KR102640361B1 - 바이오마커 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일반적으로 미생물(특히 세균), 효모 유기체 및 사상 진균을 확인하고/하거나 분류하는 방법 및 물질에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 세균 16S 리보좀 RNA(16S rRNA), 및 효모 유기체 및 사상 진균 18S 리보좀 RNA에서 특유의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 발견, 및 이 SNP들 중 하나 이상의 SNP의 존재를 근거로 샘플에서 세균, 효모 유기체 및/또는 사상 진균을 분류하고/하거나 확인하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 방법들에 유용한 프로브, 프라이머 및 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 일반적으로 미생물을 확인하고/하거나 분류하는 방법 및 물질에 관한 것이다. 상기 방법 및 물질은 세균에 대한 16S 리보좀 RNA 유전자 또는 유전자 생성물, 및 효모 유기체 및 사상 진균에 대한 18S 리보좀 RNA 유전자 또는 유전자 생성물 내에서의 다형성의 검출에 기반을 둔다. 또한, 본 발명은 본 발명의 진단 방법을 기반으로 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균의 감염을 치료하는 방법도 특징으로 한다.
샘플에서 미생물(예컨대, 세균), 효모 유기체 및 사상 진균을 신속하고 정확하게 확인하거나 분류하는 것은 매우 바람직하다.
다른 무엇보다도, 이러한 감염의 신속하고 정확한 진단은 효과적인 치료 또는 요법의 조기 실시를 가능하게 함으로써 환자의 생사를 가를 수 있다.
신속하고 정확한 확인 또는 분류는 오염된 용액, 재료 또는 식품에서, 유기체의 건강, 또는 상기 용액, 재료 또는 식품의 생산 품질에 위협을 가할 수 있는 미생물, 효모 유기체 또는 사상 진균을 관리하고/하거나, 제어하고/하거나, 박멸하고/하거나 제거하는 효과적인 제어 조치의 실시에 도움을 줄 수 있다.
또한, 신속하고 정확한 확인 또는 분류는 예를 들면, 미생물 다양성, 문 스펙트럼 및/또는 상대적 문 존재도의 생태학적 연구, 또는 유기체에 대한 병리학적 상태에서 정상 상태로부터의 균형의 이탈, 예컨대, 장, 호흡기 및 피부 장애의 모니터링을 위해 샘플 중의 천연 미생물, 효모 유기체 또는 사상 진균 집단을 보조할 수 있다.
요법, 치료 또는 조절 후 미생물, 효모 또는 사상 진균을 신속하고 정확하게 확인하거나 분류하는 것도 바람직할 수 있다. 예를 들면, 신속한 미생물 확인 또는 분류는 항생제, 스테로이드, 면역 조절제, 프리-바이오틱스 및 포스트-바이오틱스, 토양 또는 물 처리, 여과, 멸균 절차 및 소독제의 사용을 분석하는 데 유용할 수 있다.
현재, 상업적으로 이용될 수 있는 대다수의 진단 기법들은 전형적으로 배양을 이용하여 샘플로부터 살아있는 미생물, 효모 유기체 및 사상 진균을 단리하고 확인할 것을 요구하나, 이 기법은 상당한 소요 시간 및 최적이 아닌 민감성, 특이성 및 예측 값에 의해 부정적으로 영향을 받는다. 상기 기법은 일부 유기체들, 예컨대, 보안 민감성 생물학적 물질의 경우 특히 바람직하지 않을 수 있는, 유기체의 보다 더 광범위한 취급을 요구할 수도 있다.
이용될 수 있는 대안적 진단 기법은 특히 배양과 함께 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 이용을 포함한다. 그러나, 이러한 기법에 있어서 한 문제점은 배양 결과 또는 관련 임상적 또는 신체적 증상의 부재 하에서 초기 양성 PCR 결과의 신뢰성 결여이다. 이러한 기법에 있어서 또 다른 문제점은 배양과 마찬가지로 숙주 핵산의 배경에서 소량의 미생물 핵산을 검출하고자 할 때 민감성 및 특이성의 결여이다.
따라서, 세균, 효모 유기체 및/또는 사상 진균의 정확한 진단을 위해 신속하고 신뢰할 수 있는 기법의 필요성이 인식되어 있다.
다양한 양태에서, 본 발명은 부분적으로 세균을 비롯한 원핵생물들 사이에 16S(스베드버그(Svedberg) 단위) 리보좀 RNA(16S rRNA) 유전자의 고도 보존, 및 효모 유기체와 사상 진균 사이에 18S 리보좀 RNA(18S rRNA) 유전자의 고도 보존에 기반을 두고, 부분적으로 샘플에서 미생물, 특히 세균 미생물 및 효모 유기체 및/또는 사상 진균을 확인하고 분류하는 데 유용할 수 있는, 16S rRNA 유전자 및 18S rRNA 유전자 내의 다수의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 발견에 기반을 둔다.
일반적으로 말하자면, 세균을 비롯한 원핵생물은 원핵생물 리보좀의 30S 작은 서브유닛의 성분인 16S rRNA를 함유한다. 16S rRNA는 길이가 대략 1,500개 뉴클레오타이드이고, 일반적으로 23S 및 5S rRNA 유전자도 함유하는 공-전사된 오페론의 일부인 16S rRNA 유전자(16S rDNA로서도 지칭됨)에 의해 코딩된다. 16S rRNA 유전자의 DNA 서열(및 따라서 16S rRNA 분자의 RNA 서열)이 원핵생물들 사이에 고도로 보존되어 있을지라도, 변이의 영역이 있다(Weisberg W.G., et al., 1991).
유사하게, 효모 및 사상 진균 내의 18S rRNA 유전자는 원핵생물 내의 16S rRNA 유전자의 상동체이다. 18S rRNA는 40S 작은 진핵생물 리보좀 서브유닛의 성분이다. 18S rRNA 유전자의 DNA 서열(및 따라서 18S rRNA 분자의 RNA 서열)도 효모 및 사상 진균에 고도로 보존되어 있다.
본 발명의 제1양태에 따라, 샘플에서 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나 분류하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 샘플로부터의 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 샘플로부터의 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부를 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 존재 또는 부재에 대해 분석하는 단계를 포함하고, 이때 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있거나; 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자에 있거나, 이 유전자에 상응하거나; 샘플에서 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균은 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재를 근거로 확인되거나, 부분적으로 확인되거나 분류된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 샘플로부터의 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 샘플로부터의 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부를 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 존재 또는 부재에 대해 분석하는 단계를 포함하고, 이때 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647, 653, 737, 755, 762 및 776 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있고; 샘플에서 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균은 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재를 근거로 확인되거나, 부분적으로 확인되거나 분류된다.
본 발명의 제2양태에 따라, 대상체에서 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나, 분류하거나 진단하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 대상체로부터의 샘플에서 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부에서 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 존재 또는 부재를 분석하는 단계를 포함하고, 이때 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있거나; 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자에 있거나 이 유전자에 상응하거나; 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 상기 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재를 이용하여 대상체에서 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나, 분류하거나 진단한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 대상체로부터의 샘플에서 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부에서 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 존재 또는 부재를 분석하는 단계를 포함하고, 이때 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647, 653, 737, 755, 762 및 776 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있고; 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 상기 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재를 이용하여 대상체에서 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나, 분류하거나 진단한다.
본 발명의 제3양태에 따라, 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 제2양태의 방법에 따라 대상체에서 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나, 분류하거나 진단하여, 상기 대상체에서 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나, 분류하거나 진단하는 단계; 및 상기 대상체에서 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 치료하기 위한 요법 또는 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제4양태에 따라, 적어도 하나의 단리된 프로브, 수단 또는 시약을 제공한다.
제4양태의 한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 단리된 프로브, 수단 또는 시약은 샘플에서 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인할 수 있거나, 부분적으로 확인할 수 있거나 분류할 수 있고, 이때 상기 프로브, 수단 또는 시약은 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부에서 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 결합할 수 있거나, 이러한 SNP의 존재 또는 부재를 검출할 수 있거나 확인할 수 있고, 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있거나; 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자에 있거나 이 유전자에 상응한다.
제4양태의 또 다른 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 단리된 프로브, 수단 또는 시약은 샘플에서 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인할 수 있거나, 부분적으로 확인할 수 있거나 분류할 수 있고, 이때 상기 프로브, 수단 또는 시약은 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부에서 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 결합할 수 있거나, 이러한 SNP를 검출할 수 있거나 확인할 수 있고, 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647, 653, 737, 755, 762 및 776 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있다.
제4양태의 또 다른 실시양태에 따라, 상기 적어도 하나의 단리된 프로브, 수단 또는 시약은 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 포함하는 샘플과 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 포함하지 않는 샘플을 식별할 수 있고, 이때 상기 프로브, 수단 또는 시약은 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부에서 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 결합할 수 있거나, 이러한 SNP를 검출할 수 있거나 확인할 수 있고, 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있거나; 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자에 있거나 이 유전자에 상응한다.
제4양태의 또 다른 실시양태에 따라, 상기 적어도 하나의 단리된 프로브, 수단 또는 시약은 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 포함하는 샘플과 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 포함하지 않는 샘플을 식별할 수 있고, 이때 상기 프로브, 수단 또는 시약은 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부에서 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 결합할 수 있거나, 이러한 SNP를 검출할 수 있거나 확인할 수 있고, 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647, 653, 737, 755, 762 및 776 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있다.
본 발명의 제5양태에 따라, 샘플에서 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나 분류하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 제4양태의 적어도 하나의 단리된 프로브, 수단 또는 시약을 샘플과 조합하는 단계; 및 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부에서 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 존재 또는 부재를 근거로 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나 분류하는 단계를 포함하고, 이때 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있거나; 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자에 있거나 이 유전자에 상응한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 제4양태의 적어도 하나의 단리된 프로브, 수단 또는 시약을 샘플과 조합하는 단계; 및 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부에서 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 존재 또는 부재를 근거로 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나 분류하는 단계를 포함하고, 이때 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647, 653, 737, 755, 762 및 776 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있다.
본 발명의 제6양태에 따라, 제4양태의 하나 초과의 상기 단리된 프로브, 수단 또는 시약을 포함하는 어레이(특히 마이크로어레이)를 제공한다.
본 발명의 제7양태에 따라, 고체 기판 및 제4양태의 적어도 하나의 단리된 프로브, 수단 또는 시약을 포함하는 바이오칩을 제공한다.
본 발명의 제8양태에 따라, 키트 또는 어세이를 제공한다.
제8양태의 한 실시양태에서, 상기 키트 또는 어세이는 샘플에서 적어도 하나의 세균 또는 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하거나 확인하기 위한 것이고, 이때 상기 키트 또는 어세이는 제4양태의 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약; 제6양태의 어레이; 및/또는 제7양태의 바이오칩을 포함한다.
제8양태의 또 다른 실시양태에서, 상기 키트 또는 어세이는 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 포함하는 샘플과 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 포함하지 않는 샘플을 식별할 수 있고, 이때 상기 키트 또는 어세이는 제4양태의 프로브, 수단 또는 시약을 포함한다.
본 발명의 제9양태에 따라, 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)을 제공한다.
한 실시양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하거나, 확인하거나 부분적으로 확인하기 위한 표시제로서 사용할 상기 적어도 하나의 SNP는 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부에 존재하고; 이때 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있거나; 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자에 있거나 이 유전자에 상응한다.
또 다른 실시양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하거나, 확인하거나 부분적으로 확인하기 위한 표시제로서 사용할 상기 적어도 하나의 SNP는 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부에 있고; 이때 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647, 653, 737, 755, 762 및 776 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있다.
본 발명의 제10양태에 따라, 샘플에서 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나 분류하는 데 있어서 제1양태에 정의된 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP), 또는 제4양태의 적어도 하나의 단리된 프로브, 수단 또는 시약의 용도를 제공하고, 이때 상기 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균은 상기 샘플로부터의 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부에서 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재를 근거로 확인되거나, 부분적으로 확인되거나 분류된다.
본 발명의 제11양태에 따라, 본 발명의 제1양태, 제2양태, 제3양태 또는 제4양태 중 어느 한 양태의 방법에서 사용할 프로브, 수단 또는 시약을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 이하에 제공된다.
본 발명의 제12양태에 따라, 샘플에서 적어도 하나의 세균을 확인하거나 샘플에서 세균을 분류하는 데 사용하기 위한 또는 사용될 때 16S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP); 또는 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나 샘플에서 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하는 데 사용하기 위한 또는 사용될 때 18S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)을 제공한다.
본 발명의 제13양태에 따라, 샘플에서 적어도 하나의 세균을 확인하거나 샘플에서 세균을 분류하는 데 사용하기 위한 또는 사용될 때 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약으로서, 적어도 하나의 SNP를 함유하는 샘플에서 16S rRNA 유전자의 적어도 일부에 특이적으로 결합할 수 있거나, 이러한 16S rRNA 유전자의 적어도 일부를 검출할 수 있거나 확인할 수 있는 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약; 또는 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하는 데 사용하기 위한 또는 사용될 때 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약으로서, 적어도 하나의 SNP를 함유하는 샘플에서 18S rRNA 유전자의 적어도 일부에 특이적으로 결합할 수 있거나, 이러한 18S rRNA 유전자의 적어도 일부를 검출할 수 있거나 확인할 수 있는 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약을 제공한다.
본 발명의 제14양태에 따라, 샘플에서 세균을 확인하거나 샘플에서 세균을 분류하는 데 사용하기 위한 또는 사용될 때 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약으로서, 서열번호 16 내지 35, 56 또는 57 중 어느 한 서열번호로 기재된 뉴클레오타이드 서열을 가진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약; 또는 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하는 데 사용하기 위한 또는 사용될 때 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약으로서, 서열번호 53 내지 55 중 어느 한 서열번호로 기재된 뉴클레오타이드 서열을 가진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약을 제공한다.
본 발명의 제15양태에 따라, 샘플에서 적어도 하나의 세균을 확인하거나 샘플에서 세균을 분류하는 데 있어서 제12양태에 정의된 적어도 하나의 SNP, 또는 제13양태 또는 제14양태에 정의된 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약의 용도로서, 상기 적어도 하나의 세균이 전술된 바와 같이 샘플로부터의 16S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 확인되거나 분류되는 것인 용도; 또는 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하는 데 있어서 제12양태에 정의된 적어도 하나의 SNP, 또는 제13양태 또는 제14양태에 정의된 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약의 용도로서, 상기 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균이 전술된 바와 같이 샘플로부터의 18S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 확인되거나 분류되는 것인 용도를 제공한다.
본 발명의 제16양태에 따라, 샘플로부터의 16S rRNA 유전자를 제1양태에 정의된 적어도 하나의 SNP에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 샘플에서 적어도 하나의 세균을 확인하는 방법으로서, 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 적어도 하나의 세균을 확인하는 것인 방법; 또는 샘플로부터의 18S rRNA 유전자를 제12양태에 정의된 적어도 하나의 SNP에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하는 방법으로서, 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하는 것인 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 샘플로부터의 핵산을 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653 중 적어도 하나에 상응하는 위치에서 세균 16S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 샘플에서 적어도 하나의 세균을 확인하는 방법으로서, 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 적어도 하나의 세균을 확인하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 제17양태에 따라, 샘플로부터의 16S rRNA 유전자를 제1양태에 정의된 적어도 하나의 SNP에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 샘플에서 세균을 분류하는 방법으로서, 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 세균을 분류하는 것인 방법; 또는 샘플로부터의 18S rRNA 유전자를 제12양태에 정의된 적어도 하나의 SNP에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하는 방법으로서, 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 제18양태에 따라, 제13양태 또는 제14양태에 정의된 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약을 샘플과 조합하는 단계, 및 넓게 전술된 바와 같이 샘플로부터의 16S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 적어도 하나의 세균을 확인하는 단계를 포함하는, 샘플에서 적어도 하나의 세균을 확인하는 방법; 또는 제13양태 또는 제14양태에 정의된 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약을 샘플과 조합하는 단계, 및 넓게 전술된 바와 같이 샘플로부터의 18S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하는 단계를 포함하는, 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제19양태에 따라, 제13양태 또는 제14양태에 정의된 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약을 샘플과 조합하는 단계, 및 넓게 전술된 바와 같이 샘플로부터의 16S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 세균을 분류하는 단계를 포함하는, 샘플에서 세균을 분류하는 방법; 또는 제13양태 또는 제14양태에 정의된 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약을 샘플과 조합하는 단계, 및 넓게 전술된 바와 같이 샘플로부터의 18S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하는 단계를 포함하는, 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제20양태에 따라, 대상체로부터 수득된 샘플로부터의 16S rRNA 유전자를 제12양태에 정의된 적어도 하나의 SNP에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 대상체에서 세균 감염을 진단하는 방법으로서, 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 샘플에서 적어도 하나의 원인 세균을 확인함으로써 세균 감염을 진단하는 것인 방법; 또는 대상체로부터 수득된 샘플로부터의 18S rRNA 유전자를 제12양태에 정의된 적어도 하나의 SNP에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 대상체에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 진단하는 방법으로서, 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 샘플에서 적어도 하나의 원인 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인함으로써 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 진단하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 제21양태에 따라, 제13양태 또는 제14양태에 정의된 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약을 대상체로부터 수득된 샘플과 조합하는 단계, 및 넓게 전술된 바와 같이 샘플로부터의 16S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 샘플에서 적어도 하나의 원인 세균을 확인함으로써 세균 감염을 진단하는 단계를 포함하는, 대상체에서 세균 감염을 진단하는 방법; 및 제13양태 또는 제14양태에 정의된 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약을 대상체로부터 수득된 샘플과 조합하는 단계, 및 넓게 전술된 바와 같이 샘플로부터의 18S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP의 존재를 근거로 샘플에서 적어도 하나의 원인 세균을 확인함으로써 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 진단하는 단계를 포함하는, 대상체에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제22양태에 따라, 제20양태 또는 제21양태에 정의된 방법에 따라 샘플에서 적어도 하나의 원인 세균을 확인함으로써 세균 감염을 진단하는 단계, 및 확인된 적어도 하나의 원인 세균을 치료하기 위한 요법 또는 치료제를 상기 대상체에게 투여함으로써 세균 감염을 치료하는 단계를 포함하는, 세균 감염을 가진 대상체를 치료하는 방법; 또는 제20양태 또는 제21양태에 정의된 방법에 따라 샘플에서 적어도 하나의 원인 세균을 확인함으로써 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 진단하는 단계, 및 확인된 적어도 하나의 원인 효모 유기체 또는 사상 진균을 치료하기 위한 요법 또는 치료제를 상기 대상체에게 투여함으로써 세균 감염을 치료하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 가진 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제23양태에 따라, 샘플에서 적어도 하나의 세균을 확인하거나 샘플에서 세균을 분류하기 위한 올리고뉴클레오타이드 프로브의 어레이로서, 상기 프로브가 넓게 전술된 바와 같이 샘플에서 16S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 어레이; 또는 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하기 위한 올리고뉴클레오타이드 프로브의 어레이로서, 상기 프로브가 넓게 전술된 바와 같이 샘플에서 18S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 어레이를 제공한다.
본 발명의 제24양태에 따라, 샘플에서 적어도 하나의 세균을 확인하거나 샘플에서 세균을 분류하기 위한, 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 마이크로어레이로서, 상기 프로브가 넓게 전술된 바와 같이 샘플에서 16S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 마이크로어레이; 또는 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하기 위한 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 마이크로어레이로서, 상기 프로브가 넓게 전술된 바와 같이 샘플에서 18S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 제25양태에 따라, 샘플에서 적어도 하나의 세균을 확인하거나 샘플에서 세균을 분류하기 위한, 고체 기판 및 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 바이오칩으로서, 상기 적어도 하나의 프로브가 넓게 전술된 바와 같이 샘플에서 16S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 바이오칩; 또는 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하기 위한, 고체 기판 및 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 바이오칩으로서, 상기 적어도 하나의 프로브가 넓게 전술된 바와 같이 샘플에서 18S rRNA 유전자 내의 적어도 하나의 SNP에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 바이오칩을 제공한다.
본 발명의 제26양태에 따라, 샘플에서 적어도 하나의 세균을 확인하거나 샘플에서 세균을 분류하는 키트 또는 어세이로서, 전술된 바와 같은 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약, 전술된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 프로브의 어레이, 전술된 바와 같은 마이크로어레이, 및/또는 전술된 바와 같은 바이오칩을 포함하는 키트 또는 어세이; 또는 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나 샘플에서 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하는 키트 또는 어세이로서, 전술된 바와 같은 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약, 전술된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 프로브의 어레이, 전술된 바와 같은 마이크로어레이, 및/또는 전술된 바와 같은 바이오칩을 포함하는 키트 또는 어세이를 제공한다.
본 발명의 제27양태에 따라, 대상체에서 감염을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나, 분류하거나 진단하는 방법을 제공한다. 제27양태의 한 실시양태에서, 상기 감염은 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염이고, 상기 방법은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 적어도 하나의 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물 또는 이의 일부, 또는 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물 또는 이의 일부의 성질에 대해 어세이하는 단계를 포함하고, 상기 어세이는 적어도 하나의 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물 또는 이의 일부, 또는 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물 또는 이의 일부에서 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)을 검출하는 단계를 포함하고, 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물 또는 이의 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있거나; 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물 또는 이의 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자에 있거나 이 유전자에 상응하거나; 샘플에서 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균은 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재를 근거로 확인되거나, 부분적으로 확인되거나, 분류되거나 진단된다.
제27양태의 또 다른 실시양태에서, 상기 감염은 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염이고, 상기 방법은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 적어도 하나의 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물 또는 이의 일부, 또는 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물 또는 이의 일부의 성질에 대해 어세이하는 단계를 포함하고, 상기 어세이는 적어도 하나의 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물 또는 이의 일부, 또는 적어도 하나의 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물 또는 이의 일부에서 적어도 하나의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)을 검출하는 단계를 포함하고, 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물 또는 이의 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647, 653, 737, 755, 762 및 776 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있고, 상기 샘플에서 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균은 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재를 근거로 확인되거나, 부분적으로 확인되거나, 분류되거나 진단된다.
본 발명의 제1양태 내지 제27양태의 특징은 적절한 경우 이하에 기재된 바와 같을 수 있다.
한 실시양태에서, 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 상기 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647, 653, 737, 755, 762 및 776 중 적어도 하나에 상응하는 위치의 SNP들로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 초과의 SNP가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 적어도 2개의 SNP들, 적어도 3개의 SNP들, 적어도 4개의 SNP들, 적어도 5개의 SNP들, 적어도 6개의 SNP들, 적어도 7개의 SNP들, 적어도 8개의 SNP들, 적어도 9개의 SNP들, 적어도 10개의 SNP들 또는 심지어 적어도 11개의 SNP들이 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 상기 적어도 하나의 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653에 상응하는 위치의 SNP들로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 초과의 SNP가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 적어도 2개의 SNP들, 적어도 3개의 SNP들, 적어도 4개의 SNP들, 적어도 5개의 SNP들, 적어도 6개의 SNP들, 또는 심지어 적어도 7개의 SNP들이 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 상기 적어도 하나의 SNP는 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자에 있을 수 있거나 이 유전자에 상응할 수 있다. 서열번호 43으로 기재된 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 746, 764, 771 또는 785(또는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 737, 755, 762 또는 776) 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있을 수 있다. 적어도 하나의 상기 SNP, 적어도 2개의 상기 SNP들, 적어도 3개의 상기 SNP들 또는 적어도 4개의 상기 SNP들이 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 37로 기재된 18S rRNA 유전자에 있을 수 있거나 이 유전자에 상응할 수 있다. 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 SNP는 서열번호 37로 기재된 18S rRNA 유전자의 위치 343, 371, 388, 416 및 467 중 적어도 하나에 상응하는 위치에 있을 수 있다. 적어도 하나의 상기 SNP, 적어도 2개의 상기 SNP들, 적어도 3개의 상기 SNP들, 적어도 4개의 상기 SNP들 또는 적어도 5개의 상기 SNP들이 사용될 수 있다.
추가 실시양태에서, 상기 방법은 샘플로부터의 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 샘플로부터의 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부를, 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653에 상응하는 위치에서 세균 16S rRNA 유전자 내의 단일 뉴클레오타이드 다형성; 또는 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 746, 764, 771 및 785에 상응하는 위치에서 세균 16S rRNA 유전자 내의 단일 뉴클레오타이드 다형성; 또는 서열번호 37로 기재된 18S rRNA 유전자의 위치 343, 371, 388, 416 및 467에 상응하는 위치에서 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 내의 단일 뉴클레오타이드 다형성의 존재 또는 부재에 대해 분석하는 단계를 포함한다.
추가 실시양태에서, 상기 방법은 샘플로부터의 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 샘플로부터의 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부를, 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647, 653, 737, 755, 762 및 776 중 적어도 4개의 위치에 상응하는 위치에서 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부 내의 단일 뉴클레오타이드 다형성; 또는 서열번호 37로 기재된 18S rRNA 유전자의 위치 343, 371, 388, 416 및 467에 상응하는 위치에서 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 내의 단일 뉴클레오타이드 다형성의 존재 또는 부재에 대해 분석하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세균 또는 세균들은 포유동물(예를 들면, 인간) 관련 세균, 토양 관련 세균 및 물 관련 세균으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 세균 또는 세균들은 패혈증 관련 세균 또는 세균들일 수 있다.
일부 특정 실시양태에서, 세균 또는 세균들은 악시네토박터 속(Acinetobacter spp.); 악티노바실루스 속(Actinobaccillus spp.); 악티노마두라 속(Actinomadura spp.); 악티노마이세스 속(Actinomyces spp.); 악티노플라네스 속(Actinoplanes spp.); 애로모나스 속(Aeromonas spp.); 아그로박테리움 속(Agrobacterium spp.); 알리스티페스 속(Alistipes spp.); 아내로코쿠스 속(Anaerococcus spp.); 아르쓰로박터 속(Arthrobacter spp.); 바실루스 속(Bacillus spp.); 박테로이데스 속(Bacteroides spp.); 브루셀라 속(Brucella spp.); 불레이디아 속(Bulleidia spp.); 부르크홀데리아 속(Burkholderia spp.); 카르디오박테리움 속(Cardiobacterium spp.); 시트로박터 속(Citrobacter spp.); 클로스트리듐 속(Clostridium spp.); 코르니에박테리움 속(Cornyebacterium spp.); 데르마토필루스 속(Dermatophilus spp.); 도레아 속(Dorea spp.); 엔테로박터 속(Enterobacter spp.); 엔테로코쿠스 속(Enterococcus spp.); 에리시펠로쓰릭스 속(Erysipelothrix spp.); 에스케리키아 속(Escherichia spp.); 유박테리움 속(Eubacterium spp.); 에워드시엘라 속(Ewardsiella spp.); 패칼리박테리움 속(Faecalibacterium spp.); 필리팩터 속(Filifactor spp.); 피네골디아 속(Finegoldia spp.); 플라보박테리움 속(Flavobacterium spp.); 프란시셀라 속(Francisella spp.); 갈리콜라 속(Gallicola spp.); 해모필루스 속(Haemophilus spp.) 속; 헬로코쿠스 속(Helococcus spp.); 홀데마니아 속(Holdemania spp.); 하이포마이크로비움 속(Hyphomicrobium spp.); 클렙시엘라 속(Klebsiella spp.); 락토바실루스 속(Lactobacillus spp.); 레기오넬라 속(Legionella spp.); 리스테리아 속(Listeria spp.); 메틸로박테리움 속(Methylobacterium spp.); 마이크로코쿠스 속(Micrococcus spp.); 마이크로모노스포라 속(Micromonospora spp.); 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus spp.); 모락셀라 속(Moraxella spp.); 모르가넬라 속(Morganella spp.); 마이코박테리움 속(Mycobacterium spp.); 네이세리아 속(Neisseria spp.); 노카르디아 속(Nocardia spp.); 패니바실루스 속(Paenibacillus spp.); 파라박테로이데스 속(Parabacteroides spp.); 파스퇴렐라 속(Pasteurella spp.); 펩토니필루스 속(Peptoniphilus spp.); 펩토스트렙토코쿠스 속(Peptostaphylococcus spp.); 플라노코쿠스 속(Planococcus spp.); 플라노마이크로비움 속(Planomicrobium spp.); 플레시오모나스 속(Plesiomonas spp.); 포르피로모나스 속(Porphyromonas spp.); 프레보텔라 속(Prevotella spp.); 프로피오니박테리움 속(Propionibacterium spp.); 프로테우스 속(Proteus spp.); 프로비덴티아 속(Providentia spp.); 슈도모나스 속(Pseudomonas spp.); 랄스토니아 속(Ralstonia spp.); 로도코쿠스 속(Rhodococcus spp.); 로세부리아 속(Roseburia spp.); 루미노코쿠스 속(Ruminococcus spp.); 살모넬라 속(Salmonella spp.); 세디멘티박터 속(Sedimentibacter spp.); 세라티아 속(Serratia spp.); 시겔라 속(Shigella spp.); 솔로박테리움 속(Solobacterium spp.); 스핑고모나스 속(Sphingomonas spp.); 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus spp.); 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas spp.); 스트렙토코쿠스 속(Streptococcus spp.); 스트렙토마이세스 속(Streptomyces spp.); 티시에렐라 속(Tissierella spp.); 비브리오 속(Vibrio spp.); 및 예르시니아 속(Yersinia spp.); 중 적어도 하나로부터 선택된다.
일부 더 구체적인 실시양태에서, 세균 또는 세균들은 악시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii); 악시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus); 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis); 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus); 시트로박터 프레운디이(Citrobacter freundii); 엔테로박터 애로게네스(Enterobacter aerogenes); 엔테로박터 클로아카(Enterobacter cloacae); 엔테로코쿠스 아비움(Enterococcus avium); 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis); 엔테로코쿠스 패시움(Enterococcus faecium); 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli); 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca); 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae); 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis); 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa); 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens); 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus); 스타필로코쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis); 스타필로코쿠스 호미니스(Staphylococcus hominis); 스타필로코쿠스 사프로파이티쿠스(Staphylococcus saprophyticus); 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia); 스트렙토코쿠스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae); 스트렙토코쿠스 안기노수스(Streptococcus anginosus); 스트렙토코쿠스 콘스텔라투스(Streptococcus constellatus); 스트렙토코쿠스 인터메디우스(Streptococcus intermedius); 스트렙토코쿠스 밀러리(Streptococcus milleri); 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis); 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans); 스트렙토코쿠스 오랄리스(Streptococcus oralis); 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae); 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes); 스트렙토코쿠스 상귀니스(Streptococcus sanguinis); 및 스트렙토코쿠스 소브리누스(Streptococcus sobrinus) 중 적어도 하나로부터 선택된다.
구체적인 실시양태에서, 세균 또는 세균들은 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 애로게네스; 엔테로박터 클로아카; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 세라티아 마르세센스; 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스 중 적어도 하나로부터 선택된다.
구체적인 실시양태에서, 세균 또는 세균들은 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 애로게네스; 엔테로박터 클로아카; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 세라티아 마르세센스; 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 스트렙토코쿠스 피오게네스; 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes); 클로스트리듐 퍼프링겐스(Clostridium perfringens); 코리네박테리움 제이케이움(Corynebacterium jeikeium); 박테로이데스 프라길리스; 네이세리아 메닝기티데스(Neisseria meningitides); 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae); 살모넬라 속(sp.); 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스 중 적어도 하나로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 세균 또는 세균들은 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 애로게네스; 엔테로박터 클로아카; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 세라티아 마르세센스; 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 스트렙토코쿠스 피오게네스; 리스테리아 모노사이토게네스; 클로스트리듐 퍼프링겐스; 코리네박테리움 제이케이움; 박테로이데스 프라길리스; 네이세리아 메닝기티데스; 해모필루스 인플루엔자; 살모넬라 속(sp.); 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 바실루스 안쓰라시스(Bacillus anthracis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 및 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei) 중 적어도 하나로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 세균 또는 세균들은 보완 민감성 생물학적 물질(SSBA)이다. SSBA는 단계 1 물질 또는 단계 2 물질일 수 있다. 예시적 단계 1 물질은 바실루스 안쓰라시스(탄저병) 및 예르시니아 페스티스(흑사병) 중 하나 이상을 포함한다. 예시적 단계 2 물질은 클로스트리듐 보툴리눔(보툴리눔독소증, 특히 독소 생성 균주); 프란시셀라 툴라렌시스(야토병); 살모넬라 타이피(Sallmonella Typhi)(장티푸스); 및 비브리오 콜레라(특히 콜레라 혈청형 O1 또는 O139) 중 하나 이상을 포함한다. 한 실시양태에서, 세균 또는 세균들은 바실루스 안쓰라시스, 클로스트리듐 보툴리눔, 예르시니아 페스티스, 프란시셀라 툴라렌시스, 비브리오 콜레라 및 부르크홀데리아 슈도말레이로 이루어진 군의 적어도 하나로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 효모 유기체는 칸디다 속(Candida spp.), 크립토코쿠스 속(Cryptococcus spp.) 및 로도토룰라 속(Rhodotorula spp.) 중 적어도 하나로부터 선택될 수 있다. 예시적 칸디다 속은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 스텔라토이데아(Candida stellatoidea), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 귈리에르몬디이(Candida guilliermondii), 칸디다 비스와나티이(Candida viswanathii), 칸디다 아우리스(Candida auris) 및 칸디다 루시타니아(Candida lusitaniae) 중 적어도 하나로부터 선택될 수 있다. 예시적 크립토코쿠스 속은 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) 및 크립토코쿠스 가티이(Cryptococcus gattii) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 예시적 로도토룰라 속은 로도토룰라 뮤실라기노사(Rhodotorula mucilaginosa)일 수 있다.
한 실시양태에서, 사상 진균은 아스퍼길루스 속(Aspergillus spp.) 및 푸사리움 속(Fusarium spp.) 중 적어도 하나로부터 선택될 수 있다. 예시적 푸사리움 속은 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides), 푸사리움 프롤리퍼라툼(Fusarium proliferatum), 푸사리움 아베나세움(Fusarium avenaceum), 푸사리움 부비게움(Fusarium bubigeum), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 랭세티아(Fusarium langsethiae), 푸사리움 포아(Fusarium poae), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 트리신크툼(Fusarium tricinctum) 및 푸사리움 비르굴리포르메(Fusarium virguliforme) 중 적어도 하나; 특히 푸사리움 솔라니, 푸사리움 옥시스포룸, 푸사리움 베르티실리오이데스 및 푸사리움 프롤리퍼라툼 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 예시적 아스퍼길루스 속은 아스퍼길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스퍼길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스퍼길루스 렌툴루스(Aspergillus lentulus), 아스퍼길루스 테레우스(Aspergillus terreus) 및 아스퍼길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 중 적어도 하나; 특히 아스퍼길루스 푸미가투스, 아스퍼길루스 플라부스 및 아스퍼길루스 클라바투스 중 적어도 하나; 더 특히 아스퍼길루스 푸미가투스를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 효모 유기체 또는 사상 진균은 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파랍실로시스, 칸디다 글라브라타, 푸사리움 속(sp.), 아스퍼길루스 푸미가투스 및 크립토코쿠스 네오포르만스로 이루어진 군의 적어도 하나이다.
한 실시양태에서, 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균은 인간 병원체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여, 전신 염증 반응 증후군(SIRS)을 가진 대상체로부터의 혈액을 분석함으로써 SIRS의 기원(예를 들면, 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균)을 확인할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여, 대상체가 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염성 기원을 가진 패혈증을 갖는지를 확인할 수 있다. 상기 두 실시양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여, 샘플에 존재하는 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균의 존재를 확인할 수 있고/있거나, 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 식별할 수 있고/있거나 확인할 수 있다.
SIRS는 감염성 병인 또는 비감염성 병인(즉, 감염 음성 SIRS 또는 inSIRS)을 가질 수 있는 엄청난 전신 반응이다. 패혈증은 감염 동안 일어나는 SIRS이다. 이 경우 패혈증은 (의심된 감염이 있을 때) 임상의에 의해, 또는 유기체의 배양을 통해 진단된다. SIRS 및 패혈증 둘 다가 심박수, 호흡수, 체온 및 백혈구 세포 총수를 포함하는 다수의 비-특이적 숙주 반응 파라미터들에 의해 정의된다(Levy et al., 2003; Reinhart et al., 2012).
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 SNP, 또는 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약을 사용하여 샘플 중의 세균을 그람 양성 세균 또는 세균들, 또는 그람 음성 세균 또는 세균들로서 분류할 수 있다.
예를 들면, 일부 실시양태에서, 세균 또는 세균들은 특히 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653 중 적어도 하나에서 상기 SNP들 중 어느 한 SNP를 근거로 그람 양성으로서 분류될 수 있다. 하나의 이러한 실시양태에서, 세균들 또는 세균은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273 및 653에 상응하는 위치에서 SNP를 근거로 분류될 수 있고, 이때 상기 세균 또는 세균들은 위치 273에 A가 있고 위치 653에 T가 있을 때 그람 양성인 것으로 확인된다.
예를 들면, 또 다른 실시양태에서, 세균 또는 세균들은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 440에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 SNP를 근거로 그람 양성으로서 분류될 수 있고, 이때 상기 세균 또는 세균들은 위치 440에 T가 있을 때 그람 양성인 것으로 확인된다. 대조적으로, 상기 세균 또는 세균들은 위치 440에 T가 없을 때 그람 음성인 것으로 확인된다.
다른 실시양태에서, 적어도 하나의 SNP, 또는 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약을 사용하여 샘플에서 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균의 군을 분류할 수 있다.
예를 들면, 일부 실시양태에서, 세균은 상기 SNP들로부터 선택된 적어도 하나의 SNP를 근거로 특정 속에 속하는 것으로서 분류될 수 있다. 하나의 이러한 실시양태에서, 세균은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 412 및 647에 상응하는 위치에서 SNP들로부터 선택된 적어도 하나의 SNP를 근거로 특정 속에 속하는 것으로서 분류될 수 있다. 예를 들면, 샘플 중의 세균 또는 세균들은 위치 412에 T가 있을 때 스타필로코쿠스 속에 속하는 것으로서 분류될 수 있다. 예를 들면, 샘플 중의 세균 또는 세균들은 위치 647에 G가 있을 때 엔테로코쿠스 속에 속하는 것으로서 분류될 수 있다.
다른 실시양태에서, 적어도 하나의 SNP, 또는 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약을 사용하여 전술된 바와 같이 샘플에서 세균을 확인할 수 있다.
예를 들면, 세균 엔테로박터 클로아카는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 653에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 SNP를 근거로 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 세균 엔테로박터 클로아카는 위치 653에 G가 있을 때 확인된다.
