CN110914458A - 生物标志物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及用于鉴定和/或分类微生物(特别是细菌)、酵母生物和丝状真菌的方法和试剂。特别地，本发明涉及在细菌16S核糖体RNA(16S rRNA)和酵母生物和丝状真菌18S核糖体RNA中发现独特的单核苷酸多态性(SNP)，以及基于那些SNP中的一者或多者的存在，分类和/或鉴定样品中的细菌、酵母生物和/或丝状真菌的方法。本发明还涉及在那些方法中有用的探针、引物和试剂盒。

Description

生物标志物及其用途
技术领域
本发明一般涉及用于鉴定和/或分类微生物的方法和试剂。所述方法和试剂是基于检测细菌的16S核糖体RNA基因或基因产物内以及酵母生物和丝状真菌的18S核糖体RNA基因或基因产物内的多态性。本发明的特征还在于基于本发明的诊断方法用于治疗细菌、酵母生物或丝状真菌感染的方法。
背景技术
快速和准确地鉴定或分类样品中的微生物(例如细菌)、酵母生物和丝状真菌是非常理想的。
首先，通过允许及早实施有效的治疗或疗法，可以快速和准确地诊断此类感染，从而造成患者的生与死的差别。
快速和准确的鉴定或分类可以帮助实施有效的控制措施，以管理、控制、根除和/或消除受污染的溶液、材料或食品中的微生物、酵母生物或丝状真菌，否则所述微生物、酵母生物或丝状真菌会对生物体的健康或溶液、材料或食品的生产质量造成威胁。
另外，快速和准确的鉴定或分类可以帮助样品中的天然微生物、酵母生物或丝状真菌种群，例如，用于微生物多样性、门谱和/或相对门丰度(relative phylum abundance)的生态学研究，或用于监测生物体的病理状况(例如肠道、呼吸系统和皮肤疾病)中的与正常状态的平衡偏差。
在疗法、治疗或调节后，可能需要快速和准确地鉴定或分类微生物、酵母或丝状真菌。例如，快速的微生物鉴定或分类可用于分析抗生素、类固醇、免疫调节剂、益生元(pre-biotics)和后生元(post-biotics)、土壤或水处理、过滤、灭菌程序和防腐剂的使用。
当前，大多数可商购的诊断技术通常需要使用培养物从样品中分离和鉴定活的微生物、酵母生物和丝状真菌，但是所述技术会受到相当长的周转时间和次优灵敏度、特异性和预测价值的负面影响。它还可能需要对生物体进行更广泛的处理，这对于某些生物体(例如对安全性敏感的生物制剂)可能尤其不理想。
可用的替代性诊断技术包括使用聚合酶链式反应(PCR)，特别是与培养物结合使用。然而，这种技术的问题在于，在缺乏培养结果或相关的临床或身体症状的情况下，对早期的阳性PCR结果缺乏信任。这种技术的另一个问题在于，与培养一样，在尝试检测宿主核酸的背景中的少量微生物核酸时缺乏敏感性和特异性。
因此，人们需要快速和可靠的技术来准确诊断细菌、酵母生物和/或丝状真菌。
发明内容
在各个方面，本发明部分地基于原核生物(包括细菌)之间的16S(Svedberg单位)核糖体RNA(16S rRNA)基因的高度保守性以及酵母生物和丝状真菌之间的18S核糖体RNA(18S rRNA)基因的高度保守性，以及部分地基于发现16S rRNA基因和18S rRNA基因内的多种单核苷酸多态性(SNP)，这可用于鉴定和分类样品中的微生物(尤其是细菌微生物)和酵母生物和/或丝状真菌。
一般来说，包括细菌在内的原核生物都含有16S rRNA，这是原核生物核糖体的30S小亚基的组成部分。16S rRNA的长度约为1,500个核苷酸，并由16S rRNA基因(也称为16SrDNA)编码，所述基因通常是也包含23S和5S rRNA基因的共转录操纵子的一部分。尽管原核生物之间16S rRNA基因的DNA序列(和因此16S rRNA分子的RNA序列)高度保守，但仍存在变异区域(Weisberg W.G.等人,1991)。
同样，酵母和丝状真菌中的18S rRNA基因是原核生物中16S rRNA基因的同源物。18S rRNA是40S真核小核糖体亚基的组成部分。18S rRNA基因的DNA序列(和因此18S rRNA分子的RNA序列)在酵母和丝状真菌中也高度保守。
根据本发明的第一方面，提供了一种鉴定、部分鉴定或分类样品中的至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌的方法。
在一个实施方案中，所述方法包括分析来自所述样品的至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或来自所述样品的至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)，
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和653中的至少一者相对应的位置；或
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在或对应于SEQ ID NO:43中所示的16S rRNA基因；或
其中基于所述至少一个SNP的存在或不存在，鉴定、部分鉴定或分类所述样品中的所述至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌。
在另一个实施方案中，所述方法包括分析来自所述样品的至少一部分细菌16SrRNA基因或基因产物或来自所述样品的至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)，
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少一者相对应的位置；
其中基于所述至少一个SNP的存在或不存在，鉴定、部分鉴定或分类所述样品中的所述至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌。
根据本发明的第二方面，提供了一种鉴定、部分鉴定、分类或诊断受试者中的细菌、酵母生物或丝状真菌感染的方法。
在一个实施方案中，所述方法包括分析来自所述受试者的样品中的至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)；
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653中的至少一者相对应的位置；或
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在或对应于SEQ ID NO:43中所示的16S rRNA基因；或
其中所述至少一个SNP在所述至少一部分16S rRNA基因或基因产物中或在所述至少一部分18S rRNA基因或基因产物中的存在或不存在被用于鉴定、部分鉴定、分类或诊断所述受试者中的所述细菌、酵母生物或丝状真菌感染。
在另一个实施方案中，所述方法包括分析来自所述受试者的样品中的至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)；
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少一者相对应的位置；
其中所述至少一个SNP在所述至少一部分16S rRNA基因或基因产物中或在所述至少一部分18S rRNA基因或基因产物中的存在或不存在被用于鉴定、部分鉴定、分类或诊断所述受试者中的所述细菌、酵母生物或丝状真菌感染。
根据本发明的第三方面，提供了一种治疗患有细菌、酵母生物或丝状真菌感染的受试者的方法，所述方法包括：
根据第二方面的方法鉴定、部分鉴定、分类或诊断受试者中的细菌、酵母生物或丝状真菌感染，以鉴定、部分鉴定、分类或诊断所述受试者中的所述细菌、酵母生物或丝状真菌感染；
向所述受试者施用用于治疗所述受试者中的所述细菌、酵母生物或丝状真菌感染的疗法或治疗剂。
根据本发明的第四方面，提供了至少一种分离探针、工具或试剂。
在第四方面的一个实施方案中，所述至少一种分离探针、工具或试剂能够鉴定、部分鉴定或分类样品中的至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌，其中所述探针、工具或试剂能够结合、检测或鉴定在至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)，
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653中的至少一者相对应的位置；或
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在或对应于SEQ ID NO:43中所示的16S rRNA基因。
在第四方面的另一个实施方案中，所述至少一种分离探针、工具或试剂能够鉴定、部分鉴定或分类样品中的至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌，其中所述探针、工具或试剂能够结合、检测或鉴定在至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)，
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少一者相对应的位置。
根据第四方面的另一个实施方案，所述至少一种分离探针、工具或试剂能够辨别包含至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌的样品与不包含至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌的样品，其中所述探针、工具或试剂能够结合、检测或鉴定在至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)，
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653中的至少一者相对应的位置；或
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在或对应于SEQ ID NO:43中所示的16S rRNA基因。
根据第四方面的另一个实施方案，所述至少一种分离探针、工具或试剂能够辨别包含至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌的样品与不包含至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌的样品，其中所述探针、工具或试剂能够结合、检测或鉴定在至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)，
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少一者相对应的位置。
根据本发明的第五方面，提供了一种鉴定、部分鉴定或分类样品中的至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌的方法。
在一个实施方案中，所述方法包括：
将第四方面的至少一种分离探针、工具或试剂与所述样品组合；和
基于至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)，鉴定、部分鉴定或分类所述至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌，
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653中的至少一者相对应的位置；或
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在或对应于SEQ ID NO:43中所示的16S rRNA基因。
在另一个实施方案中，所述方法包括：
将第四方面的至少一种分离探针、工具或试剂与所述样品组合；和
基于至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)，鉴定、部分鉴定或分类所述至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌，
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少一者相对应的位置。
根据本发明的第六方面，提供了一种阵列(特别是微阵列)，其包括多于一种的第四方面的分离探针、工具或试剂。
根据本发明的第七方面，提供了一种生物芯片，其包括固体基板和至少一种第四方面的分离探针、工具或试剂。
根据本发明的第八方面，提供了一种试剂盒或分析法。
在第八方面的一个实施方案中，所述试剂盒或分析法用于分类或鉴定样品中的至少一种细菌或至少一种酵母生物或丝状真菌，所述试剂盒或分析法包括：至少一种第四方面的探针、工具或试剂；第六方面的阵列；和/或第七方面的生物芯片。
在第八方面的另一个实施方案中，所述试剂盒或分析法能够辨别包含至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌的样品与不包含至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌的样品，其中所述试剂盒或分析法包括第四方面的探针、工具或试剂。
根据本发明的第九方面，提供了至少一个单核苷酸多态性(SNP)。
在一个实施方案中，所述至少一个SNP处于至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中，用作分类、鉴定或部分鉴定样品中的至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌的指标；
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653中的至少一者相对应的位置；或
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在或对应于SEQ ID NO:43中所示的16S rRNA基因。
在另一个实施方案中，所述至少一个SNP处于至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中，用作分类、鉴定或部分鉴定样品中的至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌的指标；
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少一者相对应的位置。
根据本发明的第十方面，提供了如第一方面中定义的在至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)或第四方面的至少一种分离探针、工具或试剂的用途，其用于鉴定、部分鉴定或分类样品中的至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌，其中基于来自样品的至少一部分16S rRNA基因或基因产物或至少一部分18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个SNP来鉴定、部分鉴定或分类所述至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌。
根据本发明的第十一方面，提供了一种试剂盒，其包括用于本发明的第一、第二、第三或第五方面中的任一者的方法中的探针、工具或试剂。
下面提供了本发明的其他方面。
根据本发明的第十二方面，提供了16S rRNA基因中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)，其用于或正用于鉴定样品中的至少一种细菌或分类样品中的细菌；或18S rRNA基因中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)，其用于或正用于鉴定样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌或分类样品中的酵母生物或丝状真菌。
根据本发明的第十三方面，提供了用于或正用于鉴定样品中的至少一种细菌或分类样品中的细菌的至少一种探针、工具或试剂，所述至少一种探针、工具或试剂能够特异性结合、检测或鉴定样品中的含有至少一个SNP的至少一部分16S rRNA基因；或用于或正用于鉴定样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌或分类样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌的至少一种探针、工具或试剂，所述至少一种探针、工具或试剂能够特异性结合、检测或鉴定样品中的含有至少一个SNP的至少一部分18S rRNA基因。
根据本发明的第十四方面，提供了用于或正用于鉴定样品中的细菌或分类样品中的细菌的至少一种探针、工具或试剂，所述至少一种探针、工具或试剂包括具有SEQ ID NO:16-35、56或57中任一者所示的核苷酸序列的寡核苷酸；或用于或正用于鉴定样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌或分类样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌的至少一种探针、工具或试剂，所述至少一种探针、工具或试剂包括具有SEQ ID NO:53-55中任一者所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
根据本发明的第十五方面，提供了在第十二方面中定义的至少一个SNP或在第十三或第十四方面中定义的至少一种探针、工具或试剂用于鉴定样品中的至少一种细菌或分类样品中的细菌的用途，其中如上所述，基于来自样品的16S rRNA基因中存在至少一个SNP，鉴定所述至少一种细菌或分类细菌；或第十二方面中定义的至少一个SNP或第十三或第十四方面中定义的至少一种探针、工具或试剂用于鉴定样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌或分类样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌的用途，其中如上所述，基于来自样品的18S rRNA基因中存在至少一个SNP，鉴定或分类所述至少一种酵母生物或丝状真菌。
根据本发明的第十六方面，提供了一种鉴定样品中的至少一种细菌的方法，所述方法包括对来自样品的16S rRNA基因分析第一方面中所定义的至少一个SNP，其中基于所述至少一个SNP的存在来鉴定所述至少一种细菌；或一种鉴定样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌的方法，所述方法包括对来自样品的18S rRNA基因分析第十二方面所定义的至少一个SNP，其中基于所述至少一个SNP的存在来鉴定所述至少一种酵母生物或丝状真菌。
在一个实施方案中，提供了一种鉴定样品中的至少一种细菌的方法，所述方法包括对来自所述样品的核酸分析细菌16S rRNA基因中的处在与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和653中的至少一者相对应的位置上的至少一个SNP，其中基于所述至少一个SNP的存在鉴定所述至少一种细菌。
根据本发明的第十七方面，提供了一种分类样品中的细菌的方法，所述方法包括对来自样品的16S rRNA基因分析第一方面中所定义的至少一个SNP，其中基于所述至少一个SNP的存在来分类所述细菌；或一种分类样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌的方法，所述方法包括对来自样品的18S rRNA基因分析第十二方面所定义的至少一个SNP，其中基于所述至少一个SNP的存在来分类所述至少一种酵母生物或丝状真菌。
根据本发明的第十八方面，提供了一种鉴定样品中的至少一种细菌的方法，所述方法包括：
将第十三或第十四方面中所定义的至少一种探针、工具或试剂与样品组合；和
大体上如上所述，基于来自样品的16S rRNA基因中至少一个SNP的存在，鉴定所述至少一种细菌；或
一种鉴定样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌的方法，所述方法包括：
将第十三或第十四方面中所定义的至少一种探针、工具或试剂与样品组合；和
大体上如上所述，基于来自样品的18S rRNA基因中至少一个SNP的存在，鉴定所述至少一种酵母生物或丝状真菌。
根据本发明的第十九方面，提供了一种分类样品中的细菌的方法，所述方法包括：
将第十三或第十四方面中所定义的至少一种探针、工具或试剂与样品组合；和
大体上如上所述，基于来自样品的16S rRNA基因中至少一个SNP的存在，分类所述细菌；或
一种分类样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌的方法，所述方法包括：
将第十三或第十四方面中所定义的至少一种探针、工具或试剂与样品组合；和
大体上如上所述，基于来自样品的18S rRNA基因中至少一个SNP的存在，分类所述至少一种酵母生物或丝状真菌。
根据本发明的第二十方面，提供了一种诊断受试者中的细菌感染的方法，所述方法包括对从受试者获得的样品中的16S rRNA基因分析第十二方面中定义的至少一个SNP，其中细菌感染是通过基于所述至少一个SNP的存在鉴定样品中的至少一种致病性细菌来诊断的；或一种诊断受试者中的至少一种酵母生物或丝状真菌感染的方法，所述方法包括对从受试者获得的样品中的18S rRNA基因分析第十二方面所定义的至少一个SNP，其中所述至少一种酵母生物或丝状真菌感染是通过基于所述至少一个SNP的存在鉴定样品中的至少一种致病性酵母生物或丝状真菌来诊断的。
根据本发明的第二十一方面，提供了一种诊断受试者中的细菌感染的方法，所述方法包括：
将在第十三或第十四方面中定义的所述至少一种探针、工具或试剂与从受试者获得的样品组合；和
大体上如上所述，通过基于来自样品的16S rRNA基因中至少一个SNP的存在鉴定样品中的至少一种致病性细菌来诊断细菌感染；或
一种诊断受试者中的至少一种酵母生物或丝状真菌感染的方法，所述方法包括：
将在第十三或第十四方面中定义的所述至少一种探针、工具或试剂与从受试者获得的样品组合；和
大体上如上所述，通过基于来自样品的18S rRNA基因中至少一个SNP的存在鉴定样品中的至少一种致病性细菌来诊断至少一种酵母生物或丝状真菌感染。
根据本发明的第二十二方面，提供了一种治疗患有细菌感染的受试者的方法，所述方法包括：
根据第二十或第二十一方面所定义的方法，通过鉴定样品中的至少一种致病性细菌来诊断细菌感染；和
向受试者施用疗法或治疗剂，用于治疗所鉴定的至少一种致病性细菌从而治疗细菌感染；或
一种治疗患有至少一种酵母生物或丝状真菌感染的受试者的方法，所述方法包括：
根据第二十或第二十一方面所定义的方法，通过鉴定样品中的至少一种致病性细菌来诊断至少一种酵母生物或丝状真菌感染；和
向受试者施用疗法或治疗剂，用于治疗所鉴定的至少一种致病性酵母生物或丝状真菌从而治疗细菌感染。
根据本发明的第二十三方面，提供了一种用于鉴定样品中的至少一种细菌或分类样品中的细菌的寡核苷酸探针阵列，所述探针包含与大体上如上所述的样品中的16S rRNA基因中的至少一个SNP杂交的寡核苷酸；或一种用于鉴定样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌或分类样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌的寡核苷酸探针阵列，所述探针包含与大体上如上所述的样品中的18S rRNA基因中的至少一个SNP杂交的寡核苷酸。
根据本发明的第二十四方面，提供了一种微阵列，其包含用于鉴定样品中的至少一种细菌或分类样品中的细菌的寡核苷酸探针，所述探针包含与大体上如上所述的样品中的16S rRNA基因中的至少一个SNP杂交的寡核苷酸；或一种微阵列，其包含用于鉴定样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌或分类样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌的寡核苷酸探针，所述探针包含与大体上如上所述的样品中的18S rRNA基因中的至少一个SNP杂交的寡核苷酸。
根据本发明的第二十五方面，提供了一种生物芯片，其包含固体基板和用于鉴定样品中的至少一种细菌或分类样品中的细菌的至少一种寡核苷酸探针，所述至少一种探针包含与大体上如上所述的样品中的16S rRNA基因中的至少一个SNP杂交的寡核苷酸；或一种生物芯片，其包含固体基板和用于鉴定样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌或分类样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌的至少一种寡核苷酸探针，所述至少一种探针包含与大体上如上所述的样品中的18S rRNA基因中的至少一个SNP杂交的寡核苷酸。
根据本发明的第二十六方面，提供了一种用于鉴定样品中的至少一种细菌或分类样品中的细菌的试剂盒或分析法，所述试剂盒或分析法包括：如上所述的至少一种探针、工具或试剂；如上所述的寡核苷酸探针阵列；如上所述的微阵列；和/或如上所述的生物芯片；或一种用于鉴定样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌或分类样品中的至少一种酵母生物或丝状真菌的试剂盒或分析法，所述试剂盒或分析法包括：如上所述的至少一种探针、工具或试剂；如上所述的寡核苷酸探针阵列；如上所述的微阵列；和/或如上所述的生物芯片。
根据本发明的第二十七方面，提供了一种鉴定、部分鉴定、分类或诊断受试者中的感染的方法。
在第二十七方面的一个实施方案中，所述感染是细菌、酵母生物或丝状真菌感染，所述方法包括分析从所述受试者获得的生物样品中的至少一种细菌16S rRNA基因或基因产物或其一部分或至少一种酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物或其一部分的特性，其中所述分析包括检测所述至少一种细菌16S rRNA基因或基因产物或其一部分或至少一种酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物或其一部分中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)，
其中所述细菌16S rRNA基因或基因产物或其一部分中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和653中的至少一者相对应的位置；或
其中所述细菌16S rRNA基因或基因产物或其一部分中的所述至少一个SNP处在或对应于SEQ ID NO:43中所示的16S rRNA基因；或
其中基于所述至少一个SNP的存在或不存在，鉴定、部分鉴定、分类或诊断所述样品中的所述至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌。
在第二十七方面的另一个实施方案中，所述感染是细菌、酵母生物或丝状真菌感染，所述方法包括分析从所述受试者获得的生物样品中的至少一种细菌16S rRNA基因或基因产物或其一部分或至少一种酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物或其一部分的特性，其中所述分析包括检测所述至少一种细菌16S rRNA基因或基因产物或其一部分或至少一种酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物或其一部分中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)，
其中所述细菌16S rRNA基因或基因产物或其一部分中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少一者相对应的位置；
其中基于所述至少一个SNP的存在或不存在，鉴定、部分鉴定、分类或诊断所述样品中的所述至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌。
适当时，本发明的第一至第二十七方面的特征可以如下所述。
在一个实施方案中，所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP选自处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少一者相对应的位置上的SNP。在一些实施方案中，在本发明的方法中可以使用一个以上的SNP。例如，可以使用至少两个SNP、至少三个SNP、至少四个SNPS、至少五个SNP、至少六个SNP、至少七个SNP、至少八个SNP、至少九个SNP、至少十个SNP、或甚至至少十一个SNP。
在一个实施方案中，所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP选自处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和653相对应的位置上的SNP。在一些实施方案中，在本发明的方法中可以使用一个以上的SNP。例如，可以使用至少两个SNP、至少三个SNP、至少四个SNP、至少五个SNP、至少六个SNP或甚至至少七个SNP。
在另一个实施方案中，所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP可以处在或对应于SEQ ID NO:43中所示的16S rRNA基因。SEQ ID NO:43中所示的至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的至少一个SNP可以处在与SEQ ID NO:43中所示的16S rRNA基因的位置746、764、771或785(或SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置737、755、762或776)中的至少一者相对应的位置上。可以使用至少一个所述SNP、至少两个所述SNP、至少三个所述SNP或至少四个所述SNP。
在另一个实施方案中，所述至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP可以处在或对应于SEQ ID NO:37中所示的18S rRNA基因。所述至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP可以处在与SEQ ID NO:37中所示的18S rRNA基因的位置343、371、388、416和467中的至少一者相对应的位置上。可以使用至少一个所述SNP、至少两个所述SNP、至少三个所述SNP、至少四个所述SNP或至少五个所述SNP。
在另一个实施方案中，所述方法包括分析来自样品的至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或来自样品的至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在：
细菌16S rRNA基因中的处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和653对应的位置上的单核苷酸多态性；或
细菌16S rRNA基因中的处在与SEQ ID NO:43中所示的16S rRNA基因的位置746、764、771和785对应的位置上的单核苷酸多态性；或
酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因中的处在与SEQ ID NO:37中所示的18S rRNA基因的位置343、371、388、416和467对应的位置上的单核苷酸多态性。
在另一个实施方案中，所述方法包括分析来自样品的至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或来自样品的至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在：
所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的处在与SEQ IDNO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少四者相对应的位置上的单核苷酸多态性；或
酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因中的处在与SEQ ID NO:37中所示的18S rRNA基因的位置343、371、388、416和467对应的位置上的单核苷酸多态性。
在一些实施方案中，一种或多种细菌选自哺乳动物(例如人)相关细菌、土壤相关细菌和水相关细菌。在特定的实施方案中，一种或多种细菌可以是与一种或多种与败血症相关的细菌。
在一些特定的实施方案中，一种或多种细菌选自以下至少一种：不动杆菌属(Acinetobacter spp.)；放线杆菌属(Actinobaccillus spp.)；马杜拉放线菌属(Actinomadura spp.)；放线菌属(Actinomyces spp.)；游动放线菌属(Actinoplanesspp.)；气单胞菌属(Aeromonas spp.)；土壤杆菌属(Agrobacterium spp.)；别样杆菌属(Alistipes spp.)；厌氧球菌属(Anaerococcus spp.)；节杆菌属(Arthrobacter spp.)；芽孢杆菌属(Bacillus spp.)；拟杆菌属(Bacteroides spp.)；布鲁菌属(Brucella spp.)；布雷德菌属(Bulleidia spp.)；伯克氏菌属(Burkholderia spp.)；心杆菌属(Cardiobacterium spp.)；柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp.)；梭菌属(Clostridiumspp.)；棒杆菌属(Cornyebacterium spp.)；嗜皮菌属(Dermatophilus spp.)；Dorea spp；肠杆菌属(Enterobacter spp.)；肠球菌属(Enterococcus spp.)；丹毒丝菌属(Erysipelothrix spp.)；埃希氏菌属(Escherichia spp.)；真细菌属(Eubacteriumspp.)；爱德华氏菌属(Ewardsiella spp.)；粪杆菌属(Faecalibacterium spp.)；产线菌属(Filifactor spp.)；芬戈尔德菌属(Finegoldia spp.)；黄杆菌属(Flavobacteriumspp.)；弗朗西斯菌属(Francisella spp.)；Gallicola spp；嗜血杆菌属(Haemophilusspp.)；赫罗球菌属(Helococcus spp.)；霍尔德曼氏菌属(Holdemania spp.)；生丝微菌属(Hyphomicrobium spp.)；克雷伯菌属(Klebsiella spp.)；乳杆菌属(Lactobacillusspp.)；军团杆菌属(Legionella spp.)；李斯特菌属(Listeria spp.)；甲基杆菌属(Methylobacterium spp.)；微球菌属(Micrococcus spp.)；小单孢菌属(Micromonosporaspp.)；动弯杆菌属(Mobiluncus spp.)；莫拉菌属(Moraxella spp.)；摩根菌属(Morganella spp.)；分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)；奈瑟氏菌属(Neisseria spp.)；诺卡氏菌属(Nocardia spp.)；类芽孢杆菌属(Paenibacillus spp.)；副拟杆菌属(Parabacteroides spp.)；巴氏杆菌属(Pasteurella spp.)；嗜胨菌属(Peptoniphilusspp.)；消化链球菌属(Peptostreptococcus spp.)；动性球菌属(Planococcus spp.)；动性微菌属(Planomicrobium spp.)；邻单胞菌属(Plesiomonas spp.)；卟啉单胞菌属(Porphyromonas spp.)；普雷沃氏菌属(Prevotella spp.)；丙酸杆菌属(Propionibacterium spp.)；变形杆菌属(Proteus spp.)；Providentia spp.；假单胞菌属(Pseudomonas spp.)；雷尔氏菌属(Ralstonia spp.)；红球菌属(Rhodococcus spp.)；罗斯氏菌属(Roseburia spp.)；瘤胃球菌属(Ruminococcus spp.)；沙门氏菌属(Salmonellaspp.)；Sedimentibacter spp.；沙雷氏菌属(Serratia spp.)；志贺氏菌属(Shigellaspp.)；Solobacterium spp.；鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas spp.)；葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)；窄食单胞菌属(Stenotrophomonas spp.)；链球菌属(Streptococcus spp.)；链霉菌属(Streptomyces spp.)；泰氏菌属(Tissierella spp.)；弧菌属(Vibrio spp.)；和耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)。
