JPH0381296A - Ｉｃａｍ―１に関係するが、それと区別される可溶性分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、可溶性の形態の細胞間付着分子（ＳＩＣＡＭ
−１）ならびにｓＩＣＡＭ−１をエンコードするＤＮＡ
配列に関する。ｓＩＣＡＭ−１およびＩ　ＣＡＭ−１は
、実質的な類似性を有し、細胞外ドメインの最初の４４
２ＮＨ，末端アミノ酸を共有する。しかしながら、ｓｌ
ｃＡＭｌはＩＣＡＭ−１とＣ末端において異なり、そし
てこれらの変化はｓｌｃＡＭ−１に可溶性を付与する。

ＩＣＡ、Ｍ−１は、内皮細胞を包含する、多くの細胞の
タイプをリンパ球に付着して、リンパ球機能に関連する
抗原−１（ＬＦＡ−１）を発現する。

ＩＣＡＭ−１はＬＦＡ−１に直接結合するという性質を
有する。また、Ｉ　ＣＡＭ−１を介さないＬＦＡ−１仲
介性着の証拠が存在する。さらに、ＩＣＡＭ−１はＬＦ
Ａ−１＃よびヒトリノウイルスの両者に結合するという
能力を有する。それはリノウイルスおよびコクザッキー
Ａウィルスの感染を抑制する性質を有する。それはＩ　
ＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１を包含するＩＣＡＭ−１の結合
により仲介される細胞の付着と拮抗させるために使用す
ることができ、こうして炎症、移植片の拒絶、ＬＦＡ−
１発現腫瘍、および細胞の付着を包含する他のプロセス
の処置において有用である。ＩＣＡＭ−１およびｓＩＣ
ＡＭ−１の細胞外ドメインの実質的な類似性に基づいて
、ｓ　Ｉ　ＣＡＭ　−ｌハＩＣＡＭ−１について同定さ
れる性質を有する。

主要なヒトリノウイルス受容体（ＨＲＲ）は、１９８８
午１０月２５日に提出された同時係属米国特許出願（Ｓ
ｕｒｅ、）第２６２５７０号および同第２６２４２８号
に記載されているように、トランスフェクションし、同
定し、精製し、そして再構成することができる。この受
容体は、前述の細胞表面タンパク質、ＩＣＡＭ−１に同
一であることが示された。欧州特許出願第０，２８９゜
９４９号は、内皮細胞を包含する多くの細胞のタイプの
ＬＦＡ−１を含有するリンパ球への取り付けを仲介する
、膜に関連する細胞付着分子（ＩＣＡＭ−１）を記載し
ている。この特許出願は、細胞間付着分子の分野におけ
るこの研究の説明を提供する。発明者らはＩ　ＣＡＭ−
１の交互に切り継ぎされたｍ　ＲＮ　Ａを特に探索して
おり、そしてそれを同定しなかった。ＩＣＡＭ−１は、
最初に、Ｔ細胞への白血球の付着におけるその役割に基
づいて同定された［ＲｏｔｈｌｅｉｎｌＲ，、ジャーナ
ル◆オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎ。

１）、１３７：１２７０−１２７４　（１９８６）］、
そしてこれはＬＦＡ−１へのＩＣＡＭ−１のへテロタイ
プの結合により仲介されることが示された。

Ｉ　ＣＡＭ−１の主な構造は、細胞付着分子、神経細胞
付着分子（Ｎｅｕｒａｌ　　Ｃｅ１ｌ　　Ａｄｈｅｓｉ
ｏｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ　　（ＮＣＡＭ）および、ミ
レイに関連する糖タンパク質（Ｍｙｌｅｉｎ−Ａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｄ　　　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅ　ｉ　ｎＸＭ
ＡＧ）に対して相同性であることを明らかにし、そして
それは免疫グロブリン超遺伝子族のｌ員であるという提
案に導いた［５１ｍｍ。

ｎｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、ネイチャー（Ｎ　ａ　ｔ　ｕ
　ｒ　ｅ）、３３１：６２４−６２７　（１９８８）；
５ｔａｕｎｔｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、細胞（Ｃｅｌｌ
）、５２：　９２５−９３３　（１９８８）、ｃＤＮＡ
のクローンのＤＮＡ配列は、上に参照したシモンス（Ｓ
ｉｍｍｏｎｓ）らおよびスタウントン（Ｓｔａｕｎ　ｔ
　ｏ　ｎ）の”論文に記載され、これらからＩＣＡＭ−
１のアミノ酸配列は推定することができる。

Ｉ　ＣＡＭ−１膜は、２４アミノ酸を含有するする領域
および２８アミノ酸を含有する短い細胞質のテイルのま
たがる典型的な疎水性膜を有する。先行技術のＩ　ＣＡ
Ｍ−１は、非イオン性洗浄剤中の細胞を溶曹することに
よって細胞膜から可溶化される不溶性分子である。次い
で、洗浄剤中で可溶化されたＩＣＡＭ−１混合物を、カ
ラムのマトリックスに精製のために通過させる。　本発
明は、交互するｍＲＮＡ配列を表しそして洗浄剤の添加
なしに可溶性である、ｓｌｃＡＭ−１と表示するＩＣＡ
Ｍ−１の内因性の交互に切り継ぎされた（ａＩｔｅｒｎ
ａｔｉｖｅｌｙ　　５ｐｌｉｃｅｄ）分子の種を提供す
る。

