HU227547B1 - Hepatitis c virus (hcv) polypeptides - Google Patents

Description

A nemzetközi. közzététel száma: WO 93/00365.

A találmány hepatitis C (HCV; fertőzés terjedésének megakadályozására alkalmas anyagokkal és eljárásokkal foglakozik. Pontosabban, a találmány tárgyát HCV fertőzés, kimutatására, megelőzésére, valamint kezelésére használható immunkémiai reagensekként alkalmazható polipeptidek képezik.

A HCV~t először mint a non-A non~B hepatitis (NANSH) okozóját azonosították és jellemezték Hougnton és munkatársai. Hz számos immunkémiai reagensként alkalmazható általános és fajlagos polipeptid. felfedezéséhez vezetett. [Lásd például, Houghton és munkatársai, 318 216 számú európai szabadalmi leírás; Houghton és munkatársai 388 232 számú európai szabadalmi leírás; Choo és munkatársai, Science, 244, 359-362, (1983); Xuo és munkatársai,

Science, zii, 362-364, (1989); és Houghton és munkatársai, Hepatclogy, 14, 381-388, (1991)1.Ezek a közlemények a gyakorlat számára kiterjedt háttérismeretet nyújtanak a HCV fertőzésről általában és HCV polipeptideket tartalmazó immunkémiai reagensek előállításáról, valamint azok alkalmazásáról. Ezen közleményekre csatolt irodalomjegyzékben.hivatkozunk.

Houghton és munkatársai munkáját.mások már alkalmazták és továbbfejlesztették, (lásd például Highfíeld és munkatársai, 2 239 245 számú szabadalmi leírás, Egyesült krályság (Wellcome Foundation Ltd); Wang, 442 394 számú európai szabadalmi leírás, (United Biomedícal Inc.); Leung és munkatársai, 445 423 számú európai szabadalmi leírás, (Abbot Laboratories); Habits és munkatársai, 451 891 számú európai szabadalmi leírás, (Akzo N.V.); .Reyes és munkatársai, W.0 91/15516 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés, (Genelabs Inc.); Maki és munkatársai, 468 657 számú európai szabadalmi leírás, {Tonen Corp) ; és. Kanada és munkatársai, 469 348 számú európai szabadalmi leírás., (Shiono-gi Seiyaku i.K.}).

HCV hordozók és HCV vírussal fertőzött vér, valamint vérkészítmények szűrésére és azonosítására alkalmas érzékeny és specifikus eljárások jelentős haladást jelentenek az orvosi gyakorlatban.

Transzfúzió utáni májgyulladás (FTH) a transzfunóált betegek körülbelül 10 %-ánál lép fel. és a HCV ezeknek az eseteknek a 9Ö %-á.ért felelős, A fő probléma ennél a betegségnél az, hogy gyakran krónikus májkárosodásba megy át {25-55 %). A betegek gondozása, valamint a HCV-nek vér és vérkészítményekkel, vagy közvetlen személyes érintkezéssel történő átvitelének megelőzése megbízható diagnosztikai és prognosztikai eszközöket, például HCV eredetű ellenanyagok kimutatására felhasználható HCV polipeptídeket igényel, ilyen polipeptídek szintén felhasználhatók vakcinaként és- immunterápiás gyógyászati készítményként a betegség megelőzésére és/vagy kezelésére.

Mivel a HCV viszonylag újonnan felfedezett kórokozó, folyamatosan szükséges további immunkémiai reagensek jellemzésére, amelyek lehetővé teszik a betegség klinikai lefolyásának és a HCV járványtanának további tanulmányozásét a népességen belül.

A találmány új HCV epitopok jellemzésével foglalkozik, Ezeknek az epitopoknak a tanulmányozása lehetővé teszi olyan poiipeptid készítmények előállítását,- amely HCV ellenes ellenanyagokkal izmvunolőgiai reakcióba lép és/vagy in vivő HCV elleni eiienanygok termelődését váltja kí. Ezek a polipeptid készítmények felhasználhatóak diagnosztikai vizsgáló készletben standardként vagy

V ·» reagensként, és/vagy vakcinák összetevőj ekénk. Szén polipeptid szekvenciákén belül található- HCV epi.topok, elleni, például políkionélis és monoklonáiis ellenanyagok szintén felhasznál-hatók reagensként, például diagnosztikai vizsgáló készletekben, gyógyászati készítményekként, vírus ellenes hatásó anyagok kiszűrésére, és HCV eredetű polipeptidek vagy részecskék izolálására/tisztítására,

Tágabb értelemben a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti újonnan jellenzett HCV epitopokat tartalmazó^ polipét!dek, ilyen polipepfidek előállítására szolgáló eljárások (például rekombináns és szintetikus eljárások), ilyen polipeptidek alkalmazására szolgáló eljárások (például diagnosztikai, vakcina készítési és gyógyászati eljárások), valamint az ilyen felhasználás céljára kialakított eszközök, vagy készítmények (például egy immunvizsgélat kivitelezésére alkalmas készlethez vagy egyéb hordozóhoz kapcsolt polipeptidek, szájon át, vagy injekcióban alkalmazható gyógyszerészeti készítmények, Hasonlóképpen a találmány tárgykörébe tartoznak a találmány szerinti HCV spitopok ellen termelt ellenanyagok ípoliklonális, monoklonáiis, vagy megfelelőik, például kötő fragmenssk, egv láncú antigén kötő proteinek, stb.), valamint ilyen ellenanyagok előállítására és alkalmazására szolgáló eljárások (például diagnosztikai, vakcina készítési és gyógyászati eljárások), valamint a.z ilyen felhasználás céljára kialakított eszközök, vagy készítmények (például egy immunvizsgálat kivitelezésére alkalmas készlethez, vagy egyéb hordozóhoz kapcsolt ellenanyagok, szájon át vagy injekcióban alkalmazható gyógyszerészeti készítmények).

A találmány kiterjed olyan, az említett ellenanyagokat arra φ

φφφ ♦ Φ*φ ♦ «

Φ »Φ* * * * * ** ΦΦ *.« ‘ϊ φ

megfelelő tartályban tartalmazó vizsgáló készletekre, amelyek egy HCV antigén jelenlétének kimutatására -alkalmasak. A találmány kiterjed továbbá olyan, a fenti polipeptideket egy arra alkalmas tartályban tartalmazó vizsgáló készletekre, amelyek egy HCV antigén ellenes ellenanyag kimutatására alkalmasak.

A találmány tárgykörébe tartozik továbbá a találmány szerinti HCV epítopokat tartalmazó polipeptidek előállítására szolgáló eljárás, mely eljárás tartalmazza a HCV epítopot tartalmazó polipeptio szekvenciát kódoló expressziós vektorral transzformált gazdasejt inkubáiását olyan feltételek mellett, amelyek az említett polipeptid expresszáiöóását lehetővé teszik, valamint az előbbi eljárással előállított, ilyen HCV epítopot tartalmazó polipétid.

A találmány kiterjed továbbá immun-vizsgáló eljárásokra, Ezek magukba foglalnak egy HCV antigén kimutatására szolgáid immunvizsgáló eljárást, amely eljárás tartalmazza egy HCV antigént feltételezetten tartalmazó minta inkubáiását egy fent ismertetett ellenanyaggal antigén-ellenanyag komplex kialakulását lehetővé tevő feltételek mellett; valamint az ellenanyagot tartalmazó antigén-ellenanyag komplex kimutatását,

A találmány kiterjed továbbá egy HCV elleni ellenanyagok kimutatására szolgáló immunVizsgáló eljárásra, amely eljárás tartalmazza egy HCV elleni ellenanyagot feltételezetten tartalmazó minta inkubáiását egy fent ismertetett poiipeptiddel, az ellenanyag-antigén komplex kialakulását lehetővé tevő feltételek mellett; valamint a polipeptidet tartalmazó ellenanyag-antigén komplex kimutatását.

Szintén a találmány tárgyát képezik HCV fertőzés kezelésére ♦ *** ·ί * * * * * X _Μ *<ί φ ¢( alkalmas egy a találmány szerinti KCV epitopot tartalmazó immuno-gén peptidet tartalmazó vakcinák. A találmány tárgyköréhez tartozik HCV ellen ellenanyagok előállítása, mely eljárás tartalmazza egy a találmány szerinti HCV epitopot tartalmazó- tisztított immusogén polipeptid adagolását immunválasz kiváltásához elegendő mennyiségben.

A találmány fenti tárgykörei az alábbi képlet szerinti HCV epi topok, felfedezésével egészülnek ki:

&.ö\X’~A$:3y ahol aa egy öminosvat jelöl;

x és y integerek, ügy, hogy y-x>=6;

aax-aay az 1. ábrán bemutatott szekvencia szerinti aminosav szekvencia részletre utal;

és

1 va	1amely	ihet
,-v £ _	ο ρ ί n
'3 O ”	S <.< f i. w
321,	Ve / f	3 5 7,
540-	S4 9 < S	> j
729,	782-7	83,
197	2 , 110	Q 1
371,	1384,	141
566-	1568,	1573.
> i- Z.· χ	1728,	17 2
915,	~ <s?s íj t	5 04
14,	2024,	ολ/1 a Z, V <i ö
48,	2165 ,	2187
283 ,	2 3 2 5 -	2327

i o > 4 14 , 4 z z , 4 6 5 ~ 4 ! z ,

594-599, 601-613, 641,

35230' íoöi

128-0-1285, 1322,

15-32-1535, 1560,

1620, 1655, 1695 ü e; -, ioon íaftO-i-m·?·? ,:o-->c ^340-1948 1'951 ^366-1969,

1999, 2Ό01-2004, 2006-2014., 2024, 2048-2053, 2055-205-7, 2071,

226 -2 232, 2244-2 243

2401, 2417-2422, 2433-2444, 2446-2456, 2469, 2471-2476, 2495, «φ φφφφ Γ * < » » * *** φ $9« φ „ * „ * * * «> φ * **'» *φ ΦΦ 9«

2 5 3 3	, 2534 ,	2 S V *· tt 7	'7 :7 r. .. tt tt) tt 4 xi όυ <t xi w öí	2606-2612,	2632-	2 6 3 8 ,	ώίϊΟυ ,
2675	-2579,	2685-2633,	2707, 2721,	2757-2762,	•V .-j z\ tt ? 7 >' <	27 93	, 2795,
2797	-2799,	2391, 2802.	, 2817-2843,	z 8 o 5 - 2 8 Q; / t	z s / b ~	2884,	2886-

2895.

-κ *1 '**

Az e.;.o célkitűzés elérhető a következő képlet ás kifej ezei '·»:' ‘ rr,. ry :tt c? Λλ ? ,z •v«.XídU4?U'ft'UV t &«x~ssy ahol aa egy aminesvat jelöl;

x és y integerek, úgy, hogy y~x>~6;

aax-aay az 1. ábrán bemutatott szekvencia szerinti aminosav szekvencia, részletre utal:

X

k An

a kóvetnezö.

k közi

11

valamelyiket tartalmazza:

tt . .^

j n. V\ ,··\ \ Iw

1 y kise

mint

X ;ζζ

5 , 80

(ahol y k

.isebb

re 7 r> -τ , iKXÜV

tt r> \ .2 V <

, 95 (ah

v··,

Y

kisebb, mint

ή 7 tt

GO t f ~s

í

ahol

y kisebb.

mint

120) ,

10 0

(ahol y

ki

itt· 'tt* xxi..· ;

*y, *! TI X 1

•J / <

190

ía

hol y

kisebb, m

ént 2

10) , 5

00 (

ahol v

nr

senb,

ma.nt 5 5

V , t

600

< T V *>λ

hol y

kisebb, n

lint 6

25) , 1

260

(aho1 y

ki

ChxZHltt X f

mint 1280)

, 15 6

Cj

(ahol

y kisebb,

mint

1931)

< ’ 3

70 (ahol

y

KI

sebb.

mint 15

90)

, 169

X *-±

(ahol

y kisebb,

Τ'! 7 r\ 'fe i 4· k-

17 3 5}

, 19

49 (ahol

y

Ki

seob,

mint 21

24)

, 19 5

V

(ahol

y kisebb.

mint

19 85)

, 20

00 (ahol

y

ki

~ obi-, ftt f

mint 20

50)

, 200

«ζ

y kisebb,

mint

2 fi 2 5 'i

, 20

54 (ahol

ar

ki

S-G&b f

mint 22 23}

, 225

tt

(ahol

y kisebb,

Τ '! 7 ‘tt

Z -.' V

, 2 2

87 (ahol

7?' J

ki

sebb,

mi n t 23

H X 1

229

tt

(ahol

y kisebb,

mint

2310}

, 23

45 (ahol

y

ki

sebe,

mint 23

7 5}

, 234

8

(ahol

y kisebb.

yyt 7 Tv

24 64)

, 24

4 5 (anoi

V

ki

sebb,

mint 24

75)

, 24 70

<

aho 1

y kisebb.

mint

249Ö),

260

5 (rabol

y

ki

sebb,

mint 2 6

•'V ./-> \ xi· V /

, 27 8

V

ί Λ í^tts T \ CU aw -<

y k .i se b o,

w ·; *> 7·· ittJ. . : :

2 8 3 01

, 27

96 (ahol

\x

ki

.sebb,

mint 28

86)

, 280

0

(cib-01

y kisebb,

ítt.L i» k.

2850)

, 28

86 {<

V

ki

sebb,

mint 29

l> 7 >

*5 sí »»* *«»* «« ♦ *** » **· *«* ’«>* *«»

A találmány néhány megvalósítási módja szerint a fenti képlet bármelyikében x-y lehet kevesebb, vagy egyenlő mint 10,20,30,40,50.

Az ábrák rövid ismertetése

1. ábra: a HCV prototípust képviselő HCVI izolatum poliprotainjét mutatja.

2. ábra: a HCV1 c.DdS szekvencia összetételét mutatja.

3. ábra: a 23. számú humán izolátum konszenzus nukleotid s-zekvenoáját mutatja, a variábilis szekvenciákat a szekvencia sor alatt jelöltök. Szintén megadtuk a konszenzus szekvencia által ködeit aminosavakat.