在一些更具体的实施方案中，一种或多种细菌是或选自以下至少一种：鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)；乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)；脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)；普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)；弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)；产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)；阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)；鸟肠球菌(Enterococcus avium)；粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)；屎肠球菌(Enterococcus faecium)；大肠杆菌(Escherichia coli)；产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)；肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)；奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)；人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)；腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)；嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)；无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)；咽峡炎链球菌(Streptococcusanginosus)；星座链球菌(Streptococcus constellatus)；中间链球菌(Streptococcusintermedius)；米氏链球菌(Streptococcus milleri)；缓症链球菌(Streptococcusmitis)；变形链球菌(Streptococcus mutans)；口腔链球菌(Streptococcus oralis)；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)；化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)；血链球菌(Streptococcus sanguinis)；和远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)。
在特定的实施方案中，一种或多种细菌是或选自以下至少一种：乙酸钙不动杆菌；产气肠杆菌；阴沟肠杆菌；粪肠球菌；屎肠球菌；大肠杆菌；肺炎克雷伯菌；奇异变形杆菌；铜绿假单胞菌；粘质沙雷氏菌；金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌；无乳链球菌；肺炎链球菌；和化脓性链球菌。
在特定的实施方案中，一种或多种细菌是或选自以下至少一种：乙酸钙不动杆菌；产气肠杆菌；阴沟肠杆菌；粪肠球菌；屎肠球菌；大肠杆菌；肺炎克雷伯菌；奇异变形杆菌；铜绿假单胞菌；粘质沙雷氏菌；金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌；无乳链球菌；肺炎链球菌；化脓性链球菌；单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)；杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)；脆弱拟杆菌；脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；沙门氏菌(Salmonella sp.)；和表皮葡萄球菌。在另一个实施方案中，一种或多种细菌是或选自以下至少一种：乙酸钙不动杆菌；产气肠杆菌；阴沟肠杆菌；粪肠球菌；屎肠球菌；大肠杆菌；肺炎克雷伯菌；奇异变形杆菌；铜绿假单胞菌；粘质沙雷氏菌；金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌；无乳链球菌；肺炎链球菌；化脓性链球菌；单核细胞增多性李斯特菌；产气荚膜梭菌；杰氏棒杆菌；脆弱拟杆菌；脑膜炎奈瑟氏菌；流感嗜血杆菌；沙门氏菌；表皮葡萄球菌；炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)；肉毒梭菌(Clostridium botulinum)；鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)；土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)；霍乱弧菌(Vibriocholerae)；和类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)。
在一个实施方案中，一种或多种细菌是安全敏感生物剂(SSBA)。SSBA可以是1级试剂或2级试剂。示例性的一级试剂包括以下一种或多种：炭疽芽孢杆菌(炭疽)和鼠疫耶尔森氏菌(瘟疫)。示例性的2级试剂包括以下一种或多种：肉毒梭菌(肉毒中毒，尤其是产生毒素的菌株)；土拉弗朗西斯菌(土拉菌病)；伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)(伤寒)和霍乱弧菌(尤其是霍乱血清型O1或O139)。在一个实施方案中，一种或多种细菌是或选自由以下组成的组的至少一种：炭疽芽孢杆菌、肉毒梭菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉弗朗西斯菌、霍乱弧菌和类鼻疽伯克氏菌。
在一个实施方案中，酵母生物可以选自以下至少一种：念珠菌属(Candida spp.)、隐球菌属(Cryptococcus spp)和红酵母属(Rhodotorula spp)。示例性的念珠菌属可以包括以下至少一种：白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、类星形念珠菌(Candida stellatoidea)、克柔念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、季也蒙念珠菌(Candidaguilliermondii)、维氏念珠菌(Candida viswanathii)、耳念珠菌(Candida auris)和葡萄牙念珠菌(Candida lusitaniae)。示例性的隐球菌属可以包括新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)和加蒂隐球菌(Cryptococcus gattii)中的至少一种。示例性的红酵母属可能是胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。
在一个实施方案中，丝状真菌可选自以下至少一种：曲霉属(Aspergillus spp.)和镰刀菌属(Fusarium spp.)。示例性的镰刀菌属可以包括以下至少一种：腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、拟轮生镰刀菌(Fusariumverticillioides)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)、球茎状镰刀菌(Fusarium bubigeum)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、朗氏镰刀菌(Fusarium langsethiae)、梨孢镰刀菌(Fusarium poae)、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、三线镰刀菌(Fusariumtricinctum)和维氏镰刀菌(Fusarium virguliforme)；特别是腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、拟轮生镰刀菌和层出镰刀菌中的至少一种。示例性的曲霉属可以包括以下至少一种：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、棒曲霉(Aspergillusclavatus)、黑曲霉(Aspergillus lentulus)、土曲霉(Aspergillus terreus)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)；特别是烟曲霉、黄曲霉和棒曲霉中的至少一种；更特别地是烟曲霉。
在一个实施方案中，酵母生物或丝状真菌是由以下组成的组中的至少一者：白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、镰刀菌属、烟曲霉和新型隐球菌。
在一个实施方案中，细菌、酵母生物或丝状真菌是人病原体。
在一些实施方案中，本发明的方法可用于分析来自患有系统性炎症反应综合征(SIRS)的受试者的血液，以确定SIRS的来源(例如细菌、酵母生物或丝状真菌)。在其他实施方案中，本发明的方法可用于确定受试者是否患有具有细菌、酵母生物或丝状真菌感染性来源的败血症。在两个实施方案中，本发明的方法可用于确定样品中的细菌、酵母生物或丝状真菌的存在，区分和/或鉴定样品中存在的细菌、酵母生物或丝状真菌。
SIRS是一种压倒性的全身反应，其可能具有感染性病因或非感染性病因(即感染阴性SIRS或inSIRS)。败血症是感染期间发生的SIRS。在这种情况下，败血症是由临床医生(当怀疑有感染时)或通过生物体培养诊断的。SIRS和败血症均由许多非特异性宿主反应参数定义，包括心率和呼吸频率、体温和白细胞计数的变化(Levy等人,2003；Reinhart等人,2012)。
在一些实施方案中，至少一个SNP或至少一种探针、工具或试剂可用于将样品中的细菌分类为一种或多种革兰氏阳性细菌或一种或多种革兰氏阴性细菌。
例如，在一些实施方案中，一种或多种细菌可以基于上述SNP中的任何一种，特别是在SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和653中的至少一个位置上的SNP被分类为革兰氏阳性。在一个这样的实施方案中，可以基于与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置273和653相对应的位置上的SNP来分类一种或多种细菌，其中当位置273处有A并且位置653处有T时，确定所述一种或多种细菌为革兰氏阳性。
例如，在另一个实施方案中，一种或多种细菌可以基于在与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置440相对应的位置上的至少一个SNP被分类为革兰氏阳性，其中当位置440处存在T时，所述一种或多种细菌被确定为革兰氏阳性。相反，当位置440处没有T时，一种或多种细菌被确定为革兰氏阴性。
在其他实施方案中，至少一个SNP或至少一种探针、工具或试剂可用于分类样品中的细菌、酵母生物或丝状真菌的组。
例如，在一些实施方案中，可基于选自上述SNP的至少一个SNP将细菌分类为属于特定属。在一个这样的实施方案中，可以基于选自与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置412和647相对应的位置上的SNP的至少一个SNP将细菌分类为属于特定属。例如，当位置412处有T时，样品中的一种或多种细菌可以分类为属于葡萄球菌属。例如，当位置647处有G时，样品中的一种或多种细菌可以分类为属于肠球菌属。
在其他实施方案中，如上所述，至少一个SNP或至少一种探针、工具或试剂可用于鉴定样品中的细菌。
例如，可以基于与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置653相对应的位置上的至少一个SNP，在样品中鉴定出阴沟肠杆菌，其中当在位置653处有G时，鉴定出阴沟肠杆菌。
例如，可以基于与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置378和488相对应的位置上的SNP，在样品中鉴定出选自肺炎链球菌、无乳链球菌和化脓性链球菌的细菌，其中：在位置378上有A并且在位置488上有T时，所述细菌是肺炎链球菌；在位置378上有A并且在位置488上有A时，所述细菌是无乳链球菌；和在位置378上有G并且在位置488上有A时，所述细菌是化脓性链球菌。
例如，在一个实施方案中，可以基于与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和653相对应的位置上的SNP，在样品中鉴定出选自乙酸钙不动杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌的细菌，其中：当在位置273、440和647上有A时，所述细菌是乙酸钙不动杆菌；当在位置653上有G时，所述细菌是阴沟肠杆菌；当在位置273上有T并且在位置653上有T时，所述细菌是大肠杆菌；当在位置273上有T，在位置488和647上有C并且在位置653上有A时，所述细菌是肺炎克雷伯菌；当在位置440和488上有C并且在位置647上有T时，所述细菌是奇异变形杆菌；当在位置440上有A并且在位置647上有T时，所述细菌是铜绿假单胞菌；当在位置378、488和647上有A时，所述细菌是无乳链球菌；当在位置488和647上有T时，所述细菌是肺炎链球菌；和在位置378上有G并且在位置488和647上有A时，所述细菌是化脓性链球菌。
例如，在另一个实施方案中，可以基于下表中列出的SNP的存在，在样品中鉴定出选自乙酸钙不动杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌的细菌：
表1
Figure BDA0002369320530000201
Figure BDA0002369320530000211
例如，在另一个实施方案中，可以基于下表中列出的SNP的存在，在样品中鉴定出选自大肠杆菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、乙酸钙不动杆菌、粪肠球菌、单核细胞增多性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、杰氏棒杆菌、脆弱拟杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、粘质沙雷氏菌、沙门氏菌和表皮葡萄球菌的细菌：
表2
Figure BDA0002369320530000212
在另一个实施方案中，可以基于与SEQ ID NO:43所示的16S rRNA基因的位置746、764、771或785相对应的位置上的SNP，在样品中鉴定出选自炭疽芽孢杆菌、A型肉毒梭菌、B型肉毒梭菌、C型肉毒梭菌、D型肉毒梭菌、G型肉毒梭菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉弗朗西斯菌、霍乱弧菌和类鼻疽伯克氏菌的细菌，其中：当在位置746上有T，在位置764上有A，在位置771上有C并且在位置785上有G时，所述细菌是炭疽芽孢杆菌；当在位置746上有T，在位置764上有G，在位置771上有C并且在位置785上有T时，所述细菌是A型肉毒梭菌；当在位置746上有T，在位置764上有A，在位置771上有T并且在位置785上有T时，所述细菌是C型肉毒梭菌；当在位置746上有C，在位置764上有A，在位置771上有T并且在位置785上有T时，所述细菌是D型肉毒梭菌；当在位置746上有T，在位置764上有G，在位置771上有C并且在位置785上有G时，所述细菌是G型肉毒梭菌；当在位置746上有C，在位置764上有G，在位置771上有T并且在位置785上有G时，所述细菌是鼠疫耶尔森氏菌；当在位置746上有T，在位置764上有A，在位置771上有G并且在位置785上有G时，所述细菌是土拉弗朗西斯菌；当在位置746上有C，在位置764上有A，在位置771上有T并且在位置785上有G时，所述细菌是霍乱弧菌；和当在位置746上有C，在位置764上有G，在位置771上有C并且在位置785上有G时，所述细菌是类鼻疽伯克氏菌。
例如，在另一个实施方案中，可以基于下表中列出的SNP的存在，在样品中鉴定出选自炭疽芽孢杆菌、A型肉毒梭菌、B型肉毒梭菌、C型肉毒梭菌、D型肉毒梭菌、G型肉毒梭菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉弗朗西斯菌、霍乱弧菌和类鼻疽伯克氏菌的细菌：
表3
Figure BDA0002369320530000221
Figure BDA0002369320530000231
用于鉴定上述生物体的四个SNP的累积判别指数为：对于1个SNP，为0.667；对于2个SNP，为0.889；对于3个SNP，为0.944；和对于4个SNP，为0.972。
SEQ ID NO:43所示的16S rRNA基因的位置746对应于SEQ ID NO:1所示的16SrRNA基因的位置737。SEQ ID NO:43所示的16S rRNA基因的位置764对应于SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置755。SEQ ID NO:43所示的16S rRNA基因的位置771对应于SEQ IDNO:1所示的16S rRNA基因的位置762。SEQ ID NO:43所示的16S rRNA基因的位置785对应于SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置776。
因此，在另一个实施方案中，可以基于与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置737、755、762或776相对应的位置上的SNP，在样品中鉴定出选自炭疽芽孢杆菌、A型肉毒梭菌、B型肉毒梭菌、C型肉毒梭菌、D型肉毒梭菌、G型肉毒梭菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉弗朗西斯菌、霍乱弧菌和类鼻疽伯克氏菌的细菌，其中：当在位置737上有T，在位置755上有A，在位置762上有C并且在位置776上有G时，所述细菌是炭疽芽孢杆菌；当在位置737上有T，在位置755上有G，在位置762上有C并且在位置776上有T时，所述细菌是A型肉毒梭菌；当在位置737上有T，在位置755上有A，在位置762上有T并且在位置776上有T时，所述细菌是C型肉毒梭菌；当在位置737上有C，在位置755上有A，在位置762上有T并且在位置776上有T时，所述细菌是D型肉毒梭菌；当在位置737上有T，在位置755上有G，在位置762上有C并且在位置776上有G时，所述细菌是G型肉毒梭菌；当在位置737上有C，在位置755上有G，在位置762上有T并且在位置776上有G时，所述细菌是鼠疫耶尔森氏菌；当在位置737上有T，在位置755上有A，在位置762上有G并且在位置776上有G时，所述细菌是土拉弗朗西斯菌；当在位置737上有C，在位置755上有A，在位置762上有T并且在位置776上有G时，所述细菌是霍乱弧菌；和当在位置737上有C，在位置755上有G，在位置762上有C并且在位置776上有G时，所述细菌是类鼻疽伯克氏菌。
在另一个实施方案中，可以基于与SEQ ID NO:37所示的18S rRNA基因的位置343、371、388、416和467相对应的位置上的SNP，在样品中鉴定出选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、镰刀菌属、烟曲霉和新型隐球菌的酵母生物或丝状真菌，其中：当在位置343上有C，在位置371上有A，在位置388上有T，在位置416上有G并且在位置467上有G时，所述酵母生物或丝状真菌是白色念珠菌；当在位置343上有C，在位置371上有A，在位置388上有C，在位置416上有G并且在位置467上有C时，所述酵母生物或丝状真菌是热带念珠菌；当在位置343上有C，在位置371上有A，在位置388上有C，在位置416上有G并且在位置467上有G时，所述酵母生物或丝状真菌是近平滑念珠菌；当在位置343上有T，在位置371上有A，在位置388上有C，在位置416上有G并且在位置467上有G时，所述酵母生物或丝状真菌是光滑念珠菌；当在位置343上有C，在位置371上有C，在位置388上有T，在位置416上有T并且在位置467上有G时，所述酵母生物或丝状真菌是镰刀菌属；当在位置343上有C，在位置371上有C，在位置388上有T，在位置416上有C并且在位置467上有G时，所述酵母生物或丝状真菌是烟曲霉；和当在位置343上有C，在位置371上有A，在位置388上有T，在位置416上有T并且在位置467上有G时，所述酵母生物或丝状真菌是新型隐球菌。
例如，在另一个实施方案中，可以基于下表中列出的SNP的存在，在样品中鉴定出选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、镰刀菌属、烟曲霉和新型隐球菌的酵母生物或丝状真菌：
表4
Figure BDA0002369320530000241
Figure BDA0002369320530000251
可基于上述SNP中的一者或多者部分鉴定或分类细菌、酵母生物或丝状真菌。
在一个实施方案中，在本发明的方法中(特别是在第一和第二方面中)在分析之前从样品中提取核酸。在另一个实施方案中，方法中(特别是在第一和第二方面中)的分析步骤可以包括核酸的扩增。可以通过本领域已知的任何方法使用一种或多种将扩增转录的RNA的寡核苷酸/引物扩增核酸，所述方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。
可以通过本领域已知的任何方法来分析SNP，所述方法包括但不限于：高分辨率熔解分析、5'核酸酶消化(包括5'核酸酶消化)、分子信标、寡核苷酸连接、微阵列、限制性片段长度多态性、抗体检测方法、直接测序或其任何组合。在一个实施方案中，方法中(特别是在本发明的第一和第二方面中)的分析步骤包括使用高分辨率熔解分析、5'核酸酶消化、分子信标、寡核苷酸连接、微阵列、限制性片段长度多态性、抗体检测方法、直接测序或其任何组合来确定所述至少一个SNP的存在或不存在。可以通过本领域已知的任何方法来检测SNP，所述方法包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)；连接酶链式反应(LCR)；杂交分析；高分辨率熔解分析；用核酸酶消化，包括5'核酸酶消化；分子信标寡核苷酸连接；微阵列；限制性片段长度多态性；抗体检测方法；直接测序；或其任何组合。
例如，在一些实施方案中，细菌的鉴定或细菌的分类可以进一步基于大体上如上所述的SNP及其周围的DNA序列的DNA熔解特性，优选高分辨率熔解分析。
例如，在一些这样的实施方案中，本发明的方法可以进一步包括高分辨率熔解(HRM)分析，以进一步分析大体上如上所述的SNP及其周围的DNA序列的DNA熔解特性。在一个特定的实施方案中，HRM分析可包括形成含有至少一个SNP和至少一种嵌入荧光染料的DNA扩增产物(即，扩增子)，并通过其熔解温度(Tm)加热DNA扩增产物。使用掺入DNA扩增产物中的荧光染料实时监测HRM。随着温度的升高监测荧光水平，其中随着双链DNA数量的减少，荧光也减少。可以将荧光和温度的变化绘制在称为熔解曲线的图表中。
如本领域技术人员将理解的那样，取决于形成DNA扩增产物的核苷酸碱基的序列，两条DNA链分离的DNA扩增产物的Tm是可预测的。因此，由于熔解曲线看起来不同，所以可以区分DNA扩增产物，包括含有多态性(即，一个或多个SNP)的DNA扩增产物。实际上，在一些实施方案中，可以基于周围DNA序列的差异来区分含有相同多态性的DNA扩增产物。
例如，可以基于下表中列出的SNP的存在和SNP及其周围的DNA序列的DNA熔解特性，在样品中鉴定出选自乙酸钙不动杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌的细菌：
表5
Figure BDA0002369320530000261
Figure BDA0002369320530000271
例如，可以基于表2中列出的SNP的存在和SNP及其周围的DNA序列的DNA熔解特性，在样品中鉴定出选自大肠杆菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、乙酸钙不动杆菌、粪肠球菌、单核细胞增多性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、杰氏棒杆菌、脆弱拟杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、粘质沙雷氏菌、沙门氏菌、表皮葡萄球菌的细菌。
在一个实施方案中，可以基于与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和653相对应的位置上的SNP和SNP及其周围DNA的高分辨率熔解曲线分析，在样品中鉴定出选自乙酸钙不动杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌的细菌。
例如，可以基于如上所述的SNP位置和/或SNP及其周围DNA的高分辨率熔解曲线分析，在样品中鉴定出选自乙酸钙不动杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌的细菌。
在一些实施方案中，可以基于与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置412、440、488和647相对应的位置上的SNP，在样品中单独鉴定出选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、粘质沙雷氏菌和产气肠杆菌的细菌，其中：当在位置412上有T时，可以鉴定出金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，然后基于在位置412上的SNP周围的DNA的高分辨率熔解曲线分析，将它们进一步彼此区分开；当在位置647上有G时，可以鉴定出粪肠球菌和屎肠球菌，然后基于在位置647上的SNP周围的DNA的高分辨率熔解曲线分析，将它们进一步彼此区分开；当在位置440和647上有C并且在位置488上有T时，可以鉴定出粘质沙雷氏菌和产气肠杆菌，然后基于在位置440、488和647中的任一个位置上的SNP周围的DNA的高分辨率熔解曲线分析，将它们进一步彼此区分开。
在其他实施方案中，可以基于与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置378相对应的位置上的至少一个SNP和位置378上的SNP周围的DNA的高分辨率熔解曲线分析，在样品中鉴定出选自粪肠球菌、屎肠球菌、无乳链球菌和化脓性链球菌的细菌。
例如，可以基于下表中列出的SNP的存在和SNP及其周围DNA序列的DNA熔解特性，在样品中鉴定出选自炭疽芽孢杆菌、A型肉毒梭菌、B型肉毒梭菌、C型肉毒梭菌、D型肉毒梭菌、G型肉毒梭菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉弗朗西斯菌、霍乱弧菌和类鼻疽伯克氏菌的细菌：
表6
Figure BDA0002369320530000281
如上所述，SEQ ID NO:43所示的16S rRNA基因的位置746对应于SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置737。SEQ ID NO:43所示的16S rRNA基因的位置764对应于SEQ IDNO:1所示的16S rRNA基因的位置755。SEQ ID NO:43所示的16S rRNA基因的位置771对应于SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置762。SEQ ID NO:43所示的16S rRNA基因的位置785对应于SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置776。
在一个实施方案中，可以基于与SEQ ID NO:43所示的16S rRNA基因的位置746、764、771或785(或SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置737、755、762或776)相对应的位置上的SNP，和SNP及其周围DNA的高分辨率熔解曲线分析，在样品中鉴定出选自炭疽芽孢杆菌、A型肉毒梭菌、B型肉毒梭菌、C型肉毒梭菌、D型肉毒梭菌、G型肉毒梭菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉弗朗西斯菌、霍乱弧菌和类鼻疽伯克氏菌的细菌。
例如，可以基于如上所述的SNP位置和/或SNP及其周围DNA的高分辨率熔解曲线分析，在样品中鉴定出选自炭疽芽孢杆菌、A型肉毒梭菌、B型肉毒梭菌、C型肉毒梭菌、D型肉毒梭菌、G型肉毒梭菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉弗朗西斯菌、霍乱弧菌和类鼻疽伯克氏菌的细菌。
在另一个实施例中，可以基于下表中列出的SNP的存在和SNP及其周围DNA序列的DNA熔解特性，在样品中鉴定出选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、镰刀菌属、烟曲霉和新型隐球菌的酵母生物或丝状真菌：
表7
Figure BDA0002369320530000291
在一个实施方案中，可以基于与SEQ ID NO:37所示的18S rRNA基因的位置343、371、388、416和467相对应的位置上的SNP，和SNP及其周围DNA的高分辨率熔解曲线分析，在样品中鉴定出选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、镰刀菌属、烟曲霉和新型隐球菌的酵母生物或丝状真菌。
例如，可以基于如上所述的SNP位置和/或SNP及其周围DNA的高分辨率熔解曲线分析，在样品中鉴定出选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、镰刀菌属、烟曲霉和新型隐球菌的酵母生物或丝状真菌。
在一些实施方案中，可以在分析、鉴定、分类和/或诊断之前从样品中提取核酸。通常，分析、鉴定、分类和/或诊断可以包括核酸的扩增。在一些实施方案中，分析、鉴定、分类和/或诊断可以进一步包括向受试者施用治疗剂，例如抗生素。在另一个实施方案中，治疗方法(例如，在本发明的第三方面中)可以进一步包括确定至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌是否对治疗剂具有抗性的步骤。
在一个实施方案中，任何合适的样品都可以用于本发明的方法中。示例性样品可以包括痰、唾液、血液、脑脊髓液或尿液样品。
探针、工具或试剂可以是但不限于寡核苷酸、引物、核酸、多核苷酸、DNA、cDNA、RNA、肽或多肽。这些可以是例如单链或双链、天然存在的、分离的、纯化的、化学修饰的、重组的或合成的。
探针、工具或试剂可以是但不限于能够特异性结合、检测或鉴定样品中的含有至少一个SNP的至少一部分16S rRNA基因或18S rRNA基因的抗体或其他类型的分子或化学实体。
探针、工具或试剂可以是上述的任何数量或组合，并且所述数量和组合将取决于要实现的期望结果-例如，在基因组水平(基因分型)或RNA转录水平上检测SNP。
探针、工具或试剂可以被分离。探针、工具或试剂可以被可检测地标记。可检测的标记可以被包括在扩增反应中。合适的标记包括荧光染料，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、得克萨斯红、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、6-羧基荧光素(6-FAM)、2’,7’-二甲氧基-4',5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或N,N,N',N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；放射性标记，例如32P、35S、3H等。标记可以是两阶段系统，其中扩增的DNA缀合至具有高亲和力结合伴侣(例如亲和素)、特异性抗体等的生物素、半抗原等，其中结合伴侣与可检测的标记缀合。标记可以与引物之一或两者缀合。或者，标记扩增中使用的核苷酸的汇集物，以将标记掺入扩增产物中。
在特定的实施方案中，至少一种探针、工具或试剂用于在基因组水平或转录水平(优选前者)上特异性结合、检测或鉴定SNP。
在优选的实施方案中，至少一种探针、工具或试剂用于特异性结合、检测或鉴定样品中的含有表1至表7之一所列出的至少一个SNP的至少一部分16S rRNA或18S rRNA基因或基因产物。
在鉴定、部分鉴定、分类细菌、酵母生物或丝状真菌或鉴定、部分鉴定或诊断细菌、酵母生物或丝状真菌感染时，每个样品可以使用单个探针(特别是引物)，或者每个样品也可以使用多个探针(特别是引物)(即放在一个锅中)。可以将这些探针(特别是引物)添加到从扩增(例如PCR)获得的原始溶液中。
在一个实施方案中，至少一种探针、工具或试剂可包含两种引物，其各自与含有如上定义的SNP的至少一部分细菌16S rRNA基因(或基因产物)或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因(或基因产物)杂交。在另一个实施方案中，至少一种探针、工具或试剂可包含探针，其与含有如上定义的SNP的至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物杂交。
在一个实施方案中，所述至少一种探针、工具或试剂包含寡核苷酸，其具有(或包含或由其组成)与SEQ ID No 16-35和53-57中的至少一者所示的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同源性或同一性的核苷酸序列。所述探针、工具或试剂可以是引物。所述探针、工具或试剂可包含具有SEQ ID NO:16-35和53-57中的至少一者所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
在一方面，本发明提供了至少一种分离探针、工具或试剂，其中所述至少一种分离探针、工具或试剂包含寡核苷酸，其具有(或包含或由其组成)与SEQ ID No 16-35和53-57中的至少一者所示的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同源性或同一性的核苷酸序列。所述探针、工具或试剂可以是引物。
用于鉴定SEQ ID NO.43所示的16S rRNA序列中的SNP(特别是用于鉴定表3中的SNP)的合适引物可以如下表所示。
表8
Figure BDA0002369320530000321
用于鉴定SEQ ID NO.37所示的18S rRNA序列中的SNP(特别是用于鉴定表4中的SNP)的合适引物可以如下表所示。
表9
Figure BDA0002369320530000322
在本发明的范围内，本文描述的任何特征可以与本文描述的其他特征中的任何一个或多个以任何组合进行组合。
上文主要讨论了16S rRNA和18S rRNA基因的使用。但是，上文也可能适用于16SrRNA和18S rRNA以及其他16S rRNA和18S rRNA基因产物。因此，在一些实施方案中(和在适当的情况下)，可以用16S rRNA基因产物(或16S rRNA)和18S rRNA基因产物(或18S rRNA)代替上文和下文提到的16S rRNA基因和18S rRNA基因。
本说明书中对任何现有技术的引用不是，也不应该被认为是对现有技术形成公知常识的一部分的承认或任何形式的暗示。
附图说明
将参考以下附图描述本发明的各种实施方案，其中：
图1是来自以下细菌种类的编码16S rRNA分子的代表性基因的CLUSTALW序列比对：乙酸钙不动杆菌；产气肠杆菌；阴沟肠杆菌；粪肠球菌；屎肠球菌；大肠杆菌；肺炎克雷伯菌；奇异变形杆菌；铜绿假单胞菌；粘质沙雷氏菌；金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌；无乳链球菌；肺炎链球菌；和化脓性链球菌。去除了由CLUSTALW比对确定的可变序列。在与来自大肠杆菌的如SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和653相对应的位置上的SNP在比对序列中与相应的核苷酸一起突出显示。
图2显示了实施例1中测试的以下15种细菌种类的归一化高分辨率熔解(HRM)曲线图：乙酸钙不动杆菌；产气肠杆菌；阴沟肠杆菌；粪肠球菌；屎肠球菌；大肠杆菌；肺炎克雷伯菌；奇异变形杆菌；铜绿假单胞菌；粘质沙雷氏菌；金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌；无乳链球菌；肺炎链球菌；和化脓性链球菌。
图3显示了图2中所示的15种细菌种类的不同HRM曲线图，其中以大肠杆菌为基准。
图4显示了关于在与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置412相对应的位置上含有SNP的扩增子，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的归一化HRM曲线图。
图5显示了如图4所示的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的差异HRM曲线图，其中以金黄色葡萄球菌为基准。
图6显示了关于在与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置378相对应的位置上含有SNP的扩增子，粪肠球菌、屎肠球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌的归一化HRM曲线图。
图7显示了如图6所示的粪肠球菌、屎肠球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌的差异HRM曲线图，其中以粪肠球菌为基准。