本発明は、自然の汚染物質を含有しない、精製および分
離されたヒト可溶性細胞間付着分子（ＳｒｃＡＭ−１）
またはその機能的誘導体を提供する。ｓｒｃＡＭ−１は
、ＨｅＬａ、Ｈｅ　Ｉ、およびその−次トランスフエク
ション体から得ることができ、非イオン性洗浄剤の不存
在下Ｉこ可溶性であり、そして新規なｍＲＮＡ配列によ
り定められる翻訳産生物であることを特徴とする。この
ヒト細胞の自然産生物は、可溶性の形態で細胞から分泌
され、そして免疫原性でないという利点を有する。自然
可溶性産生物は、自然不溶性産生物と異なり、可溶性産
生物はＣ末端に１１アミノ酸残基を含有するが、不溶性
の形態中に存在する膜のスバンニング（ｓｐａｎｎｉｎ
ｇ）および細胞質ドメインを含有しない。

本発明は、ｓｌｃＡＭ−１をエンコードする精製および
分離されたＤＮＡ配列ならびに前記配列をエンコードす
る宿主細胞を提供する。

本発明は、工程： （ａ）未溶菌細胞から上澄み液を取り出し、（ｂ）前記
上澄み液を親和マトリックスに導入し、前記親和マトリ
ックスはｓｌｃＡＭ−１に結合することができる抗体を
固定化して含有し、（Ｃ）前記ｓ　Ｉ　ＣＡＭ−１を前
記マトリックスの前記抗体に結合させ、 （ｃ＋）前記親和マトリックスを洗浄して、結合しない
汚染物質を除去し、そして （ｅ）前記ｓｌｃＡＭｌを前記マトリックスから溶離す
ることによって、前記ｓＴｃＡＭ１を実質的に純粋な形
態で回収する、 ことを特徴とする可溶性細胞間付着分子を実質的に純粋
な形態で回収する方法を提供する。

上澄み液を前記抗体カラムに導入する前または後に、上
澄み液をレクチンまたは麦芽アグリチニンのカラムを利
用す、るそれ以上の精製を使用することができる。他の
精製工程は、大きさを決定するクロマトグラフィー、イ
オンクロマトグラフィ、おおびゲル電気泳動を包含する
。スクロースの勾配を通す速度沈降によるそれ以上の精
製を使用することができる。ｓｌｃＡＭ−１に結合する
ことができる抗体は、Ｉ　ＣＡＭ−１またはＨＲＲに対
する抗体を包含することができる。

本発明は、ｓｌｃＡＭ−１に対するポリクローナル抗体
を包含する。

本発明は、さらに、ｓＩＣＡＭ−１に結合することがで
きるが、ＩＣＡＭ−１に結合することができない、ｓｌ
ｃＡＭ−１に対して特異的の抗体を包含する。ペプチド
の抗血清を産生ずる方法は、参照、グリーン（Ｇｒｅｅ
ｎ）ら、細胞（Ｃｅｌ＋）、２８：４７７−４８７　（
１９８２）。

本発明は、また、このような抗体を産生ずることができ
るハイブリドーマ細胞系を包含する。

本発明は、さらに、ｓｌｃＡＭ−１に対して特異的に向
けられた抗体を使用して、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−
１により仲介される細胞の付着を増加する治療を包含す
る。

本発明は、さらに、工程： （ａ）ペプチド−タンパク質接合体を調製し、前記ペプ
チド−タンパク質接合体はｓｌＣＡＭ−１中に存在する
独特１１アミノ酸配列の少なくとも一部分に対して特異
的であり、 （ｂ）動物を前記ペプチド−タンパク質接合体で免疫化
し、 （ｃ）動物を促進剤投与し、そして （ｄ）抗血清を得る、 からなる、ｓＩＣＡＭ−１に結合することができるが、
ＩＣＡＭ−１に結合することができない抗体を産生ずる
方法を包含する。

抗体はｓｌｃＡＭ−１に結合することができるが、ＩＣ
ＡＭ−１に結合することができない。本発明は、同一特
異性の抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系を包含し、
前記抗体はハイブリドーマ細胞および産生の方法により
産生される。

本発明は、さらに、ＬＦＡ−１を含有する細胞をｓｌｃ
ＡＭ−１またはその機能的誘導体と接触させる工程から
なる、抗［（ＬＦＡ−１）および細胞間付着分子−１（
ＩＣＡＭ−１）の相互作用を抑制する方法を包含する。

このＩ　ＣＡＭ−１の付着を抑制する方法は、炎症、移
植片の拒絶のような病気の状態において、およびＬＦＡ
−１を発現する腫瘍細胞について用途を有する。

本発明は、さらに、ＬＦＡ−１を発現する腫瘍細胞の存
在および位置を診断する方法を包含する。

本発明は、さらに、ウィルスをｓｌｃＡＭ−１またはそ
の機能的誘導体と接触させる工程からなる、主要な受容
体群のヒトリノウイルスの感染を実質的に減少する方法
を包含する。

