JP3067777B2

JP3067777B2 - アルファー遺伝子座中に位置するｔ細胞レセプター遺伝子およびｄｎａ構成物

Info

Publication number: JP3067777B2
Application number: JP63152440A
Authority: JP
Inventors: デービスマーク; チェンユィエーシウ
Original assignee: ザボードオブトラスティーズオブザリーランドスタンフォードジュニアユニバーシティ
Priority date: 1987-06-23
Filing date: 1988-06-22
Publication date: 2000-07-24
Anticipated expiration: 2015-07-24
Also published as: DE3855634D1; ATE144791T1; DE3855634T2; EP0296786A1; JPH0198491A; EP0296786B1; GR3022080T3; ES2093606T3; EP0712928A2; HK1006725A1; EP0712928A3; CA1340629C

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、Ｔ細胞において特異的に発現される配列の
同定及び推定上のレセプターの発現における前記配列の
使用に関する。

［発明の背景］胸腺は、高等脊椎動物におけるＴリンパ球の中枢的な
分化組織である。Ｔ細胞抗原レセプター（TCR）遺伝子
の発現及び構成の調節は、数種の分化段階を経てＴ細胞
前駆細胞が発達する場合に胸腺で起こる数多くの選択的
及び成熟現象と関連しているに違いない。すなわち、種
々のタイプのＴ細胞抗原レセプター（TCR）が同定され
ている。例えば、α：βヘテロダイマーが機能的なヘル
パー及びキラーＴ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞）に見出され
ていて、ごく最近γ：δヘテロダイマーが記載された。
両ヘテロダイマーは単一形のCD3ポリペプチドと会合し
て、別個のＴ細胞集団に属する細胞表面上で独立に発現
される。

前記α：βに関しては、多数の報告がなされている。
α：βヘテロダイマーの各々のサブユニットをコードし
ている配列が単離され、α：βTCRの発現に使用され
た。さらに、TCRsに関連する研究のかなり初期に発見さ
れたある配列が、α：βレセプターとは違う推定上のTC
Rのγサブユニットであると報告された。γ：δレセプ
ターは、α：βレセプターと多くの重要な点で相違する
と考えられる。γ：δレセプターは、MHC（主要組織適
合性抗原）拘束性の細胞障害作用は示さないようであ
る。一般的に、γ：δレセプターは、Ｔ細胞の個体発生
の間を通じてα：βレセプターが出現する前に検出され
る。γ：δレセプターとα：βレセプター間には本質的
な相違があるので、結合タンパク源として、Ｔ細胞結合
のアゴニスト又はアンタゴニストとして、診断及び療法
に有用なレセプターとして、γ：δヘテロダイマーを産
生することは重要なことである。そして更にＴ細胞の因
果関係学及び機能を包含する機構を理解するうえでも重
要である。

［関連文献］ γ：δヘテロダイマーは、Brenner等、Nature（1986）3
32:145−149 Lew等、Science（1986）234:1401−1405 Pardoll等、Nature（1987）326:79−81 Bluestone等、Nature（1987）362:82−84 Borst等、Nature（1987）325:683−688 Moingeon等、Nature（1987）325:723−726 に開示されている。

γ遺伝子は、Saito等、Nature（1984）309:757−762 Sim等、Nature（1984）312:771−775に開示されてい
る。

［発明の概要］ γ：δヘテロダイマーのδサブユニットとして働きＴ
細胞の成熟初期に発現される表面タンパク質を発現する
ための、新規なDNA配列及び構築体を提供する。同時
に、該構築体はγ：δＴ細胞レセプター又はそれらの機
能的な断片の発現に適する宿主において、γ及びδサブ
ユニットを産生するために使用することができる。前記
DNA配列はまたプローブとしても使用することができ
る。

［具体的な態様の説明］Ｔ細胞成熟の初期段階に関係のあるペプチドをコード
する配列に関連する新規なDNA配列、構築体、及び発現
システムが提供される。該配列は、ＪαＣαをコードす
る領域の上流（５′端）に位置し、なんらかのＣαメッ
センジャー又はタンパク質が検出される前の初期の胸腺
リンパ球においてTCRαファミリーの遺伝子セグメント
を用いる系統的な再構成（rearrengement）を示す。こ
の遺伝子座に由来するRNAは、初期の胸腺リンパ球及び
成体（アダルト）CD4^-CD8^-細胞において高水準で発現さ
れるが、成熟Ｔ細胞集団においては発現されない。

