JPH0198491A - アルファー遺伝子座中に位置するｔ細胞レセプター遺伝子およびｄｎａ構成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｔ細胞において特異的に発現される配列の同
定および推定上のレセプターの発現における前記配列の
使用に関する。

〔発明の背景〕

胸腺は、高等を推動物におけるＴリンパ球の中枢的な分
化組織である。Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）遺伝子
の発現および構成の調節は、数種の分化段階を経て′ｒ
細胞前駆細胞が発達する場合に、胸腺で惹起する数多く
の選択的および成熟現象と関連するにちがいない。すな
わち、種々のタイプのＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）
が同定されている。例えば、α：β異種二量体が機能的
なヘルパーおよびキラーＴ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　
Ｔ−ｃｅｌｌ）上に見い出されていて、そしてほんの最
近γ：δ異種二量体が記載された。両異種二量体は、モ
ノモルフ性ＣＤ３ポリペプチドとの会合において、Ｔ細
胞の別個の集団に属する細胞表面上で独立に発現される
。

前記α：βに関しては、多数の報告がなされている。α
：β異種二量体の各々のサブユニットをコードしている
配列が単離され、α；βＴＣＲの発現に使用された。さ
らに、ＴＣＲｓに関連する研究のかなり初期に発見され
たある配列が、α：βレセプターと相違する推定上のＴ
ＣＲのγサブユニットであると報告された。Ｔ：δレセ
プターは、α：βレセプターと多くの重要な点で相違す
ると考えられる。Ｔ：δレセプターは、ＭＨＣ（主要組
織適合抗原遺伝子複合体）制限性の細胞傷害作用を示す
とは思えない。−船釣に、Ｔ：δレセプターは、Ｔ細胞
の個体発生の間を通じてα：βレセプターの出現前に検
出される。γ：δレセプターとα：βレセプター間の本
質的な相違のために、結合タンパク源として、Ｔ細胞結
合性のアゴニストまたはアンタゴニストとして診断およ
び療法に、そしてさらにＴ細胞の因果関係学および機能
を包含する機構を理解する上での用途を見い出すことが
できるレセプターとして、Ｔ：δ異種二量体を産生出来
ることに実質的な興味が存在する。

〔関連文献〕

Ｔ：δ異種二量体は、Ｂｒｅｎｎｅｒ等により、Ｎａｔ
ｕｒｅ（１９８６）３２２　　：　１４５−１４９に；
Ｌｅ−等により５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３４　　
：、１４０１−１４０５に；　　Ｐａｒｄｏｌｌ等によ
り、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２６　　：　７９−８
１に；　　Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ等により、Ｎａｔｕｒｅ
（１９８７）３２６　　：　８２−８４に；　　Ｂｏｒ
ｓｔ等により、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２５　：　
６８３−６８８に；およびＭｏｉｎｇｅｏｎ等により、
Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２５　　：　７２３−７２
６に開示されている。γ遺伝子は、Ｓａ　ｉ　ｔｏ等に
より、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９　　：　７５７
−７６２に；５ｉＩ１１等により、Ｎａｔｕｒｅ（１９
８４）３１２　　：　７７１−７７５に開示されている
。

〔発明の概要〕

Ｔ：δ異種二量体のδサブユニットとして働くＴ細胞の
成熟初期に発現される表面タンパクを発現するための新
規なりＮＡ配列および構成物が提供される。同時に、該
構成物は、Ｔ：δＴ細胞レセプターまたはそれらの機能
的な断片の発現に適する宿主において、γおよびδサブ
ユニットを産生ずるために使用することができる。前記
ＤＮＡ配列は、またプローブとしても使用することがで
きる。

〔具体的な態様の説明〕

新規なりＮＡ配列、構成物、および発現系が、配列に関
連して、そしてＴ細胞成熟の初期段階に関連するペプチ
ドをコードするものとして提供される。該配列は、Ｊ、
Ｃ，をコードする領域の５′端に位置し、そして初期の
胸腺リンパ球において系統的な組換え（ｒｅａｒｒａｎ
ｇｍｅｎ　ｔ）を示し、なんらかの０６伝令またはタン
パクが検出される前には、ＴＣＰα類の■遺伝子セグメ
ントを用いる。この遺伝子座に由来するＲＮＡは、初期
の胸腺リンパ球および成人ＣＤ４−　、ＣＤ８−細胞に
おいて高水準で発現されるが、しかし成熟Ｔ細胞集団に
おいては異る。

該配列は、ｖｃｔ→ＪｔｘＭｉ換えが生じる場合にはリ
ーダーであることが明らかである。この遺伝子座での組
換えは、１４日令の胎児胸腺リンパ球より、少なくとも
早く生ずることが明らかである。

従って、ＴＣＲβおよびＴ遺伝子と同時にか、またはこ
とによるとほんの少し前に組換えが起こることが明らか
である（Ｈａａｒｓ等、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ（１９８６
）１６４　：　１−２４およびＢｏｒｎ等、５ｃｉｅｎ
ｃｅ（１９８６）２３４　：　４７９−４８２を参照〕
。組換えバンドは、１８日令および１９日令の胸腺リン
パ球上でより一層増加しかつ複雑になるが、なお成熟Ｔ
細胞では減少する。

前記遺伝子は、３つの部分、すなわちＶ、Ｊ、およびＣ
に分けることができ、ここで■領域は免疫グロブリンの
可変領域およびα：βＴＣＲのαサブユニットに相当し
、Ｊ　ｊＪ域は結合領域に相当し、そしてＣ領域は不変
領域に相当する。■領域は、実質的にＶ３領域と相同性
を有し、そして同様にＪ領域は、Ｊ３領域に相同性を有
する。

ゲノム配列は、１３のヌクレオチドにより分離される保
存されたヘプトマー（ＡＧＣＴＧＴＧ）およびノナマー
（ＧＧＴＴＴＴＴＧＧ）を含み、組換え（ｒｅａｒｒａ
ｎｇｅ）られていないＪ配列の５′端に位置している。