4. ábra: a 27. számú humán izolátum konszenzus nukleotid szekvencájár mutatja, a variáns szekvenciákat a szekvencia sor alatt jelöltök.. Szintén megadtuk a konszenzus szekvencia által ködeit aminosavakat.

5. ábra: a 23., valamint 27.. humán izolátumok é.s a H.CV1 nukleotid szekvenciáinak sorrendjét mutatja. A homológ szekvenciákat {*) szimbólummal jelöltök. Az eltérő szekvenciákat kis betűkkel jelöltök.

6. ábra: a 23., valamint 27, humán izolátumok és a H.CV1 aminosav szekvenciáinak sorát mutatja. Az: azonos szekvenciákat {*} szimbólummal jelöltük. Az eltörő szekvenciákat kis betűkkel jelöltök.

7u ábra: a Thorn, az SCI, a HCT#18 és a H.CV1 izolátumok összetett nukleotid szekvencia sorrendjének az összehasonlítását mutatja,

8. ábra: az .SC.10 nukleotid szekvenciái árnak és a HCV1 összetett szekvenciájának összehasonlítását mutatja. Az. ECrü szekvenciáját a pontsor feletti, a HCV! szekvenciáját a pontsor alatti sorban ábrázoltuk.

*« *

9. ábra; a. HCI# 18. a JH2 3, a CH27, a Ihorne és az ECL humán, izolátumok konszenzus szekvenciáinak EnvL· szakasza által, kódolt 117-308. (a HCVl-hez viszonyítva) terjedő aminosav szekvenciák, valamint a HCVI aminosav szekvenciáinak összehasonlítását átitatja.

10. ábra: a HCT#18, a u'E23, a JH27, a Thorne és az EC1 hunén izolátumok konszenzus szekvenciáinak EnvH” szakasza által kódolt 330-360. (a HCVl-hez viszonyítva) terjedő aminosav szekvenciák, valamint a HCVI aminosav szekvenciáinak összehasonlítását mutatja.

A vonatkozó irodalmi helyek felsorolása az A találmány háttere'', valamint az Irodalomjegyzék fejezetekben található.

1. A találmány ismertetése során az alábbi definíciókat alkalmaztuk;

Hepatitis C vírus’’, vagyis HCV elnevezés a. gyakorlatban ismert vírus fajra vonatkozik, amelynek kórokozó törzsei HANBH betegséget okoznak, valamint ennek gyengített törzseire és az ezekből származó detektív gátló részecskékre vonatkozik. Lásd A találmány háttere” cián fejezetben idézett közleményeket. A HCV genomját RNS alkotja, ismeretes, hogy sz RNS tartalmú vírusok a szakirodalom szerint viszonylag magas mutációs rátával, például beépített nukleotidónként 10-3-10-4 nagyságrendű mutációs rátával rendelkeznek [Eielös és Knipe, (1986)). Mivel a genotípus heterogenitása és változékonysága az RNS vírus törzsek jellemző tulajdonsága., a HCV fajon beiül több virulens, vagy avirulens tőrzs/izolátum lehet. A szakirodalomban jói dokumentált a különböző HCV törzsek, vagy izoiátumok tenyésztése, azonosítása, kimutatása és izolálása. A találmány kiterjed továbbá különböző * * törzsek/izolátumok ellen di-agnosztikumok és vakcinák előállítására., valamint gyógyszerészeti felhasználásra alkalmas vírus ellenes szerek, például a HCV replikációját gátié szerek vizsgálatában alkalmazható készítményekre és eljárásokra.

A találmány tárgyát számos különböző HCV törzsre/izolátumra, különösen a CDC/HCV1 törzsre vagy ízdátumra {HCVi néven is ismert) vonatkozó információ: képezi. Egy törzsről, vagy izeiétűmről rendelkezésre álló ismeretek például a részleges genomiéiis, vagy aminosav szekvencia ismerete, lehetővé teszik a gyakorlatban járatos személy számára szokásos eljárások alkalmazásával új törzsek/izolátumok izolálásét és annak megállapítását, hogy az új törzsek/izolátumok HCV törzsek/izolátumok. Példaképp néhány különböző törzset/izolátumot ismertetünk az alábbiakban. Ezeket a törzseket, amelyeket több (különböző térségből származó) humán szérumból nyertünk, a HCVI genomiálís szekvenciájának ismerete alapján izoláltuk,

A rendelkezésre álló ismeretek arra utalnak, hogy a HCV a flavivírusokkal állhat távoli rokonságban. A Flavivirusok csaladjába nagyszámú kis méretű, burokkal rendelkező, emberre kórokozó vírus tartozik. A Eiavivirus részecskék morfológiája. és összetétele ismert (3rintőn, (1989)] . Általánosságban morfológiájukat tekintve a Flavivirusok egy központi nukleokapszidot tartalmaznak, amelyet egy lipid kettős réteg vesz körül. A vi··· rionok gömbalaknak, és 40-50 nanométer átmérőjűnk. Hágjuk körülbelül 25-30 nanométer átmérőjű. A virIon burkának külső felszíne mentén 5-10 nanométer hosszúságú nyúlványok, vannak, melyek végén 2 nanométer átmérőjű göbök találhatók. A család tipikus képviselői a sárgaláz vírusa, a West Eiie vírus, és a Dongna láz virusa. Ezek a vírusok pozitív RNS szálú {körülbelül 11.000 nukleotidböl állőj genomet. tartalmaznak, amely kissé nagyobb a ücv genomjánál, és körülbelül 3 500 aminosavból álló poliprotein prekurzort kódolnak. Az egyes proteinek ebből a prekurzor poiipeptídbol hasadnak le. Megállapítást nyert a HCV genomiálís RNS szerkezete es nukleotid szekvenciája, A genom egy szálú ENS-nek bizonyult, amely körülbelül 10,000 nukleotídot tartalmaz, A genom pozitív szálú és egy körülbelül 3000 aminosavból állő poliproteint kódoló folyamatos transzlációs nyitott leolvasási keretet (ORF) tartalmaz. Az ORF-en belül a struktűr-protein(ek)et az N-terminális szakasz körülbelül első negyede kódolja, a poliprotein nagyobb része nem struktűr·· pro telnek szintéziséért felelős.

összehasonlítva az ismert virus szekvenciák összességével kisebb, de lényeges kolineáris homológiákat figyelhetünk meg a flavivlrus család, és a pestisvírus (amelyet jelenleg szintén a Flavívírus családba sorolnak) nem struktúráira proteinjei között A HCV1 nukleotid szekvenciája által kódolt következtetett aminosav szekvencia és egyéb bizonyítékok alapján a kódolt HCV poliprotein lehetséges protein dóménjei és azok körülbelüli határai a. következők:

Feltételezett dómén körülbelüli határ (aminosavak sorszáma)

C (nukieokaps2id protein) 1-191

El (várion burok protein)

S2/NS1 {burok?)

NS2 (ismeretien funkció)

NS3 (proteáz?)

192-383

384-800

800-1050

1050-1550

NS4 (ismeretlen funkció!

1651 - 2.100:

NSS (polipéráz) 2100-3011 (vég).

Ezek a doménok azonban feltételezettek. Az EÍ-HS2 határ például valószínűleg a 750-810. szakaszon, és az NS3-NS4 határ az 16401650. szakaszon belül található. Bizonyíték áll rendelkezésre arra nézve is, hogy a C protein 191 aminosavböl álló változata egy prekurzor, amely tovább alakul (például egy körülbelül 170 aminosavböl álló proteinné), és as NS2, BS3, NS5 proteinek mindegyike két érett proteinné alakul tovább.

A HCV különböző törzsei, izolátumai, vagy altípusai várhatóan aminosav és nukleinsav eltéréseket tartalmaznak a HCV1-el összehasonlítva. Sok izolátum várhatóan sok (azaz 40 % feletti) homo lóg iát mutat a teljes aminosav szekvencián beiül a HCVI-el ősszehasciítva, Lehetséges azonban, hogy találunk más, kevesebb homológiát mutató HCV Ízolátumokat is. Ezeket különböző ismérvek alapján határozhatjuk meg HCV isoiátumként, például egy a HCViéhez hasonló méretű poliproteint kódoló körülbelül 9.060-12.000 nukieotidot tartalmazó ORF alapján, a HCVi-hez hasonló hidrofób és/vagv antigén sajátságú poliprotein kódolása alapján, és HCVi re jellemző konzervatív kolineáris peptid szekvenciák jelenléte alapján. Ezen kívül a genom egy pozitív szálú RNS kell hogy legyen.

Egy HCV legalább egy olyan epitopot tartalmaz, amely immunológiailag azonosítható egy a HCVI poiiproteínen belüli epítoppal. Ez az epitop az eddig ismert más Flavívitusokkal összehasonlítva a HCV-re nézve egyedi epi top. Az epi top egyedi, volta HCV ellenes ellenanyagokkal való reakcióképesség, valamint ismert Fiavivírasok elleni ellenanyagokkal való immunológiai.

♦ *** kérész Χ reakc lók hiánya alapján határozható meg. Az Immunológiai reaktivitás megáliapítására alkalmas eljárások ismertek a gyakorlatban, mint például a rudioimmunpröbs, az ELISA próba, a hemagglutináciős próba és a továbbiakban példaként aég számos p.rőba elvégzésére alkalmas eljárást ismertetünk, Más eljárás szerint, a HCV epitop szekvenciának a Flavivirus család tagjainak már ismert szekvenciájával történő összehasonlításával állapítható meg az epitop egyedi” jellege.

A fentiek mellett -a nukleinsav és aminosav azonosság alábbi paraméterei alkalmazhatóak önmagukban, vagy kombinálva egy törzs, vagy izolátum HCV-kénti azonosításához. Mivel a HCV törzsek, és izolátumok törzsfejlődés szerinti rokonok, várhatóan a genomo-k azonossága a nukleotidok szintjén 10% , vagy annál több lehet, valószínűleg 40%, vagy annál több, valószínűleg körülbelül 60%, vagy annál több, még nagyobb valószínűséggel 30%, vagy annál több; ezen telül legalább 13 egymást kővető nokleotidoól álló azonos szekvenciák azonosíthatóak. Megjegyzendő azonban, hogy a HCV genom tartalmaz variábilis és hipervariábilis szakaszokat, ezért ezekben a szakaszokban a várható azonosság lényegesen kissebb mértékű, mint a teljes genom szerinti. Egy feltételezett HCV törzs genom szekvenciája és például a CDC/HC71 cDNS szekvenciája közötti azonosság a gyakorlatban ismert -eljárásokkal meghatározható. Meghatározhatóak például a feltételezett HCV-ről szerzett polinukleotid szekvencia íni-ormé-ciö és a találmány szerinti HCV cDNS szekvencia {szekvenciák) közvetlen összehasonlításával. Meghatározhatóak továbbá polinukleotidok hibridizációjával olyan körülmények között, hogy a homológ szakaszok, {példáéi azok, amelyeket 31 emésztés előtt használunk} stabil kettős szálat képezzenek, amit egyszálú DNS-t fajlagosan hasító nukleázzal (nukl,eá sokkal) emésztünk, majd az emésztett fragmensek méretét meghatározzuk.

A HCV törzsek és izolátumok közötti törzsfejlődési rokonság miatt a feltételezett HCV törzsek és izolátumok azonosíthatóak polipeptid homológia alapján. Általában a HCV törzsek és izolátumok várhatóan legalább 10%, több mint körülbelül 40%, valószínűleg több mint körülbelül 70%, még nagyobb valószínűséggel több mint körülbelül 80%, néhány pedig még 90%-nál is nagyobb mértékű polipeptid homoiógiát mutat. Az aminosav szekvencia homológia meghatározására alkalmazható eljárások jól ismertek a gyakorlatban. Meghatározható például a minta aminosav szekvenciája és összehasonlítható a találmány szerinti szekvenciákkal. Más eljárás szerint meghatározható a feltételezett HCV genom nukleotid szekvenciája (általában egy cDNS szál segítségévei;, az általa kódolt aminosav szekvencia kikövetkeztethető és a megfelelő peptid szakaszok összehasonlíthatók,

A találmány szerint egy adott szekvenciáböl származó polinukleotid alatt egy olyan pofiunkieotidot értünk, amely legalább S, előnyösen legalább 8, előnyösebben legalább 1G-12, még előnyösebben 15-20 nukleotídot tartalmaz, melyek megfelelnek az adott hukieotld szekvencia velemely szakaszának. A megfelel alatt az adott nukleotid szekvenciával homológ, vagy azzal komplementer szekvenciát értünk.

Előnyösen, annak a szakasznak a szekvenciája, amelyből a polinukleotid származik homológ, vagy komplementer egy HCV genom egyedi szekvenciájával. Az, hogy egy szekvencia a HCV genom egyedi szekvenciája a gyakorlatban járatos személy számára Ismert íxx »* eljárásokkal határozható saeg. A szekvencia összehasonlítható adatbankokban tárolt szekvenciákkal (elsőbbségi jog -dátuma szerint) például Genebank~ban, annak megállapítása céljából, hogy a jelen, van-e a ne® fertőzött gazdaszervesetekben vagy egyéb organizmusokban. Összehasonlítható továbbá a. szekvencia egyéb vírus szervezetek ismert szekvenciáival, beleértve azokat, amelyek közismerten májgyulladást okoznak, például HAv, HBV, és KDV, valamint a Flaviviridae család, tagjaiéval. Azt, hogy egy szekven ele származék megfelel, vagy nem felel meg más szekvenciákkal megállapítható továbbá megfelelő szigorú feltételek mellett végzett hibridizációval. Nukleinsav szekvenciák komplementer voltának megállapítására szolgáló hibridizációs eljárások ismertek a gyakorlatban, lásd például Naníatis és munkatársai (19-82) . A hibridizáció során a dupla szálú poiinukieotidok között kialakult nem összeillő nukleotid párosítások meghatározhatók a gyakorlatban ismert eljárásokkal, például nukleázzal, mint a dupias zálű poilnukleotidon beiül, specifikusan az egyszálú szakaszokat emésztő Sl nukleázzal való emésztéssel. Olyan szakaszok, amelyekből tipikus DNS szekvenciák származhatnak lehetnek, de azokra nem korlátozódnak például· specifikus epitopokat ködolő szakaszok valamint nem átiródő és/vagy nem transziáiödő szakaszok is.