この配列は、Ｖα→Ｊα組換えが起こる際にリーダー
として働くようにみえる。この遺伝子座での組換えは、
14日令の胎児胸腺リンパ球ではもう起こっているように
みえる。したがって、TCRβやTCRγ遺伝子と同時又はこ
とによると少し前には組換えが起こるようである（Haar
s et l.,J.Exp.Med/（19869 164:1−24,およびBorn et
al.,Science（1986）234:479−482参照）。再構成バン
ドは18日令及び19日令の胸腺リンパ球上ではもっと強く
また複雑になるが、それより成熟したＴ細胞では減少す
る。

前記遺伝子は、３つの部分、すなわちV,J,及びＣに分
けることができる。ここでＶ領域は免疫グロブリンや
α：βTCRのαサブユニットの可変領域に類似してお
り、Ｊ領域は連結領域に、Ｃ領域は定常領域に類似して
いる。Ｖ領域はＶα領域と実質的に相同であり、Ｊ領域
はＪα領域に似ている。

ゲノム配列は再構成されていないＪ配列の上流に位置
し、13ヌクレオチド隔たって存在するヘプタマー（AGCT
GTG）とナノマー（GGTTTTGG）を含んでいる。３′側境
界には、保存されたRNAスプライシングシグナル配列（G
TAAGT）が存在する。またＤ領域が１つ、Ｖ領域とＪ領
域の間に存在して、VDJをコードする領域を含むエキソ
ンをあたえる。

Ｃ領域は、単一コピー遺伝子として存在することが観
察されている。それはＪ遺伝子セグメントの下流約13kb
及びＣαの上流約70kbのところに位置している。このコ
ード配列は、アミノ酸配列が約30.7kDの分子量を有する
タンパクをコードするものと推定される。配列は、２箇
所にＮ−結合性のグリコシル化可能部位を有する。

Ｃ領域をコードする配列は、すでに配列のわかってい
るTCR又はIgのどれかと相同な短い領域をいくつか有
し、アミノ酸配列レベルにおいてはどのＴ細胞レセプタ
ー配列とも９〜10％の相同性を有する。この配列はＴ細
胞レセプター遺伝子の特徴の多くを保存していて、最初
のドメインの後ろにおそらくヘテロダイマーの形成に関
与していると思われるシステインを１つ有し、また、ト
ランスメンブレン（膜貫通）領域に保存されたリジン残
基を持つがこれはどのＴ細胞レセプター定常領域も持つ
特徴である。リジンは、CD3ポリペプチドとの相互作用
にとって重要なのかもしれない。現在までに特徴づけら
れている３種のCD3ペプチドは全部、その膜貫通領域と
思われるところに保存アスパラギン酸またはグルタミン
酸残基を有する。Ｃ領域は、比較的短い（保存リジンか
ら数えてアミノ酸14−15個）疎水性Ｃ末端を有し、保存
された配列が間隔を置いて存在する仕方がＣαのそれと
よく似ている。本発明の目的の遺伝子は、成体（アダル
ト）du11CD1細胞とそのハイブリドーマ中に見出され
る。

興味ある構築体は通常、Ｃコード領域または非コード
隣接領域の少なくとも８個の、一般的には少なくとも12
個のヌクレオチドを含む。この隣接領域は、該Ｃ領域ま
たはその断片がJ,DおよびＶ領域と適切な向きで結合す
ることができるところである。また構築体は異種DNA、
令えば選択用マーカー、安定な複製系、合成リンカーも
しくはポリリンカー、転写開始領域または転写終了領域
等を含むことができる。通常Ｃ領域を含んでいる断片
は、その断片が含まれる元の配列の約10kbp以下、一般
に5kbp以下でよい。

主題の核酸配列は、種々の方法で使用することができ
る。該配列、特にＣまたはＪ配列は、プローブとして使
用して種々のＴ細胞においてmRNAまたはゲノムDNAを同
定することによりその配列の存在を決定できる。通常プ
ローブは少なくとも約８塩基であり、より一般には少な
くとも12塩基であり、そして50塩基以上であってもよ
い。一般的に、プローブは相同性配列の約1kbpを越え
ず、更に一般的には相同性配列の約0.5kbpを越えるもの
ではない。通常プローブは標識される。好ましくは種々
の常法、令えば放射性ヌクレオチドを用いたニックトラ
ンスレーションまたはTdT伸長等を用い、放射性同位元
素で標識することができる。

主題のペプチドをコードするmRNAに由来するcDNAは主
題のペプチドの発現に使用することができる。このcDNA
は単独で、またはδ：γTCRベクターを産生するために
γ配列の全部もしくは一部を発現する遺伝子につなげ
て、好ましい発現ベクターに挿入することができる。

