イオンを形成するようになっている、例1又は2に記載の装置。
(例4)
前記レーザー走査システムは、前記レーザー源によって放出されるレーザービームの前記サンプルステージに対する第1の相対移動を与えることができるポジショナを備える、例1、2又は3に記載の装置。
(例5)
前記レーザー走査システムの前記ポジショナは、前記サンプルステージに対する前記レーザービームの第2の相対移動も与えることができ、前記第1及び第2の相対移動が平行ではなく、例えば前記相対移動が直交している、例4に記載の装置。
(例6)
前記レーザー走査システムは、前記サンプルステージに対する前記レーザービームの第2の相対移動を与えることができる第2のポジショナを更に備え、前記第1及び第2の相対移動が平行ではなく、例えば前記相対移動が直交している、例4に記載の装置。
(例7)
前記レーザー走査システムの応答時間は、1msより速く、500μsより速く、250μsより速く、100μsより速く、50μsより速く、10μsより速く、5μsより速く、1μsより速く、500nsより速く、250nsより速く、100nsより速く、50nsより速く、10nsより速く、又は、約1nsである、例1から6のいずれか一項に記載の装置。
(例8)
前記ポジショナ及び/又は前記第2のポジショナは、(i)ガルバノメーターミラー、MEMSミラー、ポリゴンスキャナ、圧電デバイスミラーなどのミラーベースのポジショナ、及び/又は、(ii)音響光学デバイス(AOD)又は電気光学デバイス(EOD)などの固体ポジショナである、例4から7のいずれか一項に記載の装置。
(例9)
前記レーザー走査システムは、
(i)EOD、例えば電極の2つのセットが屈折媒体に直交して接続されているEODであるポジショナ、
(ii)2つの直交配置されたAODの形態を成すポジショナ及び第2のポジショナ、又は、
(iii)ガルバノメーターミラー対の形態を成すポジショナ及び第2のポジショナ、
を備える例8に記載の装置。
(例10)
前記レーザー走査システムは、
(i)ガルバノメーターミラーであるポジショナ及びAODである第2のポジショナ、
(ii)ガルバノメーターミラーであるポジショナ及びEODである第2のポジショナ、
(iii)ガルバノメーターミラー対の形態を成すポジショナ及び第2のポジショナ、並びに、AODを更に備える、又は
(iv)ガルバノメーターミラー対の形態を成すポジショナ及び第2のポジショナ、並びに、EODを更に備える、
を備える例8又は9に記載の装置。
(例11)
前記AOD屈折媒体は、二酸化テルル、溶融シリカ、ニオブ酸リチウム、三硫化ヒ素、テルライトガラス、ケイ酸鉛、Ge55As12S33、塩化水銀(I)、及び、臭化鉛(II)から選択される材料から形成される、例8、9又は10に記載の装置。
(例12)
前記EOD屈折媒体は、KTN(KTaxNb1-xO3)、LiTaO3、LiNbO3、BaTiO3、SrTiO3、SBN(Sr1-xBaxNb2O6)、BSKNN(Ba2-xSrxK1-yNayNb5O15)、及び、PBN(Pb1-xBaxNb2O6)から選択される材料から形成される、例8、9又は10に記載の装置。
(例13)
AODである場合の前記ポジショナ及び/又はAODである場合の前記第2のポジショナによって引き起こされる任意の分散を補償するようになっている少なくとも1つの分散補償器を前記ポジショナ及び/又は前記第2のポジショナと前記サンプルとの間に更に備え、随意的に、前記分散補償器は、(i)前記ポジショナによって引き起こされる前記分散を補償するのに適した線間隔を有する回折格子、(ii)前記ポジショナ及び/又は第2のポジショナによって引き起こされる前記分散を補償するのに適したプリズム、(iii)前記回折格子(i)とプリズム(ii)とを備える組み合わせ、及び/又は、(iv)更なる音響光学デバイスである、例4から12のいずれか一項に記載の装置。
(例14)
前記サンプルステージが少なくともx軸で移動可能であり、前記ポジショナは、前記サンプルステージ上への前記レーザービームの経路に少なくともy軸で偏向を導入するようになっている、例4から13のいずれか一項に記載の装置。
(例15)
(i)前記ポジショナは、前記サンプルステージ上への前記レーザービームの経路にx軸で偏向を導入するようにもなっており、又は
(ii)前記装置は、前記サンプルステージ上への前記レーザービームの経路にx軸で偏向を導入するようになっている第2のポジショナを備え、