本発明の１つの面は、ヒトリノウイルス（ＨＲＶ）の受
容体結合部位に対する可溶性結合配位子の発見およびそ
れが、また、ＬＦＡ−１に結合するという発見に関する
。この可溶性自然分子は、「細胞間付着分子−１（Ｉｎ
ｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ　　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　　Ｍｌ
ｏｌｅｃｕｌｅ−１）」まＩ；はｒｌＣＡＭ−ＩＪに関
係するが、それと区別される。Ｉ　ＣＡＭ−１は、不溶
性であり、細胞膜に結合し、そして典型的な疎水性膜ス
パン二ング領域および短い細胞質テイルを有する。本発
明の新規なタンパク質は、ＩＣＡＭ−１について発表さ
れたＤＮＡ配列と有意差を含む。ｓＩＣＡＭ−１はＩＣ
ＡＭ−１の細胞外ドメインの大部分を含有し、ＨＲＶお
よびＬＦＡ−１の結合を包含する多数の機能を包含する
が、膜のスバンニングおほび細胞質ドメインを欠く。ｓ
ｌｃＡＭ−１はＨＲＶおよびＬＦＡ−１に結合する能力
を保持し、そして可溶性の形態で分泌される。ｓＩＣＡ
Ｍ−１のためのＤＮＡ配列は、スタウントン（Ｓｔａｕ
ｎｔｏｎ）ら、５ｕｐｒａ　（１９８８）の番号に従い
ヌクレオチド１４６５〜１４８３からの１９塩基対の欠
失を含有する。ｓｌｃＡＭ−１クローンの残部は、第１
図に示すように、Ｇｌｕ４４２〜Ｌｙｓを交換する、ヌ
クレオチド位置１４６２においてＧとＡとの置換を除外
して、発表されＩ；■ＣＡＭ−１の配列と一致する。ペ
プチド中のアミノ酸残基の配列は、標準の命名法、例え
ば、レーンニンガー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）の生化学（
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ＷｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓ
ｈｅｒｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９７０）に
従って表示する。ｓｌｃＡＭ−１は、ヒトリノウイルス
およびコクサッキーＡウィルスへ結合しかつそれを阻害
する性質を有する、）（ｅＬａおよびＨＥＩ細胞の自然
産生物である。それは、また、ＬＦＡ−１へ結合する性
質を有し、そしてＩ　ＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１の結合に
より仲介される細胞の付着に対して拮抗させるために使
用することができ、こうして炎症、移植片の拒絶、Ｌ’
ＦＡ−１発現腫瘍細胞の抑制、および細胞の付着を含む
他のプロセスの処置に・おける治療として有用である。

分離および精製された配列タンパク質は、治療剤として
、異質タンパク質に関連する免疫原の問題をもｔ；ない
であろう。可溶性の天然に産出するタンパク質の分泌は
、不溶性の、細胞膜結合タンパク質の産生および精製を
排除する。なぜなら、細胞の溶菌は不必要であり、こう
して連続的培養を使用することができならびに配列の精
製および分離の手順を簡素化するからである。

主要なヒトリノウイルス受容体遺伝子を発現するヒト以
外の哺乳動物細胞系は、前に同一され、そして１９８８
午ｌＯ月２５日に提出された、同時係属米国特許出願第
２６２５７０号および同第２６２４２８号の主題であり
、そして細胞系のためのＡＴＣＣ受託の言及を含む。主
要なヒトリノウイルスの受容体は、リノウイルスの感染
を抑制するモノクローナル抗体を使用して同定された。

これらのモノクローナル抗体は、ヒト細胞上のおよびリ
ノウイルス結合性表現型を発現するマウストランスフェ
クション体上の、９５ｋｄの細胞表面糖タンパク質を認
識した。精製しｆ：　９５　ｋｄのタンパク質は、生体
外でリノウイルスに結合する。

９５ｋｄのタンパク質からのタンパク質の配列は、Ｉ　
ＣＡＭ−１のそれと同一性を示した；リノウイルス受容
体を発現するマウストランスフェクション体から得られ
たｃＤＮＡクローンは、前述のＧとＡとの交換を除外し
て、ＩＣＡＭ−１について発表された同一の配列を有し
た。こうして、主要なヒトリノウイルス受容体およびＩ
　ＣＡＭ−１は同一タンパク質であることが決定された
。ＨＥＩと表示するトランスフェクションしたマウスＬ
細胞系は分離され、これはＨＲＲ遺伝子またはＩＣＡＭ
−１遺伝子を含有しかつそれを発現した。ＩＣＡＭ−１
の用語が使用されてきたが、それは現在ＨＲＲおよびＩ
ＣＡＭ−１は互換的であることが認識されている。