種々の発現ベクターが、種々の宿主での発現に有用で
ある。原核性及び真核性宿主が発現のために有用であ
る。使用できる宿主には、大腸菌（E.coli）、枯草菌
（B.subtilis）、Bacillus licheniformis,K.lactis,CH
O細胞、サル腎臓細胞、COS細胞等が含まれる。

発現には種々の転写開始領域を使用し、種々のベクタ
ーが使える。ベクターは転写方向に添って転写及び翻訳
開始領域、挿入された遺伝子を開始領域の調節下におく
ための遺伝子挿入部位、ならびに翻訳と転写の終結領域
からなる発現カセットを含んでいるのが便利である。更
に、通常はマーカーが入れてある。このマーカーは主題
のペプチドを発現するための発現カセットを含んでいる
発現宿主の選択を可能にするものであり、このカセット
はそれ単独、またはγ配列をコードする遺伝子の発現カ
セットと連結してあるものである。

選択マーカーには、栄養要求性の宿主に原栄養性を付
与するような、負のバックグラウンドを補償する配列、
例えばカナマイシン、フロラムフェニコール、ペニシリ
ン、G418,テトラサイクリン、ゲンタマイシン等に対す
る耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子が含まれる。これ
を説明する文献としては米国特許第4,615,974、4,615,9
80、4,624,296及び4,626,505号などがある。

遺伝子は種々の方法で操作することができる。たとえ
ば５′または３′末端のどちらかあるいは両方における
非コーティング領域の全部または一部を除去したり、試
験管内（インビトロ）での変異またはプライマー修復に
より、制限部位を導入したり望ましくない制限部位を除
去したりするため１以上のヌクレオチドを変化させた
り、１または複数のコドンを変化させる、あるいは末端
伸長やアダプターまたはリンカー等へ連結するなどその
他種々の方法で操作することができる。配列の修飾は前
記の技術によるだけでなく、酵素処理、再切断、種々の
機能性配列の連結等によっても行うことができる。一般
に、各々の操作後、配列をクローン化し、所望の配列が
得られていることを確認するために分析する。分析には
制限分析、配列決定、電気泳動、サザンハイブリダイゼ
ーション等がある。

主題のポリペプチド単独かまたはγポリペプチドをコ
ードする配列と組合せて含んでいる発現ベクターは、そ
のベクターの様々な調節領域及び複製システムが機能で
きる宿主細胞ならどれにでも導入することができる。ど
の複製系を使うかによっていろいろの方法で遂行するこ
とができる。場合によってはベクターを染色体外に維持
せずに組み込ませるために複製系は宿主中で機能しなく
てもよい。ベクターはプラスミド、ウィルス、ファー
ジ、arsと連結した動原体のような染色体複製系などを
基礎とすることができる。哺乳類の発現系には、SV40、
アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどの複製系
を用いることができる。例えばCOS細胞においてはSV40
の複製系を用いることができる。形質転換細胞は主題の
ペプチドの発現に適した培地で生育させることができ
る。宿主によっては、ペプチドは細胞質中にとどまる
か、宿主の膜に運搬され膜結合タンパク質となる可能性
がある。

主題のペプチドのコード配列は、１つまたはそれ以上
の領域を除去する、あるいは１またはそれ以上の領域を
部分的に除去することにより、修飾することができる。
したがって、VD領域またはVDJ領域を、単独でまたはγ
タンパク質の可変領域と連結して単離することができ
る。このようにして定常領域の全部または一部を欠いた
可変領域を得ることができる。ペプチドの膜への運搬を
防ぎ、細胞質に留まるように操作するには、可変領域は
シグナルリーダー配列を除去して、定常領域は膜貫通配
列を除去して、または両方の処理を行う。他方、定常領
域を異種タンパク質と結合し、細胞質膜に異種タンパク
質を運搬するための輸送機構として役立てることもでき
る。いろいろな断片を結合することは文献に詳しく記載
されており、リンカーまたはアダプターを用いていろい
ろな方法で行うことができる。例えば、Maniatis等のMo
lecular Cloning;A Laboratory Mannual,Cold Spring H
arbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1982;及び米
国特許第4,617,384号を参照されたし。