３′端境界には、保存されたＲＮＡスプライシング・シ
グナル配列（ＧＴＡＡＧＴ）が存在する。また、Ｄ　’
６Ｈ域は■領域およびＪ領域の間に存在し、ＶＤＪをコ
ードする領域を包含（ｅｘｃｏｍｐａｓｓ）するエキジ
ンを提供する。

Ｃ領域は、単コピー遺伝子として存在することが観察さ
れている。それは、Ｊ遺伝子セグメントの３′端の約１
３ｋｂおよびＣｃｔの５′端の約７０ｋｂのところに位
置付けられる。このコード配列は、アミノ酸配列が約３
０．７ｋＤの分子量を有するタンパクをコードするもの
と推定される。配列は、２箇所にＮ−結合性のグリコジ
ル化部位を有する。

Ｃ領域をコードする配列は、前述のＴＣＲまたはＩｇ配
列のいずれかと相同な短い領域を共有し、そしてアミノ
酸配列レベルにおいて、いずれかのＴ細胞レセプター配
列に対して９〜１８％間の相同性がある。このものはＴ
細胞レセプター遺伝子の特徴の多くを保存しており、お
そらく異種二量体の形成のため最初のドメインの後に余
分のシスティンを有し、そしてさらにトランスメンプラ
ン領域に保存されたりジン残基を含みこれらはいずれも
Ｔ細胞レセプター不変領域の全ての特徴を備える。リジ
ンは、ＣＤ３ポリペプチドとの相互作用にとって重要で
あるかも知れない。現在までに特徴づけられている全て
の３種のＣＤ３ペプチドは、保存アスパラギン酸または
グルタミン酸残基をそれらの見かけ上のトランスメンプ
ラン部分に有する。Ｃ領域は、比較的短い（１４−１５
個のアミノ酸）疎水性Ｃ−末端を有しく保存リジンから
数える）、そして保存された配列により間隔を保たれて
、Ｃ６のそれと実質的な相同性を有する。本発明の口約
の遺伝子は、ハイプリドーマを伴う成人ダル（ｄｕｌｌ
）　ＣＤ　１細胞中に見い出される。

一般に、興味ある構成物は、Ｃコード領域または非コー
ドフランキング領域の少なくとも８個の、一般的には少
なくとも１２個のヌクレオチドを含み、そして該Ｃ領域
またはそれらの断片は、Ｊ。

Ｄおよびｖ　９ｆＪ域に対して適切な向きに結合するこ
とができる。また、構成物は異種ＤＮＡ、例えば選択用
マーカー、安定な複製系、合成リンカ−もしくはポリリ
ンカー、転写開始領域または転写終止領域等を含んでな
ることができる。一般に、Ｃ領域を含んでいる断片は、
その断片を含むもとの配列の約１０ｋｂｐ以下、一般に
５　ｋｂｐ以下であり得る。

主題の核酸配列は、種々の方法に使用することができる
。該配列は、プローブとして使用することができ、特に
その配列の存在の測定のために種々のＴ細胞においてｍ
ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを同定するためにＣ配列また
はＪ配列を使用することができる。通常、プローブは少
なくとも約８塩基であり、より一般には少なくとも１２
塩基であり、そして５０塩基以上であってもよい。一般
的に、プローブは約１　ｋｂｐを越えず、さらに一般的
には相同性配列の約０．５　ｋｂ９を越えるものでない
。通常プローブは、標識され、好ましくは種々の常法、
例えば二ツクトランスレーションまたは放射性ヌクレオ
チドによるＴｄＴ伸張等を用いる放射性同位元素で標識
され得る。

主題のペプチドをコードするｍＲＮＡに由来するｃＤＮ
Ａｓは、主題のペプチドの発現に使用することができる
。該ｃＤＮＡは、そのもの単独かまたはγ配列の全部も
しくは一部を発現する遺伝子との組合わせについて好ま
しい発現ベクターに挿入してδ：　ｒＴＣＲを産生する
ことができる。

広範な種々の発現ベクターが、広範な種々の宿主での発
現に有用である。原核性および真核性宿主が発現のため
に有用である。使用できる宿主は、Ｅ、コリー（旦、（
ｏｌｉ）　、Ｂ、ズブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）
、Ｂ、リケニホルミス（Ｂ、Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｔ
ｓ）　、Ｓ、セレビシアエ（Ｓ、ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）
　、Ｋ、ラクチス（Ｋ。

１ａｃｔｉｓ）　、ＣＨＯ細胞、モンキー腎臓細胞、Ｃ
Ｏ８細胞等を包含する。

広範な種々のベクターが、発現のために有用であり、ま
た広範な種々の転写開始領域を使用することが有用であ
る。好ましくは、ベクターは、転写の方向に転写および
翻訳開始領域、その開始領域の調節下におくための遺伝
子の挿入部位、並びに翻訳および転写終止領域を含んで
なる発現カセットを包含する。さらには、一般にマーカ
ーが備えられ、このマーカーは、主題のペプチド発現の
ための発現カセットを含んでいる発現宿主の選択を可能
にし、発現カセットはそれ単独か、またはγ配列をコー
ドする遺伝子のための発現カセットとの組合わせのいず
れかとして存在する。

選択性を与えるマーカーは、栄養要求株に原栄養性を付
与するように負のバックグランドを補償する配列、抗生
物質耐性、例えばカナマイシン、クロラムフェニコール
、ペニシリン、Ｇ４１８、テトラサイクリン、ゲンタマ
イシン等に耐性を付与する遺伝子を包含することができ
る。実例となる文献は、米国特許筒４，６１５，９７４
．４，６１５，９８０．４．６２４，２９６および４，
６２６，５０５号を包含する。

