ES2123775T5

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Procedimiento para la tipificacion de hla-b por medio de iniciadores especificos y conjuntos de sondas.

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA TIPIFICAR O SUBTIPIFICAR HLA-B QUE SE CARACTERIZA POR LA SECUENCIA GCCA EN LA POSICION 30 A 33 DE EXON 2 (CON DICHA NUMERACION ESTANDO DE ACUERDO CON ZEMMOUR Y PARHAM, 1992), SUJETO A ESTAR PRESENTE EN UNA MUESTRA, CON DICHO METODO QUE COMPRENDE AL MENOS LOS SIGUIENTES PASOS: I) AMPLIFICAR EL HLA-B CON AL MENOS UN ELEMENTO PRIMARIO DE AMPLIFICACION DEL EXTREMO 5'' DE LA SIGUIENTE LISTA: 5''-AGGTATTTCTACCCGCCA-3'' (B25P) O VARIANTES DE LA SECUENCIA DEL MISMO, EN COMBINACION CON UN ELEMENTO FUNDAMENTAL DEL EXTREMO 3'' APROPIADO ESCOGIDO ENTRE LOS MISMOS QUE LOS ELEMENTOS FUNDAMENTALES ANTES DEFINIDOS DEL EXTREMO 5'', ESTANDO POSIBLEMENTE ETIQUETADOS LOS ELEMENTOS FUNDAMENTALES DE LOS EXTREMOS 5'' Y 3''; II) HIBRIDIZAR EL PRODUCTO AMPLIFICADO, SIENDO ETIQUETADO DURANTE O DESPUES DE LA AMPLIFICACION, EN CONDICIONES APROPIADAS CON UNA O MAS SONDAS ADECUADAS SELECCIONADAS ENTRE LA REGION 15 A 261 DE LA REGION EXON 2 DEL HLA-B, ESTANDO DICHA NUMERACION DE ACUERDOCON ZEMMOUR Y PARHAM, 1992, III) LAVAR EN CONDICIONES DE LAVADO APROPIADAS; IV) DETECTAR LOS HIBRIDOS FORMADOS; Y V) INGERIR EL HLA-B PRESENTA A PARTIR DEL MODELO DE HIBRIDIZACION OBSERVADO.

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C12Q1/6881

Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes

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Inventor: Marc Andrien; Etienne Dupont; Rudi Rossau; Ilse De Canck
Current Assignee The listed assignees may be inaccurate. : Fujirebio Europe NV SA

1994

First worldwide family litigation filed

1994-03-07

Application filed by Innogenetics NV SA

1999-01-16

Application granted

1999-01-16

Publication of ES2123775T3

2005-10-01

Publication of ES2123775T5

2014-03-07

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Description

Procedimiento para la tipificación de HLA-B por medio de iniciadores específicos y conjuntos de sondas.

La invención se refiere a un procedimiento y a reactivos para la tipificación del ADN de los alelos HLA-B.

El problema técnico fundamental de la presente invención es proporcionar un método de tipificación del ADN por medio de conjuntos específicos de sondas e iniciadores que permitan la discriminación de los alelos HLA-B, especialmente aquellos que son difíciles de discriminar mediante medios serológicos.

El sistema Antigénico Leucocitario Humano (HLA) comprende una serie de genes unidos en el brazo corto del cromosoma 6. Se definen tres tipos de genes: los antígenos tipo I (HLA A, B, C) compuestos de una cadena \alpha no asociada covalentemente con la \beta2 microglobulina, codificados en el cromosoma 15; los antígenos de tipo II (DP, DQ, DR) compuestos de una cadena \alpha y una \beta; los productos de tipo III que corresponden a componentes del sistema de complemento. Los antígenos tipos I y II son glicoproteínas transmembranosas polimórficas y comparten un papel inmunológico común en la presentación del antígeno. La presentación restringida por el tipo I HLA de los antígenos extraños conduce a los receptores de las células T citotóxicas en los linfocitos T maduros. Además, los antígenos de tipo I y II juegan un papel crucial en la inmunología del trasplante y en la susceptibilidad a las enfermedades autoinmunes.

Existen extensos polimorfismos en la mayoría de los loci. En vista de la importancia médica y biológica de tales antígenos, es necesaria una técnica rápida y muy sensible para la tipificación de HLA. Se han utilizado hasta ahora distintos protocolos: serológicos, celulares y polimorfismo de fragmentos de resticción basado en el ADN (RFLP) y, recientemente, también métodos de hibridación de oligonucleótidos de secuencia específica (SSO). La tipificación del ADN mediante hibridación de oligonucleótidos proporciona la mejor definición directa de los polimorfismos de HLA cercana al análisis secuencial completo. Sin embargo, el análisis secuencial es caro y lleva tiempo y, por tanto, no es el método a elegir para las aplicaciones rutinarias.

Los polimorfismos tienen un significado fundamental para la función de los antígenos HLA y la mayoría se localizarán en exones que codifican dominios extracelulares importantes funcionalmente.

Para los genes de tipo I, la mayoría de los polimorfismos se localizan en los dominios aminoterminales \alpha1 y \alpha2. El dominio \alpha3 es un dominio de tipo inmunoglobina muy conservado. Se han identificado un total de 40 HLA A, 64 HLA B y 24 HLA C alelos (Zemmour y Parham, Tissue Antigens, 40: 221-228, 1992). Existe diversidad entre los distintos alelos en regiones específicas del dominio \alpha1 y \alpha2. Tiene lugar, entre distintos alelos un patrón en mosaico con fragmentos cortos de homología. Mecanismos genéticos tales como la recombinación homóloga y la mezcla de exones han llevado a la diversidad alélica específica del locus (Parham et al. PNAS (USA) 85:4005-4009, 1988).

Se han desarrollado distintos métodos de tipificación para discriminar entre alelos distintos de los loci muy polimórficos del tipo I y II. Un repaso a estos métodos distintos de tipificación se ofrece seguidamente:

: Serología: En un ensayo de microtoxicidad, antisueros para los distintos antígenos de tipo HLA I o II se incuban con linfocitos lisados purificados. Las células lisadas se tiñen con eosina u otros colorantes, mientras las células no lisadas permanecen sin teñir. Este método se utiliza para los alelos de tipo I A, B, C y los tipos II DR y DQ. Los alelos DP no pueden tipificarse debido a su límite de expresión demasiado bajo y a una disponibilidad limitada de los antisueros. La reacción para los alelos de tipo II se lleva a cabo sobre linfocitos B purificados. Es posible una determinación limitada de grupos supertipos de alelos sin ulterior tipificación. Tres alelos del locus HLA C permanecen serológicamente indefinidos. Debido a que se detectan los epítopos sobre la molécula HLA, la discriminación entre las cadenas \alpha y \beta resulta imposible y se identifica al heterodímero \alpha\beta. Los alosueros contra las moléculas de tipo II están a menudo contaminados por anti-tipo I y requieren ser absorbidos antes de utilizarlos. Tienen lugar reacciones cruzadas entre alelos en el mismo o en distinto locus, lo que hace que el análisis del resultado sea difícil. Aún cuando se utilicen anticuerpos monoclonales, el problema de las reacciones cruzadas no está resuelto. Aunque este es un método muy rápido (3 horas para la tipificación completa), los principales problemas son resultados erróneos e incompletos.

: Métodos celulares: Se ha desarrollado una reacción de mezcla de linfocitos (MLR) basada en la respuesta proliferativa de los cultivos de células T a la estimulación mediante células irradiadas homocigóticas de tipificación. La proliferación se mide mediante incorporación de H^{3} timidina. Este método se utiliza para la tipificación HLA tipo II de los alelos DR y DQ. La tipificación de DP es también imposible debido al bajo nivel de la expresión de su membrana. Estos análisis definen las especificidades DW que subdividen ulteriormente las especificidades serológicas. Las especificidades HLA DW están determinadas por los antígenos DR y DQ, pero se asocian casi siempre con un alelo particular en el locus DR y DQ. Puede llevarse a cabo una MLR secundaria para la tipificación de HLA DP. Este análisis se basa en las respuestas secundarias in vitro o de memoria. Cuando los linfocitos han respondido a las células estimulantes irradiadas, tras 10 días de cultivo revierten desde la expansión de las células blásticas a la producción de pequeños linfocitos. Estas células tienen la capacidad de proporcionar una respuesta más intensa y acelerada en el cultivo a las células estimuladoras irradiadas que deben ser tipificadas y que comparten el antígeno con las primeras células estimuladoras que dieron la reacción positiva inicial (Festenstein y Ollier, 1987). Aunque muy completo y correcto, este análisis lleva mucho tiempo y es difícil de llevar a cabo.

: Se desarrollaron distintos métodos de tipificación del ADN que tienen la ventaja de no estar relacionados con la expresión superficial de los antígenos. Se ofrece un repaso de dichos métodos de tipificación del ADN:

: Métodos del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP): El ADN de alto peso molecular se digiere con varios enzimas de restricción, se separa según el tamaño mediante electroforesis en gel, se emborronan con él los filtros y se hibridiza a sondas cADN HLA DQA, DQB, DPB o DRB. Se obtiene un patrón distinto de bandas para los diferentes alelos. Se utilizó el análisis secuencial para encontrar los distintos polimorfismos de los sitios de restricción y determinar los diferentes enzimas que se debían utilizar. Este método, sin embargo, adolece de ciertas desventajas: se requieren grandes cantidades de ADN de alto peso molecular, no se pueden distinguir muchos alelos, utilización de varios enzimas de restricción y detección de diferencias fenotípicamente irrelevantes de aminoácidos específicos.

: Métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Debido a que las secuencias de todos los alelos de tipo II son conocidas, pueden diseñarse iniciadores locus-específicos para amplificar las regiones polimórficas. Después de la amplificación, grandes cantidades de secuencias específicas se analizan mediante análisis RFLP o mediante hibridación SSO. El producto PCR puede digerirse mediante distintos enzimas de restricción y los fragmentos separarse mediante electroforesis en gel. Una alternativa es el método de hibridación. Se diseñan oligonucleótidos secuencia-específicos (SSO's). La hibridación puede llevarse a cabo mediante un procedimiento convencional de transferencia. Los productos PCR están unidos covalentemente a una membrana e hibridizados a SSOs marcado con ^{32}P. Son posibles otros métodos de marcaje. La detección de las señales positivas se realiza mediante autorradiografía. Debido a que todos los SSOs pueden diferir en longitud y en el contenido en GC, son necesarias posiblemente distintas temperaturas de hibridación para los SSOs distintos en el enfoque convencional de transferencia.