前記ペプチドは、様々に使用することができる。レセ
プターは相補的リガンドへの結合に使用することができ
る。この結合は、診断アッセイ、またはアフィニティク
ロマトグラフィ等に用途を見出すことができる。レセプ
ターは試験管内（in vitro）、生体内（in vivo）でＴ
細胞と競合させ、相補的リガンドへＴ細胞が結合するこ
とを防ぐことができる。目的のペプチドを持つようＴ細
胞を形質転換して前もって決められたリガンドに結合す
るＴ細胞の能力を高めることができる。主題のペプチド
は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体産生に用
いることができ、そしてこれらの抗体は更に、目的のペ
プチドと共通のイデオトープまたはパラトープを有する
Ｔ細胞の特異的なサブセットを単離するかまたは除去す
るために使用することができる。FACSまたは他の方法を
用いて患者の血液中にそのようなＴ細胞サブセットが存
在するかどうかを決定しそのようなＴ細胞サブセット等
の活性を阻害するのに、前記の抗体を使用することがで
きる。抗体は、常法により生理学的に許容される媒体、
例えばPBS中に、通常約0.165mg（タンパク質/ml）以上
を含むように導入することができる。

主題のペプチド及び核酸配列は、好ましい哺乳動物の
いずれか、例えばげっ歯動物、ウマ科、ウシ属、ウサギ
目、霊長類に由来することができる。

次の実施例は、例証のために提供するものであって、
限定のためのものではない。

［実施例］成体du11CD1CD4^-CD8^-細胞及びハイブリドーマにおい
て系統的な再構成を示し、Ｃαの上流約90kbに位置する
領域を同定した。ＪαＣα遺伝子座は少なくとも65kbに
わたるので（Wenot等、Nature（1985）316:832−836;Ha
yaday等、同誌（1985）316:823−832）、これらの再構
成はまず最初にパルスフィールドゲル電気泳動（Schwar
tz ＆ Cantor,Cell（1984）37:67−75;Carle ＆ Olson,
Nucl.Acids Res.（1984）12:5647−5664）を用いて検出
した。再構成を更に詳細に分析するために、Ｃαの上流
60kbに位置するＡと名付けた断片を用いて更に５′方向
（上流）に伸びているコスミドクローンを単離した。ま
ず、ヘルパーハイブリドーマ2B4に由来する機能性TCRα
鎖のＪ部に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
を使用して、B10.A肝臓ゲノムライブラリー（Chien等、
Nature（1984）309:322−326）からＪα2B4のゲノムコ
ーティング領域（Berker et al.,Nature（1985）317:43
0−434）を含んでいるファージクローン（λ12）を単離
した。Ｊα2B4の位置は、Ｃαの上流約65kbにマッピン
グされた。次にλ12のEcoR I断片（断片Ａ）を用いて、
BALB/c胎児DNAから調製したコスミドライブラリー（Cor
y et al.,EMBO J.（1985）4:675−681）をスクリーニン
グした。cos2およびcos3と命名した陽性のクローンを単
離し、１種及び複数種の制限酵素消化によりマッピング
した。cos3に由来する最も５′側の2.85kbEcoR I断片を
用いて、cos21およびcos22と名付けたクローンを単離し
た。更なる分析のために使用したDNA断片は、4.1kbのEc
oR IからSac Iまでのサブクローンであった（pG4.1）。
JxおよびCxの位置を制限酵素マッピング、サザン分析及
びDNA配列決定により決定した。

サザン分析は以下のようにして行った。成体の肝臓
（LV）、14日令の胎児肝臓（FL）、全胸腺リンパ球（TH
Y）、14日令の胎児胸腺リンパ球（D14）、及び15日令の
胎児胸腺リンパ球（D15）のゲノムDNAをEcoR I8μｇで
消化し、0.8％アガロースゲル上で電気泳動し、ナイロ
ン膜（Gene Screen,NEN Research Products）上にブロ
ットし、ヘキサマーをプライマーとして放射標識した
（Feinberg and Vogelstern,Anal.Biochem.（1983）13
2:6−13）pG4.1でプローブした。16MNaCl、50mMの硫酸
ナトリウム、50％のホルムアミド、100μg/mlのサケ精
子DNA、４×デンハルト液及び10％の硫酸デキストラン
中40℃でブロットをハイブリダイズさせ、２×SSPE及び
0.2×SSPE（20×SSPEは3.6MののNaCl、0.2Mのリン酸ナ
トリウム、pH7.4および0.02MのEDTAである）中55℃で洗
浄した。それぞれEcoR I消化したC57BL/6株とBALB/c株
との間では、ハイブリダイゼーションパターンの差は全
く認められなかった。