遺伝子は、５′または３′末端のいずれかか、または両
方における非コーディング領域の全部または一部を除去
することにより、あるいは試験管内（旦■工則）変異ま
たはプライマー修復により、１以上のヌクレオチドを変
化させて制限部位を導入し、不所望の制限部位を除去し
、１または複数のコドンを変化せしめ、あるいは末端伸
張により、アダプターまたはリンカ−等への連結により
、その他種々の方法で操作することができる。従って、
配列は、前記の技術によるだけでなく、酵素処理、再切
断（ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ）　、または種々の機能性配列
への連結等により変性することができる。一般に、各々
の操作後、配列はクローン化され、そして所望の配列が
得られていることを確認するために分析される。分析は
、制限分析、配列決定、電気泳動、サザーン・ハイブリ
ダイゼーション等を包含する。

主題のポリペプチドを含んでいる発現ベクターは、それ
単独かまたはＴポリペプチドをコードする配列との組合
わせとして、そのベクターの種々の調節領域および複製
系が機能する種々の宿主細胞のいずれかに導入すること
ができる。形質転換は、具体的な複製系に依存して種々
の方法で遂行することができる。ある場合には、染色体
外に維持するよりはむしろ組込みを狙うために、複製系
が宿主中で機能的でなくてもよい。ベクターは、プラス
ミド、ウィルス、ファージ、染色体複製系、例えばａｒ
ｓとの組合わせにおける動源体等に基づくことができる
。哺乳類の発現系としては、ＳＶ４０、アデノウィルス
、またはウシ乳頭ウィルス等を用いることができ、例え
ばＣＯ８細胞においてはＳＶ４０を用いることができる
。形質転換細胞は、主題のペプチドの発現のために適当
な培地で増殖することができる。特殊な宿主によっては
、ペプチドは細胞質中に残存するか、または宿主の膜に
運搬され膜結合タンパクとなる可能性がある。

主題のペプチドをコードする配列は、１以上の領域また
は１以上の領域の部分を取り除くことにより変性するこ
とができる。従って、単独またはγタンパクの可変領域
との組合わせとして、ＶＤ領領域単離するか、または■
ＤＪｗ、域を単離することができる。このようにして、
可変領域は不変領域の全部または一部を欠失するものと
して得ることができる。可変領域にシグナルリーダー配
列除去操作をするか、もしくは不変領域にトランスメン
プラン配列除去操作をするか、または画処理をするかに
より、膜への運搬を防ぎ、ペプチドを細胞質に貯蔵する
ことができる。他方、不変領域を異種タンパクと結合し
、細胞質膜に異種タンパクを運搬するための輸送機構と
して役立てることができる。種々の断片の結合は、文献
に広範囲にわたって記載されており、リンカ−またはア
ダプターを用いる変法でも遂行することができる。例え
ば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等の、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ
ｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ、　ＮＹ＋　１９８２　；および米国特許筒４，６
１７，３８４号を参照されたし。

前記ペプチドは、さまざまな方法に使用することができ
る。レセプターは、相補的リガンドへの結合のために使
用することができる。この結合は、診断アッセイ、また
はアフィニティー・クロマトグラフィー等における用途
を見い出すことができる。レセプターは、試験管内（ｉ
ｎ　ｖｉｔ四）、生体内（側血）のＴ細胞と競合させ、
相補的なリガンドへのそれらの結合を防ぐことができる
。目的のペプチドは、Ｔ細胞を形質転換するために用い
て、前もって決められたリガンドに結合するＴ細胞の能
力を上昇することができる。目的のペプチドは、モノク
ロナールまたはポリクロナール抗体産生に用いることが
でき、そしてこれらの抗体はさらに、イデオトーフ゛ま
たはパラトープと目的のペプチドとを共有するＴ細胞の
特異なサブセットを単離するかまたは取り除くために使
用することができる。さらに、抗体は、前記のようなＴ
細胞サブセント等の活性を阻害するＦＡＣ３または他の
方法を用いて、患者の血液におけるＴ細胞の前記のよう
なサブセットの存在を測定するために使用することがで
きる。抗体は、常法により生理学的に許容されうる媒体
、例えばＰＢＳ中に、一般に約０．１６５■（タンパク
／−）以上を含むように導入することができる。

主題のペプチドおよび核酸配列は、いずれかの好ましい
哺乳類源、例えば４歯動物、馬、牛、ウサギ、羊、豚、
または霊長動物等から誘導することができる。

次の実施例は、例証のために提供するものであって、限
定のためのものでない。

〔実施例〕

成人ダルＣＤＩ　、ＣＤ４−　、ＣＤ８−細胞およびハ
イブリドーマにおいて系統的な組換え（ｒｅａｒｒａｎ
ｇｅｍｅｎ　ｔ）を示すＣ３の５′端から約９０ｋｂに
位置する領域を同定した。Ｊ、Ｃ＆遺伝子座が少なくと
も６５ｋｂにわたる（Ｗｅｎｏｔ等、Ｎａ　ｔｕｒｅ（
１９８５）３１６　　：　８３２−８３６；　ｆｌａｙ
ａｄａｙ等、同誌（１９８５）３１６　　：　８２Ｂ−
８３２）ため、これらの組換えはまず最初にパルス・フ
ィールド・ゲル電気泳動（ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＣａ
ｎｔｏｒ　、　Ｃａ旦（１９８４）３７　：　６７−７
５；Ｃａｒｌｅおよび０１ｓｏｎ、Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄ
ｓ　　Ｒｅｓ、（１９８４）　　１２：　　５６４７−
５６６４）を用いて検出した。さらに詳細に組換えを分
析するために、Ｃ３の５′端の６０ｋｂに位置するＡと
称する断片を用いて、さらに５′端に伸びるコスミドク
ローンを単離した。

断片Ａは、ヘルパー・ハイブリドーマ２Ｂ４に由来する
機能性ＴＣＲ＆鎖の３部に対して特異的なオリゴヌクレ
オチドプローブである。これを使用して、ＢＩＱ、＾肝
臓ゲノム・ライブラリー（Ｃｈｉｅｎ等、Ｎａｔｕｒｅ
（１９８４）３０９　　：　３２２−３２６）に由来す
るＪ、２Ｂ４のゲノム・コーディング領域（Ｂｅｒｋｅ
ｒ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１７　　：　４３０
−４３４）を含んでいるファージ・クローン（λ１２）
を単離した。