不規則にプライミングされたｃＤＮＡライブラリーは、
ＨＥＩポリＡ＋ＲＮＡからのラムダＧＴ１１中で調製さ
れた。ライブラリーを反復実験において、ＩＣＡＭ−１
の発表された配列から誘導された２つのオリゴヌクレオ
チドを使用してスクリーニングした。オリゴヌクレオチ
ドＩＣＡＭ−Ｉは配列 ＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣ
ＣＴＴＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣを有し
、そしてオリゴヌクレオチドＩ　ＣＡＭ−３は配列 ＣＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴ（１，ＧＡ
ＧＣＴＧＧＴＡＧＧＧＧＧＣＣ，ＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴ
を有した。

３つの陽性のクローンが１つのスクリーンから得られ、
そして３つのそれ以上の研究のための選択した。２つの
クローンのＤＮＡ配列決定は、発表されたＩ　ＣＡＭ−
１配列との同一性を示した。

第３クローン、ラムダ１９．ｌ−３の配列は他の２つの
クローンと有意に異なり、上のスフラントンら番号に従
いヌクレオチド１４６５〜１４８３の１９塩基対の欠失
が存在した。１９ｂｐの欠失は第２ＣＤＮＡ１ラムダＨ
ＥＩ−４，５中に存在し、そして独立にｃＤＮＡを発生
するポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ　ＣＲ）を使用して確証
された。ＣＤＮＡの分析は、交互する切り継ぎ機構によ
り発生するＩ　ＣＡＭ−１の分泌された形態の存在を予
測した。ＨＥＩおよびＨｅＬａ細胞系の培養物上澄み液
からのｓｌｃＡＭ−１のウェスタン・プロットの同定は
、ｓ　ＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡ配列が、細胞表面に関連し
ないが、細胞媒質中に放出される、ＩＣＡＭ−１の可溶
性の形態をエンコードすることを確証する。分泌された
形態の他の付着分子（Ｎ　ＣＡＭ）を発生する、交互に
切り継ぎされたｍＲＮＡは同定された（Ｇｌｏｗｅｒ酢
酸エチル、細胞（Ｃｅ　ｌ　Ｉ）　、５５　：　９５５
　６６４　（１９８８））が、ＮＣＡＭにおいてエクソ
ンはｍＲＮＡ中に組み込まれるが、本発明においてはエ
クソンはｍＲＮＡから欠失される。ＩＣＡＭ−１のため
の交互的ｍＲＮＡ配列は従来であるされなかっｔ：（Ｓ
ｔａｕｎｔｏｎ　　　　ｅｔ　　　　　ａｌ、）　　。

ｓＩＣＡＭ　　ｌ　　ｃＤＮＡ　　クローン不規則にブ
ライミングしたｃＤＮＡライブラリーを、ラム１ＧＴＩ
Ｉ中でＨＥＩポリＡ＋（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ’　　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｊｅｓ、カルフォルニア州バロアルト）か
ら構成した。ライプラリーは、ＩＣＡＭ−１解読配列の
中央から２つの４７７−のオリゴヌクレオチドプローブ
でスクリーニングした。１９．１−３と表示する陽性の
クローンを分離し、これは１．５ｋｂのインサートを有
した；１．２５ｋｂのインサートを有する４、５と表示
する第２ＣＤＮＡクローンを分離した；そして追加のｃ
ＤＮＡクローンｐＨＲＲ−３は、第４Ｃ図、レーン３似
示すように、ＰＣＨの増幅の産生物ヲハーキンーエルマ
ー／センスＤＮＡ増幅システム（Ｐｅｒｋｉｎ　　Ｅｌ
ｍｅｒ、マサチュセッツ州つヱレスレイ）を利用するブ
ルースクリップト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）中にスクリ
ーニングすることによって得た。これらのクローンは、
発表されたＩ　ＣＡＭ−１配列と有意に異なった。それ
らのすべては、上のスタウントらの番号を付す方法にに
従いヌクレオチド１４６５から１４８３への１９塩基対
の欠失を含有する。配列　ｍＲＮＡがＨＥＩ細胞および
ＨｅＬａ細胞中に存在することを直接実証するために、
ＰＣＨの実験を、ｓｌｃＡＭ　　ｌ　　ｍＲＮＡから存
在しない１９ｂｐ領域をフランキングするプライマーを
使用して実施した。これらのプライマーを使用して、Ｉ
ＣＡＭ−１ｍＲＮＡからの産生物は１０５ｂｐであるが
、ｓｌｃＡＭ−１産生物は１９だけ短い、すなわち、８
６ｂｐである。この実験が示すように、ＨＥｌ細胞およ
びＨｅ　Ｌ　ａ細胞の両者は両者の形態の１１ｍＲＮＡ
を含有するが、対照り細胞は含有しない。次の配列を有
するＰＣＨ３，２と表示する合皮オリゴヌクレオチドを
使用して、１９ｂｐの欠失を含有しないクローンと１９
ｂｐの欠失を含有するｃＤＮＡクローンを区別し　ｔこ
　： ｇｇａａｔ　ｔｃＴＣＡＣＴＣＡＴＡＣＣＧＧＧＧＧＧ
ＡＧＡＧＣＡＣＡＴＴ合戊オリゴヌクレオチドは、１９
塩基対の欠失を含有するｃＤ合成クローンに結合しない
。さらに、ｃ　ＤＮＡ　ｌ　９゜ｌ−３およびＰ　！（
ＲＲ−３ｎ　ｏ部分的配列は、１９ｂｐの欠失を確証し
た。このデータが示すように、少なくとも２つの異なる
かつ明確なＩ　ＣＡＭ−１種がＨＥＩ細胞中に存在する
。