图8显示了关于在与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置412相对应的位置上含有SNP的扩增子，大肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、乙酸钙不动杆菌、产气肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌的归一化HRM曲线图。
图9显示了如图8所示的大肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、乙酸钙不动杆菌、产气肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌的差异HRM曲线图，其中以大肠杆菌为基准。
图10显示了关于在与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置378相对应的位置上含有SNP的扩增子，无乳链球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌的归一化HRM曲线图。
图11显示了如图10所示的无乳链球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌的差异HRM曲线图，其中以肺炎链球菌为基准。
图12显示了关于在与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置412相对应的位置上含有SNP的扩增子，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌和粘质沙雷氏菌的归一化HRM曲线图。
图13显示了关于在与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置412相对应的位置上含有SNP的扩增子，肺炎链球菌、无乳链球菌和化脓性链球菌的归一化HRM曲线图。
序列表说明
SEQ ID NO:1：大肠杆菌16S rRNA基因(Genbank登录号NR_102804.1)；
SEQ ID NO:2：金黄色葡萄球菌16S rRNA基因(Genbank登录号NR_075000.1)；
SEQ ID NO:3：表皮葡萄球菌16S rRNA基因(Genbank登录号NR_074995.1)；
SEQ ID NO:4：肺炎链球菌16S rRNA基因(Genbank登录号NR_074564.1)；
SEQ ID NO:5：无乳链球菌16S rRNA基因(Genbank登录号NR_040821.1)；
SEQ ID NO:6：化脓性链球菌16S rRNA基因(Genbank登录号NR_074091.1)；
SEQ ID NO:7：粪肠球菌16S rRNA基因(Genbank登录号NR_074637.1)；
SEQ ID NO:8：屎肠球菌16S rRNA基因(Genbank登录号NR_042054.1)；
SEQ ID NO:9：奇异变形杆菌16S rRNA基因(Genbank登录号NR_074898.1)；
SEQ ID NO:10：粘质沙雷氏菌16S rRNA基因(Genbank登录号NR_041980.1)；
SEQ ID NO:11：产气肠杆菌16S rRNA基因(Genbank登录号NR_024643.1)；
SEQ ID NO:12：阴沟肠杆菌16S rRNA基因(Genbank登录号NR_028912.1)；
SEQ ID NO:13：肺炎克雷伯氏菌16S rRNA基因(Genbank登录号NR_036794.1)；
SEQ ID NO:14：铜绿假单胞菌16S rRNA基因(Genbank登录号NR_074828.1)；
SEQ ID NO:15：乙酸钙不动杆菌16S rRNA基因(Genbank登录号AB302132.1)；
SEQ ID NO:16：正向引物(CCTCTTGCCATCGGATGTG)；
SEQ ID NO:17：反向引物(CCAGTGTGGCTGGTCATCCT)；
SEQ ID NO:18：正向引物(GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT)；
SEQ ID NO:19：正向引物(CCTACGGGAGGCAGCAGTAG)；
SEQ ID NO:20：反向引物(CGATCCGAAAACCTTCTTCACT)；
SEQ ID NO:21：正向引物(AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA)；
SEQ ID NO:22：反向引物(CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA)；
SEQ ID NO:23：正向引物(TGCCGCGTGAATGAAGAA)；
SEQ ID NO:24：正向引物(GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA)；
SEQ ID NO:25：正向引物(TGATGAAGGTTTTCGGATCGT)；
SEQ ID NO:26：反向引物(TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT)；
SEQ ID NO:27：反向引物(CCAGTGTGGCTGGTCATCCT)；
SEQ ID NO:28：反向引物(CGCTCGCCACCTACGTATTAC)；
SEQ ID NO:29：正向引物(GTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGT)；
SEQ ID NO:30：反向引物(CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG)；
SEQ ID NO:31：正向引物(GCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAA)；
SEQ ID NO:32：正向引物(GGTCTGTCAAGTCGGATGTGAA)；
SEQ ID NO:33：正向引物(TCAACCTGGGAACTCATTCGA)；
SEQ ID NO:34：反向引物(GGAATTCTACCCCCCTCTACGA)；
SEQ ID NO:35：反向引物(GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG)；
SEQ ID NO:36：烟曲霉菌株MJ-X6 18S核糖体RNA基因，完整序列(GenBank登录号HM590663.1)；
SEQ ID NO:37：白色念珠菌18S核糖体RNA基因，完整序列(GenBank登录号AF114470.1)；
SEQ ID NO:38：光滑念珠菌菌株SZ2 18S核糖体RNA基因，部分序列(GenBank登录号KT229542.1)；
SEQ ID NO:39：近平滑念珠菌18S核糖体RNA基因，部分序列(GenBank登录号DQ218328.1)；
SEQ ID NO:40：热带念珠菌18S核糖体RNA基因，部分序列(GenBank登录号AH009771.2)；
SEQ ID NO:41：新型隐球菌格鲁比变种(Cryptococcus neoformans var.grubii)H99 18S核糖体RNA rRNA(GenBank登录/NCBI参考序列：XR_001045463.1)；
SEQ ID NO:42：镰刀菌属菌株Z10 18S核糖体RNA基因，部分序列(GenBank登录号MF973465.1)；
SEQ ID NO:43：炭疽芽孢杆菌菌株2000031664 16S核糖体RNA基因，部分序列(GenBank登录号AY138383.1)；
SEQ ID NO:44：类鼻疽伯克氏菌16S rRNA基因(GenBank登录号AJ131790.1)；
SEQ ID NO:45：用于16S RNA的肉毒梭菌A型rrn基因(GenBank登录号X68185.1)；
SEQ ID NO:46：用于16S RNA的肉毒梭菌B型rrn基因(GenBank登录号X68186.1)；
SEQ ID NO:47：用于16S rRNA的肉毒梭菌C型rrn基因(GenBank登录号X68315.1)；
SEQ ID NO:48：用于16S RNA的肉毒梭菌D型rrn基因(GenBank登录号X68187.1)；
SEQ ID NO:49：用于16S rRNA的肉毒梭菌G型rrn基因(GenBank登录号X68317.1)；
SEQ ID NO:50：土拉弗朗西斯菌菌株B-38 16S核糖体RNA，部分序列(GenBank登录/NCBI参考序列：NR_029362.1)；
SEQ ID NO:51：霍乱弧菌菌株DL2 16S核糖体RNA基因，部分序列(GenBank登录号MG062858.1)；
SEQ ID NO:52：鼠疫耶尔森氏菌16S rRNA基因，分离物：SS-Yp-116(GenBank登录号AJ232238.1)；
SEQ ID NO:53：正向引物(CATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCG)；
SEQ ID NO:54：反向引物(GTTCAACTACGAGCTTTTTAAC)；
SEQ ID NO:55：反向引物(GTTCGACTACGAGCTTTTTAAC)；
SEQ ID NO:56：正向引物(GTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG)；
SEQ ID NO:57：反向引物(TCGTTTACCGTGGACTACCAGGG)。
具体实施方式
1.定义
除非另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解的含义相同。虽然与本文中所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明实践或测试中，但是描述了优选方法和材料。为了本发明的目的，以下术语定义如下。
冠词“一”和“一个/种”在本文中用于指代所述冠词的语法对象中的一个/种或多个/种(即，至少一个/种)。举例来说，“一元件”是指一个/种元件或多个/种元件。
“扩增产物”或“扩增子”是指通过核酸扩增技术产生的核酸产物。
如本文所用，术语“生物样品”是指来自患者或受试者的可以被提取、未经处理、经处理、稀释或浓缩的样品。适当地，生物样品选自患者或受试者身体的任何部分，包括但不限于头发、皮肤、指甲、组织或体液，例如痰、唾液、脑脊液、尿液和血液。
在本说明书和权利要求书(如果有的话)中，单词“包含(comprising)”及其派生词(包括“包含(comprises)”和“包含(comprise)”)包括每个所述整数，但是不排除包括一个或多个其他整数。
如本文所用，“对应的”核酸位置或核苷酸是指在两个或更多个核酸分子的比对基因座处出现的位置或核苷酸。相关的或变异的多核苷酸可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行比对。这些方法通常使匹配最大化，并且包括诸如使用手动比对以及通过使用大量可用的比对程序(例如，BLASTN)的方法，和本领域技术人员已知的其他方法。通过比对多核苷酸的序列，本领域技术人员可以使用相同的核苷酸作为指导来鉴定相应的核苷酸或位置。例如，通过比对编码大肠杆菌16S rRNA(在SEQ ID NO:1所示)的基因的序列与编码来自另一种类的16S rRNA的基因，本领域技术人员可以使用保守的核苷酸作为指导来鉴定相应的位置和核苷酸。
“基因”是指遗传单位，其占据基因组上的特定基因座并且由转录和/或翻译调控序列和/或编码区和/或非翻译序列(即内含子，5'和3'非翻译序列)组成。
“基因产物”是指基因的产物。例如，16S rRNA基因的基因产物包括16S rRNA。类似地，18S rRNA基因的基因产物包括18S rRNA。基因产物还包括例如衍生自rRNA序列的cDNA序列。基因产物还可以包括rRNA的产物，其中rRNA基因中的SNP将导致产物的相应变化。
“同源性”是指相同或构成保守取代的核酸或氨基酸的百分比。同源性可以使用序列比较程序如GAP(Deveraux等人1984)来确定，其通过引用并入本文。以这种方式，可以通过将空位插入比对中来比较与本文引用的那些序列相似或基本不同长度的序列，此类空位例如通过由GAP所使用的比较算法来确定。
本文使用“杂交”来表示互补核苷酸序列的配对以产生DNA-DNA杂合体或DNA-RNA杂合体。在DNA中，A与T配对，C与G配对。在RNA中，U与A配对，C与G配对。就这一点而言，本文使用的术语“匹配”和“错配”是指互补核酸链中的成对核苷酸的杂交潜力(hybridizationpotential)。匹配的核苷酸可以高效杂交，例如上述经典的A-T和G-C碱基对。错配是不能有效杂交的核苷酸的其他组合。核苷酸符号在下表中列出：
表10-核苷酸符号
Figure BDA0002369320530000391
“分离的”是指材料大体上或基本上不含在其天然状态下通常伴随其的组分。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指由通过磷酸二酯键(或其相关结构变体或合成类似物)连接的多个核苷酸残基(脱氧核苷酸或核糖核苷酸，或其相关结构变体或合成类似物)构成的聚合物。因此，尽管术语“寡核苷酸”通常是指其中核苷酸残基和它们之间的键是天然存在的核苷酸聚合物，但是应该理解，所述术语在其范围内还包括各种类似物，包括但不限于肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核酸等。分子的确切大小可以根据特定应用而变化。寡核苷酸通常长度相当短，通常约10至30个核苷酸残基，但是所述术语可以指任何长度的分子，尽管术语“多核苷酸”或“核酸”通常用于大型寡核苷酸。
术语“患者”和“受试者”可互换使用，是指人类或其他哺乳动物的患者和受试者，并且包括使用本发明的方法进行检查或治疗的任何个体。但是，应当理解，“患者”并不意味着存在症状。落入本发明范围内的合适的哺乳动物包括但不限于灵长类动物、家畜(例如绵羊、牛、马、驴、猪)、实验室测试动物(例如兔子、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(例如猫、狗)和圈养的野生动物(例如考拉、熊、野猫、野狗、狼、澳洲野狗、狐狸等)。
如本文所用，术语“多态性”是指与另一个个体的同源区域中的核苷酸或氨基酸序列相比，给定区域的核苷酸或氨基酸序列的差异，特别是在同一物种的个体之间不同的给定区域的核苷酸或氨基酸序列的差异。通常相对于参考序列定义多态性。多态性包括单核苷酸差异、多于一个核苷酸的差异以及单个或多个核苷酸插入、倒置和缺失；以及单个氨基酸差异、多于一个氨基酸的序列的差异以及单个或多个氨基酸插入、倒置和缺失。“多态性位点”是发生变异的基因座。应当理解的是，在核酸序列中存在多态性并且提到在多态性位点处存在一个或多个特定碱基的情况下，本发明涵盖互补链上的所述位点处的一个或多个互补碱基。
本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”表示mRNA、RNA、rRNA、cRNA、cDNA或DNA。所述术语通常是指长度大于30个核苷酸残基的寡核苷酸。
“引物”是指寡核苷酸，当和RNA链配对时，所述寡核苷酸能够在合适聚合剂的存在下引发引物延伸产物的合成。为了获得最大扩增效率，引物优选地是单链的，但是也可以是双链的。引物必须足够长，以在聚合剂存在下引发延伸产物的合成。引物长度取决于许多因素，包括应用、待使用的温度、模板反应条件、其他试剂和引物来源。举例来说，取决于靶序列的复杂度，寡核苷酸引物典型地含有15到35个或更多个核苷酸残基，虽然其也可含有更少的核苷酸残基。引物可以是大型多核苷酸，例如从约200个核苷酸到几千碱基或更多。可以选择与其设计杂交的模板上的序列“基本上互补”的引物，并将其用作起始合成的位点。“基本上互补”是指引物足够互补以与靶多核苷酸杂交。在一些实施方案中，引物与其设计杂交的模板不含有错配，但这不是必需的。例如，可以将非互补核苷酸残基连接到引物的5'末端，而引物序列的其余部分与模板互补。或者，可以将非互补核苷酸残基或一段非互补核苷酸残基散布到引物中，条件是引物序列与模板序列具有足够的互补性以与其杂交并由此形成用于合成引物的延伸产物的模板。
“探针”是指与另一分子的特异性序列或子序列或其他部分结合的分子。除非另有说明，否则术语“探针”通常是指通过互补碱基配对与另一种多核苷酸(通常称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。探针可以结合与探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸，这取决于杂交条件的严格性。探针可以被直接或间接标记。
术语“败血症”根据其在临床医学中的正常含义在本文中使用，并且包括例如全身性和/或血源性感染，例如细菌感染。
术语“败血症相关细菌”是指已被鉴定为能够在受试者中引起败血症或已在患有败血症的受试者的血液中被鉴定的细菌。因此，“哺乳动物(例如，人类)败血症相关细菌”是指已经被鉴定为能够在哺乳动物(例如，人类)受试者中引起败血症或者已经在患有败血症的哺乳动物(例如，人类)受试者的血液中被鉴定的细菌。哺乳动物(例如人)败血症相关细菌的实例包括鲍曼不动杆菌、人放线杆菌(Actinobacillus hominis)、马赛放线菌(Actinomyces massiliensis)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、炭疽芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、瓦氏心杆菌(Cardiobacterium valvarum)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、流产嗜衣原体(Chlamydophila abortus)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、弗氏柠檬酸杆菌、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌、白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、杰氏棒杆菌、解脲棒状杆菌(Corynebacterium urealyticum)、刚果嗜皮菌(Dermatophilus congolensis)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大肠杆菌、德氏真杆菌(Eubacterium desmolans)、西氏黄杆菌(Flavobacterium ceti)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌(Haemophilusparahaemolyticus)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、肠乳杆菌(Lactobacillus intestinalis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、单核细胞增多性李斯特菌、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、克氏动弯杆菌(Mobiluncus curtisii)、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)、星形诺卡菌(Nocardia asteroids)、巴西诺卡菌(Nocardiabrasiliensis)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、斯托消化链球菌(Peptostreptococcus stomatis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、颊普雷沃菌(Prevotella buccae)、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)、产黑普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)、奇异变形杆菌、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、铜绿假单胞菌、马红球菌(Rhodococcus equi)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophila)、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、牛链球菌(Streptococcusbovis)、星座链球菌、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、中间链球菌(Streptococcus intermedins)、缓症链球菌、变形链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、血链球菌、远缘链球菌、环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)、索马里链霉菌(Streptomyces somaliensis)、非典型韦荣球菌(Veillonella atypica)、坏齿韦荣球菌(Veillonella denticariosi)、殊异韦荣球菌(Veillonella dispar)、小韦荣球菌(Veillonella parvula)、罗氏韦荣球菌(Veillonella rogosae)、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)和鼠疫耶尔森氏菌。
如本文所用，“败血症”被定义为具有推测或证实的感染过程的SIRS。可以使用感染原的微生物培养或分离来确定感染过程。从免疫学的角度来看，败血症可被视为对微生物或全身感染的全身反应。
本文所用的“全身性炎症反应综合征(SIRS)”是指由具有两个或更多个以下可测量的临床特征的非特异性损伤引起的临床反应；体温高于38℃或低于36℃，心率每分钟大于90次，呼吸率每分钟大于20次，白细胞计数(总白细胞)大于12,000/mm 3或小于4,000/mm3，或带状中性粒细胞百分比大于10％。从免疫学的角度看，它可被视为代表对损伤(例如大手术)或全身炎症的全身反应。因此，如本文所用，“感染阴性SIRS(inSIRS)”包括上述临床反应，但是没有可鉴定的感染过程。
如本文所用，术语“序列同一性”是指在比较窗口上，序列在核苷酸对核苷酸基础上或氨基酸对氨基酸基础上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”是如下计算：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列，确定在这两个序列中存在相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的总位置数目(即窗口大小)，和将结果乘以100以得到序列同一性百分比(序列同一性％)。
如本文所用，术语单核苷酸多态性(SNP)是指当基因组序列中的单个核苷酸(A、T、C或G)改变(例如通过取代、添加或缺失)时发生的核苷酸序列变异。SNP可以在基因组(例如原核或真核微生物的基因组)的编码区(基因)和非编码区中都存在。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指获得期望的药理和/或生理作用。就完全或部分预防感染、病状或其症状而言，所述作用可以是预防性的，和/或就感染、病状和/或归因于感染或病状的不良影响的部分或完全治愈而言，所述作用可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物(例如人)的感染或病状的任何治疗，并且包括：(a)抑制感染或病状，即阻止其发展；和(b)减轻感染或病状，即引起感染或病状的消退。
2.本发明的多态性
本发明部分地基于确定了细菌的16S rRNA基因内(以及因此16S rRNA分子内)的SNP可用于鉴定细菌的单个种类和/或基于属分类细菌或将细菌分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性。本发明还部分基于确定了18S rRNA基因内(以及18S rRNA分子内)的SNP可用于鉴定、部分鉴定或分类酵母生物或丝状真菌。
2.1使用16S rRNA中的SNP对细菌进行分类
本发明提供了基于属对细菌种类进行分类的方法，以及确定样品中细菌的革兰氏状态的方法，即确定细菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性。
如本文所证明的，与SEQ ID NO:1所示的大肠杆菌16S rRNA基因的位置273和653相对应的编码16S rRNA的基因(以及因此16S rRNA分子本身)的核苷酸位置上的多态性可用于确定样品内的一系列细菌种类的革兰氏状态，特别是包括哺乳动物(例如人)病原体(包括通过血液培养所分离的最常见的细菌种类(Karlowsky等人，2004))。
最特别地并且如图1所示，本发明提供了对选自以下的细菌种类进行分类的方法：乙酸钙不动杆菌；产气肠杆菌；阴沟肠杆菌；粪肠球菌；屎肠球菌；大肠杆菌；肺炎克雷伯菌；奇异变形杆菌；铜绿假单胞菌；粘质沙雷氏菌；金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌；无乳链球菌；肺炎链球菌；和化脓性链球菌。
例如，用于确定样品中的在以上段落中所列的细菌之一的革兰氏状态的方法包括分析来自样品的核酸中与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置273和653相对应的16SrRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)位置上的SNP，其中在位置273上的A和位置653上的T表示样品中的细菌是革兰氏阳性的。
另一种用于确定样品中的上述细菌之一的革兰氏状态的方法包括分析来自样品的核酸中与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置440相对应的16S rRNA基因(或16SrRNA或其DNA拷贝)位置上的SNP，其中在位置440上的T表示样品中的细菌是革兰氏阳性的。
用于将样品中的上述细菌中的至少一种分类为属于特定属的方法包括分析来自样品的核酸中与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置412和647相对应的16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)位置上的SNP，其中：位置412上的T表示所述细菌属于葡萄球菌属；或位置647上的G表示所述细菌属于肠球菌属。
2.2使用16S rRNA中的SNP鉴定细菌以及使用18S rRNA中的SNP鉴定酵母生物和丝状真菌
本发明还提供了鉴定样品中的细菌的方法。
如本文所证明的，与SEQ ID NO:1所示的大肠杆菌16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和653中的任一者相对应的编码16S rRNA的基因(以及因此16S rRNA分子本身)的核苷酸位置上的多态性可用于鉴定样品内的细菌，特别是包括哺乳动物(例如人)病原体(包括通过血液培养所分离的最常见的细菌种类(Karlowsky等人，2004))。
在一个实施方案中并且如图1所示，本发明提供了鉴定选自以下的细菌的方法：乙酸钙不动杆菌；产气肠杆菌；阴沟肠杆菌；粪肠球菌；屎肠球菌；大肠杆菌；肺炎克雷伯菌；奇异变形杆菌；铜绿假单胞菌；粘质沙雷氏菌；金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌；无乳链球菌；肺炎链球菌；和化脓性链球菌。
表1和/或表5列出了使用上述SNP鉴定样品内的上述细菌种类的一般规则。
从上述细菌中，可以通过分析来自样品的核酸中与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置653相对应的16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)位置上的SNP来鉴定样品中的细菌阴沟肠杆菌，其中位置653上的G表示所述细菌是阴沟肠杆菌。
从上述细菌中，可以通过分析来自样品的核酸中与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置378和488相对应的16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)位置上的SNP来鉴定样品中的选自无乳链球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌的细菌，其中：在位置378上的A和位置488上的T表示所述细菌是肺炎链球菌；在位置378和488上的A表示所述细菌是无乳链球菌；并且在位置378上的G和位置488上的A表示所述细菌是化脓性链球菌。
从上述细菌中，通过分析来自样品的核酸中与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和653相对应的16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)位置上的SNP，所述方法可以鉴定出样品中的选自乙酸钙不动杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌的细菌，其中：在位置273、440和647上的A表示所述细菌是乙酸钙不动杆菌；在位置653上的G表示所述细菌是阴沟肠杆菌；在位置273和653上的T表示所述细菌是大肠杆菌；在位置273上的T、位置488和647上的C以及在位置653上的A表示所述细菌是肺炎克雷伯菌；在位置440和488上的C和位置647上的T表示所述细菌是奇异变形杆菌；在位置440上的A和位置647上的T表示所述细菌是铜绿假单胞菌；在位置378、488和647上的A表示所述细菌是无乳链球菌；在位置488和647上的T表示所述细菌是肺炎链球菌；和在位置378上的G和位置488和647上的A表示所述细菌是化脓性链球菌。
除上述内容外，本发明的方法还可用于鉴定样品中以下细菌的存在：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、粘质沙雷氏菌和产气肠杆菌。所述方法再次包括分析来自样品的核酸中与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和653中的任一者相对应的16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)位置上的SNP，其中：在位置412上的T表示样品包括细菌金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌；在位置647上的G表示样品包括细菌粪肠球菌和/或屎肠球菌；和在位置440和647上的C以及在位置488上的T表示样品包括细菌粘质沙雷氏菌和/或产气肠杆菌。
除上述之外，本发明的方法也可用于鉴定样品中的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、粘质沙雷氏菌和产气肠杆菌中的每一种。所述方法包括使用高分辨率熔解分析进一步分析来自样品的核酸(参见下文3.8)。高分辨率熔解分析允许基于周围核苷酸碱基的变化，将来自不同细菌但包含相同SNP的核酸序列彼此区分开。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定选自以下的细菌的方法：大肠杆菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、乙酸钙不动杆菌、粪肠球菌、单核细胞增多性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、杰氏棒杆菌、脆弱拟杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、粘质沙雷氏菌、沙门氏菌和表皮葡萄球菌。表2列出了使用上述SNP鉴定样品内的上述细菌种类的一般规则。
类似地，如本文所证明的，与SEQ ID NO:43所示的炭疽芽孢杆菌16S rRNA基因的位置746、764、771或785(或SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置737、755、762或776)相对应的编码16S rRNA的基因(和因此rRNA分子本身)的核苷酸位置上的多态性可用于鉴定样品内的细菌，特别是包括哺乳动物(例如人)病原体(包括被称为安全敏感生物剂的病原体)。
在一个实施方案中，提供了用于鉴定选自以下的细菌的方法：炭疽芽孢杆菌、A型肉毒梭菌、B型肉毒梭菌、C型肉毒梭菌、D型肉毒梭菌、G型肉毒梭菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉弗朗西斯菌、霍乱弧菌和类鼻疽伯克氏菌。
表3和/或表6列出了使用上述SNP鉴定样品内的上述细菌种类的一般规则。
从上述细菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.43的16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的细菌炭疽芽孢杆菌，其中位置746上的T、位置764上的A、位置771上的C和位置785上的G表示所述细菌是炭疽芽孢杆菌。
从上述细菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.43的16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的选自A型肉毒梭菌或B型肉毒梭菌的细菌，其中位置746上的T、位置764上的G、位置771上的C和位置785上的T表示所述细菌是A型肉毒梭菌或B型肉毒梭菌。
从上述细菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.43的16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的细菌C型肉毒梭菌，其中位置746上的T、位置764上的A、位置771上的T和位置785上的T表示所述细菌是C型肉毒梭菌。
从上述细菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.43的16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的细菌D型肉毒梭菌，其中位置746上的C、位置764上的A、位置771上的T和位置785上的T表示所述细菌是D型肉毒梭菌。
从上述细菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.43的16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的细菌G型肉毒梭菌，其中位置746上的T、位置764上的G、位置771上的C和位置785上的G表示所述细菌是G型肉毒梭菌。
从上述细菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.43的16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的细菌鼠疫耶尔森氏菌，其中位置746上的C、位置764上的G、位置771上的T和位置785上的G表示所述细菌是鼠疫耶尔森氏菌。
从上述细菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.43的16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的细菌土拉弗朗西斯菌，其中位置746上的T、位置764上的A、位置771上的G和位置785上的G表示所述细菌是土拉弗朗西斯菌。
从上述细菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.43的16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的细菌霍乱弧菌，其中位置746上的C、位置764上的A、位置771上的T和位置785上的G表示所述细菌是霍乱弧菌。
从上述细菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.43的16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的细菌类鼻疽伯克氏菌，其中位置746上的C、位置764上的G、位置771上的C和位置785上的G表示所述细菌是类鼻疽伯克氏菌。
除上述之外，本发明的方法还可用于鉴定样品中的炭疽芽孢杆菌、A型肉毒梭菌、B型肉毒梭菌、C型肉毒梭菌、D型肉毒梭菌、G型肉毒梭菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉弗朗西斯菌、霍乱弧菌和类鼻疽伯克氏菌中的每一种。所述方法包括使用高分辨率熔解分析进一步分析来自样品的核酸(参见下文3.8)。
类似地，如本文所证明的，与SEQ ID NO:37所示的白色念珠菌18S rRNA基因的位置343、371、388、416和467相对应的编码18S rRNA的基因(和因此rRNA分子本身)的核苷酸位置上的多态性可用于鉴定样品内的细菌，特别是包括哺乳动物(例如人)病原体。
在一个实施方案中，提供了用于鉴定选自以下的酵母生物或丝状真菌的方法：白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、镰刀菌属、烟曲霉和新型隐球菌。