Ｊ、２Ｂ４の位置は、Ｃ３に対して５′端の約６５ｋｂ
にマツピングされている。次に、λ１２由来のＥｃｏＲ
１断片（断片Ａ）を使用して、ＢＡＬＢ／ｃ−エンブリ
オニックＤＮＡで調製したコスミド・ライブラリー（Ｃ
ｏｒｙ等、ＥＭＢＯＪ、　（１９８５）４　：　６７５
−６８１）をスクリーニングした。ｃｏｓ　２およびｃ
ｏｓ　３と称する陽性のクローンを単乱し、そして単一
および複数の制限酵素消化によりマツピングした。

ｃｏｓ　３に由来する５′最末端の２．８５ｋｂ　Ｅｃ
ｏＲＩ断片を用いて、ｃｏｓ　２１及びｃｏｓ　２２と
称するクローンを単離した。さらに分析のために使用し
たＤＮＡ断片は、４．１ｋｂのＥｃｏＲＩから］■まで
のサブクローン（ｐＧ４．１）であった。ＪｘおよびＣ
ｘの位置は、制限酵素マツピング、サザーン分析および
ＤＮＡ配列決定により決定した。

サザーン分析は、次のように遂行した。成人肝臓（ＬＶ
）、１４日令の胎児肝臓（ＦＬ）、胸腺リンパ球全体（
ＴＨＹ）　、１４日令の胎児胸腺リンパ球（Ｄ　１４）
および１５日令の胎児胸腺リンパ球（Ｄ　１５）に由来
するゲノムＤＮＡを」並ＲＩ８趨で消化し、０．８％ア
ガロースゲル上で電気泳動し、ナイロン膜（遺伝子スク
リーニング用、ＮＥＮＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ）上にプロットし、そしてヘキサマーにより感作し
て放射能標識（ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔ
ｅｒｎ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｉ、　（１９８３）
１３２　：　Ｇ　〜Ｌ３）をした１）　Ｇ　４．１でプ
ローブした。このプロトを、ＩＭのＮａｃｌ　、　５０
ｍＭの硫酸ナトリウム、５０％のホルムアミド、１００
　ｎ　／　ｍｌのサケ精液ＤＮＡ。

４ｘデンハ）　（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）および１０％の
デキストラン硫酸中にて、４０℃でハイブリダイズし、
そして２　ｘＳＳＰＥおよび０．２　ｘＳＳＰＥ　（２
０ｘＳＳＰＥは、３．６ＭのＮａｃｌ　、０．２　Ｍの
リン酸ナトリウム、ｐＨ７，４および０．０２ＭのＥＤ
Ｔ＾である）中にて、５５℃で洗浄した。それぞれＥｃ
ｏＲＩ消化したＣ５７ＢＬ／６株とＢＡＬＢ／ｃ株との
間のハイブリダイゼーションのパターン中には、いかな
る相違も見い出せなかった。

Ｍｉ換え（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎ　ｔ）過程の動態
を理解するために、研究において分析をさまざまな日令
の胎児胸腺リンパ球ＤＮＡに拡大した。得られたデータ
は、Ｃ２遺伝子座の５′端の組換えが少なくとも１４日
令の胎児胸腺リンパ球より初期に生ずることを示す。従
って、同時かまたは、たぶんＴＣＲβおよびγ遺伝子の
ほんのすこし前に組換えが生じている（Ｂｏｒｎ等、Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳ八（１９８５）　　旦２　　：　　２９２５−２９
２９）。

たとえ、１８日令および１９日令胸腺リンパ球ＤＮＡに
おいて、組換えバンドが一層増大しかつ複雑になるとし
ても、それらはより成熟したＴ細胞では減少する。１）
　Ｇ　４．　ｌは、ｄｃＤ１細胞におけるように、総胸
腺リンパ球ＤＮＡのパターンとの類似性を示す。しかし
ながら、これらのハイブリダイズするバンドは、コーチ
シン処理した胸腺リンパ球においてはその強度が低下し
〔成人細胞については選択的に高まる（Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎおよびＢｌｏｍｇｒｅｎ、　Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、（１９２０）ｌ　：　３６２−３７１　）　）、そ
して等量のＤＮＡが使用された場合に、肺臓性のＴ細胞
調製物においてかろうじて測定可能になる。この観察結
果は、９個の機能性Ｔ細胞およびハイプリドーマの中か
ら、唯１個のヘルパー・ハイブリドーマ（２Ｂ４）が１
の染色体上に単一の組換えを維持するが、一方、他の８
個は明らかにこの領域を欠いているとの事実と一致する
。

これらの組換えの性質を決定するために、２Ｂ４ゲノム
・ライブラリー（Ｃｈｉｎ等、前述）に由来する組換え
られた断片（２Ｂ４．　Ｅｘｐ）を含有するλ−ファー
ジを単離し、そしてｐ　Ｇ　４．１と比較した。適切な
サブクローンの制限酵素地図および配列を得た。このデ
ータは、ｐＧ　４．１中にＪ６様の構成部分（Ｊｘ）が
存在し、そして２Ｂ４において観察される組換えはＪｘ
およびＪｘの５′端のＤ構成部分が関与するＶＤＪ結合
現象の結果であることを証明している。この特異な■領
域の配列分析は、■、遺伝子において高度に保存される
全てのアミノ酸をそれが含み、そしてＡｒｄｅｎ等のＶ
ｏｔ　　ＴＭ０１　　（Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１
６　　　：　　７８３−７８７）と　ＤＮＡレベルで８
３％の相同性を示し、そしてアミノ酸の相同性はやや少
なく　（７０％）、同じ遺伝子ファミリーに属すること
を示す。Ｊｘ構成部分は、公表されているＪＥＩ域の多
くの保存された配列を有し、特にサイズが類似したＪ３
遺伝子セグメントそして既存Ｊｃｔ′Ｓの半分以上に共
通するＣ−末端プロリン残基を有する。１３個のヌクレ
オチドにより分離されている保存されたヘプタマー（八
ＧＣＴＧＴＧ）およびノナマー配列（ＧＧＴＴＴＴＴＧ
Ｇ）は、組換えられていないＪｘ配列（ＧＴＡＡＧＴ）
の５′端に位置付けられる。特異なＶＤＪ組換えは、Ｖ
領域の構成部分の保存された配列とＪ領域のそれらとの
間にフレームシフトをもたらし、免疫グロブリンおよび
Ｔ細胞レセプターに共通に生ずる組換えをもたらし、そ
して２Ｂ４ハイブリドーマが機能性α：β異種二量体を
産生ずる事実と一致する。

