JPH08507690A - 特異的プライマー及びプローブセットを使用するｈｌａ−ｂタイピングの方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、試料中に存在するかもしれない、エクソン２の３０〜３３位（番号付けは、ZemmourとParham，1992による）のＧＣＣＡ配列により特徴付けられる１つ以上のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をタイピング又はサブタイピングする方法に関し、この方法は、少なくとも下記：

Description

【発明の詳細な説明】 特異的プライマー及びプローブセットを使用するＨＬＡ−Ｂタイピングの方法 本発明は、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のＤＮＡタイピングのための方法及び試薬に 関する。 本発明の基礎となっている技術的問題は、特に血清学的方法により識別するの が困難である、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の識別を可能にする特異的プライマー及び プローブセットを使用したＤＮＡタイピング方法を提供することである。 ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系は、第６染色体の短腕上の一連の連結遺伝子より なる。３つのクラスの遺伝子が定義されている：第１５染色体上にコードされる 、β２ミクログロブリンと非共有結合で結合しているα鎖よりなるクラスＩ抗原 （ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）；α鎖及びβ鎖よりなるクラス11抗原（ＤＰ、ＤＱ、Ｄ Ｒ）；補体系の成分に対応するクラスIII産物。クラスＩ及びクラスII抗原は、 多型性の膜通過型糖タンパクであり、抗原提示における共通の免疫学的役割を共 有する。ＨＬＡクラスＩに制限された外来抗原の提示により、成熟Ｔリンパ球中 に細胞毒性のＴ細胞リセプターが現われる。更に、クラスＩ及びクラスII抗原は 、移植の免疫学及び自己免疫疾患の罹病性において重要な役割を占める。 多くの座に広範囲な多型（polymorphism）が存在する。これらの抗原の生物学 的及び医学的重要性の観点から、ＨＬＡタイピングのための高感度で迅速な方法 が求められている。これまで異なるプロトコールが使用されてきた。それらは、 血清学的方法、細胞学的 方法及びＤＮＡに基づく制限断片長多型（restriction fragment polymorphism ）（ＲＦＬＰ）法及び最近の配列特異的オリゴヌクレオチド（sequence specifi c oligonucleotide）（ＳＳＯ）ハイブリダイゼーション法である。オリゴヌク レオチドハイブリダイゼーションによるＤＮＡタイピングは、完全な配列分析に 次いでＨＬＡ多型性の最も優れた直接の定義を与える。しかし、配列分析は費用 と時間がかかるため、ルーチンの使用には適さない。 多型性はＨＬＡ抗原の機能にとって根本的に重要であり、多くは機能的に重要 な細胞外ドメインをコードするエクソンに局在する。 クラスＩ遺伝子については、多くの多型はアミノ末端α１とα２ドメインに局 在する。α３ドメインは、高度に保存されたイムノグロブリン様ドメインである 。全部で４０個のＨＬＡ−Ａ、６４個のＨＬＡ−Ｂ、及び２４個のＨＬＡ−Ｃ対 立遺伝子が同定されている（ZemmourとParham，Tissue Antigens，40：221-228 ，1992）。異なる対立遺伝子間の相違は、α１及びα２ドメインの特定の領域に 発生する。異なる対立遺伝子間に、複数の短い相同部分が存在するパッチワーク パターンが発生する。相同組み換えやエクソンシャフリング（exon shuffling） のような遺伝学的機構により、座特異的（locus specific）対立遺伝子の多様性 が生じる（ParhamらPNAS（USA）85：4005-4009，1988）。 非常に多型性のクラスＩ及びクラスII座の異なる対立遺伝子を識別するために 、異なるタイピング法が開発されてきた。これらの異なるタイピング法の概要を 以下に示す： 血清学的方法：ミクロ毒性試験（microtoxicity test）におい て、異なるＨＬＡクラスＩ又はクラスII抗原に対する抗血清を、溶解した精製リ ンパ球と一緒にインキュベートする。溶解した細胞はエオシン又は他の色素で染 色されるが、一方溶解されない細胞は染色されないままである。この方法は、ク ラスＩＡ、Ｂ、Ｃ対立遺伝子及びクラスIIＤＲ及びＤＱ対立遺伝子に使用される 。ＤＰ対立遺伝子は、発現のレベルが低すぎ抗血清の入手が困難なため、タイピ ングできない。クラスII対立遺伝子の反応は、精製したＢリンパ球上で行われる 。超定型的（supertypic）な群の対立遺伝子の限定された測定は、更なるサブタ イピングなしに可能である。ＨＬＡ−Ｃ座の３個の対立遺伝子は、血清学的に未 解明のままである。ＨＬＡ分子上のエピトープが検出されるため、α鎖及びβ鎖 間の識別は不可能でありαβヘテロダイマーが同定される。クラスII分子に対す るアロ血清（allosera）は、しばしば抗クラスＩが混入しており、使用の前に吸 収する必要がある。同一又は異なる座上の対立遺伝子間で交差反応が発生し、こ れにより結果の解析が困難になっている。モノクローナル抗体が使用されるとし ても、交差反応の問題は解決されない。本法は非常に迅速な方法（完全なタイピ ングに３時間）であるが、不完全で誤った結果が得られることが大きな問題であ る。 細胞学的方法：放射線照射されたホモ接合体タイピング細胞による刺激に対す るＴ細胞培養の増殖応答に基づいて、混合リンパ球反応（mixed lymphocyte rea ction）（ＭＬＲ）が開発された。増殖は、Ｈ³−チミジンの取り込みにより測定 される。本法は、ＤＲ及びＤＱ対立遺伝子のＨＬＡクラスIIタイピングのために 使用され る。ＤＰは膜発現のレベルが低いため、ＤＰタイピングは不可能である。これら の分析は、血清学的特異性を更に細分するＤＷ特異性を規定した。ＨＬＡ−ＤＷ 特異性は、ＤＲ及びＤＱ抗原により決定されるが、これはほとんどいつもＤＲ及 びＤＱ座上のある特定の対立遺伝子と関連している。ＨＬＡ−ＤＰタイピングに ついては、２次的ＭＬＲを行うことができる。この分析は、インビトロ（試験管 内）の２次的又は記憶応答（invitro sacondary or memory responses）に基づ く。放射線照射された刺激細胞にリンパ球が応答した時には、培養の１０日後こ れらは芽細胞の広がりから小リンパ球の産物へ逆戻りする。これらの細胞は、タ イピングすべき、そして最初の陽性反応を与えた１次刺激細胞と抗原を共有する 照射された刺激細胞に対して、培養においてより強力で加速した応答を与える能 力を有する（FestensteinとOllier，1987）。本分析法は、極めて完全で正確で あるが、非常に時間がかかり実施は困難である。抗原の表面発現と関係しないと いう利点を有する、異なるＤＮＡタイピング法が開発された。これらのＤＮＡタ イピング法の概要を示す： 制限断片長多型（ＲＦＬＰ）法：高分子量ＤＮＡを幾つかの制限酵素で消化し 、ゲル電気泳動により大きさに従い分離し、フィルターにブロットし、ＨＬＡ− ＤＱＡ、ＤＱＢ、ＤＰＢ又はＤＲＢのｃＤＮＡプローブにハイブリダイズさせる 。異なる対立遺伝子について明確なパターンのバンドが得られる。異なる制限部 位の多型性を見い出すため、また使用される異なる酵素を決定するために配列分 析が使用された。しかしこの方法は幾つかの欠点を有する：大量 の高分子量ＤＮＡが必要とされること、さほど多くない対立遺伝子しか識別する ことができないこと、幾つかの制限酵素の使用、表現型では無関係な特異的アミ ノ酸の差異の検出。 ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）（ＰＣＲ）法：全ての クラスII対立遺伝子の配列は公知であるため、多型領域を増幅するために座特異 的プライマーを設計することができる。増幅後、大量の特異的配列がＲＦＬＰ分 析又はＳＳＯハイブリダイゼーションにより分析される。ＰＣＲ産物は、異なる 制限酵素により消化することができ、断片を電気泳動によりゲル上で分離できる 。代替法はハイブリダイゼーション法である。配列特異的オリゴヌクレオチド（ ＳＳＯ）を設計する。ハイブリダイゼーションは、従来法のドットブロット法で 行うことができる。ＰＣＲ産物は、膜に共有結合し、³²Ｐ標識ＳＳＯにハイブリ ダイズする。他の標識方法も可能である。陽性シグナルの検出は、オートラジオ グラフィーにより行われる。全てのＳＳＯは長さ及びＧＣ含有量が異なるため、 従来法のドットブロット法では異なるＳＳＯには異なるハイブリダイゼーション 温度が必要であろう。 ＨＬＡクラスＩ抗原に関する従来法の血清学的及び細胞学的タイピング法は、 充分確立している。しかし、抗血清の特異性、自己抗体の存在又は薬物療法のた め、誤った結果が発生することがある。ＨＬＡ−Ｂについては、下記のタイプで タイピングの問題が目立って経験される： ＤＮＡに基づくタイピング系は、これらの難しいＨＬＡ−Ｂタイプの同定を大 きく改良し加速するであろう。その結果、これは、臓器及び骨髄移植の成功率及 びかかる総費用に有益な影響をもたらす。移植の成功率と、提供者と受容者のＨ ＬＡ−Ｂ適合性との間には高い相関が存在するという充分な証拠がある。 更により正確なＨＬＡ−Ｂタイピングはまた、疾患罹病性の研究及び法医学的 調査を相当に改善又は容易にするであろう。 一般に、簡便、迅速かつ信頼できるＤＮＡタイピング法が使用可能であれば、 ＤＮＡタイピング法は、血清学的タイピング法よりも好適であることに注意すべ きである。これは、サブタイプレベルのある差異（これはＤＮＡ法では通常検出 可能である）が、同種移植片拒絶を引き起こすにも拘らず、現在の血清学的タイ ピング法により検出されないためである（Fleischhauerら，New Eng．J.Med． 323：1818-1822，1990）。 ＨＬＡクラスII遺伝子の定義に関して分子生物学の応用が成功したのとは対照 的に、クラスＩ分子タイピングの開発は未だに困難である。これは、この領域の 著しい多型性、ヌクレオチド置換の複雑さ及び多くの非古典的クラスＩ遺伝子と 偽遺伝子の存在による。クラスＩ抗原は、血清学的交差反応性群（ＣＲＥＧ）を 規定するほとんどＨＬＡ−Ａ及び−Ｂ抗原内の、異なる対立遺伝子との交差反応 性により特徴付けられる。ＨＬＡ−Ａ及びＢ対立遺伝子は、各々５個及び１０個 の古典的ＣＲＥＧ群に分類される。現在までのところ、全ての公知のＨＬＡ−Ａ 特異性は配列決定されており、このためこれらの交差反応を説明する配列の相同 性が規定され、そして最近、配列特異的プライマー（ＳＳＰ）を用いてポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用できるようになった。これとは対照的に、ＨＬＡ −Ｂ対立遺伝子は、より広範囲の多型性、及び高レベルの交差反応性により特徴 付けられる。更に、Ｂ対立遺伝子の大部分は、未だ配列決定されていない。交差 反応性とＤＮＡ配列の間の相関には、幾つかの矛盾が存在する。 クラスIIと比較すると、クラスＩ対立遺伝子のＰＣＲとＤＮＡプローブタイピ ングを扱っている文献の数は限定されている。Yoshidaらの論文（1992，下記を 参照）を除いて、本発明の主題である対立遺伝子はこれらの研究には含まれてい ない。Summersら（Hum．Immunol．32：176-182，1991）は、配列決定のためのク ラスＩ対立遺伝子のＰＣＲの使用を記載している。Ｂ４４対立遺伝子（Ｂ^*４４ ０１、Ｂ^*４４０２）の識別のための、ＰＣＲと、 オリゴヌクレオチドプローブを用いる古典的ドットハイブリダイゼーションの組 合せが、Fleischhauerら（N.Eng．J.Med．323：1818-1822，1990）により記載さ れている。 ２つの研究グループが、ＨＬＡ−Ｂ２７対立遺伝子のＤＮＡタイピングとサブ タイピングについて報告している（Hillら，The Lancet，337：640-642，1991； Dominguezら，Immunogenetics 36： 1992）は、ＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ａ２８対立遺伝子のＰＣＲ増幅に続くオリ ゴヌクレオチドタイピングを記載しており；そして増幅不応性増幅系（amplific ation refractoryamplification systemを使用する、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子のよ り一般的なタイピング法が、最近Krausaらにより記載されている（The Lancet， 341：121-122，1993）。 Yoshidaら（Hum．Immunol．34：257-266，1992）も、ＰＣＲを古典的ドットブ ロット法及び／又は１本鎖確定多型分析（single strand confirmation polymor phism analysis）と組合せた。彼らは、２６個のＨＬＡ−Ｂ特異性のタイピング のためのＰＣＲ−プライマーとプローブの組合せを設計した。彼らのタイピング 法は、主に、Ｂｗ４とＢｗ６スープラタイプ（supratypes）を識別するプライマ ーを用いるディフェレンシャル増幅の使用、及びＨＬＡ−Ｂ特異的５’−側プラ イマーの使用に基づいている。記載したプライマーセットとプローブにより、こ の著者らは下記の対立遺伝子を識別しなかった：Ｂ^*５４０１、Ｂ^*７８０１及び Ｂ^*７９０１（これらは従来法でもタイピングが難しい）。対立遺伝子間の配列 の 差異が、彼らのプライマーで増幅した領域の外側に位置しているため、Ｂ^*５２ ０１とＢ^*５２０１２や、Ｂ５３とＢ５１対立遺伝子も彼らは識別できなかった 。 従って本発明は、ハイブリダイゼーション法により１つ以上のＨＬＡ−Ｂ対立 遺伝子をＤＮＡタイピング又はサブタイピングするための方法を提供することを 目的とする。 更に詳しくは、本発明は、対応する血清学的タイピング法では問題があるか、 又は不可能であるこれらＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の、ＤＮＡタイピング及び／又は サブタイピングのための方法を目的とする。