Las técnicas convencionales serológicas y citológicas de tipificación para los antígenos del tipo HLA I están bien establecidas. Sin embargo, pueden tener lugar resultados erróneos debido a la especificidad de los antisueros, a la presencia de auto-anticuerpos o a la medicación. Para HLA-B, existe experiencia de problemas de tipificación con los tipos siguientes:

Denominación serológica	Alelo correspondiente
B54 (22)	B*5401
B52 (5)	B5201/B52012
B78	B*7801
B62 (15)	B1501/B1504
B75 (15)	B*1502
B72 (70)	B*1503
B71 (70)	todavía no conocido
B46	B*4601
B79	B*7901
B58 (17)	B*5801
B53	B*5301
B5102 (B5/B35)	B*5102
B5103 (BTA)	B*5103

Un sistema de tipificación basado en el ADN mejorará mucho y acelerará la identificación de estos tipos HLA-B difíciles. Consecuentemente, esto tendrá un impacto beneficioso en la tasa de éxito de los trasplantes de médula ósea y de órganos y en los costes totales derivados de ello. Existe una amplia evidencia de que existe una alta correlación entre la tasa de éxito de los trasplantes y la compatibilidad HLA-B del donante y del receptor.

Además, una tipificación HLA-B más precisa mejorará o facilitará también los estudios de susceptibilidad a las enfermedades y las investigaciones forenses.

Debe apuntarse que, en general, se preferirán los métodos de tipificación del ADN a los serológicos, siempre que esté disponible un método de tipificación de ADN fácil, rápido y seguro. Esto se debe al hecho de que algunas diferencias a nivel subtipo (que son habitualmente detectables mediante los métodos de ADN) podrían permanecer indetectables mediante los métodos de tipificación serológica habituales, aunque estas diferencias podrían provocar un rechazo del injerto (Fleischhauer et al., N.Eng.J.Med. 323:1818-1822, 1990).

Contrariamente a la aplicación exitosa de la biología molecular para la definición de los genes HLA tipo II, el desarrollo de la tipificación molecular del tipo I permanece difícil. Esto se debe al marcado polimorfismo, a la acusada complejidad de las sustituciones de nucleótidos y a la presencia de numerosos genes y pseudogenes no clásicos de tipo I que existen en esta región. Los antígenos de tipo I se caracterizan por reactividad cruzada entre distintos alelos, sobre todo en los antígenos HLA-A y -B que definen grupos de reactividad cruzada serológica (CREGs). Los alelos HLA-A y B se dividen, respectivamente, en cinco y diez familias CREG clásicas. Hasta la fecha, todas las especificidades HLA-A conocidas se han secuenciado llevando a la definición de homología de secuencia que explica estas reacciones cruzadas y la capacidad reciente para utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando iniciadores específicos de secuencia (SSP). En cambio, los alelos HLA-B se caracterizan por un polimorfismo mayor y por un nivel más alto de reactividad cruzada. Además, una proporción sustancial de los alelos B todavía no se han secuenciado. La correlación entre la reactividad cruzada y las secuencia de ADN presenta algunas discrepancias.

El número de publicaciones que trata de la tipificación de los alelos de tipo I mediante PCR y sondas de ADN es limitado en comparación con las dedicadas al tipo II. Excepto en el caso de la publicación de Yoshida et al (1992, véase más adelante), los alelos que constituyen el objeto de la presente invención no se tienen en cuenta en estos estudios. Summers et al (Hum. Immunol. 32:176-182, 1991) describieron la utilización de la PCR de los alelos de tipo I para secuenciación. La combinación de la PCR y de las hibridaciones clásicas de transferencia con sondas oligonucleótidas para la discriminación de los alelos B44 (B* 4401, B* 4402), se ha descrito por Fleischhauer et al., N.Eng.J.Med. 323:1818-1822, 1990).

Dos grupos de investigadores informaron sobre tipificación y subtipificación del ADN de los alelos HLA-B27 (Hill et al., The Lancet, 337, 640-642, 1991; Dominguez et al., Immunogenetics 36:277-282, 1992). Hernandez-Viña et al. (Hum. Immunol. 33; 163-173, 1992) describieron la tipificación de oligonucleótidos subsiguiente a la amplificación PCR para los alelos HLA-A2 y HLA-A28: y un enfoque de tipificación más general para los alelos HLA-A utilizando el sistema de amplificación refractario ha sido recientemente descrito por Krausa et al. (The Lancet, 341:121-122, 1993).

Yoshida et al. (Hum. Immunol. 34:257-266, 1992) combinaron también la PCR con un enfoque clásico de transferencia y/o un análisis de polimorfismo de confirmación monocatenario. Diseñaron combinaciones de iniciador-PCR y sondas para tipificación de especificidades 26 HLA-B. Su enfoque de la tipificación se basa primariamente en la utilización de amplificación diferencial con iniciadores que discriminan entre subtipos Bw4 y Bw6 y la utilización de un iniciador con un HLA-B específico en el extremo 5'. Con los conjuntos de iniciadores y las sondas que se han descrito, estos autores no discriminaron los alelos siguientes: B* 5401, B* 7801 y B* 7901, los cuales son también difíciles de tipificar mediante los métodos convencionales. Ni pueden discriminar entre B* 5201 y B* 52012, ni entre los alelos B53 y B51, ya que las diferencias secuenciales entre estos alelos se localizan por fuera de la región amplificada con sus iniciadores.

La presente invención se dirige de este modo a proporcionar un método para la tipificación o subtipificación del ADN de uno o más alelos HLA-B mediante un enfoque de hibridación.

Más particularmente, la presente invención se refiere a un método para la tipificación y/o la subtipificación del ADN de aquellos alelos HLA-B para los que los correspondientes procedimientos de tipificación serológica muestran problemas o no son posibles. Los alelos más importantes en relación a los cuales los procedimientos de tipificación serológica muestran problemas son los siguientes

Según otra forma de realización, la presente invención se dirige a proporcionar oligonucleótidos de secuencia específica que permiten la tipificación del ADN de los alelos HLA-B en relación a los cuales los procedimientos de tipificación serológica muestran problemas, tal como los alelos seleccionados a partir de la lista que se presenta anteriormente.

Según todavía otra forma de realización, la presente invención se dirige a proporcionar iniciadores de secuencia específica que permitan la tipificación del ADN de los alelos HLA-B en relación a los cuales el procedimiento de tipificación serológica muestra problemas, tales como los alelos seleccionados a partir de la lista que se presenta anteriormente.

La presente invención se dirige también a proporcionar composiciones o soportes sólidos que comprenden por lo menos uno de los oligonucleótidos de secuencia específica y/o iniciadores específicos anteriormente mencionados.

Más particularmente, el método de la invención se dirige a amplificar el exon 2 de un subconjunto específico de los alelos HLA-B, que corresponde a los alelos en relación a los cuales el procedimiento de tipificación serológica causa problemas, mediante iniciadores específicos (SPs) e hibridizar subsiguientemente los productos amplificados a un conjunto apropiado de oligonucleótidos de secuencia específica (SSOs) que cubren la región amplificada del exón 2 de HLA-B.

La presente invención se dirige asimismo a proporcionar equipos para la tipificación del ADN de alelos HLA-B en relación a los cuales el procedimiento de tipificación serológica causa problemas, tales como los alelos seleccionados de la lista que se ha presentado anteriormente.

La presente invención cumple los objetivos anteriormente mencionados, proporcionando nuevos procedimientos y reactivos. Más particularmente, la presente invención cumple las necesidades anteriomente mencionadas proporcionando un conjunto específico de iniciadores específicos (SPs) y oligonucleótidos de secuencia específica (SS)s), y equipos para llevar a la práctica dichos métodos, que proporcionan juntos un sistema preciso, rápido y sencillo para tipificar los alelos en los genes HLA-B.

El nuevo procedimiento y los reactivos según la invención pueden a su vez conducir al descubrimiento de alelos HLA-B previamente desconocidos, los cuales pueden también tipificarse e identificarse mediante dicho método. También algunos otros tipos (que no se han relacionado en la tabla anterior) pueden causar dificultades de tipificación mediante métodos serológicos, tales como B76, B77, B61, B67 y B59. Aunque las secuencias del ácido nucleico no se conocen todavía, a veces es posible predecir si pueden o no tipificarse estas especificidades utilizando el enfoque de la presente invención. Esto se ejemplificará más adelante en la presente memoria para B71.

La expresión "tipificación o subtipificación" debe entenderse como la determinación y/o la discriminación del tipo o subtipo presente en una muestra biológica. Por tipo o subtipo se entienden todas las variantes que pueden discriminarse mediante dicho método de tipificación. En el caso de discriminar el tipo de un alelo, el método de tipificación determina la presencia de dicho alelo específico.

Los tipos serológicos oficialmente reconocidos (denominados también especificidades HLA) y sus alelos correspondientes (si la secuencia se conoce) están reunidos en una lista de referencia fechada anualmente (Bodner et al., Tissue Antigens, 39:161-173, 1992).