예를 들면, 스트렙토코쿠스 뉴모니아, 스트렙토코쿠스 아갈락티아 및 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 선택된 세균은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 378 및 488에 상응하는 위치에서 SNP를 근거로 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 세균은 위치 378에 A가 있고 위치 488에 T가 있을 때 스트렙토코쿠스 뉴모니아이고; 위치 378에 A가 있고 위치 488에 A가 있을 때 스트렙토코쿠스 아갈락티아이고; 위치 378에 G가 있고 위치 488에 A가 있을 때 스트렙토코쿠스 피오게네스이다.
예를 들면, 한 실시양태에서, 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 클로아카; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 선택된 세균은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653에 상응하는 위치에서 SNP를 근거로 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 세균은 위치 273, 440 및 647에 A가 있을 때 악시네토박터 칼코아세티쿠스이고; 위치 653에 G가 있을 때 엔테로박터 클로아카이고; 위치 273에 T가 있고 위치 653에 T가 있을 때 에스케리키아 콜라이이고; 위치 273에 T가 있고 위치 488 및 647에 C가 있고 위치 653에 A가 있을 때 클렙시엘라 뉴모니아이고; 위치 440 및 488에 C가 있고 위치 647에 T가 있을 때 프로테우스 미라빌리스이고; 위치 440에 A가 있고 위치 647에 T가 있을 때 슈도모나스 애루기노사이고; 위치 378, 488 및 647에 A가 있을 때 스트렙토코쿠스 아갈락티아이고; 위치 488 및 647에 T가 있을 때 스트렙토코쿠스 뉴모니아이고; 위치 378에 G가 있고 위치 488 및 647에 A가 있을 때 스트렙토코쿠스 피오게네스이다.
예를 들면, 또 다른 실시양태에서, 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 클로아카; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 선택된 세균은 하기 표에 기재된 SNP들의 존재를 근거로 샘플에서 확인될 수 있다:
예를 들면, 또 다른 실시양태에서, 에스케리키아 콜라이, 스트렙토코쿠스 뉴모니아, 스트렙토코쿠스 아갈락티아, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 프로테우스 미라빌리스, 엔테로박터 클로아카, 클렙시엘라 뉴모니아, 슈도모나스 애루기노사, 악시네토박터 칼코아세티쿠스, 엔테로코쿠스 패칼리스, 리스테리아 모노사이토게네스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 클로스트리듐 퍼프링겐스, 코리네박테리움 제이케이움, 박테로이데스 프라길리스, 네이세리아 메닝기티디스, 해모필루스 인플루엔자, 세라티아 마르세센스, 살모넬라 속(sp.) 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스로부터 선택된 세균은 하기 표에 기재된 SNP들의 존재를 근거로 샘플에서 확인될 수 있다:
또 다른 실시양태에서, 바실루스 안쓰라시스, 클로스트리듐 보툴리눔 A형, 클로스트리듐 보툴리눔 B형, 클로스트리듐 보툴리눔 C형, 클로스트리듐 보툴리눔 D형, 클로스트리듐 보툴리눔 G형, 예르시니아 페스티스, 프란시셀라 툴라렌시스, 비브리오 콜레라 및 부르크홀데리아 슈도말레이로부터 선택된 세균은 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 746, 764, 771 또는 785에 상응하는 위치에서 SNP들을 근거로 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 세균은 위치 746에 T가 있고 위치 764에 A가 있고 위치 771에 C가 있고 위치 785에 G가 있을 때 바실루스 안쓰라시스이고; 위치 746에 T가 있고 위치 764에 G가 있고 위치 771에 C가 있고 위치 785에 T가 있을 때 클로스트리듐 보툴리눔 A형 또는 클로스트리듐 보툴리눔 B형이고; 위치 746에 T가 있고 위치 764에 A가 있고 위치 771에 T가 있고 위치 785에 T가 있을 때 클로스트리듐 보툴리눔 C형이고; 위치 746에 C가 있고 위치 764에 A가 있고 위치 771에 T가 있고 위치 785에 T가 있을 때 클로스트리듐 보툴리눔 D형이고; 위치 746에 T가 있고 위치 764에 G가 있고 위치 771에 C가 있고 위치 785에 G가 있을 때 클로스트리듐 보툴리눔 G형이고; 위치 746에 C가 있고 위치 764에 G가 있고 위치 771에 C가 있고 위치 785에 G가 있을 때 예르시니아 페스티스이고; 위치 746에 T가 있고 위치 764에 A가 있고 위치 771에 G가 있고 위치 785에 G가 있을 때 프란시셀라 툴라렌시스이고; 위치 746에 C가 있고 위치 764에 A가 있고 위치 771에 T가 있고 위치 785에 G가 있을 때 비브리오 콜레라이고; 위치 746에 C가 있고 위치 764에 G가 있고 위치 771에 C가 있고 위치 785에 G가 있을 때 부르크홀데리아 슈도말레이이다.
예를 들면, 또 다른 실시양태에서, 바실루스 안쓰라시스, 클로스트리듐 보툴리눔 A형, 클로스트리듐 보툴리눔 B형, 클로스트리듐 보툴리눔 C형, 클로스트리듐 보툴리눔 D형, 클로스트리듐 보툴리눔 G형, 예르시니아 페스티스, 프란시셀라 툴라렌시스, 비브리오 콜레라 및 부르크홀데리아 슈도말레이로부터 선택된 세균은 하기 표에 기재된 SNP들의 존재를 근거로 샘플에서 확인될 수 있다:
상기 유기체들을 확인하는 데 사용된 4개의 SNP들의 누적 식별 지수는 1개의 SNP에 대해 0.667; 2개의 SNP들에 대해 0.889; 3개의 SNP들에 대해 0.944; 그리고 4개의 SNP들에 대해 0.972이다.
서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 746은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 737에 상응한다. 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 764는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 755에 상응한다. 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 771은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 762에 상응한다. 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 785는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 776에 상응한다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 바실루스 안쓰라시스, 클로스트리듐 보툴리눔 A형, 클로스트리듐 보툴리눔 B형, 클로스트리듐 보툴리눔 C형, 클로스트리듐 보툴리눔 D형, 클로스트리듐 보툴리눔 G형, 예르시니아 페스티스, 프란시셀라 툴라렌시스, 비브리오 콜레라 및 부르크홀데리아 슈도말레이로부터 선택된 세균은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 737, 755, 762 또는 776에 상응하는 위치에서 SNP들을 근거로 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 세균은 위치 737에 T가 있고 위치 755에 A가 있고 위치 762에 C가 있고 위치 776에 G가 있을 때 바실루스 안쓰라시스이고; 위치 737에 T가 있고 위치 755에 G가 있고 위치 762에 C가 있고 위치 776에 T가 있을 때 클로스트리듐 보툴리눔 A형 또는 클로스트리듐 보툴리눔 B형이고; 위치 737에 T가 있고 위치 755에 A가 있고 위치 762에 T가 있고 위치 776에 T가 있을 때 클로스트리듐 보툴리눔 C형이고; 위치 737에 C가 있고 위치 755에 A가 있고 위치 762에 T가 있고 위치 776에 T가 있을 때 클로스트리듐 보툴리눔 D형이고; 위치 737에 T가 있고 위치 755에 G가 있고 위치 762에 C가 있고 위치 776에 G가 있을 때 클로스트리듐 보툴리눔 G형이고; 위치 737에 C가 있고 위치 755에 G가 있고 위치 762에 T가 있고 위치 776에 G가 있을 때 예르시니아 페스티스이고; 위치 737에 T가 있고 위치 755에 A가 있고 위치 762에 G가 있고 위치 776에 G가 있을 때 프란시셀라 툴라렌시스이고; 위치 737에 C가 있고 위치 755에 A가 있고 위치 762에 T가 있고 위치 776에 G가 있을 때 비브리오 콜레라이고; 위치 737에 C가 있고 위치 755에 G가 있고 위치 762에 C가 있고 위치 776에 G가 있을 때 부르크홀데리아 슈도말레이이다.
또 다른 실시양태에서, 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파랍실로시스, 칸디다 글라브라타, 푸사리움 속(spp.), 아스퍼길루스 푸미가투스 및 크립토코쿠스 네오포르만스로부터 선택된 효모 유기체 또는 사상 진균은 서열번호 37로 기재된 18S rRNA 유전자의 위치 343, 371, 388, 416 및 467에 상응하는 위치에서 SNP들을 근거로 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 효모 유기체 또는 사상 진균은 위치 343에 C가 있고 위치 371에 A가 있고 위치 388에 T가 있고 위치 416에 G가 있고 위치 467에 G가 있을 때 칸디다 알비칸스이고; 위치 343에 C가 있고 위치 371에 A가 있고 위치 388에 C가 있고 위치 416에 G가 있고 위치 467에 C가 있을 때 칸디다 트로피칼리스이고; 위치 343에 C가 있고 위치 371에 A가 있고 위치 388에 C가 있고 위치 416에 G가 있고 위치 467에 G가 있을 때 칸디다 파랍실로시스이고; 위치 343에 T가 있고 위치 371에 A가 있고 위치 388에 C가 있고 위치 416에 G가 있고 위치 467에 G가 있을 때 칸디다 글라브라타이고; 위치 343에 C가 있고 위치 371에 C가 있고 위치 388에 T가 있고 위치 416에 T가 있고 위치 467에 G가 있을 때 푸사리움 속(spp.)이고; 위치 343에 C가 있고 위치 371에 C가 있고 위치 388에 T가 있고 위치 416에 C가 있고 위치 467에 G가 있을 때 아스퍼길루스 푸미가투스이고; 위치 343에 C가 있고 위치 371에 A가 있고 위치 388에 T가 있고 위치 416에 T가 있고 위치 467에 G가 있을 때 크립토코쿠스 네오포르만스이다.
예를 들면, 또 다른 실시양태에서, 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파랍실로시스, 칸디다 글라브라타, 푸사리움 속(spp.), 아스퍼길루스 푸미가투스 및 크립토코쿠스 네오포르만스로부터 선택된 효모 유기체 또는 사상 진균은 하기 표에 기재된 SNP들의 존재를 근거로 샘플에서 확인될 수 있다:
세균, 효모 유기체 또는 사상 진균은 상기 SNP들 중 하나 이상의 SNP를 근거로 부분적으로 확인될 수 있거나 분류될 수 있다.
한 실시양태에서, 핵산은 본 발명의 방법에서(특히 제1양태 및 제2양태에서) 분석 전에 샘플로부터 추출된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법에서(특히 제1양태 및 제2양태에서) 분석하는 단계는 핵산의 증폭을 포함할 수 있다. 핵산은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가제(ligase) 연쇄 반응(LCR), 및 전사된 RNA를 증폭할 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드/프라이머를 사용하는 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당분야에서 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 증폭될 수 있다.
SNP는 고해상 용융 분석, 5' 뉴클레아제(nuclease) 소화(5' 뉴클레아제 소화를 포함함), 분자 비콘(beacon), 올리고뉴클레오타이드 라이게이션(ligation), 마이크로어레이, 제한 단편 길이 다형성, 항체 검출 방법, 직접적인 시퀀싱 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당분야에서 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 분석될 수 있다. 한 실시양태에서, 방법에서(특히 본 발명의 제1양태 및 제2양태에서) 분석하는 단계는 고해상 용융 분석, 5' 뉴클레아제 소화, 분자 비콘, 올리고뉴클레오타이드 라이게이션, 마이크로어레이, 제한 단편 길이 다형성, 항체 검출 방법, 직접적인 시퀀싱 또는 이들의 임의의 조합을 이용하여 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. SNP는 중합효소 연쇄 반응(PCR); 리가제 연쇄 반응(LCR); 하이브리드화 분석; 고해상 용융 분석; 5' 뉴클레아제 소화를 포함하는, 뉴클레아제를 사용한 소화; 분자 비콘; 올리고뉴클레오타이드 라이게이션; 마이크로어레이; 제한 단편 길이 다형성; 항체 검출 방법; 직접적인 시퀀싱; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당분야에서 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다.
예를 들면, 일부 실시양태에서, 세균의 확인 또는 세균의 분류는 넓게 전술된 바와 같이 SNP 및 이의 주변 DNA 서열의 DNA 용융 특성, 바람직하게는 고해상 용융 분석에 근거를 둘 수도 있다.
예를 들면, 일부 이러한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 넓게 전술된 바와 같이 SNP 및 이의 주변 DNA 서열의 DNA 용융 특성을 더 분석하기 위해 고해상 용융(HRM) 분석을 추가로 포함할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, HRM 분석은 적어도 하나의 SNP 및 적어도 하나의 삽입 형광 염료를 함유하는 DNA 증폭 생성물(즉, 앰플리콘)을 형성하는 단계 및 이의 용융 온도(T m )를 통해 DNA 증폭 생성물을 가열하는 단계를 포함할 수 있다. HRM은 DNA 증폭 생성물 내로 도입된 형광 염료를 사용함으로써 실시간으로 모니터링된다. 형광의 수준은 이중 가닥 DNA의 양이 감소할 때 감소하는 형광과 함께 온도 증가로서 모니터링된다. 형광 및 온도의 변화는 용융 곡선으로서 공지되어 있는 그래프로 작도될 수 있다.
숙련된 당업자가 이해할 바와 같이, DNA 증폭 생성물을 형성하는 뉴클레오타이드 염기의 서열에 의존하는, 2개의 DNA 가닥들이 분리되는 DNA 증폭 생성물의 T m 은 예측될 수 있다. 따라서, 용융 곡선이 상이한 것으로 보일 때, 다형성(즉, SNP 또는 SNP들)을 함유하는 DNA 증폭 생성물을 포함하는 DNA 증폭 생성물들을 식별할 수 있다. 실제로, 일부 실시양태에서, 주변 DNA 서열의 차이를 근거로 동일한 다형성을 함유하는 DNA 증폭 생성물들을 식별할 수 있다.
예를 들면, 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 애로게네스; 엔테로박터 클로아카; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 세라티아 마르세센스; 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 선택된 세균은 하기 표에 기재된 SNP들의 존재, 및 이 SNP들 및 이들의 주변 DNA 서열의 DNA 용융 특성을 근거로 샘플에서 확인될 수 있다:
예를 들면, 에스케리키아 콜라이, 스트렙토코쿠스 뉴모니아, 스트렙토코쿠스 아갈락티아, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 프로테우스 미라빌리스, 엔테로박터 클로아카, 클렙시엘라 뉴모니아, 슈도모나스 애루기노사, 악시네토박터 칼코아세티쿠스, 엔테로코쿠스 패칼리스, 리스테리아 모노사이토게네스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 클로스트리듐 퍼프링겐스, 코리네박테리움 제이케이움, 박테로이데스 프라길리스, 네이세리아 메닝기티디스, 해모필루스 인플루엔자, 세라티아 마르세센스, 살모넬라 속(sp.), 스타필로코쿠스 에피데르미디스로부터 선택된 세균은 표 2에 기재된 SNP들의 존재, 및 이 SNP들 및 이들의 주변 DNA 서열의 DNA 용융 특성을 근거로 샘플에서 확인될 수 있다.
한 실시양태에서, 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 애로게네스; 엔테로박터 클로아카; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 세라티아 마르세센스; 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 선택된 세균은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653에 상응하는 위치의 SNP들, 및 이 SNP들 및 이들의 주변 DNA 서열의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 샘플에서 확인될 수 있다.
예를 들면, 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 클로아카; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 선택된 세균은 전술된 SNP 위치들, 및/또는 상기 SNP들 및 이들의 주변 DNA 서열의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 샘플에서 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 세라티아 마르세센스; 및 엔테로박터 애로게네스로부터 선택된 세균은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 412, 440, 488 및 647에 상응하는 위치의 SNP들을 근거로 샘플에서 개별적으로 확인될 수 있고, 이때 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스는 위치 412에 T가 있을 때 확인될 수 있고, 그 후 위치 412에서 SNP를 둘러싸는 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 서로 더 식별될 수 있고; 엔테로코쿠스 패칼리스 및 엔테로코쿠스 패시움은 위치 647에 G가 있을 때 확인될 수 있고, 그 후 위치 647에서 SNP를 둘러싸는 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 서로 더 식별될 수 있고; 세라티아 마르세센스 및 엔테로박터 애로게네스는 위치 440 및 647에 C가 있고 위치 488에 T가 있을 때 확인될 수 있고, 그 후 위치 440, 488 및 647 중 어느 한 위치에서 SNP를 둘러싸는 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 서로 더 식별될 수 있다.
다른 실시양태에서, 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 선택된 세균은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 378에 상응하는 위치의 적어도 하나의 SNP, 및 위치 378에서 SNP를 둘러싸는 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 샘플에서 확인될 수 있다.
예를 들면, 바실루스 안쓰라시스, 클로스트리듐 보툴리눔 A형, 클로스트리듐 보툴리눔 B형, 클로스트리듐 보툴리눔 C형, 클로스트리듐 보툴리눔 D형, 클로스트리듐 보툴리눔 G형, 예르시니아 페스티스, 프란시셀라 툴라렌시스, 비브리오 콜레라 및 부르크홀데리아 슈도말레이로부터 선택된 세균은 하기 표에 기재된 SNP들의 존재, 및 이 SNP들 및 이들의 주변 DNA 서열의 DNA 용융 특성을 근거로 샘플에서 확인될 수 있다:
상기 인식된 바와 같이, 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 746은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 737에 상응한다. 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 764는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 755에 상응한다. 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 771은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 762에 상응한다. 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 785는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 776에 상응한다.
한 실시양태에서, 바실루스 안쓰라시스, 클로스트리듐 보툴리눔 A형, 클로스트리듐 보툴리눔 B형, 클로스트리듐 보툴리눔 C형, 클로스트리듐 보툴리눔 D형, 클로스트리듐 보툴리눔 G형, 예르시니아 페스티스, 프란시셀라 툴라렌시스, 비브리오 콜레라 및 부르크홀데리아 슈도말레이로부터 선택된 세균은 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 746, 764, 771 또는 785(또는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 737, 755, 762 또는 776)에 상응하는 위치의 SNP들, 및 이 SNP들 및 이들의 주변 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 샘플에서 확인될 수 있다.
예를 들면, 바실루스 안쓰라시스, 클로스트리듐 보툴리눔 A형, 클로스트리듐 보툴리눔 B형, 클로스트리듐 보툴리눔 C형, 클로스트리듐 보툴리눔 D형, 클로스트리듐 보툴리눔 G형, 예르시니아 페스티스, 프란시셀라 툴라렌시스, 비브리오 콜레라 및 부르크홀데리아 슈도말레이로부터 선택된 세균은 전술된 SNP 위치들, 및/또는 상기 SNP들 및 이들의 주변 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 샘플에서 확인될 수 있다.
또 다른 예에서, 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파랍실로시스, 칸디다 글라브라타, 푸사리움 속(spp.), 아스퍼길루스 푸미가투스 및 크립토코쿠스 네오포르만스로부터 선택된 효모 유기체 또는 사상 진균은 하기 표에 기재된 SNP들의 존재, 및 이 SNP들 및 이들의 주변 DNA 서열의 DNA 용융 특성을 근거로 샘플에서 확인될 수 있다:
한 실시양태에서, 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파랍실로시스, 칸디다 글라브라타, 푸사리움 속(spp.), 아스퍼길루스 푸미가투스 및 크립토코쿠스 네오포르만스로부터 선택된 효모 유기체 또는 사상 진균은 서열번호 37로 기재된 18S rRNA 유전자의 위치 343, 371, 388, 416 및 467에 상응하는 위치의 SNP들, 및 이 SNP들 및 이들의 주변 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 샘플에서 확인될 수 있다.
예를 들면, 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파랍실로시스, 칸디다 글라브라타, 푸사리움 속(spp.), 아스퍼길루스 푸미가투스 및 크립토코쿠스 네오포르만스로부터 선택된 효모 유기체 또는 사상 진균은 전술된 SNP 위치들, 및/또는 상기 SNP들 및 이들의 주변 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 샘플에서 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 분석, 확인, 분류 및/또는 진단 전에 샘플로부터 추출될 수 있다. 일반적으로, 분석, 확인, 분류 및/또는 진단은 핵산의 증폭을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 분석, 확인, 분류 및/또는 진단은 치료제, 예컨대, 항생제를 대상체에게 투여하는 단계도 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, (예를 들면, 본 발명의 제3양태에서와 같은) 치료 방법은 적어도 하나의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균이 치료제에 대한 내성을 나타내는 지를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 임의의 적합한 샘플을 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 예시적 샘플은 객담, 타액, 혈액, 뇌척수액 또는 소변 샘플을 포함할 수 있다.
프로브, 수단 또는 시약은 올리고뉴클레오타이드, 프라이머, 핵산, 폴리뉴클레오타이드, DNA, cDNA, RNA, 펩타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 이들은 예를 들면, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 천연 생성, 단리된, 정제된, 화학적으로 변형된, 재조합 또는 합성 프로브, 수단 또는 시약일 수 있다.
프로브, 수단 또는 시약은 적어도 하나의 SNP를 함유하는 샘플에서 16S rRNA 유전자 또는 18S rRNA 유전자의 적어도 일부에 특이적으로 결합할 수 있거나, 이러한 일부를 특이적으로 검출할 수 있거나 확인할 수 있는 항체 또는 다른 종류의 분자 또는 화학 물질일 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
프로브, 수단 또는 시약은 임의의 수 또는 조합의 프로브, 수단 또는 시약일 수 있고, 상기 수 및 조합은 달성될 원하는 결과, 예를 들면, 게놈 수준(유전형분석) 또는 RNA 전사 수준에서의 SNP의 검출에 의해 좌우될 것이다.
프로브, 수단 또는 시약은 단리될 수 있다. 프로브, 수단 또는 시약은 검출가능하게 표지부착될 수 있다. 검출가능한 표지는 증폭 반응에 포함될 수 있다. 적합한 표지는 형광색소, 예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민, 텍사스 레드, 파이코에리쓰린, 알로파이코시아닌, 6-카복시플루오레세인(6-FAM), 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카복시플루오레세인(JOE), 6-카복시-X-로다민(ROX), 6-카복시-2',4',7',4,7-헥사클로로플루오레세인(HEX), 5-카복시플루오레세인(5-FAM) 또는 N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민(TAMRA), 방사성 표지, 예를 들면, 32P, 35S, 3H 등을 포함한다. 표지는 2 단계 시스템일 수 있고, 이때 증폭된 DNA는 고친화성 결합 파트너, 예를 들면, 아비딘, 특이적 항체 등을 가진 바이오틴, 햅텐 등에 접합되고, 이때 결합 파트너는 검출가능한 표지에 접합된다. 표지는 프라이머들 중 하나 또는 둘 다에 접합될 수 있다. 대안적으로, 증폭에 사용된 뉴클레오타이드의 풀은 표지를 증폭 생성물 내로 도입하기 위해 표지부착된다.
구체적인 실시양태에서, 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약은 게놈 수준 또는 전사 수준에서, 바람직하게는 게놈 수준에서 SNP에 특이적으로 결합하거나, SNP를 특이적으로 검출하거나 확인하기 위한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약은 표 1 내지 7 중 어느 한 표에 기재된 적어도 하나의 SNP를 함유하는 샘플에서 16S rRNA 또는 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부에 특이적으로 결합하거나, 이러한 일부를 특이적으로 검출하거나 확인하기 위한 것이다.
세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나 분류하거나, 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나 진단할 때, 단일 프로브(특히 프라이머)를 각각의 샘플과 함께 사용할 수 있거나, 다수의 프로브들(특히 프라이머들)을 각각의 샘플과 함께(즉, 하나의 용기에서) 사용할 수 있다. 이러한 프로브(특히 프라이머)를 증폭(예컨대, PCR)으로부터 수득된 미처리 용액에 첨가할 수 있다.
한 실시양태에서, 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약은 상기 정의된 SNP를 함유하는 세균 16S rRNA 유전자(또는 유전자 생성물)의 적어도 일부, 또는 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자(또는 유전자 생성물)의 적어도 일부에 각각 하이브리드화하는 2개의 프라이머들을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약은 상기 정의된 SNP를 함유하는 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부, 또는 효모 유기체 또는 사상 진균 18S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부에 하이브리드화하는 프로브를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약은 서열번호 16 내지 35 및 53 내지 57 중 적어도 하나의 서열번호로 기재된 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 상동성 또는 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 가진(또는 이러한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어진) 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 프로브, 수단 또는 시약은 프라이머일 수 있다. 상기 프로브, 수단 또는 시약은 서열번호 16 내지 35 및 53 내지 57 중 적어도 하나의 서열번호로 기재된 뉴클레오타이드 서열을 가진 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 서열번호 16 내지 35 및 53 내지 57 중 적어도 하나의 서열번호로 기재된 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 상동성 또는 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 가진(또는 이러한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어진) 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 단리된 프로브, 수단 또는 시약을 제공한다. 상기 프로브, 수단 또는 시약은 프라이머일 수 있다.
서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 서열 내의 SNP를 확인하기에(특히 표 3의 SNP들을 확인하기에) 적합한 프라이머는 하기 표에 제시된 바와 같을 수 있다.
서열번호 37로 기재된 18S rRNA 서열 내의 SNP를 확인하기에(특히 표 4의 SNP들을 확인하기에) 적합한 프라이머는 하기 표에 제시된 바와 같을 수 있다.
본원에 기재된 특징들 중 임의의 특징을 본 발명의 범위 내에서 본원에 기재된 다른 특징들 중 어느 하나 이상의 특징과 임의의 조합으로 조합할 수 있다.
상기 설명은 주로 16S rRNA 및 18S rRNA 유전자의 용도를 논의한다. 그러나, 상기 설명은 16S rRNA 및 18S rRNA, 및 다른 16S rRNA 및 18S rRNA 유전자 생성물에도 적용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서(적절한 경우), 상기 설명 및 하기 설명에서 16S rRNA 유전자 및 18S rRNA 유전자의 언급은 16S rRNA 유전자 생성물(또는 16S rRNA) 및 18S rRNA 유전자 생성물(또는 18S rRNA)로 대체될 수 있다.
본 명세서에서 임의의 종래기술의 언급은 종래기술이 통상의 일반적인 지식의 부분을 형성한다는 것의 인정 또는 임의의 형태의 암시로서 간주되지 않고 간주되어서도 안 된다.
본 발명의 다양한 실시양태들은 하기 도면을 참조함으로써 기재될 것이다.
도 1은 하기 세균 종들로부터의 16S rRNA 분자를 코딩하는 대표적인 유전자들의 CLUSTALW 서열 정렬이다: 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 애로게네스; 엔테로박터 클로아카; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 세라티아 마르세센스; 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스. CLUSTALW 정렬에 의해 확인되었을 때, 가변 서열은 제거되었다. 서열번호 1로 기재된 이. 콜라이로부터의 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653에 상응하는 위치의 SNP들은 정렬된 서열에서 상응하는 뉴클레오타이드와 함께 강조되어 있다.
도 2는 실시예 1에서 시험된 하기 15종의 세균 종들에 대한 표준화된 고해상 용융(HRM) 곡선 도표를 보여준다: 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 애로게네스; 엔테로박터 클로아카; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 세라티아 마르세센스; 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스.
도 3은 기준으로서 사용된 에스케리키아 콜라이와 함께 도 2에 표시된 15종의 세균 종들에 대한 차이 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 4는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자에서 위치 412에 상응하는 위치에서 SNP를 함유하는 앰플리콘에 대한 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스에 대한 표준화된 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 5는 기준으로서 사용된 스타필로코쿠스 아우레우스와 함께 도 4에 표시된 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스에 대한 차이 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 6은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자에서 위치 378에 상응하는 위치에서 SNP를 함유하는 앰플리콘에 대한 엔테로코쿠스 패칼리스, 엔테로코쿠스 패시움, 스트렙토코쿠스 아갈락티아, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 및 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 표준화된 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 7은 기준으로서 사용된 엔테로코쿠스 패칼리스와 함께 도 6에 표시된 엔테로코쿠스 패칼리스, 엔테로코쿠스 패시움, 스트렙토코쿠스 아갈락티아, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 및 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 차이 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 8은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자에서 위치 412에 상응하는 위치에서 SNP를 함유하는 앰플리콘에 대한 에스케리키아 콜라이, 엔테로박터 클로아카, 세라티아 마르세센스, 악시네토박터 칼코아세티쿠스, 엔테로박터 애로게네스, 슈도모나스 애루기노사, 클렙시엘라 뉴모니아 및 프로테우스 미라빌리스에 대한 표준화된 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 9는 기준으로서 사용된 에스케리키아 콜라이와 함께 도 8에 표시된 에스케리키아 콜라이, 엔테로박터 클로아카, 세라티아 마르세센스, 악시네토박터 칼코아세티쿠스, 엔테로박터 애로게네스, 슈도모나스 애루기노사, 클렙시엘라 뉴모니아 및 프로테우스 미라빌리스에 대한 차이 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 10은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자에서 위치 378에 상응하는 위치에서 SNP를 함유하는 앰플리콘에 대한 스트렙토코쿠스 아갈락티아, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 및 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 표준화된 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 11은 기준으로서 사용된 스트렙토코쿠스 뉴모니아와 함께 도 10에 표시된 스트렙토코쿠스 아갈락티아, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 및 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 차이 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 12는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자에서 위치 412에 상응하는 위치에서 SNP를 함유하는 앰플리콘에 대한 에스케리키아 콜라이, 클렙시엘라 뉴모니아, 엔테로박터 애로게네스, 엔테로박터 클로아카 및 세라티아 마르세센스에 대한 표준화된 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 13은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자에서 위치 412에 상응하는 위치에서 SNP를 함유하는 앰플리콘에 대한 스트렙토코쿠스 뉴모니아, 스트렙토코쿠스 아갈락티아 및 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 표준화된 HRM 곡선 도표를 보여준다.
서열목록의 기호설명
서열번호 1: 에스케리키아 콜라이 16S rRNA 유전자(진뱅크(Genbank) 등록번호 NR_102804.1);
서열번호 2: 스타필로코쿠스 아우레우스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_075000.1);
서열번호 3: 스타필로코쿠스 에피데르미디스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_074995.1);
서열번호 4: 스트렙토코쿠스 뉴모니아 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_074564.1);
서열번호 5: 스트렙토코쿠스 아갈락티아 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_040821.1);
서열번호 6: 스트렙토코쿠스 피오게네스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_074091.1);
서열번호 7: 엔테로코쿠스 패칼리스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_074637.1);
서열번호 8: 엔테로코쿠스 패시움 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_042054.1);
서열번호 9: 프로테우스 미라빌리스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_074898.1);
서열번호 10: 세라티아 마르세센스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_041980.1);
서열번호 11: 엔테로박터 애로게네스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_024643.1);
서열번호 12: 엔테로박터 클로아카 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_028912.1);
서열번호 13: 클렙시엘라 뉴모니아 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_036794.1);
서열번호 14: 슈도모나스 애루기노사 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_074828.1);
서열번호 15: 악시네토박터 칼코아세티쿠스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 AB302132.1);
서열번호 16: 정방향 프라이머(CCTCTTGCCATCGGATGTG);
서열번호 17: 역방향 프라이머(CCAGTGTGGCTGGTCATCCT);
서열번호 18: 정방향 프라이머(CCTACGGGAGGCAGCAGTAG);
서열번호 19: 정방향 프라이머(GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT);
서열번호 20: 역방향 프라이머(CGATCCGAAAACCTTCTTCACT);
서열번호 21: 정방향 프라이머(AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA);
서열번호 22: 역방향 프라이머(CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA);
서열번호 23: 정방향 프라이머(TGCCGCGTGAATGAAGAA);
서열번호 24: 정방향 프라이머(GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA);
서열번호 25: 정방향 프라이머(TGATGAAGGTTTTCGGATCGT);
서열번호 26: 역방향 프라이머(TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT);
서열번호 27: 역방향 프라이머(AACGCTCGGATCTTCCGTATTA);
서열번호 28: 역방향 프라이머(CGCTCGCCACCTACGTATTAC);
서열번호 29: 정방향 프라이머(GTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGT);
서열번호 30: 역방향 프라이머(CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG);
서열번호 31: 정방향 프라이머(GCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAA);
서열번호 32: 정방향 프라이머(GGTCTGTCAAGTCGGATGTGAA);
서열번호 33: 정방향 프라이머(TCAACCTGGGAACTCATTCGA);
서열번호 34: 역방향 프라이머(GGAATTCTACCCCCCTCTACGA);
서열번호 35: 역방향 프라이머(GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG);
서열번호 36: 아스퍼길루스 푸미가투스 균주 MJ-X6 18S 리보좀 RNA 유전자, 완전한 서열(진뱅크 등록번호 HM590663.1);
서열번호 37: 칸디다 알비칸스 18S 리보좀 RNA 유전자, 완전한 서열(진뱅크 등록번호 AF11470.1);
서열번호 38: 칸디다 글라브라타 균주 SZ2 18S 리보좀 RNA 유전자, 부분적 서열(진뱅크 등록번호 KT229542.1);
서열번호 39: 칸디다 파랍실로시스 18S 리보좀 RNA 유전자, 부분적 서열(진뱅크 등록번호 DQ218328.1);
서열번호 40: 칸디다 트로피칼리스 18S 리보좀 RNA 유전자, 부분적 서열(진뱅크 등록번호 AH009771.2);
서열번호 41: 크립토코쿠스 네오포르만스 변종 그루비이(var. grubii) H99 18S 리보좀 RNA rRNA(진뱅크 등록번호/NCBI 기준 서열: XR_001045463.1);
서열번호 42: 푸사리움 속(sp.) 균주 Z10 18S 리보좀 RNA 유전자, 부분적 서열(진뱅크 등록번호 MF973465.1);
서열번호 43: 바실루스 안쓰라시스 균주 2000031664 16S 리보좀 RNA 유전자, 부분적 서열(진뱅크 등록번호 AY138383.1);
서열번호 44: 부르크홀데리아 슈도말레이 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 AJ131790.1);
서열번호 45: 16S RNA에 대한 클로스트리듐 보툴리눔 A형 rrn 유전자(진뱅크 등록번호 X68185.1);
서열번호 46: 16S RNA에 대한 클로스트리듐 보툴리눔 B형 rrn 유전자(진뱅크 등록번호 X68186.1);
서열번호 47: 16S rRNA에 대한 클로스트리듐 보툴리눔 C형 rrn 유전자(진뱅크 등록번호 X68315.1);
서열번호 48: 16S RNA에 대한 클로스트리듐 보툴리눔 D형 rrn 유전자(진뱅크 등록번호 X68187.1);
서열번호 49: 16S rRNA에 대한 클로스트리듐 보툴리눔 G형 rrn 유전자(진뱅크 등록번호 X68317.1);
서열번호 50: 프란시셀라 툴라렌시스 균주 B-38 16S 리보좀 RNA, 부분적 서열(진뱅크 등록번호/NCBI 기준 서열: NR_029362.1);
서열번호 51: 비브리오 콜레라 균주 DL2 16S 리보좀 RNA 유전자, 부분적 서열(진뱅크 등록번호 MG062858.1);
서열번호 52: 예르시니아 페스티스 16S rRNA 유전자, 단리물: SS-Yp-116(진뱅크 등록번호 AJ232238.1);
서열번호 53: 정방향 프라이머(CATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCG);
서열번호 54: 역방향 프라이머(GTTCAACTACGAGCTTTTTAAC);
서열번호 55: 역방향 프라이머(GTTCGACTACGAGCTTTTTAAC);
서열번호 56: 정방향 프라이머(GTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG);
서열번호 57: 역방향 프라이머(TCGTTTACCGTGGACTACCAGGG).
도 1은 하기 세균 종들로부터의 16S rRNA 분자를 코딩하는 대표적인 유전자들의 CLUSTALW 서열 정렬이다: 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 애로게네스; 엔테로박터 클로아카; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 세라티아 마르세센스; 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스. CLUSTALW 정렬에 의해 확인되었을 때, 가변 서열은 제거되었다. 서열번호 1로 기재된 이. 콜라이로부터의 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653에 상응하는 위치의 SNP들은 정렬된 서열에서 상응하는 뉴클레오타이드와 함께 강조되어 있다.
도 2는 실시예 1에서 시험된 하기 15종의 세균 종들에 대한 표준화된 고해상 용융(HRM) 곡선 도표를 보여준다: 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 애로게네스; 엔테로박터 클로아카; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 세라티아 마르세센스; 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스.
도 3은 기준으로서 사용된 에스케리키아 콜라이와 함께 도 2에 표시된 15종의 세균 종들에 대한 차이 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 4는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자에서 위치 412에 상응하는 위치에서 SNP를 함유하는 앰플리콘에 대한 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스에 대한 표준화된 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 5는 기준으로서 사용된 스타필로코쿠스 아우레우스와 함께 도 4에 표시된 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스에 대한 차이 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 6은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자에서 위치 378에 상응하는 위치에서 SNP를 함유하는 앰플리콘에 대한 엔테로코쿠스 패칼리스, 엔테로코쿠스 패시움, 스트렙토코쿠스 아갈락티아, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 및 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 표준화된 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 7은 기준으로서 사용된 엔테로코쿠스 패칼리스와 함께 도 6에 표시된 엔테로코쿠스 패칼리스, 엔테로코쿠스 패시움, 스트렙토코쿠스 아갈락티아, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 및 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 차이 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 8은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자에서 위치 412에 상응하는 위치에서 SNP를 함유하는 앰플리콘에 대한 에스케리키아 콜라이, 엔테로박터 클로아카, 세라티아 마르세센스, 악시네토박터 칼코아세티쿠스, 엔테로박터 애로게네스, 슈도모나스 애루기노사, 클렙시엘라 뉴모니아 및 프로테우스 미라빌리스에 대한 표준화된 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 9는 기준으로서 사용된 에스케리키아 콜라이와 함께 도 8에 표시된 에스케리키아 콜라이, 엔테로박터 클로아카, 세라티아 마르세센스, 악시네토박터 칼코아세티쿠스, 엔테로박터 애로게네스, 슈도모나스 애루기노사, 클렙시엘라 뉴모니아 및 프로테우스 미라빌리스에 대한 차이 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 10은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자에서 위치 378에 상응하는 위치에서 SNP를 함유하는 앰플리콘에 대한 스트렙토코쿠스 아갈락티아, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 및 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 표준화된 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 11은 기준으로서 사용된 스트렙토코쿠스 뉴모니아와 함께 도 10에 표시된 스트렙토코쿠스 아갈락티아, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 및 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 차이 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 12는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자에서 위치 412에 상응하는 위치에서 SNP를 함유하는 앰플리콘에 대한 에스케리키아 콜라이, 클렙시엘라 뉴모니아, 엔테로박터 애로게네스, 엔테로박터 클로아카 및 세라티아 마르세센스에 대한 표준화된 HRM 곡선 도표를 보여준다.
