JPS59143589A - プラスミドｐＯＡ１５ - Google Patents
プラスミドｐＯＡ１５Info
- Publication number
- JPS59143589A JPS59143589A JP58015515A JP1551583A JPS59143589A JP S59143589 A JPS59143589 A JP S59143589A JP 58015515 A JP58015515 A JP 58015515A JP 1551583 A JP1551583 A JP 1551583A JP S59143589 A JPS59143589 A JP S59143589A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- poa15
- streptomyces
- pock
- molecular weight
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なグラスミドに関し、さらに詳しくは、成
る種の放線菌に対してポック（ｐｏｃｋ ）形成能を付
与する特性をもつ放線菌由来の環状グラスミドに関する
。
る種の放線菌に対してポック（ｐｏｃｋ ）形成能を付
与する特性をもつ放線菌由来の環状グラスミドに関する
。
染色体外遺伝子であるプラスミドは、遺伝子操作におい
て有用な遺伝子をクローン化するためのベクターとして
有用である。
て有用な遺伝子をクローン化するためのベクターとして
有用である。
従来、組換えＤＮＡの研究分野で（ｒｉ、宿主としては
主に犬暢菌及び枯草菌が使用され、また、ベクターとし
てはｐ Ｂ Ｒ３２２及びブドウ球内由来のｐＵＢｘ
１０等が用いられている。
主に犬暢菌及び枯草菌が使用され、また、ベクターとし
てはｐ Ｂ Ｒ３２２及びブドウ球内由来のｐＵＢｘ
１０等が用いられている。
他方、放線菌は有用な抗生物質や生理活性物質の生産菌
として重要であり、遺伝子操作による鉋株の改良によっ
て抗生物質や生理活性物質の生産量の増大や新規な有用
物質の創生の可能性が秘められており、期待されるとこ
ろが大きく、最近注目されている。放線菌由来の遺伝子
組換え操作においては、その宿主もベクターも放線困由
来のものを利用することが望ましいと考えられ、これ迄
、放線菌由来のプラスミドとしてｐＵｃ１〜１０等数多
く報告されている（例えば、特開昭５Ｓ−１３３３９６
号、同５５−１３３３９７号、同５５−１２０６００号
公報等参照）が、これらは特定の選択マーカーを持たず
、クローニングベクターとして不適当である。これに対
して５ＣＰ２＊及び５ＬＰｘ系プラスミドはそれぞれ、
ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅ ｃｏｅｌｉ−ｃｏｌｏｒ）及びストレプトミセス・
リビダンス（Ｓ。
として重要であり、遺伝子操作による鉋株の改良によっ
て抗生物質や生理活性物質の生産量の増大や新規な有用
物質の創生の可能性が秘められており、期待されるとこ
ろが大きく、最近注目されている。放線菌由来の遺伝子
組換え操作においては、その宿主もベクターも放線困由
来のものを利用することが望ましいと考えられ、これ迄
、放線菌由来のプラスミドとしてｐＵｃ１〜１０等数多
く報告されている（例えば、特開昭５Ｓ−１３３３９６
号、同５５−１３３３９７号、同５５−１２０６００号
公報等参照）が、これらは特定の選択マーカーを持たず
、クローニングベクターとして不適当である。これに対
して５ＣＰ２＊及び５ＬＰｘ系プラスミドはそれぞれ、
ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅ ｃｏｅｌｉ−ｃｏｌｏｒ）及びストレプトミセス・
リビダンス（Ｓ。
１ｉｖｉｄａｎｓ ）にポック形成能を付与し、実際種
々の薬剤耐性遺伝子のクローン化に使用されている（Ｂ
ｉｂｂ、 ｌｖｆ、、 ｅｔ ａｌ、、 ＮａｔｒＬ
ｒｅ、 ２８４ 。
々の薬剤耐性遺伝子のクローン化に使用されている（Ｂ
ｉｂｂ、 ｌｖｆ、、 ｅｔ ａｌ、、 ＮａｔｒＬ
ｒｅ、 ２８４ 。
５２６〜５３１ 、１９８０． ＨＴｈｏｍｐｓｏｎ、
Ｃ，Ｊ、。
Ｃ，Ｊ、。
ａｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２８６ 、５２５
〜５２７゜１’ ９８０ 、 ； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、
Ｃ，Ｊ、、 ｅｔ ａｌ、。
〜５２７゜１’ ９８０ 、 ； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、
Ｃ，Ｊ、、 ｅｔ ａｌ、。
Ｊ、 ＢαＣｔｅγｉｏ１．．１５１，６６９〜６７７
゜１９８２、）。 しかし、これらの宿主はストレプト
ミセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リビダン
スに限定され、他の重要な種々多様な抗生物質生産菌中
では複製維持されず、ベクターとして応用範囲が狭いと
いう難点がある。
゜１９８２、）。 しかし、これらの宿主はストレプト
ミセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リビダン
スに限定され、他の重要な種々多様な抗生物質生産菌中
では複製維持されず、ベクターとして応用範囲が狭いと
いう難点がある。
本発明者らは、成る種の放線菌に対してポック形成能を
付与するという選択マーカーとしての性質をもち、宿主
内で安定で且つコピー数が適度に多い放線凶由来のプラ
スミドを得るべく、ストレグトマイシン生産閑であるス
トレプトミセス・ブリセラ、ｘ、 （Ｓ、 ｇｒｉｓｅ
ｌｂｓ） ＡＴＣＣ１０１３７を宿主菌として選び、各
地の土壌から分離した放線菌のプラスミドの中から上記
のストレプトミセス・グリセウスに対してポック形成能
を付与するものを形質転換によって検索した結果、今回
、コピー数約２０個／染色体、ストレプトミセス・グリ
セウス内で脱落頻度が１生活史当り約０．６％を示す如
く安定であｐ更に大きさが適当であジ、且つ、クロ−ニ
グに有用と考えられる制限酵素部位としてＢａｍＨＩ及
びＥｃｏＲＩ等を有する新規なプラスミド金兄い出し、
本発明を完成した。
付与するという選択マーカーとしての性質をもち、宿主
内で安定で且つコピー数が適度に多い放線凶由来のプラ
スミドを得るべく、ストレグトマイシン生産閑であるス
トレプトミセス・ブリセラ、ｘ、 （Ｓ、 ｇｒｉｓｅ
ｌｂｓ） ＡＴＣＣ１０１３７を宿主菌として選び、各
地の土壌から分離した放線菌のプラスミドの中から上記
のストレプトミセス・グリセウスに対してポック形成能
を付与するものを形質転換によって検索した結果、今回
、コピー数約２０個／染色体、ストレプトミセス・グリ
セウス内で脱落頻度が１生活史当り約０．６％を示す如
く安定であｐ更に大きさが適当であジ、且つ、クロ−ニ
グに有用と考えられる制限酵素部位としてＢａｍＨＩ及
びＥｃｏＲＩ等を有する新規なプラスミド金兄い出し、
本発明を完成した。
しかして、本発明によれば、ストレプトミセス・グリセ
ウスＡＴＣＣｌ０１３７に対してポック形成能を付与す
る性質を有し、分子量が約１０．４ｋｂであり、且つ下
記の制限酵素に対して下記の感受性を示す、すなわち （ａ） Ｂａｍ１ｉ ｌによる認識部位が１ケ所であ
り、（ｂ）ＥｃｏＲＩによる認識部位が１ケ所であり、
（Ｃ）Ｓαｉｔによる認識部位が５ケ所であり、（ｄ）
Ｂｇｌｎ、Ｈｉ ｎ ｄ ｍ、ＫｐｒＮ、Ｐｓｔ＋及び
Ｘｂａｌにより切断されなり ことを特徴とするプラスミドｐＯＡ１５が提供される。
ウスＡＴＣＣｌ０１３７に対してポック形成能を付与す
る性質を有し、分子量が約１０．４ｋｂであり、且つ下
記の制限酵素に対して下記の感受性を示す、すなわち （ａ） Ｂａｍ１ｉ ｌによる認識部位が１ケ所であ
り、（ｂ）ＥｃｏＲＩによる認識部位が１ケ所であり、
（Ｃ）Ｓαｉｔによる認識部位が５ケ所であり、（ｄ）
Ｂｇｌｎ、Ｈｉ ｎ ｄ ｍ、ＫｐｒＮ、Ｐｓｔ＋及び
Ｘｂａｌにより切断されなり ことを特徴とするプラスミドｐＯＡ１５が提供される。
本発明のプラスミドｐＯＡＩ５は、ストレプトミセス・
グリセウスＡＴＣＣｘ ｏ ｔ ａ７に対してポック形
成能を付与する性質があり、ここで「ポック形成」とは
、ある極のグラスミドを保持している酌株を当該グラス
ミドを保持していない同じ踵に属する菌株と接触する状
態で生育させた場合、該プラスミド非保持菌の気菌糸ま
たは胞子の形成が阻害される現象をいう。
グリセウスＡＴＣＣｘ ｏ ｔ ａ７に対してポック形
成能を付与する性質があり、ここで「ポック形成」とは
、ある極のグラスミドを保持している酌株を当該グラス
ミドを保持していない同じ踵に属する菌株と接触する状
態で生育させた場合、該プラスミド非保持菌の気菌糸ま
たは胞子の形成が阻害される現象をいう。
また、本発明の７０ラスミドｐＯＡ１５はアガロース・
グル電気泳動法によす測定した分子量が約１０、４ ｋ
ｂ テあり、この分子量はＲ，Ｗ、 Ｄａｖｉｓらの
ホルムアミド法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ。
グル電気泳動法によす測定した分子量が約１０、４ ｋ
ｂ テあり、この分子量はＲ，Ｗ、 Ｄａｖｉｓらの
ホルムアミド法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ。
Ｖｏｔ、２１．４１３〜４２８．１９７１参照）に樗い
スタンダードとしてｐＢＲ３２２（４３６２ｂｐ）を用
い電子顕微＠ （Ｈｉ ｔａｃｈｉ ＨＳ’ −７Ｄ使
用）観堅によって測定した場合の分子量（１０，４±０
．３ ｋ ｂ ）と大体一致している。しかして、本明
細書においていう分子量はアガロース・グル電気泳動法
により測定した分子量を意味するものである。
スタンダードとしてｐＢＲ３２２（４３６２ｂｐ）を用
い電子顕微＠ （Ｈｉ ｔａｃｈｉ ＨＳ’ −７Ｄ使
用）観堅によって測定した場合の分子量（１０，４±０
．３ ｋ ｂ ）と大体一致している。しかして、本明
細書においていう分子量はアガロース・グル電気泳動法
により測定した分子量を意味するものである。
さらに、本発明のプラスミドｐＯＡ１５の各種制限酵素
に対する感受性は上記（α）〜（ｄ）に示すとおりであ
り、より詳細に各制限酵素による分解断片の分子ｔ （