先行技術不溶性ＩＣＡＭ−１８よび本発明において記載
する新規な可溶性の形態。

ｃＤＮＡクローンにより表現される細胞間付着分子−１
ｍＲＮＡの欠失した（ｓｌｃＡＭ−１）および欠失しな
い（ＩＣＡＭ−１）を、第２図に示す。欠失点における
配列は、ＲＮＡ切り継ぎ接合と一致するＡＧＧＴである
。ｍＲＮＡからの１９塩基の除去は、リーディングフレ
ームをシフトし、そして２つのポリペプチド配列をアミ
ノ酸残基４４３において分散させる。欠失した形態（Ｓ
ＩＣＡＭ−１）は、追加の１１残基、次いでインフレー
ムの停止コドンを含有する。こうして、この分子は４５
３アミノ酸を含有し、これに対して欠失しない形態は５
０５アミノ酸を含有する。■ＣＡＭ−１のＮ末端を使用
して開始すると、ｓｌＣＡＭ−１はＩ　ＣＡＭ−１と共
通の４４２アミノ酸を有する。欠失した形態（３１ＣＡ
Ｍ−１）は、第３図に示すように、独特１１アミノ酸Ｃ
末端を含有するが、膜のスパンニング（２４７ミ／ＩＩ
）およびＩ　ＣＡＭ−１の細胞質テイル（２８アミノ酸
）ドメインを欠く。

ＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡクローン 複数の方法を使用して遺伝子をクローニングすることが
できる。１つの方法は、２つの部分的にオーバーラツプ
するオリゴヌクレオチドプローブを使用することである
。オリゴヌクレオチドＩＣＡＭ−１およびオリゴヌクレ
オチドＩＣＡＭ−３と呼ぶこれらの２つのプローブは、
発表されたＩＣＡＭ−１配列から合皮した。ＩＣＡＭ−
１オリゴヌクレオチドを高い比活性に標識し、そして高
い厳格さの条件下にサザンプロットにハイブリダイゼー
ションした。第４Ａ図に示すように、４゜４ｋｂの単一
のバンドは、ＨｅＬａ、ＨＥＩおよび２つの一次的ＨＲ
Ｒトランスフェクシｉン体細胞系において検出され、そ
してＬｔｋ’″細胞において存在しなかった。この結果
が確証するように、ＨＲＲトランスフェクション体はヒ
トＩＣＡＭ−１遺伝子を含有する。断片の大きさは、シ
モンス（Ｓ　ｉ　ｍｍｏ　ｎ　ｓ）らと一致するが、ス
タウントンらと異なり、多分制限部位の多形性を反映す
る。

ＩＣＡＭ−１オリゴヌクレオチドを使用して、同一細胞
系からのポリＡ＋ＲＮＡのノザンプロットをブロービン
グした。第４Ｂ図に示すように、３．３ｋｂのｍＲＮＡ
はＨｅＬａ５　ＨＥＩｓおよび一次的トランス７エクシ
３ン体細胞系において検出されたが、Ｌｔｋ−細胞にお
いて存在しなかった。ＨＥＩ細胞におけるシグナルは他
の細胞系より多数倍強く、）ＩＥＩ細胞中の非常に高度
にｍＲＮＡのレベルを示した。これはＨＥＩ細胞中のＨ
ＲＲ（ＩＣＡＭ−１）の発現のより高いレベルと一致す
る。第２の２．４ｋｂのＲＮＡは、また、ＨＥＩ細胞に
おいて検出された。これらのデータが確証するように、
ヒトＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡはｆ（ＲＲトランスフェクシ
ョン体において発現される。第４Ｂ図参照。

ヒトＩ　ＣＡＭ−１遺伝子をＨＥｌトランスフェクショ
ン体から、パーキン−エルマー／シートＤＮＡ増幅シス
テム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍａｒ。

マサチュセッツ州つエレセレイ）利用するポリメラーゼ
連鎖反応（Ｐ　ＣＲ）を使用して分離した。

ＰＣＲ増幅は、ＨｅＬａ、Ｌｔｄ−およびＨＥＩＲＮＡ
からつくった一本鎖ｃＤＮＡについて実施した。プライ
マーは発表されたＩ　ＣＡＭ−１配列の５°および３′
解読領域からつくった。ＩＣＡＭ−１特異釣場幅産生物
は、ＩＣＡＭ−１オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ
反応のサザンプロットのハイブリダイゼーションにより
検出した。

第４Ｃ図に示すように、予測する大きさに一致するほぼ
１６００ｂｐの単一のバンドはＨｅＬａ細胞およびＨＥ
Ｉ細胞から増幅されたが、Ｌ　ｔ　ｋ　−中に存在しな
かっｌ；。増幅産生物をブルースクリプト　（Ｂｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、カリフォルニ
ア州すンジエゴ）中にクロニングし、そしてＰＨＲＲＩ
およびＰＨＲＲ２と表示する２つのクローンを得た。Ｐ
ＨＲＲ２の完全な配列は、前述の単一のＧ対Ａの変化を
除外して、発表されたＩ　ＣＡＭ−１解読配列との１０
０％の同一性を示した。