도 13은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자에서 위치 412에 상응하는 위치에서 SNP를 함유하는 앰플리콘에 대한 스트렙토코쿠스 뉴모니아, 스트렙토코쿠스 아갈락티아 및 스트렙토코쿠스 피오게네스에 대한 표준화된 HRM 곡선 도표를 보여준다.
서열목록의 기호설명
서열번호 1: 에스케리키아 콜라이 16S rRNA 유전자(진뱅크(Genbank) 등록번호 NR_102804.1);
서열번호 2: 스타필로코쿠스 아우레우스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_075000.1);
서열번호 3: 스타필로코쿠스 에피데르미디스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_074995.1);
서열번호 4: 스트렙토코쿠스 뉴모니아 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_074564.1);
서열번호 5: 스트렙토코쿠스 아갈락티아 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_040821.1);
서열번호 6: 스트렙토코쿠스 피오게네스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_074091.1);
서열번호 7: 엔테로코쿠스 패칼리스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_074637.1);
서열번호 8: 엔테로코쿠스 패시움 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_042054.1);
서열번호 9: 프로테우스 미라빌리스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_074898.1);
서열번호 10: 세라티아 마르세센스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_041980.1);
서열번호 11: 엔테로박터 애로게네스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_024643.1);
서열번호 12: 엔테로박터 클로아카 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_028912.1);
서열번호 13: 클렙시엘라 뉴모니아 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_036794.1);
서열번호 14: 슈도모나스 애루기노사 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 NR_074828.1);
서열번호 15: 악시네토박터 칼코아세티쿠스 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 AB302132.1);
서열번호 16: 정방향 프라이머(CCTCTTGCCATCGGATGTG);
서열번호 17: 역방향 프라이머(CCAGTGTGGCTGGTCATCCT);
서열번호 18: 정방향 프라이머(CCTACGGGAGGCAGCAGTAG);
서열번호 19: 정방향 프라이머(GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT);
서열번호 20: 역방향 프라이머(CGATCCGAAAACCTTCTTCACT);
서열번호 21: 정방향 프라이머(AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA);
서열번호 22: 역방향 프라이머(CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA);
서열번호 23: 정방향 프라이머(TGCCGCGTGAATGAAGAA);
서열번호 24: 정방향 프라이머(GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA);
서열번호 25: 정방향 프라이머(TGATGAAGGTTTTCGGATCGT);
서열번호 26: 역방향 프라이머(TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT);
서열번호 27: 역방향 프라이머(AACGCTCGGATCTTCCGTATTA);
서열번호 28: 역방향 프라이머(CGCTCGCCACCTACGTATTAC);
서열번호 29: 정방향 프라이머(GTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGT);
서열번호 30: 역방향 프라이머(CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG);
서열번호 31: 정방향 프라이머(GCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAA);
서열번호 32: 정방향 프라이머(GGTCTGTCAAGTCGGATGTGAA);
서열번호 33: 정방향 프라이머(TCAACCTGGGAACTCATTCGA);
서열번호 34: 역방향 프라이머(GGAATTCTACCCCCCTCTACGA);
서열번호 35: 역방향 프라이머(GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG);
서열번호 36: 아스퍼길루스 푸미가투스 균주 MJ-X6 18S 리보좀 RNA 유전자, 완전한 서열(진뱅크 등록번호 HM590663.1);
서열번호 37: 칸디다 알비칸스 18S 리보좀 RNA 유전자, 완전한 서열(진뱅크 등록번호 AF11470.1);
서열번호 38: 칸디다 글라브라타 균주 SZ2 18S 리보좀 RNA 유전자, 부분적 서열(진뱅크 등록번호 KT229542.1);
서열번호 39: 칸디다 파랍실로시스 18S 리보좀 RNA 유전자, 부분적 서열(진뱅크 등록번호 DQ218328.1);
서열번호 40: 칸디다 트로피칼리스 18S 리보좀 RNA 유전자, 부분적 서열(진뱅크 등록번호 AH009771.2);
서열번호 41: 크립토코쿠스 네오포르만스 변종 그루비이(var. grubii) H99 18S 리보좀 RNA rRNA(진뱅크 등록번호/NCBI 기준 서열: XR_001045463.1);
서열번호 42: 푸사리움 속(sp.) 균주 Z10 18S 리보좀 RNA 유전자, 부분적 서열(진뱅크 등록번호 MF973465.1);
서열번호 43: 바실루스 안쓰라시스 균주 2000031664 16S 리보좀 RNA 유전자, 부분적 서열(진뱅크 등록번호 AY138383.1);
서열번호 44: 부르크홀데리아 슈도말레이 16S rRNA 유전자(진뱅크 등록번호 AJ131790.1);
서열번호 45: 16S RNA에 대한 클로스트리듐 보툴리눔 A형 rrn 유전자(진뱅크 등록번호 X68185.1);
서열번호 46: 16S RNA에 대한 클로스트리듐 보툴리눔 B형 rrn 유전자(진뱅크 등록번호 X68186.1);
서열번호 47: 16S rRNA에 대한 클로스트리듐 보툴리눔 C형 rrn 유전자(진뱅크 등록번호 X68315.1);
서열번호 48: 16S RNA에 대한 클로스트리듐 보툴리눔 D형 rrn 유전자(진뱅크 등록번호 X68187.1);
서열번호 49: 16S rRNA에 대한 클로스트리듐 보툴리눔 G형 rrn 유전자(진뱅크 등록번호 X68317.1);
서열번호 50: 프란시셀라 툴라렌시스 균주 B-38 16S 리보좀 RNA, 부분적 서열(진뱅크 등록번호/NCBI 기준 서열: NR_029362.1);
서열번호 51: 비브리오 콜레라 균주 DL2 16S 리보좀 RNA 유전자, 부분적 서열(진뱅크 등록번호 MG062858.1);
서열번호 52: 예르시니아 페스티스 16S rRNA 유전자, 단리물: SS-Yp-116(진뱅크 등록번호 AJ232238.1);
서열번호 53: 정방향 프라이머(CATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCG);
서열번호 54: 역방향 프라이머(GTTCAACTACGAGCTTTTTAAC);
서열번호 55: 역방향 프라이머(GTTCGACTACGAGCTTTTTAAC);
서열번호 56: 정방향 프라이머(GTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG);
서열번호 57: 역방향 프라이머(TCGTTTACCGTGGACTACCAGGG).
1. 정의
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있을지라도, 바람직한 방법 및 물질이 기재되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어들이 이하에 정의되어 있다.
단수형 표현은 이 표현의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)의 문법적 객체를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들면, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
"증폭 생성물" 또는 "앰플리콘"은 핵산 증폭 기법에 의해 생성된 핵산 생성물을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "생물학적 샘플"은 환자 또는 대상체로부터 추출될 수 있거나, 비처리될 수 있거나, 처리될 수 있거나, 희석될 수 있거나 농축될 수 있는 샘플을 지칭한다. 적합하게는, 생물학적 샘플은 모발, 피부, 손발톱, 조직 또는 체액, 예컨대, 객담, 타액, 뇌척수액, 소변 및 혈액을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 환자 또는 대상체의 신체의 임의의 부분으로부터 선택된다.
본 명세서 및 청구범위(존재하는 경우)에서, 용어 "포함하는", 및 "포함한다" 및 "포함하고"를 포함하는 이의 파생어는 언급된 정수들 각각을 포함하되 하나 이상의 추가 정수의 포함을 배제하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "상응하는" 핵산 위치 또는 뉴클레오타이드는 2개 이상의 핵산 분자들의 정렬된 좌위에서 발견되는 위치 또는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 관련 또는 변이체 폴리뉴클레오타이드들은 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 정렬될 수 있다. 이러한 방법은 전형적으로 일치를 최대화하고, 수동 정렬의 이용 및 이용가능한 다수의 정렬 프로그램들(예를 들면, BLASTN)의 이용, 및 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 다른 방법과 같은 방법들을 포함한다. 당분야에서 숙련된 자는 폴리뉴클레오타이드의 서열들을 정렬함으로써, 가이드로서 동일한 뉴클레오타이드를 사용하여 상응하는 뉴클레오타이드 또는 위치를 확인할 수 있다. 예를 들면, 당분야에서 숙련된 자는 이. 콜라이 16S rRNA를 코딩하는 유전자의 서열(서열번호 1로 기재됨)을 또 다른 종으로부터의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 정렬함으로써, 가이드로서 보존된 뉴클레오타이드를 사용하여 상응하는 위치 및 뉴클레오타이드를 확인할 수 있다.
"유전자"는 게놈에서 특정 좌위를 점유하고 전사 및/또는 번역 조절 서열 및/또는 코딩 영역 및/또는 비번역 서열(즉, 인트론, 5' 비번역 서열 및 3' 비번역 서열)로 이루어진 유전 단위를 의미한다.
"유전자 생성물"은 유전자의 생성물을 의미한다. 예를 들면, 16S rRNA 유전자의 유전자 생성물은 16S rRNA를 포함한다. 유사하게, 18S rRNA 유전자의 유전자 생성물은 18S rRNA를 포함한다. 유전자 생성물은 예를 들면, rRNA 서열로부터 유도된 cDNA 서열도 포함한다. 유전자 생성물은 rRNA의 생성물도 포함할 수 있고, 이때 rRNA 유전자 내의 SNP는 생성물에서 상응하는 변화를 야기할 것이다.
"상동성"은 동일하거나 보존적 치환을 구성하는 핵산 또는 아미노산의 퍼센트 수를 의미한다. 상동성은 GAP와 같은 서열 비교 프로그램을 이용함으로써 측정될 수 있다(본원에 참고로 도입된 문헌(Deveraux et al. 1984)). 이 방식으로, 본원에서 인용된 서열과 유사하거나 실질적으로 상이한 길이의 서열은 예를 들면, GAP에 의해 이용된 비교 알고리즘에 의해 결정된 갭을 정렬 내로 삽입함으로써 비교될 수 있다.
"하이브리드화"는 DNA-DNA 하이브리드 또는 DNA-RNA 하이브리드를 생성하기 위한 상보적 뉴클레오타이드 서열들의 페어링을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. DNA에서, A는 T와 페어링하고 C는 G와 페어링한다. RNA에서, U는 A와 페어링하고 C는 G와 페어링한다. 이와 관련하여, 본원에서 사용된 용어 "일치" 및 "불일치"는 상보적 핵산 가닥들에서 페어링된 뉴클레오타이드의 하이브리드화 잠재력을 지칭한다. 일치된 뉴클레오타이드는 효율적으로 하이브리드화한다(예컨대, 상기 언급된 고전적인 A-T 및 G-C 염기쌍). 불일치는 효율적으로 하이브리드화되지 않는 뉴클레오타이드들의 다른 조합이다. 뉴클레오타이드 부호는 하기 표에 기재되어 있다:
"단리된"은 물질이 그의 천연 상태에서 정상적으로 그를 동반하는 성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 포스포디에스테르 결합(또는 이의 관련 구조적 변이체 또는 합성 유사체)을 통해 결합된 다수의 뉴클레오타이드 잔기들(데옥시뉴클레오타이드들 또는 리보뉴클레오타이드들, 또는 이들의 관련 구조적 변이체들 또는 합성 유사체들)로 구성된 중합체를 지칭한다. 따라서, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 전형적으로 뉴클레오타이드 잔기들 및 이들 사이의 결합이 천연 생성 뉴클레오타이드 잔기 및 결합인 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하지만, 상기 용어는 펩타이드 핵산(PNA), 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보핵산 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 유사체들도 그의 범위 내에 포함한다는 것을 이해할 것이다. 분자의 정확한 크기는 구체적인 적용에 따라 달라질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 길이가 전형적으로 다소 짧고, 일반적으로 약 10개 내지 30개의 뉴클레오타이드 잔기이고, 상기 용어는 임의의 길이의 분자를 지칭할 수 있지만, 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 전형적으로 큰 올리고뉴클레오타이드를 위해 사용된다.
용어 "환자" 및 "대상체"는 상호교환가능하게 사용되고 인간 또는 다른 포유동물의 환자 및 대상체를 지칭하고, 본 발명의 방법을 이용함으로써 조사되거나 치료되는 임의의 개체를 포함한다. 그러나, "환자"는 증상이 존재한다는 것을 내포하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 범위 내에 속하는 적합한 포유동물은 영장류, 가축 동물(예를 들면, 양, 소, 말, 당나귀, 돼지), 실험실 시험 동물(예를 들면, 토끼, 마우스, 래트, 기니 피그, 햄스터), 반려 동물(예를 들면, 고양이, 개) 및 억류된 야생 동물(예를 들면, 코알라, 곰, 야생 고양이, 야생 개, 늑대, 딩고, 여우 등)을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "다형성"은 또 다른 개체의 상동성 영역의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 비교될 때 소정의 영역의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 차이, 구체적으로 동일한 종의 개체들 사이에 상이한 소정의 영역의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 차이를 의미한다. 다형성은 일반적으로 기준 서열과 비교하여 정의된다. 다형성은 단일 뉴클레오타이드 차이, 하나 초과의 뉴클레오타이드의 차이, 및 단일 또는 다수의 뉴클레오타이드 삽입, 역위 및 결실뿐만 아니라; 단일 아미노산 차이, 서열에서의 하나 초과의 아미노산의 차이, 및 단일 또는 다수의 아미노산 삽입, 역위 및 결실도 포함한다. "다형성 부위"는 변이가 일어나는 좌위이다. 다형성이 핵산 서열에 존재하고 특정 염기 또는 염기들이 다형성 부위에 존재한다고 언급되는 경우, 본 발명은 그 부위에서 상보적 가닥의 상보적 염기 또는 염기들을 포괄한다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 mRNA, RNA, rRNA, cRNA, cDNA 또는 DNA를 지칭한다. 상기 용어는 전형적으로 길이가 30개 초과의 뉴클레오타이드 잔기인 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.
"프라이머"는 DNA의 가닥과 페어링될 때 적합한 중합제의 존재 하에서 프라이머 연장 생성물의 합성을 시작할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 프라이머는 바람직하게는 증폭에서의 최대 효율을 위해 단일 가닥이나, 대안적으로 이중 가닥일 수 있다. 프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 생성물의 합성을 프라이밍하기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 길이는 적용, 사용될 온도, 주형 반응 조건, 다른 시약 및 프라이머의 공급원을 포함하는 많은 요인들에 의해 좌우된다. 예를 들면, 표적 서열의 복잡성에 따라, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 더 적은 뉴클레오타이드 잔기를 함유할 수 있을지라도 전형적으로 15개 내지 35개 이상의 뉴클레오타이드 잔기를 함유한다. 프라이머는 큰 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 약 200개의 뉴클레오타이드 내지 수천 킬로염기 이상일 수 있다. 주형의 서열에 하이브리드화하고 합성의 시작을 위한 부위로서 작용하도록 디자인 프라이머는 주형의 서열에 "실질적으로 상보적"이도록 선택될 수 있다. "실질적으로 상보적"은 프라이머가 표적 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하기에 충분히 상보적이라는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 주형에 하이브리드화하도록 디자인된 프라이머는 주형과의 불일치를 함유하지 않으나, 이것은 필수적이지는 않다. 예를 들면, 비-상보적 뉴클레오타이드 잔기는 프라이머의 5' 말단에 부착될 수 있고, 이때 프라이머 서열의 나머지는 주형에 상보적이다. 대안적으로, 프라이머 서열이 그와 하이브리드화할 주형의 서열과 충분한 상보성을 가짐으로써 프라이머의 연장 생성물의 합성을 위한 주형을 형성하는 한, 비-상보적 뉴클레오타이드 잔기 또는 비-상보적 뉴클레오타이드 잔기의 스트레치는 프라이머 내에 산재되어 있을 수 있다.
"프로브"는 또 다른 분자의 특정 서열 또는 하위서열 또는 다른 모이어티에 결합하는 분자를 지칭한다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 용어 "프로브"는 전형적으로 상보적 염기 페어링을 통해, 종종 "표적 폴리뉴클레오타이드"로서 지칭된 또 다른 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 폴리뉴클레오타이드 프로브를 지칭한다. 프로브는 하이브리드화 조건의 엄격도에 따라 프로브와의 완전한 서열 상보성을 결여하는 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합할 수 있다. 프로브는 직접적으로 또는 간접적으로 표지부착될 수 있다.
용어 "패혈증"은 임상 의약에서 그의 통상의 의미에 따라 본원에서 사용되고, 예를 들면, 전신 및/또는 혈인성 감염, 예컨대, 세균 감염을 포함한다.
용어 "패혈증 관련 세균"은 대상체에서 패혈증을 야기할 수 있는 것으로서 확인되었거나 패혈증을 가진 대상체의 혈액에서 확인된 세균을 지칭한다. 따라서, "포유동물(예를 들면, 인간) 패혈증 관련 세균"은 포유동물(예를 들면, 인간) 대상체에서 패혈증을 야기할 수 있는 것으로서 확인되었거나 패혈증을 가진 포유동물(예를 들면, 인간) 대상체의 혈액에서 확인된 세균을 지칭한다. 포유동물(예를 들면, 인간) 패혈증 관련 세균의 예로는 악시네토박터 바우만니이, 악티노바실루스 호미니스(Actinobaccillus hominis), 악티노마이세스 마실리엔시스(Actinomyces massiliensis), 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 바실루스 안쓰라시스, 박테로이데스 프라길리스, 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 카르디오박테리움 발바룸(Cardiobacterium valvarum), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라마이도필라 아보르투스(Chlamydophila abortus), 클라마이도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumoniae), 시트로박터 프레운디이, 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리듐 퍼프링겐스, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 제이케이움, 코리네박테리움 우레알리티쿰(Corynebacterium urealyticum), 데르마토필루스 콘골렌시스(Dermatophilus congolensis), 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 엔테로박터 애로게네스, 엔테로박터 클로아카, 엔테로코쿠스 패칼리스, 엔테로코쿠스 패시움, 에리시펠로쓰릭스 루시오패티아(Erysipelothrix rhusiopathiae), 에스케리키아 콜라이, 유박테리움 데스몰란스(Eubacterium desmolans), 플라보박테리움 세티(Flavobacterium ceti), 해모필루스 두크레이(Haemophilus ducreyi), 해모필루스 인플루엔자, 해모필루스 파라해몰리티쿠스(Haemophilus parahaemolyticus), 해모필루스 파라인플루엔자, 헬리코박터 시내디(Helicobacter cinaedi), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 클렙시엘라 옥시토카, 클렙시엘라 뉴모니아, 락토바실루스 인테스티날리스(Lactobacillus intestinalis), 레기오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인터로간스(Leptospira interrogans), 리스테리아 모노사이토게네스, 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus), 모빌룬쿠스 쿠르티시이(Mobiluncus curtisii), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 모르가넬라 모르가니이(Morganella morganii), 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 네이세리아 고노로에아(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝기티디스, 노카르디아 아스테로이드스(Nocardia asteroids), 노카르디아 브라실리엔시스(Nocardia brasiliensis), 파스퇴렐라 뮬토시다(Pasteurella multocida), 펩토스트렙토코쿠스 스토마티스(Peptostaphylococcus stomatis), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 부카(Prevotella buccae), 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia), 프레보텔라 멜라니노겐시아(Prevotella melaninogenica), 프로테우스 미라빌리스, 프로비덴시아 알칼리파시엔스(Providencia alcalifaciens), 슈도모나스 애루기노사, 로도코쿠스 에퀴(Rhodococcus equi), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 세라티아 마르세센스, 시겔라 디센테리아(Shigella dysenteriae), 시겔라 소네이(Shigella sonnei), 스타필로코쿠스 아우레우스, 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 스타필로코쿠스 해몰리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코쿠스 호미니스, 스타필로코쿠스 사프로파이티쿠스, 스테노트로포모나스 말토필라(Stenotrophomonas maltophila), 스트렙토코쿠스 아갈락티아, 스트렙토코쿠스 안기노수스, 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 콘스텔라투스, 스트렙토코쿠스 디스갈락티아(Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코쿠스 인터메딘스(Streptococcus intermedins), 스트렙토코쿠스 미티스, 스트렙토코쿠스 뮤탄, 스트렙토코쿠스 오랄리스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 상귀니스, 스트렙토코쿠스 소브리누스, 스트렙토마이세스 아눌라투스(Streptomyces anulatus), 스트렙토마이세스 소말리엔시스(Streptomyces somaliensis), 베일로넬라 아티피카(Veillonella atypica), 베일로넬라 덴티카리오시(Veillonella denticariosi), 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar), 베일로넬라 파르불라(Veillonella parvula), 베일로넬라 로고사(Veillonella rogosae), 비브리오 콜레라, 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 예르시니아 페스티스가 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "패혈증"은 추정된 또는 확인된 감염 과정을 가진 SIRS로서 정의된다. 감염 과정의 확인은 감염 물질의 미생물학적 배양 또는 단리를 이용함으로써 결정될 수 있다. 면역학적 관점에서 볼 때, 패혈증은 미생물 또는 전신 감염에 대한 전신 반응으로서 보일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "전신 염증 반응 증후군(SIRS)"은 하기 측정가능한 임상 특성들 중 둘 이상의 임상 특성을 가진, 비-특이적 손상으로부터 비롯된 임상 반응을 지칭한다: 38℃ 초과 또는 36℃ 미만의 체온, 분당 90 비트 초과의 심박수, 분당 20 초과의 호흡수, mm3당 12,000 초과 또는 mm3당 4,000 미만의 백혈구 세포 총수(총 백혈구), 또는 10% 초과의 밴드 호중구 퍼센트. 면역학적 관점에서 볼 때, SIRS는 손상(예를 들면, 주요 수술) 또는 전신 염증에 대한 전신 반응을 나타내는 것으로서 보일 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "감염 음성 SIRS(inSIRS)"는 확인될 수 있는 감염 과정의 부재 하에서 상기 인지된 임상 반응을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "서열 동일성"은 서열들이 비교 윈도우 상에서 뉴클레오타이드 대 뉴클레오타이드 기준으로 또는 아미노산 대 아미노산 기준으로 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성의 퍼센트"는, 비교 윈도우 상에서 2개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교하고, 두 서열들에서 동일한 핵산 염기(예를 들면, A, T, C, G)가 존재하는 위치의 수를 확인하여 일치된 위치의 수를 제공하고, 일치된 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 결과를 100과 곱하여 서열 동일성의 퍼센트(% 서열 동일성)을 제공함으로써 계산된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)은 게놈 서열에서 단일 뉴클레오타이드(A, T, C 또는 G)가 (예컨대, 치환, 추가 또는 결실을 통해) 변경될 때 일어나는 뉴클레오타이드 서열 변이를 지칭한다. SNP는 게놈, 예컨대, 원핵 또는 진핵 미생물의 게놈의 코딩 영역(유전자) 및 비코딩 영역 둘 다에서 일어날 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 상기 효과는 감염, 상태 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지한다는 관점에서 예방 효과일 수 있고/있거나, 감염, 상태, 및/또는 감염 또는 상태에 기인할 수 있는 불리한 영향에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료 효과일 수 있다. 본원에서 사용된 "치료"는 포유동물(예를 들면, 인간)에서 감염 또는 상태의 임의의 치료를 커버하고, (a) 감염 또는 상태의 억제, 즉 이의 발생의 정지; 및 (b) 감염 또는 상태의 경감, 즉 감염 또는 상태의 퇴행의 야기를 포함한다.
2. 본 발명의 다형성
본 발명은 세균의 16S rRNA 유전자(및 따라서 16S rRNA 분자) 내의 SNP를 사용하여 세균의 개별 종을 확인할 수 있고/있거나 속을 기준으로, 또는 그람 양성 또는 그람 음성으로서 세균을 분류할 수 있다는 확인에 부분적으로 기반을 둔다. 또한, 본 발명은 18S rRNA 유전자(및 따라서 18S rRNA 분자) 내의 SNP를 사용하여 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나 분류할 수 있다는 확인에 부분적으로 기반을 둔다.
2.1 16S rRNA 내의 SNP를 사용한 세균의 분류
속을 기준으로 세균 종을 분류하는 방법뿐만 아니라, 샘플에서 세균의 그람 상태를 확인하는 방법, 즉 세균이 그람 양성인지 아니면 그람 음성인지를 확인하는 방법도 제공한다.
본원에서 입증된 바와 같이, 서열번호 1로 기재된 이. 콜라이 16S rRNA 유전자의 위치 273 및 653에 상응하는, 16S rRNA를 코딩하는 유전자(및 따라서 16S rRNA 분자 그 자체)의 뉴클레오타이드 위치의 다형성을 이용하여, 특히 포유동물(예를 들면, 인간) 병원체를 포함하는 샘플 내의 세균 종(혈액 배양에 의해 단리된, 가장 흔히 발견되는 세균 종을 포함함(Karlowsky et al.2004))의 선택의 그람 상태를 확인할 수 있다.
가장 구체적으로 도 1에 표시된 바와 같이, 본 발명은 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 애로게네스; 엔테로박터 클로아카; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 세라티아 마르세센스; 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 선택된 세균 종을 분류하는 방법을 제공한다.
예를 들면, 샘플에서 상기 단락에 나열된 세균들 중 한 세균의 그람 상태를 확인하는 방법은 샘플로부터의 핵산을, 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273 및 653에 상응하는 위치에서 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석하는 단계를 포함하고, 이때 위치 273의 A 및 위치 653의 T는 상기 샘플 중의 세균이 그람 양성이라는 것을 표시한다.
샘플에서 상기 세균들 중 한 세균의 그람 상태를 확인하는 또 다른 방법은 샘플로부터의 핵산을, 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 440에서 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석하는 단계를 포함하고, 이때 위치 440의 T는 상기 샘플 중의 세균이 그람 양성이라는 것을 표시한다.
샘플에서 상기 세균들 중 적어도 하나의 세균을 분류하는 방법은 샘플로부터의 핵산을, 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 412 및 647에 상응하는 위치에서 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석하는 단계를 포함하고, 이때 위치 412의 T는 상기 세균이 스타필로코쿠스 속에 속한다는 것을 표시하거나; 위치 647의 G는 상기 세균이 엔테로코쿠스 속에 속한다는 것을 표시한다.
2.2 16S rRNA 내의 SNP를 사용한 세균 확인, 및 18S rRNA를 사용한 효모 유기체 및 사상 진균의 확인
본 발명은 샘플에서 세균을 확인하는 방법도 제공한다.
본원에서 입증된 바와 같이, 서열번호 1로 기재된 이. 콜라이 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653 중 어느 한 위치에 상응하는, 16S rRNA를 코딩하는 유전자(및 따라서 16S rRNA 분자 그 자체)의 뉴클레오타이드 위치의 다형성을 이용하여 특히 포유동물(예를 들면, 인간) 병원체를 포함하는 샘플 내의 세균(혈액 배양에 의해 단리된, 가장 흔히 발견되는 세균 종을 포함함(Karlowsky et al.2004))을 확인할 수 있다.
한 실시양태에서, 도 1에 표시된 바와 같이, 본 발명은 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 애로게네스; 엔테로박터 클로아카; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 세라티아 마르세센스; 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 선택된 세균을 확인하는 방법을 제공한다.
상기 SNP를 사용하여 샘플 내에서 상기 세균 종을 확인하기 위한 일반적인 규칙은 표 1 및/또는 표 5에 기재되어 있다.
상기 세균들 중 세균 엔테로박터 클로아카는 샘플로부터의 핵산을 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 653에 상응하는 위치에서 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 653의 G는 세균이 엔테로박터 클로아카임을 표시한다.
상기 세균들 중 스트렙토코쿠스 아갈락티아, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 및 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 선택된 세균은 샘플로부터의 핵산을 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 378 및 488에 상응하는 위치에서 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 378의 A 및 위치 488의 T는 세균이 스트렙토코쿠스 뉴모니아임을 표시하고, 위치 378 및 488의 A는 세균이 스트렙토코쿠스 아갈락티아임을 표시하고; 위치 378의 G 및 위치 488의 A는 세균이 스트렙토코쿠스 피오게네스임을 표시한다.
상기 방법은 샘플로부터의 핵산을 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653에 상응하는 위치에서 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 상기 세균들 중 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 클로아카; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 선택된 세균을 확인할 수 있고, 이때 위치 273, 440 및 647의 A는 세균이 악시네토박터 칼코아세티쿠스임을 표시하고; 위치 653의 G는 세균이 엔테로박터 클로아카임을 표시하고; 위치 273 및 653의 T는 세균이 이. 콜라이임을 표시하고; 위치 273의 T, 위치 488 및 647의 C 및 위치 653의 A는 세균이 클렙시엘라 뉴모니아임을 표시하고; 위치 440 및 488의 C 및 위치 647의 T는 세균이 프로테우스 미라빌리스임을 표시하고; 위치 440의 A 및 위치 647의 T는 세균이 슈도모나스 애루기노사임을 표시하고; 위치 378, 488 및 647의 A는 세균이 스트렙토코쿠스 아갈락티아임을 표시하고; 위치 488 및 647의 T는 세균이 스트렙토코쿠스 뉴모니아임을 표시하고; 위치 378의 G 및 위치 488 및 647의 A는 세균이 스트렙토코쿠스 피오게네스임을 표시한다.
전술된 용도 이외에, 본 발명의 방법은 샘플에서 하기 세균의 존재를 확인하는 데에도 이용될 수 있다: 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 세라티아 마르세센스; 및 엔테로박터 애로게네스. 상기 방법도 샘플로부터의 핵산을 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653 중 어느 한 위치에 상응하는 위치에서 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석하는 단계를 포함하고, 이때 위치 412의 T는 샘플이 세균 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 스타필로코쿠스 에피데르미디스를 포함한다는 것을 표시하고; 위치 647의 G는 샘플이 세균 엔테로코쿠스 패칼리스 및/또는 엔테로코쿠스 패시움을 포함한다는 것을 표시하고; 위치 440 및 647의 C 및 위치 488의 T는 샘플이 세균 세라티아 마르세센스 및/또는 엔테로박터 애로게네스를 포함한다는 것을 표시한다.
전술된 용도 이외에, 본 발명의 방법은 샘플에서 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 세라티아 마르세센스; 및 엔테로박터 애로게네스 각각을 확인하는 데에도 이용될 수 있다. 상기 방법은 샘플로부터의 핵산을 고해상 용융 분석(하기 3.8 참조)으로 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 고해상 용융 분석은 동일한 SNP(들)를 함유하는, 상이한 세균들로부터의 핵산 서열들이 주변 뉴클레오타이드 염기의 변이를 근거로 서로 식별될 수 있게 한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 에스케리키아 콜라이, 스트렙토코쿠스 뉴모니아, 스트렙토코쿠스 아갈락티아, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 프로테우스 미라빌리스, 엔테로박터 클로아카, 클렙시엘라 뉴모니아, 슈도모나스 애루기노사, 악시네토박터 칼코아세티쿠스, 엔테로코쿠스 패칼리스, 리스테리아 모노사이토게네스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 클로스트리듐 퍼프링겐스, 코리네박테리움 제이케이움, 박테로이데스 프라길리스, 네이세리아 메닝기티디스, 해모필루스 인플루엔자, 세라티아 마르세센스, 살모넬라 속(sp.), 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스로부터 선택된 세균을 확인하는 방법을 제공한다. 상기 SNP들을 사용하여 샘플 내에서 상기 세균 종들을 확인하기 위한 일반적인 규칙은 표 2에 기재되어 있다.
유사하게, 본원에서 입증된 바와 같이, 서열번호 43으로 기재된 바실루스 안쓰라시스 16S rRNA 유전자의 위치 746, 764, 771 또는 785(또는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 737, 755, 762 또는 776)에 상응하는, 16S rRNA를 코딩하는 유전자(및 따라서 상기 RNA 분자 그 자체)의 뉴클레오타이드 위치의 다형성을 이용하여 샘플 내에서 특히 포유동물(예를 들면, 인간) 병원체(보완 민감성 생물학적 물질로서 공지되어 있는 병원체를 포함함)를 포함하는 세균을 확인할 수 있다.
한 실시양태에서, 바실루스 안쓰라시스, 클로스트리듐 보툴리눔 A형, 클로스트리듐 보툴리눔 B형, 클로스트리듐 보툴리눔 C형, 클로스트리듐 보툴리눔 D형, 클로스트리듐 보툴리눔 G형, 예르시니아 페스티스, 프란시셀라 툴라렌시스, 비브리오 콜레라 및 부르크홀데리아 슈도말레이로부터 선택된 세균을 확인하는 방법을 제공한다.
상기 SNP들을 사용하여 샘플 내에서 상기 세균 종들을 확인하기 위한 일반적인 규칙은 표 3 및/또는 표 6에 기재되어 있다.
상기 세균들 중 세균 바실루스 안쓰라시스는 샘플로부터의 핵산을 서열번호 43의 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 746의 T, 위치 764의 A, 위치 771의 C 및 위치 785의 G는 세균이 바실루스 안쓰라시스임을 표시한다.
상기 세균들 중 클로스트리듐 보툴리눔 A형 또는 클로스트리듐 보툴리눔 B형으로부터 선택된 세균은 샘플로부터의 핵산을 서열번호 43의 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 746의 T, 위치 764의 G, 위치 771의 C 및 위치 785의 T는 세균이 클로스트리듐 보툴리눔 A형 또는 클로스트리듐 보툴리눔 B형임을 표시한다.
상기 세균들 중 세균 클로스트리듐 보툴리눔 C형은 샘플로부터의 핵산을 서열번호 43의 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 746의 T, 위치 764의 A, 위치 771의 T 및 위치 785의 T는 세균이 클로스트리듐 보툴리눔 C형임을 표시한다.
상기 세균들 중 세균 클로스트리듐 보툴리눔 D형은 샘플로부터의 핵산을 서열번호 43의 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 746의 C, 위치 764의 A, 위치 771의 T 및 위치 785의 T는 세균이 클로스트리듐 보툴리눔 D형임을 표시한다.
상기 세균들 중 세균 클로스트리듐 보툴리눔 G형은 샘플로부터의 핵산을 서열번호 43의 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 746의 T, 위치 764의 G, 위치 771의 C 및 위치 785의 G는 세균이 클로스트리듐 보툴리눔 G형임을 표시한다.
상기 세균들 중 세균 예르시니아 페스티스는 샘플로부터의 핵산을 서열번호 43의 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 746의 C, 위치 764의 G, 위치 771의 T 및 위치 785의 G는 세균이 예르시니아 페스티스임을 표시한다.
상기 세균들 중 세균 프란시셀라 툴라렌시스는 샘플로부터의 핵산을 서열번호 43의 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 746의 T, 위치 764의 A, 위치 771의 G 및 위치 785의 G는 세균이 프란시셀라 툴라렌시스임을 표시한다.
상기 세균들 중 세균 비브리오 콜레라는 샘플로부터의 핵산을 서열번호 43의 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 746의 C, 위치 764의 A, 위치 771의 T 및 위치 785의 G는 세균이 비브리오 콜레라임을 표시한다.
상기 세균들 중 세균 부르크홀데리아 슈도말레이는 샘플로부터의 핵산을 서열번호 43의 16S rRNA 유전자(또는 이의 16S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 746의 C, 위치 764의 G, 위치 771의 C 및 위치 785의 G는 세균이 부르크홀데리아 슈도말레이임을 표시한다.
전술된 용도 이외에, 본 발명의 방법은 샘플에서 바실루스 안쓰라시스, 클로스트리듐 보툴리눔 A형, 클로스트리듐 보툴리눔 B형, 클로스트리듐 보툴리눔 C형, 클로스트리듐 보툴리눔 D형, 클로스트리듐 보툴리눔 G형, 예르시니아 페스티스, 프란시셀라 툴라렌시스, 비브리오 콜레라 및 부르크홀데리아 슈도말레이 각각을 확인하는 데 이용될 수도 있다. 상기 방법은 고해상 용융 분석(하기 3.8 참조)으로 샘플로부터의 핵산을 분석하는 단계를 추가로 포함한다.
유사하게, 본원에서 입증된 바와 같이, 서열번호 37로 기재된 칸디다 알비칸스 18S rRNA 유전자의 위치 343, 371, 388, 416 및 467에 상응하는, 18S rRNA를 코딩하는 유전자(및 따라서 상기 rRNA 분자 그 자체)의 뉴클레오타이드 위치의 다형성을 이용하여 샘플 내에서 특히 포유동물(예를 들면, 인간) 병원체를 포함하는 세균을 확인할 수 있다.
한 실시양태에서, 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파랍실로시스, 칸디다 글라브라타, 푸사리움 속(spp.), 아스퍼길루스 푸미가투스, 및 크립토코쿠스 네오포르만스로부터 선택된 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하는 방법을 제공한다.
상기 SNP들을 사용하여 샘플 내에서 상기 세균 종들을 확인하기 위한 일반적인 규칙은 표 4 및/또는 표 7에 기재되어 있다.
상기 효모 유기체 또는 사상 진균 중 효모 유기체 칸디다 알비칸스는 샘플로부터의 핵산을 서열번호 37의 18S rRNA 유전자(또는 이의 18S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 343의 C, 위치 371의 A, 위치 388의 T, 위치 416의 G 및 위치 467의 G는 효모 유기체가 칸디다 알비칸스임을 표시한다.
상기 효모 유기체 또는 사상 진균 중 효모 유기체 칸디다 트로피칼리스는 샘플로부터의 핵산을 서열번호 37의 18S rRNA 유전자(또는 이의 18S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 343의 C, 위치 371의 A, 위치 388의 C, 위치 416의 G 및 위치 467의 C는 효모 유기체가 칸디다 트로피칼리스임을 표시한다.
상기 효모 유기체 또는 사상 진균 중 효모 유기체 칸디다 파랍실로시스는 샘플로부터의 핵산을 서열번호 37의 18S rRNA 유전자(또는 이의 18S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 343의 C, 위치 371의 A, 위치 388의 C, 위치 416의 G 및 위치 467의 G는 효모 유기체가 칸디다 파랍실로시스임을 표시한다.
상기 효모 유기체 또는 사상 진균 중 효모 유기체 칸디다 글라브라타는 샘플로부터의 핵산을 서열번호 37의 18S rRNA 유전자(또는 이의 18S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 343의 T, 위치 371의 A, 위치 388의 C, 위치 416의 G 및 위치 467의 G는 효모 유기체가 칸디다 글라브라타임을 표시한다.
상기 효모 유기체 또는 사상 진균 중 효모 유기체 크립토코쿠스 네오포르만스는 샘플로부터의 핵산을 서열번호 37의 18S rRNA 유전자(또는 이의 18S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 343의 C, 위치 371의 A, 위치 388의 T, 위치 416의 T 및 위치 467의 G는 효모 유기체가 크립토코쿠스 네오포르만스임을 표시한다.
