ES2123775T5 - Procedimiento para la tipificacion de hla-b por medio de iniciadores especificos y conjuntos de sondas. - Google Patents
Procedimiento para la tipificacion de hla-b por medio de iniciadores especificos y conjuntos de sondas.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA TIPIFICAR O SUBTIPIFICAR HLA-B QUE SE CARACTERIZA POR LA SECUENCIA GCCA EN LA POSICION 30 A 33 DE EXON 2 (CON DICHA NUMERACION ESTANDO DE ACUERDO CON ZEMMOUR Y PARHAM, 1992), SUJETO A ESTAR PRESENTE EN UNA MUESTRA, CON DICHO METODO QUE COMPRENDE AL MENOS LOS SIGUIENTES PASOS: I) AMPLIFICAR EL HLA-B CON AL MENOS UN ELEMENTO PRIMARIO DE AMPLIFICACION DEL EXTREMO 5'' DE LA SIGUIENTE LISTA: 5''-AGGTATTTCTACCCGCCA-3'' (B25P) O VARIANTES DE LA SECUENCIA DEL MISMO, EN COMBINACION CON UN ELEMENTO FUNDAMENTAL DEL EXTREMO 3'' APROPIADO ESCOGIDO ENTRE LOS MISMOS QUE LOS ELEMENTOS FUNDAMENTALES ANTES DEFINIDOS DEL EXTREMO 5'', ESTANDO POSIBLEMENTE ETIQUETADOS LOS ELEMENTOS FUNDAMENTALES DE LOS EXTREMOS 5'' Y 3''; II) HIBRIDIZAR EL PRODUCTO AMPLIFICADO, SIENDO ETIQUETADO DURANTE O DESPUES DE LA AMPLIFICACION, EN CONDICIONES APROPIADAS CON UNA O MAS SONDAS ADECUADAS SELECCIONADAS ENTRE LA REGION 15 A 261 DE LA REGION EXON 2 DEL HLA-B, ESTANDO DICHA NUMERACION DE ACUERDOCON ZEMMOUR Y PARHAM, 1992, III) LAVAR EN CONDICIONES DE LAVADO APROPIADAS; IV) DETECTAR LOS HIBRIDOS FORMADOS; Y V) INGERIR EL HLA-B PRESENTA A PARTIR DEL MODELO DE HIBRIDIZACION OBSERVADO.
Description
Procedimiento para la tipificación de
HLA-B por medio de iniciadores específicos y
conjuntos de sondas.
La invención se refiere a un procedimiento y a
reactivos para la tipificación del ADN de los alelos
HLA-B.
El problema técnico fundamental de la presente
invención es proporcionar un método de tipificación del ADN por
medio de conjuntos específicos de sondas e iniciadores que permitan
la discriminación de los alelos HLA-B, especialmente
aquellos que son difíciles de discriminar mediante medios
serológicos.
El sistema Antigénico Leucocitario Humano (HLA)
comprende una serie de genes unidos en el brazo corto del cromosoma
6. Se definen tres tipos de genes: los antígenos tipo I (HLA A, B,
C) compuestos de una cadena \alpha no asociada covalentemente con
la \beta2 microglobulina, codificados en el cromosoma 15; los
antígenos de tipo II (DP, DQ, DR) compuestos de una cadena \alpha
y una \beta; los productos de tipo III que corresponden a
componentes del sistema de complemento. Los antígenos tipos I y II
son glicoproteínas transmembranosas polimórficas y comparten un
papel inmunológico común en la presentación del antígeno. La
presentación restringida por el tipo I HLA de los antígenos extraños
conduce a los receptores de las células T citotóxicas en los
linfocitos T maduros. Además, los antígenos de tipo I y II juegan un
papel crucial en la inmunología del trasplante y en la
susceptibilidad a las enfermedades autoinmunes.
Existen extensos polimorfismos en la mayoría de
los loci. En vista de la importancia médica y biológica de
tales antígenos, es necesaria una técnica rápida y muy sensible para
la tipificación de HLA. Se han utilizado hasta ahora distintos
protocolos: serológicos, celulares y polimorfismo de fragmentos de
resticción basado en el ADN (RFLP) y, recientemente, también métodos
de hibridación de oligonucleótidos de secuencia específica (SSO). La
tipificación del ADN mediante hibridación de oligonucleótidos
proporciona la mejor definición directa de los polimorfismos de HLA
cercana al análisis secuencial completo. Sin embargo, el análisis
secuencial es caro y lleva tiempo y, por tanto, no es el método a
elegir para las aplicaciones rutinarias.
Los polimorfismos tienen un significado
fundamental para la función de los antígenos HLA y la mayoría se
localizarán en exones que codifican dominios extracelulares
importantes funcionalmente.
Para los genes de tipo I, la mayoría de los
polimorfismos se localizan en los dominios aminoterminales \alpha1
y \alpha2. El dominio \alpha3 es un dominio de tipo
inmunoglobina muy conservado. Se han identificado un total de 40 HLA
A, 64 HLA B y 24 HLA C alelos (Zemmour y Parham, Tissue Antigens,
40: 221-228, 1992). Existe diversidad entre
los distintos alelos en regiones específicas del dominio \alpha1 y
\alpha2. Tiene lugar, entre distintos alelos un patrón en mosaico
con fragmentos cortos de homología. Mecanismos genéticos tales como
la recombinación homóloga y la mezcla de exones han llevado a la
diversidad alélica específica del locus (Parham et al.
PNAS (USA) 85:4005-4009, 1988).
Se han desarrollado distintos métodos de
tipificación para discriminar entre alelos distintos de los
loci muy polimórficos del tipo I y II. Un repaso a estos
métodos distintos de tipificación se ofrece seguidamente:
- Serología: En un ensayo de microtoxicidad, antisueros para los distintos antígenos de tipo HLA I o II se incuban con linfocitos lisados purificados. Las células lisadas se tiñen con eosina u otros colorantes, mientras las células no lisadas permanecen sin teñir. Este método se utiliza para los alelos de tipo I A, B, C y los tipos II DR y DQ. Los alelos DP no pueden tipificarse debido a su límite de expresión demasiado bajo y a una disponibilidad limitada de los antisueros. La reacción para los alelos de tipo II se lleva a cabo sobre linfocitos B purificados. Es posible una determinación limitada de grupos supertipos de alelos sin ulterior tipificación. Tres alelos del locus HLA C permanecen serológicamente indefinidos. Debido a que se detectan los epítopos sobre la molécula HLA, la discriminación entre las cadenas \alpha y \beta resulta imposible y se identifica al heterodímero \alpha\beta. Los alosueros contra las moléculas de tipo II están a menudo contaminados por anti-tipo I y requieren ser absorbidos antes de utilizarlos. Tienen lugar reacciones cruzadas entre alelos en el mismo o en distinto locus, lo que hace que el análisis del resultado sea difícil. Aún cuando se utilicen anticuerpos monoclonales, el problema de las reacciones cruzadas no está resuelto. Aunque este es un método muy rápido (3 horas para la tipificación completa), los principales problemas son resultados erróneos e incompletos.
- Métodos celulares: Se ha desarrollado una reacción de mezcla de linfocitos (MLR) basada en la respuesta proliferativa de los cultivos de células T a la estimulación mediante células irradiadas homocigóticas de tipificación. La proliferación se mide mediante incorporación de H^{3} timidina. Este método se utiliza para la tipificación HLA tipo II de los alelos DR y DQ. La tipificación de DP es también imposible debido al bajo nivel de la expresión de su membrana. Estos análisis definen las especificidades DW que subdividen ulteriormente las especificidades serológicas. Las especificidades HLA DW están determinadas por los antígenos DR y DQ, pero se asocian casi siempre con un alelo particular en el locus DR y DQ. Puede llevarse a cabo una MLR secundaria para la tipificación de HLA DP. Este análisis se basa en las respuestas secundarias in vitro o de memoria. Cuando los linfocitos han respondido a las células estimulantes irradiadas, tras 10 días de cultivo revierten desde la expansión de las células blásticas a la producción de pequeños linfocitos. Estas células tienen la capacidad de proporcionar una respuesta más intensa y acelerada en el cultivo a las células estimuladoras irradiadas que deben ser tipificadas y que comparten el antígeno con las primeras células estimuladoras que dieron la reacción positiva inicial (Festenstein y Ollier, 1987). Aunque muy completo y correcto, este análisis lleva mucho tiempo y es difícil de llevar a cabo.
- Se desarrollaron distintos métodos de tipificación del ADN que tienen la ventaja de no estar relacionados con la expresión superficial de los antígenos. Se ofrece un repaso de dichos métodos de tipificación del ADN:
- Métodos del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP): El ADN de alto peso molecular se digiere con varios enzimas de restricción, se separa según el tamaño mediante electroforesis en gel, se emborronan con él los filtros y se hibridiza a sondas cADN HLA DQA, DQB, DPB o DRB. Se obtiene un patrón distinto de bandas para los diferentes alelos. Se utilizó el análisis secuencial para encontrar los distintos polimorfismos de los sitios de restricción y determinar los diferentes enzimas que se debían utilizar. Este método, sin embargo, adolece de ciertas desventajas: se requieren grandes cantidades de ADN de alto peso molecular, no se pueden distinguir muchos alelos, utilización de varios enzimas de restricción y detección de diferencias fenotípicamente irrelevantes de aminoácidos específicos.
- Métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Debido a que las secuencias de todos los alelos de tipo II son conocidas, pueden diseñarse iniciadores locus-específicos para amplificar las regiones polimórficas. Después de la amplificación, grandes cantidades de secuencias específicas se analizan mediante análisis RFLP o mediante hibridación SSO. El producto PCR puede digerirse mediante distintos enzimas de restricción y los fragmentos separarse mediante electroforesis en gel. Una alternativa es el método de hibridación. Se diseñan oligonucleótidos secuencia-específicos (SSO's). La hibridación puede llevarse a cabo mediante un procedimiento convencional de transferencia. Los productos PCR están unidos covalentemente a una membrana e hibridizados a SSOs marcado con ^{32}P. Son posibles otros métodos de marcaje. La detección de las señales positivas se realiza mediante autorradiografía. Debido a que todos los SSOs pueden diferir en longitud y en el contenido en GC, son necesarias posiblemente distintas temperaturas de hibridación para los SSOs distintos en el enfoque convencional de transferencia.