ｋ ｂ ）は次のとおりである。
に対する感受性は上記（α）〜（ｄ）に示すとおりであ
り、より詳細に各制限酵素による分解断片の分子ｔ （
ｋ ｂ ）は次のとおりである。
（ａ） Ｂａｍ１ｉ Ｉ ： １０．４（６）
ＥｃｏＲＩ： １０．４ （ｃ） Ｓａ、ｌｌ ： ３．０；Ｚ２；２．ｌ
；１．８；０．８ マタ、ダブル・ダイゼツション（ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅ
ｓｔｉｏｎ ）によつ゛〔決定した本発明のグラスミド
の制限酵素地図は添付の第１図に示すとおりである。図
中の数字は分子量（単位：ｋｂ−キロベースペア）であ
る。図から明らかなように、本発明のｆラスミドル Ｏ
Ａ １５ Ｉ）ＢａｍＨｌ又はＬ″ｃｏｌｌｌ サイ
トは、外来ＤＮＡのクローニング部位に適していると考
えられる。
ＥｃｏＲＩ： １０．４ （ｃ） Ｓａ、ｌｌ ： ３．０；Ｚ２；２．ｌ
；１．８；０．８ マタ、ダブル・ダイゼツション（ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅ
ｓｔｉｏｎ ）によつ゛〔決定した本発明のグラスミド
の制限酵素地図は添付の第１図に示すとおりである。図
中の数字は分子量（単位：ｋｂ−キロベースペア）であ
る。図から明らかなように、本発明のｆラスミドル Ｏ
Ａ １５ Ｉ）ＢａｍＨｌ又はＬ″ｃｏｌｌｌ サイ
トは、外来ＤＮＡのクローニング部位に適していると考
えられる。
以上に述べた如き特性をもつ本発明のプラスミドｐＯＡ
１５は、吹出面のある±４から分離されたストレグトミ
セス属に属し、本発明者等によってストレフ゛トミセス
・エスピー・０Ａ１５と命名された菌株から分離、精製
される。
１５は、吹出面のある±４から分離されたストレグトミ
セス属に属し、本発明者等によってストレフ゛トミセス
・エスピー・０Ａ１５と命名された菌株から分離、精製
される。
本菌株の閑学的性状は下記の通りである。
（ａ） 形態
分枝は単純分枝であり、車軸分枝はみられない。
胞子連鎖の胞子数は少く、その形態は不冗全ならぜん状
、ループ状（１ｏｏｐｓ ）、カギ状（ｈｏｏｋｓ）を
呈する。連鎖の長いものも見られ、それは面状である。
、ループ状（１ｏｏｐｓ ）、カギ状（ｈｏｏｋｓ）を
呈する。連鎖の長いものも見られ、それは面状である。
しばしは胞子の数ケが合体しているのが認められた。胞
子の表面構造は平滑（Ｓｍｏｏｔｈ）である。鞭毛胞子
及び胞子のうは認められない。
子の表面構造は平滑（Ｓｍｏｏｔｈ）である。鞭毛胞子
及び胞子のうは認められない。
（ｂ）次の各培地における生育状態（特にことわらない
かぎり２８Ｃ＠養） （Ｃ） 各生理的性質 （１）生育温度＝２０′〜３７Ｃに生育、４５Ｃでは生
育できない。
かぎり２８Ｃ＠養） （Ｃ） 各生理的性質 （１）生育温度＝２０′〜３７Ｃに生育、４５Ｃでは生
育できない。
（２）ゼラチンの液化：陽性
（２０Ｃ老養）
（３）スターチのカ日水分解：ｌ′４性（４）脱脂牛乳
の凝固：＠性、ペプトン化二隙性（５） メラニン様
色素の生成：陽性（ペグトン・酵母エキス鉄碧天、チロ
シン寒天及びトリプトン・酵母エキスグロス培地のいづ
れも陽性） （ｄ） 次の戻累源の同化性（プリトノ・ム・コ゛ド
リープ寒天培地上） Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−フラクトース、シュクロース、イノシトール、Ｌ−
ラムノース、ラフィノース、及びＤ−マンニット全利用
する。
の凝固：＠性、ペプトン化二隙性（５） メラニン様
色素の生成：陽性（ペグトン・酵母エキス鉄碧天、チロ
シン寒天及びトリプトン・酵母エキスグロス培地のいづ
れも陽性） （ｄ） 次の戻累源の同化性（プリトノ・ム・コ゛ド
リープ寒天培地上） Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−フラクトース、シュクロース、イノシトール、Ｌ−
ラムノース、ラフィノース、及びＤ−マンニット全利用
する。
上記の菌株は茨木県筑波郡谷田部町東１丁目１番３号の
工業技術院微生物工業技術研究所に、昭和５８年１月２
７日付で、受託番号：微工研菌寄第６８８９号にて寄託
されている。
工業技術院微生物工業技術研究所に、昭和５８年１月２
７日付で、受託番号：微工研菌寄第６８８９号にて寄託
されている。
本閑株からの前記グラスミドの分離・精製１ｄ１それ自
体公知の方法、例えばアルカリ抽出法（ｒａｐｉｄ ａ
ｌｋａｌｉｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｎｔｅｔｈｏ
ｄ ；Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，、ａｎｄ Ｊ、
Ｄｏｌｙ、’ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、、 ７
、１５１３〜１５２３ 、１’９７９・参照）により
行なうことができる。より具体咋には、上記菌株を例え
ば、シュクロース及びグリシンを含む栄養培地で培養し
た後、リゾチーム処理を行ない且つ界面活性剤例えばド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加して溶菌させ、