상기 효모 유기체 또는 사상 진균 중 사상 진균 푸사리움 속(spp.)은 샘플로부터의 핵산을 서열번호 37의 18S rRNA 유전자(또는 이의 18S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 343의 C, 위치 371의 C, 위치 388의 T, 위치 416의 T 및 위치 467의 G는 사상 진균이 푸사리움 속(spp.)임을 표시한다.
상기 효모 유기체 또는 사상 진균 중 사상 진균 아스퍼길루스 푸미가투스는 샘플로부터의 핵산을 서열번호 37의 18S rRNA 유전자(또는 이의 18S rRNA 또는 DNA 카피) 내의 SNP에 대해 분석함으로써 샘플에서 확인될 수 있고, 이때 위치 343의 C, 위치 371의 C, 위치 388의 T, 위치 416의 C 및 위치 467의 G는 사상 진균이 아스퍼길루스 푸미가투스임을 표시한다.
전술된 용도 이외에, 본 발명의 방법은 샘플에서 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 칸디다 파랍실로시스, 칸디다 글라브라타, 푸사리움 속(spp.), 아스퍼길루스 푸미가투스, 및 크립토코쿠스 네오포르만스 각각을 확인하는 데 이용될 수도 있다. 상기 방법은 고해상 용융 분석(하기 3.8 참조)으로 샘플로부터의 핵산을 분석하는 단계를 추가로 포함한다.
3. 본 발명에 따라 세균, 효모 유기체 및 사상 진균을 확인하고/하거나 분류하기 위한 특정 다형성에 대한 스크리닝
대상체로부터의 생물학적 샘플의 단리, 생물학적 샘플의 프로세싱, 게놈 DNA 추출, RNA 추출, DNA 검출 및 특징규명, RNA 검출 및 특징규명, DNA 시퀀싱, DNA 서열 분석, SNP 유전형분석 연구, RNA 위치 및 확인, RNA 프로파일링 및 RNA 스크리닝, RNA 시퀀싱, RNA 서열 분석의 단계/기법은 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다.
하나 이상의 SNP를 검출하는, 당분야에서 공지되어 있는 임의의 방법을 본원에 기재된 방법에서 이용하여 샘플 내에서 세균 종을 분류할 수 있고/있거나 확인할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 상기 방법은 한 세균 종(또는 효모 유기체 또는 사상 진균 종)을 또 다른 종에 비해 범위를 좁히거나 일부 경우 확인하는 것도 용이하게 한다. 샘플에서 단일 뉴클레오타이드 다형성에 상응하는 특정 위치에서 뉴클레오타이드 존재를 확인하는 다수의 방법들이 당분야에서 공지되어 있다. 다형성을 검출하는 다양한 수단들은 DNA 시퀀싱, 스캐닝 기법, 하이브리드화 기반 기법, 연장 기반 분석, 고해상 용융 분석, 도입 기반 기법, 제한효소 기반 분석 및 라이게이션 기반 기법을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 방법은 어느 한 가닥에 대해 16S rRNA 또는 18S rRNA 유전자 내에서, 16S rRNA 또는 18S rRNA 분자 내에서, 또는 이들의 DNA 카피 내에서 본원에 기재된 다형성을 확인할 수 있다. 일부 예에서, 다형성을 검출하는 방법은 제1 증폭 단계를 이용하고, 증폭은 16S rRNA 또는 18S rRNA 유전자, 또는 16S rRNA 또는 18S rRNA 분자의 DNA 카피로부터의 증폭일 수 있다.
핵산은 대상체로부터의 생물학적 샘플, 또는 환경 샘플, 예컨대, 공기, 토양 또는 물 샘플, 여과액, 식품 또는 제품, 또는 표면, 예컨대, 의료 기구 또는 작업 장소 표면으로부터 채취된 샘플로부터의 핵산일 수 있다. 대상체는 인간 대상체 또는 비-인간 대상체, 예컨대, 포유동물 대상체, 예컨대, 영장류, 가축 동물(예를 들면, 양, 소, 말, 당나귀, 돼지), 실험실 시험 동물(예를 들면, 토끼, 마우스, 래트, 기니 피그, 햄스터), 반려 동물(예를 들면, 고양이, 개) 및 억류된 야생 동물(예를 들면, 코알라, 곰, 야생 고양이, 야생 개, 늑대, 딩고, 여우 등)일 수 있다. 대상체로부터의 생물학적 샘플은 체액, 예컨대, 혈액, 타액, 객담, 소변, 뇌척수액, 대변, 세포, 조직 또는 생검을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 대상체 신체의 임의의 부분으로부터의 샘플일 수 있다. 다른 예에서, 핵산은 배양된 세포로부터 수득된다.
본 발명의 방법에 따라 분석되는 핵산은 샘플 내에 있는 동안 분석될 수 있거나, 샘플로부터 먼저 추출될 수 있다, 예를 들면, 분석 전에 샘플로부터 단리될 수 있다. 샘플로부터 핵산을 단리하는 임의의 방법이 본 발명의 방법에서 이용될 수 있고, 이러한 방법은 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있다. 추출된 핵산은 DNA 및/또는 RNA(mRNA 또는 rRNA를 포함함)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 추가 역전사 단계가 분석 전에 상기 방법에 포함될 수 있다. 따라서, 분석되는 핵산은 16S rRNA 유전자, 18S rRNA 유전자, 16S rRNA, 18S rRNA, 16S rRNA 또는 18S rRNA의 DNA 카피, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 상기 핵산은, 16S rRNA 유전자, 18S rRNA 유전자, 16S rRNA, 18S rRNA, 또는 16S rRNA 또는 18S rRNA의 DNA 카피의 부분이 SNP에 대해 분석되는 핵산 위치를 함유하는 한, 이러한 부분도 함유할 수 있다.
일부 경우, 상기 방법은 핵산의 증폭을 포함한다. 이러한 경우, 적합한 핵산 증폭 기법은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc. 1994-1998)에 기재된 중합효소 연쇄 반응(PCR), 예를 들면, 미국 특허 제5,422,252호에 기재된 가닥 치환 증폭(SDA), 예를 들면, 문헌(Liu et al. (1996)), PCT 출원 공보 제WO 92/01813호 및 제WO 97/19193호에 기재된 롤링 서클 복제(RCR), 예를 들면, 문헌(Sooknanan et al., (1994))에 기재된 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 리가제 연쇄 반응(LCR), 단순 서열 반복 분석(SSR), 분지된 DNA 증폭 어세이(b-DNA), 전사 증폭 및 자가-지속 서열 복제, 및 예를 들면, 문헌(Tyagi et al. (1996))에 기재된 Q-β 레플리카제(replicase) 증폭을 포함한다.
이러한 방법은 하나 이상의 SNP를 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드에 선택적으로 하이브리드화하는, 예를 들면, 증폭 프라이머 쌍을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 사용할 수 있다. 본 발명의 방법의 실시에 유용한 올리고뉴클레오타이드 프로브는 예를 들면, SNP의 위치를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오타이드의 일부에 상보적이고 이 부분을 포괄하는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 이때 다형성 부위에서의 특정 뉴클레오타이드(즉, SNP)의 존재는 상기 프로브의 선택적 하이브리드화의 존재 또는 부재에 의해 검출된다. 이러한 방법은 표적 폴리뉴클레오타이드 및 하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드를 엔도뉴클레아제(endonuclease)와 접촉시키는 단계, 및 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오타이드가 상기 프로브의 상응하는 뉴클레오타이드에 상보적인지에 따라 상기 프로브의 절단 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
프라이머는 임의의 편리한 합성 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 이러한 방법의 예는 문헌("Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties", Methods in Molecular Biology Series, Volume 20, Ed. Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 0-89603-247-7, 1993)에서 발견될 수 있다. 프라이머는 검출을 용이하게 하도록 표지부착될 수도 있다.
SNP의 검출에 유용한 임의의 방법이 본 발명에서 이용될 수 있고, SNP 유전형을 분석하는 많은 상이한 방법들이 당분야에서 공지되어 있다(검토를 위해서는 문헌(Syvanen, A. C. (2001)); 및 문헌(Kim, S. and Misra, A., (2007)) 참조). 이러한 방법은 "반응"(예를 들면, 하이브리드화, 라이게이션, 연장 및 절단)에 이은 "분리"(예를 들면, 고체상 마이크로타이터 플레이트, 마이크로입자 또는 어레이, 겔 전기영동, 용액상 균질 또는 반균질)를 포함하는 3개의 단계들의 연속적 이용으로 이루어질 수 있다. 모든 적용을 위한 단일 이상적 SNP 유전형분석 방법은 존재하지 않고, 다양한 파라미터들, 예컨대, 샘플 크기 및 분석될 SNP의 수가 주어졌을 때 가장 적절한 방법을 결정하는 것은 숙련된 당업자의 기술 내에 있다.
임상적 사용에 특히 적합하고 작은 수의 SNP의 질의(querying)에 의존하는 예시적 기술은 신속하고, (샘플 중의 핵산의 증폭을 통해) 민감하고, 1-단계로 수행되고, 실시간으로 측정된 결과를 제공하고, 다중체화 및 자동화될 수 있고, 비교적 저렴하고 정확하고, TaqMan® 어세이(5' 뉴클레아제 어세이, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)), 고해상 용융 분석, 분자 비콘 프로브, 예컨대, LUX®(인비트로겐(Invitrogen)) 또는 스코르피온(Scorpion)® 프로브(시그마 알드리치(Sigma Aldrich)) 및 주형 유도 염료 도입(TDI, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
예를 들면, TaqMan®(어플라이드 바이오시스템스)은 하이브리드화와, 대립유전자 특이적 프로브, 용액상 균질 및 형광 공명 에너지 전달을 병용한다. TaqMan® 어세이는 SNP 부위(들)을 가로질러 결합하도록 디자인된 표지부착된 프로브를 분해하기 위해 Taq DNA 중합효소의 5'-뉴클레아제 활성과 함께, 핵산을 증폭하기 위해 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 및 Taq DNA 중합효소에 의존한다. 반응, 분리 및 검출은 모두 동일한 시간에 수행될 수 있고, 결과는 반응이 진행할 때 실시간으로 판독될 수 있다. 이러한 방법은 다수의 SNP들을 동시에 분석하는 데 적합하지 않지만, 소수의 SNP들을 합리적인 가격으로 신속히, 민감하게 및 정확하게 질의하기에 특히 적합하다.
일부 방법들이 다른 방법들보다 더 적합할 수 있을지라도, 당분야에서 공지되어 있는, 하나 이상의 SNP를 검출하는 임의의 방법을 본원에 기재된 방법에서 사용하여, 샘플에서 세균들 및/또는 세균을 분류할 수 있고/있거나 확인할 수 있다. 이러한 방법의 비-한정적 예는 이하에 기재되어 있다.
3.1 핵산 시퀀싱 기법
일부 실시양태에서, 다형성은 핵산 시퀀싱 기법을 통해 확인된다. 구체적으로, 전통적인 시퀀싱 방법(예를 들면, "생거(Sanger) 방법"(Sanger, F., et al. (1975))으로서도 공지되어 있는 "디데옥시 매개 쇄 종결 방법") 및 "막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 방법"(Maxam, A. M., et al., 1977)으로서도 공지되어 있는 "화학적 분해 방법")을 이용하여 SNP 좌위를 포괄하는 증폭 생성물을 시퀀싱하여 SNP 좌위에 존재하는 뉴클레오타이드를 확인할 수 있다(상기 두 참고문헌들은 본원에 참고로 도입됨).
미국 특허 제6,294,336호(Boyce-Jacino et al.)는 한 부위에서 폴리뉴클레오타이드 표적에 선택적으로 결합하는 프라이머를 사용함으로써 핵산 분자(DNA 또는 RNA)의 서열을 확인하는 고체상 시퀀싱 방법을 제공하고, 이때 SNP는 표적에 선택적으로 결합된, 가장 3' 쪽에 있는 뉴클레오타이드이다. 다른 시퀀싱 기술, 예컨대, 변성 고압 액체 크로마토그래피 또는 질량 분광측정도 이용될 수 있다.
다른 예시적 예에서, 시퀀싱 방법은 피로시퀀싱(Pyrosequencing)™으로서 공지되어 있는 기법을 포함한다. 상기 방법은 데옥시뉴클레오타이드가 DNA의 중합 동안 도입될 때마다 피로포스페이트가 생성된다는 것에 기반을 둔다. 피로포스페이트의 생성을 루시퍼라제(luciferase) 촉진 반응에 커플링함으로써, 추가된 특정 데옥시뉴클레오타이드가 도입되는 경우 광 방사를 야기하여, 정량적이고 구별되는 피로그램을 제공한다. 샘플 프로세싱은 바이오티닐화된 프라이머를 사용한 PCR 증폭, 스트렙타비딘 코팅 비드(또는 다른 고체상)에서의 바이오티닐화된 단일 가닥 앰플리콘의 단리 및 시퀀싱 프라이머의 어닐링을 포함한다. 그 후, 설푸릴라제(sulfurylase) 및 루시퍼라제를 포함하는 표시제 반응을 위해 요구된 다수의 효소들 및 기질들뿐만 아니라, 도입되지 않은 분자의 분해를 위해 요구된 피라제(pyrase)도 첨가하는 피로시퀀스(Pyrosequence)™로 샘플을 분석한다. 그 다음, 4종의 데옥시뉴클레오타이드들을 첨가하여 샘플을 조사한다. 광 방사는 전하 커플링된 디바이스(CCD) 카메라에 의해 검출될 수 있고 도입된 뉴클레오타이드의 수에 비례한다. 결과는 패턴 인식에 의해 자동적으로 배정된다.
대안적으로, 본 발명의 방법은 "마이크로시퀀싱" 방법을 이용하여 핵산 내의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오타이드를 확인할 수 있다. 마이크로시퀀싱 방법은 "예정된" 부위에서 유일한 단일 뉴클레오타이드의 정체성을 확인한다. 이러한 방법은 표적 폴리뉴클레오타이드에서 다형성의 존재 및 정체성을 확인하는 데 특히 유용하다. 이러한 마이크로시퀀싱 방법뿐만 아니라, 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오타이드를 확인하는 다른 방법도 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제6,294,336호에 논의되어 있다.
마이크로시퀀싱 방법은 PCT 출원 공보 제WO 92/15712호에 개시된 제네틱 비트 어날리시스(Genetic Bit Analysis)™ 방법을 포함한다. DNA에서 다형성 부위를 어세이하는 추가 프라이머-안내된(guided) 뉴클레오타이드 도입 절차도 기재되어 있다(Komher, J.S., et al., 1989; Sokolov, B.P., 1990; Syvanen, A.C., et al., 1990; Kuppuswamy, M.N., et al., 1991; Prezant, T.R., et al. 1992; Ugozzoli, L., et al., 1992; Nyren, P., et al. 1993; and WO 89/10414). 이 방법들은 이들 모두가 다형성 부위에서 염기들을 식별하기 위해 표지부착된 데옥시뉴클레오타이드의 도입에 의존한다는 점에서 제네틱 비트 어날리시스™와 상이하다. 이러한 포맷에서, 신호는 도입된 데옥시뉴클레오타이드의 수에 비례하기 때문에, 동일한 뉴클레오타이드의 연속물로 존재하는 다형성은 상기 연속물의 길이에 비례하는 신호를 생성할 수 있다(Syvanen, A.C., et al. 1993).
추가 마이크로시퀀싱 방법은 다형성 부위의 뉴클레오타이드의 정체성을 확인하는 용액 기반 방법을 포함하는 미국 특허 제4,656,127호 및 프랑스 특허 제2,650,840호(PCT 출원 공보 제WO 91/02087호)에 의해 제공된다. 상기 미국 특허의 방법에서와 마찬가지로, 다형성 부위의 바로 3'에 있는 대립유전자 서열에 상보적인 프라이머가 사용된다.
다른 예시적 예에서, 예를 들면, 미국 특허 제5,002,867호는 올리고뉴클레오타이드 프로브들의 다수의 혼합물들을 사용한 하이브리드화를 통해 핵산 서열을 확인하는 방법을 기술한다. 이러한 방법에 따르면, 표적 폴리뉴클레오타이드의 서열은 표적이 한 위치에서 불변 뉴클레오타이드를 갖고 다른 위치에서 변이체 뉴클레오타이드를 가진 프로브 세트와 순차적으로 하이브리드화할 수 있게 함으로써 확인된다. 상기 방법은 표적을 프로브 세트와 하이브리드화시킨 후, 상기 세트의 적어도 하나의 구성원이 표적에 하이브리드화할 수 있는 부위의 수(즉, 일치의 수)를 측정함으로써 표적의 뉴클레오타이드 서열을 확인한다. 절차는 전형적으로 프로브 세트의 각각의 구성원이 시험될 때까지 반복된다.
대안적으로, 형광 편광 검출(FP-TDI) 어세이를 이용한 주형 유도 염료-터미네이터(dye-terminator) 도입 어세이(Chen et al. 1999)는 미니시퀀싱 또는 단일 염기 연장 어세이로서도 지칭되는 프라이머 연장 어세이의 한 버전이다(Syvanen, A.C., et al., 1990). 상기 프라이머 연장 어세이는 SNP를 검출할 수 있다. DNA 시퀀싱 프로토콜은 다형성 부위의 바로 업스트림에 있는 표적 DNA에 어닐링되는 SNP 특이적 시퀀싱 프라이머의 바로 3'에 있는 1개의 염기의 성질을 확인한다. DNA 중합효소 및 적절한 디데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(ddNTP)의 존재 하에서, 프라이머는 다형성 부위에서 표적 DNA 서열에 의해 좌우되는 1개의 염기에 의해 특이적으로 연장된다. 어느 ddNTP가 도입되는지를 확인함으로써, 표적 DNA에 존재하는 대립유전자(들)를 유추할 수 있다.
3.2 다형성 하이브리드화 기반 기법
뉴클레오타이드 서열 내의 다형성을 검출하는 하이브리드화 기법은 TaqMan® 어세이(어플라이드 바이오시스템스), 도트 블롯, 역 도트 블롯, 다중체-대립유전자 특이적 진단 어세이(MASDA), 동력학적 대립유전자 특이적 하이브리드화(DASH) (Jobs et al. 2003), 분자 비콘 및 서던 블롯을 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다.
뉴클레오타이드 서열 내의 SNP를 확인하는 (5' 뉴클레아제 어세이 또는 5' 소화 어세이로서도 공지되어 있는) TaqMan® 어세이는 표적 DNA에 하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 대체하고 절단하여 형광 신호를 생성하는 Taq 중합효소의 뉴클레아제 활성에 기반을 둔다. 특정 SNP에 특이적인 TaqMan® 프로브가 요구되고, 이때 각각의 프로브는 5' 말단에 부착된 상이한 형광 염료 및 3' 말단에 부착된 소광제를 가진다. 프로브가 온전할 때, 소광제는 형광 공명 에너지 전달(FRET)로 형광단과 상호작용하여, 이의 형광을 소광시킨다. PCT 어닐링 단계 동안, TaqMan® 프로브는 표적 DNA에 하이브리드화한다. 연장 단계에서, 형광 염료는 Taq 중합효소의 뉴클레아제 활성에 의해 절단되어, 레포터 염료에 의한 형광의 증가를 유발한다. 불일치 프로브는 단편화 없이 대체된다. 샘플의 유전형은 2종의 상이한 염료들의 신호 강도를 측정함으로써 확인된다.
또 다른 유용한 SNP 확인 방법은 다형성을 확인하기 위해 반응 온도를 꾸준히 증가시킬 때 프로브(올리고뉴클레오타이드)와 표적(PCR 생성물) 하이브리드화의 동력학적 추적을 포함하는 DASH(동력학적 대립유전자 특이적 하이브리드화)를 포함한다(Prince, J.A., et al. 2001).
일부 실시양태에서, 다중체-대립유전자 특이적 진단 어세이(MASDA)는 다수의 샘플들(>500)의 분석을 위해 이용될 수 있다. MASDA는 올리고뉴클레오타이드 하이브리드화를 이용하여 DNA 서열을 알아낸다. 다중체 DNA 샘플을 고체 지지체에 고정시키고, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드(ASO) 프로브의 풀을 사용하여 단일 하이브리드화를 수행한다. 소정의 샘플에 존재하는 특정 다형성에 상보적인 임의의 프로브는 사실상 표적 DNA에 의해 상기 풀로부터 친화성 정제된다. 결합된 ASO(들)의 화학적 또는 효소적 시퀀싱에 의해 생성된 서열 특이적 밴드 패턴(핑거프린트)은 특정 돌연변이(들)를 용이하게 확인한다.
특히 분자 비콘 및 스코르피온® 프로브를 포함하는 여러 대안적 하이브리드화 기반 기법들이 있다(Tyagi, S. and Kramer, F.R. 1996; Thelwell et al., 2000). 분자 비콘은 5' 말단 및 3' 말단에서 형광 레포터 및 소광제 염료를 가진 올리고뉴클레오타이드로 구성된다. 올리고뉴클레오타이드의 중심 부분은 표적 서열을 가로질러 하이브리드화하나, 5' 플랭킹 영역과 3' 플랭킹 영역은 서로 상보적이다. 5' 플랭킹 영역 및 3' 플랭킹 영역은 그들의 표적 서열에 하이브리드화되지 않을 때 하이브리드화되어 줄기-루프 구조를 형성하고, 레포터와 소광제 염료의 인접성 때문에 형광은 거의 없다. 그러나, 그들의 표적 서열에 하이브리드화되었을 때, 염료가 분리되고 형광의 큰 증가가 있다. 불일치된 프로브-표적 하이브리드는 정확히 상보적인 하이브리드보다 실질적으로 더 낮은 온도에서 해리한다. "비콘" 방법의 다수의 변경된 방법들이 있다. 스코르피온® 프로브는 유사하나, PCR 프라이머 서열을 프로브의 부분으로서 도입한다. 더 최근에 "이중체" 포맷도 개발되었다.
일부 실시양태에서, SNP를 확인하는 추가 방법은 SNP-IT™ 방법(오키드 바이오사이언시스 인코포레이티드(Orchid BioSciences, Inc.), 뉴저지주 프린스톤 소재)을 포함한다. 일반적으로, SNP-IT™는 3-단계 프라이머 연장 반응이다. 제1 단계에서, 표적 폴리뉴클레오타이드를 포획 프라이머에 하이브리드화시켜 샘플로부터 단리함으로써, 제1 수준의 특이성을 제공한다. 제2 단계에서, 표적 SNP 부위에서 종결 뉴클레오타이드 트리포스페이트로부터 포획 프라이머를 연장함으로써, 제2 수준의 특이성을 제공한다. 제3 단계에서, 직접적인 형광, 간접적인 형광, 간접적인 비색 어세이, 질량 분광측정, 형광 편광 등을 포함하는 다양한 공지된 포맷들을 이용하여 연장된 뉴클레오타이드 트리포스페이트를 검출할 수 있다. SNPstream™ 기구(오키드 바이오사이언시스 인코포레이티드, 뉴저지주 프린스톤 소재)를 이용하여 자동화된 포맷으로 반응을 384-웰 포맷으로 프로세싱한다.
이 실시양태에서, 방사성 프로브를 사용하거나 사용하지 않고 서던 블롯 분석으로 증폭 생성물을 검출할 수 있다. 하나의 이러한 방법에서, 예를 들면, 다형성 좌위의 핵산 서열을 매우 낮은 수준으로 함유하는 DNA의 작은 샘플을 증폭하고, 서던 블롯팅 기법을 통해, 또는 유사하게 도트 블롯 분석을 이용하여 분석한다. 비-방사성 프로브 또는 표지의 사용은 높은 수준의 증폭된 신호에 의해 용이해진다. 대안적으로, 증폭된 생성물을 검출하는 데 사용되는 프로브를 예를 들면, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생체발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소로 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능하게 표지부착할 수 있다.
하이브리드화 조건, 예컨대, 염 농도 및 온도를 스크리닝되는 핵산 서열에 맞게 조절할 수도 있다. 서던 블롯팅 및 하이브리드화 프로토콜은 문헌(Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience), pages 2.9.1-2.9.10)에 기재되어 있다. 무작위 올리고머 및 DNA 중합효소의 클레나우(Klenow) 단편을 사용한 하이브리드화를 위해 프로브를 표지부착할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 키트, 예컨대, 레디-투-고(Ready-To-Go) DNA 표지부착 비드(파마샤 바이오텍(Pharmacia Biotech))를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 매우 높은 특이적 활성의 프로브를 수득할 수 있다. 높은 반복 서열 함량을 가진 가능한 경쟁 프로브들, 및 하이브리드화 및 세척의 엄격도는 사용된 각각의 프로브에 대해 개별적으로 확인될 것이다. 대안적으로, 후보 서열의 단편을 PCR로 생성할 수 있고, 설치류-인간 체세포 하이브리드 패널 및 단편의 서브클로닝을 사용하여 특이성을 검증할 수 있다. 이것은 프로브로서의 시퀀싱 및 사용을 위한 큰 프렙(large prep)을 가능하게 한다. 일단 소정의 유전자 단편이 특징규명되면, 작은 프로브 준비는 PCR 생성물을 정제하는 겔 또는 컬럼에 의해 달성될 수 있다.
도트 블롯, 역 도트 블롯, 다중체 및 MASDA 포맷으로 사용될 수 있는 적합한 물질은 당분야에서 잘 공지되어 있고, 나일론 및 니트로셀룰로스 막을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
3.3 다형성 스캐닝 기법
뉴클레오타이드 서열 내에서 다형성을 검출하는, 본 발명에 의해 고려되는 스캐닝 기법은 화학적 불일치 절단(CMC)(Saleeba, J. A et al., 1992), 불일치 복구 효소 절단(MREC)(Lu, A.L. and Hsu, I.C, 1992), 화학적 절단 기법, 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)(Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989), 온도 구배 겔 전기영동(TGGE)(Salimullah, et al. 2005), 불변 변성 겔 전기영동(CDGE), 단일 가닥 입체구조 다형성(SSCP) 분석(Kumar, D. et al., 2006), 이종이중체 분석(HA)(Nagamine, C.M., et al., 1989), 마이크로위성(microsatellite) 마커 분석 및 단일 가닥 다형성 어세이(SSPA)를 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 SNP는 CMC를 통해 검출되고, 이때 방사성 표지부착된 DNA 야생형 서열(즉, 프로브)은 잠정적 변경을 함유하는 증폭된 서열에 하이브리드화되어 이종이중체를 형성한다. 화학적 변형에 이은 피페리딘 절단을 이용하여 이종이중체에서 불일치 버블을 제거한다. 변성된 이종이중체의 겔 전기영동 및 오토라디오그래피(autoradiography)는 절단 생성물의 가시화를 허용한다. 삼산화오스뮴은 잘못 페어링된 타이미딘의 변형을 위해 사용되고 하이드록실아민은 불일치된 사이토신을 위해 사용된다. 추가로, 프로브 DNA의 안티센스 가닥의 표지부착은 아데노신 및 구아노신 불일치의 검출을 허용한다. 불일치의 화학적 절단을 이용하여 긴 DNA 단편에서 거의 100%의 돌연변이를 검출할 수 있다. 더욱이, 이 방법은 시험된 단편 내에서 돌연변이의 정밀한 특징규명 및 정확한 위치를 제공한다. 최근에, 상기 방법은 형광 프라이머도 사용하여 다중체화를 가능하게 함으로써, 조작의 횟수를 감소시켜, CMC가 자동화에 더 적합해지도록 보정되었다. 대안적으로, PCR을 통해 도입된 형광 표지부착된 dUTP는 표적 및 프로브 DNA 가닥 둘 다의 내부 표지부착을 허용함으로써, 각각의 가능한 하이브리드의 표지부착을 가능하게 하여, 돌연변이 검출의 기회를 2배로 증가시키고 사실상 100% 검출을 보장한다.
다른 실시양태에서, 불일치 복구 효소 절단(MREC) 어세이를 이용하여 본 발명의 SNP를 확인한다. MREC는 불일치 함유 DNA에 특이적인 닉킹(nicking) 효소 시스템에 의존한다. 관심 있는 서열을 PCR로 증폭하고, 증폭된 생성물을 변성시키고 다시 어닐링시킴으로써 PCR의 말기에 동종이중체 및 이종이중체 종을 생성할 수 있다. 이 하이브리드들을 불일치 복구 효소로 처리한 후 변성 겔 전기영동으로 분석한다. MREC 어세이는 3종의 불일치 복구 효소들을 사용한다. MutY 엔도뉴클레아제는 불일치로부터 아데닌을 제거하고 A/T 및 C/G 염기전환, 및 G/C 및 T/A 전이 둘 다를 검출하는 데 유용하다. 포유동물 타이민 글리코실라제(glycosylase)는 T/G, T/C 및 T/T 불일치로부터 타이민을 제거하고, A/T 및 G/C 및 T/A 및 A/T 염기전환뿐만 아니라 G/C 및 A/T 전이도 검출하는 데 유용하다. 인간 또는 소 흉선으로부터의 모든 종류의 엔도뉴클레아제 또는 토포이소머라제(topoisomerase) I은 모든 8종의 불일치들을 인식할 수 있고, 임의의 뉴클레오타이드 치환을 스캐닝하는 데 사용될 수 있다. MREC는 DNA 가닥들 둘 다 내로 도입될 수 있는 특정 표지를 사용함으로써, 확인될 소정의 부위에서 모든 4종의 가능한 뉴클레오타이드 치환을 허용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 미국 특허 제5,217,863호에 기재된 화학적 절단 분석을 이용하여 뉴클레오타이드 서열 내에서 SNP를 확인한다. 이종이중체 분석처럼, 화학적 절단은 불일치된 대립유전자 서열들이 서로 하이브리드화할 때 생성된 상이한 성질을 검출한다. 겔에서 변경된 이동 속도로서 이 차이를 검출하는 대신에, 예를 들면, 하이드록실아민 또는 삼산화오스뮴에 이어 피페리딘을 사용한 화학적 절단에 대한 하이브리드의 변경된 민감성의 차이를 검출한다.
본 발명에 의해 고려되는 절단 방법들 중에서, RNAse A는 이종이중체 불일치 분석의 원리에 의존한다. RNAse A 절단 방법에서, PCR 증폭에 의해 수득된, 방사성 표지부착된 리보프로브와 DNA 사이의 RNA-DNA 이종이중체는 RNA:DNA 하이브리드 내의 불일치 점에서 단일 가닥 RNA를 절단하는 RNAse A의 능력을 활용함으로써 RNAse A에 의해 효소적으로 절단된다. 그 후, 전기영동 및 오토라디오그래피를 수행한다. 돌연변이의 존재 및 위치는 소정의 크기의 절단 생성물에 의해 표시된다(Meyers, R.M., et al., 1985; Gibbs, R.A. and Caskey, T., 1987).
DNA 프로브는 효소적 또는 화학적 절단을 통해 불일치를 검출하는 데 사용될 수도 있다(예를 들면, 문헌(Cotton, et al., 1988); 문헌(Shenk et al., 1975); 및 문헌(Novack et al., 1986) 참조).
일부 실시양태에서, 인베이더(Invader)® 어세이(써드 웨이브(Third Wave)™ 테크놀로지)를 이용하여 본 발명의 16S rRNA 유전자 내에서 다형성을 스캐닝할 수 있다. 예를 들면, 인베이더® 어세이는 2개의 중첩 올리고뉴클레오타이드들이 표적 DNA에 완벽히 하이브리드화할 때 형성된 3차원 구조가 Flap 엔도뉴클레아제에 의해 특이적으로 인식되고 절단된다는 사실에 기반을 둔다(Lyamichev, V. et al., 1999).
대안적으로, 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)은 서열 변이체를 분리하고 확인하는 데 유용한 기법이다. DGGE는 전형적으로 연속적으로 증가하는 양의 변성제(통상적으로 포름아미드 및 우레아, 양극에서 음극으로)의 존재 하에서 주조된 일정 농도 폴리아크릴아미드 겔 평판에서 수행된다. DGGE의 변법은 이동 경로를 따라 온도 구배를 이용하고 TGGE로서 공지되어 있다. DGGE 또는 TGGE에 의한 분리는 부분적으로 용융된 DNA 분자의 겔에서의 전기영동 이동성이 용융되지 않은 분자에 비해 크게 감소된다는 사실에 기반을 둔다.
일부 실시양태에서, 일정한 변성제 겔 전기영동(CDGE)은 문헌(Smith-Sorenson et al., 1993)에 상세히 기재된 바와 같이 뉴클레오타이드 서열 내에서 SNP를 검출하는 데 유용하다. 소정의 DNA 이중체는 일정한 변성제의 겔에서 예정된 특징적인 방식으로 용융한다. 돌연변이는 이 이동을 변경시킨다. 비정상적으로 이동하는 단편을 단리하고 시퀀싱하여 특정 돌연변이를 확인한다.
다른 실시양태에서, 단일 가닥 입체구조 다형성(SSCP) 분석은 본 발명의 SNP를 검출하는 방법을 제공한다. SSCP는 비-변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 분리된 단일 가닥 DNA 분자의 이동성의 변화에 기반을 둔 방법이다. 전기영동 이동성은 분자의 크기 및 모양 둘 다에 의해 좌우되고, 단일 가닥 DNA 분자들은 스스로 되접어 꺾이고 서열 의존적 방식으로 분자내 상호작용에 의해 결정되는 이차 구조를 생성한다. 단일 뉴클레오타이드 치환은 이차 구조를 변경시킬 수 있고, 결과적으로 단일 가닥의 전기영동 이동성을 변경시킴으로써, 오토라디오그래프에서 밴드 변동을 야기할 수 있다. 단일 가닥의 입체구조를 변경시키는 소정의 뉴클레오타이드 변이의 능력은 적절한 이론적 모델을 근거로 예측될 수 없고, 이차 구조의 루프 또는 긴 안정한 줄기에서 일어나는 염기 변화는 SSCP에 의해 검출되지 않을 것이다. 표준 SSCP는 150 내지 200 bp의 단편에서 서열 변경을 검출하는 데 있어서 최대 신뢰도에 도달한다. 방사성 기반 SSCP 분석의 민감성과 동등한 민감성으로 돌연변이를 검출할 수 있게 하는 보다 더 진보된 프로토콜이 개발되었다. 이 방법들은 PCR에서 형광 표지부착된 프라이머를 사용하고 형광 기반 자동화 시퀀싱 기계로 생성물을 분석한다. 또한, 다색 형광 SSCP는 각각의 레인으로부터의 데이터들을 서로 비교하는 데 사용될 수 있는 내부 표준물을 모든 레인에 포함시킬 수 있게 한다. 검출률을 증가시키기 위한 다른 변법은 디데옥시 핑거프린팅(ddF) 및 제한 엔도뉴클레아제 핑거프린팅(REF)에 기반을 둔 디데옥시 시퀀싱 방법을 포함한다.
ddF 방법은 1개의 디데옥시뉴클레오타이드를 사용한 생거 시퀀싱 반응의 비-변성 겔 전기영동을 포함하는, SSCP와 생거 디데옥시 시퀀싱의 조합이다. 이 방식으로, 예를 들면, 250 bp 단편을 스크리닝하여 SNP를 확인할 수 있다. REF는 1 kb 초과의 단편의 스크리닝을 가능하게 하는, SSCP의 보다 더 복잡한 변형이다. REF를 위해, 표적 서열을 PCR로 증폭하고 5개 또는 6개의 상이한 제한 엔도뉴클레아제들로 독립적으로 소화하고 비-변성 겔에서 SSCP로 분석한다. 6개의 제한 효소들이 사용되는 경우, 서열 변이는 6개의 상이한 제한 단편들에 존재함으로써, 12개의 상이한 단일 가닥 분절들을 생성할 것이다. 이 단편들 중 어느 한 단편의 이동성 변동은 본 발명의 SNP의 존재를 표시하기에 충분하다. 수득된 제한 패턴은 조사된 영역에서 변경의 국소화를 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 이종이중체 분석(HA)은 PCR 생성물 또는 뉴클레오타이드 서열에서 단일 염기 치환을 검출한다. HA는 방사성 동위원소 또는 특수 장치 없이 신속하게 수행될 수 있다. HA 방법은 PCR 생성물의 가열 및 재생으로 하나 이상의 위치에서 상이한 뉴클레오타이드를 가진 서열들 사이에 이종이중체를 형성하는 것을 이용한다. 불일치된 염기 주변의 보다 더 개방된 이중 가닥 형상으로 인해, 이종이중체는 그의 상응하는 동종이중체보다 더 느리게 이동한 후, 감소된 이동성의 밴드로서 검출된다. 인접 뉴클레오타이드들이 불일치된 영역의 형상에 실질적으로 영향을 미치기 때문에 단순히 불일치된 염기를 확인함으로써 HA 방법에 의해 검출되는 특정 단일 염기 치환의 능력을 예측할 수는 없고, 길이 기반 분리는 뉴클레오타이드 치환을 분명히 놓칠 것이다. 사용된 아크릴아미드의 온도, 겔 가교결합 및 농도의 최적화뿐만 아니라 글리세롤 및 수크로스도 돌연변이된 샘플의 해상도를 향상시킨다. HA 방법은 방사성 동위원소 또는 특수 장치 없이 신속히 수행될 수 있고 시퀀싱된 유전자에서 공지된 돌연변이 및 다형성에 대해 다수의 샘플들을 스크리닝한다. HA가 SSCP와 함께 이용될 때, DNA 단편에서 최대 100%의 모든 변경이 용이하게 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오타이드 불일치를 인식하는 단백질, 예컨대, 이. 콜라이 mutS 단백질을 사용하여 본 발명의 16S rRNA 내에서 다형성을 검출할 수 있다(Modrich 1991). mutS 어세이에서, 단백질은 2개의 서열들 사이의 이종이중체에서 뉴클레오타이드 불일치를 함유하는 서열에만 결합한다.
추가 실시양태에서, 마이크로위성 마커 분석을 이용하여 다형성 검출을 수행할 수 있다. 예를 들면, 당분야에서 공지된 표준 DNA 단리 방법을 이용하여 약 10 센티모르간(cM)의 평균 게놈 간격을 가진 마이크로위성 마커를 사용할 수 있다.
전술된 SSPA 분석 및 밀접히 관련된 이종이중체 분석 방법은 단일 염기 다형성에 대한 스크리닝을 위해 이용될 수 있다(Orita, M. et al., 1989).