El método de la presente invención se basa en una amplificación del exón 2 de un subconjunto de alelos HLA-B que esté presente posiblemente en la muestra, con conjuntos particulares de iniciadores de amplificación (a los que se hace referencia también como SPs). Subsiguientemente, los productos amplificados se hibridizan a un conjunto apropiado de sondas de ADN (a las que se alude también como SSOs), después de lo cual los híbridos formados se detectan, deduciéndose el tipo de HLA-B a partir del patrón de hibridación generado. En este enfoque, que se dirige particularmente a la identificación de tipos que son difíciles de distinguir o que no son distinguibles en absoluto mediante las técnicas serológicas, es particularmente ventajoso que el iniciador de amplificación del extremo 5' hace diana específicamente en la región 30 a 33 del exón 2 de los alelos HLA B (según la numeración dada por Zemmour y Parham, 1992). Según los datos secuenciales dados por estos autores, todos los alelos conocidos que pueden determinarse según la presente invención tienen la secuencia siguiente en posición 30 a 33 en el exón 2: 5'-GCCA-3'. Por tanto, un iniciador de amplificación que acaba en esta secuencia amplificará todos los alelos deseados, y excluirá simultáneamente la amplificación del exón 2 de otros muchos alelos HLA-B (que se caracterizan por la secuencia correspondiente 5'-TCCG-3' en posición 30 a 33 del exón 2), simplificando de este modo considerablemente el enfoque de la tipificación del ADN. Los alelos del exón 2 de HL-B de los cuales se conoce la secuencia de ADN (Zemmour y Parham, 1992) y que se caracterizan por la secuencia 5'-GCCA-3' en posición 30 a 33 se relacionan en la Tabla
1.

La presente invención se refiere, por tanto a un método para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-B en una muestra caracterizada por la secuencia 5'-GCCA-3' en la posición 30 a 33 del exón de dicho alelo HLA-B (estando dicha numeración de acuerdo con Zemmour y Parham, 1992) y, más particularmente, a un método para discriminar los tipos HLA-B que son serológicamente difíciles de discriminar tales como por ejemplo B54 (22), B52(5), B7801, B62(15), B75(15), B71(70), B72(70), B46, B79, B53, B5102, B5103 y B58(17), comprendiendo dicho método por lo menos las etapas siguientes:

\newpage

(i) posiblemente, extracción del ácido nucleico de la muestra

(ii) amplificación del ácido nucleico de los alelos HLA-B, caracterizado por la secuencia 5'-GCCA-3' en posición 30 a 33 del exón 2 de dicho alelo HLA-B con por lo menos un iniciador de amplificación del extremo 5' seleccionado a partir de la lista siguiente:

5'-AGGTATTTCTACACCGCCA-3' (B25P, SEC ID nº 1)

o sus variantes de secuencia, como:

5'-AGGTATTTCCACACCGCCA-3' (SEC ID nº 2)

5'-AGGTATTTCGACACCGCCA-3' (SEC ID nº 3)

u otras variantes secuenciales, con dichas variantes secuenciales conteniendo deleciones, y/o inserciones, y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, teniendo en cuenta que la secuencia GCCA del extremo 3' se mantenga y que estas variantes secuenciales pueden obtenerse para amplificar específicamente los mismos alelos HLA-B como el iniciador B25P o sus variantes como se ha diseñado anteriormente,

en combinación con un iniciador del extremo 3' apropiado escogido de los mismos alelos que los iniciadores del extremo 5' anteriormente definidos,

estando posiblemente dichos iniciadores de los extremos 5' y 3' marcados e,

(iii) hibridación del producto amplificado, marcándolo posiblemente durante o después de la amplificación, en condiciones apropiadas con una o más sondas apropiadas seleccionadas de la región 15 a 261 de la región del exón 2 de HLA-B, estando dicha numeración de acuerdo con la de Zemmour y Parham, 1992,

(iv) lavado en condiciones de lavado apropiadas,

(v) detección de los híbridos formados, y

(vi) deducción de los alelos presentes a partir del patrón de hibridación observado.

Con el objeto de llevar a cabo el procedimiento de la presente invención tal como se ilustra anteriormente, puede ser necesario realizar una extracción del ácido nucleico de la muestra según alguno de los procedimientos conocidos en la técnica. En caso de extracción de ARN, es necesaria la generación de cADN, extrayéndose de otro modo cADN o ADN genómico.

El término "iniciador" se refiere a una secuencia oligonucleótida de ADN monocatenario o iniciador específico (SPs) capaz de actuar como un punto de iniciación para la síntesis de un producto de extensión del iniciador el cual es complementario a la cadena de ácido nucleico que va a copiarse. La longitud y la secuencia del iniciador deben ser tal que permitan al iniciador la síntesis de los productos de extensión. Preferentemente el iniciador posee alrededor de 5-50 nucleótidos, más preferentemente entre 10 y 21 nucleótidos aproximadamente. La longitud y la secuencia específica del iniciador dependerán de la complejidad de las dianas de ARN o ADN requeridas, así como de las condiciones de la utilización del iniciador tales como temperatura y fuerza iónica.

El hecho de que los iniciadores de amplificación no tengan que emparejarse exactamente con la correspondiente secuencia matricial para garantizar la amplificación apropiada, teniendo en cuenta que un emparejamiento exacto se mantenga en los últimos tres nucleótidos en el extremo 3' del iniciador, está ampliamente documentado en la literatura (Kwok et al., Nucleic Acids Research 18:999-1005, 1990; Sommer y Tautz, Nucleic Acids Research 17, 6749, 1989).

El término "sonda" se refiere a oligonucleótidos de secuencia específica monocatenarios (SSO's) que poseen una secuencia que es exactamente complementaria de la secuencia diana del alelo que debe detectarse.

Las expresiones hibridación "apropiada" y condiciones de lavado se refieren al hecho de que en la mayoría de los casos dichas sondas son para hibridizar sólo secuencias exactamente complementarias. Tales condiciones se ejemplifican en la sección de Ejemplos. Por ejemplo, para la sonda 17 la hibridación y las temperaturas de lavado preferidas son respectivamente 54ºC y 58ºC si se utiliza como solución de lavado e hibridación TMAC 3 M. En general, las condiciones de hibridación deben ser estrictas tal como se conoce en la técnica (Maniatis et al, Molecular Cloning: un Manual de Laboratorio, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

Sin embargo, según la solución de hibridación (SSC, SSPE, etc), estas sondas deben hibridizarse a su temperatura apropiada con objeto de alcanzar especificidad suficiente (en la mayoría de casos, deben discriminarse diferencias a nivel de una mutación puntual).

Se hace referencia a los iniciadores del extremo 5' anteriormente mencionados como iniciadores B25P.

El término "muestra" se refiere a cualquier fuente de material biológico, por ejemplo manchas de sangre, pelo, células epiteliales o células de sangre periférica. Las muestras típicas pueden incluir células mononucleares de sangre periférica (PBMNC's), progenies celulares linfoblásticas (LCL'S), células pilosas o análogos. El ácido nucleico aislado preferido será ADN genómico. Sin embargo, pueden también utilizarse poli(A) + ARN citoplásmico y celular.

La expresión "deducción del alelo presente a partir del patrón de hibridación observado" se refiere a la característica central del método de tipificación de HLA-B de la presente invención que implica la identificación (a la que se hace también referencia como determinación o discriminación) de los alelos HLA-B presentes en la muestra mediante análisis del patrón de unión de un conjunto de sondas oligonucleótidas. Aunque las sondas simples pueden también proporcionar información útil, la variación de los alelos HLA-B se dispersa naturalmente, por lo que raramente es capaz cualquier sonda de identificar de modo único una variante específica. Más bien, tal como se muestra en los Ejemplos, la identidad de un alelo se deduce a partir del patrón de unión de un conjunto de sondas oligonucleótidas, las cuales son específicas para distintos segmentos de los diferentes alelos HLA-B. Dependiendo de la elección de estos sondas oligonucleótidas, cada alelo conocido corresponde a una patrón de hibridación específico tras la utilización de una combinación específica de sondas. Cada alelo será también capaz de ser discriminado a partir de cualquier otro alelo amplificado con idénticos iniciadores dependiendo de la elección de las sondas oligonucleótidas. La comparación del patrón generado de las sondas que se hibridan positivamente con una muestra que contiene uno o más alelos HLA-B desconocidos con un esquema de los patrones de hibridación esperados como por ejemplo el que se muestra en la Tabla 1, permite deducir claramente los alelos HLA-B presentes en dicha muestra.

Debido a que los alelos diana difieren algo en la secuencia en el extremo 3' del exón 2 (Zemmour y Parham,1992) pueden combinarse iniciadores de extremo 3' distinto con un iniciador de extremo 5' (B25P o sus variantes) para cumplir la amplificación específica de todos los alelos de interés.

La presente invención se refiere de este modo a un método tal como se define anteriormente, caracterizado además porque se utiliza por lo menos uno de los siguientes iniciadores de amplificación del extremo 3' (B23):

5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCA-3' (B23P1, SEC ID nº 4),

o sus variantes secuenciales, tales como:

5'-TCTGGTTGTAGTAGCGGAGCG-3' (B23P2, SEC ID nº 5)

5'-TCCGCAGGTTCTCTCGGTA-3' (B23P3, SEC ID nº 6)

u otras variantes secuenciales, conteniendo dichas variantes secuenciales deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que dichas variantes secuenciales pueden obtenerse para amplificar específicamente los mismos alelos HLA-B como el iniciador B23P1 o sus variantes B23P2 o B23P3 tal como se han designado anteriormente, proporcionándose posiblemente dichos iniciadores con un marcaje detectable, tal como la biotina.

Como se ha indicado, a estos iniciadores se hará referencia ulteriormente como B23P1, B23P2 y B23P3, respectivamente. Los iniciadores B23P1 y B23P2 tienen como diana la región 241 a 261 en el exón 2 de HLA B; el iniciador B23P3 tiene como diana la región 219 a 237 (numeración según Zemmour y Parham,1992). Los alelos de los cuales la secuencia de ADN se corresponde completamente con el extremo 3' de los iniciadores mencionados anteriormente se identifican en la Tabla 1.

A partir de estos datos, puede concluirse que, con el objeto de obtener la amplificación de todos los alelos HLA-B de interés, la amplificación con el conjunto de iniciadores

B25P/B23P1 debe combinarse por lo menos con uno de los siguientes conjuntos:

B25P/B23P2

B25P/B23P3.