随意的に、前記レーザー走査システムの前記ポジショナは、前記サンプルステージの動きも制御する制御モジュールによって制御される、
例14に記載の装置。
(例16)
前記レーザー源がピコ秒レーザー又はフェムト秒レーザー、特に、随意的にパルスピッカーを備えるフェムト秒レーザーであり、例えば、前記パルスピッカーは、前記サンプルステージ及び/又は前記レーザー走査システムの前記ポジショナの動きも制御する制御モジュールによって制御される、例1から15のいずれか一項に記載の装置。
(例17)
(i)アブレーション速度は、200Hz以上、例えば、500Hz以上、750Hz以上、1kHz以上、1.5kHz以上、2kHz以上、2.5kHz以上、3kHz以上、3.5kHz以上、4kHz以上、4.5kHz以上、5kHz以上、又は、10kHz以上、約100kHz、100kHz以上、1MHz以上、10MHz以上、又は、100MHz以上であり、及び/又は、
(ii)レーザー繰り返しレートは、少なくとも1kHz、例えば、少なくとも10kHz、少なくとも100kHz、少なくとも1MHz、少なくとも10MHz、約50MHz、又は、少なくとも100MHzであり、随意的に、
前記サンプリングシステムがパルスピッカーを更に備え、例えば、前記パルスピッカーは、前記サンプルステージ及び/又は前記レーザー走査システムの前記ポジショナの動きも制御する制御モジュールによって制御される、
例1から16のいずれか一項に記載の装置。
(例18)
前記レーザー源は、10μm未満、5μm未満、2μm未満、約1μm、又は、1μm未満の直径のスポットサイズをもたらすようになっている、例1から17のいずれか一項に記載の装置。
(例19)
カメラを更に備える、例1から18のいずれか一項に記載の装置。
(例20)
前記イオン化システムがICPである、例1から19のいずれか一項に記載の装置。
(例21)
前記検出器がTOF質量分析計である、例1から20のいずれか一項に記載の装置。
(例22)
サンプルを分析する方法において、
(i)サンプルステージ上で前記サンプルのレーザーアブレーションを行なうステップであって、レーザー放射線がレーザー走査システムを使用して前記サンプルへと方向付けられ、複数のプルームを形成するために前記アブレーションが複数の位置で行なわれる、ステップと、
(ii)前記プルームをイオン化及び質量分析に晒すステップであって、前記プルーム内の原子の検出が前記サンプルの画像の構築を可能にし、随意的に、前記複数の位置が複数の既知の位置である、ステップと、
を含む方法。
(例23)
複数の細胞を含むサンプルに関してマスサイトメトリーを行なう方法において、
(i)前記サンプル中の複数の異なる標的分子を1つ以上の異なる標識原子で標識化して、標識サンプルをもたらすステップと、
(ii)サンプルステージ上の前記サンプルのレーザーアブレーションを行なうステップであって、レーザー放射線がレーザー走査システムを使用して前記サンプルへと方向付けられ、複数のプルームを形成するために前記アブレーションが複数の位置で行なわれる、ステップと、
(iii)前記プルームをイオン化及び質量分析に晒すステップであって、前記プルーム内の原子の検出が前記サンプルの画像の構築を可能にし、随意的に、前記複数の位置が複数の既知の位置である、ステップと、
を含む方法。
(例24)
a.前記プルームのうちの1つ以上が個別にイオン化及び質量分析に晒され、及び/又は、
b.前記プルームのうちの1つ以上が既知の位置から生成される、
例22又は23に記載の方法。
(例25)
隣り合う既知の位置からのプルームが単一の事象として分析され、例えば、アブレーションが前記サンプルの対象の1つ以上の特徴で実行され、隣り合う既知の位置からの前記プルームが全て対象の特徴からのもの、例えば単一の細胞である、例22又は23に記載の方法。
(例26)
前記隣り合うスポットが、前記サンプルをアブレーションするために使用される前記レーザー放射線の前記スポットサイズの直径の10倍未満であり、例えば、前記スポットサイズの直径の8倍未満、5倍未満、2.5倍未満、2倍未満、1.5倍未満、約1倍、又は、1倍未満である例25に記載の方法。
(例27)
前記方法は、前記レーザー走査システム内のポジショナを制御して、前記レーザーによって放出されるレーザービームの前記サンプルステージに対する第1の相対移動を与えるステップを含む、例22から26のいずれか一項に記載の方法。