表4和/或表7列出了使用上述SNP鉴定样品内的上述细菌种类的一般规则。
从上述酵母生物或丝状真菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.37的18S rRNA基因(或18S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的酵母生物白色念珠菌，其中位置343上的C、位置371上的A、位置388上的T、位置416上的G和位置467上的G表示所述酵母生物是白色念珠菌。
从上述酵母生物或丝状真菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.37的18S rRNA基因(或18S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的酵母生物热带念珠菌，其中位置343上的C、位置371上的A、位置388上的C、位置416上的G和位置467上的C表示所述酵母生物是热带念珠菌。
从上述酵母生物或丝状真菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.37的18S rRNA基因(或18S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的酵母生物近平滑念珠菌，其中位置343上的C、位置371上的A、位置388上的C、位置416上的G和位置467上的G表示所述酵母生物是近平滑念珠菌。
从上述酵母生物或丝状真菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.37的18S rRNA基因(或18S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的酵母生物光滑念珠菌，其中位置343上的T、位置371上的A、位置388上的C、位置416上的G和位置467上的G表示所述酵母生物是光滑念珠菌。
从上述酵母生物或丝状真菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.37的18S rRNA基因(或18S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的酵母生物新型隐球菌，其中位置343上的C、位置371上的A、位置388上的T、位置416上的T和位置467上的G表示所述酵母生物是新型隐球菌。
从上述酵母生物或丝状真菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.37的18S rRNA基因(或18S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的丝状真菌镰刀菌属，其中位置343上的C、位置371上的C、位置388上的T、位置416上的T和位置467上的G表示所述丝状真菌是镰刀菌属。
从上述酵母生物或丝状真菌中，可以通过分析来自样品的核酸中SEQ ID NO.37的18S rRNA基因(或18S rRNA或其DNA拷贝)中的SNP来鉴定样品中的丝状真菌烟曲霉，其中位置343上的C、位置371上的C、位置388上的T、位置416上的C和位置467上的G表示所述丝状真菌是烟曲霉。
除上述之外，本发明的方法还可用于鉴定样品中的白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、镰刀菌属、烟曲霉和新型隐球菌中的每一种。所述方法包括使用高分辨率熔解分析进一步分析来自样品的核酸(参见下文3.8)。
3.筛选特异多态性以鉴定和/或分类根据本发明的细菌、酵母生物和丝状真菌
从受试者中分离生物样品、处理生物样品、基因组DNA提取、RNA提取、DNA检测和表征、RNA检测和表征、DNA测序、DNA序列分析、SNP基因分型研究、RNA定位和表征、RNA图谱(RNA profiling)和RNA筛选、RNA测序、RNA序列分析的步骤/技术可以以任何合适的方式进行。
本领域已知的检测一个或多个SNP的任何方法都可以用于本文所述的方法中，以分类和/或鉴定样品内的细菌种类。在特定的实施方案中，所述方法还有助于相比另一种缩小一种细菌种类(或酵母生物或丝状真菌种类)的范围，或在某些情况下确认一种细菌种类(或酵母生物或丝状真菌种类)。在本领域中已知许多方法来确定在对应于样品中的单核苷酸多态性的特定位置上核苷酸的出现。用于检测多态性的各种工具包括但不限于DNA测序、扫描技术、基于杂交的技术、基于延伸的分析、高分辨率熔解分析、基于掺入的技术、基于限制酶的分析和基于连接的技术。
根据本发明的方法可以鉴定在16S rRNA或18S rRNA基因内、在16S rRNA或18SrRNA分子内或在其DNA拷贝内以及在任一链中的本文所述的多态性。在一些实例中，检测多态性的方法利用第一扩增步骤，并且扩增可以来自16S rRNA或18S rRNA基因或来自16SrRNA或18S rRNA分子的DNA拷贝。
核酸可以来自受试者的生物样品，或来自环境样品(例如空气、土壤或水样品)、滤液、食品或制成品，或者来自表面的交换物，例如来自医疗仪器或工作场所表面。受试者可以是人类受试者或非人类受试者，例如哺乳动物受试者，例如灵长类动物、家畜(例如绵羊、牛、马、驴、猪)、实验室测试动物(例如兔子、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(例如猫、狗)和圈养的野生动物(例如考拉、熊、野猫、野狗、狼、澳洲野狗、狐狸等)。来自受试者的生物样品可以来自受试者身体的任何部位，包括但不限于体液，例如血液、唾液、痰、尿液、脑脊液、粪便、细胞、组织或活检组织。在其他实例中，核酸是从培养的细胞获得。
根据本发明的方法分析的核酸可以在样品内时进行分析，或者可以首先从样品中提取，例如在分析之前从样品中分离。从样品中分离核酸的任何方法都可以用于本发明的方法，并且这些方法是本领域技术人员众所周知的。提取的核酸可以包括DNA和/或RNA(包括mRNA或rRNA)。在一些实例中，在分析之前，方法中可以包括另一个反转录步骤。因此，待分析的核酸可以包括16S rRNA基因、18S rRNA基因、16S rRNA、18S rRNA、16S rRNA或18SrRNA的DNA拷贝或其任何组合。核酸也可以包含16S rRNA基因、18S rRNA基因、16S rRNA、18S rRNA或16S rRNA或18S rRNA的DNA拷贝的一部分，从而提供包含被分析SNP的核酸位置的部分。
在某些情况下，所述方法包括核酸的扩增。在这些情况下，合适的核酸扩增技术是本领域技术人员或本领域普通技术人员众所周知的，并且包括聚合酶链式反应(PCR)(例如在Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.1994-1998中描述)、链置换扩增(SDA)(例如在美国专利号5,422,252中描述)、滚环复制(RCR)(例如在Liu等人(1996)以及WO92/01813和WO 97/19193中描述)、基于核酸序列的扩增(NASBA)(例如在Sooknanan等人,(1994)中描述)、连接酶链式反应(LCR)、简单序列重复分析(SSR)、支链DNA扩增分析(b-DNA)、转录扩增和自我持续序列复制以及Q-β复制酶扩增(例如在Tyagi等人(1996)中描述)。
这些方法可以利用选择性地与含有一个或多个SNP的靶多核苷酸杂交的一种或多种寡核苷酸探针或引物，包括例如扩增引物对。可用于实施本发明方法的寡核苷酸探针可以包括例如与靶多核苷酸互补并跨越靶多核苷酸的一部分(包括SNP的位置)的寡核苷酸，其中通过探针是否存在选择性杂交来检测在多态性位点(即SNP)处存在特异性核苷酸。这种方法可以进一步包括使靶多核苷酸和杂交的寡核苷酸与核酸内切酶接触，并根据多态性位点处的核苷酸出现是否与探针的相应核苷酸互补来检测探针的裂解产物的存在或不存在。
可以使用任何方便的合成方法来制造引物。这些方法的实例可以在“寡核苷酸和类似物的方案；合成和性质(Protocols for Oligonucleotides and Analogues；Synthesis and Properties)”,Methods in Molecular Biology Series,第20卷,SudhirAgrawal编辑,Humana ISBN:0-89603-247-7,1993中找到。引物也可以被标记以有助于检测。
可用于检测SNP的任何方法均可用于本发明，并且SNP基因分型在本领域中已知许多不同的方法(综述参见
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A.C.(2001)；Kim,S.和Misra,A.,(2007))。这种方法可能包括连续使用三个步骤，包括“反应”(例如杂交、连接、延伸和裂解)，然后是“分离”(例如固相微量滴定板、微粒或阵列、凝胶电泳、均匀或半均匀溶液相)。没有针对所有应用的单一理想SNP基因分型方法，并且在给定各种参数(例如样品大小和要分析的SNP的数量)的情况下，确定最合适的方法完全在技术人员的技能范围内。
特别适合临床使用的示例性技术依赖于查询少量的SNP，是快速的，灵敏的(通过样品中核酸的扩增)，一步的，实时测量输出，能够多路复用和自动化，相对便宜并且准确的，这些方法包括但不限于
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分析法(5'核酸酶分析法，Applied Biosystems)、高分辨率熔解分析、分子信标探针(例如
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(Invitrogen)或
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探针(SigmaAldrich))和Template Directed Dye Incorporation(TDI，Perkin Elmer)。
例如，
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(Applied Biosystems)使用与等位基因特异性探针杂交、均匀溶液相和荧光共振能量转移的组合。
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分析依赖于正向和反向引物和Taq DNA聚合酶来扩增核酸，并结合Taq DNA聚合酶的5'核酸酶活性来降解旨在结合SNP位点的标记探针。反应、分离和检测都可以同时进行，并且随着反应的进行产生实时读数。尽管此类方法不适合同时分析大量SNP，但它特别适合以合理的成本快速、灵敏和准确地查询少量SNP。
尽管某些方法可能比其他方法更合适，但是本领域已知的用于检测一个或多个SNP的任何方法都可以用于本文所述的方法中，以分类和/或鉴定样品中的一种和/或多种细菌。这些方法的非限制性实例如下所述。
3.1核酸测序技术
在一些实施方案中，通过核酸测序技术鉴定多态性。具体而言，可以使用传统的测序方法(例如“双脱氧介导的链终止法(dideoxy-mediated chain termination method)”，也称为“Sanger法”(Sanger,F.等人(1975))和“化学降解方法”(也称为“Maxam-Gilbert方法”(Maxam,A.M.等人,1977))确定在SNP基因座上的核苷酸存在来对跨越SNP基因座的扩增产物进行测序，这两个参考文献通过引用并入本文。
Boyce-Jacino等人的美国专利号6,294,336提供了一种固相测序方法，所述方法通过利用在其中SNP为选择性结合于靶标的3’核苷酸的位点上选择性结合多核苷酸靶标的引物来确定核酸分子(DNA或RNA)的序列。也可以采用其他测序技术，例如变性高压液相色谱法或质谱法。
在其他说明性实例中，测序方法包括称为PyrosequencingTM的技术。所述方法是基于在DNA聚合过程中无论何时掺入脱氧核苷酸都会产生焦磷酸盐。焦磷酸的产生与荧光素酶催化的反应偶合，如果掺入了所添加的特定脱氧核苷酸，则会发光，从而产生定量且独特的热解图。样品处理包括使用生物素化引物进行PCR扩增，在链霉亲和素包被的珠子(或其他固相)上分离生物素化单链扩增子以及对测序引物进行退火。然后通过PyrosequenceTM分析样品，PyrosequenceTM添加了指示剂反应所需的多种酶和底物，包括硫酸化酶和萤光素酶以及用于降解未掺入的分子的吡咯烷酮肽酶(pyrase)。然后通过添加四个脱氧核苷酸来查询样品。可以通过电荷耦合器件(CCD)相机检测光发射，所述光发射与所掺入的核苷酸的数量成正比。通过模式识别自动分配结果。
或者，本发明的方法可以使用“微测序”方法鉴定在核酸内多态性位点处的核苷酸出现。微测序方法仅确定“预定”位点上单个核苷酸的身份。这些方法在确定靶多核苷酸中多态性的存在和身份方面具有特殊用途。在美国专利号6,294,336中讨论了这些微测序方法以及用于确定在多态性位点处的核苷酸出现的其他方法，所述专利通过引用并入本文。
微测序方法包括WO 92/15712中公开的Genetic Bit AnalysisTM方法。另外，还已经描述了用于分析DNA中的多态性位点的由引物引导的核苷酸掺入程序(Komher,J.S.等人,1989)；Sokolov,B.P.,1990；
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A.C.等人,1990；Kuppuswamy,M.N.等人,1991；Prezant,T.R.等人1992；Ugozzoli,L.等人,1992；Nyren,P.等人1993；和WO 89/10414)。这些方法与Genetic Bit AnalysisTM的不同之处在于，它们都依靠掺入被标记的脱氧核苷酸来区分多态性位点处的碱基。以这种形式，由于信号与掺入的脱氧核苷酸的数量成正比，因此在同一核苷酸序列中发生的多态性可能导致信号与序列的长度成正比(
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A.C.等人1993)。
美国专利号4,656,127和法国专利号2,650,840(WO 91/02087)提供了其他微测序方法，其涉及一种基于溶液的方法，用于确定多态性位点的核苷酸的身份。如在所述美国专利的方法中那样，使用与在多态性位点3'紧靠的等位基因序列互补的引物。
在其他说明性实例中，例如，美国专利号5,002,867描述了一种通过与寡核苷酸探针的多种混合物杂交来确定核酸序列的方法。根据这些方法，通过允许靶标与在一个位置具有恒定核苷酸而在其他位置具有变异核苷酸的探针组顺序杂交来确定靶多核苷酸的序列。所述方法通过使靶标与一组探针杂交，然后确定所述组中至少一个成员能够与靶标杂交的位点数目(即，匹配数目)来确定靶标的核苷酸序列。通常重复所述过程，直到测试了一组探针的每个成员为止。
或者，结合荧光偏振检测分析的模板导向的染料终止剂掺入分析(FP-TDI)(Chen等人1999)是引物延伸分析的一种形式，也称为小测序或单碱基延伸分析(
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A.C.等人,1990)。引物延伸分析能够检测SNP。DNA测序方案确定了SNP特异性测序引物3'端的一个碱基的性质，所述引物与多态性位点上游的靶DNA粘接。在DNA聚合酶和适当的双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)的存在下，引物特异性地延伸一个碱基，如多态性位点上的靶DNA序列所指示的。通过确定掺入了哪个ddNTP，可以推断靶DNA中存在的等位基因。
3.2基于多态性杂交的技术
用于检测核苷酸序列内多态性的杂交技术可以包括但不限于
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分析(Applied Biosystems)、斑点印迹、反向斑点印迹、多重等位基因特异性诊断分析(Multiplex-allele-specific diagnostic assay，MASDA)、动态等位基因特异性杂交(DASH)(Jobs等人2003)、分子信标和Southern印迹。
用于鉴定核苷酸序列内SNP的
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分析(也称为5’核酸酶分析或5’消化分析)是基于Taq聚合酶的核酸酶活性，所述Taq聚合酶取代并裂解与靶DNA杂交的寡核苷酸探针，从而产生荧光信号。需要对特定SNP具有特异性的
Figure BDA0002369320530000543
探针，每个探针的5'末端连接有不同的荧光染料，而3'末端连接有淬灭剂。当探针完整时，淬灭剂通过荧光共振能量转移(FRET)与荧光团相互作用，从而淬灭其荧光。在PCT退火步骤中，
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探针与靶DNA杂交。在延伸步骤中，荧光染料被Taq聚合酶的核酸酶活性裂解，导致报告染料的荧光增加。错配探针被置换而没有断裂。通过测量两种不同染料的信号强度来确定样品的基因型。
另一种有用的SNP鉴定方法包括DASH(动态等位基因特异性杂交)，其包括随着反应温度稳定升高而动态跟踪探针(寡核苷酸)与靶标(PCR产物)的杂交以鉴定多态性(Prince,J.A.等人2001)。
在一些实施方案中，多重等位基因特异性诊断分析(MASDA)可用于分析大量样品(>500)。MASDA利用寡核苷酸杂交来询问DNA序列。将多重DNA样品固定在固体载体上，并用等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针的汇集物进行一次杂交。实际上，与给定样品中存在的特定多态性互补的任何探针都可以通过靶DNA从汇集物中亲和纯化。通过结合的ASO的化学或酶促测序产生的序列特异性条带模式(指纹)可以轻松鉴定出特定的突变。
有几种基于杂交的替代技术，尤其包括分子信标和
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探针(Tyagi,S.和Kramer,F.R.1996；Thelwell等人,2000)。分子信标由在5'和3'末端具有荧光报告基因和淬灭剂染料的寡核苷酸构成。寡核苷酸的中心部分跨靶序列杂交，但是5'和3'侧翼区域彼此互补。当不与它们的靶序列杂交时，5'和3'侧翼区域杂交形成茎环结构，并且由于报告基因和淬灭剂染料的接近，几乎没有荧光。然而，与它们的靶序列杂交后，染料被分离并且荧光大大增加。与完全互补的杂交体相比，错配的探针-靶标杂交体在低得多的温度下解离。“信标”方法有多种变体。
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探针是相似的，但掺入PCR引物序列作为探针的一部分。还开发了一种更新的“双重”形式。
在一些实施方案中，鉴定SNP的另一种方法包括SNP-ITTM方法(OrchidBioSciences,Inc.,Princeton,N.J.)。通常，SNP-ITTM是一个三步引物延伸反应。在第一步中，通过与捕获引物杂交从样品中分离靶多核苷酸，这提供了第一水平的特异性。在第二步骤中，捕获引物从靶SNP位点处的终止三磷酸核苷酸延伸，这提供了第二水平的特异性。第三步，可以使用多种已知形式检测延伸的三磷酸核苷酸，所述形式包括：直接荧光、间接荧光、间接比色分析法、质谱、荧光偏振等。反应可以384孔形式，使用SNPstreamTM仪器(OrchidBioSciences,Inc.,Princeton,N.J.)以自动化形式进行。
在这些实施方案中，可以在有或没有使用放射性探针的情况下通过Southern印迹分析来检测扩增产物。在一种这样的方法中，例如，扩增包含非常低水平的多态性基因座的核酸序列的DNA的小样品，并通过Southern印迹技术或类似地使用斑点印迹分析进行分析。高水平的扩增信号有助于非放射性探针或标记的使用。或者，可以用例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶直接或间接地以可检测方式标记用于检测扩增产物的探针。
杂交条件，例如盐浓度和温度，也可以针对要筛选的核苷酸序列进行调节。Southern印迹和杂交方案在Current Protocols in Molecular Biology(GreenePublishing Associates and Wiley-Interscience),第2.9.1-2.9.10页中进行了描述。可以针对探针与随机寡聚体和DNA聚合酶的Klenow片段的杂交标记探针。遵循制造商的方案，可以使用市售试剂盒(如Ready-To-Go DNA Labeling Beads(Pharmacia Biotech))获得特异活性很高的探针。对于每个使用的探针，将分别确定具有高重复序列含量以及杂交和清洗严格性的可能的竞争探针。或者，可以通过PCR产生候选序列的片段，可以使用啮齿动物-人体细胞杂交组来验证特异性，并亚克隆所述片段。这样可以为测序做大量准备工作并用作探针。一旦确定了给定的基因片段，就可以通过凝胶或柱纯化PCR产物来实现小探针制备。
可以用于斑点印迹、反向斑点印迹、多重和MASDA形式的合适材料在本领域中是众所周知的，并且包括但不限于尼龙和硝酸纤维素膜。
3.3多态性扫描技术
本发明预期用于检测核苷酸序列内的多态性的扫描技术可以包括但不限于化学错配裂解(CMC)(Saleeba,J.A等人,1992)、错配修复酶裂解(MREC)(Lu,A.L.和Hsu,I.C,1992)、化学裂解技术、变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Wartell等人,1990；Sheffield等人,1989)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)(Salimullah等人2005)、恒定变性凝胶电泳(CDGE)、单链构象多态性(SSCP)分析(Kumar,D.等人,2006)、异源双链体分析(HA)(Nagamine,C.M.等人,1989)、微卫星标志物分析和单链多态性分析(SSPA)。
在一些实施方案中，通过CMC检测本发明的SNP，其中将被放射性标记的DNA野生型序列(即探针)与包含推定的改变的扩增序列杂交以形成异源双链体。进行化学修饰，然后进行哌啶裂解，以去除异源双链体中的错配气泡。变性异源双链体的凝胶电泳和放射自显影可以可视化裂解产物。四氧化锇用于修饰错配的胸苷，并且羟胺用于错配的胞嘧啶。另外，标记探针DNA的反义链可以检测腺苷和鸟苷错配。错配的化学裂解可用于检测长DNA片段中几乎100％的突变。而且，此方法提供了被测片段内的突变的精确表征和准确位置。最近，已对方法进行了修改，以通过使用荧光引物使CMC更适合于自动化，还可以实现多重操作，从而减少操作次数。或者，通过PCR掺入的荧光标记dUTP可以对靶标和探针DNA链两者进行内部标记，因此可以对每种可能的杂交体进行标记，从而使突变检测的机会增加了一倍，并实际上保证了100％的检测。
在其他实施方案中，错配修复酶裂解(MREC)分析法用于鉴定本发明的SNP。MREC依赖于含错配的DNA的切口酶系统。通过PCR扩增目的序列，并且可以在PCR结束时通过变性并允许再退火扩增的产物来产生同源双链体和异源双链体种类。用错配修复酶处理这些杂合体，然后通过变性凝胶电泳进行分析。MREC分析利用了三种错配修复酶。MutY核酸内切酶从错配中去除腺嘌呤，并且可用于检测A/T和C/G颠换以及G/C和T/A转换。哺乳动物胸腺嘧啶糖基化酶从T/G、T/C和T/T错配中去除胸腺嘧啶，并且可用于检测G/C和A/T转换以及A/T和G/C和T/A和A/T颠换。来自人或小牛胸腺的全型核酸内切酶或拓扑异构酶I可以识别所有八种错配，并且可用于扫描任何核苷酸取代。MREC可以使用可以掺入到两条DNA链中的特异性标记，从而可以鉴定给定位点中的所有四种可能的核苷酸取代。
在一些实施方案中，如美国专利号5,217,863中所述的化学裂解分析用于鉴定核苷酸序列内的SNP。像异源双链体分析一样，化学裂解检测出在错配的等位基因序列相互杂交时产生的不同特性。代替检测所述差异作为改变的在凝胶上的迁移速率，而是使用例如羟胺或四氧化锇，随后使用哌啶来检测杂交体对化学裂解的敏感性变化的差异。
在本发明考虑的裂解方法中，RNAse A依赖于异源双链体错配分析的原理。在RNAse A裂解方法中，利用RNAse A在RNA:DNA杂交体的错配点处裂解单链RNA的能力，通过RNAse A裂解通过PCR扩增获得的在放射性标记的核糖探针与DNA之间的RNA-DNA异源双链体。接着进行电泳和放射自显影。突变的存在和位置由给定大小的裂解产物指示(Meyers,R.M.等人,1985；Gibbs,R.A.和Caskey,T.,1987)。
DNA探针还可用于通过酶或化学裂解检测错配；参见例如Cotton等人,1988；Shenk等人,1975；和Novack等人,1986。
在一些实施方案中，可以使用
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分析法(Third WaveTM Technology)来扫描本发明的16S rRNA基因内的多态性。例如，
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分析法是基于当两个重叠的寡核苷酸与靶DNA完美杂交时形成的三维结构的识别特异性和Flap内切核酸酶裂解(Lyamichev,V.等人,1999)。
或者，变性梯度凝胶电泳(DGGE)是分离和鉴定序列变体的有用技术。DGGE通常在恒定浓度聚丙烯酰胺凝胶平板中进行，并在线性增加量的变性剂(通常为甲酰胺和尿素，阴极至阳极)存在的情况下进行浇铸。DGGE的一种变体沿迁移路径采用温度梯度，称为TGGE。通过DGGE或TGGE的分离是基于以下事实：与未熔融的分子相比，部分熔融的DNA分子在凝胶中的电泳迁移率大大降低。
在一些实施方案中，恒定变性凝胶电泳(CDGE)可用于检测核苷酸序列内的SNP，如Smith-Sorenson等人,1993中所详细描述的。给定的DNA双链体以预定的特征性方式在恒定变性剂的凝胶中熔融。突变改变了这种运动。分离出异常迁移的片段并测序以确定特异性突变。
在其他实施方案中，单链构象多态性(SSCP)分析提供了检测本发明的SNP的方法。SSCP是一种基于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离的单链DNA分子的迁移率变化的方法。电泳迁移率取决于分子的大小和形状，并且单链DNA分子会自身折叠并产生二级结构，所述二级结构由分子内相互作用以序列依赖性方式确定。单核苷酸取代可以改变二级结构，并因此改变单链的电泳迁移率，从而导致放射自显影照片上的条带移位。在适当的理论模型的基础上，无法预测给定核苷酸变异改变单链构象的能力，并且SSCP可能无法检测到二级结构的环或长稳定茎中发生的碱基变化。标准SSCP在检测150-200bp片段的序列变化方面达到最大可靠性。已经开发出了更先进的方案，可以以与基于放射性的SSCP分析相同的灵敏度检测突变。这些方法在PCR中使用荧光标记的引物，并使用基于荧光的自动测序仪分析产物。多色荧光SSCP还允许在每个泳道中包括内部标准品，其可用于彼此比较每个泳道中的数据。其他提高检测率的变体包括基于双脱氧指纹图谱(ddF)和限制性核酸内切酶指纹图谱(REF)的双脱氧测序方法。
ddF方法是SSCP和Sanger双脱氧测序的组合，涉及与一个双脱氧核苷酸进行Sanger测序反应的非变性凝胶电泳。以这种方式，例如，可以筛选250bp的片段以鉴定SNP。REF是对SSCP的更复杂的修改，允许筛选超过1kb的片段。对于REF，通过PCR扩增靶序列，用五至六种不同的限制性核酸内切酶独立消化，并通过SSCP在非变性凝胶上进行分析。在使用六种限制酶的情况下，在六个不同的限制片段中将存在序列变异，从而产生12个不同的单链区段。这些片段中任何一个的迁移率变化足以确定本发明的SNP的存在。所获得的限制模式使得能够在所检查的区域中定位变化。
在一些实施方案中，异源双链体分析(HA)检测PCR产物或核苷酸序列中的单碱基取代。无需放射性同位素或专用设备即可快速执行HA。HA方法利用PCR产物的加热和复性，在一个或多个位置具有不同核苷酸的序列之间形成异源双链体。由于围绕错配碱基的更开放的双链构象，异源双链体的迁移比其相应的同源双链体慢，然后被检测为迁移率降低的条带。仅通过了解错配的碱基不能预测通过HA方法检测到的特定单碱基取代的能力，因为相邻的核苷酸对错配区域的构象有实质性影响，并且基于长度的分离显然会错过核苷酸取代。温度、凝胶交联和所用丙烯酰胺以及甘油和蔗糖的浓度的优化提高了突变样品的分离度。HA方法无需放射性同位素或专用设备即可快速执行，并筛选大量样品以了解测序基因中的已知突变和多态性。当将HA与SSCP结合使用时，可以轻松检测到DNA片段中多达100％的所有改变。
在一些实施方案中，使用识别核苷酸错配的蛋白质(例如大肠杆菌mutS蛋白)可用于检测本发明的16S rRNA内的多态性(Modrich 1991)。在mutS分析中，蛋白质仅与异源双链体中在两个序列之间含有核苷酸错配的序列结合。
在其他实施方案中，可以使用微卫星标志物分析来进行多态性检测。可以使用本领域已知的标准DNA分离方法使用具有平均基因组间隔(例如约10厘摩(cM))的微卫星标志物。
上述的SSPA分析和密切相关的异源双链体分析方法可用于筛选单碱基多态性(Orita,M.等人,1989)。
3.4用于多态性分析的核苷酸阵列和基因芯片
本发明进一步考虑了通过使用寡核苷酸阵列来鉴定SNP的方法，其中阵列上的离散位置与包含本发明的SNP的序列中的一个或多个互补，例如至少12nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约20nt或至少约25nt或更长的寡核苷酸，并包括在多态性位置侧翼的序列。这样的阵列可以包含一系列寡核苷酸，每个寡核苷酸可以与不同的多态性特异性地杂交。有关阵列的实例，请参见Hacia等人,1996和De Risi等人,1996。
根据需要，核苷酸阵列可以包括本发明的多态性的全部或子集。阵列中可以存在一个或多个多态性形式。阵列上的寡核苷酸序列的长度通常至少约12nt，至少约15nt，至少约18nt，至少约20nt，或至少约25nt，或更多，例如长度100至200nt。有关阵列的实例，请参见Ramsay 1998；Hacia等人,1996；Lockhart等人,1996；和De Risi等人,1996。
有多种方法可用于创建生物样品的微阵列，例如用于DNA杂交分析中的DNA样品阵列。这些阵列的实例在PCT申请号WO95/35505、美国专利申请号5,445,934和Drmanac等人,1993中详细讨论。Yershov等人1996描述了寡核苷酸阵列的替代构造。Ramsay(1998)综述了寡核苷酸阵列的构造和使用。
使用高密度寡核苷酸阵列鉴定核苷酸序列内多态性的方法是本领域已知的。例如，Milosavljevic等人,1996描述了通过与短寡聚物杂交来识别DNA序列(另请参见Drmanac等人,1998；和Drmanac和Drmanac,1999)。Ginot 1997提出使用阵列鉴定未知突变。
Hacia等人1996；Cronin等人,1996及其他人描述了已知突变的检测。Chee等人,1996；Sapolsky和Lishutz,1996；和Shoemaker等人,1996讨论了在遗传作图中使用阵列。
Schena等人,1995；和DeRisi等人,1997描述了用互补DNA微阵列对基因表达模式的定量监测。Wodicka等人,1997在酿酒酵母中执行了基因组宽范围表达监测。
寡核苷酸的高密度微阵列是本领域已知的并且可商购。阵列上寡核苷酸的序列将对应于已知的靶序列。存在于阵列上的寡核苷酸的长度是杂交对错配的敏感程度的重要因素。通常，寡核苷酸的长度为至少约12nt，更通常为至少约15nt，优选为至少约20nt，更优选为至少约25nt，并且不超过约35nt，通常不超过约30nt。
使用光引导合成技术在美国专利号5,134,854和美国专利号5,445,934中描述了产生寡核苷酸的大阵列的方法。使用计算机控制的系统，通过在多个反应位点同时偶联，将单体的异质阵列转化为聚合物的异质阵列。或者，例如，如国际公开WO 95/35505中所述，通过将预合成的寡核苷酸沉积到固体基板上来产生微阵列。
可以扫描微阵列以检测被标记的基因组样品的杂交。用于检测装置上荧光标记的靶标的方法和装置是本领域已知的。通常，这些检测装置包括显微镜和用于将光引导至基板的光源。光子计数器检测来自基板的荧光，而x-y平移台则改变基板的位置。在美国专利号5,631,734中描述了可用于本发明方法中的共聚焦检测装置。Shalon等人1996描述了一种扫描激光显微镜。对使用的每种荧光团，使用适当的激发线进行扫描。然后，将从扫描生成的数字图像合并以进行后续分析。对于任何特定的阵列元件，将来自一个核酸样品的荧光信号与来自另一核酸样品的荧光信号的比率进行比较，并确定相对信号强度。
用于分析通过荧光检测收集的数据的方法是本领域已知的。数据分析包括以下步骤：从收集的数据中确定作为基板位置的函数的荧光强度，除去异常值，即偏离预定统计分布的数据，并从剩余数据中计算靶标的相对结合亲和力。所得数据可以显示为图像，每个区域中的强度根据靶标和探针之间的结合亲和力而变化。
通过微芯片技术的核酸分析也适用于本发明。在这种技术中，数千种不同的寡核苷酸探针可以阵列形式应用于硅芯片上。对要分析的核酸进行荧光标记，并与芯片上的探针杂交。使用这些核酸微芯片来研究核酸-蛋白质相互作用也是可能的。使用这种技术，可以确定突变的存在，对被分析的核酸进行测序或测量目的基因的表达水平。所述方法是一次并行处理许多甚至数千个探针的一种方法，并且可以极大地提高分析速度。
可以通过本领域普通技术人员已知的任何技术来检测mRNA转录的改变。这些技术包括Northern印迹分析、PCR扩增和RNase保护。mRNA转录降低表明序列发生了改变。
阵列/芯片技术已经在许多情况下成功应用。
例如，已经在BRCA 1基因中、在酿酒酵母突变株中以及在HIV-1病毒的蛋白酶基因中进行了突变筛选(Hacia等人,1996；Shoemaker等人,1996；Kozal等人,1996)。可以定制生产用于检测SNP的各种形式的芯片。
EP 785280描述了可用于检测SNP的基于阵列的平铺策略(array-based tilingstrategy)。简而言之，通常可以针对大量特定的多态性“平铺”阵列。“平铺”是指一组确定的寡核苷酸探针的合成，这些探针由与目的靶序列互补的序列以及所述序列的预选变异组成，例如，一个或多个给定位置被单体(即核苷酸)基础集的一个或多个成员取代。在PCT申请号WO 95/11995中进一步描述了平铺策略。在一些实施方案中，将阵列平铺以用于多个特定的SNP。特别地，所述阵列被平铺以包括多个检测块，每个检测块对于特定的SNP或一组SNP是特异性的。例如，检测块可以被平铺以包括多个探针，其跨越包括特定SNP的序列区段。为了确保与每个等位基因互补的探针，探针在SNP位置上成对合成。除了在SNP位置上不同的探针外，单取代的探针通常也平铺在检测块内。这些方法可以容易地应用于本文公开的SNP信息。
这些单取代的探针在多态性的任一方向上具有一定数量和至多一定数量的碱基，其被剩余的核苷酸(选自A、T、G、C和U)取代。通常，平铺检测块中的探针将包括直至和包括距SNP 5个碱基的序列位置的取代。单取代探针为平铺阵列提供内部对照，以区分实际杂交与人工交叉杂交。与靶序列的杂交完成并清洗阵列后，扫描阵列以确定靶序列与之杂交的阵列上的位置。然后分析来自扫描阵列的杂交数据以鉴定样品中存在SNP的一个或多个等位基因。杂交和扫描可以如PCT申请号WO 92/10092和WO 95/11995以及美国专利号5,424,186中所述进行。
因此，在一些实施方案中，芯片可包括长度约15个核苷酸的片段的核酸序列及其互补序列或其片段的阵列，所述片段包含至少约8个连续核苷酸，优选10、15、20、更优选25、30、40、47或50个连续核苷酸，并包含多态性碱基。在一些实施方案中，多态性碱基在距多核苷酸中心5、4、3、2或1个核苷酸以内，更优选在多核苷酸中心。在其他实施方案中，芯片可以包括含有任何数量的本发明的多核苷酸的阵列。
如在PCT申请WO95/251116中所描述的，可以通过使用化学偶联程序和喷墨施加设备在基板的表面上合成寡核苷酸。在另一方面，可以使用真空系统、热、UV、机械或化学粘合程序，使用类似于斑点(或狭缝)印迹的“格栅状”阵列来将cDNA片段或寡核苷酸排列并连接至基板表面。诸如上述阵列的阵列可以通过手工或使用可用的装置(狭缝印迹或斑点印迹设备)、材料(任何合适的固体载体)和机器(包括机器人仪器)来生产，并且可以包含8、24、96、384、1536、6144或更多个寡核苷酸，或任何其他数量的寡核苷酸，使其有效利用可商购的仪器。
使用这些阵列，本发明提供了鉴定样品中本发明的SNP的方法。这些方法包括将测试样品与包括对应于本发明的至少一个SNP位置的一种或多种寡核苷酸探针的阵列一起孵育，以及分析来自测试样品的核酸与寡核苷酸探针中的一者或多者的结合。这些分析通常将涉及包含寡核苷酸探针的阵列，所述寡核苷酸探针对应于许多SNP位置和/或那些SNP位置的等位基因变体，其中至少一个是本发明的SNP。
将核酸分子与测试样品一起孵育的条件有所不同。孵育条件取决于分析中使用的形式、采用的检测方法以及分析中使用的核酸分子的类型和性质。本领域技术人员将认识到，通常可获得的杂交、扩增或阵列分析形式中的任何一种都可以容易地适于使用本文公开的新颖SNP。这些分析的实例可在Chard,T,《对放射免疫分析和相关技术的介绍(AnIntroduction to Radioimmunoassay and Related Techniques)》,Elsevier SciencePublishers,Amsterdam,The Netherlands(1986)；Bullock,G.R.等人,Techniques inImmunocytochemistry,Academic Press,Orlando,Fla.第1卷(I 982),第2卷(1983),第3卷(1985)；Tijssen,P.,《酶免疫分析的实践和理论：生物化学和分子生物学中的实验室技术(Practice and Theory of Enzyme Immunoassays:Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology)》,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands(1985)中找到。