A partir de los datos proporcionados en la Tabla 1 puede concluirse también que algunos alelos se amplifican exclusivamente con un conjunto de iniciadores y no con una de las otras combinaciones fijadas anteriormente. Por ejemplo, entre otros alelos, B* 4601 o B* 7801 se amplifican solamente con el conjunto de iniciadores B25P/B23P1. Mientras, por ejemplo, los alelos B* 1503 o B* 5801 se amplifican con los conjuntos de iniciadores B25P/B23P1 y B25P/B23P3, y B25P/B23P2 y B25P/B23P3, respectivamente.

Debe mencionarse asimismo que a partir de los datos secuenciales disponibles (Zemmour y Parham,1992) pueden seleccionarse otros iniciadores de amplificación del extremo 3' con los cuales puede alcanzarse la amplificación de una parte particular del exón 2 de los alelos HLA-B si se combina con el iniciador del extremo 5' B25P o sus variantes.

En una forma de realización de la invención, la amplificación con los dos conjuntos de iniciadores de elección se lleva a cabo en distintos tubos de reacción y los productos amplificados se hibridizan separadamente, tal como se indica en el esquema de tipificación en la Figura 1.

En otra forma de realización de la invención, la amplificación con los dos conjuntos de iniciadores de elección se lleva a cabo en distintos tubos de reacción y los productos amplificados se mezclan después de amplificación y se hibridizan juntos.

En una forma de realización preferida de la invención, los distintos iniciadores implicados (B25P, B23P1 y B23P2 o B25P, B23P1 y B23P3)se mezclan y la amplificación se lleva a cabo en un tubo de reacción único, después de lo cual los productos amplificados se hibridizan juntos.

El método de amplificación utilizado puede ser, o bien PCR (Saiki et al., Science 239:487-491, 1988), la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA, Guateli et al., PNAS (USA), 87:1874-1878, 1990; Compton, Nature, 350:91-92, 1991), el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS, Kwoh et al, Proc. Natl. Acad.Sci (USA) 86:1173-1177, 1989), la amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA, Duck et al, Biotechniques 9:142-147, 1990; Walker et al. Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 89:392-396, 1992), la amplificación mediante la replicasa Q\beta (Lizardi et al., Bio/Technology 6:1197-1202, 1988; Lorneli et al., Clin. Chem, 35:1826-1831, 1989) o cualquier otro método apropiado capaz de amplificar las moléculas del ácido nucleico utilizando la extensión de los iniciadores. Durante la amplificación, los productos amplificados pueden marcarse convenientemente utilizando, bien iniciadores marcados o mediante la incorporación de nucleótidos marcados. Los marcajes pueden ser isotópicos (^{32}P, ^{35}S, etc) o no isotópicos (biotina, digoxigenina, etc).

Con objeto de distinguir los alelos amplificados de los otros, los productos de amplificación se hibridizan a un conjunto de sondas secuencia-específicas de ADN (a las que también se alude cono SSOs) que tienen como diana las regiones del exón 2 de HLA-B localizado entre las regiones seleccionadas del iniciador de amplificación. Pueden utilizarse distintos formatos de hibridación tales como el formato convencional de transferencia, la hibridación sandwich o la hibridación inversa (tal como el formato de transferencia inversa). Se seleccionó un conjunto particular de sondas de ADN que permite distinguir los alelos de interés de los otros y de otros alelos que se describen, si estos alelos están o no presentes en forma homocigótica o heterocigótica.

Para esto, se identificaron 20 secuencias básicas de sondas de ADN que se diseñaron para ser funcionales en condiciones de hibridación y lavado TMAC (cloruro de tetrametilamonio) tal como se ilustra en la sección de Ejemplos. La mayoría de estos sondas hacen diana en las regiones más variables del exón 2 de HLA-B y pueden hibridizar a más de un alelo HLA-B. Algunas sondas se seleccionaron a causa de que son alelo-específicas; estas sondas son la 8 (SEC ID nº 14), 12 (SEC ID nº 18), y la 16 (SEC ID nº 22) que hibridizan exclusivamente a B*5401, B*4601 y B*7901 respectivamente. Las regiones diana para las distintas sondas se representan esquemáticamente en la Figura 2. En la Tabla 2, se dan las secuencias de las sondas. Se proporciona una interpretación en la Tabla 1. Más adelante, las mismas 20 sondas básicas o sus variantes se ensayaron en condiciones de lavado e hibridación específicas para SSPE tal como se revisa en el Ejemplo 5 y en la Tabla 2 bis. Como puede apreciarse en la Tabla 2 bis, 9 de las sondas originalmente ensayadas con TMAC y algunas de las nuevas sondas variantes se prefieren particularmente respecto a otras bajo las condiciones SSPE específicas de tampón utilizadas.

La presente invención se refiere por tanto a un método tal como se ha definido anteriormente, en el que una o más sondas de hibridación se seleccionan a partir de la Tabla 2 (SEC ID nº 7 a 26).

Según la solución de hibridación (SSC, SSPE, TMAC, etc) estas sondas deben hibridizarse estrictamente a su temperatura apropiada con objeto de alcanzar suficiente especificidad (en la mayoría de los casos, pueden discriminarse diferencias a nivel de una mutación puntual). También, el cambio de la cantidad (concentración) de sonda utilizada respecto uno a otro puede ser beneficioso para obtener unos resultados de hibridación más específicos. Debe tenerse en cuenta en este contexto, que contrariamente a las soluciones tamponadas SSPE, las sondas de la misma longitud, a pesar de su contenido en GC, hibridizarán específicamente en soluciones TMAC a aproximadamente la misma temperatura (Jacobs et al., Nucleic Acids Research 16:4637-4650, 1988).

En la sección de Ejemplos de la presente invención se ilustran sondas básicas preferidas que utilizan distintas condiciones de tampón de lavado y de hibridación. Las sondas preferidas se incluyen en la reivindicación 7.

Entre los alelos que constituyen el objetivo de la presente invención, B* 1501 y B* 1504 no pueden discriminarse uno de otro, ya que estas secuencias son exactamente las mismas en el segundo exón. Se encuentran diferencias entre ambos alelos en el extremo 5' del exón 3 (Zemmour y Parham, 1992). Por la misma razón B* 5101 no puede distinguirse de B*5104. También para estos alelos la discriminación puede alcanzarse en el exón 3 (Zemmour y Parham, 1992). Por tanto, un sistema de tipificación más completo incluirá una combinación de sonda e iniciador para discriminar entre los tipos en el exón 3.

Los métodos de tipificación del ADN anteriormente mencionados en los que se utiliza el par de iniciadores B25P/B23P2 y se observa la hibridación con SSO's 7 (SEC ID nº 13) y 9 (SEC ID nº 15) se llevan a cabo preferentemente adicional y separadamente con el par de iniciadores B25P y B23P1 y/o los iniciadores B23P3. Para esta última aplicación, puede utilizarse como alternativa para el iniciador B25P un iniciador con la secuencia siguiente:

5'-GACGACACG/CCT/AGTTCGTGA-3'

\hskip0.5cm

B25PX1 (SEC ID nº 53)

Tal como se detalla en la sección de Ejemplos, este paso de amplificación adicional descarta la posibilidad de que tenga lugar la co-amplificación del pseudogen HLA-AR (cuando se utiliza el iniciador B23P2) y esto permite un procedimiento de tipificación de HLA-B más preciso.

Métodos de ensayo apropiados para la finalidad de la presente invención de detectar híbridos formados entre las sondas oligonucleótidas y las secuencias ácido nucleicas en una muestra, pueden comprender cualquiera de los formatos de ensayo que se conocen en la técnica. Por ejemplo, la detección puede realizarse utilizando un formato de transferencia, uniéndose la muestra amplificada no marcada a una membrana, incorporándose ésta con por lo menos una sonda marcada bajo condiciones de lavado e hibridación apropiadas y monitorizándose la presencia de la sonda unida. Las sondas pueden marcarse con radioisótopos o con marcadores que permitan la detección cromogénica o quimioluminiscente tales como las sondas unidas a la peroxidasa de rábano.

Una alternativa es un formato de transferencia "inversa", en el que la secuencia amplificada contiene un marcador. En este formato, las sondas oligonucleótidas no marcadas se unen a un soporte sólido y se exponen a la muestra marcada bajo apropiadas condiciones de hibridación estrictas y de lavado subsiguientes. Debe entenderse que también cualquier otro método de ensayo que dependa de la formación de un híbrido entre los ácidos nucleicos de la muestra y las sondas oligonucleótidas según la presente invención, puede utilizarse.

Según una forma de realización ventajosa, el procedimiento de tipificar los alelos HLA-B contenidos en una muestra biológica comprende las fases de contactar las copias amplificadas derivadas del material genético, con un soporte sólido sobre el cual, sondas tal como anteriormente se han definido, se han inmovilizado previamente.

El término "soporte sólido" puede referirse a cualquier sustrato al cual una sonda oligonucleótida puede acoplarse, teniendo en cuenta que conserve sus características de hibridación y teniendo en cuenta que el nivel anterior de hibridación permanezca bajo. El sustrato sólido será habitualmente un placa de microtitulación, una membrana (por ejemplo, de nylon o nitrocelulosa) o una microsfera (perla). Antes de la aplicación a la membrana o fijación puede ser conveniente modificar la sonda de ácido nucleico con objeto de facilitar la fijación o mejorar la eficiencia de la hibridación. Algunas modificaciones pueden abarcar la eliminación de homopolímeros, y el acoplamiento con distintos grupos reactivos tales como grupos alifáticos, grupos NH_{2}, grupos SH, grupos carboxílicos, o el coplamiento con biotina o haptenos.

Según otra forma de realización ventajosa, el procedimiento de tipificar los alelos HLA-B contenidos en una muestra biológica comprende las fases de contactar copias amplificadas derivadas del material genético, con sondas oligonucleótidas que se han inmovilizado como lineas paralelas sobre un soporte sólido.