(例28)
前記方法は、前記レーザー走査システム内のポジショナを制御して、前記サンプルステージに対する前記レーザービームの第2の相対移動を与えるステップを含み、前記第1及び第2の相対移動が平行ではなく、例えば前記相対移動が直交している、例27に記載の方法。
(例29)
前記方法は、前記レーザー走査システム内の第2のポジショナを制御して、前記サンプルステージに対する前記レーザービームの第2の相対移動を与えるステップを含み、前記第1及び第2の相対移動が平行ではなく、例えば前記相対移動が直交している、例27に記載の方法。
(例30)
前記サンプルステージの動きを制御することによって前記サンプルを第1の方向で移動させるとともに、前記レーザー走査システム内のポジショナを制御することによって第2の方向で前記サンプルに対する相対移動を前記レーザー放射線のビームに導入するステップを含み、前記第1及び第2の方向が平行ではなく、随意的に、前記相対移動が直交し、随意的に、前記走査領域が前記サンプルステージを動かさずに走査され得るよりも大きい、例27から29のいずれか一項に記載の方法。
(例31)
前記サンプルステージの動きを制御することによってX軸で前記サンプルを移動させるとともに、前記レーザー走査システム内のポジショナを制御することによってY軸で前記サンプルに対する相対移動を前記レーザー放射線のビームに導入するステップを含む、例27から29のいずれか一項に記載の方法。
(例32)
前記レーザー走査システムは、X軸でも前記サンプルに対する相対移動を前記レーザー放射線に導入し、例えば、前記レーザー走査システムは、前記サンプルステージの前記相対移動を補償し、それにより、前記サンプル上の前記アブレーションスポットに関する規則的なラスターパターンを維持する、例31に記載の方法。
(例33)
前記サンプルの3Dイメージングを実行するステップであって、レーザーアブレーションを使用して、前記サンプルの少なくとも一部を第1の深さまでアブレーションした後に、前記第1の深さまでのアブレーションにより露出された前記サンプルの部分を第2の深さまでアブレーションする、ステップを含む、例27から32のいずれか一項に記載の方法。
(例34)
アブレーション深さの変化をもたらすように前記焦点距離が制御され、及び/又は、サンプル深さの変化に影響を与えるように前記サンプルステージ上の前記サンプルは、Z軸で移動される、例33に記載の方法。
(例35)
前記ポジショナ及び/又は前記第2のポジショナは、(i)ガルバノメーターミラー、MEMSミラー、ポリゴンスキャナ、圧電デバイスミラーなどのミラーベースのポジショナ、及び/又は、(ii)音響光学デバイス(AOD)又は電気光学デバイス(EOD)などの固体ポジショナである、例26から33のいずれか一項に記載の方法。
(例36)
前記レーザー放射線をもたらすレーザーと、前記レーザー走査システムのポジショナとを制御して、前記サンプル上の位置に向けられるレーザー放射線パルスのバーストを生み出すステップを含み、前記レーザー放射線パルスのバーストから生成される前記プルームがイオン化されて連続事象として検出され、随意的に、前記バースト内の前記パルスが10-12秒よりも短いパルス持続時間を有する、例22、23及び25から35のいずれか一項に記載の方法。
(例37)
前記レーザー放射線のバーストが少なくとも3つのレーザーパルスを含み、各レーザーパルス間の持続時間は、1msより短い、例えば、500μsより短い、250μsより短い、100μsより短い、50μsより短い、10μsより短い、1μsより短い、500nsより短い、250nsより短い、100nsより短い、50nsより短い、又は、約10ns以下である、例36に記載の方法。
(例38)
前記レーザー放射線のバーストは、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、又は、少なくとも100個のレーザーパルスを含む、例37に記載の方法。
(例39)
前記ポジショナは、(i)EOD、例えば電極の2つのセットが前記屈折媒体に直交して接続されているEODである、又は、(ii)前記ポジショナが2つの直交して配置されるAODであり、随意的に、前記方法は、AODによって前記レーザー放射線のビームの強度を制御するステップも含む、例36から38のいずれか一項に記載の方法。