Las técnicas convencionales serológicas y
citológicas de tipificación para los antígenos del tipo HLA I están
bien establecidas. Sin embargo, pueden tener lugar resultados
erróneos debido a la especificidad de los antisueros, a la presencia
de auto-anticuerpos o a la medicación. Para
HLA-B, existe experiencia de problemas de
tipificación con los tipos siguientes:
| Denominación serológica | Alelo correspondiente |
| B54 (22) | B*5401 |
| B52 (5) | B*5201/B*52012 |
| B78 | B*7801 |
| B62 (15) | B*1501/B*1504 |
| B75 (15) | B*1502 |
| B72 (70) | B*1503 |
| B71 (70) | todavía no conocido |
| B46 | B*4601 |
| B79 | B*7901 |
| B58 (17) | B*5801 |
| B53 | B*5301 |
| B5102 (B5/B35) | B*5102 |
| B5103 (BTA) | B*5103 |
Un sistema de tipificación basado en el ADN
mejorará mucho y acelerará la identificación de estos tipos
HLA-B difíciles. Consecuentemente, esto tendrá un
impacto beneficioso en la tasa de éxito de los trasplantes de médula
ósea y de órganos y en los costes totales derivados de ello. Existe
una amplia evidencia de que existe una alta correlación entre la
tasa de éxito de los trasplantes y la compatibilidad
HLA-B del donante y del receptor.
Además, una tipificación HLA-B
más precisa mejorará o facilitará también los estudios de
susceptibilidad a las enfermedades y las investigaciones
forenses.
Debe apuntarse que, en general, se preferirán los
métodos de tipificación del ADN a los serológicos, siempre que esté
disponible un método de tipificación de ADN fácil, rápido y seguro.
Esto se debe al hecho de que algunas diferencias a nivel subtipo
(que son habitualmente detectables mediante los métodos de ADN)
podrían permanecer indetectables mediante los métodos de
tipificación serológica habituales, aunque estas diferencias podrían
provocar un rechazo del injerto (Fleischhauer et al.,
N.Eng.J.Med. 323:1818-1822, 1990).
Contrariamente a la aplicación exitosa de la
biología molecular para la definición de los genes HLA tipo II, el
desarrollo de la tipificación molecular del tipo I permanece
difícil. Esto se debe al marcado polimorfismo, a la acusada
complejidad de las sustituciones de nucleótidos y a la presencia de
numerosos genes y pseudogenes no clásicos de tipo I que existen en
esta región. Los antígenos de tipo I se caracterizan por reactividad
cruzada entre distintos alelos, sobre todo en los antígenos
HLA-A y -B que definen grupos de reactividad cruzada
serológica (CREGs). Los alelos HLA-A y B se dividen,
respectivamente, en cinco y diez familias CREG clásicas. Hasta la
fecha, todas las especificidades HLA-A conocidas se
han secuenciado llevando a la definición de homología de secuencia
que explica estas reacciones cruzadas y la capacidad reciente para
utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando
iniciadores específicos de secuencia (SSP). En cambio, los alelos
HLA-B se caracterizan por un polimorfismo mayor y
por un nivel más alto de reactividad cruzada. Además, una proporción
sustancial de los alelos B todavía no se han secuenciado. La
correlación entre la reactividad cruzada y las secuencia de ADN
presenta algunas discrepancias.
El número de publicaciones que trata de la
tipificación de los alelos de tipo I mediante PCR y sondas de ADN es
limitado en comparación con las dedicadas al tipo II. Excepto en el
caso de la publicación de Yoshida et al (1992, véase más
adelante), los alelos que constituyen el objeto de la presente
invención no se tienen en cuenta en estos estudios. Summers et
al (Hum. Immunol. 32:176-182, 1991) describieron
la utilización de la PCR de los alelos de tipo I para secuenciación.
La combinación de la PCR y de las hibridaciones clásicas de
transferencia con sondas oligonucleótidas para la discriminación de
los alelos B44 (B* 4401, B* 4402), se ha descrito por Fleischhauer
et al., N.Eng.J.Med. 323:1818-1822,
1990).
Dos grupos de investigadores informaron sobre
tipificación y subtipificación del ADN de los alelos
HLA-B27 (Hill et al., The Lancet, 337,
640-642, 1991; Dominguez et al., Immunogenetics
36:277-282, 1992). Hernandez-Viña
et al. (Hum. Immunol. 33; 163-173, 1992)
describieron la tipificación de oligonucleótidos subsiguiente a la
amplificación PCR para los alelos HLA-A2 y
HLA-A28: y un enfoque de tipificación más general
para los alelos HLA-A utilizando el sistema de
amplificación refractario ha sido recientemente descrito por Krausa
et al. (The Lancet, 341:121-122, 1993).
Yoshida et al. (Hum. Immunol.
34:257-266, 1992) combinaron también la PCR con un
enfoque clásico de transferencia y/o un análisis de polimorfismo de
confirmación monocatenario. Diseñaron combinaciones de
iniciador-PCR y sondas para tipificación de
especificidades 26 HLA-B. Su enfoque de la
tipificación se basa primariamente en la utilización de
amplificación diferencial con iniciadores que discriminan entre
subtipos Bw4 y Bw6 y la utilización de un iniciador con un
HLA-B específico en el extremo 5'. Con los conjuntos
de iniciadores y las sondas que se han descrito, estos autores no
discriminaron los alelos siguientes: B* 5401, B* 7801 y B* 7901, los
cuales son también difíciles de tipificar mediante los métodos
convencionales. Ni pueden discriminar entre B* 5201 y B* 52012, ni
entre los alelos B53 y B51, ya que las diferencias secuenciales
entre estos alelos se localizan por fuera de la región amplificada
con sus iniciadores.
La presente invención se dirige de este modo a
proporcionar un método para la tipificación o subtipificación del
ADN de uno o más alelos HLA-B mediante un enfoque de
hibridación.
Más particularmente, la presente invención se
refiere a un método para la tipificación y/o la subtipificación del
ADN de aquellos alelos HLA-B para los que los
correspondientes procedimientos de tipificación serológica muestran
problemas o no son posibles. Los alelos más importantes en relación
a los cuales los procedimientos de tipificación serológica muestran
problemas son los siguientes
| Denominación serológica | Alelo correspondiente |
| B54 (22) | B*5401 |
| B52 (5) | B*5201/B*52012 |
| B78 | B*7801 |
| B62 (15) | B*1501/B*1504 |
| B75 (15) | B*1502 |
| B72 (70) | B*1503 |
| B71 (70) | todavía no conocido |
| B46 | B*4601 |
| B79 | B*7901 |
| B58 (17) | B*5801 |
| B53 | B*5301 |
| B5102 (B5/B35) | B*5102 |
| B5103 (BTA) | B*5103 |
Según otra forma de realización, la presente
invención se dirige a proporcionar oligonucleótidos de secuencia
específica que permiten la tipificación del ADN de los alelos
HLA-B en relación a los cuales los procedimientos de
tipificación serológica muestran problemas, tal como los alelos
seleccionados a partir de la lista que se presenta
anteriormente.
Según todavía otra forma de realización, la
presente invención se dirige a proporcionar iniciadores de secuencia
específica que permitan la tipificación del ADN de los alelos
HLA-B en relación a los cuales el procedimiento de
tipificación serológica muestra problemas, tales como los alelos
seleccionados a partir de la lista que se presenta
anteriormente.
La presente invención se dirige también a
proporcionar composiciones o soportes sólidos que comprenden por lo
menos uno de los oligonucleótidos de secuencia específica y/o
iniciadores específicos anteriormente mencionados.
Más particularmente, el método de la invención se
dirige a amplificar el exon 2 de un subconjunto específico de los
alelos HLA-B, que corresponde a los alelos en
relación a los cuales el procedimiento de tipificación serológica
causa problemas, mediante iniciadores específicos (SPs) e hibridizar
subsiguientemente los productos amplificados a un conjunto apropiado
de oligonucleótidos de secuencia específica (SSOs) que cubren la
región amplificada del exón 2 de HLA-B.
La presente invención se dirige asimismo a
proporcionar equipos para la tipificación del ADN de alelos
HLA-B en relación a los cuales el procedimiento de
tipificación serológica causa problemas, tales como los alelos
seleccionados de la lista que se ha presentado anteriormente.
La presente invención cumple los objetivos
anteriormente mencionados, proporcionando nuevos procedimientos y
reactivos. Más particularmente, la presente invención cumple las
necesidades anteriomente mencionadas proporcionando un conjunto
específico de iniciadores específicos (SPs) y oligonucleótidos de
secuencia específica (SS)s), y equipos para llevar a la
práctica dichos métodos, que proporcionan juntos un sistema preciso,
rápido y sencillo para tipificar los alelos en los genes
HLA-B.
El nuevo procedimiento y los reactivos según la
invención pueden a su vez conducir al descubrimiento de alelos
HLA-B previamente desconocidos, los cuales pueden
también tipificarse e identificarse mediante dicho método. También
algunos otros tipos (que no se han relacionado en la tabla anterior)
pueden causar dificultades de tipificación mediante métodos
serológicos, tales como B76, B77, B61, B67 y B59. Aunque las
secuencias del ácido nucleico no se conocen todavía, a veces es
posible predecir si pueden o no tipificarse estas especificidades
utilizando el enfoque de la presente invención. Esto se
ejemplificará más adelante en la presente memoria para B71.
La expresión "tipificación o
subtipificación" debe entenderse como la determinación y/o la
discriminación del tipo o subtipo presente en una muestra biológica.
Por tipo o subtipo se entienden todas las variantes que pueden
discriminarse mediante dicho método de tipificación. En el caso de
discriminar el tipo de un alelo, el método de tipificación determina
la presencia de dicho alelo específico.
Los tipos serológicos oficialmente reconocidos
(denominados también especificidades HLA) y sus alelos
correspondientes (si la secuencia se conoce) están reunidos en una
lista de referencia fechada anualmente (Bodner et al., Tissue
Antigens, 39:161-173, 1992).
El método de la presente invención se basa en una
amplificación del exón 2 de un subconjunto de alelos
HLA-B que esté presente posiblemente en la muestra,
con conjuntos particulares de iniciadores de amplificación (a los
que se hace referencia también como SPs). Subsiguientemente, los
productos amplificados se hibridizan a un conjunto apropiado de
sondas de ADN (a las que se alude también como SSOs), después de lo
cual los híbridos formados se detectan, deduciéndose el tipo de
HLA-B a partir del patrón de hibridación generado.