Según esta forma de realización preferida de la presente invención, una o más de las sondas anteriormente definidas se utilizan para la inmovilización e incorporación a un ensayo de hibridación de fase inversa, preferiblemente para la inmovilización como lineas paralelas sobre un soporte sólido tal como una tira membranosa, para la tipificación de los alelos HLA-B según un método tal como el definido anteriormente. Según este método ventajoso, las sondas se inmovilizan en un formato de Ensayo de Sonda Lineal (LiPA). Este es un formato de hibridación inversa (Saiki et al., PNAS (USA):86:6230-6234, 1989) que utiliza tiras membranosas sobre las que se aplican convenientemente 20 ó más sondas oligonucleótidas (que incluyen oligonucleótidos de control positivo o negativo) como lineas paralelas. Las tiras LiPA se preparan tal como se describe por Stuyver et al. (J.Gen.Virol, 74:1093-1102,1993).

La presente invención se refiere también por tanto a un soporte sólido, preferentemente una tira membranosa, que porta en su superficie, una o más sondas tal como se han definido anteriormente, acopladas al soporte en forma de lineas paralelas.

LiPA es un ensayo de hibridación muy rápido y agradable de realizar. Los resultados pueden leerse 4 horas después del comienzo de la amplificación. Después de ésta, durante la cual se incorpora habitualmente un marcaje no isotópico en el producto amplificado, y de desnaturalización alcalina, el producto amplificado se contacta con las sondas en la membrana y la hibridación se lleva a cabo durante 1 a 1,5 horas. Después de un lavado breve (10 a 30 min) el procedimiento de detección empieza. Todos estos pasos se llevan a cabo en los mismos recipientes de hibridación, minimalizando de este modo el tiempo. A partir del patrón de hibridación generado, el alelo (o alelos) presente(s) HLA-B puede deducirse bien visualmente, pero preferentemente utilizando software dedicado. El formato LiPA es completamente compatible con dispositivos de escaneo comercialmente disponibles, haciendo de este modo que la interpretación automática de los resultados sea posible. Todas estas ventajas hacen que el formato LiPA sea capaz para utilizar la tipificación de HLA de forma rutinaria. El formato LiPA debe ser particularmente ventajoso para tipificar aquellos alelos que son difíciles de tipificar mediante medios serológicos rutinarios.

La presente invención se refiere asimismo a un método para detectar e identificar nuevos alelos HLA-B, diferentes de los alelos HLA-B conocidos, que comprende las etapas siguientes:

-: determinar qué alelo (o alelos) HLA-B está(n) presente(s) en una muestra biológica, según el procedimiento tal como se ha definido anteriormente.

-: en el caso de observar una muestra que no genera un patrón de hibridación compatible con los definidos en la Tabla 1, secuenciar la porción de la secuencia del exón 2 de HLA-B que corresponde a la sonda que se hibridiza anormalmente del nuevo alelo HLA-B que va a determinarse.

El conjunto de sondas de la presente invención no permite sólo discriminar los alelos de los que se conocen las secuencias, sino que también pueden detectarse de los alelos con secuencias todavía desconocidas, tal como se ejemplifica en el Ejemplo 3. En este ejemplo se muestra que B71 puede distinguirse de B72 (B*1503) utilizando la sonda 13. Esto es particularmente ventajoso, ya que la discriminación serológica de B71 y B72 es problemática.

La invención se refiere así a un método para discriminar entre B72(B*1503) y los alelos HLA-B no B72 del grupo B70 (B70, B71, es decir, alelos diferentes del B*1503), utilizando el método tal como se ha definido anteriormente, con dichos alelos HLA-B no B72 caracterizados por el hecho de que no forman un híbrido con, como mínimo, una de las siguientes sondas que hibridizan al alelo B*1503 (sonda 13 (SEC ID nº 19), sonda 7 (SEC ID nº 13), sonda 10 (SEC ID nº 16), sonda 18 (SE ID NO 24) y sonda 19 (SEC ID nº 25)).

Una vez que la secuencia de estos nuevos alelos se convierte en disponible, pueden inferirse nuevas sondas que permiten una detección específica de estos nuevos alelos. La adición de estas sondas al conjunto de 20 sondas básicas que se lista en la Tabla 1, mejorará de este modo el nivel de discriminación y la importancia de este procedimiento de tipificación.

La presente invención se refiere así también a un producto de amplificación obtenido con el conjunto de iniciadores B25P/B23P1 (SEC ID nº 1 y 4) de un alelo HLA-B que corresponde a un tipo HLA-B B70 de nivel secuencial todavía indeterminado del ácido nucleico, determinado según el método anterior, estando caracterizado dicho producto amplificado por el hecho de que forma un híbrido con la sonda 2 (SEC ID nº 8, véase la Tabla 2), mientras que no forma un híbrido con la sonda 13 (SEC ID nº 19, véase Tabla 2) bajo las condiciones siguientes:

-: prehibridación de las membranas a 54ºC durante 30 minutos en Tris-HCl 50 mM pH 8,0, SDS al 0,1%, EDTA 2 mM, TMAC 3M;

-: hibridación a 54ºC durante 1 hora en la misma solución después de añadir de 3 pmol/ml de la sonda oligonucleótida monocatenaria marcada con DIG;

-: dos fases de lavado a temperatura ambiente durante 10 minutos en 2 x SSPE, SDS al 0,1%;

-: una fase de lavado a 58ºC durante 15 minutos en solución de hibridación,

y siendo diferente dicho alelo del alelo HLA-B B70 B*1503 en como mínimo una posición nucleótida en la región que abarca los nucleótidos 192 a 209, estando dicha numeración de acuerdo con Zemmour y Parham, 1992.

La presente invención se refiere también a una composición que comprende como mínimo uno de los iniciadores oligonucleótidos de amplificación seleccionado a partir de la lista siguiente:

5'-AGGTATTTCTACACCGCCA-3' (B25P, SEC ID nº 1)

o sus variantes de secuencia, como:

5'-AGGTATTTCCACACCGCCA-3' (SEC ID nº 2)

5'-AGGTATTTCGACACCGCCA-3' (SEC ID nº 3)

y/o inserciones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que la secuencia GCCA del extremo 3' se mantenga y que dichas variantes secuenciales puedan obtenerse para amplificar específicamente los mismos alelos HLA-B como el iniciador B25P o sus variantes como se ha designado anteriormente, posiblemente en combinación con por lo menos uno de los iniciadores de la siguiente lista:

5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCA-3' (B23P1, SEC ID nº 4),

o sus variantes secuenciales, tales como:

5'-TCTGGTTGTAGTAGCGGAGCG-3' (B23P2, SEC NO 5)

5'-TCCGCAGGTTCTCTCGGTA-3' (B23P3, SEC NO 6)

o sus variantes secuenciales, conteniendo dichas variantes secuenciales deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que dichas variantes secuenciales puedan obtenerse para amplificar específicamente los mismos alelos HLA-B como el iniciador B23P1 o sus variantes B23P2 o B23P3 tal como se han designado anteriormente, proporcionándose posiblemente dichos iniciadores con un marcaje detectable, tal como la biotina, y con el conjunto de iniciadores posiblemente inmovilizados sobre un soporte sólido.

Preferentemente, tales composiciones contienen por lo menos dos o más iniciadores de amplificación seleccionados a partir de dicha lista. Más preferentemente el conjunto de iniciadores de amplificación B25P/B23P1 se combina con por lo menos uno de los siguientes conjuntos:

B25P/B23P2, ó B25P/B23P3.

Además de los componentes anteriormente mencionados, dicha composición puede comprender asimismo por lo menos uno de los siguientes iniciadores:

5'-GACGACACG/CCT/AGTTCGTGA-3'

\hskip0.5cm

B25PX1 (SEC ID nº 53)

La presente invención se refiere asimismo a una composición que comprende por lo menos una sonda oligonucleótida seleccionada a partir de la siguiente lista de sondas:

SEC ID nº 11, SEC ID nº 13, SEC ID nº 18, SEC ID nº 19, SEC ID nº 21, SEC ID nº 23, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26, SEC ID nº 27, SEC ID nº 28, SEC ID nº 29,SEC ID nº 30, SEC ID nº 36, SEC ID nº 39, SEC ID nº 44, SEC ID nº 45, SEC ID nº 46, SEC ID nº 49, SEC ID nº 52.

Preferentemente, tales composiciones contienen por lo menos dos, tres o más de dichas sondas.

La presente invención se refiere asimismo a una equipo para tipificar por lo menos un alelo HLA-B a partir de una muestra biológica capaz de contenerlo, que comprende los siguientes componentes:

-: Por lo menos un iniciador de amplificación cuando sea apropiado, escogido de entre algunos de los definidos anteriormente.

-: por lo menos una sonda inmovilizada (o inmovilizadas) preferentemente sobre un sustrato sólido, y más preferentemente sobre una e idéntica tira membranosa, seleccionándose dicha sonda (o sondas) de entre cualquiera de las que se definen anteriormente.

-: un tampón o los componentes necesarios para producirlo, que permita que pueda llevarse a cabo la reacción de hibridación entre dichas sondas y el producto amplificado.

-: cuando sea apropiado, un medio para detectar los híbridos que resultan de la hibridación precedente.

La presente invención se refiere asimismo a un equipo para la tipificación de por lo menos un alelo HLA-B a partir de una muestra biológica capaz de contenerlo, más particularmente de una muestra capaz de contener tipos HLA-B que sean serológicamente difícil discriminar, subsiguiente a la amplificación de los nucleótidos que codifican los alelos HLA-B presentes en dicha muestra, utilizando una o más combinaciones de conjuntos de iniciadores según un método tal como se define anteriormente, que comprende:

-: un tampón o los componentes necesarios para producirlo, que permitan que pueda llevarse a cabo la reacción de hibridación entre dichas sondas y el producto amplificado.

-: medios para detectar los híbridos que resultan de la hibridación precedente.

-: que incluye también posiblemente un dispositivo de interpretación y exploración automatizado para interpretar los resultados y deducir el alelo presente, a partir del patrón de hibridación observado.

Figuras y leyendas de las tablas

Fig. 1: Representación esquemática del enfoque de tipificación según la presente invención.

Fig. 2: Localización de los iniciadores y sondas de la presente invención sobre un eje que representa el exón 2 del gen HLA-B. La numeración es según Zemmour y Parham, 1992.