不規則にブライミングしたＨＥｉ　　ｃＤＮＡからつく
ったラムダＧＴＩＩライブラリーを、ＩＣＡＭ−１８よ
びＩＣＡＭ−３のプローブでスクリニングし、そして８
つの陽性のクローンを分離した。第７図に示す６つのク
ローンを、それ以上の研究のために選択し、そして部分
的ＤＮＡ配列決定により分析した。これらのクローンか
ら誘導した配列の合計はぼ１０００ヌクレオチドは、Ｉ
ＣＡＭ−１配列との同一性を示した。

可溶性タンパク質の精製および分離 ＨｅＬａおよびＨＥＩ細胞を、１０％の胎児ウシ血清を
補充したＤＭＥＭ　（ダルベツフ変性必須培地）中で標
準条件下に増殖する。これらの細胞からのコンディショ
ニングした培地を収穫し、そして遠心または濾過して、
細胞または培養破片を除去する。細胞膜結合Ｉ　ＣＡＭ
−１は上澄み液中に存在しない。次いで、この培地をモ
ノクローナル抗体−セファロース樹脂（モ”ツクローナ
ル抗体ｃ７８．４Ａは１つの例である）に吸収させ、こ
こでモノクローナル抗体はＩ　ＣＡＭ−１またはＳＩ　
ＣＡＭ−１へ向けられており、そして吸収しないタンパ
ク質を樹脂から生理的塩類緩衝液、例えば、リン酸塩緩
衝液で洗浄する。次いで、結合したｓｌｃＡＭ−１をタ
ンパク質の自然のコンフォメーションを保存する条件下
にに溶離する（同時係属出願第２６２４２８号、１９８
８年１０月２５日提出に記載されているように）。ｓｌ
ｃＡＭ−ｔは、さらに、レクチン親和クロマトグラフィ
、イオン交換クロマトグラフィー、またはゲル濾過によ
り精製することができる。

ブルースクリプトベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎａ）中
のｓｒｃＡＭｌをエンコードするｃＤＮＡから生体外で
転写したｍＲＮＡを、生体外で翻訳した。ミクロソーム
の膜の不存在下に、見掛けの分子量５２．０００ダルト
ンのグリコジル化してないタンパク質を得た：ミクロソ
ーム膜の存在下に、７２，４００ダルトンのグリコジル
化種がえられ、これをミクロソーム膜内で配列決定し、
ｓｌｃＡＭ−１ポリペプチドっが正しく翻訳され、処理
され、そしてミクロソーム膜によりグリコジル化される
ことが示される。

ＣＤＭ８ベクター中でｔｍｌｃＡＭおよびｓＩＣＡＭを
エンコードするｃＤＮＡ（参照、Ｂ、およびＡｒｕｆｆ
ｏ、Ａ、ＰＮＡＳ　　８４：３３６５（１９８７））を
ＣＯ３細胞およびマウスＬ細胞中に、ＤＥＡＥ−デキス
トラン技術を使用してトランスフェクションした。７２
時間において、細胞を２つの方法により分析しｔ：：（
１）ＩＣＡＭ種の細胞膜の発現について抗ＩＣＡＭ　　
Ｍａｂ（ｃ７８．４）を使用するＦＡＣ５分析および（
２）代謝標識つけ、次いで細胞上澄み液およびリゼイト
の抗ＩＣＡＭＭａｂを使用する免疫吸収。代謝標識っけ
からの結果は、ｓｌｃＡＭトラシスフエクションした細
胞中の６８，０００ダルトンの種の細胞内蓄積を示した
が、上澄み液中へのｓｌｃＡＭの分泌は検出できなかっ
た。これらのデータは、「調節した」分泌通路を通って
分泌されるｓｌｃＡＭといっちする［Ｒ，Ｂ、、Ｋｅ　
ＩＩ　ｅ　Ｙ　ｓ　サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２
３〇二２５　（１９８５）］。

ｓｌｃＡＭおよびＩ　ＣＡＭ−１に対して特異的な抗体
グローブを調製した。ｓｒｃＡＭのＣ末端における独特
１１アミノ酸配列から誘導した合皮ペプチド５−ＰＥＰ
。

ＰＰＧＭＲＬＳＳＳＬＷ　（Ｃ） Ｉ　ＣＡＭ−１のＣ末端から誘導したＰ２Ｏ３、ＧＴＰ
ＭＫＰＮＴＱＡＴＰＰ　（Ｃ） をつくり、そして精製した；かつこ内のＣ末端Ｃ残基を
添加して、タンパク質担体へのペプチドの結合を促進し
た。合皮ペプチドをＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　　Ｌｙｍ
ｐｉｔ　　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に標準の技術により
結合し、そしてこの接合体をウサギへ注射して抗ペプチ
ド抗血清を産生し、そしてこの抗血清はそれらのそれぞ
れのペプチド免疫原に特異的に結合することが示された
。