A polinukleotld származék nem. szükségszerűen közvetlenül származik a találmány szerinti nukleotid szekvenciából, az bármely módon előállítható, beleértve vegyi szintézist, vagy DNS repirkáoiöt, vagy reverz transzkripciót, vagy transzkripciót. Az adott szekvenciának megfelelő szakaszok kombinációi módosithatók továbbá a későbbi felhasználás! szándéknak megfelelően a gyakorlatban jól ismert eljárások szerint.

*>>

r*·*

Hasonlóképpen, a találmány szerint agy adott aminosav vagy nukleotid szekvenciából származó polipeptid, vagy aminosav szekvencia alatt egy olyan polipeptidet értűnk, amely a szekvencián beiül kódolt polipeptiddel, vagy annak egy részévei azonos aminosav szekven.cával rendelkezik, azzal jellemezve, hogy az a rész legalább 3-5, előnyösen legalább 8-10 aminosavat, még előnyösebben 11-15 aminosavat tartalmaz, vagy immunológiai eljárással azonosítható a szekvencia által kódolt polipeptiddel.

Egy rekombináns vagy származtatott polipeptid nem feltétlenül az adott nukleinsav szekvenciáról transslálódik; az más módon, is előállítható, beleértve például a vegyi szintézist, vagy rekombináns expressziós rendszerben történő expresszióját, vagy HCVbol beleértve a mutáns HCV-bői való tisztítását. Egy rekombináns, vagy származtatott polipeptid szekvenciájában tartalmazhat egy vagy több analóg, vagy mesterséges aminosavat. Aminosav analógok egy adott szekvenciába történő inszertálasára, alkalmas eljárások ismeretesek a. gyakorlatban.

A találmány szerinti rekombináns polinukieotid alatt egy genomiális, eDNS, rélszintetikus,. vagy szintetikus polínukleotidot értünk, amely az eredete és módosítása szerint: {1} nem kapcsolt egy polinukieotid egészével, vagy egy részével, amellyel egyébként a természetben kapcsolódik, (2) egy olyan polinukleotiddal kapcsolódika amellyel a természetben egyébként nem kapcsolódik, (3) a természetben nem fordul elő.

A találmány szerinti polinukieotid’' alatt bármilyen hosszúságú nukleotid polimert értünk, függetlenül attól hogy az ribonukleotídokból, vagy dezoxíribonukleotidokbói áll. Ez az elnevezés kizárólag a molekula elsődleges szerkezetére vonatkozik, így az magában foglal dupla- és- egyszálú DNS-t és RNS-t. Az elnevezés magába foglalja továbbá az ismert módosításokat, például szokásos jelölő anyagokat, metiláiást, caps”Ot, egy vagy több természetes nukleotid analóggal történő helyettesítését, nukleotídon belüli módosításokat, például semleges töltésű kötések {például metilí-oszfonátok, f-oszfotrlészterek, fosztoramidátok, karbamátok, stb.}, töltéssel rendelkező kötések (például £oszfotioátok, foszfoditíoátok, stb..}, kiegészítő részeket, mint például fehérjéket tartalmazók {például nukleázokat, toxinokat, ellenanyagokat, jelző peptideket, poii-n-lízint stb.}, interkaiátorokkal történő kapcsolás {például akridin, pszoral-en, stb..), kelátorokat tartalmazókat (például fémeket, radioaktív fémeket, bort, oxidáló fémeket, stb.}, aikiiezó anyagokat tartalmazókat, módosított kötéseket tartalmazókat (például alfa anomer nukleinsavakat, stb,}, valamint a polinukleotid nem módosított formáit.

A találmány szerinti tisztított'· polipeptid alatt a polipeptid olyan állapotát értjük, amelyben az egyéb polipeptietektől gyakorlatilag mentes, azaz egy készítményben legalább 50 súly %-ot képvisel (kívánt poiipeptid/összes polipeptid a készítményben), előnyösen legalább körülbelül 70%-ot, még előnyösebben legalább 90%~ot, tekintet nélkül a készítmény nem fehérjészerű összetevőire ..

Vírus eredetű polipeptidek tisztítására alkalmas eljárások a gyakorlatban ismertek. A tisztított ellenanyagokat hasonlóan definiáljuk.

A találmány szerinti ''rekombináns gazdasejt”, gazdase j t ”, ''sejtek”, ” sej tvonalak , ”sejtkultűrák” és egyéb hasonló, egy* X * -is sejtő egységekként tenyészthető, mikroorganizmusokat, vagy magasabbrendú eukarióta sej tvonalakat. jelölő elnevezések olyan sejtekre vonatkoznak, amelyeket recipiensként használhatók, vagy amelyeket recipiensként használtak rekombináns vektorok, vagy egyéb transzfer DNS számára, és tartalmazzák az eredeti transzfektált sejt utódait. Érthető módon egyetlen szülői sejt utódai természetes, véletlen, vagy szándékosan létrehozott mutációknak köszönhetően morfológiájukat vagy genomiális, vagy teljes DNS összetételüket tekintve nem szükségszerűen teljesen azonosak, az eredeti szülői, sejttel,

A találmány szerinti ^í!replikon alatt bármely olyan genetikai egységet, például plazmidot, kromoszómát, vírust stb, értünk, amely a sejtben a polinukleotíd replikáolő önálló egységeként viselkedik, azaz saját ellenőrzése alatt képes replikálódni.

A találmány szerinti vektor alatt egy olyan replikont értünk, amelybe másik polinukleotíd szakaszt iktattunk be, abból a célból, hogy a beiktatott szakasz replikációját és/vagy expresszióját létrehozzuk.

A találmány szerinti kontroll szekvencia” alatt olyan polinukleotid szekvenciát értünk, amelyek azon kódoló szekvenciák expressziójahoz szükségesek, amelyhez kapcsoltak. Az ilyen kontroli szekvenciák természete a gazdaszervezettől függ; prokarlotákban az ilyen kontroli szekvencia promotere, ríboszóma kötőhelyet és terminátor szekvenciát tartalmaz; eukaríótákban az Ilyen kontroll szekvencia általában promotereket, terminátor szekvenciákat és néhány esetben segítő (enhancer; szekvenciákat tartalmaz, A kontroll szekvencia elnevezés alatt szükebb értelemben minden olyan szekvenciát értünk amely az expresszióhoz szükséges, de *·>··♦' χ **♦ ·>

magába foglalhat további olyan, szekvenciákat is, amelyek jelenléte előnyős lehet, például vezető szekvenciákat.

A találmány szerinti “mlXödőképesen kapcsolt” szekvenciák alatt olyan egymás mellé helyezett szekvenciákat értünk, amelyek kapcsolata iehetővé teszi, hogy az említett szekvenciák szándékunk szerint működjenek. A kódold szekvenciához működőképesen kapcsolt' kontroli szekvencia oly módon kapcsolt, hogy a kódoló .szekvenciával kompatibilis feltételek mellett a kódoló szekvencia expressziéját érjük el.

A találmány szerinti nyitott leolvasási keret” (ORF) alatt egy polipeptidet kódoló poiinukleotid szekvencia szakaszt értünk; ez a szekvencia lehet a kódoló szekvencia része, vagy az egész kódoló szekvencia.

A találmány szerinti kódoló szekvencia” alatt egy olyan poiinukleotid szekvenciát értünk, amely egy megfelelő szabályozó szekvencia ellenőrzése alá helyezve mRNS-é íródik át, és/vagy polípeptiddé transzlálődik. A kódoló szekvencia határait az 5’ végen egy transzlációs kezdő kódon, a 3’ végen egy a transzláció befejezését jelző kódon határozza meg. Kódoló szekvenciák lehetnek, de azokra nem korlátozódnak, mRNS, cöttS, valamint rekombináns poiinukleotid szekvenciák.

A találmány szerinti ”immunológiailag azonosítható mint/vaIamivel kifejezés alatt olyan epitop (epitopok) és polipeptid (polipeptidek) jelenlétét értjük, amely .(amelyek) az adott polipeptídekben, általában HCV fehérjékben is jelen vannak. Az immunológiai azonosságot ellenanyag kötés és/vagy az ellenanyag kötés gátlásával határozhatjuk meg; ezek az eljárások jól ismertek a gyakorlatban átlagosan járatos személy számára.

» _Λ ·♦·* «·«

A találmány szerinti “epitop elnevezés alatt egy polipeptid antigén determinánsát értjük. Egy epi top három, vagy több aminosavat tartalmaz, amely egy ellenanyag kötőhelyét határozza meg. Általában egy epitop· legalább öt, néha legalább nyolc aminosavat tartalmaz. Az epitop térképezésre alkalmazható eljárások ismeretesek a gyakorlatban.

Egy polipeptid immunológiai értelemben reakcióképes egy ellenanyaggal,· ha a polipeptiden belül található fajlagos epitoppal ellenanyag felismerés következtében kötődik s~ ellenanyaghoz. Az immunológiai értelemben, vett reakciőkészséget ellenanyag kötődéssel határozhatjuk meg, különösen az ellenanyag kötődés .kinetikája, alapján, és/vagy kötés--gátlás! próbával, gátlóanyagként (gátlóanygokként) olyan ismert polipetidet (polipeptideket) használva,, amely tartalmazza azt az epi topot, amely ellen az ellenanyagot termeltük. Egy pclipeptidnek egy ellenanyaggal való immunológiai. reakcióképesége megállapítására alkalmazható· eljárások ismertek .a gyakorlatban.

A találmány szerinti ellenanyag-” alatt olyan polipeptidet, vagy polipeptidek csoportját értjük, amely legalább egy ellenanyag kötőhelyet-tartalmaz. A találmány szerinti ellenanyag kötőhely, vagy kötő dómén egy ellenanyag molekula (molekulák) variábilis: dóménjének összehajtogatóöásával keletkezik, igy képezve egy belső felszíni alakzattal rendelkező háromdimenziós kötő réseket az antigén epitopjával kiegészítő töltésmegoszlássál, amely lehetővé teszi az antigénnel az immun.lógia.1 reaktiőképeséget. Egy ellenanyag kötőhelyet egy nehéz és/vagy egy könnyű lánc dómén képezhet (VH és VL a fenti sorrendben), amelyek hipervariábilis hurkokat képezve vesznek reszt az anti-

gén kötésben. Az ellenanyag elnevezés kiterjed például gerincesek ellenanyagaira, hibrid ellenanyagokra. kiméra ellenanyagokra, módosított ellenanyagokra, univalens ellenanyagokra, az Pab fehérjékre és egyetlen doménű ellenanyagokra.

A találmány szerinti egyetlen doménű ellenanyag” CöAto) egy olyan ellenanyag, amely egy VH doménből áll és immunológiailag reagál egy adott antigénnel. Egy dAb nem. tartalmaz VL domént, de tartalmazhat egyéb, az ellenanyagokban közismerten jelen lévő antigén kötő doménokat, például a kappa és iambda doménokat,

A dAb-ok előállítására alkalmas eljárások a gyakorlatban jól ismertek. Lásd például 'Ward és munkatársai(1989),

Ellenanyagok állhatnak VH és Vb domsnekböi, valamint egyéb ismert antigén kötő doyenekből. Ilyen ellenanyagok, valamint előállításukra szolgáló eljárások példái ismertek a gyakorlatban (lásd például a 4 816 476 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), és a következőket foglalják magukba. Például gerincesből származó ellenanyagok” alatt olyan tetramert, vagy azok aggregátumát képző ellenanyagokat értünk, amelyek rendszerint konfigurációba összeállt könnyű és nehéz láncot tartalmaznak, és a láncok között lehet kovalens kötés, vagy az hiányozhat. A gerincesekből származó ellenanyagok esetében az adott ellenanyag mindegyik láncának aminosav szekvenciája homológ egy az ellenanyagot in situ, vagy in vitro (például hibridőmákban) termelő iimíoclta által termelt ellenanyagban található lánc aminosav szekvenciájával, A gerincesekből származó ellenanyagok tipikusan lehetnek natív ellenanyagok, például tisztított polikionális ellenanyagok, és monoklonális ellenanyagok. Ezeknek az ellenanyagoknak az előállítására szolgáló eljárásokat az alábbiakban ismertetjük..

A találmány szerinti hibrid ellenanyagok alatt olyan ellenanyagokat értünk, amelyekben egy pár nehéz és könnyű lánc homológ as első ellenanyagban találhatóval, míg a másik pár nehéz és könnyű lánc egy különböző, második, ellenanyagban találhatóval homológ. Tipikusan mindkét pár különböző epitópokat köt, különösen eltérő antigéneken. Ez dívalens tulajdonságot eredményez, azaz egyidejűleg két antigén kötését teszi lehetővé, ilyen hibrideket kiméra láncok felhasználásával is előállíthatunk, amint azt az alábbiakban ismertetjük.

A találmány szerint kiméra ellenanyagok alatt olyan ellenanyagokat értünk, amelyekben a nehéz és/vagy könnyű láncok fúziós proteinek. Tipikusan a lánc állandó doménje egy adott fajból és/vagy osztályból származik, és a variábilis szakasz egy attól különböző fajból, és/vagy osztályból származik. kiméra ellenanyag lehet továbbá bármely olyan ellenanyag, amelyben egyik, vagy mindkét nehéz, vagy könnyű lánc különböző eredetű ellenanyagokban előforduló szekvenciák kombinációját utánozza, függetlenül attól, hogy azok mely osztály vagy faj eredetűek, és attól, hogy a fúziós pont a variábilis/állandö rész határán található-e. így lehetséges olyan ellenanyagok előállítása, melyeknek sem a variábilis, sem az állandó régiója nem utánoz ismert ellenanyag szekvenciát, így lehetséges például olyan ellenanyagok előállítása, amelyek variábilis régiója magasabb affinitással rendelkezik egy adott antigénre nézve, vagy melynek -állandó régiója fokozott komplement fixálást eredményez, vagy egy adott állandó régió tulajdonságainak egyéb javítása.