血清学的タイピング法では問題のあ る主要な対立遺伝子は、下記のものである： 別の実施態様により、本発明は、上記リストから選択されるような血清学的タ イピング法では問題のあるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のＤＮＡタイピングを可能にす る配列特異的オリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。 更に別の実施態様により、本発明は、上記リストから選択されるような血清学 的タイピング法では問題のあるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のＤＮＡタイピングを可能 にする配列特異的プライマーを提供することを目的とする。 本発明はまた、少なくとも１つの上述の配列特異的オリゴヌクレオチド及び／ 又は特異的プライマーよりなる組成物又は固体支持物を提供することを目的とす る。 更に詳しくは、本発明の方法は、特異的なプライマー（ＳＰ）により、血清学 的タイピング法では問題のある対立遺伝子に対応する、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の 特異的サブセットのエクソン２を増幅すること、及び続いて増幅産物を、ＨＬＡ −Ｂのエクソン２の増幅領域を含む配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の 適切なセットにハイブリダイズさせることを目的とする。 本発明はまた、上記リストから選択されるような血清学的タイピング法では問 題のあるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のＤＮＡタイピングのためのキットを提供するこ とを目的とする。 本発明は、新規な方法と試薬を提供することにより、上述の目的を満たしてい る。更に詳しくは、特異的プライマー（ＳＰ）と配列特異的オリゴヌクレオチド （ＳＳＯ）の特異的なセット、及びこれと一緒になってＨＬＡ−Ｂ遺伝子の対立 遺伝子をタイピングするた めの迅速、簡便かつ正確な系を提供するその方法を実行するためのキットを提供 することにより、本発明は、上述のニーズを満たしている。 本発明による新規な方法と試薬により、以前には未知のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子 が発見され、またこれらの対立遺伝子を本法によりタイピング及び同定すること ができる。Ｂ７６、Ｂ７７、Ｂ６１、Ｂ６７及びＢ５９のような、幾つかの他の タイプ（上記の表にはリストされていない）もまた、血清学によるタイピングは 困難である。核酸配列は未知であるが、これらの特異性が本発明の方法を使用し てタイピングできるかどうかを予測することが時々可能なことがある。これは、 本明細書ではＢ７１について例示される。 「タイピング又はサブタイピング」という表現は、生物学的試料に存在するタ イプ又はサブタイプを決定及び／又は識別することとして理解されるべきである 。タイプ又はサブタイプにより、そのタイピング方法により識別される全ての変 異体が理解される。１つの対立遺伝子のタイプを識別する場合には、タイピング 方法は、その特異的対立遺伝子の存在を決定する。 公式に認められた血清学的タイプ（ＨＬＡ特異性とも呼ばれる）及びこれらの 対応する対立遺伝子（配列が公知であれば）は、毎年更新される参照リストに集 められる（Bodnerら，Tissue Antigens，39：161-173，1992）。 本発明の方法は、増幅プライマーの特定のセット（ＳＰとも呼ばれる）を用い る、恐らく試料中に存在するＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のサブセットのエクソン２の 増幅に基づく。続いて増幅産物を、 ＤＮＡプローブの適切なセット（ＳＳＯとも呼ばれる）とハイブリダイズさせ、 その後形成されたハイブリッドを検出し、生成したハイブリダイゼーションパタ ーンからＨＬＡ−Ｂタイプを導きだす。本法では、特に、血清学的方法により区 別するのが困難であるか、又は全然区別できないタイプの同定を目的としており 、５’末端増幅プライマーが、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のエクソン２の３０〜３３ 領域（ZemmourとParham，1992により与えられた番号付けによる）を特異的に標 的とすることが特に有利である。これらの著者により与えられた配列データによ り、本発明により決定することができる全ての公知の対立遺伝子は、エクソン２ の３０〜３３位に下記の配列を有している：５’−ＧＣＣＡ−３’。このため、 この配列で終わる増幅プライマーは、必要な全ての対立遺伝子を増幅し、同時に 他の多くのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子（エクソン２の３０〜３３位の対応する５’− ＴＣＣＧ−３’配列により特徴付けられる）のエクソン２の増幅を除外して、こ れによりＤＮＡタイピング法を相当に単純化する。ＤＮＡ配列が公知（Zemmour とParham，1992）であり、３０〜３０位の５’−ＧＣＣＡ−３’配列により特徴 づけられるＨＬＡ−Ｂエクソン２対立遺伝子を第１表にリストする。 このように本発明は、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のエクソン２の３０〜３３位（番 号付けは、ZemmourとParham，1992による）の５’−ＧＣＣＡ−３’配列により 特徴づけられる試料中の１つ以上のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をタイピング又はサブ タイピングするための方法に関し、更に詳しくは、例えばＢ５４（２２）、Ｂ５ ２（５）、Ｂ７８０１、Ｂ６２（１５）、Ｂ７５（１５）、 Ｂ７１（７０）、Ｂ７２（７０）、Ｂ４６、Ｂ７９、Ｂ５３、Ｂ５１０２、Ｂ５ １０３及びＢ５８（１７）のような、血清学的には識別が困難であるＨＬＡ−Ｂ タイプを識別する方法に関し、この方法は少なくとも下記の工程よりなる： （ｉ）場合により試料中の核酸を抽出し、 （ii）ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のエクソン２の３０〜３３位の５’−ＧＣＣＡ− ３’配列により特徴づけられるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の核酸を、下記のリスト： 又は次のようなこれの配列変異体、 又は他の配列変異体（これらの配列変異体は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、 及び／又は挿入、及び／又は置換を含むが、３’末端ＧＣＣＡ配列が保存されて おり、かつこれらの配列変異体が上記のＢ２５Ｐプライマー又はその変異体と同 一のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を特異的に増幅させることができる）から選択される 少なくとも１つの５’末端増幅プライマーと一緒に、上記で定義された５’末端 プライマーと同一の対立遺伝子から選択される適切な３’末端プライマー（５’ 及び３’末端プライマーは、場合により標識されている）と組合せて増幅し；そ して （iii）場合により増幅中又は増幅後に標識された増幅産物を、適切な条件で 、ＨＬＡ−Ｂエクソン２領域の１５〜２６１領域（番 号付けは、ZemmourとParham，1992による）から選択される１つ以上の適切なプ ローブとハイブリダイズさせて、 （iv）適切な洗浄条件で洗浄し、 （ｖ）形成されたハイブリッドを検出し；そして （vi）観察されるハイブリダイゼーションパターンから存在する対立遺伝子を 推定する。 上記に示した本発明の方法を実行するために、当該分野で公知の任意の方法に より試料核酸の抽出を行うことが必要になることがある。ＲＮＡの抽出の場合に は、ｃＤＮＡの作成が必要であり；そうでなければ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ を抽出する。 「プライマー」という用語は、１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列、即ち、 複製される核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成のための開始点として作 用することができる特異的プライマー（ＳＰ）のことをいう。プライマーの長さ と配列は、伸長産物の合成を開始させることができるものでなければならない。 好適には、プライマーは約５〜５０個のヌクレオチドであり、更に好適には約１ ０〜２１個のヌクレオチドである。プライマーの具体的な長さと配列は、必要な ＤＮＡ又はＲＮＡ標的の複雑さ、並びに温度やイオン強度のようなプライマー使 用の条件に依存する。 プライマーの３’末端の最後の３つのヌクレオチドが正確に一致していれば、 増幅プライマーが、適正な増幅を保証するために、対応する鋳型配列と正確に一 致する必要はないという事実は、文献上詳細に報告されている（Kwokら，Nuclei c Acids Research 18：999-1005，1990；SommerとTautz，Nucleic Acids Resear ch 17， 6749，1989）。 「プローブ」という用語は、検出すべき対立遺伝子の標的配列に、正確に相補 的な配列を有する、１本鎖の配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）のことを いう。 好適には、これらのプローブは、約５〜５０個のヌクレオチドの長さ、更に好 適には約１０〜１８個のヌクレオチドである。 「適切な」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件という表現は、ほとんどの場 合にそのプローブが、正確に相補的な配列にだけハイブリダイズする事実をいう 。このような条件は、実施例の項に例示される。例えばプローブ１７については 、好適なハイブリダイゼーション及び洗浄温度は、ハイブリダイゼーション及び 洗浄溶液として３ＭのＴＭＡＣが使用されるならば、各々５４℃及び５８℃であ る。一般に、ハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知のとおり厳重にす べきである（例えば、Maniatisら，Molecular Cloning：A Laboratory Manual， New York，Cold Spring Harbor Laboratory，1982）。 しかし、ハイブリダイゼーション溶液（ＳＳＣ、ＳＳＰＥなど）により、これ らのプローブは、充分な特異性を得るためにこれらの適切な温度でハイブリダイ ズさせるべきである（ほとんどの場合に、１つの点変異のレベルで差異が識別さ れるはずである）。 上述の５’末端プライマーは、Ｂ２５Ｐプライマーと呼ばれる。 「試料」という用語は、任意の起源の生物学的物質であり、例えば血液のしみ 、毛髪、上皮細胞又は末梢血液細胞のことをいう。典型的な試料は、末梢血単核 細胞（ＰＢＭＮＣ）、リンパ芽球様細 胞株（lymphoblastoid cell line）（ＬＣＬ）、毛髪細胞などを含む。好適な単 離された核酸は、ゲノムＤＮＡである。しかし、細胞質性、細胞性及びポリ（Ａ ）＋ＲＮＡも使用できる。 「観察されるハイブリダイゼーションパターンから存在する対立遺伝子を推定 する」という表現は、オリゴヌクレオチドプローブのパネルの結合のパターンを 解析することによる、試料中に存在するＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を同定（決定又は 識別ともいう）することよりなる、本発明のＨＬＡ−Ｂタイピング法の中心的特 徴のことをいう。単一のプローブも有用な情報を提供するかもしれないが、種々 のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子が天然に分散しており、任意の１つのプローブが独特に 特異的な変異体を同定することができることは稀である。むしろ、実施例に示さ れるように、対立遺伝子の同一性は、オリゴヌクレオチドプローブのパネルの結 合のパターンから推定され、このパターンは、異なるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の異 なるセグメントに特異的である。これらのオリゴヌクレオチドプローブの選択に 依存して、公知の各対立遺伝子は、プローブの特異的組合せの使用による特異的 なハイブリダイゼーションパターンに対応する。各対立遺伝子はまた、オリゴヌ クレオチドプローブの選択に依存して、同一プライマーで増幅された他の任意の 対立遺伝子から識別することができる。例えば、１つ以上の未知のＨＬＡ−Ｂ対 立遺伝子を含有する試料についての陽性にハイブリダイズするプローブの生成し たパターンを、第１表に示す予測されるハイブリダイゼーションパターンのスキ ームと比較することにより、その試料に存在するＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を明確に 推定することが可能になる。 標的の対立遺伝子はエクソン２の３’末端の配列が多少異なるため（Zemmour とParham，1992）、目的の全ての対立遺伝子の特異的な増幅を達成するために、 異なる３’末端プライマーを５’末端プライマー（Ｂ２５Ｐ又はその変異体）に 組合せるべきである。 このように、本発明は上記で定義された方法に関し、更に、少なくとも１つの 下記の３’末端増幅プライマー（Ｂ２３）： 又は他の配列変異体（これらの配列変異体は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、 及び／又は挿入、及び／又は置換を含むが、これらの配列変異体は、上記のＢ２ ３Ｐ１プライマー又はその変異体であるＢ２３Ｐ２若しくはＢ２３Ｐ３と同一の ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を特異的に増幅させることができ、またそのプライマーは 、場合によりビオチンのような検出可能な標識を与えられている）を使用するこ とを特徴とする方法に関する。 示されるように、これらのプライマーは更に、各々Ｂ２３Ｐ１、Ｂ２３Ｐ２及 びＢ２３Ｐ３と呼ばれる。