3.4 다형성 분석을 위한 뉴클레오타이드 어레이 및 유전자 칩
본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 어레이의 사용을 통해 SNP를 확인하는 방법도 고려하고, 이때 상기 어레이의 상이한 위치는 본 발명의 SNP를 함유하고 다형성 위치를 플랭킹하는 서열을 포함하는 하나 이상의 서열, 예를 들면, 적어도 12개 뉴클레오타이드, 적어도 약 15개 뉴클레오타이드, 적어도 약 18개 뉴클레오타이드, 적어도 약 20개 뉴클레오타이드 또는 적어도 약 25개 뉴클레오타이드 이상의 올리고뉴클레오타이드에 상보적이다. 이러한 어레이는 상이한 다형성에 각각 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 일련의 올리고뉴클레오타이드들을 포함할 수 있다. 어레이의 예에 대해서는 문헌(Hacia et al., 1996) 및 문헌(De Risi et al., 1996)을 참조한다.
뉴클레오타이드 어레이는 요구될 때 본 발명의 다형성의 전부 또는 서브세트를 포함할 수 있다. 하나 이상의 다형성 형태가 상기 어레이에 존재할 수 있다. 어레이의 올리고뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 길이가 적어도 약 12개 뉴클레오타이드, 적어도 약 15개 뉴클레오타이드, 적어도 약 18개 뉴클레오타이드, 적어도 약 20개 뉴클레오타이드 또는 적어도 약 25개 뉴클레오타이드 이상, 예컨대, 길이가 100개 내지 200개 뉴클레오타이드이다. 어레이의 예에 대해서는 문헌(Ramsay 1998); 문헌(Hacia et al., 1996); 문헌(Lockhart et al., 1996); 및 문헌(De Risi et al., 1996)을 참조한다.
생물학적 샘플의 마이크로어레이, 예컨대, DNA 하이브리드화 어세이에서 사용될 DNA 샘플들의 어레이를 생성하기 위해 다수의 방법들을 이용할 수 있다. 이러한 어레이의 예는 PCT 출원 공보 제WO95/35505호; 미국 특허출원 제5,445,934호; 및 문헌(Drmanac et al., 1993)에 상세히 논의되어 있다. 문헌(Yershov et al. 1996)은 올리고뉴클레오타이드 어레이의 대안적 구축을 기술한다. 올리고뉴클레오타이드 어레이의 구축 및 용도는 문헌(Ramsay (1998))에 의해 검토되어 있다.
뉴클레오타이드 서열 내에서 다형성을 확인하기 위해 고밀도 올리고뉴클레오타이드 어레이를 사용하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Milosavljevic et al., 1996)은 짧은 올리고머에의 하이브리드화에 의한 DNA 서열 인식을 기술한다(문헌(Drmanac et al., 1998); 및 문헌(Drmanac and Drmanac, 1999) 또한 참조). 공지되어 있지 않은 돌연변이의 확인을 위한 어레이의 사용은 문헌(Ginot 1997)에 의해 제안되어 있다.
공지된 돌연변이의 검출은 문헌(Hacia et al. 1996); 및 문헌(Cronin et al., 1996) 등에 기재되어 있다. 유전적 맵핑에 있어서 어레이의 사용은 문헌(Chee et al., 1996); 문헌(Sapolsky and Lishutz, 1996); 및 문헌(Shoemaker et al., 1996)에 논의되어 있다.
상보적 DNA 마이크로어레이를 이용한 유전자 발현 패턴의 정량적 모니터링은 문헌(Schena et al., 1995); 및 문헌(DeRisi et al., 1997)에 기재되어 있다. 문헌(Wodicka et al., 1997)은 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)에서의 게놈 범위 발현 모니터링을 수행한다.
올리고뉴클레오타이드의 고밀도 마이크로어레이는 당분야에서 공지되어 있고 상업적으로 입수될 수 있다. 어레이의 올리고뉴클레오타이드의 서열은 공지된 표적 서열에 상응할 것이다. 어레이에 존재하는 올리고뉴클레오타이드의 길이는 하이브리드화가 불일치의 존재에 얼마나 민감한지에 있어서 중요한 요인이다. 통상적으로, 올리고뉴클레오타이드는 길이가 적어도 약 12개 뉴클레오타이드일 것이고, 보다 통상적으로 길이가 적어도 약 15개 뉴클레오타이드일 것이고, 바람직하게는 길이가 적어도 약 20개 뉴클레오타이드일 것이고, 보다 바람직하게는 길이가 적어도 약 25개 뉴클레오타이드일 것이고, 길이가 약 35개 뉴클레오타이드보다 더 길지 않을 것이고, 통상적으로 길이가 약 30개 뉴클레오타이드를 초과하지 않을 것이다.
광 유도 합성 기법을 이용하여 올리고뉴클레오타이드의 큰 어레이를 생성하는 방법은 미국 특허 제5,134,854호 및 미국 특허 제5,445,934호에 기재되어 있다. 컴퓨터 제어 시스템을 이용하여, 다수의 반응 부위들에서 동시적인 커플링을 통해 단량체의 불균질 어레이를 중합체의 불균질 어레이로 전환시킨다. 대안적으로, 예를 들면, PCT 출원 공보 제WO 95/35505호에 기재된 바와 같이, 미리 합성된 올리고뉴클레오타이드를 고체 기판 위에 침착시킴으로써 마이크로어레이를 생성한다.
마이크로어레이를 스캐닝하여 표지부착된 게놈 샘플의 하이브리드화를 검출할 수 있다. 디바이스에서 형광 표시된 표적을 검출하는 방법 및 디바이스는 당분야에서 공지되어 있다. 일반적으로, 이러한 검출 디바이스는 기판에서 광을 유도하기 위한 현미경 및 광원을 포함한다. 광자 카운터는 기판으로부터의 형광을 검출하는 반면, x-y 병진 재물대는 기판의 위치를 변경시킨다. 본 방법에서 이용될 수 있는 공초점 검출 디바이스는 미국 특허 제5,631,734호에 기재되어 있다. 스캐닝 레이저 현미경은 문헌(Shalon et al. 1996)에 기재되어 있다. 적절한 여기 선을 사용하여, 사용된 각각의 형광단에 대해 스캔을 수행한다. 그 후, 스캔으로부터 생성된 디지털 영상을, 후속 분석을 위해 조합한다. 임의의 특정 어레이 요소의 경우, 1개의 핵산 샘플로부터의 형광 신호의 비를 다른 핵산 샘플로부터의 형광 신호와 비교하고, 상대적 신호 강도를 측정한다.
형광 검출에 의해 수집된 데이터를 분석하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 데이터 분석은 수집된 데이터로부터 기판 위치의 함수로서 형광 강도를 측정하는 단계, 이상치, 즉 예정된 통계학적 분포로부터 벗어난 데이터를 제거하는 단계, 및 남은 데이터로부터 표적의 상대적 결합 친화성을 계산하는 단계를 포함한다. 생성된 데이터는 표적과 프로브 사이의 결합 친화성에 따라 달라지는 강도를 가진 영상으로서 각각의 영역에서 디스플레이될 수 있다.
마이크로칩 기술을 통한 핵산 분석도 본 발명에 적용될 수 있다. 이 기법에서, 수천 개의 상이한 올리고뉴클레오타이드 프로브들이 실리콘 칩 위에 어레이로 적용될 수 있다. 분석될 핵산은 형광 표지가 부착되고, 칩 위의 프로브에 하이브리드화된다. 이 핵산 마이크로칩을 사용하여 핵산-단백질 상호작용을 연구할 수도 있다. 이 기법을 이용하여 돌연변이의 존재를 확인할 수 있거나, 분석될 핵산을 시퀀싱할 수 있거나, 관심 있는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있다. 상기 방법은 많은, 심지어 수천 개의 프로브들을 한 번에 동시에 프로세싱하는 방법이고 분속 속도를 엄청나게 증가시킬 수 있다.
mRNA 전사의 변경은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있는 임의의 기법에 의해 검출될 수 있다. 이들은 노던 블롯 분석, PCR 증폭 및 RNase 보호를 포함한다. 감소된 mRNA 전사는 서열의 변경을 표시한다.
상기 어레이/칩 기술은 다수의 경우들에서 성공적으로 이미 적용되었다.
예를 들면, BRCA 1 유전자, 사카로마이세스 세레비지애 돌연변이체 균주 및 HIV-1 바이러스의 프로테아제 유전자에서 돌연변이의 스크리닝이 착수되었다 (Hacia et al., 1996; Shoemaker et al., 1996; Kozal et al., 1996). SNP를 검출하는 데 사용될 다양한 포맷의 칩들이 주문제작 방식으로 제조될 수 있다.
SNP를 검출하는 데 유용한 어레이 기반 타일링(tiling) 기법은 유럽 특허 제785280호에 기재되어 있다. 요약하건대, 어레이는 일반적으로 다수의 특정 다형성들에 대해 "타일링"될 수 있다. "타일링"은 관심 있는 표적 서열에 상보적인 서열로 구성된 정해진 올리고뉴클레오타이드 프로브 세트의 합성뿐만 아니라, 그 서열의 미리 선택된 변이, 예를 들면, 기초 단량체, 즉 뉴클레오타이드 세트의 하나 이상의 구성원에 의한 하나 이상의 소정의 위치의 치환도 지칭한다. 타일링 기법은 PCT 출원 공보 제WO 95/11995호에 더 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 어레이는 다수의 특정 SNP들에 대해 타일링된다. 특히, 어레이는 특정 SNP 또는 SNP 세트에 각각 특이적인 다수의 검출 블록들을 포함하도록 타일링된다. 예를 들면, 검출 블록은 특정 SNP를 포함하는 서열 분절을 포괄하는 다수의 프로브들을 포함하도록 타일링될 수 있다. 각각의 대립유전자에 상보적인 프로브를 보장하기 위해, SNP 위치에서 상이한 쌍으로 프로브를 합성한다. SNP 위치에서 상이한 프로브 이외에, 단치환된 프로브도 일반적으로 검출 블록 내에서 타일링된다. 이러한 방법은 본원에 개시된 SNP 정보에 용이하게 적용될 수 있다.
이 단치환된 프로브는 (A, T, G, C 및 U로부터 선택된) 남은 뉴클레오타이드로 치환된, 다형성으로부터 어느 한 방향으로 일정 수의 염기를 가진다. 전형적으로, 타일링된 검출 블록에서 프로브는 SNP로부터 5개의 염기에 의해 떨어져 있는 위치까지 포함하는 서열 위치의 치환을 포함할 것이다. 단치환된 프로브는 인공 교차-하이브리드화로부터 실제 하이브리드화를 식별하기 위해 타일링된 어레이에 대한 내부 대조군을 제공한다. 표적 서열과의 하이브리드화의 완료 및 어레이의 세척 시, 어레이를 스캐닝하여, 표적 서열이 하이브리드화하는 어레이의 위치를 확인한다. 그 다음, 스캐닝된 어레이로부터의 하이브리드화 데이터를 분석하여, SNP의 어느 대립유전자 또는 대립유전자들이 샘플에 존재하는지를 확인한다. 하이브리드화 및 스캐닝은 PCT 출원 공보 제WO 92/10092호 및 제WO 95/11995호, 및 미국 특허 제5,424,186호에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 칩은 길이가 약 15개 뉴클레오타이드인 단편의 핵산 서열 및 이에 상보적인 서열, 또는 이의 단편의 어레이를 포함할 수 있고, 이때 상기 단편은 적어도 약 8개의 연속 뉴클레오타이드, 바람직하게는 10개, 15개, 20개, 보다 바람직하게는 25개, 30개, 40개, 47개 또는 50개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고 다형성 염기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다형성 염기는 폴리뉴클레오타이드의 중심으로부터 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 뉴클레오타이드 내에 있고, 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드의 중심에 있다. 다른 실시양태에서, 칩은 임의의 수의 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 어레이를 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 PCT 출원 공보 제W095/251116호에 기재된 바와 같이 화학적 커플링 절차 및 잉크 젯 적용 장치를 이용함으로써 기판의 표면에서 합성될 수 있다. 또 다른 양태에서, 도트(또는 슬롯) 블롯과 유사한 "격자무늬" 어레이를 이용하여, cDNA 단편 또는 올리고뉴클레오타이드를 배열할 수 있고 진공 시스템, 열, UV, 기계적 또는 화학적 결합 절차를 이용하여 기판의 표면에 결합시킬 수 있다. 어레이, 예컨대, 전술된 어레이는 손에 의해 제조될 수 있거나, 입수가능한 디바이스(슬롯 블롯 또는 도트 블롯 장치), 물질(임의의 적합한 고체 지지체) 및 기구(로봇 기구를 포함함)를 이용함으로써 제조될 수 있고, 8개, 24개, 96개, 384개, 1536개 또는 6144개 이상의 올리고뉴클레오타이드, 또는 상업적으로 입수가능한 기구의 효율적인 이용에 적합한 임의의 다른 수의 올리고뉴클레오타이드를 함유할 수 있다.
본 발명은 이러한 어레이를 이용함으로써, 샘플에서 본 발명의 SNP를 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 시험 샘플을, 본 발명의 적어도 하나의 SNP 위치에 상응하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 어레이와 함께 항온처리하는 단계, 및 시험 샘플로부터의 핵산과 상기 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 결합에 대해 어세이하는 단계를 포함한다. 이러한 어세이는 전형적으로 많은 SNP 위치들 및/또는 이러한 SNP 위치들의 대립유전자 변이체들에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 어레이를 포함할 것이고, 상기 SNP 위치들 중 적어도 하나는 본 발명의 SNP이다.
핵산 분자를 시험 샘플과 함께 항온처리하기 위한 조건은 상이하다. 항온처리 조건은 어세이에서 이용된 포맷, 이용된 검출 방법, 및 어세이에서 이용된 핵산 분자의 종류 및 성질에 의해 좌우된다. 당분야에서 숙련된 자는 통상적으로 이용가능한 하이브리드화, 증폭 또는 어레이 어세이 포맷들 중 어느 한 포맷이 본원에 개시된 신규 SNP를 사용하도록 용이하게 맞추어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이러한 어세이의 예는 문헌(Chard, T, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986)); 문헌(Bullock, G. R. et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, Fla. Vol. 1 (1982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985)); 및 문헌(Tijssen, P., Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985))에서 확인될 수 있다.
다성분 통합 시스템도 SNP를 분석하는 데 이용될 수 있다. 이러한 시스템은 단일 기능 디바이스에서 PCR 및 모세관 전기영동 반응과 같은 과정을 소형화하고 구획화한다. 이러한 기법의 일례는 칩에서의 PCR 증폭과 모세관 전기영동의 통합을 기술하는 미국 특허 제5,589,136호에 개시되어 있다.
통합 시스템은 주로 마이크로플루이딕 시스템이 사용될 때 예상될 수 있다. 이 시스템은 마이크로칩에 포함된 유리, 실리콘, 석영 또는 플라스틱 웨이퍼에 디자인된 마이크로채널의 패턴을 포함한다. 샘플의 이동은 이동 부품을 갖지 않는 기능성 미시적 밸브 및 펌프를 생성하기 위해 마이크로칩의 상이한 영역들에 걸쳐 적용된 전기적, 전기삼투적 또는 정수역학적 힘에 의해 조절된다. 전압의 변경은 마이크로기계가공된 채널들 사이의 교차점에서 액체 유동을 조절하고 마이크로칩의 상이한 구획들에 걸친 펌핑을 위한 액체 유속을 변화시킨다.
SNP의 유전형분석을 위해, 마이크로플루이딕 시스템은 예를 들면, 핵산 증폭, 미니시퀀싱 프라이머 연장, 모세관 전기영동 및 검출 방법, 예컨대, 레이저 유도 형광 검출을 통합할 수 있다.
제1 단계에서, DNA 샘플을 바람직하게는 PCR로 증폭한다. 그 다음, ddNTP(각각의 ddNTP에 대한 특이적 형광), 및 표적화된 다형성 염기의 바로 업스트림에서 하이브리드화하는 적절한 올리고뉴클레오타이드 미니시퀀싱 프라이머를 사용하는 자동화 미니시퀀싱 반응을 증폭 생성물에 대해 수행한다. 일단 3' 말단에서의 연장이 완료되면, 모세관 전기영동으로 프라이머를 도입되지 않은 형광 ddNTP로부터 분리한다. 모세관 전기영동에서 사용되는 분리 배지는 예를 들면, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜 또는 덱스트란일 수 있다. 단일 뉴클레오타이드 프라이머 연장 생성물에 도입된 ddNTP는 레이저 유도 형광 검출에 의해 확인된다. 이 마이크로칩은 적어도 96개 내지 384개 이상의 샘플들을 동시에 프로세싱하는 데 이용될 수 있다.
3.5 다형성의 검출을 위한 연장 기반 기법
뉴클레오타이드 서열 내에서 다형성을 검출하기 위한 연장 기반 기법은 유럽 특허출원 공보 제0332435호 및 문헌(Newton et al., 1989)에 개시된 증폭 불응성 돌연변이 시스템(ARMS)으로서도 공지되어 있는 대립유전자 특이적 증폭, 및 문헌(Gibbs et al. 1989)에 의해 고려되는 다형성의 클로닝(COPS)을 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다.
연장 기반 기법인 ARMS는 유전형분석을 위해 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드(ASO) PCR 프라이머를 사용한다. 이 방법에서, PCR을 위해 사용된 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머들 중 하나는 가장 통상적으로 다형성 부위를 표적화하는 프라이머의 3' 말단으로 상기 다형성 부위에 결합하도록 디자인된다. 조심스럽게 조절된 조건(어닐링 온도, 마그네슘 농도 등) 하에서, 증폭은 PCR 프라이머의 3' 말단의 뉴클레오타이드가 다형성 부위의 염기에 상보적일 경우에만 일어나고, 이때 불일치는 증폭에 "불응성"을 가진다.
돌연변이유발적으로 분리된 PCR((MS-PCR)로서 지칭되는 ARMS 방법의 변법은 한 부위에서 상이한 다형성에 각각 특이적인 상이한 길이의 2개의 ARMS 프라이머들을 포함한다. 이 방법은 상이한 다형성에 대한 상이한 길이의 PCR 생성물을 제공한다.
3.6 다형성의 검출을 위한 라이게이션 기반 어세이
SNP 검출의 또 다른 전형적인 방법은 올리고뉴클레오타이드 라이게이션 어세이를 포괄한다. 다수의 방법들이 DNA 주형에 하이브리드화된 2개의 인접 올리고뉴클레오타이드들을 결합시킬 수 있는 효소인 DNA 리가제를 사용한다. 상기 방법의 특이성은 라이게이션 부위에서 하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드와 DNA 주형 사이의 완벽한 일치에 대한 요구로부터 나온다. 올리고뉴클레오타이드 라이게이션 어세이(OLA) 또는 리가제 연쇄 반응(LCR) 어세이에서, 돌연변이 부위 주변의 서열이 먼저 증폭되고, 한 가닥은 3개의 라이게이션 프로브들을 위한 주형으로서 사용되고, 이 프로브들 중 둘은 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드(ASO)이고 세 번째 프로브는 공통된 프로브이다. 다수의 방법들이 라이게이션된 생성물의 검출을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 2개의 ASO들은 형광 또는 햅텐 표지로 상이하게 표지부착될 수 있고, 라이게이션된 생성물은 각각 형광측정 또는 비색 효소 결합 면역흡착 어세이에 의해 검출될 수 있다. 전기영동 기반 시스템의 경우, 형광 검출과 커플링된 이동성 변형제 태그의 사용 또는 프로브 길이의 변경은 단일 튜브에서 여러 단일 뉴클레오타이드 치환들의 다중체 유전형분석을 가능하게 한다. 어레이에서 사용될 때, ASO는 칩 위의 특정 위치 또는 주소에 스폿팅될 수 있다. 그 다음, PCR에 의해 증폭된 DNA를 첨가할 수 있고, 어레이 위의 특정 주소에서 표지부착된 올리고뉴클레오타이드에의 라이게이션을 측정할 수 있다.
3.7 신호 생성 다형성 검출 어세이
일부 실시양태에서, 형광 공명 에너지 전달(FRET)은 16S rRNA 유전자 내에서 다형성을 확인하는 방법으로서 고려된다. FRET는 2종의 염료 분자들의 전자 여기된 상태 사이의 상호작용으로 인해 일어난다. 여기는 광자의 방사 없이 하나의 (공여자) 염료 분자로부터 다른 (수용자) 염료 분자로 전달된다. 이것은 거리 의존적이다. 즉, 공여자 및 수용자 염료는 가까이 인접해야 한다. 하이브리드화 프로브 시스템은 형광 염료로 표지부착된 2개의 올리고뉴클레오타이드들로 이루어진다. 하이브리드화 프로브 쌍은 표적 DNA의 인접 영역에 하이브리드화하도록 디자인된다. 각각의 프로브는 상이한 마커 염료로 표지부착된다. 2종의 염료들의 상호작용은 이들 둘 다가 이들의 표적에 결합될 때에만 일어날 수 있다. 공여자 프로브는 3' 말단에서 형광단으로 표지부착되고, 수용자 프로브는 5' 말단에서 형광단으로 표지부착된다. PCR 동안, 올리고뉴클레오타이드들에 커플링된 형광단이 하이브리드 구조에서 가까이 인접하도록 2개의 상이한 올리고뉴클레오타이드들은 표적 DNA의 인접 영역에 하이브리드화한다. 공여자 형광단(F1)은 외부 광원에 의해 여기된 후, 그의 여기 에너지의 일부를 인접 수용자 형광단(F2)에게 전달한다. 여기된 수용자 형광단(F2)은 분자 인접성에 대해 검출되고 측정될 수 있는 상이한 파장에서 광을 방사한다.
다른 실시양태에서, 단일 염기 연장, 자기 분리 및 화학발광에 기반을 둔 MagSNiPer 방법은 뉴클레오타이드 서열에서 SNP를 확인하는 추가 방법을 제공한다. 태그 표지부착된 ddNTP와 함께, SNP 부위에 인접한 3' 말단을 가진 바이오티닐화된 프라이머를 사용하여 단일 염기 뉴클레오타이드 연장 반응을 수행한다. 그 다음, 스트렙타비딘을 가진 자기 코팅 비드로 프라이머를 포획하고, 도입되지 않은 표지부착된 ddNTP를 자기 분리로 제거한다. 상기 자기 비드를 알칼리성 포스파타제와 접합된 항-태그 항체와 함께 항온처리한다. 자기 분리에 의한 여분의 접합체의 제거 후, 화학발광을 측정함으로써 SNP 타이핑을 수행한다. 표지부착된 ddNTP의 도입을 알칼리성 포스파타제에 의해 유도된 화학발광으로 모니터링한다.
일부 실시양태에서, 형광 편광은 뉴클레오타이드 서열 내에서 다형성을 확인하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 다형성을 함유하는 증폭된 DNA를 대립유전자 특이적 염료 표지부착된 디데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 상업적으로 입수가능한 변형된 Taq DNA 중합효소의 존재 하에서 (다형성 부위에 인접한 DNA 주형에 하이브리드화하도록 디자인된) 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 함께 항온처리한다. 주형에 존재하는 대립유전자에 특이적인 염료-터미네이터로 프라이머를 연장시켜, 형광단의 분자량을 대략 10배 증가시킨다. 반응의 말기에, 반응 혼합물에서 2종의 염료-터미네이터들의 형광 편광을 분리 또는 정제 없이 직접 분석한다. 이 균일 DNA 진단 방법은 매우 민감하고 특이적인 것으로 확인되고 다수의 샘플들의 자동화 유전형분석에 적합하다.
다른 실시양태에서, 표면 증강 라만 산란은 이중 가닥 DNA 단편에서 단일 염기 차이를 검출하고 확인하는 방법으로서 이용될 수 있다(문헌(Chumanov, G 1999) 참조). SERS는 단일 분자 검출을 위해 이용되기도 한다(Kneipp, K, 1997). SERS는 나노미터 크기의 금속성 구조물에 부착된 분자로부터의 강력히 증가된 라만 신호를 발생시킨다.
예시적 예는 검출로서 형광 소광을 이용하는 프라이머 연장 어세이에 기반을 둔, 문헌(Xiao and Kwok 2003)에 의해 논의된 유전형분석 방법을 포함한다. 형광 소광 검출을 이용하는 주형 유도 염료-터미네이터 도입(FQ-TDI) 어세이는 형광 염료 R110 표지부착된 아사이클로터미네이터(acycloterminator) 및 R6G 표지부착된 아사이클로터미네이터가 일단 DNA 올리고뉴클레오타이드 프라이머 내로 도입되면 이들의 강도가 보편적으로 소광된다는 관찰결과에 기반을 둔다. 2종의 대립유전자 염료들의 형광 소광의 속도를 실시간으로 비교함으로써, DNA 샘플 중의 SNP의 빈도를 측정할 수 있다. 동력학적 FQ-TDI 어세이는 유전형분석 및 대립유전자 빈도 추정 둘 다에 있어서 매우 정확하고 재현가능하다.
3.8 고해상 용융 분석
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 방법은 16S rRNA 유전자, 16S rRNA 분자 또는 이의 DNA 카피 내의 본원에 기재된 SNP(들)을 근거로 샘플에서 세균들 또는 세균을 분류하고/하거나 확인하기 위해 고해상 용융(HRM) 분석을 이용한다.
HRM은 삽입 형광 염료로 염색된 PCR 생성물(즉, 앰플리콘)이 그의 용융 온도(T m )를 통해 가열되기 때문에 형광의 변화의 정확한 모니터링에 기반을 둔다. 전통적인 용융과 대조적으로, HRM 분석에서의 정보는 계산된 T m 보다는 오히려 용융 곡선의 모양으로 함유되므로, HRM은 분광법의 한 형태로서 간주될 수 있다. HRM 분석은 단일 단계 및 폐쇄된 튜브 방법이고, 증폭 및 용융은 실시간 PCR 기계에서 단일 프로토콜로서 실시될 수 있다.
본 발명의 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 SNP들 중 하나 이상의 SNP를 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드에 선택적으로 하이브리드화하는 증폭 프라이머 쌍을 사용한다. 증폭 반응 혼합물은 생성된 앰플리콘 내로 도입되는 형광 염료를 함유한다.
그 후, 온도를 약 50℃부터 약 95℃까지 점진적으로 증가시키면서(즉, 0.01℃ 내지 0.5℃) HRM을 생성된 앰플리콘에 대해 수행한다. 이 과정 동안 일부 점에서, 앰플리콘의 용융 온도에 도달되고, DNA의 두 가닥들은 분리되거나 "융융되어" 떨어진다.
앰플리콘 내로 도입된 형광 염료를 사용하여 HRM을 실시간으로 모니터링한다. 염료의 형광 수준은 이중 가닥 DNA의 양이 감소할 때 감소하는 형광과 함께 온도 증가로서 모니터링된다. 형광 및 온도의 변화는 용융 곡선으로서 공지되어 있는 그래프로 작도될 수 있다.
숙련된 당업자가 이해할 바와 같이, 2개의 DNA 가닥들이 분리되는 앰플리콘의 T m 은 앰플리콘을 형성하는 뉴클레오타이드 염기의 서열에 의해 좌우되기 때문에 예측될 수 있다. 따라서, 용융 곡선이 상이하게 보일 것이기 때문에 다형성(즉, SNP 또는 SNP들)을 함유하는 앰플리콘을 포함하는 앰플리콘들을 식별할 수 있다. 실제로, 일부 실시양태에서, 주변 DNA 서열의 차이를 근거로 동일한 다형성을 함유하는 앰플리콘들을 식별할 수 있다.
HRM 곡선들은 많은 상이한 방법들에 의해 서로 식별될 수 있다. 예를 들면, 많은 경우, HRM 곡선들은 곡선 모양의 분명한 차이, 및/또는 유의한 차이로서 간주되는 0.2℃의 차이를 가진 T m 을 근거로 식별될 수 있다. 다른 경우, 차이 그래프 분석을 이용할 수 있고, 이때 정의된 곡선을 기준으로서 이용하고, 다른 표준화된 곡선을 기준과 비교하여 작성한다(문헌(Price, E.P. et al. 2007) 참조). 다른 경우, 모든 온도에서 형광에 대한 평균 ± 1.96 표준 편차로부터 3번째 백분위수 및 97번째 백분위수를 유도하는 단계를 포함하는 차이 그래프 기반 방법을 이용할 수 있다(문헌(Andersson, P. et al., 2009); 및 문헌(Merchant-Patel, S. et al. 2008) 참조).
4. 수단, 시약, 프라이머, 프로브, 키트 및 프로세싱 시스템
본 명세서는 얼마나 다양한 SNP들이 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나 분류하거나, 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 진단하는 '수단'으로서 사용될 수 있는지를 설명한다. 이 SNP 발견은 본 발명자들이 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 확인하거나, 부분적으로 확인하거나 분류하거나, 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 진단하는 유전자/대립유전자 기반 및 유전자 생성물 기반 프로브, 수단, 시약, 방법 및 어세이를 개발할 수 있게 한다.
당분야에서 숙련된 자는 본 명세서, 특히 표 1 내지 9 및 11에서 제공된 정보를 기반으로 광범위한 유전자/대립유전자 기반 및 유전자 생성물 기반 프로브, 수단, 시약, 방법 및 어세이를 용이하게 디자인할 수 있거나, 생성할 수 있거나 제조할 수 있다.
일반적으로 말하자면, 본 명세서에 요약된 SNP들에 기반을 두거나 이 SNP들을 고려함으로써 개발된 이러한 프로브, 수단 또는 시약은 예를 들면, 유전자 또는 유전자의 부분, RNA 유전자 생성물 또는 RNA 유전자 생성물의 부분, 또는 다른 유전자 생성물 또는 이의 부분에 특이적으로 결합할 수 있거나, 이들을 특이적으로 검출할 수 있거나, 확인할 수 있거나, 특징규명할 수 있거나 정량할 수 있다.
일반적으로 말하자면, 이러한 프로브, 수단 또는 시약은 예를 들면, 게놈 수준 또는 전사 수준에서 다형성을 검출하기 위한 것일 수 있다.
일반적으로 말하자면, 이러한 프로브, 수단 또는 시약은 유전자 또는 유전자 생성물(예컨대, RNA)을 검출할 수 있는 항체 또는 다른 종류의 분자 또는 화학 물질일 수도 있다.
보다 구체적으로, 프로브, 수단 및 시약은 하기 물질들을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다:
1. 단리된, 정제된, 합성 또는 재조합 형태의 16S rRNA, 16S rDNA, 18S rRNA 또는 18S rDNA, 또는 관심 있는 SNP를 함유하는 단편을 포함하는 이들의 단편 - 단일 가닥 또는 이중 가닥.
2. 비-천연 생성 폴리뉴클레오타이드, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 또는 cDNA 형태의 16S rRNA, 16S rDNA, 18S rRNA 또는 18S rDNA, 또는 관심 있는 SNP를 함유하는 단편을 포함하는 이들의 단편 - 단일 가닥 또는 이중 가닥.
3. 상기 1 또는 2의 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 재조합 세포 또는 생물학적 샘플.
프로브, 수단 또는 시약은 상기 유전자 또는 유전자 생성물(RNA 또는 폴리펩타이드)을 검출할 수 있는 항체 또는 다른 종류의 분자 또는 화학 물질일 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
적어도 하나의 프로브, 수단 또는 시약은 임의의 수 또는 조합의 프로브, 수단 또는 시약일 수 있고, 상기 수 및 조합은 달성하고자 하는 원하는 결과에 의해 좌우될 것이다 - 예를 들면, 게놈 수준(유전형분석) 또는 RNA 수준에서 다형성의 검출.
본 발명에 따라 16S rRNA 유전자 또는 18S rRNA 유전자에서 하나 이상의 SNP를 검출하기 위해 요구된 모든 필수 물질들 및 시약들은 키트 내에 함께 조립될 수 있다. 상기 키트는 표지를 검출하기 위한 적절한 시약, 양성 대조군, 음성 대조군, 형광 염료, 세척 용액, 블롯팅 막, 마이크로타이터 플레이트, 희석 완충제 등도 임의적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 다형성을 확인하기 위한 핵산 기반 검출 키트는 하기 (i) 및 (ii) 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) (양성 대조군으로서 사용될 수 있는) 그람 양성 세포 및/또는 그람 음성 세포로부터의 핵산; 및 (ii) 의심되는 SNP 부위에서 또는 이 부위 주위에서 분석될 SNP 위치(들)를 함유하는 16S rRNA 유전자 또는 18S rRNA 유전자의 적어도 일부에 특이적으로 하이브리드화하는 프라이머 및/또는 프로브, 및 임의적으로 하나 이상의 다른 마커. 증폭을 위해 필요한 반응 혼합물을 제공하기 위해 다양한 중합효소들(이용된 핵산 증폭 기법에 따라 역전사효소, Taq, 시쿼나제(Sequenase)™ DNA 리가제 등 )을 포함하는, 핵산의 증폭에 적합한 효소도 포함될 수 있다. 이러한 키트는 일반적으로 각각의 프라이머 또는 프로브를 위한 별도의 용기뿐만 아니라 각각의 개별 시약 및 효소를 위한 별도의 용기도 적합한 수단 내에 포함할 것이다. 상기 키트는 본원에 기재된 어세이들 중 하나를 수행하기 위한 다양한 디바이스들 및 시약들; 및/또는 본원에서 정의된 SNP의 존재를 확인하기 위해 키트를 사용하는 것에 대한 인쇄된 설명서도 특징으로 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 일반적으로 기재된 방법들은 적어도 부분적으로 프로세싱 시스템, 예컨대, 적절히 프로그래밍된 컴퓨터 시스템에 의해 수행된다. 응용 소프트웨어를 실행하여 전술된 방법들이 수행될 수 있게 하는 마이크로프로세서를 가진 독립형 컴퓨터를 이용할 수 있다. 대안적으로, 상기 방법들은 적어도 부분적으로 분포된 구성의 부분으로서 작동하는 하나 이상의 프로세싱 시스템에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 프로세싱 시스템은 프로브와 핵산 분자의 하이브리드화를 검출함으로써 한 위치에서 SNP의 존재를 검출하는 데 이용될 수 있다. 프로세싱 시스템은 하나 이상의 SNP의 검출을 근거로 세균의 그람 상태 또는 정체성 또는 분류를 확인하는 데 이용될 수도 있다. 일부 예에서, 사용자에 의해 프로세싱 시스템에 입력된 명령어는 이 확인을 하는 데 있어서 프로세싱 시스템을 보조할 수 있다.
한 예에서, 프로세싱 시스템은 버스(bus)를 통해 상호연결된 적어도 하나의 마이크로프로세서, 메모리, 입력/출력 디바이스, 예컨대, 키보드 및/또는 디스플레이, 및 외부 인터페이스를 포함한다. 외부 인터페이스는 프로세싱 시스템을 주변 디바이스, 예컨대, 통신 네트워크, 데이터베이스 또는 저장 디바이스에 연결하는 데 이용될 수 있다. 마이크로프로세서는 SNP 검출 및/또는 미생물 확인 또는 분류 과정이 수행될 수 있을 뿐만 아니라 임의의 다른 요구된 과정, 예컨대, 컴퓨터 시스템과의 통신도 수행될 수 있도록 메모리에 저장된 응용 소프트웨어의 형태로 지시를 실행할 수 있다. 응용 소프트웨어는 하나 이상의 소프트웨어 모듈을 포함할 수 있고, 적합한 실행 환경, 예컨대, 작동 시스템 환경 등에서 실행될 수 있다.
4.1 16S rRNA 유전자 또는 18S rRNA 유전자에 대한 프라이머, 프로브, 키트 및 프로세싱 시스템
본 발명은 16S rRNA 유전자 또는 18S rRNA 유전자의 하나 이상의 위치에서 SNP를 확인하여, 샘플에서 세균들 또는 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하고/하거나 확인하기 위해 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있는 프로브 및 프라이머를 제공한다.
본 발명의 프라이머 및 프로브는 SNP 위치(들)를 함유하는 16S rRNA 유전자 또는 18S rRNA 유전자(또는 16S rRNA 분자 또는 이의 DNA 카피, 또는 18S rRNA 분자 또는 이의 DNA 카피)의 적어도 일부에 하이브리드화한다. 예를 들면, 상기 프라이머는 하나 이상의 SNP를 플랭킹하는 서열에 하이브리드화할 수 있고, 상기 프로브는 하나 이상의 SNP를 포함하는 서열에 하이브리드화할 수 있다. 16S rRNA 유전자 또는 18S rRNA 유전자의 공지된 서열을 기반으로 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 프라이머 및 프로브를 디자인하는 것은 숙련된 당업자의 기술 내에 있다.
서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및/또는 653에 상응하는 위치에서 세균 종의 16S rRNA 내의 SNP를 분석하는 본 발명의 방법에 유용한 프라이머 및 프로브의 비-한정적 예는 실시예 1에 기재된 프라이머 및 프로브를 포함한다.
예를 들면, 위치 273에서 SNP를 검출하기 위해, 예시적 정방향 프라이머는 CCTCTTGCCATCGGATGTG(서열번호 16)를 포함하고; 예시적 역방향 프라이머는 CCAGTGTGGCTGGTCATCCT(서열번호 17), CGATCCGAAAACCTTCTTCACT(서열번호 20), CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA(서열번호 22), TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT(서열번호 26), AACGCTCGGATCTTCCGTATTA(서열번호 27), CGCTCGCCACCTACGTATTAC(서열번호 28), CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG(서열번호 30), GGAATTCTACCCCCCTCTACGA(서열번호 34), 및 GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG(서열번호 35)를 포함한다.
위치 378에서 SNP를 검출하기 위해, 예시적 정방향 프라이머는 CCTCTTGCCATCGGATGTG(서열번호 16), CCTACGGGAGGCAGCAGTAG(서열번호 18), 및 GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT(서열번호 19)를 포함하고; 예시적 역방향 프라이머는 CGATCCGAAAACCTTCTTCACT(서열번호 20), CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA(서열번호 22), TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT(서열번호 26), AACGCTCGGATCTTCCGTATTA(서열번호 27), CGCTCGCCACCTACGTATTAC(서열번호 28), CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG(서열번호 30), GGAATTCTACCCCCCTCTACGA(서열번호 34), 및 GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG(서열번호 35)를 포함한다.
위치 412에서 SNP를 검출하기 위해, 예시적 정방향 프라이머는 CCTCTTGCCATCGGATGTG(서열번호 16), CCTACGGGAGGCAGCAGTAG(서열번호 18), GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT(서열번호 19), 및 AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA(서열번호 21)를 포함하고; 예시적 역방향 프라이머는 CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA(서열번호 22), TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT(서열번호 26), AACGCTCGGATCTTCCGTATTA(서열번호 27), CGCTCGCCACCTACGTATTAC(서열번호 28), CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG(서열번호 30), GGAATTCTACCCCCCTCTACGA(서열번호 34), 및 GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG(서열번호 35)를 포함한다.