その溶醒液をアルカリでｐＨ１２に調整することによっ
て染色体を特異的に変性させ、次いで遠心分離により該
変性染色体を除去しｆｃ後、上澄液をエタノール沈殿及
び塩化セシウム（ＣｓＣ１）−エチソウムプロマイド（
ＥｔＢｒ）密度勾配超遠心分離に付すことにより、プラ
スミドｐＯＡ１５が実質的に純粋な形で分１唯すること
ができる。
体公知の方法、例えばアルカリ抽出法（ｒａｐｉｄ ａ
ｌｋａｌｉｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｎｔｅｔｈｏ
ｄ ；Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，、ａｎｄ Ｊ、
Ｄｏｌｙ、’ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、、 ７
、１５１３〜１５２３ 、１’９７９・参照）により
行なうことができる。より具体咋には、上記菌株を例え
ば、シュクロース及びグリシンを含む栄養培地で培養し
た後、リゾチーム処理を行ない且つ界面活性剤例えばド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加して溶菌させ、
その溶醒液をアルカリでｐＨ１２に調整することによっ
て染色体を特異的に変性させ、次いで遠心分離により該
変性染色体を除去しｆｃ後、上澄液をエタノール沈殿及
び塩化セシウム（ＣｓＣ１）−エチソウムプロマイド（
ＥｔＢｒ）密度勾配超遠心分離に付すことにより、プラ
スミドｐＯＡ１５が実質的に純粋な形で分１唯すること
ができる。
本発明により提供されるグラスミドｐＯＡ１５は、後記
参考例１に示すとおり、ストレプトミセス・グリセウス
ＡＴＣＣ１０１３７に対してポック形成能を付与する特
性をゼしており、形質転俣笑、験において形（＠転換体
を明確に特定することが可能となり、その形質転換頻贋
も約１０７ｐｏｃ）ｃｓ／μｙＤＮＡと’７く、クロー
ニングベクターとして極めて適している。
参考例１に示すとおり、ストレプトミセス・グリセウス
ＡＴＣＣ１０１３７に対してポック形成能を付与する特
性をゼしており、形質転俣笑、験において形（＠転換体
を明確に特定することが可能となり、その形質転換頻贋
も約１０７ｐｏｃ）ｃｓ／μｙＤＮＡと’７く、クロー
ニングベクターとして極めて適している。
廿だ、本発明により提供されるグラスミドｐＯＡ１５は
、後記参考例２〜３において実証されているように、宿
主菌体における安定性に優れコピー数も適度に多く、ベ
クターとして極めて有用であると考えられる。
、後記参考例２〜３において実証されているように、宿
主菌体における安定性に優れコピー数も適度に多く、ベ
クターとして極めて有用であると考えられる。
次に実施例及び参考例によジ本発明のグラスミドｐＯＡ
１５についてさらに詳しく説明する。
１５についてさらに詳しく説明する。
実施例
□Ａ１５菌株の胞子を３４％シュークロース及び０．２
％ＭｇＣｌ２・６Ｈ，Ｏを含むＹＥＭＥ培地（０，３％
イーストエクストラクト、０．５％バクトペグトン、０
．３％マルトエキストラクト、１．０％グルコース）に
接種し、２８Ｃで７２時間ロータリーシェーカーで培養
した。この前＠養液１５ｍ１を、３４％シュークロース
、０．２％Ｍ’ＯＣ１，・６Ｈ，Ｏ及び０．４％グリシ
ンを含むＹＥＭＥ培地３００−にｔｉ菌し、２８Ｃで２
４時間培養後、遠心分離を行ない集菌する。１２％シュ
ークロースで洗浄後、歯体を３２−の［１（５■／ｒｎ
ｌリゾチーム、ｓｏｍＭグルコース、１０ｍＭエチレン
ソアミン四昨酸（ＥＤＩ’Ａ）、２５７ＦＬＭ）リス緩
衝液、７＋ｌＪ８．Ｏ）に懸濁し、ＯＣで６０分で溶菌
させた。その後、６４−のＫ Ｉｆ （０，２Ｎ Ｎ
ａ０１１゜１％Ｓ １．） Ｓ ）を加え、ＯＣで５分
間放置した後、４８ゴの液１１１（３ｚ１４酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ４，８）を添加し、６０分間放置した。遠心
分、−！＄を行なった後、上ｌ）￥ｌＩＣ２，５倍容の
冷エタノールを力りえ、−２００で３０分間静）摸する
。遠心分離後、残液を１０−の液■（ｏ、ｔＭ酢敏ナト
リウム、０．０５Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８，０）にとか
し、さらに２回エタノール沈滅を行ない、最終的に５６
−の’１’ Ｅ Ｓ 僅衝液（２０ｍＭ トリス緩衝液
、ｐ Ｈｓ、 ｏ、１０ ｍＭ＃ＤＴ Ａ、 ５０
ｍＭ ＮａＣｌ ）にとかした。このＤ Ｎ Ａ ｒｔ
４液に、０．３１ｎ！、の１０ ｍ９／ −（７）Ｅｔ
Ｂｒ、６．ＯｆのＣｓＣ１を加え、ＲＰ６５Ｔローター
（日立製作瓶製）を用い、３８，０００ｒｐ鳳１８Ｃ，
４０時間超遠心分離を行った。超遠心分離を行なったｆ
、ＵＶラング照射によって箪票されるプラスミドを注射
器でぬさと９、プタノールテＥ ｔ Ｂ ｒを除いた後
、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス援衝液緩衝液Ｈ７，５，
１ｍＭ Ｅ’Ｄ ７” Ａ ） に対し十分透析した。