Ｂ２３Ｐ１及びＢ２３Ｐ２プライマーは、ＨＬＡ−Ｂ エクソン２の２４１〜２６１領域を標的とし；Ｂ２３Ｐ３プライマーは、２１９ 〜２３７領域を標的とする（ZemmourとParham，1992による番号付け）。ＤＮＡ 配列が上述の プライマーの３’末端と完全に一致する対立遺伝子が、表１に同定される。 これらのデータから、目的の全てのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を増幅するためには 、プライマーセット Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１ による増幅を、下記のセット： Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ２、又は Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ３ の１つと少なくとも組合せるべきであることが結論される。 表１に与えられたデータから、幾つかの対立遺伝子は、１つのプライマーセッ トでのみ増幅され、他の組合せのセットでは増幅されないことも結論される。例 えば、特にＢ^*４６０１又はＢ^*７８０１は、Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１プライマーセ ットでのみ増幅される。これに対して、例えばＢ^*１５０３又はＢ^*５８０１対立 遺伝子は、各々Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１とＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ３、及びＢ２５Ｐ／ Ｂ２３Ｐ２とＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ３で増幅される。 また、この利用可能な配列データ（ZemmourとParham，1992）から、５’末端 プライマーのＢ２５Ｐ又はその変異体と組合せられるならば、ＨＬＡ−Ｂエクソ ン２対立遺伝子の特定の部分の増幅が達成される、他の３’末端増幅プライマー が選択できることも言及されるべきである。 本発明の１つの実施態様においては、選択した２つのプライマーセットによる 増幅を異なる反応試験管で行い、増幅産物を図１のタイピングスキームに示され るように別々にハイブリダイズさせる。 本発明の別の実施態様においては、選択した２つのプライマーセットによる増 幅を異なる反応試験管で行い、増幅産物を増幅後混合して一緒にハイブリダイズ させる。 本発明の好適な実施態様においては、関係する異なるプライマー（Ｂ２５Ｐ、 Ｂ２３Ｐ１とＢ２３Ｐ２、又はＢ２５ＰＮＢ２３Ｐ１とＢ２３Ｐ３のいずれか） を混合して、増幅を単一の反応試験管で行い、その後増幅産物を一緒にハイブリ ダイズさせる。 使用される増幅方法は、ＰＣＲ法（Saikiら，Science 239：487-491，1988） 、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ法，Guateli，PNAS(USA)；87：1874-187 8，1990；Compton，Nature；350：91-92，1991）、転写に基づく増幅系法（ＴＡ Ｓ法，Kwohら，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)86：1173-1177，1989）、鎖置換増幅 法（ＳＤＡ法，Duckら，Biotechniques 9：142-147，1990；Walkerら，Proc.Nat l.Acad.Sci.(USA)89：392-396，1992）、Ｑβレプリカーゼによる増幅法（Lizar diら，Bio/Technology 6：1197-1202，1988；Lomeliら，Clin.Chem．35：1826-1 831，1989）又はプライマー伸長を使用して核酸分子を増幅するような任意の他 の適した方法であってよい。増幅中、増幅産物は、標識プライマーを使用するか 、又は標識ヌクレオチドを取り込んで標識することが便利である。標識物は、ア イソトープ（³²Ｐ、³⁵Ｓなど）であっても、又は非アイソトープ（ビオチン、ジ ゴキシゲニンなど）であってもよい。 増幅した対立遺伝子を相互に区別するために、選択した増幅プライマー領域間 に位置するＨＬＡ−Ｂエクソン２領域を標的とする配 列特異的ＤＮＡプローブ（ＳＳＯとも呼ばれる）のセットに、増幅産物をハイブ リダイズさせる。従来法のドットブロット形式、サンドイッチハイブリダイゼー ション又は逆ハイブリダイゼーション（例えば、逆ドットブロット形式）のよう な、異なるハイブリダイゼーション形式を使用することができる。目的の対立遺 伝子を相互に、及び記載した他の対立遺伝子（これらの対立遺伝子がホモ接合状 態で存在しているにせよ、又はヘテロ接合状態で存在しているにせよ）から区別 することのできる、ＤＮＡプローブの特定のセットが選択された。 この目的のために、実施例の項に説明されるように、ＴＭＡＣ（塩化テトラメ チルアンモニウム）のハイブリダイゼーション及び洗浄条件で、機能するように 設計されている２０個の基本のＤＮＡプローブ配列を同定した。これらのプロー ブの大部分は、ＨＬＡ−Ｂエクソン２の最可変領域を標的とし、２つ以上のＨＬ Ａ−Ｂ対立遺伝子にハイブリダイズさせうる。幾つかのプローブは、対立遺伝子 特異的であるために選択された；これらのプローブは、プローブ８（ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ１４）、１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１８）、及び１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２２）であり、これらは各々Ｂ^*５４０１、Ｂ^*４６０１、及びＢ^*７９０１ にのみハイブリダイズする。異なるプローブに標的にされる領域は、図２にスキ ームとして表される。表２には、プローブの配列が示される。説明を表１に示す 。更に、実施例５と表２−２で再検討されるように、ＳＳＰＥに特異的なハイブ リダイゼーション及び洗浄条件で、同じ２０個の基本のプローブ又はその変異体 を試験した。表２−２に示 されるように、使用した特異的ＳＳＰＥ緩衝液条件の下では、元のＴＭＡＣ試験 プローブの中の９個と新規変異体プローブの幾つかが、他のものに比べて特に好 適である。 従って本発明は、１つ以上のハイブリダイゼーションプローブが、表２（ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ７〜２６）、又はその変異体［この配列変異体は、主にその末端 （３’又は５’のいずれか）に１つ以上のヌクレオチドの欠失、及び／又は挿入 、又は幾つかの本質的でないヌクレオチド（即ち、対立遺伝子間を識別するため に必須ではないヌクレオチド）の他のもの（イノシンのような修飾ヌクレオチド を含む）による置換を含むか；或はこの変異体は、任意の上述のオリゴヌクレオ チドプローブに対する相補鎖よりなるか；或はこの変異体は、デオキシリボヌク レオチドの代わりにリボヌクレオチドよりなるが、この変異体のプローブは、こ れらが誘導されたオリゴヌクレオチドプローブと同じ特異性でハイブリダイズさ せうる］から選択される上記で定義された方法に関する。 上記は、異なるが厳重なハイブリダイゼーション及び洗浄条件（異なる溶液、 異なる濃度の緩衝液、異なる濃度のプローブ、異なる温度）下で、これらが誘導 されたプローブと同じ特異性でハイブリダイズするプローブとして、本発明のこ の面で意図される変異体を定義しうることを意味する。このような変異体は、例 えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２７〜５２（表２−２）に与えられた配列に含まれる 。 ハイブリダイゼーション溶液（ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＴＭＡＣなど）に従って、 充分な特異性を達成するために、これらのプローブ を、その適切な温度で厳重にハイブリダイズさせるべきである（ほとんどの場合 に、１つの点変異のレベルで差異が識別されるはずである）。しかし、その末端 （３’又は５’のいずれか）で少数のヌクレオチドを添加又は削除するか、或は 幾つかの本質的でないヌクレオチド（即ち、対立遺伝子間を識別するために必須 でないヌクレオチド）を他のもの（イノシンのような修飾ヌクレオチドを含む） により置換することにより、表２にリストされたＤＮＡプローブをわずかに修飾 することにより、これらのプローブ又はその変異体を、同一のハイブリダイゼー ション条件（即ち、同一の温度及び同一のハイブリダイゼーション溶液）で特異 的にハイブリダイズさせうる。使用されるプローブの量（濃度）を相互に関連さ せて変化させることも、より特異的なハイブリダイゼーション結果を得るために 有益であろう。これに関連して、ＳＳＰＥに基づく緩衝液とは反対に、そのＧＣ 含量に関係なく同じ長さのプローブは、ＴＭＡＣ溶液中でほぼ同じ温度で特異的 にハイブリダイズすることに注意すべきである（Jacobsら，Nucleic Acids Rese arch 16：4637-4650，1988）。 異なるハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液条件を利用する好適な基本の及 び変異体のプローブは、本発明の実施例の項で説明する。これらの好適なプロー ブの幾つかは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７〜５２に含まれる。 本発明の主題である対立遺伝子の中で、Ｂ^*１５０１とＢ^*１５０４は、これら の配列が第２エクソンにおいて全く同一であるため、相互に識別することができ ない。両方の対立遺伝子間 の差異は、エクソン３の５’末端に見い出される（ZemmourとParham，1992）。 同じ理由で、Ｂ^*５１０１〜Ｂ^*５１０４は、区別しえない。これらの対立遺伝子 についても、識別はエクソン３で行いうる（ZemmourとParham，1992）。従って 、より完全なタイピング系は、エクソン３のタイプを識別するためのプライマー 及びプローブの組合せを含むであろう。 プライマー対Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ２が使用され、ハイブリダイゼーションがＳ ＳＯの７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３）と９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５）で観察さ れる上述のＤＮＡタイピング法は、好適には更に別々にプライマー対Ｂ２５Ｐと Ｂ２３Ｐ１及び／又はＢ２３Ｐ３プライマーで行われる。この後者の適用のため に、Ｂ２５Ｐプライマーの代わりに下記の配列： を使用することができる。 実施例の項に詳細に説明されるように、追加の増幅工程は、ＨＬＡ−ＡＲ偽遺 伝子（Ｂ２３Ｐ２プライマーが使用される時）の同時増幅（co-amplification） が発生する可能性を除外し、そしてより正確なＨＬＡ−Ｂタイピング法を可能に する。 オリゴヌクレオチドプローブと試料中の核酸配列間に形成されるハイブリッド を検出するための、本発明の目的に適切な分析法は、当該分野で公知の任意の分 析法よりなる。例えば、この検出は、ドットブロット形式を使用して、非標識増 幅試料を膜に結合させ、適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、この 膜に少なく とも１つの標識プローブを取り込み、そして結合したプローブの存在をモニター することにより行うことができる。プローブは放射性アイソトープで標識しても よいし、発色性又は化学発光性検出を可能にする標識物で標識してもよい（例え ば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合プローブ）。 代替法として、増幅配列が標識を含む「逆」ドットブロット形式がある。この 形式では、非標識オリゴヌクレオチドプローブを固体支持体に結合させて、適切 で厳重なハイブリダイゼーション及び続いての洗浄条件下で標識試料に暴露する 。試料中の核酸と本発明によるオリゴヌクレオチドプローブ間のハイブリッドの 形成に依存する任意の他の分析法も使用しうることは理解されるべきである。 １つの有利な実施態様では、生物学的試料中に含まれるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子 のタイピング法は、遺伝物質から誘導された増幅コピーを、上記で定義されたプ ローブが前もって固定化された固体支持体と接触させる工程よりなる。 「固体支持体」という用語は、オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイゼ ーション特性を保持し、かつハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベル が低く保持される限り、このようなプローブが結合することができる任意の基質 のことをいう。通常固体支持体は、マイクロタイタープレート、膜（例えば、ナ イロン又はニトロセルロース）又は微小球（ビーズ）である。 膜への適用又は固定の前に、固定を容易にするために、又はハイブリダイゼー ション効率を改善するために、核酸プローブを修飾するのが便利であろう。この ような修飾は、ホモポリマーテーリング （homopolymer tailing）、脂肪族基、ＮＨ₂基、ＳＨ基、カルボキシル基のよう な異なる反応性基との結合、又はビオチン又はハプテンとの結合を包含する。 別の有利な実施態様では、生物学的試料中に含有されるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子 のタイピング法は、遺伝物質から誘導された増幅コピーを、固体支持体に平行線 として固定化されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程よりなる。 本発明のこの好適な実施態様では、上記で定義された方法によるＨＬＡ−Ｂ対 立遺伝子のタイピングのために、固定化及び逆相ハイブリダイゼーション分析へ の組み込み（好適には膜ストリップのような固体支持体上に平行線として固定化 ）のために、１つ以上の上記で定義されたプローブが使用される。 