위치 440에서 SNP를 검출하기 위해, 예시적 정방향 프라이머는 CCTCTTGCCATCGGATGTG(서열번호 16), CCTACGGGAGGCAGCAGTAG(서열번호 18), GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT(서열번호 19), AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA(서열번호 21), TGCCGCGTGAATGAAGAA(서열번호 23), GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA(서열번호 24), 및 TGATGAAGGTTTTCGGATCGT(서열번호 25)를 포함하고; 예시적 역방향 프라이머는 TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT(서열번호 26), AACGCTCGGATCTTCCGTATTA(서열번호 27), CGCTCGCCACCTACGTATTAC(서열번호 28), CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG(서열번호 30), GGAATTCTACCCCCCTCTACGA(서열번호 34), 및 GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG(서열번호 35)를 포함한다.
위치 488에서 SNP를 검출하기 위해, 예시적 정방향 프라이머는 CCTCTTGCCATCGGATGTG(서열번호 16), CCTACGGGAGGCAGCAGTAG(서열번호 18), GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT(서열번호 19), AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA(서열번호 21), TGCCGCGTGAATGAAGAA(서열번호 23), GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA(서열번호 24), TGATGAAGGTTTTCGGATCGT(서열번호 25), 및 GTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGT(서열번호 29)를 포함하고; 예시적 역방향 프라이머는 CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG(서열번호 30), GGAATTCTACCCCCCTCTACGA(서열번호 34) 및 GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG(서열번호 35)를 포함한다.
위치 647 및/또는 653에서 SNP를 검출하기 위해, 예시적 정방향 프라이머는 CCTCTTGCCATCGGATGTG(서열번호 16), CCTACGGGAGGCAGCAGTAG(서열번호 18), GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT(서열번호 19), AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA(서열번호 21), TGCCGCGTGAATGAAGAA(서열번호 23), GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA(서열번호 24), TGATGAAGGTTTTCGGATCGT(서열번호 25), GTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGT(서열번호 29), GCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAA(서열번호 31), GGTCTGTCAAGTCGGATGTGAA(서열번호 32), 및 TCAACCTGGGAACTCATTCGA(서열번호 33)를 포함하고; 예시적 역방향 프라이머는 GGAATTCTACCCCCCTCTACGA(서열번호 34), 및 GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG(서열번호 35)를 포함한다.
유사하게, 서열번호 43으로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 746, 764, 771 또는 785(또는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 737, 755, 762 또는 776)에 상응하는 위치에서 세균 종의 16S rRNA 유전자 또는 16S rRNA 내의 SNP를 분석하는 본 발명의 방법에 유용한 프라이머 및 프로브의 비-한정적 예는 표 8에 기재된 프라이머 및 프로브를 포함한다.
유사하게, 서열번호 37로 기재된 18S rRNA 유전자의 위치 343, 371, 388, 416 및 467에서 세균 종의 18S rRNA 유전자 또는 18S rRNA 내의 SNP를 분석하는 본 발명의 방법에 유용한 프라이머 및 프로브의 비-한정적 예는 표 9에 기재된 프라이머 및 프로브를 포함한다.
5. 본 발명의 방법의 적용
본 발명의 방법은 샘플, 예컨대, 대상체로부터의 샘플 또는 환경 샘플, 예컨대, 토양 또는 물 샘플, 또는 장치 또는 기구(예를 들면, 의료 또는 수술 기구)의 표면 또는 작업 표면으로부터 채취된 샘플에서 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 분류하고/하거나 확인하는 데 유용하다. 그 후, 이러한 분류 또는 확인은 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균을 제거하거나, 박멸하거나 이들의 수를 감소시키기 위한 치료의 과정을 확인하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법들 중 임의의 둘 이상의 방법들을 조합할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법을 이용하여 샘플로부터의 핵산을 16S rRNA 유전자 내의 SNP의 존재에 대해 분석할 수 있다. 이것은 그람 양성 세균 또는 그람 음성 세균이 샘플에 존재하는지를 확인하도록 수행될 수 있다. 세균을 더 분류할 수 있거나, 세균의 정체성도 확인할 수 있거나 몇몇 가능성 중 하나로 범위를 좁힐 수 있다. 예를 들면, 상기 개시로부터 자명할 바와 같이, 샘플에서 세균을 분류하거나 심지어 확인하기 위해, 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653에 상응하는 위치의 SNP를 평가할 수 있다.
임상의는 종종 진료실, 응급실, 일반 병동 및 중환자실에서 감염 또는 의심된 감염을 가진 대상체를 담당한다. 이러한 환자는 종종 비정상적인 체온, 증가된 심박수 및 호흡수, 및 비정상적인 백혈구 세포 총수라는 비-진단 임상적 징후를 가진다. 임상의는 환자가 감염을 갖는지 아니면 갖지 않는지, 감염의 중증도, 환자가 (이미 입원하지 않은 경우) 입원해야 하는지, 감염의 공급원, 항생제를 사용해야 하는지, 그리고 항생제를 사용해야 한다면, 항생제의 종류, 경로 및 용량을 결정해야 한다. 환자 내의 감염의 존재는 가장 전형적으로 환자로부터 샘플을 채취하고 유기체를 배양 브로쓰에서 생장시킴으로써 평가된다. 일단 유기체가 생장되면, 이를 그람 염색하고 확인할 수 있다. 그러나, 많은 감염된 환자들(>50)에서, 유기체를 배양하는 것은 가능하지 않다. 확인된 유기체가 없는 경우, 임상의는 임상적 판단, 및 종종 조합되는 광범위 항생제들의 사용에 의존해야 한다. 병원성 유기체의 정체성 또는 민감성에 대한 지식이 없는 경우, 광범위 항생제의 무차별적 사용은 항생제 내성의 발생, 항생제의 남용, 및 잠재적으로 환자의 독성 부작용을 초래한다. 혈액 배양은 채취된 혈액 샘플이 살아있는 유기체를 함유할 때에만 민감한 방법(1 내지 100 cfu/㎖)이고, 언제나 혈액 샘플이 살아있는 유기체를 함유하는 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 방법은 대상체가 감염을 갖는지, 그리고 감염을 가진다면, 감염을 야기하는 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균의 분류에 기반을 둔 적절한 치료 과정을 확인하는 데 있어서 임상의를 보조하는 데 특히 유용하다.
나아가, 본 발명의 방법은 대상체로부터 전혈을 채취한 시간 이내에 그람 양성 유기체와 그람 음성 유기체의 식별을 용이하게 한다. 본 발명의 방법은 결과가 수일보다 오히려 수 시간 이내에 임상의에 의해 이용될 수 있도록 시간 효율적 방식으로 수행될 수도 있다. 이러한 특성은 임상의가 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균의 존재를 민감하게 검출할 수 있게 하고 정보를 근거로 치료에 대한 결정(예컨대, 세균의 그람 상태, 또는 추가 분류 또는 확인에 특이적인 항생제의 사용)을 할 수 있게 한다. 이 개선은 불필요하게 입원한 환자의 감소된 수, 세균, 효모 유기체 및 사상 진균의 민감한 검출, 존재량(및 다른 요인)에 대해 평가된 감염의 중증도, 광범위 항생제/의약의 감소된 사용, 광범위 항생제에 대한 감소된 환자 시간, 항생제/의약으로부터의 감소된 독성, 의약에 대한 내성(특히 항생제 내성)의 감소된 발생이라는 결과를 가져올 수 있다.
본 발명은 대상체에서의 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염의 진단 및 양성 진단 후 감염의 관리까지 확장된다. 16S rRNA 또는 18S rRNA 내에서 하나 이상의 SNP를 분석하는, 본원에 기재된 방법은 대상체가 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균 감염을 갖는지를 확인하고/하거나, 샘플에서 세균, 효모 유기체 또는 사상 진균의 군 또는 종을 확인하는 데 이용될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 세균을 그람 양성 또는 그람 음성으로서 분류하는 데에도 이용될 수 있다.
5.1 관리 및 요법
본 발명의 방법의 결과를 근거로, 대상체를 적절히 관리할 수 있고 요구된 경우 요법을 투여할 수 있다. 예를 들면, 세균 감염의 관리는 예를 들면, 치료제, 예컨대, 치료 유효 과정의 항생제의 투여를 포함할 수 있다.
전형적으로, 치료제는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 그의 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 약학(또는 대상체가 비-인간 대상체인 경우 수의학) 조성물로 투여될 것이다. 대상체에게 투여되는 활성 화합물의 용량은 시간의 경과에 따라 대상체에서 유리한 반응, 예컨대, 감염의 증상의 감소 또는 경감, 및/또는 대상체로부터의 세균의 감소 또는 제거를 달성하기에 충분해야 한다. 투여되는 약학적 활성 화합물(들)의 양은 대상체의 연령, 성별, 체중 및 일반적인 건강 상태를 포함하는, 치료되는 대상체에 의해 좌우될 수 있다. 이와 관련하여, 투여를 위한 활성 화합물(들)의 정확한 양은 의사의 판단에 의해 좌우될 것이다. 세균 감염의 치료 또는 예방에 있어서 투여되는 활성 화합물(들)의 유효량을 결정하는 데 있어서, 의사는 감염의 중증도, 및 염증, 혈압 이상, 빈맥, 빈호흡, 발열, 오한, 구토, 설사, 피부 발진, 두통, 착란, 근육통 및 발작을 포함하는, 감염과 관련된 임의의 증상의 중증도를 평가할 수 있다. 어떠한 경우에서든, 당분야에서 숙련된 자는 과도한 실험 없이 치료제의 적합한 용량 및 적합한 치료 투약법을 용이하게 결정할 수 있다.
치료제는 주요 장기에의 산소 공급을 증가시키고/시키거나, 주요 장기에의 혈류를 증가시키고/시키거나 염증 반응을 감소시키기 위해 보조(완화) 요법과 함께 투여될 수 있다. 이러한 보조 요법의 예시적 예로는 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 정맥내 식염수 및 산소가 있다.
본 명세서 전체에서 '한 실시양태' 또는 '실시양태'의 언급은 실시양태와 관련하여 기재된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시양태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐 다양한 곳에서 어구 '한 실시양태에서' 또는 '실시양태에서'의 등장은 반드시 모두 동일한 실시양태의 언급이 아니다. 나아가, 특정 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 조합으로 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
규정에 따라, 본 발명은 구조적 또는 체계적 특징에 다소 특이적인 용어로 기재되어 있다. 본원에 기재된 수단이 본 발명을 실시하는 바람직한 형태를 포함하기 때문에 본 발명은 제시되거나 기재된 특정 특징으로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 당분야에서 숙련된 자에 의해 적절히 해석되는 첨부된 청구범위(존재하는 경우)의 적절한 범위 내에서 그의 형태들 또는 변형들 중 임의의 형태 또는 변형으로 청구된다.
본원에서 인용된 모든 특허, 특허출원 및 공개문헌의 개시는 전체로서 본원에 참고로 도입된다.
본 발명이 용이하게 이해될 수 있고 실시될 수 있도록, 구체적인 바람직한 실시양태가 지금부터 하기 비-한정적 실시예에 의해 기재될 것이다.
실시예
실시예 1
이 실험의 목적은 본 발명의 16S rRNA SNP-HRM 어세이를 이용하여 패혈증을 가진 것으로 진단된 환자로부터 빈번히 단리되는 가장 우세한 세균 종들 중 15종의 세균 종들을 식별하는 것이었다.
실험 절차
종합하건대, 하기 15종의 세균 종들을 시험하였다: 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 애로게네스; 엔테로박터 클로아카; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 세라티아 마르세센스; 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스.
상기 세균 종들을 37℃에서 하룻밤 동안 뇌 심장 주입(Brain Heart Infusion) 브로쓰에서 배양한 후, QIAgen DNeasy 혈액 및 조직 키트(퀴아젠(Qiagen), 호주 소재)를 사용하여 각각의 단리물로부터 게놈 DNA를 추출하였다.
다음과 같이 표기된 7종의 SNP들을 포괄하는 영역을 증폭하도록 16S rDNA-SNP 프라이머(서열번호 16 내지 35, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)에 의해 제조됨, 호주 소재)를 디자인하였다: 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 SNP273, SNP378, SNP412, SNP440, SNP488, SNP647 및 SNP653. PCR 생성물 크기는 79 bp 내지 96 bp이었다.
실시간 PCR에 이은 HRM 분석을 이용하여 15종의 세균 종들을 식별하였다. 실시간 PCR HRM 과정은 다음과 같았다: 1 ㎕의 추출된 DNA(1 내지 3 ng)를, 10 ㎕의 2X SYBR 그린 PCR 마스터믹스(인비트로겐, 호주 소재) 및 8 pmol의 각각의 프라이머를 함유하는 19 ㎕의 반응 마스터믹스에 첨가하였다. 이 반응들에 대한 온도 순환은 다음과 같았다: 2분 동안 50℃; 2분 동안 95℃; 이어서 15초 동안 95℃, 20초 동안 52℃ 및 35초 동안 72℃의 40 주기; 2분 동안 72℃에서 유지; 20초 동안 50℃에서 유지, HRM: 0.05℃씩 65℃부터 95℃까지 상승(로터-진(Rotor-Gene) 6000, 퀴아젠, 호주 소재).
로터-진 6000 소프트웨어(버전 1.7.34 또는 1.7.87)를 이용하여 다수의 방식들로 HRM 데이터를 분석하였다. 표준화된 미처리 용융 곡선은 감소하는 형광 대 증가하는 온도, 및 사용자-정의된 곡선을 기준(즉, x-축)으로서 디스플레이하는 차이 곡선을 보여주고, 다른 표준화된 곡선들을 그 기준과 비교하여 보여준다. 차이 그래프를 이용하여 용융 곡선을 "동일한" 또는 "상이한" 곡선으로서 판정하기 위한 기준은 본 발명자 및 그의 동료에 의해 이미 개발되었고 공개되었다(예를 들면, 문헌(Stephens, A.J., et al. 2008; Merchant-Patel, S., et al. 2010) 참조).
HRM 곡선 도표가 샘플들을 식별할 수 있는 두 가지 방식이 있다. 용융 곡선의 모양은 곡선의 모양의 세부사항을 표시하고, 곡선 변동은 다른 곡선들로부터의 곡선의 열(온도) 오프셋을 표시한다.
소프트웨어는 앞에서 일반적으로 기재된 바와 같이 표준화된 용융 곡선 또는 차이 곡선으로서 사용하는 HRM 융용 곡선 분석을 허용한다. 표준화된 곡선 분석은 모든 HRM 곡선들이 해석 및 분석을 돕기 위해 동일한 출발 및 종결 형광 신호 수준과 비교될 수 있게 한다. 차이 곡선 분석은 각각의 샘플과 소정의 대조군의 용융 곡선들 사이의 차이를 디스플레이한다.
이 실험에서, 모양 및 변동 방식 둘 다를 이용하여 시험된 각각의 세균 종에 대한 HRM 곡선을 식별하였다. 각각의 세균 종에 대한 용융 온도의 변동을 확인하기 위해, 0.2℃의 용융 온도 차이를 각각의 세균 종의 용융 곡선들 사이의 유의미한 차이로서 간주하였다.
세균 종들 사이의 모양 차이를 확인하기 위해, 차이 곡선 분석을 이용하였다. 5 표준화된 형광 유닛 초과의 진폭 차이는 상이한 세균 종 용융 곡선들이 비교대상 종과 상이하다는 것을 시사한다. 따라서, 곡선의 모양의 이 차이는 각각의 세균 종의 DNA 서열의 차이를 표시한다.
결과
도 2 내지 11은 이 실시예에서 시험된 15종의 세균 종들을 식별하는 데 사용된 표준화된 용융 곡선 도표 및 차이 용융 곡선 도표를 보여준다.
15종의 세균 종들 각각은 로터-진 6000 소프트웨어(버전 1.7.34 또는 1.7.87)의 HRM 분석 설정에서 종 특이적 유전형으로 표기되었다. 세균 종 차이 곡선들의 비교를 위해, 에스케리키아 콜라이를 "보정자" 또는 "기준물"(도 3에 제시된 도표의 Y-축에서 "0"으로서 표시됨)로서 사용하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 14종의 다른 세균 종들은 모두 에스케리키아 콜라이의 "0" 선과 상이한 곡선을 보였다. 종 식별의 또 다른 예는 도 5에 제시되어 있고, 이때 스타필로코쿠스 아우레우스는 (Y-축의 "0" 위치에서) "보정자" 또는 "기준물"로서 선택되고, 표시된 바와 같이 스타필로코쿠스 에피데르미디스는 완전한 별개의 곡선을 가진다.
소변 및 혈장 중의 세균에 대한 용융 곡선 특이성은 표 11에 제공되어 있다.
논의
이 실시예는 생명을 위협하는 질환, 예컨대, 패혈증을 야기하는 것으로 알려진 15종의 상이한 세균 종들을 식별하는 데 있어서 단지 7종의 고도 식별 SNP들의 적용의 유용성을 입증한다. 결과는 본 발명의 방법이 DNA 진단 어세이를 위한 중요한 요건인 높은 특이성 및 신속성을 가진다는 것도 시사한다. 이 방법은 고도 식별 SNP들을 포괄하는 PCR 생성물의 DNA 용융 곡선을 근거로 2개의 단리물들이 동일한지 아니면 상이한지를 정확히 확인한다. 이 유전적 표적들의 조사는 이 방법이 특히 최신 기술, 예컨대, "랩-온-칩(lab-on-chip)" 디바이스 및 전용 전체 자동화 실시간 PCR 기계에 용이하게 적용될 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명은 방법은 마이크로플루이딕스의 신속히 진보하는 혁신과 조합될 때 "현장 진료(point-of-care)" 진단에 적합한 디바이스로 전달되기에 적합하다.
실시예 2
본 발명의 유용성을 입증하기 위해, 2백 개의 혈액 배양 양성 환자 샘플들을 표준 임상 미생물학 및 본 발명의 방법 둘 다로 평가하였다.
세균 종 확인을 위해 BacTAlert에 이은 MALDI 바이오타이퍼(biotyper) 방법을 이용하는 실험실에서 관용적인 혈액 배양 절차로 표준 임상 미생물학 시험을 수행하였다. 이것은 BacTAlert 혈액 배양 병을, 5일 내지 7일 동안 항온처리되는 자동화 연속 모니터링 항온처리 내로 도입하는 단계를 포함하였다. 일단 상기 혈액 배양 병이 양성(최소 12시간 항온처리)으로서 표시되면, 상기 병을 BacTAlert 기구로부터 제거하고, 생장 배지의 분취액을 회수하고 세균 배양 아가 플레이트에서 하위배양한다. 상기 아가 플레이트를 적어도 4시간 동안, 또는 가시적인 생장이 보일 때까지 37℃에서 항온처리한다. 그 후, 단일 세균 콜로니를 표적 플레이트 위에 놓고 매트릭스 용액을 첨가한다. 상기 플레이트를 바이오타이퍼 기구 내에 삽입하고 MALDI-TOF 스펙트럼을 소프트웨어로 생성한다. 상기 스펙트럼을 기준 라이브러리에 일치시켜 세균 확인을 제공한다. 이 과정을 위한 총 시간은 약 16시간 내지 18시간이다. 표준 임상 미생물학 시험은 패쏠로지 퀸즈랜드(Pathology Queensland)에 의해 수행되었다.
본 발명에 따라 이용된 방법은 BacTAlert 혈액 배양 기계에서 5일 동안 항온처리한 후 100개의 혈액 배양 음성 샘플들로부터 혈액 배양 액체(1 ㎖)를 채취하고 추출될 때까지 4℃에서 저장하는 것이었다. 혈액 배양 액체(1 ㎖)는 패쏠로지 퀸즈랜드의 진단 미생물학 부서에서 직원에 의해 200개의 혈액 배양 양성 샘플로부터도 채취되었고 DNA가 추출될 때까지 4℃에서 저장되었다. 1 ㎖의 샘플로부터의 숙주 DNA 제거, 병원체 농축 및 DNA 추출을 가능하게 하는 몰리시스(MolYsis)™ 완전 5 키트(몰자임 라이프 사이언스(Molzym Life Science), 독일 소재)를 사용하여 모든 샘플들(혈액 배양 음성 및 혈액 배양 양성)로부터 미생물 DNA를 단리하였다.
다음과 같은 실시간 PCR 포맷을 이용하여 모든 300개의 DNA 추출물을 시험하였다: 1 ㎕의 추출된 DNA(1 내지 3 ng)를, 10 ㎕의 2X SYBR 그린 PCR 마스터믹스(라이프 테크놀로지스, 호주 소재) 및 8 pmol의 각각의 프라이머를 함유하는 19 ㎕의 반응 마스터믹스에 첨가하였다. 이 반응들에 대한 온도 순환은 다음과 같았다: 2분 동안 50℃; 2분 동안 95℃; 이어서 15초 동안 95℃, 20초 동안 52℃ 및 35초 동안 72℃의 40 주기; 2분 동안 72℃에서 유지; 20초 동안 50℃에서 유지; HRM: 0.05℃씩 65℃부터 95℃까지 상승(로터진큐(RotorGeneQ), 퀴아젠, 호주 소재). 관련 대조군(주형 부재(NTC)), 및 시험된 각각의 세균 종에 대한 세균 기준 DNA로 이루어진 양성 대조군을 포함하는 모든 샘플들을 이중으로 실시하였다. 결과를 얻는 데 소요된 시간은 ±3.5시간으로서 기록되었다.
결과를 표로 작성되었고 연구의 종결 시 패쏠로지 퀸즈랜드로부터 수득된 혈액 배양 미생물학 결과와 상관관계를 가졌다.
결과
시험의 결과는 표 12에 제공되어 있다.
유리하게는, 본 발명의 방법은 임상 미생물학 결과와 비교될 때 99% 특이성을 수득할 수 있었다(그러나, 임상 미생물학과 본 발명의 방법이 상이한 결과를 수득한 2개의 샘플들의 경우 어느 방법이 부정확한 결과를 생성하였는지는 분명하지 않다). 본 발명의 방법은 환자 샘플을 최소한으로 취급하면서 약 3.5시간 이내에 결과를 수득할 수 있었다. 대조적으로, 임상 미생물학 결과는 환자 샘플의 더 상당한 취급을 요구하였고 수득하기 위해 약 16시간 내지 18시간이 소요되었다.
참고문헌
Anderson & Borreson, 1995, Diagnostic Molecular Pathology, 4: 203-211.
Andersson, P., et al., 2009, Antimicrob . Agents Chemother . 53:2679-2683.
Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc. 1994-1998.
Bullock, G. R. et al., 1985, Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, Fla. Vol. 1 (1982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985).
Chard, T., 1986, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986)
Chee, et al., 1996, Science 274: 610-613.
Chumanov, G. "Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) for Discovering and Scoring Single Based Differences in DNA" Proc. Volume SPIE, 3608 (1999).
Cotton, et al., 1988, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 85:4397.
Cronin, et al., 1996, Human Mut. 7: 244-255.
De Risi et al, 1996, Nat. Genet. 14: 457-460.
DeRisi et al., 1997, Science 270:680-686.
Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395.
Drmanac and Drmanac, 1999, Methods Enzymol. 303: 165-178
Drmanac et al., 1993, Science 260: 1649-1652.
Drmanac et al., 1998, Nature Biotech. 16: 54-58.
Gibbs et al., 1989, Nucleic Acids Research, 17: 2347.
Gibbs, R. A. and Caskey, T., 1987, Science, 236:303-305.
Ginot, 1997, Human Mutation 10:1-10.
Hacia et al., 1996, Nat. Genet. 14: 441-447.
Jobs et al., 2003, Genome Res 13: 916-924.
Karlowsky, J.A., et al. (2004) Ann Clin Microbiol Antimicrob . 10;3:7.
Kim S. & Misra A. 2007, Ann Rev Biomed Eng. 9:289-320.
Kneipp, K, 1997, Physical Review Letters, 78(9):1667-1670.
Komher, J. S. et al., 1989, Nucl . Acids. Res. 17: 7779-7784.
Kumar, D. et al., 2006, Genet. Mol . Biol, 29(2):287-289.
Kuppuswamy, M. N. et al., 1991 Proc . Natl . Acad . Sci . ( U.S.A .) 88:1143-1147.
Levy et al., 2003, Critical Care Medicine, 31:1250-1256.
Liu et al, 1996, J. Am. Chem . Soc . 118: 1587-1594.
Lockhart et al., 1996, Nature Biotechnol. 14:1675-1680.
Lu, A. L. and Hsu, I. C., 1992, Genomics, 14(2):249-255.
Lyamichev, V. et al., 1999, Nat Biotechnol , 17: 292-296.
Maxam, A. M., et al., 1977, Proc . Natl . Acad . Sci . ( U.S.A .) 74:560.
Merchant-Patel, S., et al., 2008, Int . J. Food Microbiol ., 128:304-308.
Merchant-Patel, S., Blackall, P.J., Templeton, J., Price, E.P., Tong, S.Y.C., Huygens, F., and Giffard, P.M., 2010, Applied and Environmental Microbiology., 76(2):493-499.
Meyers, R. M., et al., 1985 Science, 230:1242-1246.
Milosavljevic et al., 1996, Genomics , 37: 77-86.
Modrich, 1991, Ann. Rev. Genet., 25: 229-253.
Nagamine, C. M. et al., 1989, Am. J. Hum. Genet, 45:337-339.
Newton et al., 1989, Nucl . Acids Res. 17: 2503-2516.
Novack et al., 1986, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 83:586.
Nyren, P., et al., 1993 Anal. Biochem. 208: 171-175.
Orita, M. et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:2766.
Prezant, T. R., et al., 1992 Hum. Mutat . 1: 159-164.
Price, E.P., et al., 2007, Appln . Environ. Microbiol , 72:7793-7803.
Prince, J. A., et al., 2001 Genome Res, 11(1):152-162.
Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties", Methods in Molecular Biology Series, Volume 20, Ed. Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 0-89603-247-7, 1993.
Ramsay, 1998, Nature Biotech. 16: 40-44.
Reinhart et al., 2012, Clinical Microbiology Reviews 25(4): 609-634.
Saleeba, J. A., et al., 1992 Huma . Mutat, 1:63-69
Salimullah, et al., 2005, Cellular and Mol . Biol . Letts, 10: 237-245
Sapolsky and Lishutz, 1996, Genomics 33: 445-456
Schena et al., 1995, Science 270: 467.
Shalon, et al., 1996, Genome Res. 6: 639.
Sheffield et al., 1989, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86: 232-236
Shenk et al., 1975, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 72:989.
Shoemaker et al., 1996, Nat. Genet. 14: 450-456.
Smith-Sorenson et al., 1993, Human Mutation 2:274-285.
Sokolov, B. P., 1990, Nucl . Acids Res. 18: 3671.
Sooknanan et al., 1994, Biotechniques 17:1077-1080.
Stephens, A.J., Inman-Bamber, J., Giffard, P.M., and uygens, F., 2008, Clinical Chemistry. 54(2):432-436.
Syvanen, A. C, et al., 1990 Genomics, 8: 684-692.
Syvanen, A. C, et al., 1993, Amer . J. Hum. Genet. 52: 46-59.
Syvanen, A. C., 2001, Nat. Rev. Genet. 2, 930-942.
Thelwell et al., 2000 Nucleic Acid Res. 28(19): 3752-3761.
Tijssen, P., 1985, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands.
Tyagi et al., 1996, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:5395-5400.
Tyagi, S and Kramer, F. R., 1996, Nat. Biotechnol , 14: 303-308
Ugozzoli, L., et al., 1992, GATA, 9: 107-112.
Wartell et al., 1990 Nucl . Acids Res. 18:2699-2705
Weisburg WG, et al., (1991) J Bacteriol. 173 (2): 697-703.
Wodicka et al, 1997, Nat. Biotech. 15: 1-15.
Xiao and Kwok, 2003, Genome Research, 13(5): 932-939.
Yershov et al., 1996, Genetics 93: 4913-4918.