％ＭｇＣｌ２・６Ｈ，Ｏを含むＹＥＭＥ培地（０，３％
イーストエクストラクト、０．５％バクトペグトン、０
．３％マルトエキストラクト、１．０％グルコース）に
接種し、２８Ｃで７２時間ロータリーシェーカーで培養
した。この前＠養液１５ｍ１を、３４％シュークロース
、０．２％Ｍ’ＯＣ１，・６Ｈ，Ｏ及び０．４％グリシ
ンを含むＹＥＭＥ培地３００−にｔｉ菌し、２８Ｃで２
４時間培養後、遠心分離を行ない集菌する。１２％シュ
ークロースで洗浄後、歯体を３２−の［１（５■／ｒｎ
ｌリゾチーム、ｓｏｍＭグルコース、１０ｍＭエチレン
ソアミン四昨酸（ＥＤＩ’Ａ）、２５７ＦＬＭ）リス緩
衝液、７＋ｌＪ８．Ｏ）に懸濁し、ＯＣで６０分で溶菌
させた。その後、６４−のＫ Ｉｆ （０，２Ｎ Ｎ
ａ０１１゜１％Ｓ １．） Ｓ ）を加え、ＯＣで５分
間放置した後、４８ゴの液１１１（３ｚ１４酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ４，８）を添加し、６０分間放置した。遠心
分、−！＄を行なった後、上ｌ）￥ｌＩＣ２，５倍容の
冷エタノールを力りえ、−２００で３０分間静）摸する
。遠心分離後、残液を１０−の液■（ｏ、ｔＭ酢敏ナト
リウム、０．０５Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８，０）にとか
し、さらに２回エタノール沈滅を行ない、最終的に５６
−の’１’ Ｅ Ｓ 僅衝液（２０ｍＭ トリス緩衝液
、ｐ Ｈｓ、 ｏ、１０ ｍＭ＃ＤＴ Ａ、 ５０
ｍＭ ＮａＣｌ ）にとかした。このＤ Ｎ Ａ ｒｔ
４液に、０．３１ｎ！、の１０ ｍ９／ −（７）Ｅｔ
Ｂｒ、６．ＯｆのＣｓＣ１を加え、ＲＰ６５Ｔローター
（日立製作瓶製）を用い、３８，０００ｒｐ鳳１８Ｃ，
４０時間超遠心分離を行った。超遠心分離を行なったｆ
、ＵＶラング照射によって箪票されるプラスミドを注射
器でぬさと９、プタノールテＥ ｔ Ｂ ｒを除いた後
、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス援衝液緩衝液Ｈ７，５，
１ｍＭ Ｅ’Ｄ ７” Ａ ） に対し十分透析した。
このようにして実質的に純粋なグラスミドＤＮＡｐＯＡ
１５が得られた。
１５が得られた。
参考・ヒリ１
プラスミドの１ｉｉＡＩ製と同様に、ストレプトミセス
−グリセウスＡＴＣＣ１０１３７を、３４％シュークロ
ース、０．１ Ｍｇｃ １２−６１１２０及び０．８％
グリシンを含むＹ Ｅ Ｍ Ｅ培地２０ｍｅ中で２８ｃ
にて２４時間培養した。菌体を１２％シュークロースで
２回洗浄後、１０−の１〜／ｍｌ’）ゾチームを含むＰ
３液（７０ｍＭＮａｃ ｌ 、 ５ ｍＭ ＭｇＣ１２
−６Ｂ、０，５ｍＭＣａＣ１，−２Ｂ２０．ｏ、ｓＭシ
ュークロース、２５ｍＭＴＥＳＣＮ−） １．＋７．（
ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタン−スルホ
ン酸〕、ｐノミ、 ７．２ ）に懸濁し、２８ｃで３０
分間ゆるやかＶこ娠とうし、プロトプラストを形成させ
た。１０００：ｌ’で遠心分離段、１０ｍ１のＰＷＰ液
（７０ｍＭＮａＣｔ、 ｌＯｍＭＭｇｃ１２−６Ｈ，Ｏ
１２０ｔｎｌｌｉ ＣａＣ１２−２Ｈ２０，０，５４’
ｓ シュークロース、２ ｓ ｍＭＴＥ Ｓ、 ｐ
Ｈ７，２）で２回洗浄する。
−グリセウスＡＴＣＣ１０１３７を、３４％シュークロ
ース、０．１ Ｍｇｃ １２−６１１２０及び０．８％
グリシンを含むＹ Ｅ Ｍ Ｅ培地２０ｍｅ中で２８ｃ
にて２４時間培養した。菌体を１２％シュークロースで
２回洗浄後、１０−の１〜／ｍｌ’）ゾチームを含むＰ
３液（７０ｍＭＮａｃ ｌ 、 ５ ｍＭ ＭｇＣ１２
−６Ｂ、０，５ｍＭＣａＣ１，−２Ｂ２０．ｏ、ｓＭシ
ュークロース、２５ｍＭＴＥＳＣＮ−） １．＋７．（
ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタン−スルホ
ン酸〕、ｐノミ、 ７．２ ）に懸濁し、２８ｃで３０
分間ゆるやかＶこ娠とうし、プロトプラストを形成させ
た。１０００：ｌ’で遠心分離段、１０ｍ１のＰＷＰ液
（７０ｍＭＮａＣｔ、 ｌＯｍＭＭｇｃ１２−６Ｈ，Ｏ
１２０ｔｎｌｌｉ ＣａＣ１２−２Ｈ２０，０，５４’
ｓ シュークロース、２ ｓ ｍＭＴＥ Ｓ、 ｐ
Ｈ７，２）で２回洗浄する。
ヘマチトメーターで計数すると、約１０Ｑ／−のプロト
プラスト斑醜液が得られる。この１０ Ｑ／ｍｌのプロ
トプラストを言む懸摸液を遠心分離し、上吊゛をすてた
俊、残った少量のＰＷＰ液にプロトプラストを７１０２
面し、これに２０μｌのｐＯＡ１５Ｄ Ｎ Ａ液（約１
μ？）を加えた。この直仮に、０５ｍ１のポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）液（１５％ ’Ｊ −Ｌ −りｏ
−、Ｘ、０．１ ｋｉ ＣａＣｌ、 ・２Ｂ２０衝液
、ｐ Ｈ８，０、０，２％ｖｏｌ／ｖｏｌ微童元素済液
Ｃ０ｋａｎｉｓんｉ ｅｔ ａに Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、。
プラスト斑醜液が得られる。この１０ Ｑ／ｍｌのプロ
トプラストを言む懸摸液を遠心分離し、上吊゛をすてた