この有利な方法により、プローブは、ラインプローブアッセイ（Line Probe A ssay）（ＬｉＰＡ）形式で固定化される。これは、便利にはその上に２０個以上 のオリゴヌクレオチドプローブ（陰性又は陽性対照のオリゴヌクレオチドを含む ）が平行線として適用される膜ストリップを使用する逆ハイブリダイゼーション 形式（Saiki，PNAS(USA)；86：6230-6234，1989）である。ＬｉＰＡストリップ は、Stuyverら（J.Gen.Virol．74：1093-1102，1993）により記載されたように 調製される。 従って本発明はまた、上記で定義された１つ以上のプローブが、平行線の形で 支持体の表面に結合している固体支持体（好適には膜ストリップ）に関する。 ＬｉＰＡは、非常に迅速で使いやすいハイブリダイゼーション試 験である。結果は、増幅の開始後４時間で読むことができる。通常非アイソトー プ標識が増幅産物に組み込まれている増幅、及びアルカリ性変性の後、増幅産物 を膜上のプローブに接触させ、ハイブリダイゼーションを約１〜１．５時間行う 。簡単に洗浄（１０〜３０分）後、検出操作を開始する。これら全ての工程は、 同一のハイブリダイゼーション容器中で行われ、このため手作業の時間を少なく することができる。生成したハイブリダイゼーションパターンから、存在するＨ ＬＡ−Ｂ対立遺伝子を、視覚的にしかし好適には専用のソフトウェアを使用して 推定することができる。ＬｉＰＡ形式は、市販されている走査装置に何の問題も なく適合し、従って結果の自動解釈は非常に信頼性の高いものとなる。これら全 ての利点により、ＬｉＰＡ形式はルーチン設定でのＨＬＡタイピングの使用に適 している。ＬｉＰＡ形式は、ルーチンの血清学的方法にタイピングが困難な対立 遺伝子をタイピングするために特に有利であろう。 本発明はまた、公知のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子とは異なる、新規ＨＬＡ−Ｂ対立 遺伝子を検出し同定するための方法に関し、この方法は下記の工程よりなる： − 上記で定義した方法により、生物学的試料中に存在するＨＬＡ−Ｂ対立遺 伝子を決定し、 − 表２に定義されるものに対応するハイブリダイゼーションパターンを生成 しない試料を観察した場合は、決定されるべき新規ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の異常 にハイブリダイズするプローブに対応する、ＨＬＡ−Ｂエクソン２配列の部分を 配列決定する。 本発明のプローブセットにより、配列が公知である対立遺伝子を識別しうるの みでなく、実施例３で例証されるように未知の配列を有する対立遺伝子を検出す ることもできる。この実施例では、プローブ１３を使用してＢ７１がＢ７２（Ｂ^* １５０３）から区別できることが示される。これは、血清学に基づくＢ７１と Ｂ７２の識別に問題があるため、特に有利である。 従って本発明は、上記で定義される方法を使用して、Ｂ７２（Ｂ^*１５０３） とＢ７０群（Ｂ７０、Ｂ７１、即ち、Ｂ^*１５０３とは異なる対立遺伝子）の非 Ｂ７２ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を識別する方法に関し、ここで、非Ｂ７２ＨＬＡ対 立遺伝子は、Ｂ^*１５０３対立遺伝子［例えば、プローブ１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９）、プローブ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３）、プローブ１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１６）、プローブ１８（ＳＥＱＩＤ ＮＯ２４）、及びプローブ１９ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２５）］にハイブリダイズする少なくとも１つのプロー ブとはハイブリッドを形成しない。 これらの新規な対立遺伝子が一旦使用可能になると、これら新規対立遺伝子の 特異的検出を可能にする新規プローブを推定することができる。表１にリストさ れる２０個の基本のプローブのセットにこれらのプローブを追加することにより 、本タイピング法の識別力と信頼性のレベルが改善される。 本発明はまた、更に上記で定義された方法により決定される、核酸配列レベル で未決定のＢ７０ＨＬＡ−Ｂタイプに対応する新規ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子に関し 、ここで、この対立遺伝子は、プロー ブ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８、表２を参照のこと）とはハイブリッドを形成する が、プローブ１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９、表２参照）とはハイブリッドを形 成せず、かつこの対立遺伝子は、ヌクレオチド１９２〜２０９（番号付けは、Ze mmourとParham，1992による）の範囲の領域の少なくとも１個のヌクレオチドの 位置でＨＬＡ−ＢのＢ７０対立遺伝子であるＢ^*１５０３とは異なっている。 本発明はまた、下記のリスト： 又は次のようなこれの配列変異体、 又は他の配列変異体（これらの配列変異体は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、 及び／又は挿入、及び／又は置換を含むが、３’末端ＧＣＣＡ配列が保存されて おり、かつこれらの配列変異体が上記のＢ２５Ｐプライマー又はその変異体と同 一のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を特異的に増幅させることができる）、 又は次のような、これの配列変異体、 又は他の配列変異体（これらの配列変異体は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、 及び／又は挿入、及び／又は置換を含むが、これらの配列変異体は、上記のＢ２ ３Ｐ１プライマー又はその変異体であるＢ２３Ｐ２若しくはＢ２３Ｐ３と同一の ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を特異的に増幅させることができ、また、そのプライマー は、場合によりビオチンのような検出可能な標識物を与えられており、かつその プライマーは場合により固体支持体に固定されている）から選択される少なくと も１つのオリゴヌクレオチド増幅プライマーよりなる組成物に関する。 好適にはこのような組成物は、上記のリストから選択される少なくとも２つ以 上の増幅プライマーを含む。更に好適には、増幅プライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ ２３Ｐ１が、少なくとも１つの下記のセット： Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ２、又はＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ３ と組み合わせられる。 上述の成分に追加して、この組成物はまた、少なくとも１つの下記のプライマ ー： よりなってもよい。 本発明はまた、下記のプローブのリスト： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１１、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１４、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１７、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２０、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２３、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２５、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２ ６（表２に与えられる）、 又はその配列変異体［この配列変異体は、主にその末端（３’又は５’のいずれ か）に１つ以上のヌクレオチドの欠失、及び／又は挿入、又は幾つかの本質的で ないヌクレオチド（即ち、対立遺伝子間を識別するために必須ではないヌクレオ チド）の他のもの（イノシンのような修飾ヌクレオチドを含む）による置換を含 むか；或はこの変異体は、任意の上述のオリゴヌクレオチドプローブに対する相 補鎖よりなるか；或はこの変異体は、デオキシリボヌクレオチドの代わりにリボ ヌクレオチドよりなるが、この変異体のプローブは、これらが誘導されたオリゴ ヌクレオチドプローブと同じ特異性でハイブリダイズさせうる］から選択される 少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブよりなる組成物に関する。このよ うな変異体は、例えば、下記のプローブのリスト： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２９ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３５ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５１、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５２（表２−２に与え られる） から選択されてよい。 好適にはこのような組成物は、少なくとも２つ、３つ又はそれ以上のこれらの プローブを含有する。 本発明はまた、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を含むかもしれない生物学的試料から、 少なくとも１つのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をタイピングするためのキットに関し、 このキットは、下記の成分： − 適宜、上記で定義される任意のプライマーから選択される少なくとも１つ の増幅プライマー、 − 少なくとも１つのプローブ（このプローブは、好適には固体基質上に、更 に好適には１つの同一の膜ストリップ上に固定されており、かつこのプローブは 、上記で定義される任意のプローブから選択される）、 − 緩衝液、又はこれらのプローブと増幅産物間のハイブリダイゼーション反 応を可能にする緩衝液を調製するために必要な成分、 − 適宜、前記ハイブリダイゼーションから生じるハイブリッドを検出するた めの手段、よりなる。 本発明はまた、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を含むかもしれない生物学 的試料から、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をタイピングするためのキ ットに関し、更に詳しくは、血清学的には識別するのが困難なＨＬＡ−Ｂタイプ を含むかもしれない試料から、この試料中に存在するＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をコ ードするヌクレオチドの増幅に続いて、上記で定義される方法による１つ以上の プライマーセットの組合せを使用する、下記： − 少なくとも１つのプローブ（このプローブは、好適には固体基質上に、更 に好適には１つの同一の膜ストリップ上に固定されており、かつこのプローブは 、上記で定義される任意のプローブから選択される）、 − 緩衝液、又はこれらのプローブと増幅産物間のハイブリダイゼーション反 応を可能にする緩衝液を調製するために必要な成分、 − 前記ハイブリダイゼーションから生じるハイブリッドを検出するための手 段、 − 場合により結果を解釈し、観察されるハイブリダイゼーションパターンか ら存在する対立遺伝子を推定するための、自動走査及び解釈装置も含む、キット に関する。 図と表の凡例 図１：本発明によるタイピング法のスキームによる表示。 図２：ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のエクソン２を表す軸上への本発明のプライマーとプ ローブの局在。番号付けは、ZemmourとParham，1992による。 図３：１３の患者試料と７つの対照から得られた増幅（上のパネル）及びドッ トブロットハイブリダイゼーション（下のパネル）結 果。実施例１及び２に記載されるように、試料をプライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ ２３Ｐ１を使用して増幅し、ドットブロットし、そしてプローブ６（ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ１２）及び１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２３）とハイブリダイズさせた。 図４：Ｂ７０変異体対立遺伝子及びＢ４６対立遺伝子を含む、１５の試料（ｎ °１〜１５）について得られたドットブロットハイブリダイゼーションの結果。 増幅した物質をナイロン膜に適用した。続いてこれらの膜を、示されるように ＳＳＯ−プローブ１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９）、１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １８）、１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２１）、６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２）、及 び２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８）とハイブリダイズさせた。結果を、実施例ＳＳＯ ３及び４で検討し、表３に要約した。 表１：本発明のプライマーセットで増幅したＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子（エクソン ２）。対立遺伝子中の３’末端プライマー配列の存在、及び１９ＳＳＯ−プロー ブのセットとのハイブリダイゼーションパターンも示される。 