További példa a módosított ellenanyag, amely alatt olyan ellenanyagokat értünk, amelyben a gerincesektől szárazó ellenanyag természetesen előforduló aminosav szekvenciáját megváltoztattuk. Rekoshináus DNS technikák alkalmazásával ellenanyagokat átalakíthatunk kívánt tulajdonságok elérése érdekében. Számos megoldás lehetséges, Így egy, vagy több aminosav kicserélésétöl egy régió, például az állandó régió teljes átalakításáig terjed. Az állandó régióban eszközölt változásokkal elérhetjük a kivént sejthez kötött folyamatok, például a komplement fixáló tulajdonság, membránokkal való kölcsönhatás, és egyéb effaktor funkciók megváltoztatását. A variábilis régióban létrehozhatunk váltóstatásokat az antigén kötő tulajdonság módosítására. Ellenanyagot módosíthatunk ágy, hogy segítse egy molekula, vagy anyag fajlagos hordozását egy meghatározott sejthez, vagy szövethez. A kívánt módosításokat létrehozhatjuk a molekuláris biológiában ismert eljárásokkal, például rekombináns technikákkal, célzott mutagenezissel, stb..

Egy másik példa az ”univalens ellenanyagok”, amelyek egy másik nehéz lánc Fc (azaz állandó; régiójához kapcsolt nehéz lánc/könnyű lánc dinerekből álló aggregátumok. 'Ez a fajta ellenanyag ellenáll az antigén módosulásnak. Lásd például Glennie és munkatársai -(19-32) .

Az ellenanyag meghatározásba tartoznak az ellenanyagok Fab íragmensei is. Az ”Fab” régió elnevezés alatt a nehéz és könnyű láncok azon részét értjük, amelyek nagyjából azonosak, vagy analógok a nehéz és könnyű láncok elágazódé részelt képező -szekvenciákkal, és amelyek immunológiailag kötődnek egy bizonyos antigénhez, ugyanakkor nem tartalmazzák az eflektor Fc részt. Az Fab elnevezés magába foglalja egy nehéz és egy könnyű lánc

X ζ* aggregátumát (közismerten Fab’}, valamint a 2H és 21, láncokat tartalmazó tetramereket (közismerten F{ab}2}, amelyek képesek fajlagosan reagálni egy adott antigénnel, vagy antigén családdal. Az Fab ellenanyagok a fenti analógia szerint hasonló módon osztályozhatók, azaz gerincesekből származó Fab”, hibrid Fab, kiméra Fab és módosított Fab. Ellenanyagok Fab fragmenseinak előállítására alkalmas eljárások ismertek a gyakorlatban és azok magukba foglalják például a p-roteolízissel, és rekombináns technikákkal történő szintézis módszereit..

Az ellenanyagok elnevezés alá tartoznak továbbá az egyláncú antígénkötő proteinek (SCA) , mint az a típus, amelyet Se.hiom ismertet a Cancer Research 1992. június lö-í számában (és az ott idézett irodalmi helyek szerintiek). .

A találmány szerinti immunogén polipeptid elnevezés alatt egy olyan polipeptíded értünk, amely képes sejtes és/vagy humorélis immunválasz kiváltására függetlenül attól, hogy arra önmagában képes, vagy hordozóhoz kapcsolva, adjuvans alkalmazása nélkül, vagy azzal együtt.

A találmány szerinti polipeptid elnevezés alatt aminosav polimereket értünk, tekintet nélkül azok méretére; így a.'polipeptid meghatározás kiterjed peptídekre, oligopeptidekre és proteinekre. Ez a-z elnevezés nem vonatkozik, vagy nem zárja ki a polipeptid expressziő utáni módosításait, mint például a glikozilezé-st, acetilezést, fossforilezést és hasonlókat. A fenti meghatározás kiterjed például egy, vagy több analóg aminosavat (beleértve a mesterséges aminosavakat, stb.) tartalmazó polipeptidekre, helyettesített kapcsoló részt tartalmazó polipeptidekre, valamint

a gyakorlatban szokásos egyéb módosításokra, természetesekre és mesterségesekre egyaránt

A találmány szerinti transzformáció’* elnevezés alatt egy exogén polinukleotid ínszertálasét értjük valamely gazdasejtbe, függetlenül az alkalmazott eljárástól, mint például direkt felvétel, transzdukció, £-párosodés, vagy eiektroporáció. Az exogén polinukleotid fenntartható mint nem integrált vektor (például plazmád) , vagy más módon, a gazdasejt genomba integrálva.

A találmány szerinti kezelés elnevezés alatt megelőzést és/vagy terápiát értünk.

A találmány szerinti ” egyed' elnevezés gerincesekre, különösen az emlős fajokra vonatkozik, és magába foglal állatokat (például kutyát, macskát, szarvasmarhát, sertést, judot, kecskét, nyalat, egeret, patkányt, tengerimáiacot stb) és főemlősöket, beleértve a majmot, a csimpánzt, a páviánt és az embert, de azokra nem korlátozódik..

A találmány szerinti elnevezés egy nukleinsav ”sense lánca alatt azt a szekvenciát jelöli, amely homológ a mRNS szekvenciájával. As anti-sense lánc olyan, szekvenciát tartalmaz, amely komplementer a sense lánccal,

A találmány szerinti elnevezés egy vírus pozitív szálú genom ja alatt olyan genomot ért, amely függetlenül attól, hogy az RNS vagy DNS, egyszáiű és vírus polipeptidet (po-.lipeptid.eket) kódol. Pozitív szálú RNS vírusokra példák Togavirldae, Coronaviriöae, Retroviridas, Picornaviriöae, és Caiiciviridas családok. Ide tartozik továbbá a Flaviviridae -család, amelyeket korábban a Togavirldae családba soroltak. Lásd Fíelds és knipe (1986).

* * *♦*

A találmány szerinti ” ellenanyagot tartalmazó test-alkotórész” alatt egy egyed testének olyan alkotórészét értjük, amely a kérdéses ellenanyagok forrása lehet. Ellenanyagot tartalmazó testalkotórészek, ismeretesek a gyakorlatban és magukba foglalják, például a plazmát, szérumot, gerincscato-rna folyadékot, nyirok nedvet, továbbá a légző-, emésztő- és hügy ivar szervek külső: váladékait, valamint a könnyet, nyálat, tejet, fehérvérsejteket és miéi ómákat., de azokra nem korlátozódnak..

A találmány szerinti “biológiai minta' alatt egy ©gyedből vett •szövet, vagy folyadék mintát értünk, például plazmát, szérumot, gerinccsatorna folyadékot, nyíroknedvet, továbbá a bor-, légző···, emésztő- és húgyivarszervek külső váladékait, valamint a. könnyet., nyálat, tejet, tumorokat, szerveket és in vitro sejt-kultúra összetevők mintáit {a kultúrában tenyésztett sejtek, feltételezetten vírus fertőzött, sejtek, rekombináns sejtek és sejt összetevők kondicionált felülúszőja, de azokra nem korlátozódva} de azokra nem korlátozódva.

A találmány szerinti megvalósítási módnál, ha azt .másképpen nem jelöltük, a molekuláris biológiában, mikrobiológiában, rekombináns DNS technikákban és immunológiában szokásos eljárásokat alkalmaztunk. Ezen eljárások részletes leírása megtalálható a szakirodalomban. Lásd például Maníatis, Fitsch és Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982); D.K Glover szerk., ”DN.A Cloning, Ί-ΣΙ. kötet”, (1985) ; M.J. Ca.it szerk., Oiigonucleotid Synthesis, (1984); B.D. Hames és S.ü. Higgíns szerk., Hucleíc Acid Kybridizatíon'¹, (1981) ; B.D. Hames és S.J, Higgíns szerk, Transoription and Translation, (1984); R.I. Freshney szerk., Animál Cell Culture”, (1986); TRL Press, Irszobilized.

’ »* *'♦ ♦

Celi$s and Bnzymes'', (1986>; 8. Pérhal, A Practical Gui.de to

Molecular Cloning, Methods in Enzymology sorosat, (Academic Press Inc.), (1984); C.H. Miller és H.P. Calos szerk., Gene Transfer Vectors fór Mammallan Cells, (Ccld Spring Harbor Laboratory) ; Wu és Grossmann,. illetve Wu szerk., Methods ín Enzymol.

154. és 15.5. kötet : Mayer és Wslker szerk., Immunochemieal

Methods In Cell And Molecular Biology*', (Academic Press, Londoni , (1987)? Soopes, Protein Purification; Principi.es and Practíce”, második kiadás {Springer-Verlag, N.Y.,), (1887): valamint D.M. Vföir és C.C. Slackwell szerk., Handbook of Experimental Immunolo-gy”, Ί-ÍV. kötet, (198-6·)« A fenti és az alábbiakban említett szabadalmi leírásokat, szabadalmi bejelentéseket és közleményeket irodalmi helyekként adjuk meg.

11.A. Csonkolt HCV polipeptidek

A találmány szerinti anyagokat és eljárásokat új HCV epitopok. azonosítása tette lehetővé. Ezen epítopok (vagy antigénhatású régiók) megismerése tette lehetővé csonkolt HCV szekvenciákat tartalmazó polipeptidek előállítását, amelyek immunológiai reagensekként alkalmazhatók.

A legalább egy vírus epitopot kódoló csonkolt HCV aminosav szekvenciák hasznos immunológiai reagensek. Az ilyen csonkolt szekvenciák reagensként alkalmazhatók például egy immunprcbában. Ezek a polipeptidek használhatóak továbbá, mint alegység antigének készítményekben antíszérum, vagy vakcina előállítás céljára.

Bár ezek a csonkolt szekvenciák előállíthatok a natív vírus fehérje számos, a gyakorlatban szokásos kezelésével, általában előnyös egy HCV szekvenciát tartalmazó szintetikus, vagy rekombináns polipeptid előállítása, Szék a csonkolt HCV szekvenciákat tartalmazó poiipeptidek állhatnak kizárólag HCV szekvenciákból (egy vagy több epi top egymás mellett, vagy megszakítva) , vagy HCV szekvenciákból és heterológ szekvenciákból egy fúziós proteinen belül. A találmány szerinti előnyös heterológ szekvenciák közé tartoznak azok a szekvenciák, amelyek elősegítik. a kiválasztást a rekombináns gazdaszervezetből, növelik a HCV epltop(ok) immmunválaszt kiváltó képességét, vagy elősegítik a polipeptid kapcsolását valamely ímmnnpróba, vagy vakcina hordozójához.

Lásd. például a 116,201 számú európai szabadalmi leírást, a 4,722,840 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírást, a 259,149 számú európai szabadalmi leírást, a 4,629,783 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírást, melyeket irodalmi helyekként idézünk..

A csonkolt HCV szekvenciákat tartalmazó poiipeptidek mérete tág határok között változhat, a minimális· méret elegendő keli legyen ahhoz, hogy egy HCV epitopot alkosson, mig a maximális méret nem kritikus. Előnyösen a maximális méret nem lényegesen nagyobb, mint ami a kívánt HCV epltop képzéséhez és a heterológ szekvencia (ha van ilyen) funkciójának (funkcióinak) ellátáséhoz szükséges. A csonkolt HCV aminosav szekvencia jellemzően 5 (vagy 8) aminosavtól körülbelül ISO aminosav hosszúságig terjed. Jellemzőbb azonban, hogy a HCV szekvencia maximum körülbelül 50 (vagy 40) aminosav, és néha maximum 20, 25, vagy 30 aminosav hosszúságú láncig terjed. Általában kívánatos legalább körülbelül 8, 10, 12, vagy 15 aminosavból álló HCV szekvencia, kiválasztása.

A találmány szerint .alkalmazható- csonkolt HCV aminosav szék ^νί vencí-ákat (oktamereket) alább, a példákban Ismertetjük. Megjegyezzük, hogy ezek a peptidek nem szükségszerűen fednek pontosan egy epitopok. A szekvencia nem immunogán részei szokásos eljárásokkal meghatározhatók és deletálhatök az Ismertetett szekvenciákból. Ezenkívül további, egy epítopot tartalmazó, vagy immunogén. csonkolt HCV aminosav szekvenciák azonosíthatok a találmány szerint.

A találmány szerinti csonkolt aminosav szekvenciákat tartalmazd polipeptid készítmények elöállíthatók mint .különálló péptiöek, vagy beépíthettek egy nagyobb polipeptiobe, és felhasználhatók az alább ismertetett módokon. A találmány szerinti előnyös megvalósítási módban az El és/vagy Ez doménokhól nyert csonkolt szekvenciák vakcinákban és gyógyászati készítményekben alkalmazhatók. Míg általában bármely doménnek lehet valamilyen diagnosztikai alkalmazási területe, a ü, MSI, MS4 valamint NS'5 doménok különösen előnyösek, és különösen előnyös a C dómén kombinációja az NS3, NS4, vagy NS5 öoménok egyikével, vagy közülük többel,.

11.S.Polipeptidek előállítása

A HCV aminosav szekvenciáit kódoló rendelkezésünkre álló DNS szekvenciák lehetővé teszik a polipeptid antigénhatású aktív régióit kódoló expressziós vektorok előállítását (lásd például 2. ábra) ..

Ezek az antigénhatasű aktív régiók származhatnak a külső, vagy belső burok antigénekből, vagy a mag antigénekből, de lehetnek nem struktúr-fehérje eredetűek, például polinukleotid kötő fehérjék, polinukleotid polimeráz(ok) és egyéb, a vírus szaporodás** «»»» « bt . . ’··:

*♦» * ♦» t » áboz és a vírusrészecskék összeél.l.á.sához szükséges virusfehér™ jók. Az előnyős polipeptideket kódold fragmensek származhatnak például hagyományos restrikciós emésztéssel, vagv szintetikus eljárással készült virus eredetű cDNS-bői, és olyan vektorokba kapcsoltak, mint a béta-Galaktozidáz, vagy a superoxid dizmutáz CSŐD), előnyösen a SOD-ha. A SÓD fúziós szekvenciákat tartalmazó polipeptidek előállítására alkalmas eljárásokat és vektorokat ismertet a 0196055 számú európai szabadalmi leírás (1985, október

1). A SÓD és HCV fúziós polipeptideket kódoló vektorokat, például a NANS5-1- 1-et, NANBSl-st, valamint ClöÖ-3-at, amely összetett HCV cDNS-ekben kódolt, s IV.B.1, IV.B.2, és IV.B.4 fejezetek irnják le. A KCV cDNS-t tartalmazó nyitott olvasási keret (vagy annak egy szintetikus változata) bármely része alkalmazható rekombináns polipeptid expresszsiására, akár mint érett, vagy mint fúziós protein.