このＶＤＪｘ配列を含有する転写物が検出できるか否か
を決定するために、サブクローン２Ｂ４．Ｅｘｐをノザ
ン分析のためのプローブとして使用した。

Ｊｘ構成部分が単独でハイブリダイズできるような条件
下では、２Ｂ４ＲＮＡにおけるＣ４の約１／２０の水準
であるが、新たに産生じた胸腺リンパ球および成人二重
陰性（ｄｏｕｂｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）細胞ＲＮＡに
おいてはより高い水準でそれが発現されることがわかる
。次に、２Ｂ４ｃＤＮＡライブラリー（本来のクローン
の大きさは、〜２００　、０００である）をスクリーニ
ングし、そして新規なＣｇ域（Ｃｘ）にスプライシング
される前述のＶＤＪｘエキソンを含有する単一クローン
を単離した。Ｃｘコーディング領域は、ゲノム中に単一
コピー遺伝子として存在する。これは、Ｊｘ遺伝子セグ
メント３′端の１３キｏ　ヘ−ス（ｋｂ）およびＣ，の
５’端の７０ｋｂに位置している。ゲノムの構成は、配
列分析により図示した。このｃＤＮＡクローン（ｐλ１
２）ノ制限酵素地図およびその配列を以下に示す。

明細書の浄書（内容（ ，、、、、ＧｌｕＬｙｓ　　、　　Ｈｅ　　。

ＴＭ０１　　　　　　　　、、、　、、Ｔ　、、、　、
、、　、、、　ａ、、　、Ａ、、、、　、Ｔ、　、、、
　。

＋１ 、、、、、、、、Ｇ１ｎＶａｌ ＴＡ２７　　　　　　　．０．、、、　、、、　、、、
　、、、　、、、　、、、　、、、　ｃ、ｃｃｒ、　。

△ ＬａＩＡｓｐ　Ｃ！ｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔ
ｈｒ　Ｓａｒ　Ｃｕ　Ｔｙｒ　１２Ｂ４　・Ｅｘ　ＰＣ
ＩＧ　ＧＡＣＩＧｒ　ＴＣＡ　ＴＡＴ　ＧＡＧ　ＡＣＡ
　ＫＴ　ＧＡＡ　ＴＡＣ７Ｐ入１２　　　　　　　。

一−−−−Ａｒｇ、−計　、　　５ａｒＴＡ２７　　　
　　　　　０．、　、、、　、、、　、、、　、、、　
ａａ　、、、　Ａ、Ｇ　、、、　、Ｃ，ｒＭａｔ　Ｖａ
ｌ　ＰｈｅＩｘｕ　ｕｓ　Ｔ５ｒｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　
Ｓｅｒ　Ｐｈｅ）２Ｂ４・Ｅｘｐ　　　　　　悲ごロー
（Ｔｒ　ＡＴｒ　１χ店田■口：（こ変更なし） 、　　ＴｒｐＳｅｒ、　　、　　、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、　
　、　　、’Ｌｅｕ。

１０．πλＴ、、、、、、、Ａ　、、、、、Ｇ　、、、
ＧＡ、、、Ｃ、、、、、、Ｃ，、、、。

冗 ７ａＩＧｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ
　Ｔｈｒ！　ＣＡＧ　（ｒＡＡＣＡ（χ℃〃℃にπａＣ
π刀αＡ　ＧＡＡＧＡＡＧ’ｆＣＫｊ：。

、、Ａ　、、、　　、Ａ、　Ｃ，、、、Ｃ、、、、、、
、、、、、Ｃ、、、Ｃ，、、、、、、、、、。

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ｇ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ
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ＡＣｍ　ＣＡＧ　Ｃ１丁ＴＴｒ、［αａｃ、ｙ工Ｔ９０
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　ＡＯ：　ＣＡＡ　Ｇ１℃ｌＱｌ’１ ｍ 全てのＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−３（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂ
ｉｏｔｅｃ製）にサブクローンし、二重鎖プラスミドＤ
ＮＡ上でＴ７およびＳｐ６プロモーター特異性プライマ
ーを用いチエインターミネータ−法により配列を決定し
た（ＣｈｅｎおよびＳｅｅｂｕｒｇ、　ＤＮＡ（１９８
５）４　：　１６５−１７０）。記載される全ての配列
決定は、双方の鎖について行われた。配列決定を容易に
するため、欠失サブクローンをＥｘｏｌ　Ｉ　Ｉおよび
Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎヌクレアーゼ処理（Ｈｅｎ　１ｋｏ
ｆ　ｆ　、　Ｇｅｎｅ　（１９８４）　２８　：　３５
１−３５９）で発生せしめた。ｐλ１２ＣＤＮＡクロー
ンの可変領域（Ｖ）　、Ｊ、不変領域（Ｃ）および３′
端の非翻訳領域（３’ｕｔ）の位置を示した。ｐＧ　４
．１および２Ｂ４゜Ｅｘｐの陰になっている領域は、Ｄ
ＮＡ配列決定で同一の配列を示すことが判明した。

ｐλ１２のちょうど５′端および３′端におけるＥｃｏ
Ｒ１部位は、クローニングに用いたＥｃｏＲ１リンカ−
に由来する部位である。アミノ酸配列におけるＮ−結合
グリコシル化が可能な部位は、“ＣＨＯ”により示した
。保存ヘプタマーおよびノナマー配列およびＲＮＡスプ
ライス配列は下線を付した。システィン残基は三角印を
示した。