En este enfoque, que se dirige particularmente a la identificación
de tipos que son difíciles de distinguir o que no son distinguibles
en absoluto mediante las técnicas serológicas, es particularmente
ventajoso que el iniciador de amplificación del extremo 5' hace
diana específicamente en la región 30 a 33 del exón 2 de los alelos
HLA B (según la numeración dada por Zemmour y Parham, 1992). Según
los datos secuenciales dados por estos autores, todos los alelos
conocidos que pueden determinarse según la presente invención tienen
la secuencia siguiente en posición 30 a 33 en el exón 2:
5'-GCCA-3'. Por tanto, un iniciador
de amplificación que acaba en esta secuencia amplificará todos los
alelos deseados, y excluirá simultáneamente la amplificación del
exón 2 de otros muchos alelos HLA-B (que se
caracterizan por la secuencia correspondiente
5'-TCCG-3' en posición 30 a 33 del
exón 2), simplificando de este modo considerablemente el enfoque de
la tipificación del ADN. Los alelos del exón 2 de
HL-B de los cuales se conoce la secuencia de ADN
(Zemmour y Parham, 1992) y que se caracterizan por la secuencia
5'-GCCA-3' en posición 30 a 33 se
relacionan en la Tabla
1.
1.
La presente invención se refiere, por tanto a un
método para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos
HLA-B en una muestra caracterizada por la secuencia
5'-GCCA-3' en la posición 30 a 33
del exón de dicho alelo HLA-B (estando dicha
numeración de acuerdo con Zemmour y Parham, 1992) y, más
particularmente, a un método para discriminar los tipos
HLA-B que son serológicamente difíciles de
discriminar tales como por ejemplo B54 (22), B52(5), B7801,
B62(15), B75(15), B71(70), B72(70), B46,
B79, B53, B5102, B5103 y B58(17), comprendiendo dicho método
por lo menos las etapas siguientes:
\newpage
(i) posiblemente, extracción del ácido nucleico
de la muestra
(ii) amplificación del ácido nucleico de los
alelos HLA-B, caracterizado por la secuencia
5'-GCCA-3' en posición 30 a 33 del
exón 2 de dicho alelo HLA-B con por lo menos un
iniciador de amplificación del extremo 5' seleccionado a partir de
la lista siguiente:
5'-AGGTATTTCTACACCGCCA-3'
(B25P, SEC ID nº 1)
o sus variantes de secuencia,
como:
5'-AGGTATTTCCACACCGCCA-3'
(SEC ID nº 2)
5'-AGGTATTTCGACACCGCCA-3'
(SEC ID nº 3)
u otras variantes secuenciales, con
dichas variantes secuenciales conteniendo deleciones, y/o
inserciones, y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, teniendo en
cuenta que la secuencia GCCA del extremo 3' se mantenga y que estas
variantes secuenciales pueden obtenerse para amplificar
específicamente los mismos alelos HLA-B como el
iniciador B25P o sus variantes como se ha diseñado
anteriormente,
en combinación con un iniciador del
extremo 3' apropiado escogido de los mismos alelos que los
iniciadores del extremo 5' anteriormente
definidos,
estando posiblemente dichos
iniciadores de los extremos 5' y 3' marcados
e,
(iii) hibridación del producto amplificado,
marcándolo posiblemente durante o después de la amplificación, en
condiciones apropiadas con una o más sondas apropiadas seleccionadas
de la región 15 a 261 de la región del exón 2 de
HLA-B, estando dicha numeración de acuerdo con la de
Zemmour y Parham, 1992,
(iv) lavado en condiciones de lavado
apropiadas,
(v) detección de los híbridos formados, y
(vi) deducción de los alelos presentes a partir
del patrón de hibridación observado.
Con el objeto de llevar a cabo el procedimiento
de la presente invención tal como se ilustra anteriormente, puede
ser necesario realizar una extracción del ácido nucleico de la
muestra según alguno de los procedimientos conocidos en la técnica.
En caso de extracción de ARN, es necesaria la generación de cADN,
extrayéndose de otro modo cADN o ADN genómico.
El término "iniciador" se refiere a una
secuencia oligonucleótida de ADN monocatenario o iniciador
específico (SPs) capaz de actuar como un punto de iniciación para la
síntesis de un producto de extensión del iniciador el cual es
complementario a la cadena de ácido nucleico que va a copiarse. La
longitud y la secuencia del iniciador deben ser tal que permitan al
iniciador la síntesis de los productos de extensión. Preferentemente
el iniciador posee alrededor de 5-50 nucleótidos,
más preferentemente entre 10 y 21 nucleótidos aproximadamente. La
longitud y la secuencia específica del iniciador dependerán de la
complejidad de las dianas de ARN o ADN requeridas, así como de las
condiciones de la utilización del iniciador tales como temperatura y
fuerza iónica.
El hecho de que los iniciadores de amplificación
no tengan que emparejarse exactamente con la correspondiente
secuencia matricial para garantizar la amplificación apropiada,
teniendo en cuenta que un emparejamiento exacto se mantenga en los
últimos tres nucleótidos en el extremo 3' del iniciador, está
ampliamente documentado en la literatura (Kwok et al.,
Nucleic Acids Research 18:999-1005, 1990; Sommer y
Tautz, Nucleic Acids Research 17, 6749, 1989).
El término "sonda" se refiere a
oligonucleótidos de secuencia específica monocatenarios (SSO's) que
poseen una secuencia que es exactamente complementaria de la
secuencia diana del alelo que debe detectarse.
Las expresiones hibridación "apropiada" y
condiciones de lavado se refieren al hecho de que en la mayoría de
los casos dichas sondas son para hibridizar sólo secuencias
exactamente complementarias. Tales condiciones se ejemplifican en la
sección de Ejemplos. Por ejemplo, para la sonda 17 la hibridación y
las temperaturas de lavado preferidas son respectivamente 54ºC y
58ºC si se utiliza como solución de lavado e hibridación TMAC 3
M. En general, las condiciones de hibridación deben ser estrictas
tal como se conoce en la técnica (Maniatis et al, Molecular
Cloning: un Manual de Laboratorio, New York, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1982).
Sin embargo, según la solución de hibridación
(SSC, SSPE, etc), estas sondas deben hibridizarse a su temperatura
apropiada con objeto de alcanzar especificidad suficiente (en la
mayoría de casos, deben discriminarse diferencias a nivel de una
mutación puntual).
Se hace referencia a los iniciadores del extremo
5' anteriormente mencionados como iniciadores B25P.
El término "muestra" se refiere a cualquier
fuente de material biológico, por ejemplo manchas de sangre, pelo,
células epiteliales o células de sangre periférica. Las muestras
típicas pueden incluir células mononucleares de sangre periférica
(PBMNC's), progenies celulares linfoblásticas (LCL'S), células
pilosas o análogos. El ácido nucleico aislado preferido será ADN
genómico. Sin embargo, pueden también utilizarse poli(A) +
ARN citoplásmico y celular.
La expresión "deducción del alelo presente a
partir del patrón de hibridación observado" se refiere a la
característica central del método de tipificación de
HLA-B de la presente invención que implica la
identificación (a la que se hace también referencia como
determinación o discriminación) de los alelos HLA-B
presentes en la muestra mediante análisis del patrón de unión de un
conjunto de sondas oligonucleótidas. Aunque las sondas simples
pueden también proporcionar información útil, la variación de los
alelos HLA-B se dispersa naturalmente, por lo que
raramente es capaz cualquier sonda de identificar de modo único una
variante específica. Más bien, tal como se muestra en los Ejemplos,
la identidad de un alelo se deduce a partir del patrón de unión de
un conjunto de sondas oligonucleótidas, las cuales son específicas
para distintos segmentos de los diferentes alelos
HLA-B. Dependiendo de la elección de estos sondas
oligonucleótidas, cada alelo conocido corresponde a una patrón de
hibridación específico tras la utilización de una combinación
específica de sondas. Cada alelo será también capaz de ser
discriminado a partir de cualquier otro alelo amplificado con
idénticos iniciadores dependiendo de la elección de las sondas
oligonucleótidas. La comparación del patrón generado de las sondas
que se hibridan positivamente con una muestra que contiene uno o más
alelos HLA-B desconocidos con un esquema de los
patrones de hibridación esperados como por ejemplo el que se muestra
en la Tabla 1, permite deducir claramente los alelos
HLA-B presentes en dicha muestra.
Debido a que los alelos diana difieren algo en la
secuencia en el extremo 3' del exón 2 (Zemmour y Parham,1992) pueden
combinarse iniciadores de extremo 3' distinto con un iniciador de
extremo 5' (B25P o sus variantes) para cumplir la amplificación
específica de todos los alelos de interés.
La presente invención se refiere de este modo a
un método tal como se define anteriormente, caracterizado además
porque se utiliza por lo menos uno de los siguientes iniciadores de
amplificación del extremo 3' (B23):
5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCA-3'
(B23P1, SEC ID nº 4),
o sus variantes secuenciales, tales
como:
5'-TCTGGTTGTAGTAGCGGAGCG-3'
(B23P2, SEC ID nº 5)
5'-TCCGCAGGTTCTCTCGGTA-3'
(B23P3, SEC ID nº 6)
u otras variantes secuenciales,
conteniendo dichas variantes secuenciales deleciones y/o inserciones
y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que
dichas variantes secuenciales pueden obtenerse para amplificar
específicamente los mismos alelos HLA-B como el
iniciador B23P1 o sus variantes B23P2 o B23P3 tal como se han
designado anteriormente, proporcionándose posiblemente dichos
iniciadores con un marcaje detectable, tal como la
biotina.
Como se ha indicado, a estos iniciadores se hará
referencia ulteriormente como B23P1, B23P2 y B23P3,
respectivamente. Los iniciadores B23P1 y B23P2 tienen como diana la
región 241 a 261 en el exón 2 de HLA B; el iniciador B23P3 tiene
como diana la región 219 a 237 (numeración según Zemmour y
Parham,1992). Los alelos de los cuales la secuencia de ADN se
corresponde completamente con el extremo 3' de los iniciadores
mencionados anteriormente se identifican en la Tabla 1.
A partir de estos datos, puede concluirse que,
con el objeto de obtener la amplificación de todos los alelos
HLA-B de interés, la amplificación con el conjunto
de iniciadores
B25P/B23P1 debe combinarse por lo menos con uno
de los siguientes conjuntos:
B25P/B23P2
ó
B25P/B23P3.
A partir de los datos proporcionados en la Tabla
1 puede concluirse también que algunos alelos se amplifican
exclusivamente con un conjunto de iniciadores y no con una de las
otras combinaciones fijadas anteriormente. Por ejemplo, entre otros
alelos, B* 4601 o B* 7801 se amplifican solamente con el conjunto de
iniciadores B25P/B23P1. Mientras, por ejemplo, los alelos B* 1503 o
B* 5801 se amplifican con los conjuntos de iniciadores B25P/B23P1 y
B25P/B23P3, y B25P/B23P2 y B25P/B23P3, respectivamente.