本発明に関し下記の微生物が、アメリン・タイプ・カル
チャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　；　１２３０
１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒ。

ｃｋｕｉｌｌｅ、ＭＤ２０８５２．ＵＳＡ）に寄託され
ｔこ　。

（ａ）ＡＴｃｃ受託番号ＣＲＬ９５９２の哺乳動物　細
胞ＨＥ−１ （ａ）ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ９５９３の哺乳動物　細
胞ＨＲＶＲＩ　（ＨＲＲＩ） 及び （ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９５９４のハイブリドーマ
　細胞Ｃｍ９２．１Ａ 本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１１精製および分離されたヒト可溶性細胞間付着分子−
１またはその機能的誘導体。

２、ＨｅＬａ％Ｈｅ　Ｉ、およびその−次トランス７エ
クシタン体から得られ、 （Ａ）洗浄剤の不存在下に可溶性であり、そして ＣＢ）第１図に示すｍＲＮＡ配列の翻訳産生物である、 ことを特徴とする細胞間付着分子。

３、好ましくは第１図に示す、ヒト可溶性細胞間付着分
子−１をエンコードするＤＮＡ配列により特徴づけられ
る、精製および分離されたＤＮＡ配列。

４、上記第３項記載のＤＮＡ配列を含有する宿主細胞。

５、工程： （Ａ）未溶菌細胞から上澄み液を取り出し、（Ｂ）前記
上澄み液を親和マトリックスに導入し、前記親和マトリ
ックスはｓｌｃＡＭ−１に結合することができる抗体、
好ましくはＩＣＡＭ−１およびｓｌＣＡＭ−１に対する
抗体、またはその誘導体を固定化して含有し、 （Ｃ）前記ｓＩＣＡＭ−１を前記マトリックスの前記抗
体に結合させ、 （Ｄ）前記親和マトリックスを洗浄して、結合しない汚
染物質を除去し、そして （Ｅ）前記ｓｌｃＡＭ−１を前記マトリックスから溶離
することによって、前記ＳＩＣＡＭ−１を実質的に純粋
な形態で回収する、 ことを特徴とする可溶性細胞間付着分子−１を実質的に
純粋な形態で回収する方法。

６、上澄み液を前記抗体カラムに導入する前または後に
、上澄み液をレクチンまたは麦芽アグリチニンのカラム
に導入することをさらに特徴とする、上記第５項記載の
方法。

７、ｓｌｃＡＭ−１に結合することができるが、不溶性
ＩＣＡＭ−１に結合することができない、好ましくは第
１図に示すｌｌアミノ酸配列Ｃ末端に結合することがで
きる、抗体、好ましくはモノクローナル抗体。

８、上記第１または２項記載のタンパク質からなる、ヒ
トリノウイルスの感染を減少するための製剤学的組成物
。

９、ｓｌｃＡＭ−１および／またはＩＣＡＭ−１に対す
るモノクローナル抗体、および／またはそれらの混合物
からなる、過剰のｓＩＣＡＭ−１により引き起こされる
免疫欠損を逆転するための製剤学的組成物。