再構成過程の動態を理解するために、発生における様
々な日令の胎児胸腺リンパ球に範囲を広げて分析した。
得られたデータは、Ｃα遺伝子座の上流における再構成
が少なくとも14日令の胎児胸腺リンパ球ではすでに起こ
っていることを示す。したがってこの遺伝子はTCRβ及
びγ遺伝子と同時かまたは多分ほんのすこし早く再構成
される。18日令及び19日令胸腺リンパ球DNAにおいて
は、再構成バンドはより濃くなり、かつ複雑になるにも
かかわらず、これらのバンドは更に成熟したＴ細胞では
減少する。全胸腺リンパ球DNAにおいてもpG4.1はdCD1細
胞の場合と同様なパターンを示す。しかしこれらのハイ
ブリダイズするバンドは、コーチゾン処理（成熟細胞を
選択的に増す）（Anderson ＆ Blomgren,Cell Immunol,
（1920）1:362−371）した胸腺リンパ球においてはその
強度が低下する。脾臓のＴ細胞標品においては等量のDN
Aを使用してかろうじて測定可能になる。この観察結果
は、９種の機能性Ｔ細胞及びハイブリドーマの中で、ヘ
ルパーハイブリドーマ2B4だけが１つの染色体の上で１
回だけの再構成を保持しているのに対し、他の８種は明
らかにこの領域を欠いてしまっているという事実と一致
する。

これらの再構成の性質を決定するために、2B4ゲノム
ライブラリー（Chin et al.,上褐）から再構成断片（2B
4.Exp）を含有するλファージを単離し、pG4.1と比較し
た。関連のサブクローンの制限酵素地図と配列を得た。
このデータはpG4.1にはＪα様エレメント（Jx）があ
り、2B4で観察される再構成はJxとJxの上流のＤエレメ
ントが関与するVDJ連結現象の結果であることを立証し
ている。この特定のＶ領域の配列分析から、これがＶα
遺伝子において高度に保存されているアミノ酸をすべて
含み、Arden等のＶαTA27（Nature（1985）316:783−78
7）とDNAレベルで83％の相同性を示し、アミノ酸の相同
性はそれよりやや少なく70％であって、同じ遺伝子ファ
ミリーに属することがわかる。Jxエレメントは公表され
ているＪ領域中の保存配列の多くを有し、特にサイズが
Ｊα遺伝子セグメントと似ており、既知のＪαセグメン
トの半分以上に共通するＣ末端プロリン残基を有する。
13ヌクレオチド離れて存在する保存されたヘプタマー
（AGCTGTG）とノナマー（GGTTTTTGG）の配列が再構成を
うけていないJx配列の５′側に存在する。Jx配列の３′
端境界にはGTAAGTという保存RNAスプライシングシグナ
ル配列が存在する。この場合のVDJ再構成はＶ領域の構
成要素の保存された配列とＪ領域の保存配列との間にフ
レームシフトをおこしており、これは免疫グロブリン及
びＴ細胞レセプターの再構成ではよくあることである
が、2B4ハイブリドーマが機能性のα：βヘテロダイマ
ーを持っているという事実とあっている。

このVDJx配列を含んでいる転写物が検出できるどうか
決定するために、サブクローン2B4.Expをノーザン分析
のためのプローブとして使用した。Jxエレメントだけが
ハイブリダイズできるような条件下で、VDJxを含む転写
物の発現は2B4RNA中ではＣαの約20分の１水準である
が、新生児胸腺リンパ球及び成体二重陰性（CD4CD8 dou
ble negative）細胞RNAにおいてはより高い水準で発現
されていることがわかる。次に2B4cDNAライブラリー
（〜200,000オリジナルクローンからなる）をスクリー
ニングし、上記のVDJエキソンが新規なＣ領域（Cx）に
組継ぎされたものを含むクローンがただ一つ単離され
た。Cxコード領域はゲノム中に単一コピー遺伝子として
存在する。これはJx遺伝子セグメントの下流13キロベー
ス（kb）でＣαの上流70kbに位置している。ゲノムの構
成は配列分析により明らかにした。このcDNAクローン
（ｐλ12）の制限酵素地図及びその配列を以下に示す。

DNA断片はすべてpGEM−３（Promega Biotec）にサブ
クローンし、二重鎖プラスミドDNA上でT7およびSp6の両
プロモーターに特異的なプライマーを用いたチェーンタ
ーミネーター法により配列を決定した（Chen ＆ Seeber
g,DNA（1985）4:165−170）。記載した配列はすべて、
両方の鎖について配列決定したものである。配列決定を
容易にするため、Exo IIIおよび緑豆（mung bean）ヌク
レアーゼ処理により部分欠失サブクローンを作成した
（Henikoff,Gene（1984）28:351−359）。ｐλ12cDNAク
ローンの可変（Ｖ）、Ｊ、定常（Ｃ）および３′端の非
翻訳（３′ut）領域を示してある。pG4.1および2B4.Exp
で影をつけた領域はDNA配列決定で配列が同一と判断さ
れたところである。ｐλ12の５′及び３′末端のEcoR I
部位は、クローニングに用いたEcoR Iリンカーに由来す
る。アミノ酸配列中のＮ−結合グリコシル化が可能な部
位は“CHO"で示した。保存ヘプタマー及びノナマー配
列、及びRNAスプライス配列は下線を引いた。システイ
ン残基には三角印をつけた。TA27Vα配列（Arden et a
l.,前述）は、2B4.Exp V領域に非常に似ていて、相同核
酸及びアミノ酸はダッシュ（−）で示した。2B4.Exp.p
λ12クローンの予想されるアミノ酸配列はＮ−末端プロ
セシング位置と思われる点（Berke、前述、Arden前述）
から番号をつけた。