表２：ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のタイピング用ＳＳＯ−プローブのパネル。 表２−２：逆ハイブリダイゼーション（ラインプローブアッセイ、ＬｉＰＡ） 形式で使用するために、試験されるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のタイピング用ＳＳＯ −プローブのパネル。これら全てのプローブは、表２に与えられた基本セットの ２０個のＳＳＯから誘導される。好適なプローブは、「＋」として示される。 表３：実施例３及び４で記載される５個のＳＳＯ−プローブとハイブリダイズ させた１５の増幅試料から得られたハイブリダイゼーション結果の要約。図４も 参照。 表４：２０個のオリゴヌクレオチドプローブを固定したＬｉＰＡストリップで 得られたハイブリダイゼーション結果。各々増幅１及び２（実施例６参照）後に 得られた試料とのハイブリダイゼーション後の陽性ハイブリダイゼーションシグ ナルは、「＋」として示される。 略語 ＴＭＡＣ：塩化テトラメチルアンモニウム ＳＳＯ：配列特異的オリゴヌクレオチド ＤＩＧ１１−ｄｄＵＴＰ：ジゴキシゲニン−１１−２’，３’−ジデオキシ−ウ リジン−５’−三リン酸 ＤＩＧ：ジゴキシゲニン ＡＭＰＰＤ：３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”− ホスホリルオキシ）−フェニル−１’，２−ジオキセタン ＡＰ：アルカリ性ホスファターゼ 実施例 実施例１．プライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１によるあるＨＬＡ−Ｂ対立遺 伝子の特異的増幅 実施例により、１つのプライマーセットでの増幅特異性を説明する。図３に示 したように、１２の試料と７つの対照をプライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１及び４）で 増幅した。細胞物質から出発して、標準的プロトコールによりゲノムＤＮＡを調 製した。ゲノムＤＮＡ約０．５μｇを、各プライマー１２．５pmoles；２００mM の各ｄＮＴＰ（Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden）；１０mMのト リスＨＣｌ（ｐＨ８．５）；５０mMのＫＣｌ；１mMのＭｇＣｌ₂；０．０１％の ゼラチン；０．０２５％のＮＰ−４０及びＴａｑ（Thermusaquaticus）ＤＮＡポ リメラーゼ（Boerhinger，Mannheim GmbH，FRG）１単位を含有する、２倍の蒸留 水で最終容量５０μｌに調整したＰＣＲ緩衝液と混合した。試料を９５℃で１０ 分間加熱して、各９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間、そして ＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Thermal Cycler）（Techne and Perkin-Elmer Cetus Corp.，Norwalk，CT）中で、７２℃で１０分間の最終延長でＰＣＲのサイ クルを３５回行った。増幅産物を１．５％ゲル電気泳動により性状解析した。 結果を図３に示した。増幅可能な対立遺伝子が存在する全ての試料中に、入手 できる配列データにより予測されるように、臭化エチジウム染色後に約２４６塩 基対の明瞭なバンドを観察した。 試料１、４、５、６、８、９、１０、１１、及び１２は、Ｂ^*７８０１対立遺 伝子を含んでいた（図１にＢＳＮＡ、ＢＸＩ又はＢＴｅ７６として示した）。試 料２と３及び対照１５では、Ｂ８対立遺伝子（Ｂ^*０８０１）を見い出した。試 料１６〜１９は、各々Ｂ３５、Ｂ５５、Ｂ５６及びＢ５４のホモ接合体の対照で あった。陰性対照（１３及び１４は、各々Ｂ^*３７０１及びＢ^*１８０１対立遺伝 子を含んでいた）では、バンドを観察できなかった。これら の対立遺伝子には、エクソン２の３０〜３３位に５’−ＧＣＣＡ−３’の代わり に５’−ＴＣＣＧ−３’配列があった（ZemmourとParham，1992）。 実施例２．Ｂ７８対立遺伝子の検出のためのドットブロットタイピング測定 本実施例では、プローブ６及び１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２及び２３）を使 用した、Ｂ^*７８０１対立遺伝子の特異的タイピングを説明する。Ｂ^*７８０１は 、両方のプローブ（６及び１７）とハイブリダイズする唯一の対立遺伝子である ため、プライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１で増幅した他の対立遺伝子からＢ^* ７８０１を識別することができる。 配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯ）を化学合成し、ジゴキシゲ ニン−１１−２’，３’−ジデオキシ−ウリジン−５’−三リン酸（ＤＩＧ−１ １−ｄｄＵＴＰ）とＤＮＡデオキシヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼを 用いてその３’末端を標識した。１３の試料と７つの対照を、実施例１で記載し たようにプライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１で増幅した。 次にＰＣＲ産物２μｌを、ナイロン膜（Hybond N Plus，Amersham，Buckingha mshire，UK）上にドットブロットし、フィルターを０．４ＮのＮａＯＨ中で５分 間浸漬することにより変性させ、そして１０×ＳＳＰＥ（生理食塩水リン酸ナト リウムＥＤＴＡ）１０ml中で１５分間中和した。ブロッティング後、５０mMのト リス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％のＳＤＳ、２mMのＥＤＴＡ、３ＭのＴＭ ＡＣ（塩化テトラメチルアンモニウム、 Janssen Chimica，Geel，Belgium）を含有するハイブリダイゼーション溶液１０ ml中で、５４℃で３０分間、膜を予備的にハイブリダイズさせた。ハイブリダイ ゼーションのために、ＳＳＯ−６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２）（５２℃）を除い て、５４℃で１時間、この予備的ハイブリダイゼーション溶液に３pmol/mlのＤ ＩＧ標識ＳＳＯを添加した。過剰のプローブを除去するために、（２×ＳＳＰＥ 、０．１％ＳＤＳ）中で２回、室温で１０分間、次いでハイブリダイゼーション 溶液中で１５分間厳密に５８℃で、フィルターを洗浄した（５４℃で洗浄したＳ ＳＯ−６を除く）。 抗ＤＩＧアルカリ性ホスファターゼ、Ｆａｂ断片（抗−ＤＩＧ−ＡＰ）を使用 して非アイソトープ検出を行い、化学発光性基質ＡＭＰＰＤ［３−（２’−スピ ロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）−フェニル −１，２−ジオキセタン］により可視化した。水気を切った膜を、カセット中で １５〜３０分間Ｘ線フィルム（X-omat AR5，Kodak）に暴露した。このオリゴタ イピング法で使用した全ての試薬は、Boerhinger，Mannheim GmbH，FRGから購入 した。結果を図３に示した。Ｂ７８タイプの対立遺伝子が存在する（ＢＳＮＡ、 ＢＸ１又はＢＴｅ７６）全ての試料が、プローブ６及び１７（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ１２及び２３）と明白にハイブリダイズした。他の試料（ｎ°２、３、７、１ ５、１６、１７、１８、及び１９）は、プローブ１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２３ ）又はプローブ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２）のいずれかとハイブリダイズする が、両方とはハイブリダイズしなかった。試料１３及び１４は、使用したプライ マーセットでは増幅しなかった ため、プローブ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２）とプローブ１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２３）のいずれでもハイブリダイゼーションシグナルは観察されなかった。 実施例３．Ｂ７０変異体のタイピング及びサブタイピング 本実施例では、Ｂ７０変異体を含んでいる７つの試料を使用して、Ｂ７０変異 体のタイピング及びサブタイピングを説明する。ブランクと７つの非Ｂ７０試料 も対照として用いた（表３を参照のこと）。Ｂ７１とＢ７２は、ブロードな抗原 ＨＬＡ−Ｂ７０のサブタイプの対立遺伝子である。Ｂ７２対立遺伝子（Ｂ^*１５ ０３）の配列は文献上公知（ZemmourとParham，1992）であり；Ｂ７１配列は最 近まで公知でなかった。単独特異的なＢ７１及びＢ７２試薬は記載されてなく、 他の抗原（主にＢ３５とＢ６２）の存在によりＢ７０変異体の正確な血清学的指 定が確立していない。Ｂ７０変異体の識別は等電点フォーカシング（isoelectri c focusing）により可能であるが、これはルーチン設定の好ましい方法ではない 。 プライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１及び４）及び 本発明の幾つかのプローブの組合せを使用することにより、Ｂ７２変異体を他の Ｂ７０変異体から区別することができた。ここで強調したいことは、Ｂ７１及び Ｂ７２以外の他の変異体は未だ同定されていないが存在するかもしれないという ことである。 Ｂ７０変異体対立遺伝子を含んでいることが公知（表３の、試料１〜６及び８ ）の一連の試料からＤＮＡを抽出して、実施例１で記載したように増幅した。増 幅産物を５つのナイロン膜に適用し、こ れを更に実施例２で記載したように処理した。これらの膜を各々下記のプローブ のセット：２、６、１２、１３及び１５（ＳＥＱＩＤ ＮＯ８、１２、１８、１ ９及び２１）とハイブリダイズさせた。これらのプローブで得られた結果を図４ に示した。これらの結果を表３に要約した。全ての場合に、７つのＢ７０試料の 内４つに存在するＢ７２変異体（Ｂ^*１５０３）を、Ｂ７１又は他の可能性のあ る変異体から区別することができた。Ｂ^*１５０３（Ｂ７２）は、プローブ２及 び１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８及び１９）とハイブリダイズすることにより特徴 づけられるが、一方他のＢ７０変異体はプローブ１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９ ）と非反応性であった。従って本実施例は、配列情報がない時にでも、対立遺伝 子を識別できる可能性を明白に示している。 実施例４．Ｂ４６変異体のタイピング 実施例３で記載したのと同じ方法、プライマーセット、及びプローブの組合せ を使用して、２つのＢ４６含有試料をタイピングした。図４と表３にタイピング 結果を示した。プローブパネル中のプローブ１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１８）の 存在によって、Ｂ^*４６０１を容易に追跡でき、他の対立遺伝子から明確に区別 できた。プライマーセットＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１／４） により増幅した全ての対立遺伝子の中で、Ｂ^*４６０１はプローブ１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１８）とハイブリダイズした唯一の対立遺伝子であった。 実施例５．ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のタイピングのためのラインプローブアッセイ （ＬｉＰＡ）及びＳＳＯ ラインプローブアッセイ（ＬｉＰＡ）のために好適なハイブリダイゼーション 及び洗浄媒体は、ＳＳＰＥに基づく緩衝液である。基本的にはStuyverら（J.Gen .Virol．74：1093-1102，1993）により記載されたようにＬｉＰＡストリップを 調製した。ＬｉＰＡ形式では全てのプローブが同一のハイブリダイゼーション及 び洗浄条件（同一塩濃度及び温度）下で特異的に反応するため、またＳＳＰＥ中 のＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融点がＧＣ含量とプローブの長さに依存するた め、ＴＭＡＣに基づく緩衝系からＳＳＰＥに基づく緩衝系に変更するために表２ のリストに示したプローブの修飾が幾つかのプローブについて必要になる。 ＬｉＰＡ形式に使用するための最も適したプローブを選択するために、多数の プローブ（表２−２にリストされる）を合成し、ＴＴＰと末端トランスフェラー ゼを使用して３’末端につなぎ、固体支持体（ニトロセルロース膜）に固定した 。 下記のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を使用して、これらのプローブを 標的物質にハイブリダイズさせた。 − ハイブリダイゼーション： − ５×ＳＳＰＥ／０．５％ＳＤＳ − ５５℃ − 洗浄： − ２×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ − ５５℃ （１×ＳＳＰＥは、０．１８ＭのＮａＣｌ、０．０１ＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、１mMの ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）である） 上述の条件下で特異性と感度に関して最良の試験結果を示したプローブを、更 にＬｉＰＡストリップ上での使用のために選択した。これらのプローブを表２− ２に陽性（＋）として評点した。ＴＭＡＣ緩衝系で使用された２０プローブの内 ９つだけ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ７ｂ、１１、１２、１３、１８、１９、２１、２３ 及び２４）が、ＳＳＰＥに基づく系で修飾なしに使用することができた。 これらの結果により、使用されるプローブの配列のわずかな修飾が重要であり 、信頼できるＬｉＰＡ試験の開発のためには細心のプローブ設計が必須であるこ とが明白に証明された。 