Debe mencionarse asimismo que a partir de los
datos secuenciales disponibles (Zemmour y Parham,1992) pueden
seleccionarse otros iniciadores de amplificación del extremo 3' con
los cuales puede alcanzarse la amplificación de una parte particular
del exón 2 de los alelos HLA-B si se combina con el
iniciador del extremo 5' B25P o sus variantes.
En una forma de realización de la invención, la
amplificación con los dos conjuntos de iniciadores de elección se
lleva a cabo en distintos tubos de reacción y los productos
amplificados se hibridizan separadamente, tal como se indica en el
esquema de tipificación en la Figura 1.
En otra forma de realización de la invención, la
amplificación con los dos conjuntos de iniciadores de elección se
lleva a cabo en distintos tubos de reacción y los productos
amplificados se mezclan después de amplificación y se hibridizan
juntos.
En una forma de realización preferida de la
invención, los distintos iniciadores implicados (B25P, B23P1 y B23P2
o B25P, B23P1 y B23P3)se mezclan y la amplificación se lleva
a cabo en un tubo de reacción único, después de lo cual los
productos amplificados se hibridizan juntos.
El método de amplificación utilizado puede ser, o
bien PCR (Saiki et al., Science 239:487-491,
1988), la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico
(NASBA, Guateli et al., PNAS (USA),
87:1874-1878, 1990; Compton, Nature,
350:91-92, 1991), el sistema de amplificación basado
en la transcripción (TAS, Kwoh et al, Proc. Natl. Acad.Sci
(USA) 86:1173-1177, 1989), la amplificación por
desplazamiento de la cadena (SDA, Duck et al, Biotechniques
9:142-147, 1990; Walker et al. Proc. Natl.
Acad. Sci (USA) 89:392-396, 1992), la amplificación
mediante la replicasa Q\beta (Lizardi et al.,
Bio/Technology 6:1197-1202, 1988; Lorneli et
al., Clin. Chem, 35:1826-1831, 1989) o cualquier
otro método apropiado capaz de amplificar las moléculas del ácido
nucleico utilizando la extensión de los iniciadores. Durante la
amplificación, los productos amplificados pueden marcarse
convenientemente utilizando, bien iniciadores marcados o mediante la
incorporación de nucleótidos marcados. Los marcajes pueden ser
isotópicos (^{32}P, ^{35}S, etc) o no isotópicos (biotina,
digoxigenina, etc).
Con objeto de distinguir los alelos amplificados
de los otros, los productos de amplificación se hibridizan a un
conjunto de sondas secuencia-específicas de ADN (a
las que también se alude cono SSOs) que tienen como diana las
regiones del exón 2 de HLA-B localizado entre las
regiones seleccionadas del iniciador de amplificación. Pueden
utilizarse distintos formatos de hibridación tales como el formato
convencional de transferencia, la hibridación sandwich o la
hibridación inversa (tal como el formato de transferencia inversa).
Se seleccionó un conjunto particular de sondas de ADN que permite
distinguir los alelos de interés de los otros y de otros alelos que
se describen, si estos alelos están o no presentes en forma
homocigótica o heterocigótica.
Para esto, se identificaron 20 secuencias básicas
de sondas de ADN que se diseñaron para ser funcionales en
condiciones de hibridación y lavado TMAC (cloruro de
tetrametilamonio) tal como se ilustra en la sección de Ejemplos. La
mayoría de estos sondas hacen diana en las regiones más variables
del exón 2 de HLA-B y pueden hibridizar a más de un
alelo HLA-B. Algunas sondas se seleccionaron a causa
de que son alelo-específicas; estas sondas son la 8
(SEC ID nº 14), 12 (SEC ID nº 18), y la 16 (SEC ID nº 22) que
hibridizan exclusivamente a B*5401, B*4601 y B*7901 respectivamente.
Las regiones diana para las distintas sondas se representan
esquemáticamente en la Figura 2. En la Tabla 2, se dan las
secuencias de las sondas. Se proporciona una interpretación en la
Tabla 1. Más adelante, las mismas 20 sondas básicas o sus variantes
se ensayaron en condiciones de lavado e hibridación específicas para
SSPE tal como se revisa en el Ejemplo 5 y en la Tabla 2 bis. Como
puede apreciarse en la Tabla 2 bis, 9 de las sondas originalmente
ensayadas con TMAC y algunas de las nuevas sondas variantes se
prefieren particularmente respecto a otras bajo las condiciones SSPE
específicas de tampón utilizadas.
La presente invención se refiere por tanto a un
método tal como se ha definido anteriormente, en el que una o más
sondas de hibridación se seleccionan a partir de la Tabla 2 (SEC ID
nº 7 a 26).
Según la solución de hibridación (SSC, SSPE,
TMAC, etc) estas sondas deben hibridizarse estrictamente a su
temperatura apropiada con objeto de alcanzar suficiente
especificidad (en la mayoría de los casos, pueden discriminarse
diferencias a nivel de una mutación puntual). También, el cambio de
la cantidad (concentración) de sonda utilizada respecto uno a otro
puede ser beneficioso para obtener unos resultados de hibridación
más específicos. Debe tenerse en cuenta en este contexto, que
contrariamente a las soluciones tamponadas SSPE, las sondas de la
misma longitud, a pesar de su contenido en GC, hibridizarán
específicamente en soluciones TMAC a aproximadamente la misma
temperatura (Jacobs et al., Nucleic Acids Research
16:4637-4650, 1988).
En la sección de Ejemplos de la presente
invención se ilustran sondas básicas preferidas que utilizan
distintas condiciones de tampón de lavado y de hibridación. Las
sondas preferidas se incluyen en la reivindicación 7.
Entre los alelos que constituyen el objetivo de
la presente invención, B* 1501 y B* 1504 no pueden discriminarse uno
de otro, ya que estas secuencias son exactamente las mismas en el
segundo exón. Se encuentran diferencias entre ambos alelos en el
extremo 5' del exón 3 (Zemmour y Parham, 1992). Por la misma razón
B* 5101 no puede distinguirse de B*5104. También para estos alelos
la discriminación puede alcanzarse en el exón 3 (Zemmour y Parham,
1992). Por tanto, un sistema de tipificación más completo incluirá
una combinación de sonda e iniciador para discriminar entre los
tipos en el exón 3.
Los métodos de tipificación del ADN anteriormente
mencionados en los que se utiliza el par de iniciadores B25P/B23P2 y
se observa la hibridación con SSO's 7 (SEC ID nº 13) y 9 (SEC ID nº
15) se llevan a cabo preferentemente adicional y separadamente con
el par de iniciadores B25P y B23P1 y/o los iniciadores B23P3. Para
esta última aplicación, puede utilizarse como alternativa para el
iniciador B25P un iniciador con la secuencia siguiente:
5'-GACGACACG/CCT/AGTTCGTGA-3'
\hskip0.5cmB25PX1 (SEC ID nº 53)
Tal como se detalla en la sección de Ejemplos,
este paso de amplificación adicional descarta la posibilidad de que
tenga lugar la co-amplificación del pseudogen
HLA-AR (cuando se utiliza el iniciador B23P2) y esto
permite un procedimiento de tipificación de HLA-B
más preciso.
Métodos de ensayo apropiados para la finalidad de
la presente invención de detectar híbridos formados entre las sondas
oligonucleótidas y las secuencias ácido nucleicas en una muestra,
pueden comprender cualquiera de los formatos de ensayo que se
conocen en la técnica. Por ejemplo, la detección puede realizarse
utilizando un formato de transferencia, uniéndose la muestra
amplificada no marcada a una membrana, incorporándose ésta con por
lo menos una sonda marcada bajo condiciones de lavado e hibridación
apropiadas y monitorizándose la presencia de la sonda unida. Las
sondas pueden marcarse con radioisótopos o con marcadores que
permitan la detección cromogénica o quimioluminiscente tales como
las sondas unidas a la peroxidasa de rábano.
Una alternativa es un formato de transferencia
"inversa", en el que la secuencia amplificada contiene un
marcador. En este formato, las sondas oligonucleótidas no marcadas
se unen a un soporte sólido y se exponen a la muestra marcada bajo
apropiadas condiciones de hibridación estrictas y de lavado
subsiguientes. Debe entenderse que también cualquier otro método de
ensayo que dependa de la formación de un híbrido entre los ácidos
nucleicos de la muestra y las sondas oligonucleótidas según la
presente invención, puede utilizarse.
Según una forma de realización ventajosa, el
procedimiento de tipificar los alelos HLA-B
contenidos en una muestra biológica comprende las fases de contactar
las copias amplificadas derivadas del material genético, con un
soporte sólido sobre el cual, sondas tal como anteriormente se han
definido, se han inmovilizado previamente.
El término "soporte sólido" puede referirse
a cualquier sustrato al cual una sonda oligonucleótida puede
acoplarse, teniendo en cuenta que conserve sus características de
hibridación y teniendo en cuenta que el nivel anterior de
hibridación permanezca bajo. El sustrato sólido será habitualmente
un placa de microtitulación, una membrana (por ejemplo, de nylon o
nitrocelulosa) o una microsfera (perla). Antes de la aplicación a la
membrana o fijación puede ser conveniente modificar la sonda de
ácido nucleico con objeto de facilitar la fijación o mejorar la
eficiencia de la hibridación. Algunas modificaciones pueden abarcar
la eliminación de homopolímeros, y el acoplamiento con distintos
grupos reactivos tales como grupos alifáticos, grupos NH_{2},
grupos SH, grupos carboxílicos, o el coplamiento con biotina o
haptenos.
Según otra forma de realización ventajosa, el
procedimiento de tipificar los alelos HLA-B
contenidos en una muestra biológica comprende las fases de contactar
copias amplificadas derivadas del material genético, con sondas
oligonucleótidas que se han inmovilizado como lineas paralelas sobre
un soporte sólido.
Según esta forma de realización preferida de la
presente invención, una o más de las sondas anteriormente definidas
se utilizan para la inmovilización e incorporación a un ensayo de
hibridación de fase inversa, preferiblemente para la inmovilización
como lineas paralelas sobre un soporte sólido tal como una tira
membranosa, para la tipificación de los alelos HLA-B
según un método tal como el definido anteriormente. Según este
método ventajoso, las sondas se inmovilizan en un formato de Ensayo
de Sonda Lineal (LiPA). Este es un formato de hibridación inversa
(Saiki et al., PNAS (USA):86:6230-6234, 1989)
que utiliza tiras membranosas sobre las que se aplican
convenientemente 20 ó más sondas oligonucleótidas (que incluyen
oligonucleótidos de control positivo o negativo) como lineas
paralelas. Las tiras LiPA se preparan tal como se describe por
Stuyver et al. (J.Gen.Virol,
74:1093-1102,1993).