理論的にはin frameメッセージ中でのこのタンパク質
の予想される分子量は約30.7kDであろう。Ｃ領域をコー
ドする配列は、前述したTCRまたはIg配列と相同性のあ
る短い領域をいくつか有し、どのＴ細胞レセプター配列
に対してもアミノ酸配列レベルで９〜18％の相同性を有
する。第１ドメインの後ろにヘテロダイマー形成のため
と思われるシステインが１つあり、さらに他のＴ細胞レ
セプターを定常領域すべての特徴である膜貫通領域中の
保存リジン残基を有しているなどＴ細胞レセプター遺伝
子の特徴の多くが保存されている。この位置におけるリ
ジンは、CD3ポリペプチドとの相互作用に重要であろう
ことが示唆されている（Chien et al.,Nature（1984）3
12:31−35）。この相互作用が仮定されたのは、今日ま
でに特徴づけられているCD3ポリペプチドの３種すべて
が、その見かけ上の膜貫通領域に保存されたアスパラギ
ン酸またはグルタミン酸を有するからである。

新規なＴ細胞レセプターの定常領域配列は、免疫グロ
ブリン及び他のＴ細胞レセプターとはごつ弱い相同性
（９−18％）しかない。この弱い相同性は、前述のＣα
配列にも共通するものであり、免疫グロブリンとの関係
がより密接であるＣγやＣβの定常部（第１ドメインに
おける相同性は40％にものぼる）とは対照的である。し
たがってCxとＣαはどちらも全く免疫グロブリン様折り
畳み（fold）構造を形成せず、それ以外のなんらかの構
造がＴ細胞受容体分子の部分として必要である可能性が
ある。

CxとＣα間の興味深い類似点は、両者とも比較的短い
（14〜15アミノ酸）疎水性Ｃ末端（保存リジンから数え
て）を有することである。これに対し、ＣγおよびＣβ
の対応する領域はもっと長く（それぞれ23アミノ酸と25
アミノ酸）、各々がその分子の末端近くに３個の荷電残
基を有する（ＣβはKKKNSで終わり、ＣγはNEKKSで終わ
る）。ポリペプチド配列関係におけるこれらの相違は、
ヘテロダイマー形成及びCD3ポリペプチドとの相互作用
において重要な意味を持つ可能性がある。Cxのその他の
特徴は、Cxの保存配列の間の空きかたがＣαと似てい
て、Ｃγ及びＣβの構成とは比較的似ていないことであ
る。４つのＴ細胞レセプターの定常領域は、保存された
システイン（Ｃ）、リジン（Ｋ）、及びトリプトファン
（Ｗ）残基にそろえて並べることができる。ほとんどの
場合にこれらの残基間の間隔は、CxとＣαとがよく似て
いて、γとβとが互いによく似ている。この観察結果の
ただ一つの例外は、Ｃαの第２番目と第３番目のシステ
インの間の距離が異常に短いことである。また興味深い
のは、γ及びβのどちらも、最初の保存システイン残基
から数えて14番目のアミノ酸としてトリプトファンを有
しこれはほとんどの免疫グロブリンの定常領域の特徴で
もあるのだが、一方CxもＣαもその位置またはその近傍
にトリプトファンをもたないことである。α及びβは対
を形成することが知られているので、CxとＣγも同じ様
なペアを作ると考えらように見える。そこでαがγとペ
アを作り、Ｘ鎖がβとペアを作る可能性も当然考えられ
る。もしこの後の可能性が正しいとすると、これらの２
つの遺伝子座がそれにしたがって機能しているように見
える相互排除規則を説明する助けになるかもしれない。