Más eljárás szerint HCV epitopokat tartalmazó polipeptideket előállíthatunk kémiai szintézissel az ábrákban és a példákban szereplő aminosav szekvenciák alapján a szokásos eljárásokkal.

A találmány szerint előnyős polipeptideket kódoló DNS fuzionált, vagy nem fuzionált formában, a kiválasztást lehetővé tevő szignál szekvenciával, vagy anélkül, kapcsolható bármely megfelelő gazdaszervezet számára alkalmas expressziós vektorba. Mind eukarióta, mind prokariőta gazdaszevezet rendszerek használatosak rekombináns polipeptidek előállítására, ezeket a gazdasejt vonalakat a 318,215 sz. európai szabadalmi leírás ismerteti. A polípeptiöet ezután iizált sejtekből, vagy tenyésztőfolyadékbói izoláljuk, és a felhasználás céljának mértéke szerint tisztítjuk. A tisztítás a gyakorlatban szokásos eljárásokkal végezhető, ♦ ♦ “ϊ “ί például· differenciái entraháiássai, só frakcíonálással, ioncserélő kromatográfiával, affinitás kromatográfiával, centrifugáiással, és hasonlóakkal. Lásd például a fehérjék tisztításé nak számtalan eljárását a Kethods in Enzymology köteteiben. Az ilyen polípetidek alkalmazhatok mint diagnosztikusok, a neutraixzáiő ellenanyagokat kiváltó polipeptidekbői pedig vakcinákat készíthetünk, Ezen polipeptidek ellen termelt ellenanyagok szintén használhatók diagnosztikusként, vagy passzív immun terápia céljára. Az alábbiak szerint ezen polipeptidek ellen termelt ellenanyagok alkalmasak továbbá, például HCV részecskék izolálására és azonosítására.

HCV polipeptideket izolálhatok és csonkolhatok (ha. még nincsenek csonkolva) HCV virionokhól Is. A virionok tenyészthetők HCV fertőzött sejtekben, szövetienyészetekben, vagy fertőzött gazcas zrvezetben..

11.C,Antigén hatású polipeptidek előállítása és hordozóval való konjugálása.

Sgy polipeptid antigén hatású része általában viszonylag kis méretű, jellemzően 8-10 aminosav hosszúságú, vagy annál kisebb, bár 5 aminosavböl álló fragmensek is jellemezhetnek egy antigén hatású, régiót. Ezek a szegmensek megfelelhetnek HCV antigén régióknak. Ennek megfelelően, a HCV cDNS-ek alapján rövid HCV polipeptid szegmenseket ködeió ENS~ek rekombináns úton expresszélhatók, akár mint fúziós proteinek, vagy mint izolált polipeptidek, Rövid aminosav szekvenciák könnyen előáliitbatók továbbá kémiai szintézissel. Olyan esetekben, amelyekben a szintetizált polipeptid konfigurációja helyes és a megfelelő epitopot

képezi, de túl kis méretű ahhoz, hogy iismunogén legyen, a polipeptid egy megfelelő hordozóhoz kapcsolható.

A gyakorlatban számos eljárás Ismeretes ilyen kapcsolások létrehozáséra, beleértev diszulfid kötések létrehozását N~ szukcinimidil-3-(2--píriöílfio)propionát(SPDPj , valamint szűkeinimidíl-4 ímaieimiöo-metii}ciklohexán-l-karboxilét ÍSMCC) felhasználásával (Pierce Company, Rockford, Illinois, USA) {ha a peptid nem tartalmaz S2ulfhidrii csoportot, az létrehozható cisztein maradék hozzáadásával). Szék a reagensek diszulfid kötést képeznek önmaguk és sz egyik proteinen található peptid cisztein maradékok között, valamint- amid kötést egy másik fehérje lizin, vagy más szabad amino csoport epszilon-amino csoportján keresztül. Számos ilyen -diszulfid/amid képző anyag ismeretes. Lásd például Imun Rév. , 62, 18-5, (19S2) . Más bifunkcionális kapcsoló anyagok inkább tioéter, mint diszulfid kötést létesítenek. Számos ilyen tíoéter képző anyag hozzáférhető a kereskedelemben, és magukba foglalják a S-m-aleimido-k.apron.sav, a 2-brömecetsav, és a 2jóöeeetsav, a 4-(M-maleimldo-metil}ciklohexán-l-karb-oxilsav és hasonlóak reaktív észtereit. A karboxil csoportok aktiválhatók szukcinimid, vagy 1-hidroxil-2-nitro-4-szulfonsav nátrium sójával kombinálva. Antigének kapcsolásának további eljárásai a 259,149 sz. európai szabadalmi leírásban ismertetett rotavírus/”kötő pétid” rendszert alkalmazzák, amelyet mint irodalmi helyet adunk meg. A fenti felsorolás nem teljes, és az említett vegyületek módosulatai éppúgy használhatók.

bármely olyan hordozóanyag használható, amely önmaga nem okozza a gazdaszervezetre káros ellenanyagok termelődését. A megfelelő hordozók jellemzően nagyok, lassan metaboiizálödő makromolekulák, ·♦♦ *♦ például, proteinek, po.liszach.sridők, például latexxei aktivizált Sepharose, agaróz, cellulóz, cellulóz gyöngyök és hasonlók, aminosav polimerek, mint például poliglutsminsav, polilizin. és hasonlók, aminosav kopoiimorek, inaktív vírus részecskék, lásd például a találmány szernti II.D. fejezetet, különösen hasznos protein hordozók a szérum albuminok, csiga hemocianin, immunglobulin molekulák, tireoglobulin, ovalbumin, tetanusz toxoió és egyéb a gyakorlatban járatos személy szájára jói ismert fehérjék. 11,D. HCV epitopokat tartalmazó hibrid részecske immunogének elő á'11.1 tás-a

A HCV -epitopok, immunogenitása fokozható továbbá azok emlős vagy gomba rendszerekben való előállításával olyan részecskeképző fehérjékkel fuzionálva, vagy összekapcsolva, mint amilyen a hepatitisz B felszíni antigénre jellemző. Lásd például a 4,722,84-0 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást.

Az olyan konstrukciók, amelyekben a HCV epitop közvetlenül a részecske-képző fehérje kódoló szekvenciához kapcsolt, a HCV epitopra nézve immunogén hibrideket képeznek. Ezen felül az előállított vektorok mindegyike tartalmaz HBV fajlagos epitopokat, különböző fokú immunogenitással, mint például a pre-S péptid. így a HCV szekvenciákat tartalmazó részecske-képző protein konstrukciók hüV-re és HSV-re nézve immunogének.

A hepatitisz felszíni antigénekről (HBSAg) kimutatták, hogy S, eerevisiae-bsn [?.Vaienzuela és munkatársai, (1982)) és például emlős sejtekben is [?.Vaienzuela és munkatársai, (1982)1 belőlük részecskék képződnek és azok összeállnak. Kimutatták, hogy ilyen részecskék kialakulása fokozza a monomer alegységek immunogentiását. A konstrukciók tartalmazhatják a HBSAg irnmundomnáns

- 34. ~ epítopját is, amely tartalmazza a felszín· előtti (pre-S) régió 55 aminosavát. [Neurath és munkatársai, (1984)j . Élesttőben expresssálható pre-S-HHSAg részecske konstrukciókat ismertet a 174 444 sz, európai szabadalmi leírás, {1986. március 19); élesztőben expresssálható heterológ vírus szekvenciákat tartalmazó hibrideket ismertet a .17 5 261 sz. európai szabadalmi leírás (1966. március 26), Ezek a konstrukciók emlős sejtekben, például kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekben is expresszálbatők egy SV40dihidrofoiát-reduktáz vektor felhasználásával íkichelle és munkatársai, (1934)),

A részecske-képző proteint kódoló szekvencia részei helyettesíthetők továbbá HCV epitopot kódoló kódonokkal. Ennél a helyette sí. résnél azok a régiók, amelyek az egységek éleszőben, vagy emlős sejtben immunogén részecskékké való összeáliásához nem szükségesek, deletáihatók, így eltávolítva a HCV epitoppal versengő további HBV antigén hatású részeket.

11. S. Vakcinák előállítása

Vakcinák előállíthatok egy, vagy több HCV eredetű immunogén polípepcldbői, Szék a polipeptídek különböző gazdaszervezetek sejtjeiben (például baktérium, élesztő, rovar, vagy emlős sejtekben) expresszélhatök, vagy más eljárás szerint izoíálhatőak vírus készítményekből, vagy előállííhatoak szintetikus úton. HCV elleni mcnovaiens, vagy multival.ens vakcinák tartalmazhatják egy, vagy több struktür-fehérje egy vagy több epitopját, és/vagy egy vagy több nem .struktür-fehérje egy vagy több epi topj át.. Ezek a vakcinák tartalmazhatnak például rekombináns HCV polipeptídeket, és/vagy a várromokból izolált polipeptídeket. A vakcinák elönyö*'*: „*» • \ :*» sen tartalmazhatnak a következő HCV proteinek közül egyet vagy többet, vagy azokból származó alegység antigéneket: SÍ, Sí, C, NS2, NS3, NC4, valamint HSS, Különösen előnyösek a találmány szerint az El-et, és/vagy H2~őt, vagy azok alegységeit tartalmazó vakcinák.

A lentieken kívül lehetséges továbbá élő vakcinák előállítása egy, vagy több rekombináns HCV poíipeptidet expresszáló legyengített mikroorganizmusból, Megfelelő legyengített mikroorganizmusok ismeretesek a gyakorlatban, és magukba foglalnak például vírusokat [például vaccinia vírust (lásd Brown és munkatársai, (1386)1 és naktér1umokat is,

Aktív összetevőként egy ímmunogán polipeptídet (poiipeptídeket) tartalmazó vakcinák előállítására szolgáló eljárások ismeretesek a gyakorlatban járatos személy számára.

Az ilyen vakcinák általában injekciós készítmény formájában készülnek folyékony oldatok, vagy szuszpenzíök formájában, vagy előállíthatok as Injektálás előtt folyékony vívőanyagokban oldható, vagy szuszpendálhato szilárd formában is. A készítmény továbbá emulzisikálható, vagy a protein iiposzőmákba burkolható.

Az aktív immunogén összetevőket gyakran a gyógyszergyárfásban elfogadott és az aktív összetevővel összeférhető vivőanyaggal keverik össze. Megfelelő vivőanyagok például a víz, fiziológiás sóoldat, dextröz, giioerol, etanol, vagy hasonlók és ezek kombinációi. Kívánt esetben a vakolna kis mennyiségben tartalmazhat továbbá kiegészítő anyagokat, például nedvesítő vagy emuizrflkálö anyagokat, pH pufferolő anyagokat, és/vagy adjuvánsokat, amelyek fokozzák a vakcina hatásosságát. Hatásos adjuvánsok például, de nem kizárólag; alumínium-hidroxid, K-acetil-muramil-b-treoníi-D-

*ϊ *

* $ i zogl u. t an· i n (ρνχ -HD2}, N - ac e t i 1 -sor ~mu r ami 1 - L - a I an i 1 - D - i z og 1 u ha min. (CGP 11637, más néven nor-HDP) ,

K-N-acetíl-muramil-L-aianil-D-izoglutaminii-L-aianin-Z'- (1 ’ -2’ - di palmi toli - sn-güeero -3 -hidroxi foss fór íloxi) -etíiamín (CG? 1.9 83 S A, más néven HTP), valamint 8181, amely baktériumokból kivont három összetevőt, monofőszlórii llpid A-t, trehalózdimikoiátot, és sejtfal· vázat tartalmaz (HPLaTDáHCYS) 2 %-os squalén/TweenR 83 emulzióban. Egy adjuváns hatékonysága, megállapítható egy HCV antigén hatású szekvenciát tartalmazó immunogén polipeptid ellen, az említett polipeptidet, valamint a különböző adjuvánsokat tartalmazó vakcina adagolása eredményeképpen termelődött ellenanyagok mennyiségének meghatározásával.

A vakcinákat szokásosan parenterálisan, jellemzően injekció formájában adagoljuk, például bőr alá, vagy izomba. Egyéb adagolási módokra alkalmas további készítmények magukba, foglalnak kúpokat és néhány esetben szájon át. adagolandó készítményeket. Kúpok esetében hagyományos kötőanyagok és hordozóanyagok lehetnek például polialkl.ién-giikolok, vagy trigliceridek; ilyen kúpok készíthetők az aktív összetevőt 0,5-10 %, előnyösen 1-2 % mennyiségben tartalmazó elegyekből. Szájon át adagolható készítmények olyan szokásosan alkalmazott vivőanyagokat, tartalmaznak, mint például a gyógyszergyártásban szokásos minőségű mannitol, laktóz, keményítő, magnézium-sztearát, a szacharin nátriumsója, cellulóz, magnézium-karbonát és hasonlók. Ezek a készítmények lehetnek oldatok, szuszpenzlök. tabletták, pirulák, kapszulák, lassú felszívódást készítmények, vagy porok, és 10-95 %, előnyösen 25-70 % aktív összetevőt tartalmaznak.

A proteinekből készíthetők vakcinák eredeti, vagy só formában.