(例40)
前記方法は、サンプル上の対象の1つ以上の特徴を特定し、前記サンプル上の対象の前記1つ以上の特徴の位置情報を記録し、及び、前記サンプルのレーザーアブレーションを実行するステップを含み、レーザー放射線が、前記対象の1つ以上の特徴の前記位置情報を用いて、レーザー走査システムを使用して前記サンプルへと方向付けられ、1つ以上のプルームを形成する、例22から39のいずれか一項に記載の方法。
(例41)
対象の特徴からのプルームが連続事象として分析される、例40に記載の方法。
(例42)
前記特徴は、前記サンプルの光学画像の検査によって特定され、随意的に、前記サンプルが蛍光標識で標識化され、前記蛍光標識が蛍光を発するような条件下で前記サンプルが照射される、例40又は41に記載の方法。
(例43)
サンプルを分析する方法において、
(i)レーザー放射線を使用してサンプル材料のスラグを脱着するステップであって、レーザー放射線が、レーザー走査システムを使用してサンプルステージ上の前記サンプルに向けられる、ステップと、
(ii)前記サンプル材料のスラグをイオン化し、質量分析によって前記スラグ内の原子を検出するステップと、
を含む方法。
(例44)
複数の細胞を含むサンプルに関してマスサイトメトリーを行なう方法において、
(i)前記サンプル中の複数の異なる標的分子を1つ以上の異なる標識原子で標識化して、標識サンプルを与えるステップと、
(ii)レーザー放射線を使用してサンプル材料のスラグを脱着するステップであって、レーザー放射線が、レーザー走査システムを使用してサンプルステージ上の前記サンプルへと方向付けられる、ステップと、
(iii)前記サンプル材料のスラグをイオン化して、質量分析によって前記スラグ内の原子を検出するステップと、
を含む方法。
(例45)
前記脱着は、レーザー放射線の一連のパルスを脱着されるべき前記サンプル材料へと方向付けることによって達成され、
随意的に、
a.前記レーザー放射線の一連のパルスが前記サンプル材料へと螺旋パターンで方向付けられ、例えば、前記一連のパルスがバーストとして送出され、例えば、前記バースト内の前記パルスが10-12秒よりも短いパルス持続時間を有し、及び/又は
b.前記一連のパルスが前記サンプル上の既知の位置の範囲内にある、
例43又は44に記載の方法。
(例46)
前記レーザー放射線のバーストが少なくとも3つのレーザーパルスを含み、各レーザーパルス間の持続時間は、1msより短い、例えば、500μsより短い、250μsより短い、100μsより短い、50μsより短い、10μsより短い、1μsより短い、500nsより短い、250nsより短い、100nsより短い、50nsより短い、又は、約10ns以下である、例45に記載の方法。
(例47)
前記レーザー放射線のバーストは、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、又は、少なくとも100個のレーザーパルスを含む、例46に記載の方法。
(例48)
レーザーアブレーションを使用して、対象の特徴の周囲の前記材料をアブレーションし、前記対象の特徴における前記サンプル材料が前記サンプルキャリアから材料のスラグとして脱着される前に前記周囲の領域を除去する、例43から47のいずれか一項に記載の方法。
(例49)
前記方法は、前記レーザー走査システム内のポジショナを制御して、前記レーザーによって放出されるレーザービームの前記サンプルステージに対する第1の相対移動を与えるステップを含む、例43から48のいずれか一項に記載の方法。
(例50)
前記方法は、前記レーザー走査システム内のポジショナを制御して、前記サンプルステージに対する前記レーザービームの第2の相対移動を与えるステップを含み、前記第1及び第2の相対移動が平行ではなく、例えば前記相対移動が直交している、例49に記載の方法。
(例51)
前記方法は、前記レーザー走査システム内の第2のポジショナを制御して、前記サンプルステージに対する前記レーザービームの第2の相対移動を与えるステップを含み、前記第1及び第2の相対移動が平行ではなく、例えば前記相対移動が直交している、例49に記載の方法。
(例52)