Ｘ鎖の発現のレベル及び分布を評価するために、胸腺
の未成熟及び成熟リンパ球集団からとったRNAについてC
x、Ｃγ、ＣαのcDNAプローブを用いてノーザンブロッ
トを行った。CxとＣγを含んでいる配列は、アダルト二
重陰性細胞のRNA及び15日令の胎児胸腺リンパ球培養物
（IL−４及びテトラデカノイルホルボールアセテート存
在下で培養）において高レベルで発現されていた。新生
児胸腺リンパ球での発現はいくらか少なく、未分画のア
ダルト胸腺RNAでは長時間暴露したオートラジオグラム
でかろうじて検出できた。全胸腺における発現のレベル
は、我々の見積もりでは、アダルト二重陰性細胞の場合
の十分の１より多いことはない。これとは対照的に、Ｃ
αmRNAは、培養胎児胸腺リンパ球においてははっきりせ
ず、アダルト二重陰性細胞RNAではかろうじて検出で
き、アダルト胸腺リンパ球RNAにおいては明らかに存在
する。これらのデータは、二重陰性細胞標品がCD1マー
カーで選択されていないので、これまで発表された結果
と矛盾しない。

細胞集団中、Cx特異的RNAの大きさは2.0kb及び1.55kb
の２つの主要なグループに分けられる（マーカーのリボ
ゾーム28S及び18Sを5.1kb及び2.0kbとして測定）。Ｖ領
域をプローブとするハイブリダイゼーションでは2.0kb
のバンドのみが検出される。Jxの上流に位置するＤエレ
メントが同定され、いくつかの胎児胸腺リンパ球とアダ
ルト二重陰性細胞ハイブリドーマでDJx再構成が観察さ
れた。DJ再構成体を１個持っているただ一つの染色体を
有する二重陰性ハイブリドーマでは、1.55kbRNAだけが
存在する。このことは、1.55kb種の少なくともいくらか
はDJ転写体であることを支持するものである。これは、
VDJとDJの再構成体に対応するmRNAがサイズの違うクラ
スとして転写されることが観察されているIgのＨ鎖遺伝
子Ｃμ及びTCRのβ鎖遺伝子の場合と似ている。

2B4細胞における転写物の大きさは1.85kbであるとの
観察結果がある。この結果は再現性があり、単離された
cDNAクローンの大きさと合致している。これに対する説
明の一つは、細胞株間の多形性によるというものであ
る。なぜならば2B4転写物はB10.A株の染色体に由来し
（融合パートナーBW5147はこの領域が両方の染色体から
欠失している）、ここで解析された細胞集団はBALB/cま
たはBALB/cと129のF₁雑種（３週令のBALB/c×129F₁の胸
腺を抗CD4（GK1.5）モノクローナル抗体（A.Zlotnick博
士から入手できる）でテストしたもの）のどちらかに由
来するものだからである。別の説明は分別スプライシン
グである。

記載したこの特定の遺伝子は機能性の再構成を示さな
いが、遺伝子の構成要素は、高度に保存されたＴ細胞レ
セプターと免疫グロブリン配列と性質が一致する。2B4c
DNAクローンのＣ領域の配列はゲノム配列解析で確認さ
れた。Cxは単一コピー遺伝子であり、イントロン−エキ
ソン構成はIgとTCRの定常領域のそれに非常によく似て
いるので、偽遺伝子であるとは考えられない。さらに、
機能性ヘルパーあるいは細胞傷害性Ｔ細胞株に由来する
ほとんどすべてのγ鎖cDNAはout−of−frame連結の転写
物を表すものではあるが、なおその他の細胞タイプでは
機能性のメッセージとタンパク質を検出することができ
る。ここで単離されたcDNAは、機能性のα：βヘテロダ
イマーを持つヘルパーＴハイブリドーマ2B4からのもの
なので、これらの細胞中では機能性のないメッセージが
作られていても、他のタイプのＴ細胞中にCx配列を有す
るタンパク質が確認できるだろうと考えるのは合理的で
ある。

そのような機能性のある配列の１つの例は、２つのＮ
−結合グリコシル部位を有する30.7kDのポリペプチドを
コードしていると考えられる。全部グリコシル化された
形で約37kdとなる。これは報告されているマウスのδ鎖
タンパク質（グリコシル化された形で45kd、エンドグリ
コシダーゼＦで処理して37kd、Pardolly、前出）よりも
かなり小さい。ヒトＣγ遺伝子が１から３のヒンジ様エ
キソンを含むように別々にスプライス（組み継ぎ）され
ることができ、そのために見かけの分子量が相当に変化
することが最近観察されている（Littman et al.,Natur
e（1987）326:85−88）。2B4のメッセージは、Cx配列を
有する主な２種の大きい方と比べると約150ヌクレオチ
ドほど短い。したがって同じ様な現象がここに報告した
遺伝子についても起こっていて、胸腺リンパ球でみられ
る主要高分子量種が2B4cDNA配列にくらべエキソンを１
つまたはそれ以上余計に持っている可能性がある。コー
ド領域配列が150ヌクレオチド増えるとグリコシル化さ
れない分子量で36.2kDになる。これはマウスのδ鎖につ
いて観察されたものとほぼ同じである。