ＴＡ２７Ｖ　ｏｒ配列（Ａｒｄｅｎ等、前述）は、２Ｂ
４．ＥｘｐＶ領域に非常に似ていて、核酸およびアミノ
酸の相同性はダッシュ（−）で示した。２Ｂ４．Ｅｘｐ
、ｐλ工２の予測されるアミノ酸配列は、Ｎ−末端にお
ける推定されるプロセッシングポイント（Ｂｅｒｋｅ　
−、前述；Ａｒｄｅｎ等、前述）から出発して番号をつ
けた。

理論上、フレーム・メツセージ内では、このタンパクの
推定される分子量は、約３０．７ｋＤであろう。

Ｃ領域をコードする配列は、前述したＴＣＲまたはＩｇ
配列の各々と相同の短い領域を担い、そしていずれかｌ
のＴ細胞レセプター配列に対してアミノ酸配列レベルで
９〜１８％間の相同性を有する。それは、Ｔ細胞レセプ
ター遺伝子の特徴の多くを維持しており、おそらく異種
二量体形成のため第一ドメインの後に余分のシスティン
を有し、そしてさらにトランスメンプラン領域中に保持
された残基を含有し、他のＴ細胞レセプター不変部のす
べての特徴を含有している。この位置におけるリジンは
、ＣＤ３ポリペプチドとの相互作用にとって重要であり
うることが示唆されていた（Ｃｈ　ｉ　ｅｎ等、Ｎａｔ
ｕｒｅ（１９８４）３１２　　：　３ｌ−３５）。この
相互作用は、今日までに特徴付けられているＣＤ３ペプ
チドの３種すべてが、それらの見かけ上のトランスメン
プラン領域に保存されたアスパラギン酸またはグルタミ
ン酸残基を有するごとく仮定されていた。

新規なＴ細胞レセプターの不変領域配列は、免疫グロブ
リンおよび他のＴ細胞レセプターに対してほんの弱い相
同性（９−１８％）があるだけである。この弱い相同性
は、前述のＣヶ配列に共有され、免疫グロブリンにより
密接に関係（最初のドメイン中４０％まで相同）する０
丁およびＣβ不変部と対照的である。従って、Ｃｘまた
はＣｃＭのいずれも全く免疫グロブリン様折りたたみ（
ｆｏｌｄ）を形成せず、そして何んらかの他の構造（１
または複数）がＴ細胞レセプター分子の部分として必要
とされる可能性が存在する。

ＣｘとＣ，間の興味をそそる類似点は、両者とも比較的
短い（１４−１５のアミノ酸）疎水性Ｃ−末端（保存さ
れたリジンから数える）を有することであり、これに対
し、Ｃ７およびＣｈの対応する領域はより長く　（それ
ぞれ、２３および２５のアミノ酸）、そして各々がその
分子の末端の近傍（ＫＫＸＮＳ’のＣβ末端および“Ｎ
ＥにＫＳ”のＣｒ末端）に３個の荷電残基を有する。ポ
リペプチド配列関係におけるこれらの相違は、異種二量
体形成およびＣＤ３ポリペプチドとの相互作用にとって
重要である可能性がある。Ｃｘ配列の他の特徴は、Ｃｘ
保存配列がＣ，のそれらと、Ｘ保存配列が一定の間隔を
保たれていて類似し、そしてＣアおよびＣ，９の構成物
とはほとんど共通点をもたないことである。４つのＴ細
胞レセプターの不変領域は、保存されたシスティン（Ｃ
）、リジン（Ｋ）およびトリプトファン（Ｗ）残基によ
り整列され得る。

はとんどの場合に、これらの残基間の間隔は、ＣｘとＣ
＆との間に非常に近似していて、そしてそれらはγとβ
との間にも非常に近似している。

この観察についてのただ１つの例外は、Ｃ＆の第２番口
と第３番目のシスティン間の距離が異常に短いことであ
る。また、興味深いのは、γおよびβとも、殆んどの免
疫グロブリンの不変領域の特徴である、第１番口のシス
ティン残基の前に１４番目のアミノ酸としてトリプトフ
ァンを有するが、一方ＣｘまたはＣヶのいずれもその位
置またはその近くにトリプトファンをもたないことであ
る。

αおよびβは相互に一対になることが知られているから
、ＣｘおよびＣアは等価な対であるようである。推論と
しては、αはＴと一対になり、または“Ｘ″鎖はβと一
対になり得る可能性がある。

この後者の可能性が真実であるならば、それは、これら
の２つの遺伝子座が機能するであろう見かけの相互排除
則を説明することを助けるであろう。

Ｘ鎖の発現のレベルおよび分布を評価するために、′ノ
ーザン（Ｎｏｒ　ｔｈｅｒｎ）　　″プロットを未成熟
のおよび成熟した胸腺リンパ球集団に由来するＲＮＡ’
ｓで調製し、そしてＣｘ　、ＣＴおよびＣ６のｃＤＮＡ
プローブによりプローブした。

ＣｘとＣＴを共に含有する配列は、新たに生まれた胸腺
リンパ球ではいくらか発現が減少するが、成人の二重陰
性細胞ＲＮＡおよび１５日令の胎児胸腺リンパ球培養物
（ＩＬ−４およびテトラデカノイルホルボールアセテー
トで培養した）において高レベルで発現され、そして長
くオートラジオグラムにさらした後の未分画成人胸腺Ｒ
ＮＡにおいては、はんのわずかたけ検出できるにすぎな
い。

総胸腺における発現のレベルは、成人二重陰性細胞にお
ける発現のほんの１／１０にすぎないことが推測される
。対照的に、Ｃ，、ｍＲＮＡは、培養胎児胸腺リンパ球
においては明瞭でなく、二重陰性細胞ＲＮＡにおいては
ほんのわずか検出でき、そして成人胸腺リンパ球ＲＮＡ
においては明瞭に存在する。このデータは、二重陰性細
胞調製物がＣＤＩマーカーによって選択されないとの公
表されている結果と調和する。