Fig. 3: Resultados de la amplificación (cuadro superior) e hibridación de transferencia (cuadro inferior) obtenidas con 13 muestras de pacientes y 7 controles. El material se amplificó utilizando el conjunto de iniciadores B25P/B23P1, se transfirió y se hibridizó con las sondas 6 (SEC ID nº 12) y 17 (SEC ID nº 23) tal como se describe en los ejemplos 1 y 2.

Fig. 4: Resultados de la hibridación de transferencia obtenidos para 15 muestras (nº 1 a 15 ), entre los cuales se encuentran las que albergan los alelos variantes B 70 y los alelos B46.

Se aplicó el material amplificado a membranas de nylon. Se hibridizaron subsiguientemente estas membranas con las sondas SSO 13 (SEC ID nº 19), 12 (SEC ID nº 18), 15 (SEC ID nº 21), 6 (SEC ID nº 12) y 2 (SEC ID nº 8) como se ha indicado. Los resultados se comentan en los ejemplos SSO 3 y 4 y se sumarizan en la Tabla 3.

Tabla 1: Alelos HLA-B amplificados (exón 2) con los conjuntos de iniciadores de la invención. También se indica la presencia de la secuencia del iniciador del extremo 3' en los alelos y el patrón de hibridación con el conjunto de las sondas SSO 19.

Tabla 2: Cuadro de las sondas SSO de tipificación para los alelos HLA-B.

Tabla 2 bis: Cuadro de las sondas SSO de tipificación para los alelos HLA-B ensayados, para su utilización en un formato de hibridación inversa (Ensayo de sonda lineal, LiPA). Todas estas sondas se derivan del conjunto básico de 20 SSOs que se proporciona en la Tabla 2. Las sondas preferidas se indican como "+".

Tabla 3: Sumario de los resultados de hibridación obtenidos con 15 muestras amplificadas hibridizadas con 5 sondas SSO, tal como se describe en los Ejemplos 3 y 4. Véase también la Fig. 4.

Tabla 4: Resultados de hibridación obtenidos con una tira LiPA sobre la cual se inmovilizaron 20 sondas oligonucleótidas. Se indican como "+" señales de hibridación positiva obtenidas después de hibridación con material obtenido respectivamente tras la amplificación 1 y 2 (véase el Ejemplo 6).

Abreviaturas

TMAC: Cloruro de tetrametilamonio

SSO: Oligonucleótido secuencia-específico.

DIG 11-ddUTP: Digoxigenina-11-2',3'-didesoxi-uridina-5'-trifosfato.

DIG: Digoxigenina.

AMPPD: 3-(2'-espiroadamantano)-4 metoxi-4-(3''-fosforiloxi)-fenil-1'2-dioxetano.

AP: fosfatasa alcalina.

Ejemplos Ejemplo 1 Amplificación específica de ciertos alelos HLA-B con el conjunto de iniciadores B25P/B23P1

Como ejemplo, se ilustra la especificidad de amplificación con uno de los conjuntos de iniciadores. Tal como se indica en la Fig 3, se amplificaron 12 muestras y 7 controles con el conjunto de iniciadores B25P/B23P1 (SEC ID nº 1 y 4). Se preparó ADN genómico a partir de material celular, mediante protocolos estándares. Se mezclaron aproximadamente 0,5 \mug de ADN genómico con tampón PCR que contenía 12,5 pmoles de cada uno de los iniciadores; 200 mM de cada dNTP (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia); 10 mM de Tris HCl (pH 8,5); 50 mM de KCl; 1 mM de MgCl_{2}; gelatina al 0,01%; NP-40 al 0,025% y 1 Unidad de Taq (Thermus aquaticus); ADN polimerasa (Boehringer Mannheim GmbH, FRG) ajustada a un volumen final de 50 \mul con agua doblemente destilada. Las muestras se calentaron a 95ºC durante 10 minutos y se sometieron a 35 ciclos de PCR, cada uno de los cuales consistió en 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto, con una extensión final a 72ºC durante 10 minutos, en un Ciclador Térmico de ADN (Techne y Perkin-Elmer Cetus Corp. Norwalk, CT). Los productos de amplificación se caracterizaron mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.

Los resultados se muestran en la Figura 3. En todas las muestras en las que se encontraban alelos amplificables, se observó, tras tinción mediante bromuro de etidio, una banda precisa de alrededor de 246 pares de bases, tal como se predijo por los datos secuenciales disponibles.

Las muestras 1, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y 12 albergaron al alelo B*7801 (indicado en la Fig 1 como BSNA, BX1 ó BTe76). En las muestras 2 y 3 y en el control 15, se encuentra un alelo B8 (B* 0801). Las muestras 16 a 19 son controles homocigóticos para B35, B55, B56 y B54, respectivamente. En los controles negativos no se pudieron observar bandas (13 y 14 que albergaran respectivamente los alelos B*3701 y B*1801). Estos alelos poseen la secuencia 5'-TCCG-3' en posición 30 a 33 del exón 2, en lugar de la 5'-GCCA-3' (Zemmour y Parham, 1992).

Ejemplo 2 Ensayo de tipificación de transferencia para la detección del alelo (o alelos) B78

En este ejemplo la tipificación específica del alelo B*7801 se describe utilizando las sondas 6 y 17 (SEC ID nº 12 y 23). Debido a que B *7801 es el único alelo que se hibriza con ambas sondas (6 y 17), B*7801 puede discriminarse a partir de otros alelos amplificados con el conjunto de iniciadores B25P/B23P1.

Las sondas oligonucleótidas secuencio-específicas (SSOs) se sintetizaron químicamente y se marcaron en su extremo 3' con (digoxigenina-11-2',3'-didesoxi-uridina-5'-trifosfato DIG-11-ddUTP) y ADN desoxinucleotidilexotransferasa. Se amplificaron 13 muestras y 7 controles con el conjunto de iniciadores B25P/B23P1, tal como se describe en el ejemplo 1.

Consecuentemente, 2 \mul de los productos PCR se transfirieron a membranas de nylon (Hybond N Plus, Amersham, Buckinghamshire, UK) desnaturalizadas empapando los filtros en NaOH 0,4N durante 5 minutos y se neutralizaron en 10 ml de 10 X SSPE (solución EDTA salina de fosfato sódico) durante 15 minutos. Después de la transferencia, las membranas se prehibridizaron a 54ºC durante 30 minutos en 10 ml de solución de hibridación que contenía 50 mM de Tris-HCl, (pH 8,0), SDS al 0,1%, 2 mM EDTA, 3M TMAC (cloruro de tetrametilamonio), Janssen Chimica, Geel, Bélgica). Para la hibridación se añadieron 3 pmol/ml de SSO marcada con DIG a la solución de prehibridación durante 1 hora a la temperatura de 54ºC, excepto para la SSO-6 (SEC ID nº 12), que fue a 52ºC. Para eliminar el exceso de sondas, los filtros se lavaron dos veces en (2X SSPE, SDS al 0,1%) a temperatura ambiente durante 10 minutos y entonces en solución de hibridación durante 15 minutos a la temperatura estricta de 58ºC, excepto para la SSO-6 que se lavó a 54ºC.

Se llevó a cabo la detección no isotópica utilizando fosfatasa alcalina anti-DIG. Fragmentos Fab (anti-DIG-AP) y visualización se obtuvieron con el sustrato quimioluminiscente AMPPD (3-(2'-espiroadamantano)-4 metoxi-4-(3''-fosforiloxi)-fenil-1'2-dioxetano). Las membranas drenadas se expusieron a una película de rayos X (X-omat AR5, Kodak) en un cassette durante 15-30 minutos. Todos los reactivos utilizados en este procedimiento de oligotipificación se obtuvieron de Boehringer Mannheim GmbH, FRG). Los resultados se ilustran en la Fig 3. Todas las muestras en las que un alelo del tipo B78 está presente, (BSNA, BX1 ó BTe76), se hibridiza claramente con las sondas 6 y 17 (SEC ID nº 12 y 23). Otras muestras (nºs 2,3,7,15,16,17,18, y 19) se hibridizan, bien con la sonda 17 (SEC ID nº 23), o con la sonda 6 (SEC ID nº 12), pero no con ambas. Debido a que las muestras 13 y 14 no se amplifican con el conjunto de iniciadores utilizado, las señales de hibridación no se observan ni con la sonda 6 (SEC ID nº 12) ni con la sonda 17 (SEC ID nº 23).

Ejemplo 3 Tipificación y subtipificación de las variantes B70

En este ejemplo, la tipificación y subtipificación de las variantes B70 se ilustra utilizando 7 muestras que albergan las variantes B70. También se incluyeron como controles un blanco y 7 muestras no-B70 (véase la Tabla 3). B71 y B72 son alelos subtípicos al amplio antígeno HLA-B70. La secuencia del alelo B72 (B*1503) está publicada (Zemmour y Parham, 1992); hasta recientemente, la secuencia B71 no lo estaba. No están descritos reactivos específicos para B71 y B72 y la presencia de otros antígenos, principalmente B35 y B62, oscurecen la adscripción serológica exacta de las variantes B70. La distinción entre las variantes B70 puede realizarse mediante isoelectroenfoque, pero no existe una técnica favorable que se pueda aplicar de forma rutinaria.

Utilizando el conjunto de iniciadores B25P/B23P1 (SEC ID nº 1 y 4) y una combinación de algunas sondas de la invención, las variantes B72 podrían distinguirse de otras variantes B70. En este punto debe enfatizarse que pudieran existir otras variantes además de B71 y B72, todavía no identificadas.

A partir de un conjunto de muestras, que se conocen por albergar los alelos variantes B70 (muestras 1 a 6 y 8, en la Tabla 3), se extrajo ADN y se amplificó tal como se describe en el Ejemplo 1. Los productos amplificados se aplicaron a 5 membranas de nylon que se procesaron ulteriormente tal como se describe en el Ejemplo 2. Estas membranas se hibridizaron respectivamente con los siguientes conjuntos de sondas: 2, 6, 12, 13 y 15 (SEC ID nº 8, 12, 18, 19 y 21). Los resultados obtenidos con estas sondas se muestran en la Fig. 4. y se sumarizan en la Tabla 3. En todos los casos, la variante B72 (B*1503), que estaba presente en 4 de las 7 muestras B70, pudo distinguirse de la variante B71 o de otras posibles variantes. B*1503 (B72) se caracteriza porque se hibridiza con las sondas 2 y 13 (SEC ID nº 8 y 19) mientras que se encontró que otras variantes B 70 no reaccionaban con la sonda 13 (SEC ID nº 19). Este ejemplo, por tanto, ilustra claramente la posibilidad de discriminar entre alelos, aún cuando la información de la secuencia no se encuentra disponible.