以上の結果から、これら新規な核酸配列は、分化の特
定な段階にある未熟なＴ細胞を同定するために使用でき
ることが明らかである。さらにこれらの配列は、主題の
ペプチド単独で発現させる、または他のＴ細胞特異的ペ
プチド、具体的にはＴ細胞レセプターにかかわるペプチ
ド、更に具体的にはβ及びγペプチド、との組み合わせ
て発現させるためのDNA構築体に用いることができる。
主題のペプチドは単独でまたは他のペプチドの組み合わ
せて、様々な環境下、たとえば診断用イムノアッセイ、
アフィニティクロマトグラフィなどでリガンドを結合さ
せるのに使用することができる。さらに主題のペプチド
は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の作成に
使用でき、そのような抗体は交差反応性のペプチドを持
っている２種のＴ細胞に結合してそのような特異的Ｔ細
胞を活性化または除去することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ユィエーシウチェンアメリカ合衆国，カリフォルニア 94041，マウンテンビュー，フォックスボロドライブ 422 (56)参考文献ＮａｔｕｒｅＶｏｌ．308（1984) ｐ．153−158 ＮａｔｕｒｅＶｏｌ．312（1984) ｐ．31−35 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】標準的ハイブリダイゼーション法により下
記の配列又はその相補配列にハイブリダイズできる、哺
乳類Ｔ細胞抗原レセプターδサブユニットをコードする
単離された核酸。
【請求項２】請求項１に記載の単離された核酸の少なく
とも連続した50ヌクレオチドからなる、単離されたポリ
ヌクレオチド。
【請求項３】請求項１に記載の単離された核酸の少なく
とも連続した500ヌクレオチドからなる、単離されたポ
リヌクレオチド。
【請求項４】請求項１に記載の単離された核酸の少なく
とも連続した1500ヌクレオチドからなる、単離されたポ
リヌクレオチド。
【請求項５】連続したヌクレオチドが哺乳類Ｔ細胞抗原
レセプターδサブユニットの免疫原性断片をコードする
ものである、請求項２から４のいずれか１項に記載の単
離されたポリヌクレオチド；ここで免疫原性断片は単独
であるいはキャリヤータンパクに連結して動物に投与し
た場合にその断片に対する抗体を誘起できるものであ
る。
【請求項６】核酸が検出可能に標識されている、請求項
１に記載の単離された核酸。
【請求項７】核酸が検出可能に標識されている、請求項
２から４のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレ
オチド。
【請求項８】請求項１に記載の単離された核酸を含む組
換えベクター。
【請求項９】請求項２から５のいずれか１項に記載の単
離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項１０】宿主中でのその核酸の発現を制御する遺
伝要素と機能的に連結された請求項１に記載の核酸を含
む、組換え発現ベクター。
【請求項１１】宿主中でのそのポリヌクレオチドの発現
を制御する遺伝要素と機能的に連結された請求項２から
４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、組
換え発現ベクター。
【請求項１２】請求項１に記載の核酸を含むように遺伝
子操作された宿主細胞、又はその子孫。
【請求項１３】請求項２から４のいずれか１項に記載の
ポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された宿主細
胞、又はその子孫。
【請求項１４】請求項８から11のいずれか１項に記載の
組換え発現ベクターを含むように遺伝子操作された宿主
細胞、又はその子孫。
【請求項１５】宿主細胞が細菌宿主細胞である、請求項
12から14のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１６】宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請
求項12から14のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１７】（ａ）哺乳類Ｔ細胞タンパク質をコード
する核酸を含む試料を標準的ハイブリダイゼーション条
件下で、下記の配列又はその相補体の少なくとも連続す
る12ヌクレオチドを有する核酸プローブと接触させ、（ｂ）該プローブに選択的にハイブリダイズできるポリ
ヌクレオチドを単離する、工程により得られる哺乳類Ｔ
細胞δサブユニットをコードする単離された核酸。
【請求項１８】請求項17に記載の核酸の少なくとも連続
する50ヌクレオチドを有する、単離されたポリヌクレオ
チド。
【請求項１９】請求項17に記載の核酸の少なくとも連続
する500ヌクレオチドを有する、単離されたポリヌクレ
オチド。