:♦ »♦* χ

*

A gyógyszergyárZásban szokásos sók lehetnek savas csoportot létrehozó sók, (a peptid szabad amino csoportjával} , amelyek szervetlen savakkal, például sósavval, foszforsavval, vagy szerves savakkal például ecetsavval, o-xálsawal, borkősavval, maiéin savval és hasonlókkal képződnek. A szabad karboxi! csoporttal képzett sók szintén képződhetnek szervetlen bázisokból, például nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium-, vagy vashidroxidből, vagy olyan szerves bázisokból, mint például az izopropílamin, trimetiiamin, 2~eti!amino-etanol, hisztidin, prokain, és hasonlók,

IX. F. Vakcinák adagja és az adagolás módja

A vakcinákat a készítmény mennyiségi összetételével összeegyeztethető módon és olyan mennyiségben adagoljuk, amely proíilaktíkusan és/vagy terápiásán hatékony. Az adagolandó mennyiség, amely általában adagonként 5-250 mikrograrm antigén, függ a kezelendő egyedtói, az egyed immunrendszerének ellenanyag szintetizáló képességétől és az elérendő védettség mértékétől. Az adagolandó aktív összetevő pontos mennyisége függhet a kezelőorvos megítélésétől és egyedenként változhat.

A vakcina beadható egyszeri alkalommal, vagy előnyösen többszöri adagolással. A többszöri adagoláson alapuló eljárás szerint a vakcinázás kezdeti menetében l-lö-szeres adag adható, majd meghatározott Időtartam elteltével az immunválasz fenntartásához és megerősítéséhez szükséges további adagok következnek, például 1-4 hónap múlva a második adag, és ha szükséges, egy azt követő adag (adagok) néhány hónap múlva. Az adagolás menetét legalább részben az egyed szükséglete és a kezelőorvos megítélése határozza meg.

Az ímmunogén HCV antigént (antigéneket) tartalmazó vakcina ada~ «ί Ο' ί Γ” ♦χχ .,·

....

φ golhatő továbbá más immun-szabályozó anyagokkal, például immunglobulinokkal együtt,

II.G. Ellenanyagok előállítás® HCV epitopok ellen

A találmány szerinti immunogén. polipeptideket használtuk fel ellenanyagok termelésére, beleértve poliklonális és monoklonális ellenanyagokat. Ha poliklonális ellenanyagok előállítása a cél, a kiválasztott állatot (például egeret, nyalat, kecskét,lovat, stb.) egy HCV epitóppal rendelkező immunogén polipeptiddel immunizáljuk, Az immunizált állatokból szérumot gyűjtőnk, és. azt ismert eljárások szerint kezeljük. Ha egy íiüV epitop elleni poliklonális ellenanyagokat tartalmazó szérum más antigének ellen is tartalmaz ellenanyagokat, a poliklonális ellenanyagok immunaf 11πi tás-krom-a togr áfi áva1 ti s z t£ t hatők. Poliklonális an t i s z ér um előállítására, és feldolgozására szolgáló eljárások Ismertek a gyakorlatban, lásd például Mayer és Walk.er (1987). -Más eljárás szerint poliklonális ellenanyagok izolálhatok egy előzőleg HCVvel fertőzött emlősből.

HCV epitopok elleni monoklonális ellenanyagok szintén könnyen előállíthatők a gyakorlatban járatos személy számára.. Hibrídomák segítségévei monoklonális· ellenanyagok előállítására szolgáló általános eljárások jói ismertek. Folyamatos ellenanyag-termelő sejtvonaiak sejtfúzióval, és egyéb eljárásokkal,· például B Ximfo•citák onkogén DNS-sel való dírekt transzformációjával, vagy Spstein-Sarr vírussal való transzfekciójával állíthatók elő. Lásd például M. Schreíer és munkatársai, (1930); Hammeri ing- és munkatársai (1981)? kannett és munkatársai, (1980); lásd ezen kívül a 4 341 761, a 4 399 121, a 4 427 783, a 4 444 887, a 4 486 917, η

**♦·* c

*

a 4 472 500. a 4 491 632, és a 4 493 890 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat. HCV epitopok ellet előállított monoklonális ellenanyagok csoportjai különböző tulajdonságokra, például izotípusra, epi top· affinitásra, stb. vizsgálhatók.

Mind a HCV epi.topok, ellen termelt monoklonális, mind a poliklonális ellenanyagok különösen alkalmazhatók diagnosztikai célra, és azok, amelyek neutráliséinak, alkalmazhatók passzív immunterápia céljára. Monoklonális ellenanyagok különösen előnyösen használhatók anti-idiotípus ellenanyagok előállítására.

Az anti-idiotípus ellenanyagok immunglobulinok, amelyek egy olyan fertőző ágens antigénjének belső tükörképét hordozzák, amely ellen a védettséget létrehozni kívántuk. Lásd például A. Nísonolf, és munkatársai, (1981),’ és Dreesman és munkatársai, (1985) . Anti-idiotípus ellenanyagok előállítására, szolgáló eljárások ismeretesek a gyakorlatban. Lásd például Grzych <198-5), MaoNamara és munkatársai, (1984), és Vytdeghaag és munkatársai, (1985).

Ezek az anti-idiotípus ellenanyagok felhasználhatók ΝΑΗ3Ή kezelésére, NAMSH elleni vakcínázásra, NANBH diagnózisára, valamint HCV antigének immunogén régióinak felderítésére.

II.H. Immunvízs-gálő eljárás és diagnosztikai készlet Mind a találmány szerinti polipeptidek, mind az ellenanyagok felhasználhatók Immunvizsgáló eljárásokban HCV ellenanyagok jelenlétének, vagy a vírus, és/vagy HCV polipeptidek. (vagy építőnek; kimutatáséra például biológiai mintákban. At ímmunvizsgálö eljárások megtervezésének számos változata lehetséges, és sok formája ismert a gyakorlatban. A találmány szerinti imm.unvi.zsgáló eljárásokban legalább egy HCV eredtű vírus epitopot kaszaálunk. As egyik megvalósítási mód szerint az imunvlzsgáló eljárásókban HCV eredtő vírus, epitopok kombinációit használjuk. As. epitopok származhatnak ugyanazon polipeptidböl, vagy különböző vírus polipeptidekboí, é-s lehetnek különálló rekombináns vagy természetes poiipeptidekben, vagy együtt ugyanabban a rek.ombináns polípeptidben. Egy immunvizsgáló eljárásban felhasználhatunk például egy vírus epitop (epitopok) elleni monoklonáiis ellenanyagot, egy vírus antigén, epitopjai. elleni .aonoklonális ellenanyagok kombinációját, különböző vírus antigének epitopjai elleni monokionálís ellenanyagokat, ugyanazon vírus antigén elleni polikionális ellenanyagokat, vagy kölönböző vírus antigének elleni polikionális ellenanyagokat. Az eljárás alapulhat például kompetíoión, vagy közvetlen reakción, vagy szendvics típusú vizsgálatokon.. Az eljárásokban alkalmazhatok szilárd hordozók, vagy azok alapulhatnak- immunprecipítácíón. A legtöbb vizsgálat magában foglalja jelölt ellenanyag, vagy polipeptid felhasználását; a jelölés lehet például enzimatikus, fluoreszcens, kemilnmineszcens, radioaktív, vagy festék molekula. Ismeretesek olyan vizsgáló eljárások is, amelyek felerősítik a próba által kibocsátott jelet; ilyen vizsgáló eljárások például a biotint, vagy avidint felhasználó eljárások, valamint jelölt enzimet alkalmazó és az enzim által közvetített immunvízsgáiő eljárások, mint például az. ELISA eljárások (amelyet az alábbiakban ismertetünk).

Egy antr-HCV ellenanyag (ellenanyagok) kimutatására szolgáló immunvízsgáiő eljárás jellemzően magában foglalja az ellenanyagokat. feltételezetten tartalmazó vizsgálati minta, például egy biológiai minta kiválasztását és előkészítését, majd annak inka.....

hálását egy antigén hatású (például epltopot tartalmazó) HCV poiipeptiddei (polípeptídekkel) az antigén-ellenanyag komplex kialakulását lehetővé tevő feltételek mellett, ás az ilyen komplexek képződésének kimutatásét. Megfelelő inkubációs feltételek ismeretesek a gyakorlatban. Az immunvízsgálő eljárások lehetnek heterogén, vagy homogén típusúak, és szokásos, vagy kompétitív típusúak, de azokra nem korlátozódnak.

A heterogén változatban a polipeptid jellemzően egy szilárd hordozóhoz kötött, hogy az inkubálást kővetően megkönnyítsük, a minta elkülönítését a poiípeptídtől. Alkalmazható szilárd hordozók például a nítroeeilulős (például membránszurő, vagy mikrolemez rekeszeinek formájában) , polivinii-klorid (például, lapokban, vagy mikroiemez rekeszeinek tormájában), polisztírén latex (például gyöngyök, vagy mikroiemezek formájában) poiiviniiidinfluoríd {Immáron E -ként. ismert), diazotált papír, nylon membránok, aktivált gyöngyök, valamint Protein A gyöngyök. A heterogén változatban alkalmazhatók például Dynatech ImmulonR i, vagy 1'mmul.on.R 2 mikroiemezek, vagy 0.25 hüvelyk átmérőjű polisztírén gyöngyök (Preclsion Piastic Ball). Az antigén hatású polipeptidet tartalmazó szilárd hordozót a vizsgalati mintától való elválasztását követően és a kötött ellenanyagok meghatározása előtt jellemzően mossuk. A gyakorlatban mind szokásos, mind kompetitív eljárások Ismertek.

A homogén változat esetem a vizsgálati anyagot oldatban inkubáljuk az antigénnel. Ezt végezhetjük például olyan feltételek mellett, hogy bármely képződött antigén-ellenanyag komplex kicsapódjon. A gyakorlatban ezeknek a vizsgálatoknak mind szokásos, mind kompetitív formái ismeretesek.

4* *

* **«r«

A. szokásos változatban, az ellenanyag-antigén komplexet képző HCV ellenanyagok mennyiségét közvetlenül mérjük. Est végezhetjük annak meghatározásával, hogy az anti-HCV ellenenanyagokon egy epitopot felismerő jelölt anti-xenogen (például anti-humán) ellenanyagok a komplex képződésnek következtében kötődtek-e. A kompetitív változatban a mintában található HCV ellenanyagok mennyiségére ismert mennyiségű jelölt ellenanyag (vagy más versengd ligand} a komplexben a kötésre gyakorolt kompetitív hatásának méréséből következtethetünk..

Az antí-HCV ellenanyagot tartalmazó képződött komplexek, (vagy a kompetitív vizsgálatok esetén a versengd ellenanyag mennyisége) a. vizsgálat típusától függően számos ismert eljárás- bármelyikével kimutatható. Jelöletlen HCV ellenanyagok a komplexben kimutathatók például antí-xenogen üg-nek egy jelölöanyaggal képzett kenjugátuma (például egy enzim, mint jelölő anyag) alkalmazásával .

Olyan immunvízsgáló eljárásokban, ahol a vizsgálat tárgyét HCV polipeptidek képezik, a vizsgálati anyagot, jellemzően egy biológiai mintát antigén-ellenanyag komplexek kialakulását lehetővé tevő feltételek mellett anti-HCV ellenanyagokkal inkubáljuk. Különböző eljárások alkalmazhatóak. Alkalmazható például szendvics típusú vizsgálat, ahol egy szilárd hordozóhoz kötött ellenanyagot in'kubálunk a vizsgálati mintával, mossuk, a vizsgálat tárgya elleni második jelölt ellenanyaggal inkubáljuk, majd a szilárd hordozót ismét mossuk. A vizsgálat tárgyát annak kimutatásával határozzuk meg, hogy « második ellenanyag kötődött-e a .szilárd hordozóhoz.. Kompetitív forma esetében, amely lehet heterogén, vagy homogén, a vizsgálati mintát rendszerint ellenanyaggal >»«

*0 *»φ,χ és egy jelölt versengő- antigénnel inkubáljuk, vagy egymást követően, vagy egyszerre. Ilyen és- más eljárások ismeretesek a gyakorlatban. HCV fertőzés kimutatására szolgáló hatékony eljárások magukba foglalhatják epltopok sorának alkalmazását a fentiekben Ismertetettek szerint. Az epi topok, sora beépíthető egy, vagy több poli.pepti.0be. A különböző epltopok kimutatására szolgáló vizsgálatok lehetnek egymást követnek, vagy egyidejűek.

Az enzimmel jelölt imtínnadszorbcios próba (ELISA) alkalmazható antigén, vagy ellenanyag koncéntráció meghatározására. Ez az eljárás egy enzimnek egy antigénnel,, vagy ellenanyaggal való konjugációján alapul, es a mennyiséget a köbött enzim-aktivitás jelzi. Ellenanyag meghatározása céljára az ismert antigént egy szilára fázishoz {például egy mikrolemezhez, vagy műanyag kémcsőhöz;· kötjük, a vizsgálati szérum hígításaival inkubáljuk, mossuk, egy enzimmel jelölt anti-immunglobulinnal inkubáljuk, majd ismét mossuk. A jelölésre alkalmas enzimek ismertek a gyakorlatban, és lehet például tormáméroxidáz. A szilárd fázishoz kötődött enzim-aktivitást a fajlagos szubsztrát hozzáadásával, és a termék képződés, vagy szubsztrát felhasználás kolorimetriás meghatározásával mérjük. A kötődött enzim-aktivitás közvetlenül a kötődött ellenanyag mennyiségétől függ.

Antigén meghatározás céljára egy ismert fajlagos ellenanyagot kötünk egy szilárd fázishoz, hozzáadjuk az antigént tartalmazó vizsgálati anyagot, inkubálást követően a szilárd fázist mossuk, és egy második enzimmel jelölt ellenanyagot adunk hozzá. Mosást követően szubsztrátot adunk hozzá, majd az enzim-aktivitást koiorímetriásan mérjük, és antigén koncentrációra vonatkoztatjuk. Immundiagnózisra alkalmas és a megfelelő jelölt reagenseket

I *

* *Φ tartalmazó készletek a megfelelő anyagok, beleértve a találmány szerinti HCV epítopokat tartalmazó polipeptideket, vagy HCV epitopok ellen termelt ellenanyagokat, megfelelő kiszerelésben elöállíthatók, a vizsgálat kiviteljéséhez szükséges egyéb reagensekkel, anyagokkal és megfelelő vizsgálati utasításokkal együtt. Ili. Általános módszerek

A találmány megvalósítása során alkalmazható· általános eljárások megtalálhatók például az idézett irodalmi helyeken, különösen a 318,216 és a 338,232 számú európai szabadalmi leírásokban valamint az Idézett irodalomjegyzék szerinti irodalmi helyeken.