前記ポジショナ及び/又は前記第2のポジショナは、(i)ガルバノメーターミラー、MEMSミラー、ポリゴンスキャナ、圧電デバイスミラーなどのミラーベースのポジショナ、及び/又は、(ii)音響光学デバイス(AOD)又は電気光学デバイス(EOD)などの固体ポジショナであり、例えば、前記レーザー走査システムは、(a)ガルバノメーターミラーであるポジショナ及びAODである第2のポジショナ、
(b)ガルバノメーターミラーであるポジショナ及びEODである第2のポジショナ、
(c)ガルバノメーターミラー対の形態を成すポジショナ及び第2のポジショナ、及び、AODを更に備える、又は、
(d)ガルバノメーターミラー対の形態を成すポジショナ及び第2のポジショナ、及び、EODを更に備える、
を備える、例43から51のいずれか一項に記載の方法。
(例53)
前記方法は、サンプル上の対象の1つ以上の特徴を特定し、前記サンプル上の対象の前記1つ以上の特徴の位置情報を記録し、及び、前記サンプルからサンプル材料を脱着させるステップを含み、レーザー放射線が、前記対象の1つ以上の特徴の前記位置情報を用いて、レーザー走査システムを使用して前記サンプルへと方向付けられ、前記対象の1つ以上の特徴から材料のスラグを脱着させる、例43から51のいずれか一項に記載の方法。
(例54)
前記特徴は、前記サンプルの光学画像の検査によって特定され、随意的に、前記サンプルが蛍光標識で標識化され、前記蛍光標識が蛍光を発するような条件下で前記サンプルが照射される、例53に記載の方法。
(例55)
前記サンプルがサンプルキャリア上にあり、前記サンプルキャリアが前記サンプルと前記サンプルキャリアとの間に脱着膜層を備え、前記レーザー放射線が前記脱着膜へと方向付けられてサンプル材料を脱着させる、例43から54のいずれか一項に記載の方法。
(例56)
例22から42のいずれか一項に記載の方法を更に含む、例43から55のいずれか一項に記載の方法。
(例57)
例1から21のいずれか一項に記載の装置の使用を含む、例22から55のいずれかに記載の方法。
(例58)
例22から57のいずれか一項に記載の方法で用いるレーザー走査システム。
(例59)
画像を位置合わせする方法において、
a)イメージングマスサイトメトリー以外のイメージングモダリティによって組織サンプルの第1の組織切片から第1の画像を取得するステップと、
b)イメージングマスサイトメトリーによって前記組織サンプルの第2の組織切片の第2の画像を取得するステップと、
c)前記第1及び第2の画像を位置合わせするステップと、
を含む方法。
(例60)
イメージングマスサイトメトリー以外の前記イメージングモダリティが非線形顕微鏡法である、例59に記載の方法。
(例61)
前記装置は、複数の質量タグの存在を選択的に検出するように構成され、前記質量タグがランタニド同位体を含む、例2に記載の装置。
(例62)
イメージングマスサイトメトリーの方法において、
光学顕微鏡法によってサンプルにおける特徴を特定するステップと、
その特徴の全体にわたって放射線を走査して、材料のプルームを生成するステップと、
前記材料のプルームを質量分析器へ送出するステップと、
を含む方法。
(例63)
前記特徴が細胞である、例62に記載の方法。
(例64)
前記サンプルが質量タグ付きSBPを含む、例62又は63に記載の方法。
(例65)
1秒間に100を超える単一細胞を分析するステップを更に含む、例63又は64に記載の方法。
(例66)
前記放射線がレーザー放射線である、例62から65のいずれか一項に記載の方法。
(例67)
ICPによって前記材料をイオン化するステップを更に含む、例66に記載の方法。
(例68)
前記質量分析器がTOF検出器を備える、例62から67のいずれか一項に記載の方法。
(例69)
例62から68のいずれか一項に記載の方法を実施するための装置。
Claims (20)
- 複数の細胞を含むサンプルに関してマスサイトメトリーを行なう方法において、
(i)前記サンプル中の複数の異なる標的分子を1つ以上の異なる標識原子で標識化して、標識サンプルをもたらすステップと、
(ii)前記サンプル上にレーザー放射線をラスター照射することにより、サンプルステージ上の前記サンプルのレーザーアブレーションを行なうステップであって、複数のプルームを形成するために前記アブレーションが複数の細胞のうちの1つの細胞上の複数の位置で行なわれる、ステップと、
(iii)前記複数のプルームをイオン化及び質量分析に晒すステップと、
(iv)前記複数のプルーム内の前記1つ以上の異なる標識原子を連続事象として検出するステップと、