細胞集団中には、Ｃｘ特異性ＲＮＡの２つの主な大きさ
、２．０ｋｂおよび１．５５ｋｂ　（マーカーとしては
、リポソーム２８３および１８Ｓを５．１ｋｂおよび２
．０ｋｂとして用いて測定した）に属するものが存在す
る。■領域をプローブとして用いるハイブリダイゼーシ
ョンは、２．０ｋｂのバンドのみが検出される。Ｄ構成
部分は、ある胎児胸腺リンパ球および成人二重陰性細胞
バイプリドーマで観察されるＪｘおよびＤＪｘ組換え構
成部分の５′端に位置することが確認された。ＤＪ組換
え領域を含有する１つの染色体だけを有する二重陰性ハ
イブリドーマにおいては、単に１．５５ｋｂＲＮＡだけ
が存在する。このことは、少なくともいくらかの１．５
５ｋｂ種がＤＪ転写体であることを支持する。これは、
ＩｇのＨ鎖遺伝子ＣμおよびＴＣＲのβ鎖遺伝子として
観察されているものに類似し、そしてここでは、ＶＤＪ
およびＤＪの双方が関与する組換え領域に対応するメン
センジャーＲＮＡは、別個の大きさの部類のものとして
転写される。

２Ｂ４細胞における転写物の大きさは１．８５ｋｂであ
るとの１つの測定結果がある。この結果は、再現性があ
りそして単離したｃＤＮＡクローンの大きさと一致する
。２Ｂ４転写物はＢＩＯ，Ａ株の染色体に由来しく融合
パートナ−ＢＷ　５１４７は両方の染色体からこの領域
が欠失している）、そしてここで解析される細胞集団は
、ＢＡＬＢ八かまたはＢＡＬＢ／ｃｘ１２９Ｆ、　’　
ｓ　　［ＢＡＬＢ／ｃｘ１２９ｆ’、の胸腺を抗−ＣＤ
４およびＧ　Ｋ　１．５モノクロ一ナル抗体（叶、八。

Ｚｌｏｔｎｉｋより分譲可能）で処理して３週間経過し
たものから得た〕のいずれかに由来するものであるため
、これは株の多形現象に基づくということが１つの説明
である。他の説明は、異るスプライシングである。　　
　。

開示される特異な遺伝子は、機能的な組換えを示さない
が、しかし遺伝子の構造上の構成部分は、高度に保存さ
れたＴ細胞レセプターおよび免疫グロブリン配列と相同
である。２Ｂ４ｃＤＮＡクローンの０部の配列は、ゲノ
ムの配列分析により同定された。Ｃｘは、単一コピー遺
伝子であり、そしてイントロンーエキソンの構成はＩｇ
およびＴＣＰ不変領域のそれに非常に似ているから、こ
れは偽−遺伝子（ｐｓｕｅｄｏ−ｇｅｎｅ）ではないら
しい。さらに、機能性ヘルパーまたは細胞障害性のＴ細
胞株由来のＴ鎖ｃＤＮＡクローンの殆んどすべては、Ｊ
鎖のフレーム外連結現象の転写物を示し、そして他の細
胞型においては、いまだ機能性メソセージおよびタンパ
クが検出され得る。単離されるｃＤＮＡは、Ｔヘルパー
・ハイブリドーマ２Ｂ４に由来し、そしてこのものは機
能性α：β異種二量体を担持するから、非機能性メツセ
ージは、これらの細胞においてなされるが、一方、Ｃｘ
配列を担持するタンパクは、他のＴ細胞系で同定される
であろうとの推定が合理的である。

前記の配列の機能的変形体は、２つのＮ−結合グリコシ
ル部位を有する３０．７ｋＤのポリペプチドをコードす
るであろう。完全なグリコジル化体は、約３７ｋＤであ
る。従って、グリコジル化体として４５ｋＤそしてエン
ド（Ｅｎｄｏ）　Ｆ処理した後に３７ｋＤになると、報
告されているマウスδ鎖タンパク（Ｐａｒｄｏｌｌｙ、
前述）よりも相当に小さい。最近、ヒ）ＣＴｌ伝子は、
見かけ上の分子量にかなりの変化を引き起こす１ないし
３個のヒンジ様エキソンを包含して種々にスプライスさ
れ得ることが観察された（Ｌｉｔｔｍａｎ等、Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９８７）３２６　　：　８５−８８）。

２Ｂ４メソセージは、Ｃｘ配列を含有している２つの主
要な種のより大きなものより約１５０ヌクレオチド短い
。それゆえに、類似の現象をここに開示される遺伝子で
起こすことが可能であり、そして胸腺リンパ球中に見い
出される主な高分子量の種が、２Ｂ４ｃＤＮＡに比較し
てそれ以上のエキソンまたはエキソン類を有することが
可能と解される。