IV. Példák

Az alábbiakban a. találmány megvalósításának példáit írjuk le, kizárólag szemléltetés céljából, azok a. találmány tárgyát nem, korlátozzák. A találmány leírása alapján a szabadalmi, igények szerinti számos megvalósítási mód a. gyakorlatban járatos személyek számára nyilvánvalóak.

IV.A A HCV genom epítop térképezése Az alábbi példa egy epitóp térképezési kísérlet eredményét sze mlélteti, melyet az 1. ábra szerinti HCV1 poliprotein szekvencián végeztünk. Amint a 3-11. ábrák mutatják, a HCV izolátumok között heterogenitás mutatkozik, jelezve, hogy ezek az aminosav helyettesítések elvégezhetőek az alábbi oktamerekben. has HCV Izoiátunok azonos pozíciójú aminosavjának helyettesítésén tűi, bizonyos aminosavak szintetikus analógokkal, vagy töltésen, stb alapuló konzervatív helyettesítése is a. találmány tárgykörébe tartozik.

*** **♦ * * *' ·*·»» * » **♦ *« 4,/ * * * *♦ «*

XV.A.l Átfedő peptidek szinttézise Egy tömbhöz 8x12-es elrendzésben rögzített polietilén, tüskéket.

(Coselco Kimétopés, victoria, Australia) 20 térfogat/térfogat %os dimotilformamidban. ÍDMF) oldott piperidin oldatba helyezéssel készítettünk esd 30 percig, szobahőmérsékleten. A tüskéket ezután eltávolítodtűk, 5 percig mostuk BMP-ben, majd metanolban négyszer mostuk. (2 perc/mosás i , A tüskéket legalább 10 percig levegőn szárítottuk, és utoljára LW-ben 5 percig mostuk. 1 -hidroxibenzotríazolt (HOBt, 367 mi lí gramm.) rw-ben (80 miliüter) oldottunk, Fmoc~védett aminosavak kapcsolásához: Pmoc-L-Ala-OPfp, Fmoc-LCys(Trt) -OPfp, Fmoc-L-Asp(0-tSu) OPfp, Fmoc-L-Glu(OtBu) -öPfp,

Fmoc--L -Phe-OPfp, Fmoc-L-Gly-OPfp, Fmoc-L-His (Boci -OPfp, Fmoc-Llie-OPfp, Fmoc-L-bys(Boci-OPfp, Fmoe-L-Leu-OPíp, Fmoc-L-det-OPfp, Fmoc-L-Asn-OPfp, Fmoc~L-Pro-OPfp, Fmoc-L-Gin-OPfp, Fmoc-LArgtHtr) -OPfp, Fmoc-L-Ser (tBu) -ODhbt, Fmoc-L-Thr ( tBu)--ODhbt,

Fmoc-L-Val-OPfp, Fmoc-I>~Tyr-OP fp.

A védett amínosavakat mifrotiter lemezek rekeszeibe mértük HOBt hozzáadása mellett, és a tömböt úgy helyeztük a lemezek fölé, hogy a tüskék a rekeszekbe merüljenek, A készletet ezután, műanyag tasakos zártuk és 25 oG-on 18 órán át hagytuk, hogy az első aminosav a tüskékhez kötődjön. Ezután a tömböt eltávolítottuk és a tüskéket DMF-el (2 percig}, metanollal (4x2 percig), majd újra BMF-el (2 percig) mostuk,, hogy a kötődött aminosavakat megtisztítsuk és védelmüket megszüntesük. Az eljárást minden további kötődő aminosav estében addig ismételtük, amíg az összes oktamér elkészült.

A szabad h-terminális végeket ezután acíleztük, hogy a szabad amid csoportokat kompenzáljuk, mivel az epítopok többsége nem N~ *

terminálisán található és másként nem rendelkezne a szükséges pozitív töltéssel. Az aeetílesést úgy végeztük, hogy a mikrotitráiö lemez rekeszeit DMF/jégecet/arietilamín (5:2:1 tf/tf/tfi oldattal töltöttük meg és a tüskéket azokban 90 percen át 20 oCon tartottuk. A tüskéket ezután DMF-ben (2 percig), majd metanolban (4x2 percig) mostuk és legalább lö percig levegőn szárítottuk. Az oidslláncokat védő csoportokat úgy távolitettük el, hogy a tüskéket triflőrecetsav/fenoi/oitioetán (95:2.5:2.5 tf/tf/tf) oldattal kezeltük 4 órán át szobahőmérsékleten, polipropilén tasakban. A tüskéket ezután diklorometánban (2x2 percig), 5%-os di~ízopropiletí Iamín/öíklcrom.etánban (2x5 percig), diklorometánban (5 percig) mostuk, majd legalább 10 percig levegőn szárítottuk. A tüskéket ezután vízzel (2 percig), metanollal (18 órát) mostuk, vákumban szárítottuk és lezárt műanyag zsákokban szilika gél fölött tároltuk.

TV.A.2. Peptidek vizsgálata

A fentiek szerint készült peptid-oktamereket hordozó tüskéket először ultrahanggal kezeltük 30 percig 1% nátrium dódétólszulfátot, 0.1% 2-Kierkapto-etano.lt, 0.1 Mól/liter NaH2PO4-et tartalmazó pufferben, 60 oü-on. A tüskéket ezután többször vízbe mártottuk (80 oC), majd metanolban forraltuk (2 percig) és levegőn szárítottuk. A tüskéket ezután mikrotitráló lemezek rekeszeiben előkezeltük 200 mikről!tér blokkoló pufíerrel (PBS-ben oldott 1% ovaibumin, 1% HSA, 0.1% Tween és Ö.OS-% NaN3) 1 órán. át, cü-on, rázás közben, A tüskéket ezután mikrotitráló lemezek rekeszeibe mártottuk, amelyek 175 mikroliter HCV-vei fertőzöttnek diagnosztizált beteg szérumát tartalmazták és 4 oü-on éjszakán át inkubáltuk. A próbát három különböző betegből származó antiszérummal végeztük el. A FAA 3 663-s (A”) jelű minta erős HCV ellenes reakciót adott Western lenyomat technikával, HCV ellenes kompetitív ELISA próbával, a C1Q0-3 klánnal szemben HCV BLISA próbával (IGOO-szeres hígításnál), és >4+ R'f.BA reakciót adott a C1OÖ, az

5-1-1, és C33 klenokkal szemben (a C22 esetében a próbát nem végeztük el), (Az antigének és klánok elnevezése a 318,216 és 388,232 számú európai szabadalmi leírások, valamint az Ortho Díagnostics Systems, Inc. által forgalmazott HCV ímmux^próbákra vonatkozó szakirodalom szerintiek.) A tömény plazmát 500-szorosára hígítottuk blokkoló pufferben. A FAA 33028 (B'd jelű minta erős HCV ellenes reakciót adott Western lenyomat technikával,

HCV ellenes kompetitív ELISA próbával, a C100-3 klánnal szemben HCV ELISA próbával (SOO-szoros hígításnál) , és >4-;· RISA reakciót adott a C100, 5-1-1, C33 és €22 Ilonokkal szemben. A poliklonálís antiszérumot protein A oszlopon részlegesen tisztítottuk és blokkoló pufferben 20-0-szoros hígításban használtuk. A ?AA s32S31 PC) minta mérsékelt HCV ellenes reakciót adott Western lenyomat technikával (3+·) , HCV kompetitív ELISA próbával , a C1ÖG-3 klonnal HCV ELISA próbával (54-szeres hígításnál·) és 3*, illetve 4+ R1BA rekelő t mutatott a Clöö, illetve 5-1-1 kiőnokksl szemben (a próbát a. C3 3o és C22 klánokkal nem. végeztük el) . A poliklonálís ellenanyagot protein A oszlopon részlegesen, tisztítottuk és blokkoló pufferben 500-szoros hígításban használtuk. A tüskéket ezután PBS/Tween 20 pufferben mostuk (4x'ld percig) szobahőmérsékleten, majd azokat míkrotítráiö lemezek tormaperoxidázzal jelölt kecske anti-humán immunglobulin antíszérumot (175 mikről!tér térfogatban, blokkoló pufferben 2000-szeres hígításban) * * “ ♦ M «φ tartalmazó rekeszeiben inkubáltuk egy órán át, 25 oC-on- rázás mellett. Az anti-humán anti szérum, humán immunglobulin könnyű és nehéz láncára fajlagos, és reagál mind az IgG, mind az IgM osztályokkal. A tüskéket újra mostuk PBS/Tween 2S pufferrel (4 x 10 perc) szobahőmérsékleten. Szubsztrát oldó puffért készítettünk NaHIPOi (1 mol/i, 200 ml) és citromsav (1 mol/l, ISO m.l) desztillált vízzel. 2 liter őssztéríegatra hígítva, és a pH értéket négyre állítottuk. Közvetlenül a felhasználás előtt 10Ό ml pufferhoz: azino-di-l-stilbenztíazodinszulfonátot (ABTS, 50 mg: és hidrogén-peroxidot (0,3 mikroliter/ml) adtunk szubsztrát oldat készítése céljából. A mikrotítráló lemez rekeszeibe szubsztrát oldatot (150 mikroiiterj mértünk, majd a tüskéket a rekeszekbe mártottuk és sötétben 25 oC-on inkubáltuk. A színreakció kialakulását kővetően a reakciót a tüskék kiemelésével állítottuk le és az oldat abszorpcióját 405 nanométer hullámhosszon mértük.

Az alább felsorolt oktamer peptidek anti-HCV antiszérumokkal immunológiai reakciót mutattak. A mindhárom antiszérummal reagáló peptideket epi topként jelöltük, míg a csak egy, vagy két antiszérummai reagálók gyenge -epi topként jelöltük. (”“-ként jelölve).

A különlegesen erős epi topokat számok helyett, betűkkel jelöltük (például SpAA).

AAü	szekvencia	AA#	szekvencia
23	KSPGCGQA		87	GNBGCGWA
24	SPGGGQAV	Bp2
25	PGGGQAVG		88	NEGGGWAG
25	CGGQAVGG		89	EGCGW&GW
27	GGQAVGGV		90	GCGWAGWL
28	GQAVGGVY		' 91	GGWAGWLL
29	QAVGGVYL		82	GWAGWLLS
2 0	AVGGVYLL		9 3	WAGWLLSP
31	VGGVYLLP		94	AGWLbSPR
32	ggvyll.fr		95	GVLLSPRG

33	GVYLLPRR		96	YLLSPRGS
34	VYL.LPS.RG		97	LíjSPRGSR
35	YLLPRRGP		98	LSPRGSRP
36	LLPRRGPR		99	SPRGSRPS
66	PKARRPEG	api	100	PRGSRPSW	Ep3
6?	KARRPSGR		101	RGSSPSWG
68	ARRPEGRT		102	GSRPSWG?
69	RRPEGRTW		10 3	SRPSWGPT
7 0	RPEGRTWA
71	PEGRTWAQ		186	TVPA8AYQ	Sp4
72	EGRTWAQP		187	VPASAYQV
7.3	GRTWAQPG	EpA[l8S PA8AYQVR	189
/ 4	R.TWAQPGY		ASAYQ7RA
7 5	TWAQPGYP		190	SAYQVRYS
7 6	WAQPGYPW		191	AYOYRNST
7?	AQPGYPWP
7 8	QPGYPWPL		206	DCPNSSIV
79	PGYPWPLGO
80	GYPWPLYG		22 3	TRGCVPCV
81	YPWPLYGN
82	PWPLYGNE		9 ?	EGNASRCW	EPS
8 3	WPLYGEEG
84	PLYGNEGC		256	tqlrrhid'
85	LYGNEGCG
86	YGNEGCGW		2 8 6	LVGQLFTp·'	Ep
			297	RHWTTQGC
			29 9	WTYQGGNG
			321	MRHNW'SPl
			34?	DMIAGAHW	Sp7
			35?	LAGPAYFS	Sp8
413	EINTRGSW	Epö	594	YSRGGSGP	PA
.1. ¾	INTNGSWH		595	SRCGSGPW
			596	RCGSGPWL
432	SENTGWLA”		597	CGSGPWLT
			593	GSGPWLTR
465	EDQGWGP1	SpC	599	SGPW’LTPR
466	DQGWGP1S		600	GPWLTPRC
467	QGWGPISY		601	PWLTPRCL
468	GWGP1SYA		602	WLTPRCLV
469	WGPISYAN		603	LTPRCLVD
47 0	GPISYANG		6 0 4	TRRCLVDY

471	PISYANGS	60 5	PRCLVDYP
		606	ECLVDYP7
430:	PDQRPYCW' SpD	607	CLVDYPYR
481	PQRPYCWH	603	LVDYPYRL
432	QRPYCWHY	609	VDYPYRLW
433	RPYCWEYP	610	SYPYELWH
4 8 4	PYCWHYPP	611	YPYRLWHY ES
		612	YPYRLWHYP
500	KSVCGPVY Sp9	613	YRLWHYPC
501	SYCGPVYC
502	VCGPVYCE	641	SAACWTR
521	ESGAPTYŐ EplO	,&p I z
		662	LSPLLLlIEpl3
540	NNTRPPLG EpE	6 5 3	SFLLL111
541	N'TEFPLGD	664	PLLLIUQ
54 2	TRPPLGW	665	LLLIIIQW
543	RPPLGNWr
544	PPLGNWFG	685	LSTGLIHlZ
545	PLGNWFGC
54 5	LCWRGCT	705	VGSSIÁSW~
547	GWFGCTW	706	GSSTASWA
548	YWFGCTW5
549	WGGGTWYY	729	AEVCSClYSpl4
579	LHCPTÖCP”	7 82	WPGAVYT
		783	VFGAYYTF
		7 34	PGAVYTFY
		785	GAVYTFYG
		7 86	AVYTFYGY
		7 87	VYTFYGYY
		788	YTFYGYYP
		789	TFYGMWPL
		SOI	laepqray·
351	RVEAQLHV EpH	1384	VXYGGEÜL Ep20
852	VEAQLHW
853	EAQL.HW!	1410	LG2EAVAY Ep21
854	AQLHVWI?	1411	GI.NAYAYY
855	QLHVWXPP
		1454	CNTCV1QT~
893	LAVPGPLW~
		1492	GRGKPGIY Sp22
916	QGLLRECA~	1493	RGXPGIYK