実施例６．ＬｉＰＡストリップを使用するより代表的なホモ接合性細胞株のタイ ピング プローブ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３）及び９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５）の 配列に対応する配列がそのＨＬＡ−ＡＲ偽遺伝子に存在するため、ＨＬＡ−ＡＲ 偽遺伝子の同時増幅（プライマーＢ２３Ｐ２が使用される時）により、プローブ ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３）及び９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５）によるハイブ リダイゼーション結果はあいまいなものになっている。 陽性のハイブリダイゼーションシグナルのもとを最終的に突きとめるために、 少なくとも１つのＢ２３プライマーと下記の配列： を有するプライマーを使用する追加の増幅を行った。 次に、得られた増幅産物を、少なくともプローブ７と９が固定化 されるストリップとハイブリダイズさせた。 本測定におけるプローブ７及び９についての陽性ハイブリダイゼーションシグ ナルは、プローブ７及び／又は９配列が、分析された試料のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝 子に存在していることを示しており、従ってプローブ７及び／又は９は陽性とす べきである。陰性の結果は、それらの最初の陽性ハイブリダイゼーションシグナ ルは偽遺伝子に由来し、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子自体に由来しないため、１回目の増幅 後の結果の解釈において、これらのプローブは無視すべきであることを意味する 。 プライマーＢ２５ＰとＢ２３Ｐ１／Ｂ２３Ｐ２（増幅１）、及びプライマーＢ ２５Ｘ１とＢ２３Ｐ１／Ｂ２３Ｐ２（増幅２）による別々の増幅後の、幾つかの 選択した試料（ホモ接合性細胞株Ａ〜Ｇ）で得られたハイブリダイゼーション結 果を、表４に要約した。 これらの結果により、試料Ａについて、プローブ７及び９の陽性ハイブリダイ ゼーションシグナルは、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子に由来することが示された。試料 Ｅ及びＦの、プローブ９で得られた陽性シグナルについても同じことがいえた。 増幅工程１及び２後の結果を組合せると、表１の助けにより下記のＨＬＡ−Ｂ 対立遺伝子を推定することができた： 試料 対立遺伝子 Ａ Ｂ^* ０８０１ Ｂ Ｂ^* １５０１ Ｃ Ｂ^* ４００１ Ｄ Ｂ^* ４６０１ Ｅ Ｂ^* ５１０１ Ｆ Ｂ^* ５３０１ Ｇ Ｂ^* ５７０１ 増幅２について下記のプライマーセット： Ｂ２５ＰとＢ２３Ｐ１／Ｂ２３Ｐ３ を使用した時に、基本的に同一の結果が得られた。 配列表 （１）一般情報： （i）出願人： （A）名称：Innogenetics N.V. （B）町：Industriepark Zwijnaarde 7 Bus 4 （C）市：Gent （E）国：ベルギー （F）郵便コード（ZIP）：９０５２ （G）電話：００−３２−０９．２４１．０７．１１ （H）ファックス：００−３２−０９．２４１．０７．９９ （ii）発明の名称： 特異的プライマー及びプローブセットを使用するＨＬＡ−Ｂ タイピングの方法 （iii）配列の数：５３ （iv）コンピューター可続形式： （A）メジウムタイプ：フロッピーディスク （B）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換機 （C）オペレーションシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （D）ソフトウェア：パテントインリリーズ＃１．０、バージョ ン＃１．２５（ＥＰＯ） （２）配列番号（SEQ ID No.）：１の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１９塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプライマーＢ２５Ｐ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*３５０１のエクソン２のヌクレ オチド１５〜３３にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.１： （２）配列番号（SEQ ID No.）：２の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１９塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプライマーＢ２５Ｐ変異種 （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*４００１のエクソン２のヌクレ オチド１５〜３３にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.２： （２）配列番号（SEQ ID No.）：３の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１９塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプライマーＢ２５Ｐ変異種 （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*０８０１のエクソン２のヌクレ オチド１５〜３３にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.３： （２）配列番号（SEQ ID No.）：４の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：２１塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：YES （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプライマーＢ２３Ｐ１ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*４００１のエクソン２のヌクレ オチド２４１〜２６１にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.４： （２）配列番号（SEQ ID No.）：５の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：２１塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：YES （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプライマーＢ２３Ｐ２ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*１３０１のエクソン２のヌクレ オチド２４１〜２６１にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.５： （２）配列番号（SEQ ID No.）：６の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１９塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：YES （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプライマーＢ２３Ｐ３ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*５１０１のエクソン２のヌクレ オチド２１９〜２３７にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.６： （２）配列番号（SEQ ID No.）：７の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*４００１のエクソン２のヌクレ オチド６１〜７８にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.７： （２）配列番号（SEQ ID No.）：８の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トボロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ２ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*０８０１のエクソン２のヌクレ オチド６０〜７７にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.８： （２）配列番号（SEQ ID No.）：９の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ３ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*５１０１のエクソン２のヌクレ オチド６０〜７７にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.９： （２）配列番号（SEQ ID No.）：１０の情報： （ｉ）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ４ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ＊３５０１のエクソン２のヌクレ オチド６０〜７７にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.１０： （２）配列番号（SEQ ID No.）：１１の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ５ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*１５０１のエクソン２のヌクレ オチド１２６〜１４３にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.１１： （２）配列番号（SEQ ID No.）：１２の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ６ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*３５０１のエクソン２のヌクレ オチド１２５〜１４２にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.１２： （２）配列番号（SEQ ID No.）：１３の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ７ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*０８０１のエクソン２のヌクレ オチド１２３〜１４０にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.１３： （２）配列番号（SEQ ID No.）：１４の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ８ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*５４０１のエクソン２のヌクレ オチド１４３〜１６１にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.１４： （２）配列番号（SEQ ID No.）：１５の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ９ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*０８０１のエクソン２のヌクレ オチド１７８〜１９５にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.１５： （２）配列番号（SEQ ID No.）：１６の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１０ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*４００１のエクソン２のヌクレ オチド１７９〜１９６にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.１６： （２）配列番号（SEQ ID No.）：１７の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１１ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*５７０１のエクソン２のヌクレ オチド１７９〜１９６にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.１７： （２）配列番号（SEQ ID No.）：１８の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１２ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*４６０１のエクソン２のヌクレ オチド１８９〜２０６にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.１８： （２）配列番号（SEQ ID No.）：１９の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１３ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*４００１のエクソン２のヌクレ オチド１９２〜２０９にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.