La presente invención se refiere también por
tanto a un soporte sólido, preferentemente una tira membranosa, que
porta en su superficie, una o más sondas tal como se han definido
anteriormente, acopladas al soporte en forma de lineas
paralelas.
LiPA es un ensayo de hibridación muy rápido y
agradable de realizar. Los resultados pueden leerse 4 horas después
del comienzo de la amplificación. Después de ésta, durante la cual
se incorpora habitualmente un marcaje no isotópico en el producto
amplificado, y de desnaturalización alcalina, el producto
amplificado se contacta con las sondas en la membrana y la
hibridación se lleva a cabo durante 1 a 1,5 horas. Después de un
lavado breve (10 a 30 min) el procedimiento de detección empieza.
Todos estos pasos se llevan a cabo en los mismos recipientes de
hibridación, minimalizando de este modo el tiempo. A partir del
patrón de hibridación generado, el alelo (o alelos)
presente(s) HLA-B puede deducirse bien
visualmente, pero preferentemente utilizando software dedicado. El
formato LiPA es completamente compatible con dispositivos de escaneo
comercialmente disponibles, haciendo de este modo que la
interpretación automática de los resultados sea posible. Todas estas
ventajas hacen que el formato LiPA sea capaz para utilizar la
tipificación de HLA de forma rutinaria. El formato LiPA debe ser
particularmente ventajoso para tipificar aquellos alelos que son
difíciles de tipificar mediante medios serológicos rutinarios.
La presente invención se refiere asimismo a un
método para detectar e identificar nuevos alelos
HLA-B, diferentes de los alelos
HLA-B conocidos, que comprende las etapas
siguientes:
- -
- determinar qué alelo (o alelos) HLA-B está(n) presente(s) en una muestra biológica, según el procedimiento tal como se ha definido anteriormente.
- -
- en el caso de observar una muestra que no genera un patrón de hibridación compatible con los definidos en la Tabla 1, secuenciar la porción de la secuencia del exón 2 de HLA-B que corresponde a la sonda que se hibridiza anormalmente del nuevo alelo HLA-B que va a determinarse.
El conjunto de sondas de la presente invención no
permite sólo discriminar los alelos de los que se conocen las
secuencias, sino que también pueden detectarse de los alelos con
secuencias todavía desconocidas, tal como se ejemplifica en el
Ejemplo 3. En este ejemplo se muestra que B71 puede distinguirse de
B72 (B*1503) utilizando la sonda 13. Esto es particularmente
ventajoso, ya que la discriminación serológica de B71 y B72 es
problemática.
La invención se refiere así a un método para
discriminar entre B72(B*1503) y los alelos
HLA-B no B72 del grupo B70 (B70, B71, es decir,
alelos diferentes del B*1503), utilizando el método tal como se ha
definido anteriormente, con dichos alelos HLA-B no
B72 caracterizados por el hecho de que no forman un híbrido con,
como mínimo, una de las siguientes sondas que hibridizan al alelo
B*1503 (sonda 13 (SEC ID nº 19), sonda 7 (SEC ID nº 13), sonda 10
(SEC ID nº 16), sonda 18 (SE ID NO 24) y sonda 19 (SEC ID nº
25)).
Una vez que la secuencia de estos nuevos alelos
se convierte en disponible, pueden inferirse nuevas sondas que
permiten una detección específica de estos nuevos alelos. La adición
de estas sondas al conjunto de 20 sondas básicas que se lista en la
Tabla 1, mejorará de este modo el nivel de discriminación y la
importancia de este procedimiento de tipificación.
La presente invención se refiere así también a un
producto de amplificación obtenido con el conjunto de iniciadores
B25P/B23P1 (SEC ID nº 1 y 4) de un alelo HLA-B que
corresponde a un tipo HLA-B B70 de nivel secuencial
todavía indeterminado del ácido nucleico, determinado según el
método anterior, estando caracterizado dicho producto amplificado
por el hecho de que forma un híbrido con la sonda 2 (SEC ID nº 8,
véase la Tabla 2), mientras que no forma un híbrido con la sonda 13
(SEC ID nº 19, véase Tabla 2) bajo las condiciones siguientes:
- -
- prehibridación de las membranas a 54ºC durante 30 minutos en Tris-HCl 50 mM pH 8,0, SDS al 0,1%, EDTA 2 mM, TMAC 3M;
- -
- hibridación a 54ºC durante 1 hora en la misma solución después de añadir de 3 pmol/ml de la sonda oligonucleótida monocatenaria marcada con DIG;
- -
- dos fases de lavado a temperatura ambiente durante 10 minutos en 2 x SSPE, SDS al 0,1%;
- -
- una fase de lavado a 58ºC durante 15 minutos en solución de hibridación,
y siendo diferente dicho alelo del alelo
HLA-B B70 B*1503 en como mínimo una posición
nucleótida en la región que abarca los nucleótidos 192 a 209,
estando dicha numeración de acuerdo con Zemmour y Parham, 1992.
La presente invención se refiere también a una
composición que comprende como mínimo uno de los iniciadores
oligonucleótidos de amplificación seleccionado a partir de la lista
siguiente:
5'-AGGTATTTCTACACCGCCA-3'
(B25P, SEC ID nº 1)
o sus variantes de secuencia,
como:
5'-AGGTATTTCCACACCGCCA-3'
(SEC ID nº 2)
5'-AGGTATTTCGACACCGCCA-3'
(SEC ID nº 3)
y/o inserciones y/o sustituciones
de uno o más nucleótidos, con la condición de que la secuencia GCCA
del extremo 3' se mantenga y que dichas variantes secuenciales
puedan obtenerse para amplificar específicamente los mismos alelos
HLA-B como el iniciador B25P o sus variantes como se
ha designado anteriormente, posiblemente en combinación con por lo
menos uno de los iniciadores de la siguiente
lista:
5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCA-3'
(B23P1, SEC ID nº 4),
o sus variantes secuenciales, tales
como:
5'-TCTGGTTGTAGTAGCGGAGCG-3'
(B23P2, SEC NO 5)
5'-TCCGCAGGTTCTCTCGGTA-3'
(B23P3, SEC NO 6)
o sus variantes secuenciales,
conteniendo dichas variantes secuenciales deleciones y/o inserciones
y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que
dichas variantes secuenciales puedan obtenerse para amplificar
específicamente los mismos alelos HLA-B como el
iniciador B23P1 o sus variantes B23P2 o B23P3 tal como se han
designado anteriormente, proporcionándose posiblemente dichos
iniciadores con un marcaje detectable, tal como la biotina, y con el
conjunto de iniciadores posiblemente inmovilizados sobre un soporte
sólido.
Preferentemente, tales composiciones contienen
por lo menos dos o más iniciadores de amplificación seleccionados a
partir de dicha lista. Más preferentemente el conjunto de
iniciadores de amplificación B25P/B23P1 se combina con por lo menos
uno de los siguientes conjuntos:
B25P/B23P2, ó B25P/B23P3.
Además de los componentes anteriormente
mencionados, dicha composición puede comprender asimismo por lo
menos uno de los siguientes iniciadores:
5'-GACGACACG/CCT/AGTTCGTGA-3'
\hskip0.5cmB25PX1 (SEC ID nº 53)
La presente invención se refiere asimismo a una
composición que comprende por lo menos una sonda oligonucleótida
seleccionada a partir de la siguiente lista de sondas:
SEC ID nº 11, SEC ID nº 13, SEC ID nº 18, SEC ID
nº 19, SEC ID nº 21, SEC ID nº 23, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26, SEC
ID nº 27, SEC ID nº 28, SEC ID nº 29,SEC ID nº 30, SEC ID nº 36, SEC
ID nº 39, SEC ID nº 44, SEC ID nº 45, SEC ID nº 46, SEC ID nº 49,
SEC ID nº 52.
Preferentemente, tales composiciones contienen
por lo menos dos, tres o más de dichas sondas.
La presente invención se refiere asimismo a una
equipo para tipificar por lo menos un alelo HLA-B a
partir de una muestra biológica capaz de contenerlo, que comprende
los siguientes componentes:
- -
- Por lo menos un iniciador de amplificación cuando sea apropiado, escogido de entre algunos de los definidos anteriormente.
- -
- por lo menos una sonda inmovilizada (o inmovilizadas) preferentemente sobre un sustrato sólido, y más preferentemente sobre una e idéntica tira membranosa, seleccionándose dicha sonda (o sondas) de entre cualquiera de las que se definen anteriormente.
- -
- un tampón o los componentes necesarios para producirlo, que permita que pueda llevarse a cabo la reacción de hibridación entre dichas sondas y el producto amplificado.
- -
- cuando sea apropiado, un medio para detectar los híbridos que resultan de la hibridación precedente.
La presente invención se refiere asimismo a un
equipo para la tipificación de por lo menos un alelo
HLA-B a partir de una muestra biológica capaz de
contenerlo, más particularmente de una muestra capaz de contener
tipos HLA-B que sean serológicamente difícil
discriminar, subsiguiente a la amplificación de los nucleótidos que
codifican los alelos HLA-B presentes en dicha
muestra, utilizando una o más combinaciones de conjuntos de
iniciadores según un método tal como se define anteriormente, que
comprende:
- -
- por lo menos una sonda inmovilizada (o inmovilizadas) preferentemente sobre un sustrato sólido, y más preferentemente sobre una e idéntica tira membranosa, seleccionándose dicha sonda (o sondas) de entre cualquiera de las que se definen anteriormente.
- -
- un tampón o los componentes necesarios para producirlo, que permitan que pueda llevarse a cabo la reacción de hibridación entre dichas sondas y el producto amplificado.
- -
- medios para detectar los híbridos que resultan de la hibridación precedente.
- -
- que incluye también posiblemente un dispositivo de interpretación y exploración automatizado para interpretar los resultados y deducir el alelo presente, a partir del patrón de hibridación observado.
Fig. 1: Representación esquemática del enfoque de
tipificación según la presente invención.
Fig. 2: Localización de los iniciadores y sondas
de la presente invención sobre un eje que representa el exón 2 del
gen HLA-B. La numeración es según Zemmour y Parham,
1992.
Fig. 3: Resultados de la amplificación (cuadro
superior) e hibridación de transferencia (cuadro inferior) obtenidas
con 13 muestras de pacientes y 7 controles. El material se amplificó
utilizando el conjunto de iniciadores B25P/B23P1, se transfirió y se
hibridizó con las sondas 6 (SEC ID nº 12) y 17 (SEC ID nº 23) tal
como se describe en los ejemplos 1 y 2.
Fig. 4: Resultados de la hibridación de
transferencia obtenidos para 15 muestras (nº 1 a 15 ), entre los
cuales se encuentran las que albergan los alelos variantes B 70 y
los alelos B46.