追加の１５０ヌクレオチドのコーディング領域配列は、
３６．２ｋＤＯ未グモ スδ鎖について観察されたものとほぼ同一である。

前記の結果から、新規な核酸配列は、分化の特殊な段階
における未熟なＴ細胞を同定するために使用することが
できることが明らかである。さらに、これらの配列をＤ
ＮＡ構成物として用いて、主題のペプチドを単独で、ま
たは他のＴ細胞特異性ペプチドと、殊にＴ細胞レセプタ
ーを包含する他のペプチドと、なかんずくβおよびＴペ
プチドとの組み合せでの発現についてプローブすること
ができる。主題のペプチド単独または他のペプチドとの
組み合せ物は、リガンドの結合物として、種々の環境下
、例えば診断上の免疫アッセイ、またはアフィニティー
・クロマトグラフィー等に使用することができる。さら
に、主題のペプチドは、前記のような具体的なＴ細胞を
活性化するかまたは除去するような交差反応性ペプチド
を担う２つのＴ細胞に結合するモノクローナルまたはポ
リクローナル抗体の産生に使用することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、転写および翻訳開始領域、該開始領域の開始制御の
   もとでペプチドをコードする遺伝子またはその断片、並
   びに転写および翻訳終止領域を含んでなる発現カセット
   を含有するＤＮＡ構成物であって、前記発現カセットは
   前記遺伝子の野生型配列の約５ｋｂｐ未満を含んでなり
   、前記遺伝子は、（ａ）ジャームライン（ｇｅｒｍｌｉ
   ｎｅ）ＤＮＡから組換え（ｒｅａｒｒａｎｇｅ）られて
   いるか、またはプロセスされ組換え（ｒｅａｒｒａｎｇ
   ｅ）られたジャームラインＤＮＡに対応するｃＤＮＡで
   あり； （ｂ）Ｔ細胞レセプターのアルファーサブユニット領域
   に相当するＶ、Ｄ、Ｊ、およびＣ領域を含んでなり、 （ｃ）Ｔ細胞レセプターのアルファーサブユニットの遺
   伝子座以外の遺伝子座におけるものであり；そして （ｄ）前記遺伝子を含んでなる脊椎動物宿主の発生の初
   期に発現される特徴を有し、かつ、 前記断片が、Ｃ領域の少なくとも８個のアミノ酸および
   前記ペプチドと免疫学的に交差反応性であるオリゴペプ
   チドをコードしており、そして選択のためのマーカー、
   細胞性宿主中で安定な複製系、または合成リンカーもし
   くはポリリンカーの少なくとも１つを含んでなる異種性
   ＤＮＡと結合している、前記ＤＮＡ構成物。 ２、前記転写および翻訳開始領域が、哺乳類細胞におい
   て機能する領域である請求項１記載のＤＮＡ構成物。 ３、前記遺伝子が、ｃＤＮＡである請求項１記載のＤＮ
   Ａ構成物。 ４、前記発現カセットが、マーカーを結合している請求
   項１記載のＤＮＡ構成物を含んでなる形質転換細胞。 ５、前記細胞が哺乳類細胞である請求項４記載の形質転
   換細胞。 ６、Ｃ領域遺伝子の少なくとも１２個のヌクレオチドの
   オープンリーディングフレームを含んでなる５ｋｂｐ未
   満のＤＮＡ配列であって、前記遺伝子の配列が、 （ａ）ジャームラインＤＮＡから組換え（ｒｅａｒｒａ
   ｎｇｅ）られているか、またはプロセスされ組換え （ｒｅａｒｒａｎｇｅ）られたジャームラインＤＮＡに
   対応するｃＤＮＡであり、 （ｂ）Ｔ細胞レセプターのアルファーサブユニット領域
   に相当するＶ、Ｄ、Ｊ、およびＣ領域を含んでなり、 （ｃ）Ｔ細胞レセプターのアルファーサブユニットの遺
   伝子座以外の遺伝子座におけるものであり、そして （ｄ）前記遺伝子を含んでなる脊椎動物宿主の発生の初
   期に発現される特徴を有し、かつ、 前記断片が、前記ペプチドと免疫学的に交差反応性であ
   るオリゴヌクレオチドを少なくともコードする前記ＤＮ
   Ａ配列。 ７、（ａ）Ｔ細胞レセプターのアルファーサブユニット
   領域に相当するＶ、Ｄ、Ｊ、およびＣ領域を含んでなり
   、 （ｂ）Ｔ細胞レセプターのアルファーサブユニット遺伝
   子座以外の遺伝子座におけるものであり、そして （ｃ）遺伝子を含んでなるを椎動物宿主の発生の初期に
   発現される、特徴を有する遺伝子を含んでなるｃＤＮＡ
   配列。 ８、（ａ）ジャームラインＤＮＡから組換え（ｒｅａｒ
   ｒａｎｇｅ）られているか、またはプロセスされ組合さ
   れたジャームラインＤＮＡに対応するｃＤＮＡであり、 （ｂ）Ｔ細胞レセプターのアルファーサブユニット領域
   に相当するＶ、Ｄ、Ｊ、およびＣ領域を含んでなり、 （ｃ）Ｔ細胞レセプターのアルファーサブユニット遺伝
   子座以外の遺伝子座におけるものであり、そして （ｄ）前記遺伝子を含んでなる脊椎動物宿主の発生の初
   期に発現され、かつ、前記断片が、前記ペプチドと免疫
   学的に交差反応性であるオリゴペプチドを少なくともコ
   ードしており、そしてその５′末端において異種性の転
   写および翻訳開始領域と遺伝子が結合しており、そして
   その３′末端において翻訳および転写終止領域と結合し
   ている、ことを特徴とする遺伝子を含んでなる発現カセ
   ット。 ９、遺伝子またはそれらの断片により発現されるペプチ
   ドの製造方法であって、前記遺伝子が、（ａ）ジャーム
   ラインＤＮＡから組換え（ｒｅａｒｒａｎｇｅ）られて
   いるか、またはプロセスされ組合されたジャームライン
   ＤＮＡに対応するｃＤＮＡであり、（ｂ）Ｔ細胞レセプ
   ターのアルファーサブユニット領域に相当するＶ、Ｄ、
   Ｊ、およびＣ領域を含んでなり、 （ｃ）Ｔ細胞レセプターのアルファーサブユニット遺伝
   子座以外の遺伝子座におけるものであり、そして （ｄ）前記遺伝子を含んでなる脊椎動物宿主の発生の初
   期に発現され、かつ 前記断片が、前記ペプチドと免疫学的に交差反応性であ
   るオリゴペプチドを少なくともコードしていることを特
   徴とするものであり、そしてその５′末端において該遺
   伝子と異種性の転写および翻訳開始領域が結合し、そし
   てその３′末端において該遺伝子と翻訳および転写終止
   領域が結合している前記遺伝子を含んでなる発現カセッ
   トで、形質転換されている細胞を増殖せしめることより
   なる前記製造方法。