<110> Microbio Pty Ltd
<120> Biomarkers and Uses Thereof
<130> 2019-FPA-9756
<150> AU2017901846
<151> 2017-05-17
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1542
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
aaattgaaga gtttgatcat ggctcagatt gaacgctggc ggcaggccta acacatgcaa 60
gtcgaacggt aacaggaaga agcttgcttc tttgctgacg agtggcggac gggtgagtaa 120
tgtctgggaa actgcctgat ggagggggat aactactgga aacggtagct aataccgcat 180
aacgtcgcaa gaccaaagag ggggaccttc gggcctcttg ccatcggatg tgcccagatg 240
ggattagcta gtaggtgggg taacggctca cctaggcgac gatccctagc tggtctgaga 300
ggatgaccag ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg 360
ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc cgcgtgtatg aagaaggcct 420
tcgggttgta aagtactttc agcggggagg aagggagtaa agttaatacc tttgctcatt 480
gacgttaccc gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag 540
ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac gcaggcggtt tgttaagtca 600
gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcatctga tactggcaag cttgagtctc 660
gtagaggggg gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg gaggaatacc 720
ggtggcgaag gcggccccct ggacgaagac tgacgctcag gtgcgaaagc gtggggagca 780
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcgacttgg aggttgtgcc 840
cttgaggcgt ggcttccgga gctaacgcgt taagtcgacc gcctggggag tacggccgca 900
aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960
tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggtc ttgacatcca cagaactttc cagagatgga 1020
ttggtgcctt cgggaactgt gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgttgtga 1080
aatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatct tttgttgcca gcggtccggc 1140
cgggaactca aaggagactg ccagtgataa actggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1200
atcatggccc ttacgaccag ggctacacac gtgctacaat ggcgcataca aagagaagcg 1260
acctcgcgag agcaagcgga cctcataaag tgcgtcgtag tccggattgg agtctgcaac 1320
tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtggatca gaatgccacg gtgaatacgt 1380
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcaaa agaagtaggt 1440
agcttaacct tcgggagggc gcttaccact ttgtgattca tgactggggt gaagtcgtaa 1500
caaggtaacc gtaggggaac ctgcggttgg atcacctcct ta 1542
<210> 2
<211> 1555
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 2
ttttatggag agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca 60
agtcgagcga acggacgaga agcttgcttc tctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac 120
acgtggataa cctacctata agactgggat aacttcggga aaccggagct aataccggat 180
aatattttga accgcatggt tcaaaagtga aagacggtct tgctgtcact tatagatgga 240
tccgcgctgc attagctagt tggtaaggta acggcttacc aaggcaacga tgcatagccg 300
acctgagagg gtgatcggcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc 360
agcagtaggg aatcttccgc aatgggcgaa agcctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat 420
gaaggtcttc ggatcgtaaa actctgttat tagggaagaa catatgtgta agtaactgtg 480
cacatcttga cggtacctaa tcagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 540
atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgcgcgt aggcggtttt 600
ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtggaggg tcattggaaa ctggaaaact 660
tgagtgcaga agaggaaagt ggaattccat gtgtagcggt gaaatgcgca gagatatgga 720
ggaacaccag tggcgaaggc gactttctgg tctgtaactg acgctgatgt gcgaaagcgt 780
ggggatcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 840
ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt 900
acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggagcatg 960
tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaaatct tgacatcctt tgacaactct 1020
agagatagag ctttcccctt cgggggacaa agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1080
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttaag cttagttgcc 1140
atcattaagt tgggcactct aagttgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1200
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgatttg ggctacacac gtgctacaat ggacaataca 1260
aagggcagcg aaaccgtgag gtcaagcaaa tcccataaag ttgttctcag ttcggattgt 1320
agtctgcaac tcgactacat gaagctggaa tcgctagtaa tcgtagatca gcatgctacg 1380
gtgaatacgt tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1440
cgaagccggt ggagtaacct tttaggagct agccgtcgaa ggtgggacaa atgattgggg 1500
tgaagtcgta acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc tttct 1555
<210> 3
<211> 1554
<212> DNA
<213> Staphylococcus epidermidis
<400> 3
ttttatggag agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca 60
agtcgagcga acagacgagg agcttgcttc tctgacgtta gcggcggacg ggtgagtaac 120
acgtggataa cctacctata agactgggat aacttcggga aaccggagct aataccggat 180
aatatattga accgcatggt tcaatagtga aagacggttt tgctgtcact tatagatgga 240
tccgcgccgc attagctagt tggtaaggta acggcttacc aaggcaacga tgcgtagccg 300
acctgagagg gtgatcggcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc 360
agcagtaggg aatcttccgc aatgggcgaa agcctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat 420
gaaggtcttc ggatcgtaaa actctgttat tagggaagaa caaatgtgta agtaactatg 480
cacgtcttga cggtacctaa tcagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 540
atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgcgcgt aggcggtttt 600
ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtggaggg tcattggaaa ctggaaaact 660
tgagtgcaga agaggaaagt ggaattccat gtgtagcggt gaaatgcgca gagatatgga 720
ggaacaccag tggcgaaggc gactttctgg tctgtaactg acgctgatgt gcgaaagcgt 780
ggggatcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 840
ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt 900
acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggagcatg 960
tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaaatct tgacatcctc tgacccctct 1020
agagatagag ttttcccctt cgggggacag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1080
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttaag cttagttgcc 1140
atcattaagt tgggcactct aagttgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1200
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgatttg ggctacacac gtgctacaat ggacaataca 1260
aagggcagcg aaaccgcgag gtcaagcaaa tcccataaag ttgttctcag ttcggattgt 1320
agtctgcaac tcgactatat gaagctggaa tcgctagtaa tcgtagatca gcatgctacg 1380
gtgaatacgt tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1440
cgaagccggt ggagtaacca tttggagcta gccgtcgaag gtgggacaaa tgattggggt 1500
gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttct 1554
<210> 4
<211> 1514
<212> DNA
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 4
gtttgatcct ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtagaacgct 60
gaaggaggag cttgcttctc tggatgagtt gcgaacgggt gagtaacgcg taggtaacct 120
gcctggtagc gggggataac tattggaaac gatagctaat accgcataag agtggatgtt 180
gcatgacatt tgcttaaaag gtgcacttgc atcactacca gatggacctg cgttgtatta 240
gctagttggt ggggtaacgg ctcaccaagg cgacgataca tagccgacct gagagggtga 300
tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc 360
ttcggcaatg gacggaagtc tgaccgagca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggat 420
cgtaaagctc tgttgtaaga gaagaacgag tgtgagagtg gaaagttcac actgtgacgg 480
tatcttacca gaaagggacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtccc 540
gagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggttagata agtctgaagt 600
taaaggctgt ggcttaacca tagtaggctt tggaaactgt ttaacttgag tgcaagaggg 660
gagagtggaa ttccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaggaa caccggtggc 720
gaaagcggct ctctggcttg taactgacgc tgaggctcga aagcgtgggg agcaaacagg 780
attagatacc ctggtagtcc acgctgtaaa cgatgagtgc taggtgttag accctttccg 840
gggtttagtg ccgtagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt 900
gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 960
gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atccctctga ccgctctaga gatagagttt 1020
tccttcggga cagaggtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1080
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaacccc tattgttagt tgccatcatt cagttgggca 1140
ctctagcgag actgccggta ataaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg 1200
ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggctgg tacaacgagt cgcaagccgg 1260
tgacggcaag ctaatctctt aaagccagtc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct 1320
acatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg 1380
gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta 1440
accgtaagga gccagccgcc taaggtggga tagatgattg gggtgaagtc gtaacaaggt 1500
agccgtatcg gaag 1514
<210> 5
<211> 1501
<212> DNA
<213> Streptococcus agalactiae
<400> 5
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtagaac gctgaggttt ggtgtttaca 60
ctagactgat gagttgcgaa cgggtgagta acgcgtaggt aacctgcctc atagcggggg 120
ataactattg gaaacgatag ctaataccgc ataagagtaa ttaacacatg ttagttattt 180
aaaaggagca attgcttcac tgtgagatgg acctgcgttg tattagctag ttggtgaggt 240
aaaggctcac caaggcgacg atacatagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgg caatggacgg 360
aagtctgacc gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420
ttagagaaga acgttggtag gagtggaaaa tctaccaagt gacggtaact aaccagaaag 480
ggacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtcccgagcg ttgtccggat 540
ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ctttaagtct gaagttaaag gcagtggctt 600
aaccattgta cgctttggaa actggaggac ttgagtgcag aaggggagag tggaattcca 660
tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aggaacaccg gtggcgaaag cggctctctg 720
gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt 780
agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaggt gttaggccct ttccggggct tagtgccgca 840
gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat 900
tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 960
ttaccaggtc ttgacatcct tctgaccggc ctagagatag gctttctctt cggagcagaa 1020
gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1080
aacgagcgca acccctattg ttagttgcca tcattaagtt gggcactcta gcgagactgc 1140
cggtaataaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 1200
gctacacacg tgctacaatg gttggtacaa cgagtcgcaa gccggtgacg gcaagctaat 1260
ctcttaaagc caatctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat 1320
cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1380
cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttaggagcca 1440
gccgcctaag gtgggataga tgattggggt gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag 1500
g 1501
<210> 6
<211> 1543
<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 6
gagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtagaa 60
cgctgagaac tggtgcttgc accggttcaa ggagttgcga acgggtgagt aacgcgtagg 120
taacctacct catagcgggg gataactatt ggaaacgata gctaataccg cataagagag 180
actaacgcat gttagtaatt taaaaggggc aattgctcca ctatgagatg gacctgcgtt 240
gtattagcta gttggtgagg taaaggctca ccaaggcgac gatacatagc cgacctgaga 300
gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag 360
ggaatcttcg gcaatggggg caaccctgac cgagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggttt 420
tcggatcgta aagctctgtt gttagagaag aatgatggtg ggagtggaaa atccaccaag 480
tgacggtaac taaccagaaa gggacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540
ggtcccgagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tttttaagtc 600
tgaagttaaa ggcattggct caaccaatgt acgctttgga aactggagaa cttgagtgca 660
gaaggggaga gtggaattcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaggaacacc 720
ggtggcgaaa gcggctctct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc gtggggagca 780
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctagg tgttaggccc 840
tttccggggc ttagtgccgg agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc 900
aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960
ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc cgatgcccgc tctagagata 1020
gagttttact tcggtacatc ggtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080
agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccctatt gttagttgcc atcattaagt 1140
tgggcactct agcgagactg ccggtaataa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200
atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggttggtaca acgagtcgca 1260
agccggtgac ggcaagctaa tctcttaaag ccaatctcag ttcggattgt aggctgcaac 1320
tcgcctacat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt 1380
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440
gaggtaacct attaggagcc agccgcctaa ggtgggatag atgattgggg tgaagtcgta 1500
acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc ttt 1543
<210> 7
<211> 1522
<212> DNA
<213> Enterococcus faecalis
<400> 7
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac 60
gcttctttcc tcccgagtgc ttgcactcaa ttggaaagag gagtggcgga cgggtgagta 120
acacgtgggt aacctaccca tcagaggggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgc 180
ataacagttt atgccgcatg gcataagagt gaaaggcgct ttcgggtgtc gttgatggat 240
ggacccgcgg tgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcca cgatgcatag 300
ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 360
ggcagcagta gggaatcttc ggcaatggac gaaagtctga ccgagcaacg ccgcgtgagt 420
gaagaaggtt ttcggatcgt aaaactctgt tgttagagaa gaacaaggac gttagtaact 480
gaacgtcccc tgacggtatc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 540
gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt 600
ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggag 660
acttgagtgc agaagaggag agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat 720
ggaggaacac cagtggcgaa ggcggctctc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag 780
cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 840
gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgctg cagcaaacgc attaagcact ccgcctgggg 900
agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 960
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctttgaccac 1020
tctagagata gagctttccc ttcggggaca aagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1080
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tgttagttgc 1140
catcatttag ttgggcactc tagcgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1200
gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tgggaagtac 1260
aacgagtcgc tagaccgcga ggtcatgcaa atctcttaaa gcttctctca gttcggattg 1320
caggctgcaa ctcgcctgca tgaagccgga atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc 1380
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1440
ccgaagtcgg tgaggtaacc tttttggagc cagccgccta aggtgggata gatgattggg 1500
gtgaagtcgt aacaaggtag cc 1522
<210> 8
<211> 1551
<212> DNA
<213> Enterococcus faecium
<400> 8
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctatacatgc aagtcgaacg 60
cttctttttc caccggagct tgctccaccg gaaaaagagg agtggcgaac gggtgagtaa 120
cacgtgggta acctgcccat cagaaaggga taacacttgg aaacaggtgc taataccgta 180
taacaaatca aaaccgcatg gttttgattt gaaaggcgct ttcgggtgtc gctgatggat 240
ggacccgcgg tgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcca cgatgcatag 300
ccgcacctga gagggtgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctctacggga 360
ggcagcagta gggaatcttc ggcaatggac gaaagtctga ccgagcaacg ccgcgtgagt 420
gaagaaggtt ttcggatcgt aaaactctgt tgttagagaa gaacaaggat gagagtaact 480
gttcatccct tgacggtatc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 540
gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt 600
tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactgggaga 660
cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg 720
gaggaacacc agtggcgaag gcggctctct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc 780
gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag 840
tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 900
gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 960
tgtggtttaa ttcgaagcaa cacgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tttgaccact 1020
ctagagatag agcttcccct tcgggggcaa agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1080
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatt gttagttgcc 1140
atcattcagt tgggcactct agcaagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1200
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat gggaagtaca 1260
acgagttgcg aagtcgcgag gctaagctaa tctcttaaag cttctctcag ttcggattgc 1320
aggctgcaac tcgcctgcat gaagccggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg 1380
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc 1440
gaagtcggtg aggtaacctt ttggagccag ccgcctaagg tgggatagat gattggggtg 1500
aagtcgtaac aaggtagccg tatctgaagg tgcggctgga tcacctcctt t 1551
<210> 9
<211> 1542
<212> DNA
<213> Proteus mirabilis
<400> 9
aattgaagag tttgatcatg gctcagattg aacgctggcg gcaggcctaa cacatgcaag 60
tcgagcggta acaggagaaa gcttgctttc ttgctgacga gcggcggacg ggtgagtaat 120
gtatggggat ctgcccgata gagggggata actactggaa acggtggcta ataccgcata 180
atgtctacgg accaaagcag gggctcttcg gaccttgcac tatcggatga acccatatgg 240
gattagctag taggtggggt aaaggctcac ctaggcgacg atctctagct ggtctgagag 300
gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg 360
gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg cagccatgcc gcgtgtatga agaaggcctt 420
agggttgtaa agtactttca gcggggagga aggtgataag gttaataccc ttgtcaattg 480
acgttacccg cagaagaagc accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 540
gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcacg caggcggtca attaagtcag 600
atgtgaaagc cccgagctta acttgggaat tgcatctgaa actggttggc tagagtcttg 660
tagagggggg tagaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaataccg 720
gtggcgaagg cggccccctg gacaaagact gacgctcagg tgcgaaagcg tggggagcaa 780
acaggattag ataccctggt agtccacgct gtaaacgatg tcgatttaga ggttgtggtc 840
ttgaaccgtg gcttctggag ctaacgcgtt aaatcgaccg cctggggagt acggccgcaa 900
ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 960
cgatgcaacg cgaagaacct tacctactct tgacatccag cgaatccttt agagatagag 1020
gagtgccttc gggaacgctg agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgaa 1080
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcct ttgttgccag cacgtaatgg 1140
tgggaactca aaggagactg ccggtgataa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1200
atcatggccc ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat ggcagataca aagagaagcg 1260
acctcgcgag agcaagcgga actcataaag tctgtcgtag tccggattgg agtctgcaac 1320
tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtagatca gaatgctacg gtgaatacgt 1380
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcaaa agaagtaggt 1440
agcttaacct tcgggagggc gcttaccact ttgtgattca tgactggggt gaagtcgtaa 1500
caaggtaacc gtaggggaac ctgcggttgg atcacctcct ta 1542
<210> 10
<211> 1505
<212> DNA
<213> Serratia marcescens
<400> 10
gctcagattg aacgctggcg gcaggcttaa cacatgcaag tcgagcggta gcacagggga 60
gcttgctccc tgggtgacga gcggcggacg ggtgagtaat gtctgggaaa ctgcctgatg 120
gagggggata actactggaa acggtagcta ataccgcata acgtcgcaag accaaagagg 180
gggaccttcg ggcctcttgc catcagatgt gcccagatgg gattagctag taggtggggt 240
aatggctcac ctaggcgacg atccctagct ggtctgagag gatgaccagc cacactggaa 300
ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc 360
aagcctgatg cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggcctt cgggttgtaa agcactttca 420
gcgaggagga aggtggtgag cttaatacgt tcatcaattg acgttactcg cagaagaagc 480
accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt taatcggaat 540
tactgggcgt aaagcgcacg caggcggttt gttaagtcag atgtgaaatc cccgggctca 600
acctgggaac tgcatttgaa actggcaagc tagagtctcg tagagggggg tagaattcca 660
ggtgtagcgg tgaaatgcgt agagatctgg aggaataccg gtggcgaagg cgggcccctg 720
gacgaagact gacgctcagg tgccaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt 780
agtccacgct gtaaacgatg tcgatttgga ggttgtgccc ttgaggcgtg gcttccggag 840
ctaacgcgtt aaatcgaccg cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt 900
gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct 960
tacctactct tgacatccag agaactttcc agagatggat tggtgccttc gggaactctg 1020
agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgaa atgttgggtt aagtcccgca 1080
acgagcgcaa cccttatcct ttgttgccag cggttcggcc gggaactcaa aggagactgc 1140
cagtgataaa ctggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacgagtagg 1200
gctacacacg tgctacaatg gcatatacaa agagaagcga cctcgcgaga gcaagcggac 1260
ctcataaagt atgtcgtagt ccggattgga gtctgcaact cgactccatg aagtcggaat 1320
cgctagtaat cgtagatcag aatgctacgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1380
cccgtcacac catgggagtg ggttgcaaaa gaagtaggta gcttaacctt cgggagggcg 1440
cttaccactt tgtgattcat gactggggtg aagtcgtaac aaggtaaccg taggggaacc 1500
tgcgg 1505
<210> 11
<211> 1438
<212> DNA
<213> Enterobacter aerogenes
<220>
<221> misc_feature
<222> (1425)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 11
acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgagcggtag cacagagagc ttgctctcgg 60
gtgacgagcg gcggacgggt gagtaatgtc tgggaaactg cctgatggag ggggataact 120
actggaaacg gtagctaata ccgcataacg tcgcaagacc aaagtggggg accttcgggc 180
ctcatgccat cagatgtgcc cagatgggat tagctagtag gtggggtaat ggctcaccta 240
ggcgacgatc cctagctggt ctgagaggat gaccagccac actggaactg agacacggtc 300
cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag 360
ccatgccgcg tgtatgaaga aggccttcgg gttgtaaagt actttcagcg aggaggaagg 420
cgttaaggtt aataaccttg gcgattgacg ttactcgcag aagaagcacc ggctaactcc 480
gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa 540
gcgcacgcag gcggtctgtc aagtcggatg tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc 600
attcgaaact ggcaggctag agtcttgtag aggggggtag aattccaggt gtagcggtga 660
aatgcgtaga gatctggagg aataccggtg gcgaaggcgg ccccctggac aaagactgac 720
gctcaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780
aacgatgtcg acttggaggt tgtgcccttg aggcgtggct tccggagcta acgcgttaag 840
tcgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc 900
acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctactcttga 960
catccagaga acttagcaga gatgctttgg tgccttcggg aactctgaga caggtgctgc 1020
atggctgtcg tcagctcgtg ttgtgaaatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080
ttatcctttg ttgccagcgg tccggccggg aactcaaagg agactgccag tgataaactg 1140
gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac gagtagggct acacacgtgc 1200
tacaatggca tatacaaaga gaagcgacct cgcgagagca agcggacctc ataaagtatg 1260
tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc tagtaatcgt 1320
agatcagaat gctacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380
gggagtgggt tgcaaaagaa gtaggtagct taaccttcgg gaggncgctt taccactt 1438
<210> 12
<211> 1511
<212> DNA
<213> Enterobacter cloacae
<400> 12
tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgaacgg tagcacagag agcttgctct 60
cgggtgacga gtggcggacg ggtgagtaat gtctgggaaa ctgcctgatg gagggggata 120
actactggaa acggtagcta ataccgcata aygtcgcaag accaaagagg gggaccttcg 180
ggcctcttgc catcagatgt gcccagatgg gattagctag taggtggggt aacggctcac 240
ctaggcgacg atccctagct ggtctgagag gatgaccagc cacactggaa ctgagacacg 300
gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg 360
cagccatgcc gcgtgtatga agaaggcctt cgggttgtaa agtactttca gcggggagga 420
aggtgttgtg gttaataacc gcagcaattg acgttacccg cagaagaagc accggctaac 480
tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt 540
aaagcgcacg caggcggtct gtcaagtcgg atgtgaaatc cccgggctca acctgggaac 600
tgcattcgaa actggcaggc tggagtcttg tagagggggg tagaattcca ggtgtagcgg 660
tgaaatgcgt agagatctgg aggaataccg gtggcgaagg cggccccctg gacaaagact 720
gacgctcagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780
gtaaacgatg tcgatttgga ggttgtgccc ttgaggcgtg gcttccggag ctaacgcgtt 840
aaatcgaccg cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctggtct 960
tgacatccac agaactttcc agagatggat tggtgccttc gggaactgtg agacaggtgc 1020
tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgaa atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080
cccttatcct ttgttgccag cggtccggcc gggaactcaa aggagactgc cagtgataaa 1140
ctggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacgaccagg gctacacacg 1200
tgctacaatg gcgcatacaa agagaagcga cctcgcgaga gcaagcggac ctcataaagt 1260
gcgtcgtagt ccggattgga gtctgcaact cgactccatg aagtcggaat cgctagtaat 1320
cgtagatcag aatgctacgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380
catgggagtg ggttgcaaaa gaagtaggta gcttaacctt cgggagggcg cttaccactt 1440
tgtgattcat gactggggtg aagtcgtaac aaggtaaccg taggggaacc tgcggctgga 1500
tcacctcctt g 1511
<210> 13
<211> 1534
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 13
agagtttgat nntggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60
ggtagcacag agagcttgct ctcgggtgac gagcggcgga cgggtgagta atgtctggga 120
aactgcctga tggaggggga taactactgg aaacggtagc taataccgca taacgtcgca 180
agaccaaagt gggggacctt cgggcctcat gccatcagat gtgcccagat gggattagct 240
agtaggtggg gtaacggctc acctaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgacca 300
gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360
cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggcc ttcgggttgt 420
aaagcacttt cagcggggag gaaggcgatg aggttaataa cctcatcgat tgacgttacc 480
ctgcagaaga agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcaag 540
cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc acgcaggcgg tctgtcaagt cggatgtgaa 600
atccccgggc tcaacctggg aactgcattc gaaactggca ggctagagtc ttgtagaggg 660
gggtagaatt ccaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc tggaggaata ccggtggcga 720
aggcggcccc ctggacaaag actgacgctc aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgtcgattt ggaggttgtg cccttgaggc 840
gtggcttccg gagctaacgc gttaaatcga ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa 900
actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgca 960
acgcgaagaa ccttacctgg tcttgacatc cacagaactt tccagagatg gattggtgcc 1020
ttcgggaact gtgagacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgttgt gaaatgttgg 1080
gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat cctttgttgc cagcggttag gccgggaact 1140
caaaggagac tgccagtgat aaactggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc 1200
ccttacgacc agggctacac acgtgctaca atggcatata caaagagaag cgacctcgcg 1260
agagcaagcg gacctcataa agtatgtcgt agtccggatt ggagtctgca actcgactcc 1320
atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtagat cagaatgcta cggtgaatac gttcccgggc 1380
cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgca aaagaagtag gtagcttaac 1440
cttcgggagg gcgcttacca ctttgtgatt catgactggg gtgaagtcgt aacaaggtaa 1500
ccgtagggga acctgcggtt ggatcacctc cttt 1534
<210> 14
<211> 1536
<212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa
<400> 14
gaactgaaga gtttgatcat ggctcagatt gaacgctggc ggcaggccta acacatgcaa 60
gtcgagcgga tgaagggagc ttgctcctgg attcagcggc ggacgggtga gtaatgccta 120
ggaatctgcc tggtagtggg ggataacgtc cggaaacggg cgctaatacc gcatacgtcc 180
tgagggagaa agtgggggat cttcggacct cacgctatca gatgagccta ggtcggatta 240
gctagttggt ggggtaaagg cctaccaagg cgacgatccg taactggtct gagaggatga 300
tcagtcacac tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 360
ttggacaatg ggcgaaagcc tgatccagcc atgccgcgtg tgtgaagaag gtcttcggat 420
tgtaaagcac tttaagttgg gaggaagggc agtaagttaa taccttgctg ttttgacgtt 480
accaacagaa taagcaccgg ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac gaagggtgca 540
agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gcgcgtaggt ggttcagcaa gttggatgtg 600
aaatccccgg gctcaacctg ggaactgcat ccaaaactac tgagctagag tacggtagag 660
ggtggtggaa tttcctgtgt agcggtgaaa tgcgtagata taggaaggaa caccagtggc 720
gaaggcgacc acctggactg atactgacac tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 780
attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgtcgac tagccgttgg gatccttgag 840
atcttagtgg cgcagctaac gcgataagtc gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta 900
aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 960
caacgcgaag aaccttacct ggccttgaca tgctgagaac tttccagaga tggattggtg 1020
ccttcgggaa ctcagacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1080
gggttaagtc ccgtaacgag cgcaaccctt gtccttagtt accagcacct cgggtgggca 1140
ctctaaggag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg 1200
gcccttacgg ccagggctac acacgtgcta caatggtcgg tacaaagggt tgccaagccg 1260
cgaggtggag ctaatcccat aaaaccgatc gtagtccgga tcgcagtctg caactcgact 1320
gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtga atcagaatgt cacggtgaat acgttcccgg 1380
gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg ctccagaagt agctagtcta 1440
accgcaaggg ggacggttac cacggagtga ttcatgactg gggtgaagtc gtaacaaggt 1500
agccgtaggg gaacctgcgg ctggatcacc tcctta 1536
<210> 15
<211> 1497
<212> DNA
<213> Acinetobacter calcoaceticus
<400> 15
tagagtttga tcctggctca gattgaacgc tggcggcagg cttaacacat gcaagtcgag 60
cggggaaagg tagcttgcta ctggacctag cggcggacgg gtgagtaatg cttaggaatc 120
tgcctattag tgggggacaa cattccgaaa ggaatgctaa taccgcatac gtcctacggg 180
agaaagcagg ggaccttcgg gccttgcgct aatagatgag cctaagtcgg attagctagt 240
tggtggggta aaggcctacc aaggcgacga tctgtagcgg tctgagagga tgatccgcca 300
cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 360
atggggggaa ccctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttat ggttgtaaag 420
cactttaagc gaggaggagg ctactagtat taatactact ggatagtgga cgttactcgc 480
agaataagca ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg tgcgagcgtt 540
aatcggattt actgggcgta aagcgtgcgt aggcggccat ttaagtcaaa tgtgaaatcc 600
ccgagcttaa cttgggaatt gcattgcata ctggatggct agagtatggg agaggatggt 660
agaattccag gtgtagcggt gaaatgcgta gagatctgga ggaataccga tggcgaaggc 720
agccatctgg cctaatactg acgctgaggt acgaaagcat gggagcagaa caggattaga 780
taccctggta gtccatgccg taaacgatgt ttactagccg ttggggcctt tgaggcttta 840
gtggcgcagc taacgcgata agtagaccgc ctggggagta cggtcgcaag actaaaactc 900
aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc 960
gaagaacctt acctggcctt gacatactag aaactttcca gagatggatt ggtgccttcg 1020
ggaatttaga tacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080
agtcccgcaa cgagcgcaac ccttttcctt acttgccagc atttcggatg ggaactttaa 1140
ggatactgcc agtgacaaac tggaggaagg cggggacgac gtcaagtcat catggccctt 1200
acggccaggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaaa gggttgctac ctagcgatag 1260
gatgctaatc tcaaaaagcc gatcgtagtc cggattggag tctgcaactc gactccatga 1320
agtcggaatc gctagtaatc gcggatcaga atgcccggtg atacgttccc gggccttgta 1380
cacaccgccc gtcacaccat gggagtttgt tgcaccagaa gtaggtagtc taaccgcaag 1440
gaggacgctt accacggtgt ggccgatgac tggggtgaag tcgtaacaag gtaacca 1497
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 16
cctcttgcca tcggatgtg 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 17
ccagtgtggc tggtcatcct 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 18
cctacgggag gcagcagtag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 19
gggaggcagc agtagggaat 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 20
cgatccgaaa accttcttca ct 22
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 21
aagacggtct tgctgtcact tataga 26
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 22
ctatgcatcg ttgccttggt aa 22
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 23
tgccgcgtga atgaagaa 18
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 24
gcgtgaagga tgaaggctct a 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 25
tgatgaaggt tttcggatcg t 21
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 26
tgatgtacta ttaacacatc aaccttcct 29
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 27
aacgctcgga tcttccgtat ta 22
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 28
cgctcgccac ctacgtatta c 21
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 29
gttgtaagag aagaacgagt gtgagagt 28
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 30
cgtagttagc cgtccctttc tg 22
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 31
gcggtttgtt aagtcagatg tgaa 24
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 32
ggtctgtcaa gtcggatgtg aa 22
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 33
tcaacctggg aactcattcg a 21
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 34
ggaattctac ccccctctac ga 22
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 35
ggaattctac ccccctctac aag 23
<210> 36
<211> 1720
<212> DNA
<213> Aspergillus fumigatus
<400> 36
ggaccgggcc tgtctaggta taagcaattt atacggtgaa actgcgaatg gctcattaaa 60
tcagttatcg tttatttgat agtaccttac tacatggata cctgtggtaa ttctagagct 120
aatacatgct aaaaacctcg acttcggaag gggtgtattt attagataaa aaaccaatgc 180
ccttcggggc tccttggtga atcataataa cttaacgaat cgcatggcct tgcgccggcg 240
atggttcatt caaatttctg ccctatcaac tttcgatggt aggatagtgg cctaccatgg 300
tggcaacggg taacggggaa ttagggttcg attccggaga gggagcctga gaaacggcta 360
ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccgacacgg ggaggtagtg 420
acaataaata ctgatacggg gctcttttgg gtctcgtaat tggaatgagt acaatctaaa 480
tcccttaacg aggaacaatt ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc 540
tccaatagcg tatattaaag ttgttgcagt taaaaagctc gtagttgaac cttgggtctg 600
gctggccggt ccgcctcacc gcgagtactg gtccggctgg acctttcctt ctggggaacc 660
tcatggcctt cactggctgt ggggggaacc aggactttta ctgtgaaaaa attagagtgt 720
tcaaagcagg cctttgctcg aatacattag catggaataa tagaatagga cgtgcggttc 780
tattttgttg gtttctagga ccgccgtaat gattaatagg gatagtcggg ggcgtcagta 840
ttcagctgtc agaggtgaaa ttcttggatt tgctgaagac taactactgc gaaagcattc 900
gccaaggatg ttttcattaa tcaggaacga aagttagggg atcgaagacg atcagatacc 960
gtcgtagtct taaccataaa ctatgccgac tagggatcgg gcggtgtttc tatgatgacc 1020
cgctcggcac cttacgagaa atcaaagttt ttgggttctg gggggagtat ggtcgcaagg 1080
ctgaaactta aagaaattga cggaagggca ccacaaggcg tggagcctgc ggcttaattt 1140
gactcaacac ggggaaactc accaggtcca gacaaaataa ggattgacag attgagagct 1200
ctttcttgat cttttggatg gtggtgcatg gccgttctta gttggtggag tgatttgtct 1260
gcttaattgc gataacgaac gagacctcgg cccttaaata gcccggtccg catttgcggg 1320
ccgctggctt cttaggggga ctatcggctc aagccgatgg aagtgcgcgg caataacagg 1380
tctgtgatgc ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgacagg gccagcgagt 1440
acatcacctt ggccgagagg tctgggtaat cttgttaaac cctgtcgtgc tggggataga 1500
gcattgcaat tattgctctt caacgaggaa tgcctagtag gcacgagtca tcagctcgtg 1560
ccgattacgt ccctgccctt tgtacacacc gcccgtcgct actaccgatt gaatggctcg 1620
gtgaggcctt cggactggct caggggagtt ggcaacgact ccccagagcc ggaaagttgg 1680
tcaaacccgg tcattagagg aaagaaaaaa ttaaacacgg 1720
<210> 37
<211> 1632
<212> DNA
<213> Candida albicans
<220>
<221> misc_feature
<222> (1587)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 37
tcagttatcg tttatttgat agtaccttac tacttggata accgtggtaa ttctagagct 60
aatacatgct taaaatcccg actgtttgga agggatgtat ttattagata aaaaatcaat 120
gccttcgggc tctttgatga ttcataataa cttttcgaat cgcatggcct tgtgctggcg 180
atggttcatt caaatttctg ccctatcaac tttcgatggt aggatagtgg cctaccatgg 240
tttcaacggg taacggggaa taagggttcg attccggaga gggagcctga gaaacggcta 300
ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccgacacgg ggaggtagtg 360
acaataaata acgatacagg gcccttttgg gtcttgtaat tggaatgagt acaatgtaaa 420
taccttaacg aggaacaatt ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc 480
tccaaaagcg tatattaaag ttgttgcagt taaaaagctc gtagttgaac cttgggcttg 540
gctggccggt ccatcttttt gatgcgtact ggacccagcc gagcctttcc ttctgggtag 600
ccatttatgg cgaaccagga cttttacttt gaaaaaatta gagtgttcaa agcaggcctt 660
tgctcgaata tattagcatg gaataataga ataggacgtt atggttctat tttgttggtt 720
tctaggacca tcgtaatgat taatagggac ggtcgggggt atcagtattc agttgtcaga 780
ggtgaaattc ttggatttac tgaagactaa ctactgcgaa agcatttacc aaggacgttt 840
tcattaatca agaacgaaag ttaggggatc gaagatgatc agataccgtc gtagtcttaa 900
ccataaacta tgccgactag ggatcggttg ttgttctttt attgacgcaa tcggcacctt 960
acgagaaatc aaagtctttg ggttctgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag 1020
gaattgacgg aagggcacca ccaggagtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg 1080
gaaactcacc aggtccagac acaataagga ttgacagatt gagagctctt tcttgatttt 1140
gtgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctgct taattgcgat 1200
aacgaacgag accttaacct actaaatagt gctgctagca tttgctggta tagtcacttc 1260
ttagagggac tatcgacttc aagtcgatgg aagtttgagg caataacagg tctgtgatgc 1320
ccttagacgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgacgga gccagcgagt ataagccttg 1380
gccgagaggt ctgggaaatc ttgtgaaact ccgtcgtgct ggggatagag cattgtaatt 1440
gttgctcttc aacgaggaat tcctagtaag cgcaagtcat cagcttgcgt tgattacgtc 1500
cctgcccttt gtacacaccg cccgtcgcta ctaccgattg aatggcttag tgaggcctcc 1560
ggattggttt aggaaagggg gcaactncat tctggaaccg agaagctggt caaacttggt 1620
catttagagg aa 1632
<210> 38
<211> 1732
<212> DNA
<213> Candida glabrata
<400> 38
agtatttgtc taaaaattaa gccatgcatg tctaagtata agcaatttat acagtgaaac 60
tgcgaatggc tcattaaatc agttatcgtt tatttgatag ttcctttact acatggtata 120
actgtggtaa ttctagagct aatacatgct taaaatctcg acctcttgga agagatgtat 180
ttattagata aaaaatcaat gtcttcggac tttttgatga ttcataataa cttttcgaat 240
cgcatggcct tgtgctggcg atggttcatt caaatttctg ccctatcaac tttcgatggt 300
aggatagtgg cctaccatgg tttcaacggg taacggggaa taagggttcg attccggaga 360
gggagcctga gaaacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat 420
cctgacacag ggaggtagtg acaataaata acgatacagg gcccattcgg gtcttgtaat 480
tggaatgagt acaatgtaaa taccttaacg aggaacaatt ggagggcaag tctggtgcca 540
gcagccgcgg taattccagc tccaatagcg tatattaaag ttgttgcagt taaaaagctc 600
gtagttgaac tttgggcctg ggtggccggt ccgatttttt cgtgtactgg aatgcacccg 660
ggcctttcct tctggctaac cccaagtcct tgtggcttgg cggcgaacca ggacttttac 720
tttgaaaaaa ttagagtgtt caaagcaggc gtattgctcg aatatattag catggaataa 780
tggaatagga cgtttggttc tattttgttg gtttctagga ccatcgtaat gattaatagg 840
gacggtcggg ggcatcagta ttcaattgtc agaggtgaaa ttcttggatt tattgaagac 900
taactactgc gaaagcattt gccaaggacg ttttcattaa tcaagaacga aagttagggg 960
atcgaagatg atcagatacc gtcgtagtct taaccataaa ctatgccgac tagggatcgg 1020
gtggtgtttt tttagtgacc cactcggcac cttacgagaa atcaaagtct ttgggttctg 1080
gggggagtat ggtcgcaagg ctgaaactta aaggaattga cggaagggca ccaccaggag 1140
tggagcctgc ggcttaattt gactcaacac ggggaaactc accaggtcca gacacaataa 1200
ggattgacag attgagagct ctttcttgat tttgtgggtg gtggtgcatg gccgttctta 1260
gttggtggag tgatttgtct gcttaattgc gataacgaac gagaccttaa cctactaaat 1320
agtggtgcta gcatttgctg gttgtccact tcttagaggg actatcggtt tcaagccgat 1380
ggaagtttga ggcaataaca ggtctgtgat gcccttagac gttctgggcc gcacgcgcgc 1440
tacactgacg gagccagcga gtctaacctt ggccgagagg tcttggtaat cttgtgaaac 1500
tccgtcgtgc tggggataga gcattgtaat tattgctctt caacgaggaa ttcctagtaa 1560
gcgcaagtca tcagcttgcg ttgattacgt ccctgccctt tgtacacacc gcccgtcgct 1620
agtaccgatt gaatggctta gtgaggcctc aggatctgct tagaagaggg ggcgactcca 1680
cttcagagcg gagaatctgg tcaaacttgg tcatttagag gaaacccaaa aa 1732
<210> 39
<211> 1223
<212> DNA
<213> Candida parapsilosis
<400> 39
gcctgagaaa cggctaccac atccaaggaa ggcagcaggc gcgcaaatta cccaatcccg 60
acacggggag gtagtgacaa taaataacga tacagggccc tttcgggtct tgtaattgga 120
atgagtacaa tgtaaatacc ttaacgagga acaattggag ggcaagtctg gtgccagcag 180
ccgcggtaat tccagctcca aaagcgtata ttaaagttgt tgcagttaaa aagctcgtag 240
ttgaaccttg ggcttggctg gccggtccat cttttttgat gcgtactgga cccagccgag 300
cctttccttc tggctagcct ttttggcgaa ccaggacttt tactttgaaa aaattagagt 360
gttcaaagca ggcctttgct cgaatatatt agcatggaat aatagaatag gacgttatgg 420
ttctattttg ttggtttcta ggaccatcgt aatgattaat agggacggtc gggggtatca 480
gtattcagta gtcagaggtg aaattcttgg atttactgaa gactaactac tgcgaaagca 540
tttaccaagg acgttttcat taatcaagaa cgaaagttag gggatcgaag atgatcagat 600
accgtcgtag tcttaaccat aaactatgcc gactagggat cggttgttgt tcttttattg 660
acgcaatcgg caccttacga gaaatcaaag tctttgggtt ctggggggag tatggtcgca 720
aaggctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca ggagtggagc ctgcggctta 780
atttgactca acacggggaa actcaccagg tccagacaca ataaggattg acagattgag 840
agctctttct tgattttgtg ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt ggagtgattt 900
gtctgcttaa ttgcgataac gaacgagacc ttaacctact aaatagtgct gctagcattt 960
gctggtatag tcacttctta gagggactat cgatttcaag tcgatggaag tttgaggcaa 1020
taacaggtct gtgatgccct tagacgttct gggccgcacg cgcgctacac tgacggagcc 1080
agcgagtata aaccttggcc gagaggtctg ggaaatcttg tgaaactccg tcgtgctggg 1140
gatagagcat tgtaattatt gctcttcaac gaggaattcc tagtaagcgc aagtcatcag 1200
cttgcgttga ttacgtccct gcc 1223
<210> 40
<211> 1563
<212> DNA
<213> Candida tropicalis
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (627)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (631)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (674)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (684)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (699)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (704)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (723)..(822)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (866)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1014)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1509)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1542)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 40
atgcttgtct caagattaag ccatgcatgt ctaagtataa gcaatttata cagtgaaact 60
gcgaatggnt cattaaatca gttatcgttt atttgatagt accttactac ttggataacc 120
gtggtaattc tagagctaat acatgcttaa aatcccgact gtttggaagg gatgtattta 180
ttagataaaa aatcaatgtc ttcggactct ttgatgattc ataataactt ttcgaatcgc 240
atggccttgt gctggcgatg gttcattcaa atttctgccc tatcaacttt cgatggtagg 300
atagtggcct accatggttt caacgggtaa cggggaataa gggttcgatt ccggagaggg 360
agcctgagaa acggctacca catccaagga aggcagcagg cgcgcaaatt acccaatccc 420
gacacgggga ggtagtgaca ataaataacg atacagggcc ctttcgggtc ttgtaattgg 480
aatgagtaca atgtaaatac cttaacgagg aacaattgga gggcaagtct ggtgccagca 540
gcccgcggta attccagctt caaaagccgt atattaaagg tggttgcagt taaaaagctc 600
gtagttgaac cttgggcttt ggttggnccg nccatctttc tgaagcctac tggaccccaa 660
cccgagccct ttcntttggc taancctttt ggcgaaccng gacntttacc tttgaaaaaa 720
ttnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 780
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncgattagg gatcggttgt 840
tgttctttaa ttgacgccat tgggcncctt acgagaaatc aaaagtcttt gggttctggg 900
ggaagtatgg tcgcaaggtt gaaactttaa aggaattgac ggaagggcac caccaggagt 960
ggagcctgcg ggcttaattt gactcaacac ggggaaactc accaggtcca gacncaataa 1020
ggattgacag attgagagct ctttcttgat tttgtgggtg gtggtgcatg gccgttctta 1080
gttggtggag tgatttgtct gcttaattgc gataacgaac gagaccttaa cctactaaat 1140
agtgctgcta gcatttgctg gtatagtcac ttcttagagg gactatcgat ttcaagtcga 1200
tggaagtttg aggcaataac aggtctgtga tgcccttaga cgttctgggc cgcacgcgcg 1260
ctacactgac ggagccagcg agtataaacc ttggccgaga ggtctgggaa atcttgtgaa 1320
actccgtcgt gctggggata gagcattgta attgttgctc ttcaacgagg aattcctagt 1380
aagcgcaagt catcagcttg cgttgattac gtccctgccc tttgtacaca ccgcccgtcg 1440
ctactaccga ttgaatggct tagtgaggct tccggattgg tttaggaaag ggggcaactc 1500
cattctggna ccgagaagct agtcaaactc ggtcatttag ancaagtaaa agtcgaacaa 1560
ggt 1563
<210> 41
<211> 1801
<212> DNA
<213> Cryptococcus neoformans
<400> 41
acctggttga tcctgccagt agtcatatgc ttgtctcaaa gattaagcca tgcatgtcta 60
agtataaacg aattcatact gtgaaactgc gaatggctca ttaaatcagt tatagtttat 120
ttgatggtat cttgctacat ggataactgt ggtaattcta gagctaatac atgctgaaaa 180
gccccgactt ctggaagggg tgtatttatt agataaaaaa ccaatgggtt tcggccctct 240
atggtgaatc ataataactt ctcgaatcgc atggccttgt gccggcgatg cttcattcaa 300
atatctgccc tatcaacttt cgatggtagg atagaggcct accatggtat caacgggtaa 360
cggggaatta gggttcgatt ccggagaggg agcctgagaa acggctacca catccaagga 420
aggcagcagg cgcgcaaatt acccaatccc gacacgggga ggtagtgaca ataaataaca 480
atacagggct cttttgggcc ttgtaattgg aatgagtaca atttaaatcc cttaacgagg 540
aacaactgga gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa ttccagctcc agtagcgtat 600
attaaagttg ttgcagttaa aaagctcgta gtcgaacttc aggtctggcg aggcggtcct 660
cctcacggag tgcactgtct tgctggacct tacctcctgg tggtcctgta tgctctttac 720
tgggtgtgca ggggaaccag gaattttacc ttgaaaaaat tagagtgttc aaagcaggca 780
atcgcccgaa tacattagca tggaataata gaataggacg tgcggttcta ttttgttggt 840
ttctaggatc gccgtaatga ttaataggga cggtcggggg cattggtatt ccgttgctag 900
aggtgaaatt cttagattga cggaagacca acaactgcga aagcatttgc caaggacgtt 960
ttcattgatc aagaacgaag gttaggggat caaaaacgat tagataccgt tgtagtctta 1020
acagtaaacg atgccgacta gggatcggcc cacgtcaatc tctgactggg tcggcacctt 1080
acgagaaatc aaagtctttg ggttctgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag 1140
gaattgacgg aagggcacca ccaggtgtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg 1200
gaaactcacc aggtccagac atagtgagga ttgacagatt gatagctctt tcttgattct 1260
atgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctggt taattccgat 1320
aacgaacgag accttaacct gctaaatagt caggccggct ttggctggtc gtatgacttc 1380
ttagagggac tgtcggcgtc tagtcgacgg aagtttgagg caataacagg tctgtgatgc 1440
ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgactga gccagcgagt cttaccgcct 1500
tggccgagag gcctgggtaa tcttgtgaaa ctcagtcgtg ctggggatag agcattgcaa 1560
ttattgctct tcaacgagga atacctagta agcgtgagtc accagctcgc gttgattacg 1620
tccctgccct ttgtacacac cgcccgtcgc tactaccgat tgaatggctt agtgagatct 1680
ccggattggc gttggggagc cggcaacggc accccttggc cgagaagttg atcaaacttg 1740
gtcatttaga ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc 1800
a 1801
<210> 42
<211> 1673
<212> DNA
<213> Fusarium sp.