多组分集成系统也可用于分析SNP。这些系统在单个功能装置中微型化和分隔诸如PCR和毛细管电泳反应的过程。在美国专利号5,589,136中公开了这种技术的实例，其描述了PCR扩增和毛细管电泳在芯片中的集成。
当使用微流体系统时，主要可以设想集成系统。这些系统包括设计在微芯片上包括的玻璃、硅、石英或塑料晶圆上的微通道图案。样品的运动由施加在微芯片不同区域上的电力、电渗力或静水力控制，以创建没有运动部件的功能性微型阀和泵。改变电压可控制在微加工通道之间的交叉点处的液体流量，并改变液体流速以在微芯片的不同部分中泵送。
为了对SNP进行基因分型，微流体系统可以集成例如核酸扩增、微型测序引物延伸、毛细管电泳以及诸如激光诱导荧光检测的检测方法。
第一步，优选通过PCR扩增DNA样品。然后，使用ddNTP(每个ddNTP的特异性荧光)和仅在靶向多态性碱基的上游杂交的适当的寡核苷酸微型测序引物对扩增产物进行自动微型测序反应。一旦完成3'端的延伸，就可以通过毛细管电泳将引物与未掺入的荧光ddNTP分开。毛细管电泳中使用的分离介质可以是例如聚丙烯酰胺、聚乙二醇或葡聚糖。通过激光诱导的荧光检测鉴定单核苷酸引物延伸产物中掺入的ddNTP。此微芯片可用于并行处理至少96到384个或更多样品。
3.5用于检测多态性的基于延伸的技术
用于检测核苷酸序列内多态性的基于延伸的技术可以包括但不限于如欧洲专利申请公开号0332435和Newton等人,1989所公开的等位基因特异性扩增，也称为扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)，和Gibbs等人,1989设想的多态性克隆(COPS)。
基于延伸的技术ARMS使用等位基因特异性寡核苷酸(ASO)PCR引物进行基因分型。在这种方法中，将用于PCR的两种寡核苷酸引物之一设计为与多态性位点结合，最常见的是引物的3'端靶向所述位点。在仔细控制的条件下(退火温度、镁浓度等)，仅当PCR引物3'端的核苷酸与多态性位点上的碱基互补时才发生扩增，错配是扩增的“难点”。
ARMS方法的一种变体，称为诱变分离PCR(MS-PCR)，包括两个不同长度的ARMS引物，每个引物都对位点上的不同多态性是特异的。此方法针对不同的多态性产生不同长度的PCR产物。
3.6用于检测多态性的基于连接的分析法
SNP检测的另一种典型方法涵盖寡核苷酸连接分析法。许多方法利用DNA连接酶，这是可以将杂交到DNA模板的两个相邻寡核苷酸连接在一起的酶。所述方法的特异性来自在连接位点处的杂交寡核苷酸和DNA模板之间的完美匹配的要求。在寡核苷酸连接分析法(OLA)或连接酶链式反应(LCR)分析法中，突变位点周围的序列首先被扩增，并且一条链用作三个连接探针的模板，这些探针中的两个是等位基因特异性寡核苷酸(ASO)，第三个是普通探针。许多方法可用于检测连接产物。例如，可以用荧光或半抗原标记对两种ASO进行差异标记，并分别通过荧光或比色酶联免疫吸附分析法检测连接产物。对于基于电泳的系统，使用迁移率修饰剂标签或与荧光检测相结合的探针长度的变化可以在单个管中对若干单核苷酸取代进行多重基因分型。在阵列上使用时，ASO可以在芯片上的特定位置或地址上形成斑点。然后可以添加通过PCR扩增的DNA，并可以测量与阵列上特定地址上的标记寡核苷酸的连接。
3.7信号产生多态性检测分析法
在一些实施方案中，考虑荧光共振能量转移(FRET)作为鉴定16S rRNA基因内多态性的方法。由于两个染料分子的电子激发态之间的相互作用而发生FRET。激发从一个(供体)染料分子转移到另一个(受体)染料分子，而没有光子的发射。这是取决于距离的，即供体和受体染料必须非常接近。杂交探针系统由两个标记有荧光染料的寡核苷酸组成。杂交探针对被设计为与靶DNA上的相邻区域杂交。每个探针都用不同的标记染料标记。只有当两种染料都结合到它们的靶标上时，两种染料才会发生相互作用。供体探针在3'末端标记有荧光团，受体探针则在5'末端标记有荧光团。在PCR期间，两个不同的寡核苷酸与靶DNA的相邻区域杂交，从而使与寡核苷酸偶联的荧光团在杂交体结构中非常接近。供体荧光团(F1)被外部光源激发，然后将其激发能的一部分传递给相邻的受体荧光团(F2)。激发受体荧光团(F2)发出不同波长的光，然后可以检测和测量其分子接近度。
在其他实施方案中，基于单碱基延伸、磁分离和化学发光的MagSNiPer方法提供了在核苷酸序列中鉴定SNP的另一种方法。用生物素化的引物进行单碱基核苷酸延伸反应，所述引物的3'末端与带有经标签标记的ddNTP的SNP位点邻接。然后用带有抗生蛋白链菌素的磁性包被的珠子捕获引物，并通过磁分离去除未掺入的经标记的ddNTP。将磁珠和与碱性磷酸酶缀合的抗标签抗体一起孵育。通过磁分离除去过量的缀合物之后，通过测量化学发光进行SNP分型。通过由碱性磷酸酶诱导的化学发光监测经标记的ddNTP的掺入。
在一些实施方案中，荧光偏振提供了用于鉴定核苷酸序列内的多态性的方法。例如，在等位基因特异性染料标记的双脱氧核糖核苷三磷酸和市售的经修饰Taq DNA聚合酶存在下，将含有多态性的扩增DNA与寡核苷酸引物(被设计用于与多态性位点相邻的DNA模板杂交)一起孵育。引物通过对模板上存在的等位基因具有特异性的染料终止剂延伸，使荧光团的分子量增加约10倍。反应结束时，无需分离或纯化即可直接分析反应混合物中两种染料终止剂的荧光偏振。这种同质的DNA诊断方法显示出高度的灵敏度和特异性，并且适用于大量样品的自动基因分型。
在其他实施方案中，表面增强的拉曼散射可用作检测和鉴定双链DNA片段中单碱基差异的方法(参见Chumanov,G 1999)。SERS也已用于单分子检测(Kneipp,K,1997)。SERS导致附着在纳米尺寸金属结构上的分子的拉曼信号大大增强。
示例性的实例包括由Xiao和Kwok 2003讨论的基于引物延伸分析的基因分型方法，其中荧光淬灭作为检测。模板指导的染料终止剂结合荧光淬灭检测(FQ-TDI)分析是基于以下观察结果：一旦将荧光染料R110和R6G标记的非环终止剂掺入DNA寡核苷酸引物上，所述非环终止剂的强度就会被普遍地淬灭。通过实时比较两种等位基因染料的荧光淬灭速率，可以测量DNA样品中SNP的频率。动力学FQ-TDI分析法在基因分型和等位基因频率估计中都非常准确且可复现。
3.8高分辨率熔解分析
在特定的实施方案中，本发明的方法利用高分辨率熔解(HRM)分析，用于基于在16S rRNA基因内、在16S rRNA分子内或在其DNA拷贝内的本文所述的一个或多个SNP来分类和/或鉴定样品中的一种或多种细菌。
HRM是基于准确地监测荧光变化，因为被嵌入荧光染料染色的PCR产物(即扩增子)被加热到其熔解温度(Tm)。与传统的熔解相反，HRM分析中的信息包含在熔解曲线的形状中，而不仅仅是计算出的Tm，因此HRM可以看作是光谱学的一种形式。HRM分析是一步封闭管法，扩增和熔解可以在实时PCR机上作为单个方案运行。
在本发明的实施方案中，所述方法利用扩增引物对，所述扩增引物对与包含本文所述的SNP中的一者或多者的靶多核苷酸选择性杂交。扩增反应混合物包含荧光染料，其被掺入所得扩增子中。
然后对所得的扩增子进行HRM，其中温度在约50℃至约95℃的范围内递增(即0.01-0.5℃)。在此过程中的某个点，达到了扩增子的熔解温度，并且两条DNA链分离开或“熔化开”。
使用掺入扩增子中的荧光染料实时监测HRM。随着温度的升高监测染料的荧光水平，其中随着双链DNA数量的减少荧光也减少。可以将荧光和温度的变化绘制在称为熔解曲线的图表中。
如本领域技术人员将理解的那样，取决于形成扩增子的核苷酸碱基的序列，两条DNA链分离的扩增子的Tm是可预测的。因此，由于熔解曲线看起来不同，所以可以区分扩增子，包括含有多态性(即，一个或多个SNP)的扩增子。实际上，在一些实施方案中，可以基于周围DNA序列的差异来区分含有相同多态性的扩增子。
HRM曲线可以通过许多不同的策略进行区分。例如，在许多情况下，可以基于曲线形状的明显差异和/或基于Tm来区分HRM曲线，其中将0.2℃的差异视为显著。在其他情况下，可以使用差异图分析，其中将定义的曲线用作基线，并相对于基线绘制其他归一化曲线(参见Price,E.P.等人2007)。在其他情况下，可以使用基于差异图的方法，其包括从每个温度下的荧光的平均值±1.96标准偏差中得出第3个和第97个百分位(参见Andersson,P.等人,2009；和Merchant-Patel,S.等人2008)。
4.工具、试剂、引物、探针、试剂盒和处理系统
本说明书解释了如何将各种SNP用作‘工具’，以鉴定、部分鉴定或分类细菌、酵母生物或丝状真菌，或诊断细菌、酵母生物或丝状真菌感染。所述SNP发现使发明人能够开发基于基因/等位基因和基于基因产物的探针、工具、试剂、方法和分析法，以鉴定、部分鉴定或分类细菌、酵母生物或丝状真菌，或诊断细菌、酵母生物或丝状真菌感染。
基于说明书中，尤其是表1至9和表11中提供的信息，本领域技术人员可以容易地设计、生产或制造各种基于基因/等位基因和基于基因产物的探针、工具、试剂、方法和分析法。
一般而言，基于本说明书中概述的SNP的或鉴于本说明书中概述的SNP开发的这些探针、工具或试剂可例如特异性结合、检测、鉴定、表征或定量基因或基因的一部分、RNA基因产物或RNA基因产物的一部分、或其他基因产物或其部分。
一般而言，这种探针、工具或试剂可以用于例如在基因组水平或转录水平上检测多态性。
一般而言，这种探针、工具或试剂也可以是能够检测基因或基因产物(例如RNA)的抗体或其他类型的分子或化学实体。
更具体地说，探针、工具和试剂可包括但不限于以下各项：
1.16S rRNA、16S rDNA、18S rRNA或18S rDNA的分离、纯化、合成或重组形式，或其片段，包括含有目标SNP的片段-单链或双链。
2.16S rRNA、16S rDNA、18S rRNA或18S rDNA的非天然存在的多核苷酸、重组多核苷酸、寡核苷酸或cDNA形式，或其片段，包括含有目的SNP的片段-单链或双链。
3.包含1或2的核酸或多核苷酸的表达载体、重组细胞或生物样品。
探针、工具或试剂可以是但不限于能够检测基因或基因产物(RNA或多肽)的抗体或其他类型的分子或化学实体。
至少一种探针、工具或试剂可以是上述的任何数量或组合，并且所述数量和组合将取决于要实现的期望结果-例如，在基因组水平(基因分型)或RNA水平上检测多态性。
用于检测根据本发明的16S rRNA基因或18S rRNA基因中的一个或多个SNP所需的所有必需材料和试剂可以在试剂盒中组装在一起。试剂盒还可任选地包括用于检测标记、阳性和阴性对照、荧光染料、洗涤溶液、印迹膜、微量滴定板、稀释缓冲液等的适当试剂。例如，用于鉴定多态性的基于核酸的检测试剂盒可包括以下一种或多种：(i)来自革兰氏阳性细胞和/或革兰氏阴性细胞的核酸(可用作阳性对照)；和(ii)与在疑似SNP位点上或周围含有欲分析的一个或多个SNP位置和任选地一个或多个其他标志物的16S rRNA基因或18SrRNA基因的至少一部分特异性杂交的引物和/或探针。还包括适合于扩增核酸的酶，包括各种聚合酶(逆转录酶、Taq、SequenaseTM DNA连接酶等，取决于所用的核酸扩增技术)、脱氧核苷酸和缓冲液，以提供扩增所需的反应混合物。这些试剂盒通常还将以合适的方式包括用于每种单独的试剂和酶以及用于每种引物或探针的不同容器。试剂盒还可具有用于进行本文所述的分析法之一的各种装置和试剂；和/或关于使用所述试剂盒鉴定本文定义的SNP的存在的印刷说明书。
在一些实施方案中，本文中大体描述的方法至少部分地由处理系统(诸如适当编程的计算机系统)实施。可以使用具有微处理器的独立计算机，所述微处理器执行应用软件以允许实施上述方法。或者，这些方法可以至少部分地由作为分布式体系结构的一部分运行的一个或多个处理系统来实施。例如，处理系统可以用于通过检测探针与核酸分子的杂交来检测在一个位置上SNP的存在。处理系统还可以用于基于一个或多个SNP的检测来确定革兰氏状态或身份或细菌的分组。在一些实例中，由用户输入到处理系统的命令可以帮助处理系统做出这些确定。
在一个实例中，处理系统包括经由总线互连的至少一个微处理器、存储器、诸如键盘和/或显示器的输入/输出设备以及外部接口。外部接口可用于将处理系统连接到外围设备，例如通信网络、数据库或存储设备。微处理器可以以存储在存储器中的应用软件的形式执行指令，以允许实施SNP检测和/或微生物鉴定或分类过程，以及实施任何其他所需的过程，例如与计算机系统通信。所述应用软件可以包括一个或多个软件模块，并且可以在诸如操作系统环境等合适的执行环境中执行。
4.1用于16S rRNA基因或18S rRNA基因的引物、探针、试剂盒和加工系统
本发明提供了可用于本文所述方法中的探针和引物，以确定16S rRNA基因或18SrRNA基因的一个或多个位置上的SNP，以便分类和/或鉴定样品中的一种或多种细菌、酵母生物或丝状真菌。
本发明的引物和探针与含有一个或多个SNP位置的16S rRNA基因或18S rRNA基因(或16S rRNA分子或其DNA拷贝或18S rRNA分子或其DNA拷贝)的至少一部分杂交。例如，引物可以与一个或多个SNP侧翼的序列杂交，并且探针可以与包含一个或多个SNP的序列杂交。基于16S rRNA基因或18S rRNA基因的已知序列，设计用于本发明方法的合适的引物和探针完全在技术人员的技能范围内。
可用于本发明方法的引物和探针的非限制性实例包括实施例1中所述的那些，其中分析细菌种类的16S rRNA中在与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和/或653相对应的位置上的SNP。
例如，为了检测位置273上的SNP，示例性的正向引物包括CCTCTTGCCATCGGATGTG(SEQ ID NO:16)，并且示例性的反向引物包括CCAGTGTGGCTGGTCATCCT(SEQ ID NO:17)、CGATCCGAAAACCTTCTTCACT(SEQ ID NO:20)、CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA(SEQ ID NO:22)、TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT(SEQ ID NO:26)、AACGCTCGGATCTTCCGTATTA(SEQ ID NO:27)、CGCTCGCCACCTACGTATTAC(SEQ ID NO:28)、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG(SEQ ID NO:30)、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA(SEQ ID NO:34)和GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG(SEQ ID NO:35)。
为了检测位置378上的SNP，示例性的正向引物包括CCTCTTGCCATCGGATGTG(SEQ IDNO:16)、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG(SEQ ID NO:18)和GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT(SEQ ID NO:19)；并且示例性的反向引物包括CGATCCGAAAACCTTCTTCACT(SEQ ID NO:20)、CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA(SEQ ID NO:22)、TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT(SEQ ID NO:26)、AACGCTCGGATCTTCCGTATTA(SEQ ID NO:27)、CGCTCGCCACCTACGTATTAC(SEQ ID NO:28)、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG(SEQ ID NO:30)、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA(SEQ ID NO:34)和GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG(SEQ ID NO:35)。
为了检测位置412上的SNP，示例性的正向引物包括CCTCTTGCCATCGGATGTG(SEQ IDNO:16)、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG(SEQ ID NO:18)、GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT(SEQ ID NO:19)和AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA(SEQ ID NO:21)；并且示例性的反向引物包括CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA(SEQ ID NO:22)、TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT(SEQ ID NO:26)、AACGCTCGGATCTTCCGTATTA(SEQ ID NO:27)、CGCTCGCCACCTACGTATTAC(SEQ ID NO:28)、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG(SEQ ID NO:30)、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA(SEQ ID NO:34)和GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG(SEQ ID NO:35)。
为了检测位置440上的SNP，示例性的正向引物包括CCTCTTGCCATCGGATGTG(SEQ IDNO:16)、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG(SEQ ID NO:18)、GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT(SEQ ID NO:19)、AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA(SEQ ID NO:21)、TGCCGCGTGAATGAAGAA(SEQ ID NO:23)、GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA(SEQ ID NO:24)和TGATGAAGGTTTTCGGATCGT(SEQ ID NO:25)；并且示例性的反向引物包括TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT(SEQ ID NO:26)、AACGCTCGGATCTTCCGTATTA(SEQ ID NO:27)、CGCTCGCCACCTACGTATTAC(SEQ ID NO:28)、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG(SEQ ID NO:30)、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA(SEQ ID NO:34)和GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG(SEQ ID NO:35)。
为了检测位置488上的SNP，示例性的正向引物包括CCTCTTGCCATCGGATGTG(SEQ IDNO:16)、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG(SEQ ID NO:18)、GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT(SEQ ID NO:19)、AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA(SEQ ID NO:21)、TGCCGCGTGAATGAAGAA(SEQ ID NO:23)、GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA(SEQ ID NO:24)、TGATGAAGGTTTTCGGATCGT(SEQ ID NO:25)和GTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGT(SEQ ID NO:29)；并且示例性的反向引物包括CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG(SEQ ID NO:30)、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA(SEQ ID NO:34)和GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG(SEQ ID NO:35)。
为了检测位置647和/或653上的SNP，示例性正向引物包括CCTCTTGCCATCGGATGTG(SEQ ID NO:16)、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG(SEQ ID NO:18)、GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT(SEQ IDNO:19)、AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA(SEQ ID NO:21)、TGCCGCGTGAATGAAGAA(SEQ ID NO:23)、GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA(SEQ ID NO:24)、TGATGAAGGTTTTCGGATCGT(SEQ ID NO:25)、GTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGT(SEQ ID NO:29)、GCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAA(SEQ IDNO:31)、GGTCTGTCAAGTCGGATGTGAA(SEQ ID NO:32)和TCAACCTGGGAACTCATTCGA(SEQ ID NO:33)；并且示例性的反向引物包括GGAATTCTACCCCCCTCTACGA(SEQ ID NO:34)和GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG(SEQ ID NO:35)。
类似地，可用于本发明方法的引物和探针的非限制性实例包括表8中所述的那些，其中分析细菌种类的16S rRNA基因或16S rRNA中在与SEQ ID NO:43所示的16S rRNA基因的位置746、764、771或785(或SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置737、755、762或776)相对应的位置上的SNP。
类似地，可用于本发明方法的引物和探针的非限制性实例包括表9中所述的那些，其中分析细菌种类的18S rRNA基因或18S rRNA中在SEQ ID NO:37所示的18S rRNA基因的位置343、371、388、416和467上的SNP。
5.本发明方法的应用
本发明的方法可用于分类和/或鉴定样品中的细菌、酵母生物或丝状真菌，例如来自受试者的样品或环境样品，例如土壤或水样品，或取自设备或仪器(例如医疗或外科手术仪器)表面或工作表面的样品。然后可以使用这种分类或鉴定来确定用于去除、根除或减少细菌、酵母生物或丝状真菌的数量的治疗过程。可以组合本发明的方法中的任何两种或更多种。例如，可以使用本发明的方法分析来自样品的核酸中16S rRNA基因中SNP的存在。可以这样做以确定样品中是否存在革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。细菌可以被进一步分组，或者细菌的身份也可以被确定或缩小到几种可能性之一。例如，如从以上公开内容显而易见的，可以评估与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和653相对应的位置上的SNP，以便分类或甚至鉴定样品中的细菌。
患有感染或疑似感染的受试者通常在诊所、急诊室、普通病房和重症监护室中向临床医生展示。这些患者通常具有温度异常、心率和呼吸频率增加以及白细胞计数异常的非诊断性临床体征。临床医生必须确定患者是否患有感染，感染的严重程度，是否允许患者入院(如果尚未住院)，感染源，是否使用抗生素，以及(如果有的话)抗生素的类型、途径和剂量。最典型地，通过从患者中取得样品并在培养液中生长生物体来评估患者中感染的存在。生物体一旦生长，就可以对它进行革兰氏染色和鉴定。但是，在许多受感染的患者(>50)中，不可能培养生物体。如果没有鉴定的生物体，临床医生必须依靠临床判断和经常组合使用广谱抗生素。在不了解病原生物的身份或敏感性的情况下，不加选择地使用广谱抗生素会导致抗生素耐药性的发展、抗生素的过度使用以及对患者的潜在毒性副作用。只有当所采集的血液样品含有活生物体时，血液培养才是一种灵敏的方法(1-100cfu/mL)，但情况并非总是如此。
因此，本发明的方法在帮助临床医生确定受试者是否具有感染以及(如果有的话)基于引起感染的细菌、酵母生物或丝状真菌的分类的适当治疗过程中特别有用。
此外，本发明的方法有助于在从受试者获取全血的几小时内辨别革兰氏阳性和革兰氏阴性生物。本发明的方法还可以以省时的方式执行，使得结果可以在数小时而不是数天内提供给临床医生。这些属性使临床医生可以灵敏地检测到细菌、酵母生物或丝状真菌的存在，并做出明智的治疗决定(例如使用对革兰氏状态特异性的抗生素或进一步对细菌进行分组或鉴定)。这些改善可导致不必要地减少住院的患者数量，细菌、酵母生物和丝状真菌的灵敏的检测，按负荷(和其他因素)评估感染的严重性，减少使用广谱抗生素/药物，减少患者使用广谱抗生素的时间，减少抗生素/药物的毒性，减少对药物的抗药性(特别是抗生素抗药性)的发展。
本发明还扩展到诊断受试者中的细菌、酵母生物或丝状真菌感染，和在阳性诊断之后对感染的管理。本文描述的分析16S rRNA或18S rRNA内的一个或多个SNP的方法可用于确定受试者是否具有细菌、酵母生物或丝状真菌感染和/或鉴定样品中的细菌、酵母生物或丝状真菌的组或种类。本文所述的方法可以进一步用于将细菌分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性。
5.1管理与治疗
基于本发明的方法的结果，可以在需要时适当地对受试者进行管理和给予治疗。例如，细菌感染的管理可包括例如施用治疗剂，例如抗生素的治疗有效过程。
通常，将治疗剂与药学上可接受的载体一起以药物(或如果受试者是非人类受试者，则以兽医学)组合物的形式并以有效量施用以实现其预期目的。施用于受试者的活性化合物的剂量应足以在受试者中随时间推移实现有益的反应，例如减轻或缓解感染症状，和/或减少或消除受试者的细菌。待施用的一种或多种药物活性化合物的数量可以取决于待治疗的受试者，包括其年龄、性别、体重及其总体健康状况。在这方面，用于施用的一种或多种活性化合物的精确量将取决于从业者的判断。在确定欲在细菌感染的治疗或预防中施用的一种或多种活性化合物的有效量时，从业者可以评估感染的严重程度以及与感染相关的任何症状的严重程度，所述症状包括炎症、血压异常、心动过速、呼吸急促、发烧、发冷、呕吐、腹泻、皮疹、头痛、精神错乱、肌肉酸痛和癫痫发作。无论如何，本领域技术人员可以在不进行过度实验的情况下容易地确定治疗剂的合适剂量和合适的治疗方案。
可以与辅助(姑息)疗法一起施用治疗剂，以增加向主要器官的氧气供应，增加向主要器官的血流量和/或减少炎症反应。这些辅助疗法的说明性实例包括非甾体抗炎药(NSAID)、静脉注射生理盐水和氧气。
在整个本说明书中，对‘一个实施方案’或‘一实施方案’的引用是指结合所述实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书中各处出现的短语‘在一个实施方案中’或‘在一实施方案中’不一定都指同一实施方案。此外，可以以任何合适的方式以一种或多种组合来组合特定特征、结构或特性。
根据法规，已经以或多或少地针对结构或方法特征的语言描述了本发明。应当理解，本发明不限于所示出或描述的特定特征，因为本文所述的方式包括使本发明生效的优选形式。因此，在本领域技术人员适当解释的所附权利要求(如果有的话)的适当范围内，以其任何形式或修改要求保护本发明。
本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用全文并入本文。
为了可以容易地理解本发明并将其付诸实践，现在将通过以下非限制性实施例描述特定的优选实施方案。
实施例
实施例1
所述实验的目的是使用本发明的16S rRNA SNP-HRM分析法，辨别经常从诊断为败血症的患者中分离出的最常见细菌种类中的15种。
实验步骤
总共测试了以下15种细菌种类：乙酸钙不动杆菌；产气肠杆菌；阴沟肠杆菌；粪肠球菌；屎肠球菌；大肠杆菌；肺炎克雷伯菌；奇异变形杆菌；铜绿假单胞菌；粘质沙雷氏菌；金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌；无乳链球菌；肺炎链球菌；和化脓性链球菌。
在37℃的脑心浸液中将细菌种类培养过夜，然后使用QIAgen DNeasy Blood andTissue Kit(Qiagen，Australia)从每个分离物中提取基因组DNA。
设计16S rDNA-SNP引物(SEQ ID NO:16-35，由Sigma Aldrich,Australia制造)，以扩增包含如下指定的七个SNP的区域：SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的SNP273、SNP378、SNP412、SNP440、SNP488、SNP647和SNP653。PCR产物的大小范围为79bp至96bp。
实时PCR和随后的HRM分析用于区分15种细菌种类。实时PCR HRM过程为：将1μl提取的DNA(1-3ng)添加到19μl的反应预混液中，其含有10μl的2X SYBR green PCRMastermix(Invitrogen，Australia)和8pmol的每种引物。这些反应的温度循环如下：50℃持续2分钟，95℃持续2分钟，随后是95℃持续15秒、52℃持续20秒和72℃持续35秒的40个循环，在72℃下维持2分钟，在50℃下维持20秒，HRM：以0.05℃从65℃渐升到95℃(Rotor-Gene6000,Qiagen,Australia)。
使用Rotor-Gene 6000软件(版本1.7.34或1.7.87)以多种方式分析HRM数据。归一化的原始熔解曲线描绘了荧光随温度升高而降低，而差异曲线则显示了用户定义的曲线作为基线(即x轴)，并描绘了与所述基线有关的其他归一化曲线。发明人和她的同事先前已经开发和发布了使用差异图将熔解曲线称为相同或不同的标准(参见例如Stephens,A.J.,等人2008；Merchant-Patel,S.等人2010)。
HRM曲线图可以通过两种方法来区分样品。熔解曲线的形状指示曲线形状中的细节，并且曲线位移指示曲线与其他曲线的热(温度)偏移。
所述软件允许如上所述使用归一化的熔解曲线或差异曲线来进行HRM熔解曲线分析。归一化曲线分析允许将所有HRM曲线与相同的起始和结束荧光信号水平进行比较，以帮助解释和分析。差异曲线分析显示每个样品与给定对照的熔解曲线之间的差异。
在所述实验中，使用形状和位移方法来区分每种测试细菌种类的HRM曲线。为了确定每种细菌种类的熔解温度的变化，将0.2℃的熔解温度差视为每种细菌种类的熔解曲线之间的显著差异。
为了确定细菌种类之间的形状差异，使用了差异曲线分析。>5归一化荧光单位的幅度差异表明不同的细菌种类熔解曲线与比较种类是不同的。因此，曲线形状的这些差异表明每种细菌种类的DNA序列的差异。
结果
图2至11描绘了用于区分本实施例中测试的15种细菌种类的归一化和差异熔解曲线图。
在Rotor-Gene 6000软件(版本1.7.34或1.7.87)的HRM分析设置中，将15种细菌种类中的每一种都指定为种类特异性基因型。为了比较细菌种类差异曲线，使用大肠杆菌作为“校准物”或“参照物”(在图3所示的图的Y轴上表示为0)。如图3所示，其他14种细菌种类均显示出不同于大肠杆菌的“0”线的曲线。种类区分的另一个实施例如图5所示，其中金黄色葡萄球菌被选作“校准物”或“参照物”(在Y轴上的“0”位置)，而表皮葡萄球菌具有完整的分离曲线。
表11提供了尿液和血浆中细菌的熔解曲线特异性。
表11-尿液和血浆中的细菌形态：熔解曲线特异性
Figure BDA0002369320530000761
Figure BDA0002369320530000771
$Tm：PCR产物的熔解温度；*SNP：单核苷酸多态性。
p值SNP1对比SNP2：<0.0001；p值SNP2对比SNP3：0.002；p值SNP3对比SNP4：0.0005。
讨论
所述实施例证实了仅应用七个高区分性SNP来区分15种已知引起致命性疾病如败血症的细菌种类的有用性。结果还表明，本发明的方法是高度特异性和快速的，这两者都是DNA诊断分析的重要要求。所述方法基于包含高度区分性SNP的PCR产物的DNA熔解曲线，准确确定两个分离株是相同还是不同。对这些遗传靶标的询问意味着，这种方法特别适合于适应新兴技术，例如“芯片实验室”装置和专用的全自动实时PCR机。与微流体学中快速发展的创新相结合，本发明的方法适合于转移到适用于“即时护理”诊断的装置上。
实施例2
为了证明本发明的有用性，通过标准临床微生物学和本发明的方法评估了200例血液培养阳性的患者样品。
通过在实验室中使用BacTAlert系统通过常规血液培养程序进行标准的临床微生物学测试，然后使用MALDI生物分型仪方法进行细菌种类鉴定。这涉及将BacTAlert血液培养瓶放入自动连续监测的培养箱中，并进行5-7天的孵育。一旦将血液培养瓶标记为阳性(至少孵育12小时)，就从BacTAlert仪器中取出所述瓶，取出等分的生长培养基，并在细菌培养琼脂板上进行亚培养。将琼脂平板在37℃下孵育至少4小时，或直到出现可见的生长。此后，将单个细菌菌落置于目标平板上，并加入基质溶液。将所述平板插入生物定型仪中，并通过软件生成MALDI-TOF光谱。光谱与参考库相匹配以提供细菌鉴定。此过程的总时间约为16-18小时。标准临床微生物学测试由Pathology Queensland进行。
根据本发明使用的方法是在BacTAlert血液培养机上孵育5天后，从100个血液培养阴性样品中收集血液培养液(1mL)，并储存在4℃直至提取。Pathology Queensland的诊断微生物学部门的工作人员还从200个血液培养阳性样品中收集了血液培养液(1mL)，并储存在4℃下直至提取DNA。使用MolYsisTM Complete 5试剂盒(Molzym Life Science,Germany)从所有样品(血液培养阴性和血液培养阳性)中分离微生物DNA，所述试剂盒能够从1mL样品中去除宿主DNA、富集病原体和提取DNA。
使用实时PCR形式对所有300种DNA提取物进行如下测试：将1微升提取的DNA(1至3ng)添加到19μl的反应预混液中，其含有10μl的2x SYBR green PCR Mastermix(LifeTechnologies，Australia)和8pmol的每种引物。这些反应的温度循环如下：50℃持续2分钟，95℃持续2分钟，随后是95℃持续15秒、52℃持续20秒和72℃持续35秒的40个循环，在72℃下维持2分钟，在50℃下维持20秒，HRM：以0.05℃从65℃渐升到95℃(RotorGeneQ,Qiagen,Australia)。所有样品均一式两份运行，包括相关对照(无模板(NTC))和由每个测试细菌种类的细菌参照DNA组成的阳性对照。获得结果的时间记录为±3.5小时。
在研究结束时，将结果制成表格并与从Pathology Queensland获得的血液培养微生物学结果相关联。
结果
表12提供了试验的结果。
表12-本发明的方法与临床微生物学结果之间的相关性(病理学QLD试验)。在200个血液培养阳性患者样品中代表了10种细菌种类。
Figure BDA0002369320530000781
Figure BDA0002369320530000791
有利地，当与临床微生物学结果相比时，本发明的方法能够获得99％的特异性(但是，尚不清楚对于其中临床微生物学和本发明的方法获得不同结果的两个样品，哪种方法产生了错误的结果)。本发明的方法能够在约3.5小时内获得结果，并且对患者样品的处理最少。相反，临床微生物学结果需要对患者样品进行更繁琐的处理，并花费了大约16-18小时。
引用文献
Anderson&Borreson,1995,Diagnostic Molecular Pathology,4:203-211.
Andersson,P.等人,2009,Antimicrob.Agents Chemother.53:2679-2683.
Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.1994-1998.
Bullock,G.R.等人,1985,Techniques in Immunocytochemistry,AcademicPress,Orlando,Fla.第1卷(1982),第2卷(1983),第3卷(1985).
Chard,T.,1986,An Introduction to Radioimmunoassay and RelatedTechniques,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands(1986)
Chee等人,1996,Science 274:610-613.