俊、残った少量のＰＷＰ液にプロトプラストを７１０２
面し、これに２０μｌのｐＯＡ１５Ｄ Ｎ Ａ液（約１
μ？）を加えた。この直仮に、０５ｍ１のポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）液（１５％ ’Ｊ −Ｌ −りｏ
−、Ｘ、０．１ ｋｉ ＣａＣｌ、 ・２Ｂ２０衝液
、ｐ Ｈ８，０、０，２％ｖｏｌ／ｖｏｌ微童元素済液
Ｃ０ｋａｎｉｓんｉ ｅｔ ａに Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、。
ｇｏ 、３８９−４００．１９７４．］）を加え室温で
１分間放置後、５ｍｌのＰＷＰ液を小加七、ＤＮＡの取
り込みを停止させた。遠心分離後、ＰＷＰ液で洗浄し、
白金耳を用いて後記の再生培地に描いた。なお、形質転
換体の比率が多い場合には適当に希釈し、過剰量のｐＯ
Ａ１５を保粕しないプロトプラストを添加した後に再生
培地上に播いた。約２８Ｃで７日培養すると、再生ブレ
ート上にポックが観察され、すべてのポックはｐＯＡ１
５を保持していた。形質転換頻度は、ストレプトミセス
０Ａ１５から調製したｐＯＡ１５を用いると９．４Ｘ１
０／μｔＤＮＡであったが、ストレプトミセス・グリセ
ウスＡＴＣＣ１ｏ１３７がら新たに調製したｐＯＡｌｌ
を用いると２．４Ｘ１０７ス・グリセウスＡＴＣＣ１０
１３７が何らかの制限修飾系を保持しているためと考え
られる。
１分間放置後、５ｍｌのＰＷＰ液を小加七、ＤＮＡの取
り込みを停止させた。遠心分離後、ＰＷＰ液で洗浄し、
白金耳を用いて後記の再生培地に描いた。なお、形質転
換体の比率が多い場合には適当に希釈し、過剰量のｐＯ
Ａ１５を保粕しないプロトプラストを添加した後に再生
培地上に播いた。約２８Ｃで７日培養すると、再生ブレ
ート上にポックが観察され、すべてのポックはｐＯＡ１
５を保持していた。形質転換頻度は、ストレプトミセス
０Ａ１５から調製したｐＯＡ１５を用いると９．４Ｘ１
０／μｔＤＮＡであったが、ストレプトミセス・グリセ
ウスＡＴＣＣ１ｏ１３７がら新たに調製したｐＯＡｌｌ
を用いると２．４Ｘ１０７ス・グリセウスＡＴＣＣ１０
１３７が何らかの制限修飾系を保持しているためと考え
られる。
※再生培地
シュークロース １３７２グルコー
ス １０２η？リベソ０トン（
犬五） ４．Ｏｆイースト・エクス
ｌ−ンクト ４０２ｋ１ｇｃ １２−６１
１２０ ４．１ ｉｉ’ＫＣ１Ｏ
，５？ ｉ（、ＨＰＯ４０，２？ ＣａＣ１２−２１１，０７，４り Ｔ Ｅ Ｓ ＋＃衝敵 ５７
？脱イオン水 １ｌＪｐ Ｈ７
，２ 寒天 ２２２ 参考例２ 」上人とビゲ」に４Ｌロビニ乙ム≧豫Ａ工ＣＣ１０１３
７での安定性 ｐＯＡ１５でストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ１
０１３７を形質転換した後、出現してきたポックを再生
Ｊ１片地に移植し胞子を形成させた。
ス １０２η？リベソ０トン（
犬五） ４．Ｏｆイースト・エクス
ｌ−ンクト ４０２ｋ１ｇｃ １２−６１
１２０ ４．１ ｉｉ’ＫＣ１Ｏ
，５？ ｉ（、ＨＰＯ４０，２？ ＣａＣ１２−２１１，０７，４り Ｔ Ｅ Ｓ ＋＃衝敵 ５７
？脱イオン水 １ｌＪｐ Ｈ７
，２ 寒天 ２２２ 参考例２ 」上人とビゲ」に４Ｌロビニ乙ム≧豫Ａ工ＣＣ１０１３
７での安定性 ｐＯＡ１５でストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ１
０１３７を形質転換した後、出現してきたポックを再生
Ｊ１片地に移植し胞子を形成させた。
ここから胞子ｗ、′１１７Ｊ液を調製し、適当に希釈後
書中培地に倚いてコロニーを形成させた。ｐＯＡ１５を
保持しないストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ１０
１３７の胞子をグレート−而に生育するように濃く撞い
た再生培地に先のコロニーをレプリカして、コロニーの
回りに狭い胞子形成阻害ゾーンが形成されるかどうかで
、それぞれのコロニーのポック形成能を判定した。この
結果１生活史（ｏｎｅ １ｉｆｅ ｃｙｃｌｅ ）当９
ポック形成能を示さなくなった胞子は０．６％（１／１
５９）であり、これはｐＯＡ１５の脱落頻度と考えられ
、ｐＯＡ１５はストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ
１０１３７で安定であることが明らかとなった。
書中培地に倚いてコロニーを形成させた。ｐＯＡ１５を
保持しないストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ１０
１３７の胞子をグレート−而に生育するように濃く撞い
た再生培地に先のコロニーをレプリカして、コロニーの
回りに狭い胞子形成阻害ゾーンが形成されるかどうかで
、それぞれのコロニーのポック形成能を判定した。この
結果１生活史（ｏｎｅ １ｉｆｅ ｃｙｃｌｅ ）当９
ポック形成能を示さなくなった胞子は０．６％（１／１
５９）であり、これはｐＯＡ１５の脱落頻度と考えられ
、ｐＯＡ１５はストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ
１０１３７で安定であることが明らかとなった。
参考例３
コ１＝”−）；ｙ、ｆｄキーザーらの方法（Ｋｉｅｓｅ
ｒ、 Ｔ。
ｒ、 Ｔ。
ｅｔ ａｌ、、 Ｎｏｔ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、、
１８５ 。
１８５ 。
２２３〜２３８，１９８２．）を一部改変して決定した
。すなわち、ｐＯＡ１５を保持するストレフ０トミセス
・グリセウスＡＴＣＣ１０１３７をｎｉｌ記実施例と同
様にフ０ロトプラスト化し、１倍芥の１％ザルコシル及
び２５ｍＭＥＤＴＡ 液を加え、完全に溶萌させた優
、ｑｏｃで１０分間保温し、膜結合型ＤＮＡを、萌胞残
清から遊離させた。冷却Ｌｔ倍ｓのフェノール：クロロ
ホルム（１：１）液を肌え厳しく攪拌し、遠心分離によ
って水層と有機層とに分けた。この操作に、ｃ！ｌｌ蛋
白質が除かれる。水層をエタノール沈２飯汝、適当に希
釈し、このようにして調製した種々の希釈サンプルにつ
いてアガロ−スケ゛ル電気激動を行なった。泳動後、ケ
゛ルをＥｔＢｒ ｉ；ｉ （１，０／ｌｚり／、７りで
染色し、短波長の紫外線を照射しｃ ｃ ｃＤＮＡに切
れ目を入れ、さらに、ＥｔＢｒ溶液で１時間染色を行な
った。このケ゛ルをポラロイドフィルム６６５Ｑ用いて
撮影し、そのネガティブフィルムの染色体トフ。
。すなわち、ｐＯＡ１５を保持するストレフ０トミセス
・グリセウスＡＴＣＣ１０１３７をｎｉｌ記実施例と同
様にフ０ロトプラスト化し、１倍芥の１％ザルコシル及
び２５ｍＭＥＤＴＡ 液を加え、完全に溶萌させた優
、ｑｏｃで１０分間保温し、膜結合型ＤＮＡを、萌胞残
清から遊離させた。冷却Ｌｔ倍ｓのフェノール：クロロ
ホルム（１：１）液を肌え厳しく攪拌し、遠心分離によ
って水層と有機層とに分けた。この操作に、ｃ！ｌｌ蛋
白質が除かれる。水層をエタノール沈２飯汝、適当に希
釈し、このようにして調製した種々の希釈サンプルにつ
いてアガロ−スケ゛ル電気激動を行なった。泳動後、ケ
゛ルをＥｔＢｒ ｉ；ｉ （１，０／ｌｚり／、７りで
染色し、短波長の紫外線を照射しｃ ｃ ｃＤＮＡに切
れ目を入れ、さらに、ＥｔＢｒ溶液で１時間染色を行な
った。このケ゛ルをポラロイドフィルム６６５Ｑ用いて
撮影し、そのネガティブフィルムの染色体トフ。
ラスミド部位の讃さを、島津デンシトメーターＣ８−９
１０を用いて定量化した。ストレプトミセス・グリセウ
スＡＴＣＣ１０１３７の染色体の大きさを１０’ ｋｂ
とすると（Ｂｅｎｉｇｎｉ、 Ｒ。
１０を用いて定量化した。ストレプトミセス・グリセウ
スＡＴＣＣ１０１３７の染色体の大きさを１０’ ｋｂ
とすると（Ｂｅｎｉｇｎｉ、 Ｒ。
ｅｔ ａｔ、、 Ａｐｐｌ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、
３０ 。
３０ 。
１８０−１８２．１９７７、）、上で得られた染色体と
グラスミドの比よｆ）、７）ＯＡ１５のコピー数は約２
０コピー／染色体と算出された。
グラスミドの比よｆ）、７）ＯＡ１５のコピー数は約２
０コピー／染色体と算出された。
第１図は本発明のグラスミドｐＯＡ１５の制限酵素地図
である。 第１図 手続補正書（自発ン 昭和５８年６月１４日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１５５１５号 ２、発明の名称 プラスミドｐｏΔ１５ ３ 七〇正をする渚 事（′＋とυ）関係 持訂出願人 住 所 東京都中央区京橋−丁目１５番１号４人 埋
人〒１（Ｊ７ 別紙のとおり （１）本願特許請求の範囲の全文（明細書第１頁第５〜
１４行）を別紙のとおり訂正する。 （２） 明細書第１９頁下から第４行にｒ（１／１！
Ｍ’）Ｊとあるを、Ｆ（１／１ｓｓ）、１と訂正する。 以上 （別紙） 〔特許請求の範囲〕 「ストレプトミセス・グリセウスΔＴ（：’（：’１０
１３７に対してポック形成能を付与する性質を有し、分
子量が約１０．４ ｋ ｂであり、且つ下記の制限酵素
に対して下記の感受性を示す、すなわち（７１） Ｂ
ａｍＨＩによる認識部位が１ケ所であり、（ｂ）
ＥｃｏＲＩによる認識部位が１ケ所であり、（ｃ）Ｓａ
ｉｌによる認識部位が５ケ所であり、（ｃＱ Ｂｇｌ
ｌ、Ｂｉｎｄｉｌｌ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ及びｘｂα
Ｉにより切断されない
である。 第１図 手続補正書（自発ン 昭和５８年６月１４日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１５５１５号 ２、発明の名称 プラスミドｐｏΔ１５ ３ 七〇正をする渚 事（′＋とυ）関係 持訂出願人 住 所 東京都中央区京橋−丁目１５番１号４人 埋
人〒１（Ｊ７ 別紙のとおり （１）本願特許請求の範囲の全文（明細書第１頁第５〜
１４行）を別紙のとおり訂正する。 （２） 明細書第１９頁下から第４行にｒ（１／１！
Ｍ’）Ｊとあるを、Ｆ（１／１ｓｓ）、１と訂正する。 以上 （別紙） 〔特許請求の範囲〕 「ストレプトミセス・グリセウスΔＴ（：’（：’１０
１３７に対してポック形成能を付与する性質を有し、分
子量が約１０．４ ｋ ｂであり、且つ下記の制限酵素
に対して下記の感受性を示す、すなわち（７１） Ｂ