Se aplicó el material amplificado a membranas de
nylon. Se hibridizaron subsiguientemente estas membranas con las
sondas SSO 13 (SEC ID nº 19), 12 (SEC ID nº 18), 15 (SEC ID nº 21),
6 (SEC ID nº 12) y 2 (SEC ID nº 8) como se ha indicado. Los
resultados se comentan en los ejemplos SSO 3 y 4 y se sumarizan en
la Tabla 3.
Tabla 1: Alelos HLA-B
amplificados (exón 2) con los conjuntos de iniciadores de la
invención. También se indica la presencia de la secuencia del
iniciador del extremo 3' en los alelos y el patrón de hibridación
con el conjunto de las sondas SSO 19.
Tabla 2: Cuadro de las sondas SSO de tipificación
para los alelos HLA-B.
Tabla 2 bis: Cuadro de las sondas SSO de
tipificación para los alelos HLA-B ensayados, para
su utilización en un formato de hibridación inversa (Ensayo de sonda
lineal, LiPA). Todas estas sondas se derivan del conjunto básico de
20 SSOs que se proporciona en la Tabla 2. Las sondas preferidas se
indican como "+".
Tabla 3: Sumario de los resultados de hibridación
obtenidos con 15 muestras amplificadas hibridizadas con 5 sondas
SSO, tal como se describe en los Ejemplos 3 y 4. Véase también la
Fig. 4.
Tabla 4: Resultados de hibridación obtenidos con
una tira LiPA sobre la cual se inmovilizaron 20 sondas
oligonucleótidas. Se indican como "+" señales de hibridación
positiva obtenidas después de hibridación con material obtenido
respectivamente tras la amplificación 1 y 2 (véase el Ejemplo
6).
TMAC: Cloruro de tetrametilamonio
SSO: Oligonucleótido
secuencia-específico.
DIG 11-ddUTP:
Digoxigenina-11-2',3'-didesoxi-uridina-5'-trifosfato.
DIG: Digoxigenina.
AMPPD:
3-(2'-espiroadamantano)-4
metoxi-4-(3''-fosforiloxi)-fenil-1'2-dioxetano.
AP: fosfatasa alcalina.
Como ejemplo, se ilustra la especificidad de
amplificación con uno de los conjuntos de iniciadores. Tal como se
indica en la Fig 3, se amplificaron 12 muestras y 7 controles con el
conjunto de iniciadores B25P/B23P1 (SEC ID nº 1 y 4). Se preparó ADN
genómico a partir de material celular, mediante protocolos
estándares. Se mezclaron aproximadamente 0,5 \mug de ADN genómico
con tampón PCR que contenía 12,5 pmoles de cada uno de los
iniciadores; 200 mM de cada dNTP (Pharmacia LKB Biotechnology,
Uppsala, Suecia); 10 mM de Tris HCl (pH 8,5); 50 mM de KCl; 1
mM de MgCl_{2}; gelatina al 0,01%; NP-40 al 0,025%
y 1 Unidad de Taq (Thermus aquaticus); ADN polimerasa (Boehringer
Mannheim GmbH, FRG) ajustada a un volumen final de 50 \mul con
agua doblemente destilada. Las muestras se calentaron a 95ºC durante
10 minutos y se sometieron a 35 ciclos de PCR, cada uno de los
cuales consistió en 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 30 segundos
y 72ºC durante 1 minuto, con una extensión final a 72ºC durante 10
minutos, en un Ciclador Térmico de ADN (Techne y
Perkin-Elmer Cetus Corp. Norwalk, CT). Los productos
de amplificación se caracterizaron mediante una electroforesis en
gel de agarosa al 1,5%.
Los resultados se muestran en la Figura 3. En
todas las muestras en las que se encontraban alelos amplificables,
se observó, tras tinción mediante bromuro de etidio, una banda
precisa de alrededor de 246 pares de bases, tal como se predijo por
los datos secuenciales disponibles.
Las muestras 1, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y 12
albergaron al alelo B*7801 (indicado en la Fig 1 como BSNA, BX1 ó
BTe76). En las muestras 2 y 3 y en el control 15, se encuentra un
alelo B8 (B* 0801). Las muestras 16 a 19 son controles homocigóticos
para B35, B55, B56 y B54, respectivamente. En los controles
negativos no se pudieron observar bandas (13 y 14 que albergaran
respectivamente los alelos B*3701 y B*1801). Estos alelos poseen la
secuencia 5'-TCCG-3' en posición 30
a 33 del exón 2, en lugar de la
5'-GCCA-3' (Zemmour y Parham,
1992).
En este ejemplo la tipificación específica del
alelo B*7801 se describe utilizando las sondas 6 y 17 (SEC ID nº 12
y 23). Debido a que B *7801 es el único alelo que se hibriza con
ambas sondas (6 y 17), B*7801 puede discriminarse a partir de otros
alelos amplificados con el conjunto de iniciadores B25P/B23P1.
Las sondas oligonucleótidas
secuencio-específicas (SSOs) se sintetizaron
químicamente y se marcaron en su extremo 3' con
(digoxigenina-11-2',3'-didesoxi-uridina-5'-trifosfato
DIG-11-ddUTP) y ADN
desoxinucleotidilexotransferasa. Se amplificaron 13 muestras y 7
controles con el conjunto de iniciadores B25P/B23P1, tal como se
describe en el ejemplo 1.
Consecuentemente, 2 \mul de los productos PCR
se transfirieron a membranas de nylon (Hybond N Plus, Amersham,
Buckinghamshire, UK) desnaturalizadas empapando los filtros en NaOH
0,4N durante 5 minutos y se neutralizaron en 10 ml de 10 X SSPE
(solución EDTA salina de fosfato sódico) durante 15 minutos. Después
de la transferencia, las membranas se prehibridizaron a 54ºC durante
30 minutos en 10 ml de solución de hibridación que contenía 50 mM de
Tris-HCl, (pH 8,0), SDS al 0,1%, 2 mM EDTA, 3M TMAC
(cloruro de tetrametilamonio), Janssen Chimica, Geel, Bélgica). Para
la hibridación se añadieron 3 pmol/ml de SSO marcada con DIG a la
solución de prehibridación durante 1 hora a la temperatura de 54ºC,
excepto para la SSO-6 (SEC ID nº 12), que fue a
52ºC. Para eliminar el exceso de sondas, los filtros se lavaron dos
veces en (2X SSPE, SDS al 0,1%) a temperatura ambiente durante 10
minutos y entonces en solución de hibridación durante 15 minutos a
la temperatura estricta de 58ºC, excepto para la
SSO-6 que se lavó a 54ºC.
Se llevó a cabo la detección no isotópica
utilizando fosfatasa alcalina anti-DIG. Fragmentos
Fab (anti-DIG-AP) y visualización se
obtuvieron con el sustrato quimioluminiscente AMPPD
(3-(2'-espiroadamantano)-4
metoxi-4-(3''-fosforiloxi)-fenil-1'2-dioxetano).
Las membranas drenadas se expusieron a una película de rayos X
(X-omat AR5, Kodak) en un cassette durante
15-30 minutos. Todos los reactivos utilizados en
este procedimiento de oligotipificación se obtuvieron de Boehringer
Mannheim GmbH, FRG). Los resultados se ilustran en la Fig 3. Todas
las muestras en las que un alelo del tipo B78 está presente, (BSNA,
BX1 ó BTe76), se hibridiza claramente con las sondas 6 y 17 (SEC ID
nº 12 y 23). Otras muestras (nºs 2,3,7,15,16,17,18, y 19) se
hibridizan, bien con la sonda 17 (SEC ID nº 23), o con la sonda 6
(SEC ID nº 12), pero no con ambas. Debido a que las muestras 13 y 14
no se amplifican con el conjunto de iniciadores utilizado, las
señales de hibridación no se observan ni con la sonda 6 (SEC ID nº
12) ni con la sonda 17 (SEC ID nº 23).
En este ejemplo, la tipificación y
subtipificación de las variantes B70 se ilustra utilizando 7
muestras que albergan las variantes B70. También se incluyeron como
controles un blanco y 7 muestras no-B70 (véase la
Tabla 3). B71 y B72 son alelos subtípicos al amplio antígeno
HLA-B70. La secuencia del alelo B72 (B*1503) está
publicada (Zemmour y Parham, 1992); hasta recientemente, la
secuencia B71 no lo estaba. No están descritos reactivos específicos
para B71 y B72 y la presencia de otros antígenos, principalmente B35
y B62, oscurecen la adscripción serológica exacta de las variantes
B70. La distinción entre las variantes B70 puede realizarse mediante
isoelectroenfoque, pero no existe una técnica favorable que se pueda
aplicar de forma rutinaria.
Utilizando el conjunto de iniciadores B25P/B23P1
(SEC ID nº 1 y 4) y una combinación de algunas sondas de la
invención, las variantes B72 podrían distinguirse de otras variantes
B70. En este punto debe enfatizarse que pudieran existir otras
variantes además de B71 y B72, todavía no identificadas.
A partir de un conjunto de muestras, que se
conocen por albergar los alelos variantes B70 (muestras 1 a 6 y 8,
en la Tabla 3), se extrajo ADN y se amplificó tal como se describe
en el Ejemplo 1. Los productos amplificados se aplicaron a 5
membranas de nylon que se procesaron ulteriormente tal como se
describe en el Ejemplo 2. Estas membranas se hibridizaron
respectivamente con los siguientes conjuntos de sondas: 2, 6, 12, 13
y 15 (SEC ID nº 8, 12, 18, 19 y 21). Los resultados obtenidos con
estas sondas se muestran en la Fig. 4. y se sumarizan en la Tabla 3.
En todos los casos, la variante B72 (B*1503), que estaba presente en
4 de las 7 muestras B70, pudo distinguirse de la variante B71 o de
otras posibles variantes. B*1503 (B72) se caracteriza porque se
hibridiza con las sondas 2 y 13 (SEC ID nº 8 y 19) mientras que se
encontró que otras variantes B 70 no reaccionaban con la sonda 13
(SEC ID nº 19). Este ejemplo, por tanto, ilustra claramente la
posibilidad de discriminar entre alelos, aún cuando la información
de la secuencia no se encuentra disponible.
Se tipificaron dos muestras que contenían B46
utilizando idénticos métodos, conjunto de iniciadores, y combinación
de sondas tal como se se describe en el Ejemplo 3. En la Fig. 4 y en
la Tabla 3, se ofrecen los resultados de la tipificación. Debido a
la presencia de la sonda 12 (SEC ID nº 18) en el cuadro de sondas,
B*4601 puede dibujarse fácilmente y distinguirlo unívocamente de
otros alelos. A partir de todos los alelos amplificados por el
conjunto de iniciadores B25P/B23P1 (SEC ID nº 1/4), B*4601 es el
único alelo que se hibridiza con la sonda 12 (SEC ID nº 18).