<400> 42
gcaattatac cgcgaaactg cgaatggctc attatataag ttatcgttta tttgatagta 60
ccttactact tggataaccg tggtaattct agagctaata catgctaaaa atcccgactt 120
cggaagggat gtatttatta gattaaaaac caatgccctt cggggctcac tggtgattca 180
tgataactcc tcgaatcgca tggccttgtg ccggcgatgg ttcattcaaa tttcttccct 240
atcaactttc gatgtttggg tattggccaa acatggttgc aacgggtaac ggagggttag 300
ggctcgaccc cggagaagga gcctgagaaa cggctactac atccaaggaa ggcagcaggc 360
gcgcaaatta cccaatcccg acacggggag gtagtgacaa taaatactga tacagggctc 420
ttttgggtct tgtaattgga atgagtacaa tttaaatccc ttaacgagga acaattggag 480
ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata ttaaagttgt 540
tgtggttaaa aagctcgtag ttgaaccttg ggcctggccg tccggtccgc ctcaccgcgt 600
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ccgtaatgat taatagggac agtcgggggc atcagtattc aattgtcaga ggtgaaattc 840
ttggatttat tgaagactaa ctactgcgaa agcatttgcc aaggatgttt tcattaatca 900
ggaacgaaag ttaggggatc gaagacgatc agataccgtc gtagtcttaa ccataaacta 960
tgccgactag ggatcggacg gtgttatttt ttgacccgtt cggcacctta cgagaaatca 1020
aagtgcttgg gctccagggg gagtatggtc gcaaggctga aacttaaaga aattgacgga 1080
agggcaccac caggggtgga gcctgcggct taatttgact caacacgggg aaactcacca 1140
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ccttaacctg ctaaatagcc cgtattgctt tggcagtacg ctggcttctt agagggacta 1320
tcggctcaag ccgatggaag tttgaggcaa taacaggtct gtgatgccct tagatgttct 1380
gggccgcacg cgcgctacac tgacggagcc agcgagtact tccttgtccg aaaggtccgg 1440
gtaatcttgt taaactccgt cgtgctgggg atagagcatt gcaattattg ctcttcaacg 1500
aggaatccct agtaagcgca agtcatcagc ttgcgttgat tacgtccctg ccctttgtac 1560
acaccgcccg tcgctactac cgattgaatg gctcagtgag gcgtccggac tggcccagag 1620
aggtgggcaa ctaccactca gggccggaaa gctctccaaa ctcggtcatt aga 1673
<210> 43
<211> 1554
<212> DNA
<213> Bacillus anthracis
<400> 43
ttattggaga gtttgatcct ggctcaggat gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa 60
gtcgagcgaa tggattaaga gcttgctctt atgaagttag cggcggacgg gtgagtaaca 120
cgtgggtaac ctgcccataa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggata 180
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tggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 540
aatacgtagg tggcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggtggttt 600
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gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaaccc 1020
tagagatagg gcttctcctt cgggagcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1080
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca 1140
tcattwagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1200
cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa 1260
agagctgcaa gaccgcgagg tggagctaat ctcataaaac cgttctcagt tcggattgta 1320
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gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttct 1554
<210> 44
<211> 1610
<212> DNA
<213> Burkholderia pseudomallei
<400> 44
tctagatgcg tgctcgagcg gccgcccagt gctgcatgga tatctgctga attcggcttg 60
agcagtttga tcctggctca gattgaacgc tggcggcatg ccttacacat gcaagtcgaa 120
cggcagcacg ggcttcggcc tggtggcgag tggcgaacgg gtgagttata catcggagca 180
tgtcctgtag tgggggatag cccggcgaaa gccgaattaa taccgcatac gatctgagga 240
tgaaagcggg ggaccttcgg gcctcgcgct atagggttgg ccgatggctg attagctagt 300
tggtggggta aaggcctacc aaggcgacga tcagtagctg gtctgagagg acgaccagcc 360
acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aattttggac 420
aatgggcgca agcctgatcc agcaatgccg cgtgtgtgaa gaaggccttc gggttgtaaa 480
gcacttttgt ccggaaagaa atcattctgg ctaatacccg gagtggatga cggtaccgga 540
agaataagca ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcgagcgtt 600
aatcgggatt actgggcgta aagcgtgcgc aggcggtttg ctaagaccga tgtgaaatcc 660
ccgggctcaa cctgggaact gcattggtga ctggcaggct agagtatggc agaggggggt 720
agaattccac gtgtagcagt gaaatgcgta gagatgtgga ggaataccga tggcgaaggc 780
agccccctgg gccaatactg acgctcatgc acgaaagcgt ggggagaaaa caggattaga 840
taccctggta gtccacgccc taaacgatgt caactagttg ttggggattc atttccttag 900
taacgtagct aacgcgcgaa gttgaccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca 960
aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggatgatgtg gattaattcg atgcaacgcg 1020
aaaaacctta cctacccttg acatggtcgg aagcccgatg agagttgggc gtgctcgaaa 1080
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aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcct tagttgctac gcaagagcac tctaaggaga 1200
ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcctcatgg cccttatggg 1260
tagggcttca cacgtcatac aatggtcgga acagagggtc gccaacccgc gagggggagc 1320
caatcccaga aaaccgatcg tagtccggat tgcactctgc aactcgagtg catgaagctg 1380
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accgcccgtc acaccatggg agtgggtttt accagaagtg gctagtctaa ccgcaaggag 1500
gacggtcacc acggtaggat tcatgactgg ggtgaagtcg taacaaggta gccgtagaag 1560
ccgaattcca gcacactggc ggccgttact actggatccg agctcgtacc 1610
<210> 45
<211> 1511
<212> DNA
<213> Clostridium botulinum
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 45
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attagctagt tggtaaggta acggcttacc aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg 300
gtgatcggcc acattggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 360
aatattgcgc aatgggggag accctgacgc agcaacgccg cgtgggtgat gaaggtcttc 420
ggattgtaaa gccctgtttt ctaggacgat aatgacggta ctagaggagg aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcga gcgttgtccg gatttactgg 540
gcgtaaaggg tgcgtaggcg gatgtttaag tgggatgtga aatccccggg cttaacctgg 600
gggctgcatt ccaaactgga tatctagagt gcaggagagg aaagcggaat tcctagtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat taggaagaac accagtggcg aaggcggctt tctggactgt 720
aactgacgct gaggcacgaa agcgtgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatggatact aggtgtaggg ggtatcaact ccccctgtgc cgcagttaac 840
acaataagta tcccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg 900
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ggacttgaca tcccttgcat agcctagaga taggtgaagc ccttcggggc aaggagacag 1020
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gcaacccttg ttattagttg ctaccattaa gttgagcact ctaatgagac tgcctgggta 1140
accaggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgtcca gggctacaca 1200
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caccatgaga gctggtaaca cccgaagtcc gtgaggtaac cgtaaggagc cagcggccga 1440
aggtgggatt agtgattggg gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtaggaga acctgcggct 1500
ggatcacctc c 1511
<210> 46
<211> 1510
<212> DNA
<213> Clostridium botulinum
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 46
nnnnnnngag agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca 60
agtcgagcga tgaagcttcc ttcgggaagt ggattagcgg cggacgggtg agtaacacgt 120
gggtaacctg cctcaaagtg ggggatagcc ttccgaaagg aagattaata ccgcataaca 180
taagagaatc gcatgatttt cttatcaaag atttattgct ttgagatgga cccgcggcgc 240
attagctagt tggtaaggta acggcttacc aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg 300
gtgatcggcc acattggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc aggagtgggg 360
aatattgcgc aatgggggaa accctgacgc agcaacgccg cgtgggtgat gaaggtcttc 420
ggattgtaaa gccctgtttt ctaggacgat aatgacggta ctagaggagg aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcga gcgttgtccg gatttactgg 540
gcgtaaaggg tgcgtaggcg gatgtttaag tgggatgtga aatccccggg cttaacctgg 600
gggctgcatt ccaaactgga tatctagagt gcaggagagg aaagcggaat tcctagtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat taggaagaac accagtggcg aaggcggctt tctggactgt 720
aactgacgct gaggcacgaa agcgtgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatggatact aggtgtaggg ggtatcaact ccccctgtgc cgcagttaac 840
acaataagta tcccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcagcgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacct 960
ggacttgaca tcccttgcat agcctagaga taggtgaagc ccttcggggc aaggagacag 1020
gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgtta ggttaagtcc tgcaacgagc 1080
gcaacccttg ttattagttg ctaccattaa gttgagcact ctaatgagac tgcctgggta 1140
accaggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgtcca gggctacaca 1200
cgtgctacaa tggtaggtac aataagacgc aagaccgtga ggtggagcaa aacttataaa 1260
acctatctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagctgga gttgctagta 1320
atcgcgaatc agaatgtcgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380
accatgagag ctggtaacac ccgaagtccg tgaggtaacc gtaaggagcc agcggccgaa 1440
ggtgggatta gtgattgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtaggagaa cctgcggctg 1500
gatcacctcc 1510
<210> 47
<211> 1516
<212> DNA
<213> Clostridium botulinum
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 47
nnnnnnngag agtttgatcc tggctcagga cgaacgtggc ggcgtgccta acacatgcaa 60
gtcgagcgat gaagcttcct tcggggagtg gattagcggc ggacgggtga gtaacacgtg 120
ggtaacctgc ctcaaagagg gggatagcct cccgaaaggg agattaatac cgcataacat 180
tattttatgg catcatagaa taatcaaagg agcaatccgc tttgattatg gacccgcgtc 240
gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga 300
gggtgatcgg ccacattgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg 360
ggaatattgc gcaatggggg aaaccctgac gcagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt 420
tcggatcgta aaactctgtc tttagggacg ataatgacgg tacctaagga ggaagccacg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttact 540
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gggcgctgca tttgaaactg ggcatctaga gtgcaggaga ggaaagtgga attcctagtg 660
tagcggtgaa atgcgtagag attaggaaga acaccagtgg cgaaggcgac tttctggact 720
gtaactgaca ctgagatacg aaagcgtggg tagcaaacag gattagatcc ccctggtagt 780
ccacgccgta aacgatgaat actaggtgtc ggggggtacc accctcggtg ccgcagcaaa 840
cgcattaagt attccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg 900
gggacccgca caagcagcgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
tagacttgac atctcctgaa ttactcttaa tcgaggaagt cccttcgggg gacaggaaga 1020
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc ttattgttag ttgctactat taagttaagc actctaacga gactgccgcg 1140
gttaacgtag aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg tctagggcta 1200
cacacgtgct acaatggctg gtacaacgag cagcaaaccc gcgaggggga gcaaaacttg 1260
aaagccagtc ccagttcgga ttgtaggctg aaactcgcct acatgaagtt ggagttgcta 1320
gtaatcgcgg aatcagcatg tcgcggtgaa tacgtccccg ggtcttgtac acaccgcccg 1380
tcacaccatg agagccggta acacccgaag cccgtgaggt aaccgtaagg agccagcggt 1440
cgaaggtggg attggtgatt ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgtagg agaacctgcg 1500
gttggatcac ctcctt 1516
<210> 48
<211> 1516
<212> DNA
<213> Clostridium botulinum
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (373)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (789)..(790)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 48
nnnnnnngag agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aacacatgca 60
agtcgagcga tgaagcttcc ttcgggaagt ggattagcgg cggacgggtg agtaacacgt 120
gggtaacctg cctcaaagag tgggatagcc tcccgaaagg gagattaata ccgcataaca 180
ttattttatg gcatcataca taaaataatc aaaggagcaa tccgctttga gatggacccg 240
cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg caacgatgcg tagccgacct 300
gagagggtga tcggccacat tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca 360
gtggggaata ttncgcaatg ggggaaaccc tgacgcagca acgccgcgtg agtgatgaag 420
gttttcggat cgtaaaactc tgtctttagg gacgataatg acggtaccta aggaggaagc 480
cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt 540
tactgggcgt aaagagtatg taggtgggtg cttaagtcag atgtgaaatt cccgggctca 600
acctgggagc tgcatttgaa actgggcatc tagagtgcag gagaggaaag tggaattcct 660
agtgtagcgg tgaaatgcgt agagattagg aagaacacca gtggcgaagg cgactctctg 720
gactgtaact gacactgaga tacgaaagcg tgggtagcaa acaggattag ataccctggt 780
agtccacgnn gtaaacgatg aatactaggt gtcggggggt accaccctcg gtgccgcagc 840
aaacgcatta agtattccgc ctgggaagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg 900
acggggcccg cacaagcagc ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960
cctagacttg acatctcctg aattactctt aatcgaggaa gtcccttcgg ggacaggaag 1020
acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080
gagcgcaacc cttattgtta gttgctacta ttaagttaag cactctaacg agactgccgc 1140
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tcacaccatg agagccggta acacccgaag cccgtgaggt aaccgtaagg agccagcggt 1440
cgaaggtggg attggtgatt ggggtaagtc gtaacaaggt agccgtagga gaacctgcgg 1500
ctggatcacc tccttt 1516
<210> 49
<211> 1513
<212> DNA
<213> Clostridium botulinum
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 49
nnnnnnnaga gtttgatcct ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta acacatgcaa 60
tcgagcgatg aagcttcctt cgggaagtgg attagcggcg gacgggtgag taacacgtgg 120
gtaacctgcc tcatagaggg gaatagcctc ccgaaaggga gattaatacc gcataaagta 180
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gcattagcta gttggtgagg taagggctca ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga 300
gggtgatcgg ccacattgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg 360
ggaatattgc gcaatggggg aaaccctgac gcagcaacgc cgcgtgaatg aagaaggcct 420
tagggttgta aagttctgtc atatgggaag ataatgacgg taccatatga ggaagccacg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttact 540
gggcgtaaag gatgcgtagg cggacattta agtcagatgt gaaatacccg ggctcaactt 600
gggtgctgca tttgaaactg ggtgtctaga gtgcaggaga ggaaagcgga attcctagtg 660
tagcggtgaa atgcgtagag attaggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tttctggact 720
gtaactgacg ctgaggcatg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780
cacgccgtaa acgatgaata ctaggtgtag gaggtatcga ccccttctgt gccgcagtta 840
acacaataag tattccgcct ggggagtacg atcgcaagat taaaactcaa aggaattgac 900
gggggcccgc acaagcagcg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960
ctagacttga catcccctga attacctgta atgagggaag cccttcgggg cagggagaca 1020
ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt atcattagtt gctaccatta agttgagcac tctagtgaga ctgcccgggt 1140
taaccgggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgtc tagggctaca 1200
cacgtgctac aatggttggt acaacaagat gcaagaccgc gaggtggagc taaacttaaa 1260
aaaccaaccc agttcggatt gtaggctgaa actcgcctac atgaagccgg agttgctagt 1320
aatcgcgaat cagcatgtcg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380
caccatgaga gctggtaaca cccgaagtcc gtgaggtaac cgtaaggagc cagcggccga 1440
aggtgggatt agtgattggg gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtaggaga acctgcggtt 1500
ggatcacctc ctt 1513
<210> 50
<211> 1521
<212> DNA
<213> Francisella tularensis
<400> 50
ttgaagagtt tgatcatggc tcagattgaa cgctggtggc atgcttaaca catgcaagtc 60
gaacggtaac aggtcttagg atgctgacga gtggcggacg ggtgagtaac gcgtaggaat 120
ctgcccattt gagggggata ccagttggaa acgactgtta ataccgcata atatctgtgg 180
attaaaggtg gctttcggcg tgtcgcagat ggatgagcct gcgttggatt agctagttgg 240
tggggtaagg gcccaccaag gctacgatcc atagctgatt tgagaggatg atcagccaca 300
ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat 360
gggggcaacc ctgatccagc aatgccatgt gtgtgaagaa ggccctaggg ttgtaaagca 420
ctttagttgg ggaggaaagc ctcaaggtta atagccttgg gggaggacgt tacccaaaga 480
ataagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggggggtgc aagcgttaat 540
cggaattact gggcgtaaag ggtctgtagg tggtttgtta agtcagatgt gaaagcccag 600
ggctcaacct tggaactgca tttgatactg gcaaactaga gtacggtaga ggaatgggga 660
atttctggtg tagcggtgaa atgcgtagag atcagaagga acaccaatgg cgaaggcaac 720
attctggacc gatactgaca ctgagggacg aaagcgtggg gatcaaacag gattagatac 780
cctggtagtc cacgctgtaa acgatgagta ctagctgttg gagtcggtgt aaaggctcta 840
gtggcgcacg taacgcgata agtactccgc ctggggacta cggccgcaag gctaaaactc 900
aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc 960
gaagaacctt acctggtctt gacatcctgc gaactttcta gagatagatt ggtgcttcgg 1020
aacgcagtga cagtgctgca cggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt 1080
cccgcaacga gcgcaacccc tattgatagt taccatcatt aagttgggta ctctattaag 1140
actgccgctg acaaggcgga ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg gcccttacga 1200
ccagggctac acacgtgcta caatgggtat tacagagggc tgcgaaggtg cgagctggag 1260
cgaaactcaa aaaggtactc ttagtccgga ttgcagtctg caactcgact gcatgaagtc 1320
ggaatcgcta gtaatcgcag gtcagaatac tgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca 1380
caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg ctccagaagt agatagctta acgaatgggc 1440
gtttaccacg gagtgattca tgactggggt gaagtcgtaa caatggtagc cgtagggaac 1500
ctgcggctgg atcacctcct t 1521
<210> 51
<211> 1464
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 51
tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg cagcacagag 60
gaacttgttc cttgggtggc gagcggcgga cgggtgagta atgcctggga aattgcccgg 120
tagaggggga taaccattgg aaacgatggc taataccgca taacctcgta agagcaaagc 180
aggggacctt cgggccttgc gctaccggat atgcccaggt gggattagct agttggtgag 240
gtaagggctc accaaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg 300
aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc 360
gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt aaagtacttt 420
cagtagggag gaaggtggtt aagctaatac cttaatcatt tgacgttacc tacagaagaa 480
gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga 540
attactgggc gtaaagcgca tgcaggtggt ttgttaagtc agatgtgaaa gccctgggct 600
caacctagga atcgcatttg aaactgacaa gctagagtac tgtagagggg ggtagaattt 660
caggtgtagc ggtgaaatgc gtagagatct gaaggaatac cggtggcgaa ggcggccccc 720
tggacagata ctgacactca gatgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg 780
gtagtccacg ccgtaaacga tgtctacttg gaggttgtga cctagagtcg tggctttcgg 840
agctaacgcg ttaagtagac cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaatgaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac 960
cttacctact cttgacatcc tcagaagaga ctggagacag tcttgtgcct tcgggaactg 1020
agagacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg ttaagtcccg 1080
caacgagcgc aacccttatc cttgtttgcc agcacgtaat ggtgggaact ccagggagac 1140
tgccggtgat aaaccggagg aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatggc ccttacgagt 1200
agggctacac acgtgctaca atggcgtata cagagggcag cgataccgcg aggtggagcg 1260
aatctcacaa agtacgtcgt agtccggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg 1320
aatcgctagt aatcgcaaat cagaatgttg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca 1380
ccgcccgtca caccatggga gtgggctgca aaagaagcag gtagtttaac cttcgggagg 1440
acgcttgcca ctttgggtac ttgg 1464
<210> 52
<211> 1469
<212> DNA
<213> Yersinia pestis
<400> 52
ctggcggcag gcctaacaca tgcaagtcga gcggcaccgg gaagtagttt actactttgc 60
cggcgagcgg cggacgggtg agtaatgtct ggggatctgc ctgatggagg gggataacta 120
ctggaaacgg tagctaatac cgcatgacct cgcaagagca aagtggggga ccttagggcc 180
tcacgccatc ggatgaaccc agatgggatt agctagtagg tggggtaatg gctcacctag 240
gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc 300
agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc 360
catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttcggg ttgtaaagca ctttcagcga ggaggaaggg 420
gttgagttta atacgctcaa tcattgacgt tactcgcaga agaagcaccg gctaactccg 480
tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 540
cgcacgcagg cggtttgtta agtcagatgt gaaatccccg cgcttaacgt gggaactgca 600
tttgaaactg gcaagctaga gtcttgtaga ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa 660
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ctcaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgctgtaa 780
acgatgtcga cttggaggtt gtgcccttga ggcgtggctt ccggagctaa cgcgttaagt 840
cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca 900
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tactcttgac 960
atccacagaa tttggcagag atgctaaagt gccttcggga actgtgagac aggtgctgca 1020
tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080
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gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac gagtagggct acacacgtgc 1200
tacaatggca gatacaaagt gaagcgaact cgcgagagcc agcggaccac ataaagtctg 1260
tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc tagtaatcgt 1320
agatcagaat gctacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380
gggagtgggt tgcaaaagaa gtaggtagct taaccttcgg gagggcgctt accactttgt 1440
gattcatgac tggggtgaag tcgtaacaa 1469
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 53
catccaagga aggcagcagg cgcg 24
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 54
gttcaactac gagcttttta ac 22
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 55
gttcgactac gagcttttta ac 22
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 56
gtgtagcggt gaaatgcgta gag 23
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 57
tcgtttaccg tggactacca ggg 23
Claims (36)
- 샘플로부터의 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부를 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 존재 또는 부재에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 샘플에서 세균을 확인하거나, 부분적으로 확인하는 방법으로서,
상기 세균은 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 애로게네스; 엔테로박터 클로아카; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 세라티아 마르세센스; 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스;로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647 및 653에 상응하는 위치에 있고;
상기 세균은 상기 SNP의 존재 또는 부재를 근거로 하기 기준에 따라 확인되거나, 부분적으로 확인되는 방법:
(A) 상기 세균은 위치 412에 T가 있을 때 스타필로코쿠스 아우레우스로 확인되고;
(B) 상기 세균은 위치 647에 G가 있을 때 엔테로코쿠스 속에 속하는 것으로 확인되고;
(C) 상기 세균은 위치 653에 G가 있을 때 엔테로박터 클로아카로 확인되고;
(D) 상기 세균은 위치 378에 A가 있고 위치 488에 T가 있거나, 위치 488 및 647에 T가 있을 때 스트렙토코쿠스 뉴모니아로 확인되고;
(E) 상기 세균은 위치 378에 A가 있고 위치 488 또는 위치 647에 A가 있을 때 스트렙토코쿠스 아갈락티아로 확인되고;
(F) 상기 세균은 위치 378에 G가 있고 위치 488 또는 위치 647에 A가 있을 때 스트렙토코쿠스 피오게네스로 확인되고;
(G) 상기 세균은 위치 273, 440 및 647에 A가 있을 때 악시네토박터 칼코아세티쿠스로 확인되고;
(H) 상기 세균은 위치 273에 T가 있고 위치 653에 T가 있을 때 에스케리키아 콜라이로 확인되고;
(I) 상기 세균은 위치 273에 T가 있고, 위치 488 및 647에 C가 있고, 위치 653에 A가 있을 때 클렙시엘라 뉴모니아로 확인되고;
(J) 상기 세균은 위치 440 및 488에 C가 있고 위치 647에 T가 있을 때 프로테우스 미라빌리스로 확인되고; 또는
(K) 상기 세균은 위치 440에 A가 있고 위치 647에 T가 있을 때 슈도모나스 애루기노사로 확인된다. - 청구항 1에 있어서,
용융 곡선 분석을 사용하여 종들을 식별하는 방법. - 청구항 2에 있어서,
스타필로코쿠스 아우레우스 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스는 위치 412에서 SNP를 둘러싸는 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 서로 식별되는 방법. - 청구항 2에 있어서,
엔테로코쿠스 패칼리스 및 엔테로코쿠스 패시움은 위치 647에서 SNP를 둘러싸는 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 서로 식별되는 방법. - 청구항 2에 있어서,
세라티아 마르세센스 및 엔테로박터 애로게네스는 위치 440, 488 및 647 중 어느 하나에서 SNP를 둘러싸는 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 서로 식별되는 방법. - 청구항 2에 있어서,
엔테로코쿠스 패칼리스, 엔테로코쿠스 패시움, 스트렙토코쿠스 아갈락티아 및 스트렙토코쿠스 피오게네스는 위치 378에서 SNP를 둘러싸는 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 서로 식별되는 방법. - 샘플로부터의 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부를 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 존재 또는 부재에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 샘플에서 세균을 확인하거나, 부분적으로 확인하는 방법으로서,
상기 세균은 악시네토박터 칼코아세티쿠스; 엔테로박터 애로게네스; 엔테로박터 클로아카; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 패시움; 에스케리키아 콜라이; 클렙시엘라 뉴모니아; 프로테우스 미라빌리스; 슈도모나스 애루기노사; 세라티아 마르세센스; 스타필로코쿠스 아우레우스; 스타필로코쿠스 에피데르미디스; 스트렙토코쿠스 아갈락티아; 스트렙토코쿠스 뉴모니아; 스트렙토코쿠스 피오게네스; 리스테리아 모노사이토게네스; 클로스트리듐 퍼프링겐스; 코리네박테리움 제이케이움; 박테로이데스 프라길리스; 네이세리아 메닝기티데스; 해모필루스 인플루엔자; 및 살모넬라 속(sp.);으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647, 653, 737, 755, 762 및 776에 상응하는 위치에 있고,
상기 세균은 각각의 세균에 대해 아래의 표에 열거된 SNP의 존재 또는 부재를 근거로 확인되거나, 부분적으로 확인되는 방법:
. - 청구항 7에 있어서,
용융 곡선 분석을 사용하여 종들을 식별하는 방법. - 청구항 8에 있어서,
스타필로코쿠스 아우레우스 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스는 위치 412에서 SNP를 둘러싸는 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 서로 식별되는 방법. - 청구항 8에 있어서,
엔테로코쿠스 패칼리스 및 엔테로코쿠스 패시움은 위치 647에서 SNP를 둘러싸는 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 서로 식별되는 방법. - 청구항 8에 있어서,
세라티아 마르세센스 및 엔테로박터 애로게네스는 위치 440, 488 및 647 중 어느 하나에서 SNP를 둘러싸는 DNA의 고해상 용융 곡선 분석을 근거로 서로 식별되는 방법. - 청구항 1 또는 청구항 7에 있어서,
상기 샘플은 객담, 혈액, 뇌척수액 또는 소변을 포함하는 생물학적 샘플인 방법. - 청구항 1 또는 청구항 7에 있어서,
상기 분석하는 단계는 고해상 용융 분석, 5' 뉴클레아제 소화, 분자 비콘(beacon), 올리고뉴클레오타이드 라이게이션(ligation), 마이크로어레이, 제한 단편 길이 다형성, 항체 검출 방법, 직접적인 시퀀싱 또는 이들의 임의의 조합을 이용하여 상기 SNP의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 청구항 1 또는 청구항 7에 있어서,
상기 방법은 상기 세균이 치료제에 내성인지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 샘플은 서열번호 16-35 중 어느 하나로 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 적어도 하나의 단리된 프로브와 조합되는 방법. - 청구항 15에 있어서,
상기 샘플은 서열번호 22, 26-28 및 33-35 중 어느 하나로 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 단리된 프로브와 조합되는 방법. - 청구항 7에 있어서,
상기 샘플은 서열번호 16-35 및 53-57 중 어느 하나로 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 단리된 프로브와 조합되는 방법. - 청구항 17에 있어서,
상기 샘플은 서열번호 22, 26-28, 33-35 및 57 중 어느 하나로 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 단리된 프로브와 조합되는 방법. - 청구항 17에 있어서,
상기 샘플은 서열번호 53-57 중 어느 하나로 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 단리된 프로브와 조합되는 방법. - 청구항 19에 있어서,
상기 샘플은 서열번호 57로 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 단리된 프로브와 조합되는 방법. - 청구항 1 또는 청구항 7에 있어서,
상기 샘플은 대상체로부터 수득된 샘플이고; 상기 세균은 상기 대상체로부터 수득된 샘플에서 확인되거나, 부분적으로 확인됨으로써, 상기 대상체가 상기 세균으로 세균 감염을 갖는 것으로 확인되고, 상기 세균을 억제하는데 효과적인 항생제를 투여함으로써 치료하기 위해 보내져야 하는 방법. - 샘플에서 적어도 하나의 세균을 확인하거나, 부분적으로 확인할 수 있는 적어도 하나의 단리된 프로브를 포함하는 조성물로서,
상기 프로브는 세균 16S rRNA 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 일부에서 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 존재 또는 부재를 결합, 검출 또는 확인할 수 있고,
상기 SNP는 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 유전자의 위치 273, 378, 412, 440, 488, 647, 653, 737, 755, 762 및 776에 상응하는 위치에 있는 조성물. - 청구항 22에 있어서,
상기 적어도 하나의 프로브는 서열번호 16-35 및 53-57 중 어느 하나로 기재된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물. - 청구항 22의 상기 단리된 프로브를 하나 이상 포함하는 어레이.
- 고체 기판 및 청구항 22의 적어도 하나의 단리된 프로브를 포함하는 바이오칩.
- 샘플에서 적어도 하나의 세균을 분류하거나 확인하기 위한 키트 또는 어세이로서,
상기 키트 또는 어세이는 청구항 22의 프로브; 청구항 24의 어레이 또는 청구항 25의 바이오칩 중 적어도 하나를 포함하는 키트 또는 어세이. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
- 삭제
- 삭제
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| US11761038B1 (en) | 2020-07-06 | 2023-09-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
| US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
| US11827935B1 (en) | 2020-11-19 | 2023-11-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes |
| KR102453357B1 (ko) * | 2020-11-26 | 2022-10-07 | 고려대학교 산학협력단 | 형광 프로브를 이용한 칸디다 알비칸, 칸디다 아우리스, 및 칸디다 글라브라타를 감별하여 검출할 수 있는 동시다중 등온증폭반응 프라이머 세트 |
| AU2021409136A1 (en) | 2020-12-21 | 2023-06-29 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes |
| CN114717339B (zh) * | 2021-01-05 | 2024-04-05 | 深圳华大生命科学研究院 | 检测snp位点的试剂在制备试剂盒中的用途 |
| CN113201594A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-08-03 | 广东产品质量监督检验研究院（国家质量技术监督局广州电气安全检验所、广东省试验认证研究院、华安实验室） | 一种食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法 |
| EP4196605A1 (en) | 2021-09-01 | 2023-06-21 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
| KR102546048B1 (ko) * | 2022-12-29 | 2023-06-23 | 드림디엑스 주식회사 | 진균 감염 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법 |
| KR102546046B1 (ko) * | 2022-12-29 | 2023-06-23 | 드림디엑스 주식회사 | 세균 감염 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6054278A (en) | 1997-05-05 | 2000-04-25 | The Perkin-Elmer Corporation | Ribosomal RNA gene polymorphism based microorganism identification |
| JP2016520314A (ja) * | 2013-05-29 | 2016-07-14 | イミューンエクスプレス・プロプライエタリー・リミテッドＩｍｍｕｎｅＸｐｒｅｓｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ | 微生物マーカーおよびその使用 |
Family Cites Families (56)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8311018D0 (en) | 1983-04-22 | 1983-05-25 | Amersham Int Plc | Detecting mutations in dna |
| IE61148B1 (en) | 1988-03-10 | 1994-10-05 | Ici Plc | Method of detecting nucleotide sequences |
| US5002867A (en) | 1988-04-25 | 1991-03-26 | Macevicz Stephen C | Nucleic acid sequence determination by multiple mixed oligonucleotide probes |
| WO1989010414A1 (en) | 1988-04-28 | 1989-11-02 | Robert Bruce Wallace | AMPLIFIED SEQUENCE POLYMORPHISMS (ASPs) |
| US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| US5424186A (en) | 1989-06-07 | 1995-06-13 | Affymax Technologies N.V. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
| FR2650840B1 (fr) | 1989-08-11 | 1991-11-29 | Bertin & Cie | Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications |
| WO1992001813A1 (en) | 1990-07-25 | 1992-02-06 | Syngene, Inc. | Circular extension for generating multiple nucleic acid complements |
| ATE244065T1 (de) | 1990-12-06 | 2003-07-15 | Affymetrix Inc | Verfahren und reagenzien für immobilisierten polymersynthese in sehr grossem masstab |
| US6004744A (en) | 1991-03-05 | 1999-12-21 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer |
| US5422252A (en) | 1993-06-04 | 1995-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Simultaneous amplification of multiple targets |
| US5858659A (en) | 1995-11-29 | 1999-01-12 | Affymetrix, Inc. | Polymorphism detection |
| EP0730663B1 (en) | 1993-10-26 | 2003-09-24 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes on biological chips |
| US5631734A (en) | 1994-02-10 | 1997-05-20 | Affymetrix, Inc. | Method and apparatus for detection of fluorescently labeled materials |
| US6015880A (en) | 1994-03-16 | 2000-01-18 | California Institute Of Technology | Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix |
| US5807522A (en) | 1994-06-17 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for fabricating microarrays of biological samples |
| KR19980701336A (ko) * | 1995-01-13 | 1998-05-15 | 아서 에스. 모겐스턴 | 균류의 검출 및 확인을 위한 핵산 표지체(nucleic acid probes for the detection and identification of fungi) |
| US5589136A (en) | 1995-06-20 | 1996-12-31 | Regents Of The University Of California | Silicon-based sleeve devices for chemical reactions |
| ATE199572T1 (de) | 1995-11-21 | 2001-03-15 | Univ Yale | Unimolekulare segmentamplifikation und bestimmung |
| AU2320597A (en) | 1996-03-19 | 1997-10-10 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide |
| US6134854A (en) | 1998-12-18 | 2000-10-24 | Perstorp Ab | Glider bar for flooring system |
| AUPQ909000A0 (en) | 2000-07-28 | 2000-08-24 | University Of Sydney, The | A method of detecting microorganisms |
| US20040010129A1 (en) * | 2001-11-01 | 2004-01-15 | Po-Hsiang Hsu | Nucleic acid kit for bacterial pathogen diagnosis and method for using the same |
| AUPS115502A0 (en) | 2002-03-18 | 2002-04-18 | Diatech Pty Ltd | Assessing data sets |
| JP2003284559A (ja) | 2002-03-28 | 2003-10-07 | Masao Nasu | 細菌種同定方法 |
| WO2003106676A1 (ja) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 | 微生物同定用プローブ及びそれを用いた同定方法 |
| CN1291997C (zh) | 2002-10-25 | 2006-12-27 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种提取细菌mRNA的方法 |
| KR100611056B1 (ko) * | 2002-12-16 | 2006-08-10 | 학교법인 포항공과대학교 | 병원성 미생물 검출을 위한 올리고뉴클레오티드마이크로칩 및 이를 이용한 병원성 미생물 검출방법 |
| JP2004313181A (ja) | 2003-04-02 | 2004-11-11 | Canon Inc | 感染症起炎菌検出用プローブ及びプローブセット、ならびに担体及び遺伝子検査方法 |
| JP2007014351A (ja) | 2003-04-02 | 2007-01-25 | Canon Inc | 感染症検出用プローブ、遺伝子検出用のプローブ、感染症起炎菌増幅反応用プライマー、感染症起炎菌増幅反応用プライマーセット及び感染症起炎菌検出方法 |
| US20050142584A1 (en) * | 2003-10-01 | 2005-06-30 | Willson Richard C. | Microbial identification based on the overall composition of characteristic oligonucleotides |
| US7381547B2 (en) * | 2004-04-28 | 2008-06-03 | Tzam Diagnostics, Llc | Methods and compositions to detect bacteria using multiplex PCR |
| US7763426B2 (en) | 2004-11-01 | 2010-07-27 | The Regents Of The University Of California | Probes and methods for detection of Escheridia coli and antibiotic resistance |
| CN1683565A (zh) | 2005-03-15 | 2005-10-19 | 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 | 一套检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针及其用途 |
| CN100368560C (zh) | 2005-09-22 | 2008-02-13 | 广州华银医药科技有限公司 | 一种呼吸道病原体的实时荧光聚合酶链式反应检测方法 |
| US8741565B2 (en) | 2005-12-30 | 2014-06-03 | Honeywell International Inc. | Oligonucleotide microarray for identification of pathogens |
| JP4914142B2 (ja) | 2006-08-04 | 2012-04-11 | キヤノン株式会社 | 検査装置 |
| EP1953247A1 (en) | 2007-01-31 | 2008-08-06 | GC Corporation | A method for measuring the number of oral streptococci, and a PCR primers-probe set used for the same |
| EP1997905A1 (en) * | 2007-06-01 | 2008-12-03 | Friesland Brands B.V. | Nucleic acid amplification |
| EP3604558B1 (en) * | 2010-02-17 | 2022-10-12 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods to detect atopobium vaginae nucleic acid |
| GB201021399D0 (en) | 2010-12-16 | 2011-01-26 | Genetic Analysis As | Oligonucleotide probe set and methods of microbiota profiling |
| GB201102693D0 (en) | 2011-02-16 | 2011-03-30 | Genetic Analysis As | Method for identifying neonates at risk for necrotizing enterocolitis |
| WO2012139122A1 (en) | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Azzazy Hassan Mohamed Ei-Said | Detection of nucleic acids using unmodified gold nanoparticles |
| EP2753713B1 (en) | 2011-09-08 | 2017-07-19 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid |
| KR20130046321A (ko) | 2011-10-27 | 2013-05-07 | 한국외국어대학교 연구산학협력단 | 식중독 세균 Staphylococcus aureus 탐지용 탐침자 및 그를 포함한 DNA 칩 |
| CN103352257B (zh) * | 2012-05-08 | 2014-08-27 | 马庆伟 | 制备细菌核酸指纹特征谱库的方法 |
| US20140106974A1 (en) * | 2012-10-15 | 2014-04-17 | Synblex, Llc | Pathogen identification process and transport container |
| US9707555B2 (en) | 2012-11-30 | 2017-07-18 | Qvella Corporation | Method for pretreatment of microbial samples |
| CN103614326B (zh) | 2013-11-27 | 2016-05-04 | 峨眉山绿地生态农业开发有限公司 | 一种高温堆肥促腐细菌复合菌剂及其应用 |
| WO2015095796A1 (en) * | 2013-12-20 | 2015-06-25 | President And Fellows Of Harvard College | An engineered genetic enteric sensor bacteria and uses thereof |
| CN103952417B (zh) * | 2014-04-15 | 2016-01-20 | 天津大学 | 枯草芽孢杆菌双组分调控系统突变基因yvrH及应用 |
| US20170204452A1 (en) | 2014-07-23 | 2017-07-20 | Steffen Mergemeier | Method for the detection of sepsis |
| NL2013266B1 (en) | 2014-07-25 | 2016-05-19 | Microbiome Ltd | Novel test for microbial blood infections. |
| CN104372072A (zh) * | 2014-07-29 | 2015-02-25 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量pcr方法 |
| CA2988415A1 (en) | 2015-06-04 | 2016-12-08 | Basf Se | Recombinant microorganism for improved production of fine chemicals |
| CN105483251A (zh) | 2015-12-31 | 2016-04-13 | 上海星耀医学科技发展有限公司 | 一种用于检测痰液中细菌的探针、试剂盒和方法 |
-
2018
- 2018-05-17 WO PCT/AU2018/050471 patent/WO2018209398A1/en active Search and Examination
- 2018-05-17 KR KR1020197037291A patent/KR102640361B1/ko active IP Right Grant
- 2018-05-17 AU AU2018267693A patent/AU2018267693A1/en active Pending
- 2018-05-17 US US16/614,697 patent/US11739389B2/en active Active
- 2018-05-17 JP JP2020514306A patent/JP7377544B2/ja active Active
- 2018-05-17 EP EP18801880.8A patent/EP3625358A4/en active Pending
- 2018-05-17 CA CA3063283A patent/CA3063283A1/en active Pending
- 2018-05-17 CN CN201880047409.5A patent/CN110914458A/zh active Pending
-
2019
- 2019-11-17 IL IL270723A patent/IL270723A/en unknown
- 2019-12-12 ZA ZA2019/08301A patent/ZA201908301B/en unknown
-
2023
- 2023-05-29 JP JP2023087731A patent/JP2023113746A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6054278A (en) | 1997-05-05 | 2000-04-25 | The Perkin-Elmer Corporation | Ribosomal RNA gene polymorphism based microorganism identification |
| JP2016520314A (ja) * | 2013-05-29 | 2016-07-14 | イミューンエクスプレス・プロプライエタリー・リミテッドＩｍｍｕｎｅＸｐｒｅｓｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ | 微生物マーカーおよびその使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2018267693A1 (en) | 2020-01-16 |
| ZA201908301B (en) | 2022-07-27 |
| EP3625358A1 (en) | 2020-03-25 |
| EP3625358A4 (en) | 2021-02-24 |
| CA3063283A1 (en) | 2018-11-22 |
| JP7377544B2 (ja) | 2023-11-10 |
| JP2023113746A (ja) | 2023-08-16 |
| JP2020520251A (ja) | 2020-07-09 |
| CN110914458A (zh) | 2020-03-24 |
| US11739389B2 (en) | 2023-08-29 |
| IL270723A (en) | 2020-01-30 |
| KR20200009054A (ko) | 2020-01-29 |
| US20200071749A1 (en) | 2020-03-05 |
| WO2018209398A1 (en) | 2018-11-22 |
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