ａｍＨＩによる認識部位が１ケ所であり、（ｂ）
ＥｃｏＲＩによる認識部位が１ケ所であり、（ｃ）Ｓａ
ｉｌによる認識部位が５ケ所であり、（ｃＱ Ｂｇｌ
ｌ、Ｂｉｎｄｉｌｌ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ及びｘｂα
Ｉにより切断されない
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ１０１３７に対
してポック形成能を付与する性質を有し、分子竜が約１
０．４ ｋ ｂであり、且つ下記の抽］限酵素に対して
下記の感受性を示す、すなわち（（Ｚ） ＢａｍＨＩ
による認識部位が１ケ所であり、（６） Ｅｃｏ
ＲＩ による認識部位が１ケ所であり、（Ｃ） ５
ａｌＩ による認識部位が５ケ所であり、（ｄ）
Ｂａ１Ｕ、Ｉｆ ｉ ｎ ｄ ＩＩＩ、ＫｐｎＩＸＰｓ
ｔＩ及びＸｂａＩにより切断されない ことを特徴とするプラスミドｐＯＡ１５゜
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58015515A JPS59143589A (ja) | 1983-02-03 | 1983-02-03 | プラスミドｐＯＡ１５ |
| US06/575,848 US4615980A (en) | 1983-02-03 | 1984-02-01 | Plasmid pOA15 |
| EP84101119A EP0115864A1 (en) | 1983-02-03 | 1984-02-03 | Plasmid pOA15 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58015515A JPS59143589A (ja) | 1983-02-03 | 1983-02-03 | プラスミドｐＯＡ１５ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59143589A true JPS59143589A (ja) | 1984-08-17 |
| JPH0322156B2 JPH0322156B2 (ja) | 1991-03-26 |
Family
ID=11890950
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58015515A Granted JPS59143589A (ja) | 1983-02-03 | 1983-02-03 | プラスミドｐＯＡ１５ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4615980A (ja) |
| EP (1) | EP0115864A1 (ja) |
| JP (1) | JPS59143589A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2093606T3 (es) | 1987-06-23 | 1997-01-01 | Univ Leland Stanford Junior | Gen del receptor de celulas t localizado en el locus alfa y estructuras artificiales de adn. |
| JP4258874B2 (ja) * | 1999-02-10 | 2009-04-30 | チッソ株式会社 | 放線菌由来の環状プラスミドｄｎａ |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1979001169A1 (en) * | 1978-06-01 | 1979-12-27 | D Hopwood | Streptomyces plasmids and their use as vectors for the incorporation of nucleic acid into cellular systems |
| JPS57206699A (en) * | 1981-06-10 | 1982-12-18 | Takeda Chem Ind Ltd | Plasmid patm 3 and its preparation |
-
1983
- 1983-02-03 JP JP58015515A patent/JPS59143589A/ja active Granted
-
1984
- 1984-02-01 US US06/575,848 patent/US4615980A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-02-03 EP EP84101119A patent/EP0115864A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4615980A (en) | 1986-10-07 |
| JPH0322156B2 (ja) | 1991-03-26 |
| EP0115864A1 (en) | 1984-08-15 |
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