Los medios preferidos de lavado y de hibridación
para el Ensayo de sonda lineal (LiPA) son soluciones tampón basadas
en SSPE. Las tiras LIPA se prepararon esencialmente tal como se
describe por Stuyver et al (J.Gen. Virol
74:1093-1102, 1993). Debido que en un formato LiPA
todas las sondas deben reaccionar específicamente bajo idénticas
condiciones de lavado e hibridación (idéntica concentración salina y
temperatura) y la temperatura de fusión del híbrido ADN:ADN en SSPE
depende del contenido en GC y de la longitud de la sonda es
necesaria, para algunas de las sondas que se relacionan en la Tabla
2, una modificación con objeto de cambiar de un sistema de tampón
basado en TMAC a un sistema de tampón basado en SSPE.
Con el objeto de seleccionar las sondas que más
se puedan adaptar a un formato LiPA, se sintetizaron muchas sondas
(que se relacionan en la Tabla 2 bis), que se seccionaron en sus
extremos 3' utilizando TTP y transferasa terminal y se inmovilizaron
sobre un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa). Estas sondas se
hibridizaron con material diana utilizando las siguientes
condiciones de lavado e hibridación:
| - | hibridación: | -5 x SSPE/SDS al 0,5% |
| -55ºC | ||
| - | lavado: | -2 x SSPE/SDS al 0,1% |
| -55ºC | ||
| (1 x SSPE es NaCl 0,18M, NaH_{2}PO_{4} 0,01M, EDTA 1 mM (pH 7,2)) |
Las sondas que exhiben los mejores resultados del
ensayo respecto a sensibilidad y especificidad bajo las condiciones
anteriormente mencionadas, se seleccionaron para utilización
ulterior sobre tiras LiPA. Estas sondas se clasificaron como
positivas (+) en la Tabla 2 bis. Sólo 9 de las 20 sondas utilizadas
en el sistema de tampón TMAC (SEC ID nº 7b, 11, 12, 13, 18, 19, 21,
23 y 24) se pudieron utilizar sin modificarlas en el sistema basado
en SSPE.
Estos resultados demuestran claramente que
ligeras modificaciones de la secuencia de las sondas utilizadas
podrían ser importantes, y que el diseño meticuloso de las sondas es
esencial para el desarrollo de un ensayo LiPA fiable.
Debido a co-amplificación del
pseudogén HLA-AR (cuando se utiliza el iniciador
B23P2), los resultados de la hibridación con las sondas 7 (SEC ID nº
13) y 9 (SEC ID nº 15) son equívocos, ya que las secuencias que
corresponden a aquellas de la sonda 7 (SEC ID nº 13) y 9 (SEC ID nº
15) están presentes en el pseudogén.
Con objeto de sondear el origen de una eventual
señal de hibridación positiva, se llevó a cabo una amplificación
adicional, utilizando por lo menos uno de los iniciadores B23 y un
iniciador con la siguiente secuencia:
5'-GACGACACG/CCT/AGTTCGTGA-3'
\hskip0.5cmB25PX1 (SEC ID nº 53)
El producto de amplificación obtenido se
hibridizó, en consecuencia, con una tira sobre la cual se
inmovilizaron por lo menos las sondas 7 y 9.
Una señal de hibridación positiva para las sondas
7 y 9 en este ensayo indica que las secuencias de la sonda 7 y/o 9
se encuentran en los alelos HLA-B de la muestra
analizada y por lo tanto, las sondas 7 y/o 9 deben clasificarse como
positivas. Un resultado negativo significa que estas sondas deben
despreciarse durante la interpretación de los resultados después de
la primera amplificación, ya que su señal de hibridación positiva se
originó a partir del pseudogén y no a partir del gen
HLA-B en sí mismo.
Los resultados de la hibridación obtenidos con
algunas muestras seleccionadas (progenies celulares homocigóticas A
a G) después de la amplificación separada con los iniciadores B25P y
B23P1/B23P2 (amplificación 1) y con los iniciadores B25PX1 y
B23P1/B23P2 (amplificación 2), se sumarizan en la Tabla 4. Estos
resultados muestran que, para la muestra A, la señal de hibridación
positiva para las sondas 7 y 9 se origina a partir del alelo
HLA-B. Lo mismo ocurre para la señal positiva
obtenida con la sonda 9 en las muestras E y F.
Si los resultados después de las etapas de
amplificación 1 y 2 se combinan, pueden deducirse los siguientes
alelos HLA-B con la ayuda de la Tabla 1:
\newpage
| muestra | alelo |
| A | B*0801 |
| B | B*1501 |
| C | B*4001 |
| D | B*4601 |
| E | B*5101 |
| F | B*5301 |
| G | B*5701 |
Se obtienen esencialmente idénticos resultados
cuando, para la amplificación 2, se utiliza el siguiente conjunto de
iniciadores:
B25P y B23P1/B23P3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Innogenetics N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Industriepark Zwijnaarde 7 Bus 4
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Gent
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Bélgica
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 9052
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 00-32-09.241.07.11
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 00-32.241.07.99
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO PARA TIPIFICAR HLA-B POR MEDIO DE INICIADORES ESPECÍFICOS Y CONJUNTOS DE SONDAS.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 53
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- FORMA LEGIBLE DEL COMPUTADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0 Versión # 1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Iniciador oligonucleótido B25P
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 15-33 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*3501
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGTATTTCAT ACACCGCCA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Variante del Iniciador oligonucleótido B25P
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 15-33 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4001
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº. 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGTATTTCC ACACCGCCA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE:Variante del Iniciador oligonucleótido B25P
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 15-33 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*0801
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGTATTTCG ACACCGCCA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: Si
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Iniciador oligonucleótido B23P1
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 241-261 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4001
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTGGTTGTA GTAGCCGCGC A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: Si
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Iniciador oligonucleótido B23P2
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 241-261 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*1301
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTGGTTGTA GTAGCGGAGC G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA:lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: Si
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Iniciador oligonucleótido B23P3
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 219-237 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*5101
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCGCAGGTT CTCTCGGTA
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 61-78 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4001
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTTCATCAC CGTGGGCT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA:ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 2
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 60-77 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*0801
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCTTCATCT CAGTGGGC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 60-77 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*5101
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCTTCATTG CAGTGGGC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótid 4
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 60-77 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*3501
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCTTCATCG CAGTGGGC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 126-143 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*1501
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAGGATGG CGCCCCGG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 125-142 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*3501
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCGAGGACG GAGCCCCG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 7
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 123-140 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*0801
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTCCAGAGAG AGGAGCCG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 8
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 143-161 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*5401
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCCGTGGG TGGAGCAG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 9
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 178-195 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*0801
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGACCGGAA CACACAGA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 179-196 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4001
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGACCGGGAG ACACAGAT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 179-196 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*5701
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGACGGGGAG ACACGGAA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 189-206 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4601
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACACAGAAGT ACAAGCGC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 13
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 192-209 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4001
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGATCTCCA AGACCAAC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 14
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 191-208 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*0801
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGATCTTC AAGACCAA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 15
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 192-209 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*5401
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGATCTACA AGGCCCAG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 16
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 191-208 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*7901
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGATCTGC AAGACCAA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 17
\newpage
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 212-229 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*7801
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGACTGAC CGAGAGAG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 18
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 211-228 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4001
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACAGACTTA CCGAGAGA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sonda oligonucleótida 19
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: se hibridiza a los nucleótidos 220-237 del exón 2 de por ejemplo, HLA-B*4001
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCGAGAGAG CCTGCGGA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCCGAGGAA GGAGCCGC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTCATCACC GTGGGCT
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTTCATCTC AGTGGGC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTTCATTGC AGTGGGC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTCATCGCA GTGGGC
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGGCGCCC CGG
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGACGGAGCC CCG
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGGATGGCG CCCCGG
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAGGACGGA GCCCCG
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAGGACGG AGCCCCG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCGAGGACG GAGCCCCGG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCGAGAGAG GAGCC
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTCCGAGAG AGGAGCC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGTGGGTGG AGCAG
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCCGTGGGT GGAGCAG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGACCGGAAC ACACAGA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACCGGAACA CACAGA
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACCGGAACA CACAG
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGACCGGAAC ACACAG
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACCGGGAGA CACAGAT
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGGGGAGAC ACGGAA
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACAGATCTT CAAGACCAAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGATCTTC AAGACCAAC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGATCTTCA AGACCAA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACAGATCTG CAAGACCAA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAGAGAGCC TGCGG
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAGAGAGCC TGCGGA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Característica_misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre_estándar=*G ó C_{*}
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Característica_misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre_estándar=*T ó A_{*}
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACGACACNC CNGTTCGTGA
\hfill20
Claims (19)
1. Método para tipificar o subtipificar uno o más
alelos HLA-B en una muestra, caracterizado
por la secuencia 5'-GCCA-3' en la
posición 30 a 33 del exón 2 de dicho alelo HLA-B
(estando dicha numeración de acuerdo con Zemmour y Parham, 1992) y,
más particularmente, método para discriminar los tipos
HLA-B que son serológicamente difíciles de
discriminar, como por ejemplo B54(22), B52(5), B7801,
B62(15), B75(15), B71(70), B72(70), B46,
B79, B53, B5102, B5103 y B58 (17), con dicho método que comprende
por lo menos las siguientes etapas:
- (i)
- posiblemente, extracción el ácido nucleico de la muestra
- (ii)
- amplificación del ácido nucleico de los alelos HLA-B caracterizado por la secuencia 5'-GCCA-3' en posición 30 a 33 del exón 2 de dicho alelo HLA-B con por lo menos un iniciador de amplificación del extremo 5' seleccionado a partir de la lista siguiente:
- 5'-AGGTATTTCTACACCGCCA-3' (B25P, SEC ID nº 1)
- o sus variantes de secuencia, como:
- 5'-AGGTATTTCCACACCGCCA-3' (SEC ID nº 2)
- 5'-AGGTATTTCGACACCGCCA-3' (SEC ID nº 3)
- u otras variantes secuenciales, conteniendo dichas variantes secuenciales deleciones, y/o inserciones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que la secuencia 5'-GCCA-3' del extremo 3' se mantenga y que estas variantes secuenciales puedan obtenerse para amplificar específicamente los mismos alelos HLA-B como el iniciador B25P o sus variantes tal como se han designado anteriormen- te,
- en combinación con un iniciador del extremo 3' apropiado escogido de los mismos alelos que los iniciadores del extremo 5' anteriormente definidos,
- estando posiblemente dichos iniciadores de los extremos 5' y 3'marcados e,
- (iii)
- hibridación del producto amplificado, marcándolo posiblemente durante o después de la amplificación, en condiciones apropiadas con una o más sondas apropiadas seleccionadas de la región 15 a 261 de la región del exón 2 de HLA-B, estando dicha numeración de acuerdo con la de Zemmour y Parham, 1992,
- (iv)
- lavado con condiciones de lavado apropiadas,
- (v)
- detección de los híbridos formados, y
- (vi)
- deducción de los alelos presentes a partir del patrón de hibridación observado.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado además porque se utiliza por lo menos uno de
los siguientes iniciadores de amplificación del extremo 3':
5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCA-3'
(B23P1, SEC ID nº 4),
o sus variantes secuenciales, tales
como:
5'-TCTGGTTGTAGTAGCGGAGCG-3'
(B23P2, SEC ID nº 5)
5'-TCCGCAGGTTCTCTCGGTA-3'
(B23P3, SEC ID nº 6)
u otras variantes secuenciales, conteniendo
dichas variantes secuenciales deleciones y/o inserciones y/o
sustituciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que
dichas variantes secuenciales puedan obtenerse para amplificar
específicamente los mismos alelos HLA-B como el
iniciador B23P1 o sus variantes B23P2 o B23P3 tal como se han
designado anteriormente, proporcionándose posiblemente dichos
iniciadores con un marcaje detectable, tal como la biotina.