１０、精製されたＬＦＡ−１またはその機能的誘導体か
らなる、過剰のｓｌＣＡＭ−１により引き起こされる免
疫欠損を逆転するための製剤学的組成物。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｓＩＣＡＭ−１のヌクレオチドおよびアミノ
酸配列を示す。 第２図は、ｓｌＣＡＭ−１のＩＣＡＭ−１のＣ末端領域
の比較である。ＩＣＡＭ−１およびｓｌＣＡＭ−１のヌ
クレオチドおよび推定のアミノ酸配列は、アミノ酸残基
４３５において開始することが示されている。ｓｌｃＡ
Ｍ−１配列のダッシュは損失したヌクレオチドを示す。 両者のタンパク質中の停止コドンの位置は星印により示
されている。 第３図は、ｓ　Ｉ　ＣＡＭ　、　ｌのＩ　ＣＡＭ−１の
構造の比較である。ＩＣＡＭ−１の領域にまたがる膜は
点描した箱により示され、そして細胞質ドメインはハツ
チングした箱により示されている。ＳＩＣＡＭ−１の新
規なＣ末端は、充実の箱により示されている。免疫グロ
ブリンとの相同性を示す５つの予測されるドメインは■
〜Ｖの番号が付されている。 第４図は、ＩＣＡＭ−１遺伝子およびＨＲＲトランスフ
ェクション体中のその発現を示す。Ａ：ＥｃｏＲＩで制
限しそしてオリゴヌクレオチドＩＣＡＭ−１でブロービ
ングした、）ＩｅＬａ　（レーン１）　、ＬＴＫ−（レ
ーン２）およびＨＥＩ（レーン３）のサザンプロット；
Ｂ：オリゴヌクレオチドＩ　ＣＡＭ−１でブロービング
したＨｅＬａ（し−ンｌ）、Ｌｔｋ−（レーン２）およ
びＨＥＩ（レーン３）ポリＡ＋ＲＮＡのノザンプロット
；Ｃ：ＨｅＬａ　（レーンｌ）、Ｌｔｋ−（レーン２）
およびＨＥｌ、（レーン３）ポリＡ十ＲＮＡから調製し
たｃＤＮＡのＰＣＲ増幅。使用するプライマーは、配列
ｇｇａａ　ｔ　ｔ　ｃＡＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣ
ＣＣＣＣＧＧＣＣＣおよび　ｇｇａａｔ　ｔｃＴＣＡＧ
ＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＣＴＴＧＴＧＴＧＴＴを有するＩ
　ＣＡＭ−１のＮ末端およびＣ末端の解読配列からのも
のであった。上の場合はＩＣＡＭ−１配列、下の場合は
制限部位のリンカ−である。 レーンｌおよび２．７２時間の暴露、レーン３．９０分
の暴露。 第５図は、ＨｅＬａおよびＨＥＩＪｆＥ胞におけるＩＣ
ＡＭ−１およびｓｌｃＡＭ−１のｍ　ＲＮ　Ａの検出を
示すゲルである。ＰＣＲ増幅は、プライマーのＰ　ＣＲ
５、４（ＣＴＴＧＡＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＴ
ＣＧＧ）およびＰ　ＣＲ３、４（ＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧ
ＡＣＡＡＴＣＴＣＡＴＡＣＣＧ）を使用してｌｏｏｎｇ
ｋの一本鎖ｃＤＮＡについて実施した。伸長は７２℃に
おいて２５サイクルで実施し、そして産生物の１／Ｉ　
Ｏの産生物を１％のアガロース／３％のＮｕシーブ（Ｓ
ｉｅｖｅ）ゲルで分析した。レーンｌ、ＨｅＬａ　　ｃ
ＤＮＡ；レーン２、ＨＥＩ　　ｃＤＮＡ；レーン３、Ｌ
ＴＫ−ｃＤＮＡ；レーン４、Ｉ　ＣＡＭ　−１７−ｒ　
−ジの対照；レーン４、ＩＣＡＭ−１ファージ対照；レ
ーン５、ｓｌｃＡＭｌファージ対照；レーン６、Ｉ　Ｃ
ＡＭ　−１＋　ｓ　Ｉ　ＣＡＭ　−１フアージ対照。１
０５ｂｐおよび８６ｂｐの特定の増幅産生物を矢印で示
す。 第６図は、ＨｅＬａおよびＨＥＩ細胞によるＩＣＡＭ−
１タンパク質の可溶性の形態の合皮を示すウェスタ〉・
・プロットである。それが実証するように、ＨｅＬａ８
よびＨＥ　１ｔｔｆｉ胞中の培養物上澄み液中のタンパ
ク質種の存在はＩ　ＣＡＭ−１に関係した。細胞リゼイ
トおよび培養物上澄み液の等しいアリコートを、５ＤＳ
−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース上にブロッ
ティングし、そしてＩ　ＣＡＭ−１に対するウサギポリ
クローナル抗血清でブロービングし、次いで１２８１プ
ロテインＡでブロービングした；膜結合Ｉ　ＣＡＭ−１
の位置に密接して移動する種は、ＨｅＬａおよびＨＥＩ
の培養物上澄み液の両者において見られる。 第７図は、クローニングしたｓｌｃＡＭ−１およびＩＣ
ＡＭ−１のプラスミドのグラフの表示である。 ７Ａ、ｐＨＲＲ３はＰＣＲにより得られるｓＩＣＡＭ−
１をエンコードする全長のｃＤＮＡである。クローン１
９．１−３および４．５は、ラムダＧＴＩＩにおいてＨ
ＥＩ　　ｃＤＮＡライブラリーから得られるｓｌｃＡＭ
−１をエンコードする、部分的ｃＤＮＡクローンである
。クローンより下に、ｓ　Ｉ　ＣＡＭ−１分子の略図が
存在する。Ｓはシグナルペプチドであり、そしてＩ−Ｖ
はｒｇＧ相同的ドメインである。充実の箱は、独特１１
アミノ酸Ｃ末端を示す。 ７Ｂ％　ｐＨＲＲｌおよびＩ）ＨＲＲ２は、ＰＣＨによ
り得られる全長のｃＤＮＡクローンである。 残りのＩ　ＣＡＭ−１クローンは、ラムダＧＴＩＩに８
いてＨＥＪ　　ｃＤＮＡライブラリーから得られた。ク
ローンより下に、Ｉ　ＣＡＭ−１分子の略図が存在し、
シグナルペプチド（Ｓ）、５つのｒｇＧ相同的ドメイン
（１−Ｖ）、トランスメンブレン領域（ＴＭ）および細
胞質ドメイン（Ｃ）を示す。 ＦＩＧ、１α ＦＩＧ、１ｂ ＩＣＡＭ−１／ＡＴ）− ｓ　ＬＣＡ門−１ＯＣ沫瑣匹１転の注校Ｓ−ｉ５−１ｃ
Ａ ＾ Ｆ！Ｇ、Ｉ！。 図面の浄書（内容に変更なし） Ｆ］Ｇ、５ 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、６

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、精製および分離されたヒト可溶性細胞間付着分子−
   １またはその機能的誘導体。