Ejemplo 4 Tipificación de las variantes B46

Se tipificaron dos muestras que contenían B46 utilizando idénticos métodos, conjunto de iniciadores, y combinación de sondas tal como se se describe en el Ejemplo 3. En la Fig. 4 y en la Tabla 3, se ofrecen los resultados de la tipificación. Debido a la presencia de la sonda 12 (SEC ID nº 18) en el cuadro de sondas, B*4601 puede dibujarse fácilmente y distinguirlo unívocamente de otros alelos. A partir de todos los alelos amplificados por el conjunto de iniciadores B25P/B23P1 (SEC ID nº 1/4), B*4601 es el único alelo que se hibridiza con la sonda 12 (SEC ID nº 18).

Ejemplo 5 Ensayo de sonda lineal (LiPA) y SSO's para tipificación de los alelos HLA-B

Los medios preferidos de lavado y de hibridación para el Ensayo de sonda lineal (LiPA) son soluciones tampón basadas en SSPE. Las tiras LIPA se prepararon esencialmente tal como se describe por Stuyver et al (J.Gen. Virol 74:1093-1102, 1993). Debido que en un formato LiPA todas las sondas deben reaccionar específicamente bajo idénticas condiciones de lavado e hibridación (idéntica concentración salina y temperatura) y la temperatura de fusión del híbrido ADN:ADN en SSPE depende del contenido en GC y de la longitud de la sonda es necesaria, para algunas de las sondas que se relacionan en la Tabla 2, una modificación con objeto de cambiar de un sistema de tampón basado en TMAC a un sistema de tampón basado en SSPE.

Con el objeto de seleccionar las sondas que más se puedan adaptar a un formato LiPA, se sintetizaron muchas sondas (que se relacionan en la Tabla 2 bis), que se seccionaron en sus extremos 3' utilizando TTP y transferasa terminal y se inmovilizaron sobre un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa). Estas sondas se hibridizaron con material diana utilizando las siguientes condiciones de lavado e hibridación:

-	hibridación:	-5 x SSPE/SDS al 0,5%
	-55ºC
-	lavado:	-2 x SSPE/SDS al 0,1%
	-55ºC

(1 x SSPE es NaCl 0,18M, NaH_{2}PO_{4} 0,01M, EDTA 1 mM (pH 7,2))

Las sondas que exhiben los mejores resultados del ensayo respecto a sensibilidad y especificidad bajo las condiciones anteriormente mencionadas, se seleccionaron para utilización ulterior sobre tiras LiPA. Estas sondas se clasificaron como positivas (+) en la Tabla 2 bis. Sólo 9 de las 20 sondas utilizadas en el sistema de tampón TMAC (SEC ID nº 7b, 11, 12, 13, 18, 19, 21, 23 y 24) se pudieron utilizar sin modificarlas en el sistema basado en SSPE.

Estos resultados demuestran claramente que ligeras modificaciones de la secuencia de las sondas utilizadas podrían ser importantes, y que el diseño meticuloso de las sondas es esencial para el desarrollo de un ensayo LiPA fiable.

Ejemplo 6 Tipificación de las progenies celulares homocigóticas más representativas utilizando las tiras LiPA

Debido a co-amplificación del pseudogén HLA-AR (cuando se utiliza el iniciador B23P2), los resultados de la hibridación con las sondas 7 (SEC ID nº 13) y 9 (SEC ID nº 15) son equívocos, ya que las secuencias que corresponden a aquellas de la sonda 7 (SEC ID nº 13) y 9 (SEC ID nº 15) están presentes en el pseudogén.

Con objeto de sondear el origen de una eventual señal de hibridación positiva, se llevó a cabo una amplificación adicional, utilizando por lo menos uno de los iniciadores B23 y un iniciador con la siguiente secuencia:

5'-GACGACACG/CCT/AGTTCGTGA-3'

\hskip0.5cm

B25PX1 (SEC ID nº 53)

El producto de amplificación obtenido se hibridizó, en consecuencia, con una tira sobre la cual se inmovilizaron por lo menos las sondas 7 y 9.

Una señal de hibridación positiva para las sondas 7 y 9 en este ensayo indica que las secuencias de la sonda 7 y/o 9 se encuentran en los alelos HLA-B de la muestra analizada y por lo tanto, las sondas 7 y/o 9 deben clasificarse como positivas. Un resultado negativo significa que estas sondas deben despreciarse durante la interpretación de los resultados después de la primera amplificación, ya que su señal de hibridación positiva se originó a partir del pseudogén y no a partir del gen HLA-B en sí mismo.

Los resultados de la hibridación obtenidos con algunas muestras seleccionadas (progenies celulares homocigóticas A a G) después de la amplificación separada con los iniciadores B25P y B23P1/B23P2 (amplificación 1) y con los iniciadores B25PX1 y B23P1/B23P2 (amplificación 2), se sumarizan en la Tabla 4. Estos resultados muestran que, para la muestra A, la señal de hibridación positiva para las sondas 7 y 9 se origina a partir del alelo HLA-B. Lo mismo ocurre para la señal positiva obtenida con la sonda 9 en las muestras E y F.

Si los resultados después de las etapas de amplificación 1 y 2 se combinan, pueden deducirse los siguientes alelos HLA-B con la ayuda de la Tabla 1:

\newpage

muestra	alelo
A	B*0801
B	B*1501
C	B*4001
D	B*4601
E	B*5101
F	B*5301
G	B*5701

Se obtienen esencialmente idénticos resultados cuando, para la amplificación 2, se utiliza el siguiente conjunto de iniciadores:

B25P y B23P1/B23P3.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Secuencias de ADN de sondas oligonucleóticas

TABLA 2 (continuación)

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Innogenetics N.V.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Industriepark Zwijnaarde 7 Bus 4

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Gent

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Bélgica

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 9052

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO: 00-32-09.241.07.11

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX: 00-32.241.07.99

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO PARA TIPIFICAR HLA-B POR MEDIO DE INICIADORES ESPECÍFICOS Y CONJUNTOS DE SONDAS.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 53

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): FORMA LEGIBLE DEL COMPUTADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: disco blando

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0 Versión # 1.25 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Iniciador oligonucleótido B25P

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 15-33 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*3501

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGTATTTCAT ACACCGCCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Variante del Iniciador oligonucleótido B25P

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 15-33 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4001

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº. 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGTATTTCC ACACCGCCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:Variante del Iniciador oligonucleótido B25P

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 15-33 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*0801

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGTATTTCG ACACCGCCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Iniciador oligonucleótido B23P1

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 241-261 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4001

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGGTTGTA GTAGCCGCGC A

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Iniciador oligonucleótido B23P2

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 241-261 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*1301

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGGTTGTA GTAGCGGAGC G

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA:lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Iniciador oligonucleótido B23P3

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 219-237 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*5101

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCGCAGGTT CTCTCGGTA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 1

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 61-78 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4001

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTTCATCAC CGTGGGCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 2

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 60-77 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*0801

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCTTCATCT CAGTGGGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 3

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 60-77 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*5101

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCTTCATTG CAGTGGGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótid 4

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 60-77 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*3501

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCTTCATCG CAGTGGGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 5

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 126-143 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*1501

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGATGG CGCCCCGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 6

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 125-142 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*3501

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCGAGGACG GAGCCCCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 7

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 123-140 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*0801

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTCCAGAGAG AGGAGCCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 8

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 143-161 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*5401

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCCGTGGG TGGAGCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 178-195 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*0801

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGACCGGAA CACACAGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 10

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 179-196 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4001

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACCGGGAG ACACAGAT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 11

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 179-196 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*5701

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACGGGGAG ACACGGAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 12

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 189-206 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4601

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACACAGAAGT ACAAGCGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 13

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 192-209 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4001

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGATCTCCA AGACCAAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 14

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 191-208 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*0801

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAGATCTTC AAGACCAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 15

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 192-209 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*5401

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGATCTACA AGGCCCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 16

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 191-208 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*7901

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAGATCTGC AAGACCAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 17

\newpage

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 212-229 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*7801

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAGACTGAC CGAGAGAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 18

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 211-228 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4001

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACAGACTTA CCGAGAGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 19

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 220-237 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4001

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCGAGAGAG CCTGCGGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCGAGGAA GGAGCCGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCATCACC GTGGGCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTTCATCTC AGTGGGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTTCATTGC AGTGGGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCATCGCA GTGGGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGGCGCCC CGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACGGAGCC CCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGATGGCG CCCCGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAGGACGGA GCCCCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGACGG AGCCCCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCGAGGACG GAGCCCCGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCGAGAGAG GAGCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTCCGAGAG AGGAGCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGTGGGTGG AGCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCCGTGGGT GGAGCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACCGGAAC ACACAGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCGGAACA CACAGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCGGAACA CACAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACCGGAAC ACACAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCGGGAGA CACAGAT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGGGGAGAC ACGGAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACAGATCTT CAAGACCAAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAGATCTTC AAGACCAAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGATCTTCA AGACCAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACAGATCTG CAAGACCAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAGAGAGCC TGCGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAGAGAGCC TGCGGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Característica_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: nombre_estándar=*G ó C_{*}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Característica_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: nombre_estándar=*T ó A_{*}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACGACACNC CNGTTCGTGA

\hfill

Claims (19)