3. Método según alguna de las reivindicaciones 1
a 2, caracterizado porque utiliza para la amplificación por
lo menos una de las siguientes combinaciones de conjunto de
iniciadores:
- B25P/B23P1 en combinación con B25P/B23P2, o
- B25P/B23P1 en combinación con B25P/B23P3.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la reacción de
amplificación con los dos conjuntos de iniciadores de elección se
lleva a cabo en distintos tubos de reacción y los productos
amplificados se hibridizan por separado.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la reacción de
amplificación con los dos conjuntos de iniciadores de elección se
lleva a cabo en distintos tubos de reacción y los productos
amplificados se mezclan después de la amplificación y se hibridizan
conjuntamente.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los iniciadores
de elección se mezclan y la reacción de amplificación se lleva a
cabo en un único tubo de reacción después de lo cual los productos
amplificados se hibridizan conjuntamente.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque una o más sondas
de hibridación se seleccionan a partir de la lista siguiente:
SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº
10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID
nº 15, SEC ID nº 16, SEC ID nº 17, SEC ID nº 18,SEC ID nº 19, SEC ID
nº 20, SEC ID nº 21, SEC ID nº 22, SEC ID nº 23, SEC ID nº 24, SEC
ID nº 25, SEC ID nº 26, y estando posiblemente dichas sondas
marcadas, o conteniendo sondas derivadas de las, mismas grupos
alifáticos NH_{2}, SH o carboxílicos.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque los productos de
amplificación obtenidos se inmovilizan sobre un soporte sólido y se
ponen en contacto con alguna de las sondas según la reivindicación 7
que se han marcado previamente.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque las productos de
amplificación obtenidos, marcados durante o después de la
amplificación, se ponen en contacto con un soporte sólido sobre el
cual, se han inmovilizado previamente por lo menos una de las sondas
según la reivindicación 7.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque los productos de
amplificación obtenidos se hibridizan a sondas oligonucleótidas
inmovilizadas en forma de líneas paralelas sobre tiras
membranosas.
11. Utilización de una o más sondas según la
reivindicación 7, para su inmovilización e incorporación a un ensayo
de hibridación de fase inversa, preferentemente para la
inmovilización en forma de líneas paralelas sobre un soporte sólido
tal como una tira membranosa, para la tipificación de alelos
HLA-B según un método tal como el que se define en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Método para detectar e identificar nuevos
alelos HLA-B, distintos de los alelos
HLA-B conocidos, caracterizado porque
comprende las etapas siguientes de:
- -
- determinar a qué tipo de HLA-B pertenece el ácido nucleico presente en una muestra biológica, según el procedimiento que se se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
- -
- en el caso de observar una muestra que no genera un patrón de hibridación compatible con los definidos en la Tabla 1, secuenciar la porción de la secuencia del exón 2 de HLA-B que corresponde a la sonda que se hibridiza de forma anómala del nuevo alelo HLA-B que debe ser determinado.
13. Método para discriminar entre B72 (B*1503) y
los alelos de HLA-B no-B72 (B70,
B71, es decir, alelos diferentes de B* 1503), utilizando el método
según la reivindicación 12, estando dichos alelos HLA no
B-72, caracterizados porque no forman un
híbrido con por lo menos una de las sondas que se hibridizan al
alelo B*1503 (por ejemplo la sonda 13 (SEC ID nº 19), la sonda 7
(SEC ID nº 13), la sonda 10 (SEC ID nº 16), la sonda 18 (SEC ID nº
24) y la sonda 19 (SEC ID nº 25).
14. Producto de amplificación obtenido con el
conjunto de iniciadores B25P/B23P1 (SEC ID nº 1 y 4) de un alelo
HLA-B que corresponde a un tipo
HLA-B B70 indeterminado a nivel secuencial del ácido
nucleico, determinado según el método de la reivindicación 13,
estando dicho producto de amplificación caracterizado porque
forma un híbrido con la sonda 2 (SEC ID nº 8,), mientras que no
forma un híbrido con la sonda 13 (SEC ID nº 19), bajo las
condiciones siguientes:
- -
- prehibridación de las membranas a 54ºC durante 30 minutos en Tris-HCl 50 mM pH 8, SDS al 0,1%, EDTA 2 mM, TMAC 3M;
- -
- hibridación a 54ºC durante 1 hora en la misma solución después de añadir 3 pmol/ml de la sonda oligonucleótida monocatenaria marcada con DIG;
- -
- dos fases de lavado a temperatura ambiente durante 10 minutos en 2 x SSPE, SDS al 0,1%;
- -
- una fase de lavado a 58ºC durante 15 minutos en solución de hibridación,
siendo dicho alelo diferente del alelo
HLA-B B*1503 en por lo menos una posición nucleótida
en la región que abarca los nucleótidos 192 a 209, estando dicha
numeración de acuerdo con Zemmour y Parham, 1992.
15. Composición que comprende por lo menos uno de
los iniciadores oligonucleótidos de amplificación seleccionado a
partir de la lista siguiente:
5'-AGGTATTTCTACACCGCCA-3'
(B25P)
o sus variantes de secuencia, tales
como:
5'-AGGTATTTCCACACCGCCA-3'
5'-AGGTATTTCGACACCGCCA-3'
u otras variantes secuenciales de los mismos,
conteniendo dichas variantes secuenciales deleciones y/o inserciones
y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que
la secuencia GCCA del extremo 3' se mantenga y que dichas variantes
secuenciales puedan obtenerse para amplificar específicamente los
mismos alelos HLA-B como el iniciador B25P o sus
variantes como se han designado anteriormente, posiblemente en
combinación con por lo menos uno de los iniciadores de la siguiente
lista:
5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCA-3'
(B23P1, SEC ID nº 4),
o sus variantes secuenciales, tales como:
5'-TCTGGTTGTAGTAGCGGAGCG-3'
(B23P2, SEC ID nº 5)
5'-TCCGCAGGTTCTCTCGGTA-3'
(B23P3, SEC ID nº 6)
u otras variantes secuenciales de los mismos,
conteniendo dichas variantes secuenciales deleciones y/o inserciones
y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que
las variantes secuenciales puedan obtenerse para amplificar
específicamente los mismos alelos HLA-B como el
iniciador B23P1 o sus variantes B23P2 o B23P3 tal como se han
designado anteriormente, proporcionándose posiblemente dichos
iniciadores con un marcaje detectable, tal como la biotina.
16. Composición que comprende por lo menos una
sonda oligonucleótida seleccionada a partir de la siguiente lista de
sondas:
SEC ID nº 11, SEC ID nº 13, SEC ID nº 18, SEC ID
nº 19, SEC ID nº 21, SEC ID nº 23, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26, SEC
ID nº 27, SEC ID nº 28, SEC ID nº 29,SEC ID nº 30, SEC ID nº 36, SEC
ID nº 39, SEC ID nº 44, SEC ID nº 45, SEC ID nº 46, SEC ID nº 49,
SEC ID nº 52.
17. Soporte sólido, preferentemente una tira
membranosa, que lleva en su superficie una o más sondas según la
reivindicación 16, acopladas al soporte en forma de líneas
paralelas.
18. Equipo para tipificar por lo menos un alelo
HLA-B a partir de una muestra biológica capaz de
contenerlo, que comprende los siguientes componentes:
- -
- por lo menos iniciador de amplificación seleccionado de entre cualquiera de los de la reivindicación 15.
- -
- por lo menos una sonda inmovilizada (o inmovilizadas) preferentemente sobre un sustrato sólido, y más preferentemente sobre una e idéntica tira membranosa, seleccionándose dicha sonda (o sondas) de entre cualquiera de las que se definen en la reivindicación 16.
- -
- un tampón o los componentes necesarios para producirlo, que permita que pueda llevarse a cabo la reacción de hibridación entre dichas sondas y el producto amplificado.
- -
- medios para detectar los híbridos que resultan de la hibridación precedente, cuando sea apropiado.
19. Equipo para tipificar por lo menos un alelo
HLA-B a partir de una muestra biológica capaz de
contenerlo, más particularmente de una muestra capaz de contener
tipos de HLA-B difíciles de tipificar
serológicamente, consecutivo a la amplificación de los nucleótidos
que codifican los alelos HLA-B presentes en dicha
muestra, que utiliza una o más combinaciones de conjuntos de
iniciadores según un método de cualquiera de las reivindicaciones 1
a 9, que comprende:
- -
- por lo menos una sonda inmovilizada (o inmovilizadas) preferentemente sobre un sustrato sólido, y más preferentemente sobre una e idéntica tira membranosa, seleccionándose dicha sonda (o sondas) de entre cualquiera de las que se definen en la reivindicación 16.
- -
- un tampón o los componentes necesarios para producirlo, que permita que pueda llevarse a cabo la reacción de hibridación entre dichas sondas y el producto amplificado.
- -
- medios para detectar los híbridos que resultan de la hibridación precedente, cuando sea apropiado.
- -
- que además incluye posiblemente un dispositivo de interpretación y exploración automatizado para interpretar los resultados y deducir el alelo presente, a partir del patrón de hibridación observado.
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|---|---|---|---|
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| EP93400700 | 1993-03-18 |
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