を含む方法。 - 前記レーザー放射線は、アブレーションのためのスポットサイズ直径によって特徴付けられ、前記複数の位置の任意の2つの隣接する位置の間隔が、前記スポットサイズ直径の10倍未満である請求項1に記載の方法。
- 前記ラスター照射することは、レーザー走査システム内のポジショナを制御して、前記サンプルステージに対して第1の方向に前記レーザー放射線を移動させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ラスター照射することは、前記ポジショナを制御して、前記サンプルステージに対して第2の方向に前記レーザー放射線を移動させることを含み、前記第1の方向及び前記第2の方向が平行ではない、請求項3に記載の方法。
- 前記ラスター照射することは、前記レーザー走査システム内の第2のポジショナを制御して、前記サンプルステージに対して第2の方向に前記レーザー放射線を移動させることを含み、前記第1の方向及び前記第2の方向が平行ではない、請求項3に記載の方法。
- 前記第1の方向及び前記第2の方向が直交している、請求項5に記載の方法。
- 前記ラスター照射することは、前記サンプルステージを第3の方向に移動させることによって前記サンプルを移動させることを含み、前記第3の方向が前記第1の方向に対して平行ではない、請求項3から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第3の方向が前記第1の方向に対して垂直である、請求項7に記載の方法。
- 前記サンプルの3Dイメージングを実行するステップであって、レーザーアブレーションを使用して、前記サンプルの少なくとも一部を第1の深さまでアブレーションした後に、前記第1の深さまでのアブレーションにより露出された前記サンプルの部分を第2の深さまでアブレーションする、ステップを含む、請求項3から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レーザー放射線は焦点距離によって特徴付けられ、
アブレーション深さの変化をもたらすように前記焦点距離が制御され、及び/又は、
前記サンプルステージは、前記第2の深さまでアブレーションするためにZ軸で移動される、請求項9に記載の方法。 - 前記ポジショナは、(i)ミラーベースのポジショナ、及び/又は、(ii)固体ポジショナである、請求項3から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のポジショナは、(i)ミラーベースのポジショナ、及び/又は、(ii)固体ポジショナである、請求項5に記載の方法。
- 前記レーザー放射線をもたらすレーザーと、レーザー走査システムのポジショナとを制御して、前記複数の位置に向けられるレーザー放射線パルスのバーストを生み出すステップを含む、請求項2から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レーザー放射線のバーストが少なくとも3つのレーザーパルスを含み、各レーザーパルス間の持続時間は、1msより短い、請求項13に記載の方法。
- 前記持続時間は、500μsより短い、請求項14に記載の方法。
- 前記レーザー放射線のバーストは、少なくとも10個のレーザーパルスを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記複数のプルームは第1の複数のプルームであり、
前記方法は、前記サンプル上の前記複数の細胞を特定し、前記サンプル上の前記複数の細胞の位置情報を記録し、前記サンプルのレーザーアブレーションを実行するステップを含み、レーザー放射線が、前記複数の細胞の前記位置情報を用いて、前記サンプルへと方向付けられ、第2の複数のプルームを形成する、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第2の複数のプルームが連続事象として分析される、請求項17に記載の方法。
- 前記ラスター照射することは、100μm 2 の領域に及ぶ、請求項1に記載の方法。
- 前記レーザー放射線は、2μm未満のスポットサイズによって特徴付けられる、請求項19に記載の方法。
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