Hide Dependent

1. Método para tipificar o subtipificar uno o más alelos HLA-B en una muestra, caracterizado por la secuencia 5'-GCCA-3' en la posición 30 a 33 del exón 2 de dicho alelo HLA-B (estando dicha numeración de acuerdo con Zemmour y Parham, 1992) y, más particularmente, método para discriminar los tipos HLA-B que son serológicamente difíciles de discriminar, como por ejemplo B54(22), B52(5), B7801, B62(15), B75(15), B71(70), B72(70), B46, B79, B53, B5102, B5103 y B58 (17), con dicho método que comprende por lo menos las siguientes etapas:

(i): posiblemente, extracción el ácido nucleico de la muestra

(ii): amplificación del ácido nucleico de los alelos HLA-B caracterizado por la secuencia 5'-GCCA-3' en posición 30 a 33 del exón 2 de dicho alelo HLA-B con por lo menos un iniciador de amplificación del extremo 5' seleccionado a partir de la lista siguiente:

: 5'-AGGTATTTCTACACCGCCA-3' (B25P, SEC ID nº 1)

: o sus variantes de secuencia, como:

: 5'-AGGTATTTCCACACCGCCA-3' (SEC ID nº 2)

: 5'-AGGTATTTCGACACCGCCA-3' (SEC ID nº 3)

: u otras variantes secuenciales, conteniendo dichas variantes secuenciales deleciones, y/o inserciones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que la secuencia 5'-GCCA-3' del extremo 3' se mantenga y que estas variantes secuenciales puedan obtenerse para amplificar específicamente los mismos alelos HLA-B como el iniciador B25P o sus variantes tal como se han designado anteriormen- te,

: en combinación con un iniciador del extremo 3' apropiado escogido de los mismos alelos que los iniciadores del extremo 5' anteriormente definidos,

: estando posiblemente dichos iniciadores de los extremos 5' y 3'marcados e,

(iii): hibridación del producto amplificado, marcándolo posiblemente durante o después de la amplificación, en condiciones apropiadas con una o más sondas apropiadas seleccionadas de la región 15 a 261 de la región del exón 2 de HLA-B, estando dicha numeración de acuerdo con la de Zemmour y Parham, 1992,

(iv): lavado con condiciones de lavado apropiadas,

(v): detección de los híbridos formados, y

(vi): deducción de los alelos presentes a partir del patrón de hibridación observado.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado además porque se utiliza por lo menos uno de los siguientes iniciadores de amplificación del extremo 3':

5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCA-3' (B23P1, SEC ID nº 4),

o sus variantes secuenciales, tales como:

5'-TCTGGTTGTAGTAGCGGAGCG-3' (B23P2, SEC ID nº 5)

5'-TCCGCAGGTTCTCTCGGTA-3' (B23P3, SEC ID nº 6)

u otras variantes secuenciales, conteniendo dichas variantes secuenciales deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que dichas variantes secuenciales puedan obtenerse para amplificar específicamente los mismos alelos HLA-B como el iniciador B23P1 o sus variantes B23P2 o B23P3 tal como se han designado anteriormente, proporcionándose posiblemente dichos iniciadores con un marcaje detectable, tal como la biotina.

3. Método según alguna de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque utiliza para la amplificación por lo menos una de las siguientes combinaciones de conjunto de iniciadores:

- B25P/B23P1 en combinación con B25P/B23P2, o

- B25P/B23P1 en combinación con B25P/B23P3.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la reacción de amplificación con los dos conjuntos de iniciadores de elección se lleva a cabo en distintos tubos de reacción y los productos amplificados se hibridizan por separado.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la reacción de amplificación con los dos conjuntos de iniciadores de elección se lleva a cabo en distintos tubos de reacción y los productos amplificados se mezclan después de la amplificación y se hibridizan conjuntamente.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los iniciadores de elección se mezclan y la reacción de amplificación se lleva a cabo en un único tubo de reacción después de lo cual los productos amplificados se hibridizan conjuntamente.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque una o más sondas de hibridación se seleccionan a partir de la lista siguiente:

SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, SEC ID nº 16, SEC ID nº 17, SEC ID nº 18,SEC ID nº 19, SEC ID nº 20, SEC ID nº 21, SEC ID nº 22, SEC ID nº 23, SEC ID nº 24, SEC ID nº 25, SEC ID nº 26, y estando posiblemente dichas sondas marcadas, o conteniendo sondas derivadas de las, mismas grupos alifáticos NH_{2}, SH o carboxílicos.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque los productos de amplificación obtenidos se inmovilizan sobre un soporte sólido y se ponen en contacto con alguna de las sondas según la reivindicación 7 que se han marcado previamente.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque las productos de amplificación obtenidos, marcados durante o después de la amplificación, se ponen en contacto con un soporte sólido sobre el cual, se han inmovilizado previamente por lo menos una de las sondas según la reivindicación 7.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque los productos de amplificación obtenidos se hibridizan a sondas oligonucleótidas inmovilizadas en forma de líneas paralelas sobre tiras membranosas.

11. Utilización de una o más sondas según la reivindicación 7, para su inmovilización e incorporación a un ensayo de hibridación de fase inversa, preferentemente para la inmovilización en forma de líneas paralelas sobre un soporte sólido tal como una tira membranosa, para la tipificación de alelos HLA-B según un método tal como el que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Método para detectar e identificar nuevos alelos HLA-B, distintos de los alelos HLA-B conocidos, caracterizado porque comprende las etapas siguientes de:

-: determinar a qué tipo de HLA-B pertenece el ácido nucleico presente en una muestra biológica, según el procedimiento que se se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

-: en el caso de observar una muestra que no genera un patrón de hibridación compatible con los definidos en la Tabla 1, secuenciar la porción de la secuencia del exón 2 de HLA-B que corresponde a la sonda que se hibridiza de forma anómala del nuevo alelo HLA-B que debe ser determinado.

13. Método para discriminar entre B72 (B*1503) y los alelos de HLA-B no-B72 (B70, B71, es decir, alelos diferentes de B* 1503), utilizando el método según la reivindicación 12, estando dichos alelos HLA no B-72, caracterizados porque no forman un híbrido con por lo menos una de las sondas que se hibridizan al alelo B*1503 (por ejemplo la sonda 13 (SEC ID nº 19), la sonda 7 (SEC ID nº 13), la sonda 10 (SEC ID nº 16), la sonda 18 (SEC ID nº 24) y la sonda 19 (SEC ID nº 25).

14. Producto de amplificación obtenido con el conjunto de iniciadores B25P/B23P1 (SEC ID nº 1 y 4) de un alelo HLA-B que corresponde a un tipo HLA-B B70 indeterminado a nivel secuencial del ácido nucleico, determinado según el método de la reivindicación 13, estando dicho producto de amplificación caracterizado porque forma un híbrido con la sonda 2 (SEC ID nº 8,), mientras que no forma un híbrido con la sonda 13 (SEC ID nº 19), bajo las condiciones siguientes:

-: prehibridación de las membranas a 54ºC durante 30 minutos en Tris-HCl 50 mM pH 8, SDS al 0,1%, EDTA 2 mM, TMAC 3M;

-: hibridación a 54ºC durante 1 hora en la misma solución después de añadir 3 pmol/ml de la sonda oligonucleótida monocatenaria marcada con DIG;

siendo dicho alelo diferente del alelo HLA-B B*1503 en por lo menos una posición nucleótida en la región que abarca los nucleótidos 192 a 209, estando dicha numeración de acuerdo con Zemmour y Parham, 1992.

15. Composición que comprende por lo menos uno de los iniciadores oligonucleótidos de amplificación seleccionado a partir de la lista siguiente:

5'-AGGTATTTCTACACCGCCA-3' (B25P)

o sus variantes de secuencia, tales como:

5'-AGGTATTTCCACACCGCCA-3'

5'-AGGTATTTCGACACCGCCA-3'

u otras variantes secuenciales de los mismos, conteniendo dichas variantes secuenciales deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que la secuencia GCCA del extremo 3' se mantenga y que dichas variantes secuenciales puedan obtenerse para amplificar específicamente los mismos alelos HLA-B como el iniciador B25P o sus variantes como se han designado anteriormente, posiblemente en combinación con por lo menos uno de los iniciadores de la siguiente lista:

5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCA-3' (B23P1, SEC ID nº 4),

o sus variantes secuenciales, tales como:

5'-TCTGGTTGTAGTAGCGGAGCG-3' (B23P2, SEC ID nº 5)

5'-TCCGCAGGTTCTCTCGGTA-3' (B23P3, SEC ID nº 6)

u otras variantes secuenciales de los mismos, conteniendo dichas variantes secuenciales deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que las variantes secuenciales puedan obtenerse para amplificar específicamente los mismos alelos HLA-B como el iniciador B23P1 o sus variantes B23P2 o B23P3 tal como se han designado anteriormente, proporcionándose posiblemente dichos iniciadores con un marcaje detectable, tal como la biotina.

16. Composición que comprende por lo menos una sonda oligonucleótida seleccionada a partir de la siguiente lista de sondas:

17. Soporte sólido, preferentemente una tira membranosa, que lleva en su superficie una o más sondas según la reivindicación 16, acopladas al soporte en forma de líneas paralelas.

18. Equipo para tipificar por lo menos un alelo HLA-B a partir de una muestra biológica capaz de contenerlo, que comprende los siguientes componentes:

-: por lo menos iniciador de amplificación seleccionado de entre cualquiera de los de la reivindicación 15.

-: por lo menos una sonda inmovilizada (o inmovilizadas) preferentemente sobre un sustrato sólido, y más preferentemente sobre una e idéntica tira membranosa, seleccionándose dicha sonda (o sondas) de entre cualquiera de las que se definen en la reivindicación 16.

-: medios para detectar los híbridos que resultan de la hibridación precedente, cuando sea apropiado.

19. Equipo para tipificar por lo menos un alelo HLA-B a partir de una muestra biológica capaz de contenerlo, más particularmente de una muestra capaz de contener tipos de HLA-B difíciles de tipificar serológicamente, consecutivo a la amplificación de los nucleótidos que codifican los alelos HLA-B presentes en dicha muestra, que utiliza una o más combinaciones de conjuntos de iniciadores según un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende:

-: que además incluye posiblemente un dispositivo de interpretación y exploración automatizado para interpretar los resultados y deducir el alelo presente, a partir del patrón de hibridación observado.

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