１９： （２）配列番号（SEQ ID No.）：２０の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：N0 （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１４ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*０８０１のエクソン２のヌクレ オチド１９１〜２０８にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.２０： （２）配列番号（SEQ ID No.）：２１の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１５ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*５４０１のエクソン２のヌクレ オチド１９２〜２０９にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.２１： （２）配列番号（SEQ ID No.）：２２の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１６ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*７９０１のエクソン２のヌクレ オチド１９１〜２０８にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.２２： （２）配列番号（SEQ ID No.）：２３の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomicＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１７ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*７８０１のエクソン２のヌクレ オチド２１２〜２２９にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.２３： （２）配列番号（SEQ ID No.）：２４の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１８ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*４００１のエクソン２のヌクレ オチド２１１〜２２８にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.２４： （２）配列番号（SEQ ID No.）：２５の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：オリゴヌクレオチドプローブ１９ （B）位置：例えばＨＬＡ−Ｂ^*４００１のエクソン２のヌクレ オチド２２０〜２３７にアニールする （xi）配列の記述：SEQ ID No.２５： （２）配列番号（SEQ ID No.）：２６の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.２６： （２）配列番号（SEQ ID No.）：２７の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１７塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.２７： （２）配列番号（SEQ ID No.）：２８の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１７塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.２８： （２）配列番号（SEQ ID No.）：２９の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１７塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.２９： （２）配列番号（SEQ ID No.）：３０の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１６塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.３０： （２）配列番号（SEQ ID No.）：３１の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１３塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.３１： （２）配列番号（SEQ ID No.）：３２の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１３塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.３２： （２）配列番号（SEQ ID No.）：３３の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１６塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.３３： （２）配列番号（SEQ ID No.）：３４の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１６塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.３４： （２）配列番号（SEQ ID No.）：３５の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１７塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.３５： （２）配列番号（SEQ ID No.）：３６の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１９塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイボセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.３６： （２）配列番号（SEQ ID No.）：３７の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１５塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.３７： （２）配列番号（SEQ ID No.）：３８の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１７塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.３８： （２）配列番号（SEQ ID No.）：３９の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１５塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.３９： （２）配列番号（SEQ ID No.）：４０の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１７塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.４０： （２）配列番号（SEQ ID No.）：４１の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１７塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.４１： （２）配列番号（SEQ ID No.）：４２の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１６塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.４２： （２）配列番号（SEQ ID No.）：４３の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１５塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.４３： （２）配列番号（SEQ ID No.）：４４の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１６塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.４４： （２）配列番号（SEQ ID No.）：４５の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１７塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.４５： （２）配列番号（SEQ ID No.）：４６の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１６塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.４６： （２）配列番号（SEQ ID No.）：４７の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：２０塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.４７： （２）配列番号（SEQ ID No.）：４８の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１９塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.４８： （２）配列番号（SEQ ID No.）：４９の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１７塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.４９： （２）配列番号（SEQ ID No.）：５０の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１９塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.５０： （２）配列番号（SEQ ID No.）：５１の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１５塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.５１： （２）配列番号（SEQ ID No.）：５２の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１６塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （xi）配列の記述：SEQ ID No.５２： （２）配列番号（SEQ ID No.）：５３の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：２０塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：genomic ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：NO （iii）アンチセンス配列：NO （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：他の特徴 （B）位置：９ （D）他の情報：／標準名＝Ｇ又はＣ （ix）配列の特徴： （A）名称／キイ：他の特徴 （B）位置：１２ （D）他の情報：／標準名＝Ｔ又はＡ （xi）配列の記述：SEQ ID No.５３：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ロッソ，リュディ ベルギー国、ベー―2180 エケーレン、ウ ィルヘフーフェストラート 45 (72)発明者 ドゥ・カンク，イルゼ ベルギー国、ベー―2020 アントウェルペ ン、ブス 105、クライスホーフストラー ト 146