Chumanov,G."Surface Enhanced Raman Scattering(SERS)for Discoveringand Scoring Single Based Differences in DNA"Proc.Volume SPIE,3608(1999).
Cotton等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:4397.
Cronin等人,1996,Human Mut.7:244-255.
De Risi等人,1996,Nat.Genet.14:457-460.
DeRisi等人,1997,Science 270:680-686.
Deveraux等人,1984,Nucleic Acids Research 12,387-395.
Drmanac和Drmanac,1999,Methods Enzymol.303:165-178
Drmanac等人,1993,Science 260:1649-1652.
Drmanac等人,1998,Nature Biotech.16:54-58.
Gibbs等人,1989,Nucleic Acids Research,17:2347.
Gibbs,R.A.和Caskey,T.,1987,Science,236:303-305.
Ginot,1997,Human Mutation 10:1-10.
Hacia等人,1996,Nat.Genet.14:441-447.
Jobs等人,2003,Genome Res 13:916-924.
Karlowsky,J.A.等人(2004)Ann Clin Microbiol Antimicrob.10；3:7.
Kim S.&Misra A.2007,Ann Rev Biomed Eng.9:289-320.
Kneipp,K,1997,Physical Review Letters,78(9):1667-1670.
Komher,J.S.等人,1989,Nucl.Acids.Res.17:7779-7784.
Kumar,D.等人,2006,Genet.Mol.Biol,29(2):287-289.
Kuppuswamy,M.N.等人,1991Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:1143-1147.
Levy等人,2003,Critical Care Medicine,31:1250-1256.
Liu等人,1996,J.Am.Chem.Soc.118:1587-1594.
Lockhart等人,1996,Nature Biotechnol.14:1675-1680.
Lu,A.L.和Hsu,I.C.,1992,Genomics,14(2):249-255.
Lyamichev,V.等人,1999,Nat Biotechnol,17:292-296.
Maxam,A.M.等人,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)74:560.
Merchant-Patel,S.等人,2008,Int.J.Food Microbiol.,128:304-308.
Merchant-Patel,S.,Blackall,P.J.,Templeton,J.,Price,E.P.,Tong,S.Y.C.,Huygens,F.,和Giffard,P.M.,2010,Applied and Environmental Microbiology.,76(2):493-499.
Meyers,R.M.等人,1985Science,230:1242-1246.
Milosavljevic等人,1996,Genomics,37:77-86.
Modrich,1991,Ann.Rev.Genet.,25:229-253.
Nagamine,C.M.等人,1989,Am.J.Hum.Genet,45:337-339.
Newton等人,1989,Nucl.Acids Res.17:2503-2516.
Novack等人,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:586.
Nyren,P.等人,1993Anal.Biochem.208:171-175.
Orita,M.等人,1989,Proc Natl Acad Sci USA,86:2766.
Prezant,T.R.等人,1992Hum.Mutat.1:159-164.
Price,E.P.等人,2007,Appln.Environ.Microbiol,72:7793-7803.
Prince,J.A.等人,2001Genome Res,11(1):152-162.
Protocols for Oligonucleotides and Analogues；Synthesis andProperties”,Methods in Molecular Biology Series,Volume 20,Ed.Sudhir Agrawal,Humana ISBN:0-89603-247-7,1993.
Ramsay,1998,Nature Biotech.16:40-44.
Reinhart等人,2012,Clinical Microbiology Reviews 25(4):609-634.
Saleeba,J.A.等人,1992Huma.Mutat,1:63-69
Salimullah等人,2005,Cellular and Mol.Biol.Letts,10:237-245
Sapolsky和Lishutz,1996,Genomics 33:445-456
Schena等人,1995,Science 270:467.
Shalon等人,1996,Genome Res.6:639.
Sheffield等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:232-236
Shenk等人,1975,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72:989.
Shoemaker等人,1996,Nat.Genet.14:450-456.
Smith-Sorenson等人,1993,Human Mutation 2:274-285.
Sokolov,B.P.,1990,Nucl.Acids Res.18:3671.
Sooknanan等人,1994,Biotechniques 17:1077-1080.
Stephens,A.J.,Inman-Bamber,J.,Giffard,P.M.,和Huygens,F.,2008,ClinicalChemistry.54(2):432-436.
Figure BDA0002369320530000821
A.C等人,1990Genomics,8:684-692.
Figure BDA0002369320530000822
A.C等人,1993,Amer.J.Hum.Genet.52:46-59.
Figure BDA0002369320530000823
A.C.,2001,Nat.Rev.Genet.2,930-942.
Thelwell等人,2000Nucleic Acid Res.28(19):3752-3761.
Tijssen,P.,1985,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays:LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands.
Tyagi等人,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5395-5400.
Tyagi,S和Kramer,F.R.,1996,Nat.Biotechnol,14:303-308
Ugozzoli,L.等人,1992,GATA,9:107-112.
Wartell等人,1990Nucl.Acids Res.18:2699-2705
Weisburg WG等人,(1991)J Bacteriol.173(2):697-703.
Wodicka等人,1997,Nat.Biotech.15:1-15.
Xiao和Kwok,2003,Genome Research,13(5):932-939.
Yershov等人,1996,Genetics 93:4913-4918.
序列表
<110> 麦克罗比奥私人有限公司
<120> 生物标志物及其用途
<130> 170537PC
<150> AU2017901846
<151> 2017-05-17
<160> 57
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 1542
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 1
aaattgaaga gtttgatcat ggctcagatt gaacgctggc ggcaggccta acacatgcaa 60
gtcgaacggt aacaggaaga agcttgcttc tttgctgacg agtggcggac gggtgagtaa 120
tgtctgggaa actgcctgat ggagggggat aactactgga aacggtagct aataccgcat 180
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cgggaactca aaggagactg ccagtgataa actggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1200
atcatggccc ttacgaccag ggctacacac gtgctacaat ggcgcataca aagagaagcg 1260
acctcgcgag agcaagcgga cctcataaag tgcgtcgtag tccggattgg agtctgcaac 1320
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agcttaacct tcgggagggc gcttaccact ttgtgattca tgactggggt gaagtcgtaa 1500
caaggtaacc gtaggggaac ctgcggttgg atcacctcct ta 1542
<210> 2
<211> 1555
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 2
ttttatggag agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca 60
agtcgagcga acggacgaga agcttgcttc tctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac 120
acgtggataa cctacctata agactgggat aacttcggga aaccggagct aataccggat 180
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agcagtaggg aatcttccgc aatgggcgaa agcctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat 420
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cacatcttga cggtacctaa tcagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 540
atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgcgcgt aggcggtttt 600
ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtggaggg tcattggaaa ctggaaaact 660
tgagtgcaga agaggaaagt ggaattccat gtgtagcggt gaaatgcgca gagatatgga 720
ggaacaccag tggcgaaggc gactttctgg tctgtaactg acgctgatgt gcgaaagcgt 780
ggggatcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 840
ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt 900
acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggagcatg 960
tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaaatct tgacatcctt tgacaactct 1020
agagatagag ctttcccctt cgggggacaa agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1080
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttaag cttagttgcc 1140
atcattaagt tgggcactct aagttgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1200
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgatttg ggctacacac gtgctacaat ggacaataca 1260
aagggcagcg aaaccgtgag gtcaagcaaa tcccataaag ttgttctcag ttcggattgt 1320
agtctgcaac tcgactacat gaagctggaa tcgctagtaa tcgtagatca gcatgctacg 1380
gtgaatacgt tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1440
cgaagccggt ggagtaacct tttaggagct agccgtcgaa ggtgggacaa atgattgggg 1500
tgaagtcgta acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc tttct 1555
<210> 3
<211> 1554
<212> DNA
<213> 表皮葡萄球菌
<400> 3
ttttatggag agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca 60
agtcgagcga acagacgagg agcttgcttc tctgacgtta gcggcggacg ggtgagtaac 120
acgtggataa cctacctata agactgggat aacttcggga aaccggagct aataccggat 180
aatatattga accgcatggt tcaatagtga aagacggttt tgctgtcact tatagatgga 240
tccgcgccgc attagctagt tggtaaggta acggcttacc aaggcaacga tgcgtagccg 300
acctgagagg gtgatcggcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc 360
agcagtaggg aatcttccgc aatgggcgaa agcctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat 420
gaaggtcttc ggatcgtaaa actctgttat tagggaagaa caaatgtgta agtaactatg 480
cacgtcttga cggtacctaa tcagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 540
atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgcgcgt aggcggtttt 600
ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtggaggg tcattggaaa ctggaaaact 660
tgagtgcaga agaggaaagt ggaattccat gtgtagcggt gaaatgcgca gagatatgga 720
ggaacaccag tggcgaaggc gactttctgg tctgtaactg acgctgatgt gcgaaagcgt 780
ggggatcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 840
ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt 900
acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggagcatg 960
tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaaatct tgacatcctc tgacccctct 1020
agagatagag ttttcccctt cgggggacag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1080
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttaag cttagttgcc 1140
atcattaagt tgggcactct aagttgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1200
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgatttg ggctacacac gtgctacaat ggacaataca 1260
aagggcagcg aaaccgcgag gtcaagcaaa tcccataaag ttgttctcag ttcggattgt 1320
agtctgcaac tcgactatat gaagctggaa tcgctagtaa tcgtagatca gcatgctacg 1380
gtgaatacgt tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1440
cgaagccggt ggagtaacca tttggagcta gccgtcgaag gtgggacaaa tgattggggt 1500
gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttct 1554
<210> 4
<211> 1514
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌
<400> 4
gtttgatcct ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtagaacgct 60
gaaggaggag cttgcttctc tggatgagtt gcgaacgggt gagtaacgcg taggtaacct 120
gcctggtagc gggggataac tattggaaac gatagctaat accgcataag agtggatgtt 180
gcatgacatt tgcttaaaag gtgcacttgc atcactacca gatggacctg cgttgtatta 240
gctagttggt ggggtaacgg ctcaccaagg cgacgataca tagccgacct gagagggtga 300
tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc 360
ttcggcaatg gacggaagtc tgaccgagca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggat 420
cgtaaagctc tgttgtaaga gaagaacgag tgtgagagtg gaaagttcac actgtgacgg 480
tatcttacca gaaagggacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtccc 540
gagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggttagata agtctgaagt 600
taaaggctgt ggcttaacca tagtaggctt tggaaactgt ttaacttgag tgcaagaggg 660
gagagtggaa ttccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaggaa caccggtggc 720
gaaagcggct ctctggcttg taactgacgc tgaggctcga aagcgtgggg agcaaacagg 780
attagatacc ctggtagtcc acgctgtaaa cgatgagtgc taggtgttag accctttccg 840
gggtttagtg ccgtagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt 900
gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 960
gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atccctctga ccgctctaga gatagagttt 1020
tccttcggga cagaggtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1080
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaacccc tattgttagt tgccatcatt cagttgggca 1140
ctctagcgag actgccggta ataaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg 1200
ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggctgg tacaacgagt cgcaagccgg 1260
tgacggcaag ctaatctctt aaagccagtc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct 1320
acatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg 1380
gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta 1440
accgtaagga gccagccgcc taaggtggga tagatgattg gggtgaagtc gtaacaaggt 1500
agccgtatcg gaag 1514
<210> 5
<211> 1501
<212> DNA
<213> 无乳链球菌
<400> 5
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtagaac gctgaggttt ggtgtttaca 60
ctagactgat gagttgcgaa cgggtgagta acgcgtaggt aacctgcctc atagcggggg 120
ataactattg gaaacgatag ctaataccgc ataagagtaa ttaacacatg ttagttattt 180
aaaaggagca attgcttcac tgtgagatgg acctgcgttg tattagctag ttggtgaggt 240
aaaggctcac caaggcgacg atacatagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgg caatggacgg 360
aagtctgacc gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420
ttagagaaga acgttggtag gagtggaaaa tctaccaagt gacggtaact aaccagaaag 480
ggacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtcccgagcg ttgtccggat 540
ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ctttaagtct gaagttaaag gcagtggctt 600
aaccattgta cgctttggaa actggaggac ttgagtgcag aaggggagag tggaattcca 660
tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aggaacaccg gtggcgaaag cggctctctg 720
gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt 780
agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaggt gttaggccct ttccggggct tagtgccgca 840
gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat 900
tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 960
ttaccaggtc ttgacatcct tctgaccggc ctagagatag gctttctctt cggagcagaa 1020
gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1080
aacgagcgca acccctattg ttagttgcca tcattaagtt gggcactcta gcgagactgc 1140
cggtaataaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 1200
gctacacacg tgctacaatg gttggtacaa cgagtcgcaa gccggtgacg gcaagctaat 1260
ctcttaaagc caatctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat 1320
cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1380
cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttaggagcca 1440
gccgcctaag gtgggataga tgattggggt gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag 1500
g 1501
<210> 6
<211> 1543
<212> DNA
<213> 化脓性链球菌
<400> 6
gagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtagaa 60
cgctgagaac tggtgcttgc accggttcaa ggagttgcga acgggtgagt aacgcgtagg 120
taacctacct catagcgggg gataactatt ggaaacgata gctaataccg cataagagag 180
actaacgcat gttagtaatt taaaaggggc aattgctcca ctatgagatg gacctgcgtt 240
gtattagcta gttggtgagg taaaggctca ccaaggcgac gatacatagc cgacctgaga 300
gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag 360
ggaatcttcg gcaatggggg caaccctgac cgagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggttt 420
tcggatcgta aagctctgtt gttagagaag aatgatggtg ggagtggaaa atccaccaag 480
tgacggtaac taaccagaaa gggacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540
ggtcccgagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tttttaagtc 600
tgaagttaaa ggcattggct caaccaatgt acgctttgga aactggagaa cttgagtgca 660
gaaggggaga gtggaattcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaggaacacc 720
ggtggcgaaa gcggctctct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc gtggggagca 780
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctagg tgttaggccc 840
tttccggggc ttagtgccgg agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc 900
aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960
ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc cgatgcccgc tctagagata 1020
gagttttact tcggtacatc ggtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080
agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccctatt gttagttgcc atcattaagt 1140
tgggcactct agcgagactg ccggtaataa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200
atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggttggtaca acgagtcgca 1260
agccggtgac ggcaagctaa tctcttaaag ccaatctcag ttcggattgt aggctgcaac 1320
tcgcctacat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt 1380
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440
gaggtaacct attaggagcc agccgcctaa ggtgggatag atgattgggg tgaagtcgta 1500
acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc ttt 1543
<210> 7
<211> 1522
<212> DNA
<213> 粪肠球菌
<400> 7
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac 60
gcttctttcc tcccgagtgc ttgcactcaa ttggaaagag gagtggcgga cgggtgagta 120
acacgtgggt aacctaccca tcagaggggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgc 180
ataacagttt atgccgcatg gcataagagt gaaaggcgct ttcgggtgtc gttgatggat 240
ggacccgcgg tgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcca cgatgcatag 300
ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 360
ggcagcagta gggaatcttc ggcaatggac gaaagtctga ccgagcaacg ccgcgtgagt 420
gaagaaggtt ttcggatcgt aaaactctgt tgttagagaa gaacaaggac gttagtaact 480
gaacgtcccc tgacggtatc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 540
gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt 600
ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggag 660
acttgagtgc agaagaggag agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat 720
ggaggaacac cagtggcgaa ggcggctctc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag 780
cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 840
gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgctg cagcaaacgc attaagcact ccgcctgggg 900
agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 960
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctttgaccac 1020
tctagagata gagctttccc ttcggggaca aagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1080
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tgttagttgc 1140
catcatttag ttgggcactc tagcgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1200
gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tgggaagtac 1260
aacgagtcgc tagaccgcga ggtcatgcaa atctcttaaa gcttctctca gttcggattg 1320
caggctgcaa ctcgcctgca tgaagccgga atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc 1380
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1440
ccgaagtcgg tgaggtaacc tttttggagc cagccgccta aggtgggata gatgattggg 1500
gtgaagtcgt aacaaggtag cc 1522
<210> 8
<211> 1551
<212> DNA
<213> 屎肠球菌
<400> 8
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctatacatgc aagtcgaacg 60
cttctttttc caccggagct tgctccaccg gaaaaagagg agtggcgaac gggtgagtaa 120
cacgtgggta acctgcccat cagaaaggga taacacttgg aaacaggtgc taataccgta 180
taacaaatca aaaccgcatg gttttgattt gaaaggcgct ttcgggtgtc gctgatggat 240
ggacccgcgg tgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcca cgatgcatag 300
ccgcacctga gagggtgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctctacggga 360
ggcagcagta gggaatcttc ggcaatggac gaaagtctga ccgagcaacg ccgcgtgagt 420
gaagaaggtt ttcggatcgt aaaactctgt tgttagagaa gaacaaggat gagagtaact 480
gttcatccct tgacggtatc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 540
gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt 600
tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactgggaga 660
cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg 720
gaggaacacc agtggcgaag gcggctctct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc 780
gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag 840
tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 900
gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 960
tgtggtttaa ttcgaagcaa cacgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tttgaccact 1020
ctagagatag agcttcccct tcgggggcaa agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1080
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatt gttagttgcc 1140
atcattcagt tgggcactct agcaagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1200
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat gggaagtaca 1260
acgagttgcg aagtcgcgag gctaagctaa tctcttaaag cttctctcag ttcggattgc 1320
aggctgcaac tcgcctgcat gaagccggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg 1380
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc 1440
gaagtcggtg aggtaacctt ttggagccag ccgcctaagg tgggatagat gattggggtg 1500
aagtcgtaac aaggtagccg tatctgaagg tgcggctgga tcacctcctt t 1551
<210> 9
<211> 1542
<212> DNA
<213> 奇异变形杆菌
<400> 9
aattgaagag tttgatcatg gctcagattg aacgctggcg gcaggcctaa cacatgcaag 60
tcgagcggta acaggagaaa gcttgctttc ttgctgacga gcggcggacg ggtgagtaat 120
gtatggggat ctgcccgata gagggggata actactggaa acggtggcta ataccgcata 180
atgtctacgg accaaagcag gggctcttcg gaccttgcac tatcggatga acccatatgg 240
gattagctag taggtggggt aaaggctcac ctaggcgacg atctctagct ggtctgagag 300
gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg 360
gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg cagccatgcc gcgtgtatga agaaggcctt 420
agggttgtaa agtactttca gcggggagga aggtgataag gttaataccc ttgtcaattg 480
acgttacccg cagaagaagc accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 540
gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcacg caggcggtca attaagtcag 600
atgtgaaagc cccgagctta acttgggaat tgcatctgaa actggttggc tagagtcttg 660
tagagggggg tagaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaataccg 720
gtggcgaagg cggccccctg gacaaagact gacgctcagg tgcgaaagcg tggggagcaa 780
acaggattag ataccctggt agtccacgct gtaaacgatg tcgatttaga ggttgtggtc 840
ttgaaccgtg gcttctggag ctaacgcgtt aaatcgaccg cctggggagt acggccgcaa 900
ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 960
cgatgcaacg cgaagaacct tacctactct tgacatccag cgaatccttt agagatagag 1020
gagtgccttc gggaacgctg agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgaa 1080
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcct ttgttgccag cacgtaatgg 1140
tgggaactca aaggagactg ccggtgataa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1200
atcatggccc ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat ggcagataca aagagaagcg 1260
acctcgcgag agcaagcgga actcataaag tctgtcgtag tccggattgg agtctgcaac 1320
tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtagatca gaatgctacg gtgaatacgt 1380
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcaaa agaagtaggt 1440
agcttaacct tcgggagggc gcttaccact ttgtgattca tgactggggt gaagtcgtaa 1500
caaggtaacc gtaggggaac ctgcggttgg atcacctcct ta 1542
<210> 10
<211> 1505
<212> DNA
<213> 粘质沙雷氏菌
<400> 10
gctcagattg aacgctggcg gcaggcttaa cacatgcaag tcgagcggta gcacagggga 60
gcttgctccc tgggtgacga gcggcggacg ggtgagtaat gtctgggaaa ctgcctgatg 120
gagggggata actactggaa acggtagcta ataccgcata acgtcgcaag accaaagagg 180
gggaccttcg ggcctcttgc catcagatgt gcccagatgg gattagctag taggtggggt 240
aatggctcac ctaggcgacg atccctagct ggtctgagag gatgaccagc cacactggaa 300
ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc 360
aagcctgatg cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggcctt cgggttgtaa agcactttca 420
gcgaggagga aggtggtgag cttaatacgt tcatcaattg acgttactcg cagaagaagc 480
accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt taatcggaat 540
tactgggcgt aaagcgcacg caggcggttt gttaagtcag atgtgaaatc cccgggctca 600
acctgggaac tgcatttgaa actggcaagc tagagtctcg tagagggggg tagaattcca 660
ggtgtagcgg tgaaatgcgt agagatctgg aggaataccg gtggcgaagg cgggcccctg 720
gacgaagact gacgctcagg tgccaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt 780
agtccacgct gtaaacgatg tcgatttgga ggttgtgccc ttgaggcgtg gcttccggag 840
ctaacgcgtt aaatcgaccg cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt 900
gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct 960
tacctactct tgacatccag agaactttcc agagatggat tggtgccttc gggaactctg 1020
agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgaa atgttgggtt aagtcccgca 1080
acgagcgcaa cccttatcct ttgttgccag cggttcggcc gggaactcaa aggagactgc 1140
cagtgataaa ctggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacgagtagg 1200
gctacacacg tgctacaatg gcatatacaa agagaagcga cctcgcgaga gcaagcggac 1260
ctcataaagt atgtcgtagt ccggattgga gtctgcaact cgactccatg aagtcggaat 1320
cgctagtaat cgtagatcag aatgctacgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1380
cccgtcacac catgggagtg ggttgcaaaa gaagtaggta gcttaacctt cgggagggcg 1440
cttaccactt tgtgattcat gactggggtg aagtcgtaac aaggtaaccg taggggaacc 1500
tgcgg 1505
<210> 11
<211> 1438
<212> DNA
<213> 产气肠杆菌
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (1425)..(1425)
<223> n为a、c、g或t
<400> 11
acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgagcggtag cacagagagc ttgctctcgg 60
gtgacgagcg gcggacgggt gagtaatgtc tgggaaactg cctgatggag ggggataact 120
actggaaacg gtagctaata ccgcataacg tcgcaagacc aaagtggggg accttcgggc 180
ctcatgccat cagatgtgcc cagatgggat tagctagtag gtggggtaat ggctcaccta 240
ggcgacgatc cctagctggt ctgagaggat gaccagccac actggaactg agacacggtc 300
cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag 360
ccatgccgcg tgtatgaaga aggccttcgg gttgtaaagt actttcagcg aggaggaagg 420
cgttaaggtt aataaccttg gcgattgacg ttactcgcag aagaagcacc ggctaactcc 480
gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa 540
gcgcacgcag gcggtctgtc aagtcggatg tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc 600
attcgaaact ggcaggctag agtcttgtag aggggggtag aattccaggt gtagcggtga 660
aatgcgtaga gatctggagg aataccggtg gcgaaggcgg ccccctggac aaagactgac 720
gctcaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780
aacgatgtcg acttggaggt tgtgcccttg aggcgtggct tccggagcta acgcgttaag 840
tcgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc 900
acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctactcttga 960
catccagaga acttagcaga gatgctttgg tgccttcggg aactctgaga caggtgctgc 1020
atggctgtcg tcagctcgtg ttgtgaaatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080
ttatcctttg ttgccagcgg tccggccggg aactcaaagg agactgccag tgataaactg 1140
gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac gagtagggct acacacgtgc 1200
tacaatggca tatacaaaga gaagcgacct cgcgagagca agcggacctc ataaagtatg 1260
tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc tagtaatcgt 1320
agatcagaat gctacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380
gggagtgggt tgcaaaagaa gtaggtagct taaccttcgg gaggncgctt taccactt 1438
<210> 12
<211> 1511
<212> DNA
<213> 阴沟肠杆菌
<400> 12
tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgaacgg tagcacagag agcttgctct 60
cgggtgacga gtggcggacg ggtgagtaat gtctgggaaa ctgcctgatg gagggggata 120
actactggaa acggtagcta ataccgcata aygtcgcaag accaaagagg gggaccttcg 180
ggcctcttgc catcagatgt gcccagatgg gattagctag taggtggggt aacggctcac 240
ctaggcgacg atccctagct ggtctgagag gatgaccagc cacactggaa ctgagacacg 300
gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg 360
cagccatgcc gcgtgtatga agaaggcctt cgggttgtaa agtactttca gcggggagga 420
aggtgttgtg gttaataacc gcagcaattg acgttacccg cagaagaagc accggctaac 480
tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt 540
aaagcgcacg caggcggtct gtcaagtcgg atgtgaaatc cccgggctca acctgggaac 600
tgcattcgaa actggcaggc tggagtcttg tagagggggg tagaattcca ggtgtagcgg 660
tgaaatgcgt agagatctgg aggaataccg gtggcgaagg cggccccctg gacaaagact 720
gacgctcagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780
gtaaacgatg tcgatttgga ggttgtgccc ttgaggcgtg gcttccggag ctaacgcgtt 840
aaatcgaccg cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctggtct 960
tgacatccac agaactttcc agagatggat tggtgccttc gggaactgtg agacaggtgc 1020
tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgaa atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080
cccttatcct ttgttgccag cggtccggcc gggaactcaa aggagactgc cagtgataaa 1140
ctggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacgaccagg gctacacacg 1200
tgctacaatg gcgcatacaa agagaagcga cctcgcgaga gcaagcggac ctcataaagt 1260
gcgtcgtagt ccggattgga gtctgcaact cgactccatg aagtcggaat cgctagtaat 1320
cgtagatcag aatgctacgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380
catgggagtg ggttgcaaaa gaagtaggta gcttaacctt cgggagggcg cttaccactt 1440
tgtgattcat gactggggtg aagtcgtaac aaggtaaccg taggggaacc tgcggctgga 1500
tcacctcctt g 1511
<210> 13
<211> 1534
<212> DNA
<213> 肺炎克雷伯菌
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (11)..(12)
<223> n为a、c、g或t
<400> 13
agagtttgat nntggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60
ggtagcacag agagcttgct ctcgggtgac gagcggcgga cgggtgagta atgtctggga 120
aactgcctga tggaggggga taactactgg aaacggtagc taataccgca taacgtcgca 180
agaccaaagt gggggacctt cgggcctcat gccatcagat gtgcccagat gggattagct 240
agtaggtggg gtaacggctc acctaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgacca 300
gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360
cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggcc ttcgggttgt 420
aaagcacttt cagcggggag gaaggcgatg aggttaataa cctcatcgat tgacgttacc 480
ctgcagaaga agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcaag 540
cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc acgcaggcgg tctgtcaagt cggatgtgaa 600
atccccgggc tcaacctggg aactgcattc gaaactggca ggctagagtc ttgtagaggg 660
gggtagaatt ccaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc tggaggaata ccggtggcga 720
aggcggcccc ctggacaaag actgacgctc aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgtcgattt ggaggttgtg cccttgaggc 840
gtggcttccg gagctaacgc gttaaatcga ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa 900
actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgca 960
acgcgaagaa ccttacctgg tcttgacatc cacagaactt tccagagatg gattggtgcc 1020
ttcgggaact gtgagacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgttgt gaaatgttgg 1080
gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat cctttgttgc cagcggttag gccgggaact 1140
caaaggagac tgccagtgat aaactggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc 1200
ccttacgacc agggctacac acgtgctaca atggcatata caaagagaag cgacctcgcg 1260
agagcaagcg gacctcataa agtatgtcgt agtccggatt ggagtctgca actcgactcc 1320
atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtagat cagaatgcta cggtgaatac gttcccgggc 1380
cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgca aaagaagtag gtagcttaac 1440
cttcgggagg gcgcttacca ctttgtgatt catgactggg gtgaagtcgt aacaaggtaa 1500
ccgtagggga acctgcggtt ggatcacctc cttt 1534
<210> 14
<211> 1536
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 14
gaactgaaga gtttgatcat ggctcagatt gaacgctggc ggcaggccta acacatgcaa 60
gtcgagcgga tgaagggagc ttgctcctgg attcagcggc ggacgggtga gtaatgccta 120
ggaatctgcc tggtagtggg ggataacgtc cggaaacggg cgctaatacc gcatacgtcc 180
tgagggagaa agtgggggat cttcggacct cacgctatca gatgagccta ggtcggatta 240
gctagttggt ggggtaaagg cctaccaagg cgacgatccg taactggtct gagaggatga 300
tcagtcacac tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 360
ttggacaatg ggcgaaagcc tgatccagcc atgccgcgtg tgtgaagaag gtcttcggat 420
tgtaaagcac tttaagttgg gaggaagggc agtaagttaa taccttgctg ttttgacgtt 480
accaacagaa taagcaccgg ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac gaagggtgca 540
agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gcgcgtaggt ggttcagcaa gttggatgtg 600
aaatccccgg gctcaacctg ggaactgcat ccaaaactac tgagctagag tacggtagag 660
ggtggtggaa tttcctgtgt agcggtgaaa tgcgtagata taggaaggaa caccagtggc 720
gaaggcgacc acctggactg atactgacac tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 780
attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgtcgac tagccgttgg gatccttgag 840
atcttagtgg cgcagctaac gcgataagtc gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta 900
aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 960
caacgcgaag aaccttacct ggccttgaca tgctgagaac tttccagaga tggattggtg 1020
ccttcgggaa ctcagacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1080
gggttaagtc ccgtaacgag cgcaaccctt gtccttagtt accagcacct cgggtgggca 1140
ctctaaggag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg 1200
gcccttacgg ccagggctac acacgtgcta caatggtcgg tacaaagggt tgccaagccg 1260
cgaggtggag ctaatcccat aaaaccgatc gtagtccgga tcgcagtctg caactcgact 1320
gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtga atcagaatgt cacggtgaat acgttcccgg 1380
gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg ctccagaagt agctagtcta 1440
accgcaaggg ggacggttac cacggagtga ttcatgactg gggtgaagtc gtaacaaggt 1500
agccgtaggg gaacctgcgg ctggatcacc tcctta 1536
<210> 15
<211> 1497
<212> DNA
<213> 乙酸钙不动杆菌
<400> 15
tagagtttga tcctggctca gattgaacgc tggcggcagg cttaacacat gcaagtcgag 60
cggggaaagg tagcttgcta ctggacctag cggcggacgg gtgagtaatg cttaggaatc 120
tgcctattag tgggggacaa cattccgaaa ggaatgctaa taccgcatac gtcctacggg 180
agaaagcagg ggaccttcgg gccttgcgct aatagatgag cctaagtcgg attagctagt 240
tggtggggta aaggcctacc aaggcgacga tctgtagcgg tctgagagga tgatccgcca 300
cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 360
atggggggaa ccctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttat ggttgtaaag 420
cactttaagc gaggaggagg ctactagtat taatactact ggatagtgga cgttactcgc 480
agaataagca ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg tgcgagcgtt 540
aatcggattt actgggcgta aagcgtgcgt aggcggccat ttaagtcaaa tgtgaaatcc 600
ccgagcttaa cttgggaatt gcattgcata ctggatggct agagtatggg agaggatggt 660
agaattccag gtgtagcggt gaaatgcgta gagatctgga ggaataccga tggcgaaggc 720
agccatctgg cctaatactg acgctgaggt acgaaagcat gggagcagaa caggattaga 780
taccctggta gtccatgccg taaacgatgt ttactagccg ttggggcctt tgaggcttta 840
gtggcgcagc taacgcgata agtagaccgc ctggggagta cggtcgcaag actaaaactc 900
aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc 960
gaagaacctt acctggcctt gacatactag aaactttcca gagatggatt ggtgccttcg 1020
ggaatttaga tacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080
agtcccgcaa cgagcgcaac ccttttcctt acttgccagc atttcggatg ggaactttaa 1140
ggatactgcc agtgacaaac tggaggaagg cggggacgac gtcaagtcat catggccctt 1200
acggccaggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaaa gggttgctac ctagcgatag 1260
gatgctaatc tcaaaaagcc gatcgtagtc cggattggag tctgcaactc gactccatga 1320
agtcggaatc gctagtaatc gcggatcaga atgcccggtg atacgttccc gggccttgta 1380
cacaccgccc gtcacaccat gggagtttgt tgcaccagaa gtaggtagtc taaccgcaag 1440
gaggacgctt accacggtgt ggccgatgac tggggtgaag tcgtaacaag gtaacca 1497
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 16
cctcttgcca tcggatgtg 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 17
ccagtgtggc tggtcatcct 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 18
cctacgggag gcagcagtag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 19
gggaggcagc agtagggaat 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 20
cgatccgaaa accttcttca ct 22
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 21
aagacggtct tgctgtcact tataga 26
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 22
ctatgcatcg ttgccttggt aa 22
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 23
tgccgcgtga atgaagaa 18
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 24
gcgtgaagga tgaaggctct a 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 25
tgatgaaggt tttcggatcg t 21
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 26
tgatgtacta ttaacacatc aaccttcct 29
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 27
aacgctcgga tcttccgtat ta 22
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 28
cgctcgccac ctacgtatta c 21
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 29
gttgtaagag aagaacgagt gtgagagt 28
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 30
cgtagttagc cgtccctttc tg 22
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 31
gcggtttgtt aagtcagatg tgaa 24
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 32
ggtctgtcaa gtcggatgtg aa 22
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 33
tcaacctggg aactcattcg a 21
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 34
ggaattctac ccccctctac ga 22
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 35
ggaattctac ccccctctac aag 23
<210> 36
<211> 1720
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 36
ggaccgggcc tgtctaggta taagcaattt atacggtgaa actgcgaatg gctcattaaa 60
tcagttatcg tttatttgat agtaccttac tacatggata cctgtggtaa ttctagagct 120
aatacatgct aaaaacctcg acttcggaag gggtgtattt attagataaa aaaccaatgc 180
ccttcggggc tccttggtga atcataataa cttaacgaat cgcatggcct tgcgccggcg 240
atggttcatt caaatttctg ccctatcaac tttcgatggt aggatagtgg cctaccatgg 300
tggcaacggg taacggggaa ttagggttcg attccggaga gggagcctga gaaacggcta 360
ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccgacacgg ggaggtagtg 420
acaataaata ctgatacggg gctcttttgg gtctcgtaat tggaatgagt acaatctaaa 480
tcccttaacg aggaacaatt ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc 540
tccaatagcg tatattaaag ttgttgcagt taaaaagctc gtagttgaac cttgggtctg 600
gctggccggt ccgcctcacc gcgagtactg gtccggctgg acctttcctt ctggggaacc 660
tcatggcctt cactggctgt ggggggaacc aggactttta ctgtgaaaaa attagagtgt 720
tcaaagcagg cctttgctcg aatacattag catggaataa tagaatagga cgtgcggttc 780
tattttgttg gtttctagga ccgccgtaat gattaatagg gatagtcggg ggcgtcagta 840
ttcagctgtc agaggtgaaa ttcttggatt tgctgaagac taactactgc gaaagcattc 900
gccaaggatg ttttcattaa tcaggaacga aagttagggg atcgaagacg atcagatacc 960
gtcgtagtct taaccataaa ctatgccgac tagggatcgg gcggtgtttc tatgatgacc 1020
cgctcggcac cttacgagaa atcaaagttt ttgggttctg gggggagtat ggtcgcaagg 1080
ctgaaactta aagaaattga cggaagggca ccacaaggcg tggagcctgc ggcttaattt 1140
gactcaacac ggggaaactc accaggtcca gacaaaataa ggattgacag attgagagct 1200
ctttcttgat cttttggatg gtggtgcatg gccgttctta gttggtggag tgatttgtct 1260
gcttaattgc gataacgaac gagacctcgg cccttaaata gcccggtccg catttgcggg 1320
ccgctggctt cttaggggga ctatcggctc aagccgatgg aagtgcgcgg caataacagg 1380
tctgtgatgc ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgacagg gccagcgagt 1440
acatcacctt ggccgagagg tctgggtaat cttgttaaac cctgtcgtgc tggggataga 1500
gcattgcaat tattgctctt caacgaggaa tgcctagtag gcacgagtca tcagctcgtg 1560
ccgattacgt ccctgccctt tgtacacacc gcccgtcgct actaccgatt gaatggctcg 1620
gtgaggcctt cggactggct caggggagtt ggcaacgact ccccagagcc ggaaagttgg 1680
tcaaacccgg tcattagagg aaagaaaaaa ttaaacacgg 1720
<210> 37
<211> 1632
<212> DNA
<213> 白色念珠菌
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (1587)..(1587)
<223> n为a、c、g或t
<400> 37
tcagttatcg tttatttgat agtaccttac tacttggata accgtggtaa ttctagagct 60
aatacatgct taaaatcccg actgtttgga agggatgtat ttattagata aaaaatcaat 120
gccttcgggc tctttgatga ttcataataa cttttcgaat cgcatggcct tgtgctggcg 180
atggttcatt caaatttctg ccctatcaac tttcgatggt aggatagtgg cctaccatgg 240
tttcaacggg taacggggaa taagggttcg attccggaga gggagcctga gaaacggcta 300
ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccgacacgg ggaggtagtg 360
acaataaata acgatacagg gcccttttgg gtcttgtaat tggaatgagt acaatgtaaa 420
taccttaacg aggaacaatt ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc 480
tccaaaagcg tatattaaag ttgttgcagt taaaaagctc gtagttgaac cttgggcttg 540
gctggccggt ccatcttttt gatgcgtact ggacccagcc gagcctttcc ttctgggtag 600
ccatttatgg cgaaccagga cttttacttt gaaaaaatta gagtgttcaa agcaggcctt 660
tgctcgaata tattagcatg gaataataga ataggacgtt atggttctat tttgttggtt 720
tctaggacca tcgtaatgat taatagggac ggtcgggggt atcagtattc agttgtcaga 780
ggtgaaattc ttggatttac tgaagactaa ctactgcgaa agcatttacc aaggacgttt 840
tcattaatca agaacgaaag ttaggggatc gaagatgatc agataccgtc gtagtcttaa 900
ccataaacta tgccgactag ggatcggttg ttgttctttt attgacgcaa tcggcacctt 960
acgagaaatc aaagtctttg ggttctgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag 1020
gaattgacgg aagggcacca ccaggagtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg 1080
gaaactcacc aggtccagac acaataagga ttgacagatt gagagctctt tcttgatttt 1140
gtgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctgct taattgcgat 1200
aacgaacgag accttaacct actaaatagt gctgctagca tttgctggta tagtcacttc 1260
ttagagggac tatcgacttc aagtcgatgg aagtttgagg caataacagg tctgtgatgc 1320
ccttagacgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgacgga gccagcgagt ataagccttg 1380
gccgagaggt ctgggaaatc ttgtgaaact ccgtcgtgct ggggatagag cattgtaatt 1440
gttgctcttc aacgaggaat tcctagtaag cgcaagtcat cagcttgcgt tgattacgtc 1500
cctgcccttt gtacacaccg cccgtcgcta ctaccgattg aatggcttag tgaggcctcc 1560
ggattggttt aggaaagggg gcaactncat tctggaaccg agaagctggt caaacttggt 1620
catttagagg aa 1632
<210> 38
<211> 1732
<212> DNA
<213> 光滑念珠菌
<400> 38
agtatttgtc taaaaattaa gccatgcatg tctaagtata agcaatttat acagtgaaac 60
tgcgaatggc tcattaaatc agttatcgtt tatttgatag ttcctttact acatggtata 120
actgtggtaa ttctagagct aatacatgct taaaatctcg acctcttgga agagatgtat 180
ttattagata aaaaatcaat gtcttcggac tttttgatga ttcataataa cttttcgaat 240
cgcatggcct tgtgctggcg atggttcatt caaatttctg ccctatcaac tttcgatggt 300
aggatagtgg cctaccatgg tttcaacggg taacggggaa taagggttcg attccggaga 360
gggagcctga gaaacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat 420
cctgacacag ggaggtagtg acaataaata acgatacagg gcccattcgg gtcttgtaat 480
tggaatgagt acaatgtaaa taccttaacg aggaacaatt ggagggcaag tctggtgcca 540
gcagccgcgg taattccagc tccaatagcg tatattaaag ttgttgcagt taaaaagctc 600
gtagttgaac tttgggcctg ggtggccggt ccgatttttt cgtgtactgg aatgcacccg 660
ggcctttcct tctggctaac cccaagtcct tgtggcttgg cggcgaacca ggacttttac 720
tttgaaaaaa ttagagtgtt caaagcaggc gtattgctcg aatatattag catggaataa 780
tggaatagga cgtttggttc tattttgttg gtttctagga ccatcgtaat gattaatagg 840
gacggtcggg ggcatcagta ttcaattgtc agaggtgaaa ttcttggatt tattgaagac 900
taactactgc gaaagcattt gccaaggacg ttttcattaa tcaagaacga aagttagggg 960
atcgaagatg atcagatacc gtcgtagtct taaccataaa ctatgccgac tagggatcgg 1020
gtggtgtttt tttagtgacc cactcggcac cttacgagaa atcaaagtct ttgggttctg 1080
gggggagtat ggtcgcaagg ctgaaactta aaggaattga cggaagggca ccaccaggag 1140
tggagcctgc ggcttaattt gactcaacac ggggaaactc accaggtcca gacacaataa 1200
ggattgacag attgagagct ctttcttgat tttgtgggtg gtggtgcatg gccgttctta 1260
gttggtggag tgatttgtct gcttaattgc gataacgaac gagaccttaa cctactaaat 1320
agtggtgcta gcatttgctg gttgtccact tcttagaggg actatcggtt tcaagccgat 1380
ggaagtttga ggcaataaca ggtctgtgat gcccttagac gttctgggcc gcacgcgcgc 1440
tacactgacg gagccagcga gtctaacctt ggccgagagg tcttggtaat cttgtgaaac 1500
tccgtcgtgc tggggataga gcattgtaat tattgctctt caacgaggaa ttcctagtaa 1560
gcgcaagtca tcagcttgcg ttgattacgt ccctgccctt tgtacacacc gcccgtcgct 1620
agtaccgatt gaatggctta gtgaggcctc aggatctgct tagaagaggg ggcgactcca 1680
cttcagagcg gagaatctgg tcaaacttgg tcatttagag gaaacccaaa aa 1732
<210> 39
<211> 1223
<212> DNA
<213> 近平滑念珠菌
<400> 39
gcctgagaaa cggctaccac atccaaggaa ggcagcaggc gcgcaaatta cccaatcccg 60
acacggggag gtagtgacaa taaataacga tacagggccc tttcgggtct tgtaattgga 120
atgagtacaa tgtaaatacc ttaacgagga acaattggag ggcaagtctg gtgccagcag 180
ccgcggtaat tccagctcca aaagcgtata ttaaagttgt tgcagttaaa aagctcgtag 240
ttgaaccttg ggcttggctg gccggtccat cttttttgat gcgtactgga cccagccgag 300
cctttccttc tggctagcct ttttggcgaa ccaggacttt tactttgaaa aaattagagt 360
gttcaaagca ggcctttgct cgaatatatt agcatggaat aatagaatag gacgttatgg 420
ttctattttg ttggtttcta ggaccatcgt aatgattaat agggacggtc gggggtatca 480
gtattcagta gtcagaggtg aaattcttgg atttactgaa gactaactac tgcgaaagca 540
tttaccaagg acgttttcat taatcaagaa cgaaagttag gggatcgaag atgatcagat 600
accgtcgtag tcttaaccat aaactatgcc gactagggat cggttgttgt tcttttattg 660
acgcaatcgg caccttacga gaaatcaaag tctttgggtt ctggggggag tatggtcgca 720
aaggctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca ggagtggagc ctgcggctta 780
atttgactca acacggggaa actcaccagg tccagacaca ataaggattg acagattgag 840
agctctttct tgattttgtg ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt ggagtgattt 900
gtctgcttaa ttgcgataac gaacgagacc ttaacctact aaatagtgct gctagcattt 960
gctggtatag tcacttctta gagggactat cgatttcaag tcgatggaag tttgaggcaa 1020
taacaggtct gtgatgccct tagacgttct gggccgcacg cgcgctacac tgacggagcc 1080
agcgagtata aaccttggcc gagaggtctg ggaaatcttg tgaaactccg tcgtgctggg 1140
gatagagcat tgtaattatt gctcttcaac gaggaattcc tagtaagcgc aagtcatcag 1200
cttgcgttga ttacgtccct gcc 1223
<210> 40
<211> 1563
<212> DNA
<213> 热带念珠菌
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (69)..(69)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (627)..(627)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (631)..(631)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (674)..(674)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (684)..(684)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (699)..(699)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (704)..(704)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (723)..(822)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (866)..(866)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (1014)..(1014)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (1509)..(1509)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (1542)..(1542)
<223> n为a、c、g或t
<400> 40
atgcttgtct caagattaag ccatgcatgt ctaagtataa gcaatttata cagtgaaact 60
gcgaatggnt cattaaatca gttatcgttt atttgatagt accttactac ttggataacc 120
gtggtaattc tagagctaat acatgcttaa aatcccgact gtttggaagg gatgtattta 180
ttagataaaa aatcaatgtc ttcggactct ttgatgattc ataataactt ttcgaatcgc 240
atggccttgt gctggcgatg gttcattcaa atttctgccc tatcaacttt cgatggtagg 300
atagtggcct accatggttt caacgggtaa cggggaataa gggttcgatt ccggagaggg 360
agcctgagaa acggctacca catccaagga aggcagcagg cgcgcaaatt acccaatccc 420
gacacgggga ggtagtgaca ataaataacg atacagggcc ctttcgggtc ttgtaattgg 480
aatgagtaca atgtaaatac cttaacgagg aacaattgga gggcaagtct ggtgccagca 540
gcccgcggta attccagctt caaaagccgt atattaaagg tggttgcagt taaaaagctc 600
gtagttgaac cttgggcttt ggttggnccg nccatctttc tgaagcctac tggaccccaa 660
cccgagccct ttcntttggc taancctttt ggcgaaccng gacntttacc tttgaaaaaa 720
ttnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 780
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncgattagg gatcggttgt 840
tgttctttaa ttgacgccat tgggcncctt acgagaaatc aaaagtcttt gggttctggg 900
ggaagtatgg tcgcaaggtt gaaactttaa aggaattgac ggaagggcac caccaggagt 960
ggagcctgcg ggcttaattt gactcaacac ggggaaactc accaggtcca gacncaataa 1020
ggattgacag attgagagct ctttcttgat tttgtgggtg gtggtgcatg gccgttctta 1080
gttggtggag tgatttgtct gcttaattgc gataacgaac gagaccttaa cctactaaat 1140
agtgctgcta gcatttgctg gtatagtcac ttcttagagg gactatcgat ttcaagtcga 1200
tggaagtttg aggcaataac aggtctgtga tgcccttaga cgttctgggc cgcacgcgcg 1260
ctacactgac ggagccagcg agtataaacc ttggccgaga ggtctgggaa atcttgtgaa 1320
actccgtcgt gctggggata gagcattgta attgttgctc ttcaacgagg aattcctagt 1380
aagcgcaagt catcagcttg cgttgattac gtccctgccc tttgtacaca ccgcccgtcg 1440
ctactaccga ttgaatggct tagtgaggct tccggattgg tttaggaaag ggggcaactc 1500
cattctggna ccgagaagct agtcaaactc ggtcatttag ancaagtaaa agtcgaacaa 1560
ggt 1563
<210> 41
<211> 1801
<212> DNA
<213> 新型隐球菌
<400> 41
acctggttga tcctgccagt agtcatatgc ttgtctcaaa gattaagcca tgcatgtcta 60
agtataaacg aattcatact gtgaaactgc gaatggctca ttaaatcagt tatagtttat 120
ttgatggtat cttgctacat ggataactgt ggtaattcta gagctaatac atgctgaaaa 180
gccccgactt ctggaagggg tgtatttatt agataaaaaa ccaatgggtt tcggccctct 240
atggtgaatc ataataactt ctcgaatcgc atggccttgt gccggcgatg cttcattcaa 300
atatctgccc tatcaacttt cgatggtagg atagaggcct accatggtat caacgggtaa 360
cggggaatta gggttcgatt ccggagaggg agcctgagaa acggctacca catccaagga 420
aggcagcagg cgcgcaaatt acccaatccc gacacgggga ggtagtgaca ataaataaca 480
atacagggct cttttgggcc ttgtaattgg aatgagtaca atttaaatcc cttaacgagg 540
aacaactgga gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa ttccagctcc agtagcgtat 600
attaaagttg ttgcagttaa aaagctcgta gtcgaacttc aggtctggcg aggcggtcct 660
cctcacggag tgcactgtct tgctggacct tacctcctgg tggtcctgta tgctctttac 720
tgggtgtgca ggggaaccag gaattttacc ttgaaaaaat tagagtgttc aaagcaggca 780
atcgcccgaa tacattagca tggaataata gaataggacg tgcggttcta ttttgttggt 840
ttctaggatc gccgtaatga ttaataggga cggtcggggg cattggtatt ccgttgctag 900
aggtgaaatt cttagattga cggaagacca acaactgcga aagcatttgc caaggacgtt 960
ttcattgatc aagaacgaag gttaggggat caaaaacgat tagataccgt tgtagtctta 1020
acagtaaacg atgccgacta gggatcggcc cacgtcaatc tctgactggg tcggcacctt 1080
acgagaaatc aaagtctttg ggttctgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag 1140
gaattgacgg aagggcacca ccaggtgtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg 1200
gaaactcacc aggtccagac atagtgagga ttgacagatt gatagctctt tcttgattct 1260
atgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctggt taattccgat 1320
aacgaacgag accttaacct gctaaatagt caggccggct ttggctggtc gtatgacttc 1380
ttagagggac tgtcggcgtc tagtcgacgg aagtttgagg caataacagg tctgtgatgc 1440
ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgactga gccagcgagt cttaccgcct 1500
tggccgagag gcctgggtaa tcttgtgaaa ctcagtcgtg ctggggatag agcattgcaa 1560
ttattgctct tcaacgagga atacctagta agcgtgagtc accagctcgc gttgattacg 1620
tccctgccct ttgtacacac cgcccgtcgc tactaccgat tgaatggctt agtgagatct 1680
ccggattggc gttggggagc cggcaacggc accccttggc cgagaagttg atcaaacttg 1740
gtcatttaga ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc 1800
a 1801
<210> 42
<211> 1673
<212> DNA
<213> 镰刀菌属
<400> 42
gcaattatac cgcgaaactg cgaatggctc attatataag ttatcgttta tttgatagta 60
ccttactact tggataaccg tggtaattct agagctaata catgctaaaa atcccgactt 120
cggaagggat gtatttatta gattaaaaac caatgccctt cggggctcac tggtgattca 180
tgataactcc tcgaatcgca tggccttgtg ccggcgatgg ttcattcaaa tttcttccct 240
atcaactttc gatgtttggg tattggccaa acatggttgc aacgggtaac ggagggttag 300
ggctcgaccc cggagaagga gcctgagaaa cggctactac atccaaggaa ggcagcaggc 360
gcgcaaatta cccaatcccg acacggggag gtagtgacaa taaatactga tacagggctc 420
ttttgggtct tgtaattgga atgagtacaa tttaaatccc ttaacgagga acaattggag 480
ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata ttaaagttgt 540
tgtggttaaa aagctcgtag ttgaaccttg ggcctggccg tccggtccgc ctcaccgcgt 600
gtactggctc ggccgggcct ttccctctgt ggaaccccat gcccttcact gggcgtggcg 660
gggaaacagg acttttactg tgaaaaaatt agagtgctcc aggcaggcct atgctcgaat 720
acattagcat ggaataatag aataggacgt gtggttctat tttgttggtt tctaggaccg 780
ccgtaatgat taatagggac agtcgggggc atcagtattc aattgtcaga ggtgaaattc 840
ttggatttat tgaagactaa ctactgcgaa agcatttgcc aaggatgttt tcattaatca 900
ggaacgaaag ttaggggatc gaagacgatc agataccgtc gtagtcttaa ccataaacta 960
tgccgactag ggatcggacg gtgttatttt ttgacccgtt cggcacctta cgagaaatca 1020
aagtgcttgg gctccagggg gagtatggtc gcaaggctga aacttaaaga aattgacgga 1080
agggcaccac caggggtgga gcctgcggct taatttgact caacacgggg aaactcacca 1140
ggtccagaca caatgaggat tgacagattg agagctcttt cttgattttg tgggtggtgg 1200
tgcatggccg ttcttagttg gtggagtgat ttgtctgctt aattgcgata acgaacgaga 1260
ccttaacctg ctaaatagcc cgtattgctt tggcagtacg ctggcttctt agagggacta 1320
tcggctcaag ccgatggaag tttgaggcaa taacaggtct gtgatgccct tagatgttct 1380
gggccgcacg cgcgctacac tgacggagcc agcgagtact tccttgtccg aaaggtccgg 1440
gtaatcttgt taaactccgt cgtgctgggg atagagcatt gcaattattg ctcttcaacg 1500
aggaatccct agtaagcgca agtcatcagc ttgcgttgat tacgtccctg ccctttgtac 1560
acaccgcccg tcgctactac cgattgaatg gctcagtgag gcgtccggac tggcccagag 1620
aggtgggcaa ctaccactca gggccggaaa gctctccaaa ctcggtcatt aga 1673
<210> 43
<211> 1554
<212> DNA
<213> 炭疽芽孢杆菌
<400> 43
ttattggaga gtttgatcct ggctcaggat gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa 60
gtcgagcgaa tggattaaga gcttgctctt atgaagttag cggcggacgg gtgagtaaca 120
cgtgggtaac ctgcccataa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggata 180
acattttgaa ccgcatggtt cgaaattgaa aggcggcttc ggctgtcact tatggatgga 240
cccgcgtcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcaacga tgcgtagccg 300
acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 360
agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat 420
gaaggctttc gggtcgtaaa actctgttgt tagggaagaa caagtgctag ttgaataagc 480
tggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 540
aatacgtagg tggcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggtggttt 600
cttaagtctg atgtgaaagc ccacggctca accgtggagg gtcattggaa actgggagac 660
ttgagtgcag aagaggaaag tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatatgg 720
aggaacacca gtggcgaagg cgactttctg gtctgtaact gacactgagg cgcgaaagcg 780
tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt 840
gttagagggt ttccgccctt tagtgctgaa gttaacgcat taagcactcc gcctggggag 900
tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat 960
gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaaccc 1020
tagagatagg gcttctcctt cgggagcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1080
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca 1140
tcattwagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1200
cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa 1260
agagctgcaa gaccgcgagg tggagctaat ctcataaaac cgttctcagt tcggattgta 1320
ggctgcaact cgcctacatg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg 1380
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc 1440
gaagtcggtg gggtaacctt tttggagcca gccgcctaag gtgggacaga tgattggggt 1500
gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttct 1554
<210> 44
<211> 1610
<212> DNA
<213> 类鼻疽伯克氏菌
<400> 44
tctagatgcg tgctcgagcg gccgcccagt gctgcatgga tatctgctga attcggcttg 60
agcagtttga tcctggctca gattgaacgc tggcggcatg ccttacacat gcaagtcgaa 120
cggcagcacg ggcttcggcc tggtggcgag tggcgaacgg gtgagttata catcggagca 180
tgtcctgtag tgggggatag cccggcgaaa gccgaattaa taccgcatac gatctgagga 240
tgaaagcggg ggaccttcgg gcctcgcgct atagggttgg ccgatggctg attagctagt 300
tggtggggta aaggcctacc aaggcgacga tcagtagctg gtctgagagg acgaccagcc 360
acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aattttggac 420
aatgggcgca agcctgatcc agcaatgccg cgtgtgtgaa gaaggccttc gggttgtaaa 480
gcacttttgt ccggaaagaa atcattctgg ctaatacccg gagtggatga cggtaccgga 540
agaataagca ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcgagcgtt 600
aatcgggatt actgggcgta aagcgtgcgc aggcggtttg ctaagaccga tgtgaaatcc 660
ccgggctcaa cctgggaact gcattggtga ctggcaggct agagtatggc agaggggggt 720
agaattccac gtgtagcagt gaaatgcgta gagatgtgga ggaataccga tggcgaaggc 780
agccccctgg gccaatactg acgctcatgc acgaaagcgt ggggagaaaa caggattaga 840
taccctggta gtccacgccc taaacgatgt caactagttg ttggggattc atttccttag 900
taacgtagct aacgcgcgaa gttgaccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca 960
aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggatgatgtg gattaattcg atgcaacgcg 1020
aaaaacctta cctacccttg acatggtcgg aagcccgatg agagttgggc gtgctcgaaa 1080
gagaaccggc gcacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1140
aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcct tagttgctac gcaagagcac tctaaggaga 1200
ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcctcatgg cccttatggg 1260
tagggcttca cacgtcatac aatggtcgga acagagggtc gccaacccgc gagggggagc 1320
caatcccaga aaaccgatcg tagtccggat tgcactctgc aactcgagtg catgaagctg 1380
gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac 1440
accgcccgtc acaccatggg agtgggtttt accagaagtg gctagtctaa ccgcaaggag 1500
gacggtcacc acggtaggat tcatgactgg ggtgaagtcg taacaaggta gccgtagaag 1560
ccgaattcca gcacactggc ggccgttact actggatccg agctcgtacc 1610
<210> 45
<211> 1511
<212> DNA
<213> 肉毒梭菌
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (1)..(7)
<223> n为a、c、g或t
<400> 45
nnnnnnngag agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca 60
agtcgagcga tgaagcttcc ttcgggaagt ggattagcgg cggacgggtg agtaacacgt 120
gggtaacctg cctcaaagtg ggggatagcc ttccgaaagg aagattaata ccgcataata 180
taagagaatc gcatgatttt cttatcaaag atttattgct ttgagatgga cccgcggcgc 240
attagctagt tggtaaggta acggcttacc aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg 300
gtgatcggcc acattggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 360
aatattgcgc aatgggggag accctgacgc agcaacgccg cgtgggtgat gaaggtcttc 420
ggattgtaaa gccctgtttt ctaggacgat aatgacggta ctagaggagg aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcga gcgttgtccg gatttactgg 540
gcgtaaaggg tgcgtaggcg gatgtttaag tgggatgtga aatccccggg cttaacctgg 600
gggctgcatt ccaaactgga tatctagagt gcaggagagg aaagcggaat tcctagtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat taggaagaac accagtggcg aaggcggctt tctggactgt 720
aactgacgct gaggcacgaa agcgtgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatggatact aggtgtaggg ggtatcaact ccccctgtgc cgcagttaac 840
acaataagta tcccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcagcgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacct 960
ggacttgaca tcccttgcat agcctagaga taggtgaagc ccttcggggc aaggagacag 1020
gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgtta ggttaagtcc tgcaacgagc 1080
gcaacccttg ttattagttg ctaccattaa gttgagcact ctaatgagac tgcctgggta 1140
accaggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgtcca gggctacaca 1200
cgtgctacaa tggtaggtac aataagacgc aagaccgtga ggtggagcaa aacttataaa 1260
acctatctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagctgga gttgctagta 1320
atcgcgaatc agaatgtcgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgccccgtca 1380
caccatgaga gctggtaaca cccgaagtcc gtgaggtaac cgtaaggagc cagcggccga 1440
aggtgggatt agtgattggg gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtaggaga acctgcggct 1500
ggatcacctc c 1511
<210> 46
<211> 1510
<212> DNA
<213> 肉毒梭菌
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (1)..(7)
<223> n为a、c、g或t
<400> 46
nnnnnnngag agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca 60
agtcgagcga tgaagcttcc ttcgggaagt ggattagcgg cggacgggtg agtaacacgt 120
gggtaacctg cctcaaagtg ggggatagcc ttccgaaagg aagattaata ccgcataaca 180
taagagaatc gcatgatttt cttatcaaag atttattgct ttgagatgga cccgcggcgc 240
attagctagt tggtaaggta acggcttacc aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg 300
gtgatcggcc acattggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc aggagtgggg 360
aatattgcgc aatgggggaa accctgacgc agcaacgccg cgtgggtgat gaaggtcttc 420
ggattgtaaa gccctgtttt ctaggacgat aatgacggta ctagaggagg aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcga gcgttgtccg gatttactgg 540
gcgtaaaggg tgcgtaggcg gatgtttaag tgggatgtga aatccccggg cttaacctgg 600
gggctgcatt ccaaactgga tatctagagt gcaggagagg aaagcggaat tcctagtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat taggaagaac accagtggcg aaggcggctt tctggactgt 720
aactgacgct gaggcacgaa agcgtgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatggatact aggtgtaggg ggtatcaact ccccctgtgc cgcagttaac 840