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のエクソン２の３０〜３３位（番号付けは、Zemm ourとParham，1992による）の５’−ＧＣＣＡ−３’配列により特徴づけられる 試料中の１つ以上のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をタイピング又はサブタイピングする ための方法であって、更に詳しくは、例えばＢ５４（２２）、Ｂ５２（５）、Ｂ ７８０１、Ｂ６２（１５）、Ｂ７５（１５）、Ｂ７１（７０）、Ｂ７２（７０） 、Ｂ４６、Ｂ７９、Ｂ５３、Ｂ５１０２、Ｂ５１０３及びＢ５８（１７）のよう な、血清学的には識別が困難であるＨＬＡ−Ｂタイプを識別する方法であって、 少なくとも下記の工程： （ｉ）場合により試料中の核酸を抽出し、 （ii）ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のエクソン２の３０〜３３位の５’−ＧＣＣＡ− ３’配列により特徴づけられるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の核酸を、下記のリスト： 又は次のようなこれの配列変異体、 又は他の配列変異体（これらの配列変異体は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、 及び／又は挿入、及び／又は置換を含むが、３’末端に５’−ＧＣＣＡ−３’配 列が保存されており、かつこれらの配列変異体が上記のＢ２５Ｐプライマー又は その変異体と同一のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を特異的に増幅させることができる） から選択され る少なくとも１つの５’末端増幅プライマーと一緒に、上記で定義された５’末 端プライマーと同一の対立遺伝子から選択される適切な３’末端プライマー（５ ’及び３’末端プライマーは、場合により標識されている）と組合せて増幅し； そして （iii）場合により増幅中又は増幅後に標識された増幅産物を、適切な条件で 、ＨＬＡ−Ｂエクソン２領域の１５〜２６１領域（番号付けは、ZemmourとParha m，1992による）から選択される１つ以上の適切なプローブとハイブリダイズさ せて、 （iv）適切な洗浄条件で洗浄し、 （ｖ）形成されたハイブリッドを検出し；そして （vi）観察されるハイブリダイゼーションパターンから存在する対立遺伝子を 推定する、 よりなることを特徴とする方法。 ２． 更に、少なくとも１つの下記の３’末端増幅プライマー： 又は他の配列変異体（これらの配列変異体は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、 及び／又は挿入、及び／又は置換を含むが、これらの配列変異体は、上記のＢ２ ３Ｐ１プライマー又はその変異体であるＢ２３Ｐ２若しくはＢ２３Ｐ３と同一の ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を特 異的に増幅させることができ、またそのプライマーは、場合によりビオチンのよ うな検出可能な標識を与えられている） を使用することを特徴とする、請求の範囲第１項記載の方法。 ３． 少なくとも１つの下記のプライマーセットの組合せ： − Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ２と組合せたＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１、又は − Ｂ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ３と組合せたＢ２５Ｐ／Ｂ２３Ｐ１を増幅のために使 用する、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４． 選択された２つのプライマーセットとの増幅反応が異なる反応試験管で 行われ、増幅産物が別々にハイブリダイズされる、請求の範囲第１項〜第３項の いずれか１項記載の方法。 ５． 選択された２つのプライマーセットとの増幅反応が異なる反応試験管で 行われ、増幅後に増幅産物が混合されて、一緒にハイブリダイズされる、請求の 範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載の方法。 ６． 選択されたプライマーが混合されて、増幅反応が単一の反応試験管で行 われ、その後増幅産物が一緒にハイブリダイズされる、請求の範囲第１項〜第３ 項のいずれか１項記載の方法。 ７． １つ以上のハイブリダイゼーションプローブが、下記のリスト： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２６、 又はその配列変異体［この配列変異体は、主にその末端（３’又は５’のいずれ か）に１つ以上のヌクレオチドの欠失、及び／又は挿入、又は幾つかの本質的で ないヌクレオチド（即ち、対立遺伝子間を識別するために必須ではないヌクレオ チド）の他のもの（イノシンのような修飾ヌクレオチドを含む）による置換を含 むか、或はこの変異体は、任意の上述のオリゴヌクレオチドプローブに対する相 補鎖よりなるか、或はこの変異体は、デオキシリボヌクレオチドの代わりにリボ ヌクレオチドよりなるが、この変異体のプローブは、これらが誘導されたオリゴ ヌクレオチドプローブと同じ特異性でハイブリダイズさせることができ、そして このプローブは、場合により標識されている］、又は脂肪族基、ＮＨ₂、ＳＨ又 はカルボキシル基を含有するその誘導体プローブから選択される、請求の範囲第 １項〜第６項のいずれか１項記載の方法。 ８． 得られた増幅産物が固体支持体に固定化され、予め標識された請求の範 囲第７項記載の任意のプローブと接触させることを特徴とする、請求の範囲第１ 項〜第７項のいずれか１項記載の方法。 ９． 好適には増幅中又は増幅後に標識された、得られた増幅産物を、請求の 範囲第７項記載の少なくとも１つのプローブが予め固 定化された固体支持体と接触させることを特徴とする、請求の範囲第１項〜第８ 項のいずれか１項記載の方法。 １０． 得られた増幅産物を、膜ストリップに平行線として固定化されたオリ ゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせることを特徴とする、請求の範囲 第１項〜第９項のいずれか１項記載の方法。 １１． 請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか１項記載の方法によるＨＬＡ −Ｂ対立遺伝子のタイピングのため、固定化及び逆相ハイブリダイゼーション分 析への組み込み、好適には膜ストリップのような固体支持体上に平行線として固 定化させるための、請求の範囲第７項記載の１つ以上のプローブの使用。 １２． 請求の範囲第７項記載の１つ以上のプローブが、平行線の形で支持体 の表面に結合している固体支持体、好適には膜ストリップ。 １３． 公知のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子とは異なる新規ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を 検出し同定するための方法であって、下記の工程： − 請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか１項記載の方法により、生物学的 試料中に存在する核酸が属するＨＬＡ−Ｂタイプを決定し、 − 表２に定義されるものに対応するハイブリダイゼーションパターンを生成 しない試料を観察した場合は、決定されるべき新規ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の、異 常にハイブリダイズするプローブに対応する、ＨＬＡ−Ｂエクソン２配列の部分 を配列決定する、 よりなることを特徴とする方法。 １４． 請求の範囲第１３項記載の方法を使用して、Ｂ７２（Ｂ^*１５０３） と非Ｂ７２ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子（Ｂ７０、Ｂ７１、即ち、Ｂ^*１５０３とは異 なる対立遺伝子）を識別するための方法であって、この非Ｂ７２ＨＬＡ対立遺伝 子が、Ｂ^*１５０３対立遺伝子［例えば、プローブ１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１ ９）、プローブ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３）、プローブ１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１６）、プローブ１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２４）、及びプローブ１９（Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ２５）］にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブとは ハイブリッドを形成しないことにより特徴付けられる方法。 １５． 請求の範囲第１４項記載の方法により決定される、核酸配列レベルで 未決定のＢ７０ＨＬＡ−Ｂタイプに対応する新規ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子［この対 立遺伝子は、プローブ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８）とはハイブリッドを形成する が、プローブ１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９）とはハイブリッドを形成せず、か つこの対立遺伝子は、ヌクレオチド１９２〜２０９（番号付けは、ZemmourとPar ham，1992による）の範囲の領域の少なくとも１個のヌクレオチドの位置でＨＬ Ａ−Ｂ対立遺伝子Ｂ^*１５０３とは異なっている］、及びこの対立遺伝子由来の オリゴヌクレオチド断片、特にこの対立遺伝子のオリゴヌクレオチド１９２〜２ ０９の範囲の領域よりなる断片。 １６． 下記のリスト： 又は次のようなこれの配列変異体、 又は他の配列変異体（これらの配列変異体は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、 及び／又は挿入、及び／又は置換を含むが、３’末端ＧＣＣＡ配列が保存されて おり、かつこれらの配列変異体は、上記のＢ２５Ｐプライマー又はその変異体と 同一のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を特異的に増幅させることができる）、 又は他の配列変異体（これらの配列変異体は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、 及び／又は挿入、及び／又は置換を含むが、これらの配列変異体は、上記のＢ２ ３Ｐ１プライマー又はその変異体であるＢ２３Ｐ２若しくはＢ２３Ｐ３と同一の ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を特異的に増幅させることができ、また、そのプライマー は、場合によりビオチンのような検出可能な標識物を与えられている）から選択 される少なくとも１つのオリゴヌクレオチド増幅プライマーよりなる組成物。 １７． 下記のプローブのリスト： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１１、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１ ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１ ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２ ０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２ ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２５、又はＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ２６、 又はその配列変異体［この配列変異体は、主にその末端（３’又は５’）に１つ 以上のヌクレオチドの欠失、及び／又は挿入、又は幾つかの本質的でないヌクレ オチド（即ち、対立遺伝子間を識別するために必須ではないヌクレオチド）の他 のもの（イノシンのような修飾ヌクレオチドを含む）による置換を含むか；或は この変異体は、任意の上述のオリゴヌクレオチドプローブに対する相補鎖よりな るか；或はこの変異体は、デオキシリボヌクレオチドの代わりにリボヌクレオチ ドよりなるが、この変異体のプローブは、これらが誘導されたオリゴヌクレオチ ドプローブと同じ特異性でハイブリダイズさせうるものであり、例えば、下記の プローブのリスト： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２９ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３５ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３８ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４１ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５１、又はＳ ＥＱ ＩＤ ＮＯ５２ から選択される変異体である］から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオ チドプローブよりなる組成物。 １８． ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を含むかもしれない生物学的試料から、少なく とも１つのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をタイピングするためのキットであって、下記 の成分： − 適宜、請求の範囲第１６項の任意のプライマーから選択される少なくとも １つの増幅プライマー、 − 少なくとも１つのプローブ（このプローブは、好適には固体基質上に、更 に好適には１つの同一の膜ストリップ上に固定されており、かつこのプローブは 、請求の範囲第１７項の任意のプローブから選択される）、 − 緩衝液、又はこれらのプローブと増幅産物間のハイブリダイゼーション反 応を可能にする緩衝液を調製するために必要な成分、 − 適宜、前記ハイブリダイゼーションから生じるハイブリッドを検出するた めの手段 よりなることを特徴とするキット。 １９． ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を含むかもしれない生物学的試料から、少なく とも１つのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子をタイピングするためのキットであって、更に 詳しくは、血清学的には識別するのが困 難なＨＬＡ−Ｂタイプを含むかもしれない試料から、この試料中に存在するＨＬ Ａ−Ｂ対立遺伝子をコードするヌクレオチドの増幅に続いて、請求の範囲第１項 〜第９項のいずれか１項の方法による１つ以上のプライマーセットの組合せを使 用する、下記： − 少なくとも１つのプローブ（このプローブは、好適には固体基質上に、更 に好適には１つの同一の膜ストリップ上に固定されており、かつこのプローブは 、請求の範囲第１６項の任意のプローブから選択される）、 − 緩衝液、又はこれらのプローブと増幅産物間のハイブリダイゼーション反 応を可能にする緩衝液を調製するために必要な成分、 − 前記ハイブリダイゼーションから生じるハイブリッドを検出するための手 段、 − 場合により結果を解釈し、観察されるハイブリダイゼーションパターンか ら存在する対立遺伝子を推定するための、自動走査及び解釈装置をも含む、キッ ト。