acaataagta tcccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcagcgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacct 960
ggacttgaca tcccttgcat agcctagaga taggtgaagc ccttcggggc aaggagacag 1020
gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgtta ggttaagtcc tgcaacgagc 1080
gcaacccttg ttattagttg ctaccattaa gttgagcact ctaatgagac tgcctgggta 1140
accaggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgtcca gggctacaca 1200
cgtgctacaa tggtaggtac aataagacgc aagaccgtga ggtggagcaa aacttataaa 1260
acctatctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagctgga gttgctagta 1320
atcgcgaatc agaatgtcgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380
accatgagag ctggtaacac ccgaagtccg tgaggtaacc gtaaggagcc agcggccgaa 1440
ggtgggatta gtgattgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtaggagaa cctgcggctg 1500
gatcacctcc 1510
<210> 47
<211> 1516
<212> DNA
<213> 肉毒梭菌
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (1)..(7)
<223> n为a、c、g或t
<400> 47
nnnnnnngag agtttgatcc tggctcagga cgaacgtggc ggcgtgccta acacatgcaa 60
gtcgagcgat gaagcttcct tcggggagtg gattagcggc ggacgggtga gtaacacgtg 120
ggtaacctgc ctcaaagagg gggatagcct cccgaaaggg agattaatac cgcataacat 180
tattttatgg catcatagaa taatcaaagg agcaatccgc tttgattatg gacccgcgtc 240
gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga 300
gggtgatcgg ccacattgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg 360
ggaatattgc gcaatggggg aaaccctgac gcagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt 420
tcggatcgta aaactctgtc tttagggacg ataatgacgg tacctaagga ggaagccacg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttact 540
gggcgtaaag agtatgtagg tgggtgctta agtcagatgt gaaattcccg ggcttaacct 600
gggcgctgca tttgaaactg ggcatctaga gtgcaggaga ggaaagtgga attcctagtg 660
tagcggtgaa atgcgtagag attaggaaga acaccagtgg cgaaggcgac tttctggact 720
gtaactgaca ctgagatacg aaagcgtggg tagcaaacag gattagatcc ccctggtagt 780
ccacgccgta aacgatgaat actaggtgtc ggggggtacc accctcggtg ccgcagcaaa 840
cgcattaagt attccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg 900
gggacccgca caagcagcgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
tagacttgac atctcctgaa ttactcttaa tcgaggaagt cccttcgggg gacaggaaga 1020
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc ttattgttag ttgctactat taagttaagc actctaacga gactgccgcg 1140
gttaacgtag aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg tctagggcta 1200
cacacgtgct acaatggctg gtacaacgag cagcaaaccc gcgaggggga gcaaaacttg 1260
aaagccagtc ccagttcgga ttgtaggctg aaactcgcct acatgaagtt ggagttgcta 1320
gtaatcgcgg aatcagcatg tcgcggtgaa tacgtccccg ggtcttgtac acaccgcccg 1380
tcacaccatg agagccggta acacccgaag cccgtgaggt aaccgtaagg agccagcggt 1440
cgaaggtggg attggtgatt ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgtagg agaacctgcg 1500
gttggatcac ctcctt 1516
<210> 48
<211> 1516
<212> DNA
<213> 肉毒梭菌
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (1)..(7)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (373)..(373)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (789)..(790)
<223> n为a、c、g或t
<400> 48
nnnnnnngag agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aacacatgca 60
agtcgagcga tgaagcttcc ttcgggaagt ggattagcgg cggacgggtg agtaacacgt 120
gggtaacctg cctcaaagag tgggatagcc tcccgaaagg gagattaata ccgcataaca 180
ttattttatg gcatcataca taaaataatc aaaggagcaa tccgctttga gatggacccg 240
cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg caacgatgcg tagccgacct 300
gagagggtga tcggccacat tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca 360
gtggggaata ttncgcaatg ggggaaaccc tgacgcagca acgccgcgtg agtgatgaag 420
gttttcggat cgtaaaactc tgtctttagg gacgataatg acggtaccta aggaggaagc 480
cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt 540
tactgggcgt aaagagtatg taggtgggtg cttaagtcag atgtgaaatt cccgggctca 600
acctgggagc tgcatttgaa actgggcatc tagagtgcag gagaggaaag tggaattcct 660
agtgtagcgg tgaaatgcgt agagattagg aagaacacca gtggcgaagg cgactctctg 720
gactgtaact gacactgaga tacgaaagcg tgggtagcaa acaggattag ataccctggt 780
agtccacgnn gtaaacgatg aatactaggt gtcggggggt accaccctcg gtgccgcagc 840
aaacgcatta agtattccgc ctgggaagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg 900
acggggcccg cacaagcagc ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960
cctagacttg acatctcctg aattactctt aatcgaggaa gtcccttcgg ggacaggaag 1020
acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080
gagcgcaacc cttattgtta gttgctacta ttaagttaag cactctaacg agactgccgc 1140
ggttaacgtg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gtctagggct 1200
acacacgtgc tacaatggct ggtacaacga gcagcaaacc cgcgaggggg agcaaaactt 1260
gaaagccagt cccagttcgg attgtaggct gaaactcgcc tacatgaagt tggagttgct 1320
agtaatcgcg aatcagcatg tcgcggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac acaccgcccg 1380
tcacaccatg agagccggta acacccgaag cccgtgaggt aaccgtaagg agccagcggt 1440
cgaaggtggg attggtgatt ggggtaagtc gtaacaaggt agccgtagga gaacctgcgg 1500
ctggatcacc tccttt 1516
<210> 49
<211> 1513
<212> DNA
<213> 肉毒梭菌
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (1)..(7)
<223> n为a、c、g或t
<400> 49
nnnnnnnaga gtttgatcct ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta acacatgcaa 60
tcgagcgatg aagcttcctt cgggaagtgg attagcggcg gacgggtgag taacacgtgg 120
gtaacctgcc tcatagaggg gaatagcctc ccgaaaggga gattaatacc gcataaagta 180
tgaaggtcgc atgacttcat tataccaaag gagtaatccg ctatgagatg gacccgcggc 240
gcattagcta gttggtgagg taagggctca ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga 300
gggtgatcgg ccacattgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg 360
ggaatattgc gcaatggggg aaaccctgac gcagcaacgc cgcgtgaatg aagaaggcct 420
tagggttgta aagttctgtc atatgggaag ataatgacgg taccatatga ggaagccacg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttact 540
gggcgtaaag gatgcgtagg cggacattta agtcagatgt gaaatacccg ggctcaactt 600
gggtgctgca tttgaaactg ggtgtctaga gtgcaggaga ggaaagcgga attcctagtg 660
tagcggtgaa atgcgtagag attaggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tttctggact 720
gtaactgacg ctgaggcatg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780
cacgccgtaa acgatgaata ctaggtgtag gaggtatcga ccccttctgt gccgcagtta 840
acacaataag tattccgcct ggggagtacg atcgcaagat taaaactcaa aggaattgac 900
gggggcccgc acaagcagcg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960
ctagacttga catcccctga attacctgta atgagggaag cccttcgggg cagggagaca 1020
ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt atcattagtt gctaccatta agttgagcac tctagtgaga ctgcccgggt 1140
taaccgggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgtc tagggctaca 1200
cacgtgctac aatggttggt acaacaagat gcaagaccgc gaggtggagc taaacttaaa 1260
aaaccaaccc agttcggatt gtaggctgaa actcgcctac atgaagccgg agttgctagt 1320
aatcgcgaat cagcatgtcg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380
caccatgaga gctggtaaca cccgaagtcc gtgaggtaac cgtaaggagc cagcggccga 1440
aggtgggatt agtgattggg gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtaggaga acctgcggtt 1500
ggatcacctc ctt 1513
<210> 50
<211> 1521
<212> DNA
<213> 土拉弗朗西斯菌
<400> 50
ttgaagagtt tgatcatggc tcagattgaa cgctggtggc atgcttaaca catgcaagtc 60
gaacggtaac aggtcttagg atgctgacga gtggcggacg ggtgagtaac gcgtaggaat 120
ctgcccattt gagggggata ccagttggaa acgactgtta ataccgcata atatctgtgg 180
attaaaggtg gctttcggcg tgtcgcagat ggatgagcct gcgttggatt agctagttgg 240
tggggtaagg gcccaccaag gctacgatcc atagctgatt tgagaggatg atcagccaca 300
ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat 360
gggggcaacc ctgatccagc aatgccatgt gtgtgaagaa ggccctaggg ttgtaaagca 420
ctttagttgg ggaggaaagc ctcaaggtta atagccttgg gggaggacgt tacccaaaga 480
ataagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggggggtgc aagcgttaat 540
cggaattact gggcgtaaag ggtctgtagg tggtttgtta agtcagatgt gaaagcccag 600
ggctcaacct tggaactgca tttgatactg gcaaactaga gtacggtaga ggaatgggga 660
atttctggtg tagcggtgaa atgcgtagag atcagaagga acaccaatgg cgaaggcaac 720
attctggacc gatactgaca ctgagggacg aaagcgtggg gatcaaacag gattagatac 780
cctggtagtc cacgctgtaa acgatgagta ctagctgttg gagtcggtgt aaaggctcta 840
gtggcgcacg taacgcgata agtactccgc ctggggacta cggccgcaag gctaaaactc 900
aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc 960
gaagaacctt acctggtctt gacatcctgc gaactttcta gagatagatt ggtgcttcgg 1020
aacgcagtga cagtgctgca cggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt 1080
cccgcaacga gcgcaacccc tattgatagt taccatcatt aagttgggta ctctattaag 1140
actgccgctg acaaggcgga ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg gcccttacga 1200
ccagggctac acacgtgcta caatgggtat tacagagggc tgcgaaggtg cgagctggag 1260
cgaaactcaa aaaggtactc ttagtccgga ttgcagtctg caactcgact gcatgaagtc 1320
ggaatcgcta gtaatcgcag gtcagaatac tgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca 1380
caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg ctccagaagt agatagctta acgaatgggc 1440
gtttaccacg gagtgattca tgactggggt gaagtcgtaa caatggtagc cgtagggaac 1500
ctgcggctgg atcacctcct t 1521
<210> 51
<211> 1464
<212> DNA
<213> 霍乱弧菌
<400> 51
tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg cagcacagag 60
gaacttgttc cttgggtggc gagcggcgga cgggtgagta atgcctggga aattgcccgg 120
tagaggggga taaccattgg aaacgatggc taataccgca taacctcgta agagcaaagc 180
aggggacctt cgggccttgc gctaccggat atgcccaggt gggattagct agttggtgag 240
gtaagggctc accaaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg 300
aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc 360
gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt aaagtacttt 420
cagtagggag gaaggtggtt aagctaatac cttaatcatt tgacgttacc tacagaagaa 480
gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga 540
attactgggc gtaaagcgca tgcaggtggt ttgttaagtc agatgtgaaa gccctgggct 600
caacctagga atcgcatttg aaactgacaa gctagagtac tgtagagggg ggtagaattt 660
caggtgtagc ggtgaaatgc gtagagatct gaaggaatac cggtggcgaa ggcggccccc 720
tggacagata ctgacactca gatgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg 780
gtagtccacg ccgtaaacga tgtctacttg gaggttgtga cctagagtcg tggctttcgg 840
agctaacgcg ttaagtagac cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaatgaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac 960
cttacctact cttgacatcc tcagaagaga ctggagacag tcttgtgcct tcgggaactg 1020
agagacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg ttaagtcccg 1080
caacgagcgc aacccttatc cttgtttgcc agcacgtaat ggtgggaact ccagggagac 1140
tgccggtgat aaaccggagg aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatggc ccttacgagt 1200
agggctacac acgtgctaca atggcgtata cagagggcag cgataccgcg aggtggagcg 1260
aatctcacaa agtacgtcgt agtccggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg 1320
aatcgctagt aatcgcaaat cagaatgttg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca 1380
ccgcccgtca caccatggga gtgggctgca aaagaagcag gtagtttaac cttcgggagg 1440
acgcttgcca ctttgggtac ttgg 1464
<210> 52
<211> 1469
<212> DNA
<213> 鼠疫耶尔森氏菌
<400> 52
ctggcggcag gcctaacaca tgcaagtcga gcggcaccgg gaagtagttt actactttgc 60
cggcgagcgg cggacgggtg agtaatgtct ggggatctgc ctgatggagg gggataacta 120
ctggaaacgg tagctaatac cgcatgacct cgcaagagca aagtggggga ccttagggcc 180
tcacgccatc ggatgaaccc agatgggatt agctagtagg tggggtaatg gctcacctag 240
gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc 300
agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc 360
catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttcggg ttgtaaagca ctttcagcga ggaggaaggg 420
gttgagttta atacgctcaa tcattgacgt tactcgcaga agaagcaccg gctaactccg 480
tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 540
cgcacgcagg cggtttgtta agtcagatgt gaaatccccg cgcttaacgt gggaactgca 600
tttgaaactg gcaagctaga gtcttgtaga ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa 660
atgcgtagag atctggagga ataccggtgg cgaaggcggc cccctggaca aagactgacg 720
ctcaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgctgtaa 780
acgatgtcga cttggaggtt gtgcccttga ggcgtggctt ccggagctaa cgcgttaagt 840
cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca 900
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tactcttgac 960
atccacagaa tttggcagag atgctaaagt gccttcggga actgtgagac aggtgctgca 1020
tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080
tatcctttgt tgccagcacg taatggtggg aactcaaggg agactgccgg tgacaaaccg 1140
gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac gagtagggct acacacgtgc 1200
tacaatggca gatacaaagt gaagcgaact cgcgagagcc agcggaccac ataaagtctg 1260
tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc tagtaatcgt 1320
agatcagaat gctacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380
gggagtgggt tgcaaaagaa gtaggtagct taaccttcgg gagggcgctt accactttgt 1440
gattcatgac tggggtgaag tcgtaacaa 1469
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 53
catccaagga aggcagcagg cgcg 24
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 54
gttcaactac gagcttttta ac 22
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 55
gttcgactac gagcttttta ac 22
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 56
gtgtagcggt gaaatgcgta gag 23
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 57
tcgtttaccg tggactacca ggg 23

Claims (22)

1.一种鉴定、部分鉴定或分类样品中的至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌的方法，所述方法包括分析来自所述样品的至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或来自所述样品的至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)，
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少一者相对应的位置；
其中基于所述至少一个SNP的存在或不存在，鉴定、部分鉴定或分类所述样品中的所述至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌。
2.一种鉴定、部分鉴定、分类或诊断受试者中的细菌、酵母生物或丝状真菌感染的方法，所述方法包括分析来自所述受试者的样品中的至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)；
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少一者相对应的位置；
其中所述至少一个SNP在所述至少一部分16S rRNA基因或基因产物中或在所述至少一部分18S rRNA基因或基因产物中的存在或不存在被用于鉴定、部分鉴定、分类或诊断所述受试者中的所述细菌、酵母生物或丝状真菌感染。
3.一种治疗患有细菌、酵母生物或丝状真菌感染的受试者的方法，所述方法包括：
根据权利要求2的方法鉴定、部分鉴定、分类或诊断受试者中的细菌、酵母生物或丝状真菌感染，以鉴定、部分鉴定、分类或诊断所述受试者中的所述细菌、酵母生物或丝状真菌感染；
向所述受试者施用用于治疗所述受试者中的所述细菌、酵母生物或丝状真菌感染的疗法或治疗剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述样品是包括痰、血液、脑脊髓液或尿液的生物样品。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中分析步骤包括使用高分辨率熔解分析、5'核酸酶消化、分子信标、寡核苷酸连接、微阵列、限制性片段长度多态性、抗体检测方法、直接测序或其任何组合来确定所述至少一个SNP的存在或不存在。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法还包括确定所述至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌是否对治疗剂具有抗性的步骤。
7.一种鉴定样品中的至少一种细菌的方法，所述方法包括对来自所述样品的核酸分析细菌16S rRNA基因中的处在与SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647和653中的至少一者相对应的位置上的至少一个SNP，其中基于所述至少一个SNP的存在鉴定所述至少一种细菌。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置737、755、762和776中的至少一者相对应的位置。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQ ID NO:37中所示的18S rRNA基因或基因产物的位置343、371、388、416和467中的至少一者相对应的位置。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法包括分析来自所述样品的至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或来自所述样品的至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在：
所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的处在与SEQ ID NO:1中所示的16SrRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少四者相对应的位置上的单核苷酸多态性；或
所述至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中的处在与SEQ IDNO:37中所示的18S rRNA基因的位置343、371、388、416和467相对应的位置上的单核苷酸多态性。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述细菌是由以下组成的组中的至少一者或所述细菌感染是由以下组成的组中的至少一者引起的：乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)；产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)；阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；屎肠球菌(Enterococcusfaecium)；大肠杆菌(Escherichia coli)；肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)；奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)；无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)；化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)；单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)；杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)；脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)；脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；沙门氏菌(Salmonella sp.)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
12.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述细菌是由以下组成的组中的至少一者或所述细菌感染是由以下组成的组中的至少一者引起的：炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)。
13.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述酵母生物或丝状真菌是由以下组成的组中的至少一者：白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candidatropicalis)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)。
14.一种鉴定、部分鉴定、分类或诊断受试者中的感染的方法，其中所述感染是细菌、酵母生物或丝状真菌感染，所述方法包括分析从所述受试者获得的生物样品中的至少一种细菌16S rRNA基因或基因产物或其一部分或者至少一种酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物或其一部分的特性，其中所述分析包括检测所述至少一种细菌16S rRNA基因或基因产物或其一部分或者所述至少一种酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物或其一部分中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)，
其中所述细菌16S rRNA基因或基因产物或其一部分中的所述至少一个SNP处在与SEQID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少一者相对应的位置；
其中基于所述至少一个SNP的存在或不存在，鉴定、部分鉴定、分类或诊断所述样品中的所述至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌。
15.能够鉴定、部分鉴定或分类样品中的至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌的至少一种分离探针、工具或试剂，其中所述探针、工具或试剂能够结合、检测或鉴定在至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)，
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少一者相对应的位置。
16.根据权利要求15所述的至少一种分离探针、工具或试剂，其中所述至少一种探针、工具或试剂包含具有SEQ ID NO:16-35和53-57中的至少一者所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
17.一种鉴定、部分鉴定或分类样品中的至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌的方法，所述方法包括：
将根据权利要求15或权利要求16所述的至少一种分离探针、工具或试剂与所述样品组合；和
基于至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或至少一部分酵母生物或丝状真菌18SrRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)，鉴定、部分鉴定或分类所述至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌，
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少一者相对应的位置。
18.一种阵列，其包括多于一种的根据权利要求15或权利要求16所述的分离探针、工具或试剂。
19.一种生物芯片，其包括固体基板和根据权利要求15或权利要求16所述的至少一种分离探针、工具或试剂。
20.一种用于分类或鉴定样品中的至少一种细菌或至少一种酵母生物或丝状真菌的试剂盒或分析法，所述试剂盒或分析法包括：根据权利要求15或权利要求16所述的至少一种探针、工具或试剂；根据权利要求18所述的阵列；和/或根据权利要求19所述的生物芯片。
21.至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或至少一部分酵母生物或丝状真菌18SrRNA基因或基因产物中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)，其用作分类、鉴定或部分鉴定样品中的至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌的指标；
其中所述至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物中的所述至少一个SNP处在与SEQID NO:1中所示的16S rRNA基因的位置273、378、412、440、488、647、653、737、755、762和776中的至少一者相对应的位置。
22.如权利要求1所定义的在至少一部分细菌16S rRNA基因或基因产物或至少一部分酵母生物或丝状真菌18S rRNA基因或基因产物中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)或根据权利要求15或权利要求16所述的至少一种分离探针、工具或试剂的用途，其用于鉴定、部分鉴定或分类样品中的至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌，其中基于来自所述样品的至少一部分16S rRNA基因或基因产物或至少一部分18S rRNA基因或基因产物中存在或不存在至少一个SNP来鉴定、部分鉴定或分类所述至少一种细菌、酵母生物或丝状真菌。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111455088A (zh) * 2020-05-18 2020-07-28 中国水稻研究所 层出镰刀菌ssr分子标记及其应用
CN113201594A (zh) * 2021-03-31 2021-08-03 广东产品质量监督检验研究院（国家质量技术监督局广州电气安全检验所、广东省试验认证研究院、华安实验室） 一种食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法
CN114717339A (zh) * 2021-01-05 2022-07-08 深圳华大生命科学研究院 检测snp位点的试剂在制备试剂盒中的用途

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
WO2020123319A2 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Methods of using master / copy arrays for spatial detection
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
SG11202106899SA (en) 2019-12-23 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
IL294949A (en) * 2020-01-22 2022-09-01 Microbio Pty Ltd A method for quantifying bacteria
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
EP4242325A3 (en) 2020-04-22 2023-10-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021237056A1 (en) * 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Rna integrity analysis in a biological sample
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
CN116034166A (zh) 2020-06-25 2023-04-28 10X基因组学有限公司 Dna甲基化的空间分析
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
KR102453357B1 (ko) * 2020-11-26 2022-10-07 고려대학교 산학협력단 형광 프로브를 이용한 칸디다 알비칸, 칸디다 아우리스, 및 칸디다 글라브라타를 감별하여 검출할 수 있는 동시다중 등온증폭반응 프라이머 세트
AU2021409136A1 (en) 2020-12-21 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
KR102546046B1 (ko) * 2022-12-29 2023-06-23 드림디엑스 주식회사 세균 감염 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법
KR102546048B1 (ko) * 2022-12-29 2023-06-23 드림디엑스 주식회사 진균 감염 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040010129A1 (en) * 2001-11-01 2004-01-15 Po-Hsiang Hsu Nucleic acid kit for bacterial pathogen diagnosis and method for using the same
US20080199863A1 (en) * 2004-11-01 2008-08-21 The Regents Of The University Of California Probes and methods for detection of pathogens and antibiotic resistance
CN103352257A (zh) * 2012-05-08 2013-10-16 向华 制备细菌核酸指纹特征谱库的方法
AU2014273850A1 (en) * 2013-05-29 2015-12-17 Immunexpress Pty Ltd Microbial markers and uses therefor

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8311018D0 (en) 1983-04-22 1983-05-25 Amersham Int Plc Detecting mutations in dna
IE61148B1 (en) 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
US5002867A (en) 1988-04-25 1991-03-26 Macevicz Stephen C Nucleic acid sequence determination by multiple mixed oligonucleotide probes
AU3694689A (en) 1988-04-28 1989-11-24 Mark H. Skolnick Amplified sequence polymorphisms (asps)
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
FR2650840B1 (fr) 1989-08-11 1991-11-29 Bertin & Cie Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications
CA2087256A1 (en) 1990-07-25 1992-01-26 Jerry L. Ruth Circular extension for generating multiple nucleic acid complements
ATE244065T1 (de) 1990-12-06 2003-07-15 Affymetrix Inc Verfahren und reagenzien für immobilisierten polymersynthese in sehr grossem masstab
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
US5422252A (en) 1993-06-04 1995-06-06 Becton, Dickinson And Company Simultaneous amplification of multiple targets
WO1995011995A1 (en) 1993-10-26 1995-05-04 Affymax Technologies N.V. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US5858659A (en) 1995-11-29 1999-01-12 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection
US5631734A (en) 1994-02-10 1997-05-20 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for detection of fluorescently labeled materials
US6015880A (en) 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
KR19980701336A (ko) * 1995-01-13 1998-05-15 아서 에스. 모겐스턴 균류의 검출 및 확인을 위한 핵산 표지체(nucleic acid probes for the detection and identification of fungi)
US5589136A (en) 1995-06-20 1996-12-31 Regents Of The University Of California Silicon-based sleeve devices for chemical reactions
AU714486B2 (en) 1995-11-21 2000-01-06 Yale University Unimolecular segment amplification and detection
AU2320597A (en) 1996-03-19 1997-10-10 Molecular Tool, Inc. Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide
US6054278A (en) * 1997-05-05 2000-04-25 The Perkin-Elmer Corporation Ribosomal RNA gene polymorphism based microorganism identification
US6134854A (en) 1998-12-18 2000-10-24 Perstorp Ab Glider bar for flooring system
AUPQ909000A0 (en) * 2000-07-28 2000-08-24 University Of Sydney, The A method of detecting microorganisms
AUPS115502A0 (en) 2002-03-18 2002-04-18 Diatech Pty Ltd Assessing data sets
JP2003284559A (ja) * 2002-03-28 2003-10-07 Masao Nasu 細菌種同定方法
JP4422019B2 (ja) * 2002-06-14 2010-02-24 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 微生物同定用プローブ及びそれを用いた同定方法
CN1291997C (zh) 2002-10-25 2006-12-27 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种提取细菌mRNA的方法
KR100611056B1 (ko) * 2002-12-16 2006-08-10 학교법인 포항공과대학교 병원성 미생물 검출을 위한 올리고뉴클레오티드마이크로칩 및 이를 이용한 병원성 미생물 검출방법
JP2007014351A (ja) 2003-04-02 2007-01-25 Canon Inc 感染症検出用プローブ、遺伝子検出用のプローブ、感染症起炎菌増幅反応用プライマー、感染症起炎菌増幅反応用プライマーセット及び感染症起炎菌検出方法
JP2004313181A (ja) 2003-04-02 2004-11-11 Canon Inc 感染症起炎菌検出用プローブ及びプローブセット、ならびに担体及び遺伝子検査方法
US20050142584A1 (en) * 2003-10-01 2005-06-30 Willson Richard C. Microbial identification based on the overall composition of characteristic oligonucleotides
US7381547B2 (en) * 2004-04-28 2008-06-03 Tzam Diagnostics, Llc Methods and compositions to detect bacteria using multiplex PCR
CN1683565A (zh) * 2005-03-15 2005-10-19 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 一套检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针及其用途
CN100368560C (zh) * 2005-09-22 2008-02-13 广州华银医药科技有限公司 一种呼吸道病原体的实时荧光聚合酶链式反应检测方法
US8741565B2 (en) 2005-12-30 2014-06-03 Honeywell International Inc. Oligonucleotide microarray for identification of pathogens
JP4914142B2 (ja) * 2006-08-04 2012-04-11 キヤノン株式会社 検査装置
EP1953247A1 (en) 2007-01-31 2008-08-06 GC Corporation A method for measuring the number of oral streptococci, and a PCR primers-probe set used for the same
EP1997905A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-03 Friesland Brands B.V. Nucleic acid amplification
EP3604558B1 (en) * 2010-02-17 2022-10-12 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect atopobium vaginae nucleic acid
GB201021399D0 (en) 2010-12-16 2011-01-26 Genetic Analysis As Oligonucleotide probe set and methods of microbiota profiling
GB201102693D0 (en) * 2011-02-16 2011-03-30 Genetic Analysis As Method for identifying neonates at risk for necrotizing enterocolitis
WO2012139122A1 (en) * 2011-04-08 2012-10-11 Azzazy Hassan Mohamed Ei-Said Detection of nucleic acids using unmodified gold nanoparticles
EP2753713B1 (en) * 2011-09-08 2017-07-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid
KR20130046321A (ko) 2011-10-27 2013-05-07 한국외국어대학교 연구산학협력단 식중독 세균 Staphylococcus aureus 탐지용 탐침자 및 그를 포함한 DNA 칩
US20140106974A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-17 Synblex, Llc Pathogen identification process and transport container
US9707555B2 (en) 2012-11-30 2017-07-18 Qvella Corporation Method for pretreatment of microbial samples
CN103614326B (zh) 2013-11-27 2016-05-04 峨眉山绿地生态农业开发有限公司 一种高温堆肥促腐细菌复合菌剂及其应用
US10047405B2 (en) * 2013-12-20 2018-08-14 President And Fellows Of Harvard College Engineered genetic enteric sensor bacteria and uses thereof
CN103952417B (zh) * 2014-04-15 2016-01-20 天津大学 枯草芽孢杆菌双组分调控系统突变基因yvrH及应用
US20170204452A1 (en) 2014-07-23 2017-07-20 Steffen Mergemeier Method for the detection of sepsis
NL2013266B1 (en) 2014-07-25 2016-05-19 Microbiome Ltd Novel test for microbial blood infections.
CN104372072A (zh) * 2014-07-29 2015-02-25 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量pcr方法
CA2988415A1 (en) * 2015-06-04 2016-12-08 Basf Se Recombinant microorganism for improved production of fine chemicals
CN105483251A (zh) 2015-12-31 2016-04-13 上海星耀医学科技发展有限公司 一种用于检测痰液中细菌的探针、试剂盒和方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040010129A1 (en) * 2001-11-01 2004-01-15 Po-Hsiang Hsu Nucleic acid kit for bacterial pathogen diagnosis and method for using the same
US20080199863A1 (en) * 2004-11-01 2008-08-21 The Regents Of The University Of California Probes and methods for detection of pathogens and antibiotic resistance
CN103352257A (zh) * 2012-05-08 2013-10-16 向华 制备细菌核酸指纹特征谱库的方法
AU2014273850A1 (en) * 2013-05-29 2015-12-17 Immunexpress Pty Ltd Microbial markers and uses therefor
CN105492628A (zh) * 2013-05-29 2016-04-13 因姆内克斯普雷斯私人有限公司 微生物标志物及其用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FERNANDEZ ET AL.,: ""Identification of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the 16S rRNA gene of foodborne Bacillus spp"" *
MARQUES ET AL.，: ""Intraspecific sequence variation in 16S rRNA gene of Ureaplasma diversum isolates"" *
MASAYUKI IMAJOH ET AL.,: ""Genotypic characteristics of a Mycobacterium sp. isolated from yellowtail Seriola quinqueradiata and striped jack Pseudocaranx dentex in Japan"" *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111455088A (zh) * 2020-05-18 2020-07-28 中国水稻研究所 层出镰刀菌ssr分子标记及其应用
CN114717339A (zh) * 2021-01-05 2022-07-08 深圳华大生命科学研究院 检测snp位点的试剂在制备试剂盒中的用途
CN114717339B (zh) * 2021-01-05 2024-04-05 深圳华大生命科学研究院 检测snp位点的试剂在制备试剂盒中的用途
CN113201594A (zh) * 2021-03-31 2021-08-03 广东产品质量监督检验研究院（国家质量技术监督局广州电气安全检验所、广东省试验认证研究院、华安实验室） 一种食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法

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