928	M1GGÜYVQ	Epl 5
946	TGTY7YNH	Epl
952	NHLTPLRD	SpG
952	HLTPLRDW
954	LTPLRSWA
1826	LAPITAYA
187 2	TCINGVCW	EpK
110 9	LVGWPAPQ	Epl 6
1171	GPAGHAVG	Epl 7
1113	PAGHAVGT
1114	AGRAVG1F
1115	GHAVGIFR
1116	HAVGIFRA
1117	AVG1FRAA
1213	VVRQSSQV
1240	VPAAYAAQ'
12 60	ATLGPGAY'
1288	GVRTTTGS Epl 8
1231	VRITTGSP
1282	RITTGSPI
1283	ITTGSPIT
1284	TTGSP1TY
1285	TGSPITYG
1222	DATSILGl’
1338	TAGARLVV'
13 71	GEIPFYGK	Epl 9
1694	IIPDRBVL	EpM
1695	IPDREVLY
17 10	ECSQHLPY gpN
17 11	CSQHLPYI

15 32	PAETTVRL Ep23
1533	ASTTVRLR
1534	ETTVRLRA
1535	TTVRLRAY
1568	GVP1GLIH Ep24
1561	VPIGLTHI
1531	ENLEYLVA
1567	NLPYLVAY
1568	LPYLVAYQ.
1569	RYLVAYQA
1570	YEVAYQAT
1571	LVAYQATV
1572	TAYQATVC
1573	AYQATVCA
1574	YQATVCAR
157 5	QATVCARQ
157 6	ATVCARQA
1577	TVCARQAP
16 0 1	PRSWDQMW
160 2	PSW8QNWK
1603	SWDQMWKC
1604	WDQMWKCL
1605	DQMWKCLI
1606	QMWKCL7R
1607	WKGLIRL
1615	KPTEHGPI Ep27
1616	PTLHGP1P
1617	TERGPIPL
1613	LHGPIPLL
1619	HGPIPL.LY
1620	GPIPLLYR
1655	WTSTWL
1366	SECTIPCS EpS
1967	SCTIPCSG
1968	i. mC S Gíó
1963	TIPCSGSW

2 <· φ

SQHLRY1E	1939 2000	LMPQLPG.I GFQLPGIP	EpT
EKQKALGL	S.pO		2001	PQLPGIFS
KQKALGEL			200 2	QLFGIPEV
			200 3	LFG1PSVS
E1EWAKLH	EpP		2004	PGIPSVSC
TSWAMW			2005	GIFEVSCQ
SWAKLMW			2006	IPEVSCQR
WAKLMWNE			2007	FEVSCQRG
AKLHWNE1			.ώ 8 U 8	EVSGQRGY
			2009	VSCQRGYK
LRGNPAIA			2010	SCQRGYKG
			2011	CQRGYKGV
LFNILGGW	Ep28		2012	QRGYKGW
			2013	RGYKGWR
AAPGAATA”			201.4	GYKGVWRG
1LAGYGAG	Ep23		2024	IRHTRCHC
VNL.1FA11.'		r p x	2048	VGPRIGRN	EpG
PGEGAVQN	EpG		2049	GPRICRYY
GEGAVQWi			20 5 0	PRICRNYW
EGAVQWMN			20 51	RICHNYWS
GAVQW81R			205 2	ICRNYWSG
AVQwMNRL			205 3	CRNYWSGT
VQWMMRL1			2054	RNYWSGTE
			205 5	NYWSGTEF
RGNRVSP1	EpR		205 5	YWSGTEPI
			2057	WSGTEPIN
AAARVTAI	Ep3O
AAEVTAIL			2071	TPLPAPNY	Ep32
AR'VTA1LS
EVTA1LSS			2088	EEYVIRQV	EpV
VTAILSSL			2089	EYVIRQVG
TAILSSLV			2090	YV1RQVGD
AILSSLVT			2091	VIRQVGDF
1LSSLVTQ			2092	1RQVGDFH
L.SFLVTQL			2093	EQVGOFHY
SSLVTQLL SLVTQLLR LVTQLLRR			2108	DNLKCPCQ'
SIELDGVR	EoW		2230	REAQALPV	EpZ
1SLDGVRL	<2281	EAQAL:PVW>-----------	—i>
ELDGVR1H			2282	AQALPVVA

φ φ φ φ φ φ >· φ

2125	EDGVRLHR		2283	QADPWAR
2125	DGV.RLHE.P		2284	ALPVWARP
2127	GVE.LHRF.A		2285	LPWARPD
2128	VREHRFA?		2286	PWARPSY
2129	RLKRFAP?		2287	WAPFDYH
2130	LHRFAPPC		2288	WARPDYNP
2131	HRFAPPC.K		2289	ARPDYNPP
2132	RFAPPCKP		2290	RPDYNPPL
2133	FAPPCXP.L
2134	APPCKPEE		2325	PPPRRKRT
2135	PPCKPLLR		232 6	PPRKR.RTV
2136	PCKPLLRS		2327	PRKKRTW
2137	CXPELRES
2138	RPLLEEEV		2 345	AEIASRSE
2139	PLLREEVS		2 846	SLASRSEG
2140	LLREEV'SF	SpX	2347	LASRSEGS
2141	LRESVSER		2343	ASESEGSS
2142	PEEVSFEV		2349	SRSEGSSS
2143	EEVSFRVG
2144	SVSFRVGL		2382	AE-S-Y S SEP
2145	VSFRVGLH
2146	SFRVGLHB		24öl	SIGSVSTV
2147	FRVGLHEY		Ep38
2148	RVGLHEYP		2417	VVCCShSY
2165	EPEPDVAV		SpAA
			2418	VCCSHSYV
2187	GRRLARGS“		2419	CCSMSYWI
			2420	CSMSYW1G
2226	L ISÁRELV	EpY	2421	ShSYWIGA
7 Λ Λ 7 2228	ISAMLLWR EANLLWRQ		2422^S.WIGALp-d
2229	ANLLW.RQS
2230	NLLWRQEM
2231	LLWRQEMG
2232	LWRQEMGG
2244	VESENKVV	Ep33
2245	ESENKVV1
2246	SENKVVIL
2247	EHXVV1LF
2248	NXVV1LDS
2249	KWILDSF
2250	VVILDSFD

Ερ35

Ερ'36

Ερ37

* ♦ V

2257	E.ISVPAEX Sp34
24 39	QKLFINAB EpB'-B		260 2	LFLAVRGS
2440	K.Lf ií\AijÖ	EpUU .........
2441	LPJNALSN		2603	RLAYMGSS
2442	PINALSNS		2604	LAVNGSSY
2443	INALSHSE		2605	AVYGSSYG
2444	NALSRSLE		2606	VRGSSYGE
2445	ALSRSLLR		2607	MGSSYGEQ
2448	ESKSLERH		2608	GSSYGSQR
2447	SNSELRHH		2609	SSYGS.QEY
2448	NSLLRHHN		2610	SYGEQRVE
244«	SLLRHHNL		2611	YGEQEVES
2450	L1RHHALV		2612	GEQRVEEL
24 51	LRHHNLVY
2452	RHKNLVYS		2632	KTFHGFSY ;
2453	HHNLVYST	Ep41
245 5	NEVYST1S		2633	TPMGFSYD
2456	EVYSTISR		2634	PNGESYDT
			2 635	MGFSYDTR
24 6«	QKKVTEDE Sp39		2636	GFSYDTRC
247 0	KXVTFDRL		2637	FSYDTECS
2471	KVTFBRLQ
2472	VTEDRLQV		266 0	YQCCOLD?
247 3	TFDHLQVL
2474	EDRLQVLD		2676	LTERLYVG
247 5	.DRLQvLÜS	EpSE
247 6	REQVEDSH	2677	TERLYYGG
			267 8	ERLYVGGP
2495	ASKVKANL~		2679	RLYYGGPL
2533	RKAVTHIN SpCC		2688	NSRGENCG
2534	ΚΑΥΤΗ1NS	EpFF
			2689	SRGENCGY
257 3	GRKPARE2 Sp40		2690	RGENCGYR
2574	RKPARLIV		2691	GSNCGYRR
2575	KPARLIVF		2692	SNCGYRRC
2576	PARLIVFP		2693	NGGYRRCR
257 7	ARLIYFPD
257 8	RLIVFPDL		2707	TSCGNTLI Ep4

2721 AACRAAGE~

2757 AFTEAMTR

Ep4 3

5 8 FTSÁMTRY ♦**»

		2759	YEANYRYS
		2760	EAATRYSA
		2761	ANIAYSAP
		2 7 6 2	NYRYSAPP
2773	DLEEIJSC Ep44	287 3	DLPPPIQE Ep47
27 80	LEETISCS	2879	LPPIIQRE
		2880	PPIIQRLH
27 94	HDGAGKRV	2881	PYIQRLHG
Ερ45		2882	YYQELHGE
27 9 5	DGAGKRVY	2883	YQRLHGLS
279 8	GAGKRVYY	2 884	QRLHGESA
27 97	AGKRVYYE	2885	REHGESAE
27 98	GKRVYYLT	2886	LHGLSAES
27 99	KRVYYLTR	28 87	HGHSAESL
280 0	RVYYEYRD	2888	GESAFSEH
2801	VYYLTEDP	2839	LSAFSLHS
2 8 0 2	YYLTRDPT	289 0	SAFSLHSY
		2891	AESLHSYS
2817	VETARHT?	2892	FSLHSYSP EpGG
		289 3	SEHSYSPG
2818	ETAEHTPV	2834	EHSYSEGE
2819	TARKTFHV	239 5	HSYSPGEI
2820	ARHTPVHS
2 821	RRTPVHSV
2822	HTPVHSVL
282 3	TPVNSVEG
2824	P7NSVLGN
282 5	VNSWLGNI
2828	NSWECNT2
2827	SWLGNIÍM
2828	WLGN1IME
2823	EGNIYNEA
2830:	GNIIMEAP
2831	Y11REAP7
2 8 3 2	1IMEAPTL
283 3	INEAPTLV
2834	NEAPTLVA
2833	EAPYLVAR
2830	APTEWARM
2837	PTEWARMI
2838	TLWARAIL
2833	AVARAIÉN
2 34 0	VARNYLMY
2841	ARI4IENTR
2342	RNIENYHE

**

2843 MILMTHFE

2883 LDCEIYGA Ep46

2884 DCEIYGAC

2885 CEIYGACY

2866 SIYGACYS

2867 IYGACYSI

2912 LGVPPLRA Bp48

2913 GVPPLRAW

2914 VPPLRAWH

2938 AAICGKYL Ep49

2939 AICGKYLE

2940 ICGKYLÉN

6 6 BLSGWETA. EpHE

2984 YSHARPRW Epll

Az

IV.8. Differenciáló alábbi vizsgálatot a korai és vizsgálat a késői antigének megkülönböztetése céljából végeztük. A korai antigénekre jellemző ellenanyagok hamarabb mutathatók ki és használhatok HCV fertőzés diagnóziséra.

Egy magas AL?~ai rendelkező, de anti-C10Q-3 ellenanyagra negatív betegtől sorozatos vérmintát vettünk, A teljes áthangoiődást {C109-3 pozitív!tás 5 megelőző őt vérmintát összekevertük és a vizsgálatban 200ö~szeres hígításban használtuk, A vizsgálatot a fenti IV.A, fejezetben ismertetettek szerint végeztük, azonban egy tüske készletet torma-peroxidázzal jelölt kecske anti-humán IgG fajlagos antiszérumban, mig a másik készletet tormaperoxidázzal jelölt kecske anti-humán IgM fajlagos antiszérumban inkubáltuk. Az Igd ellenanyagokkal immunológiai reakciót mutató epitopok korai epitopok.

X ♦·** 9 ♦ * *

Ezek az -eredmények azt mutatják, hogy a korai epitopok többsége körülbelül a 480-850. aminosav régióban található, különösen erős IgM epitopok voltak az 506, 510, 523, 553, 562, 580 számú és sz 590-820. régióban található aminosavakkal kezdődő oktamerek. Az ebbe a régióba tartozó epitopokkal rendelkező antigéneket alkalmazó vizsgáló eljárások egy koraibb időpontban teszik, lehetővé a HCV fertőzés diagnózisát, mint más antigéneket alkalmazó vizsgáló eljárások.

Vizsgáltunk továbbá öt, nyitott szívműtét során adott transzfűsiót követően kialakult HAüS hepatitisben szenvedő betegtől sorozatosan vett plazma mintákat, a vizsgálatokat 3-12 éven át végeztük. A kezdeti vérvételek kozott kevesebb, mint egy hét telt el. Mindegyik mintát vizsgáltuk EIA próbával egy mag antigén (C22S , két burok antigén (El és E2) és három nem-struktűr régió antigénnel (C33c, ClöQ és NS-55 szemben termelődött fajlagos IgG és IgM immunglobulinokra. Égy találtuk, hogy a C22 és C33e elleni XgM válasz megelőzte az IgG választ. Az NS5- szintén váltott ki Igik választ, de ez nem előzte meg az ezen antigén elleni IgG választ.. így olyan próbák készíthetők, melyek képesek a fertőzés nagyon korai szakaszának meghatározására a G22 és C33o régiókból származó epitopok felhasználásával és azok fajlagos IgM kötődését vizsgálva. A C33c régió elleni ellenanyagok maradtak fenn a leghosszabb lóéig, ami arra utal, hogy a C33c antigént alkalmazó diagnosztikai próbák a legmegbízhatóbbak..

XV, C. Szekvencia eltérések különböző egyénekből származó HCV i z o lát umokb an

Olyan HCV izolátumokat azonosítottunk humán betegekben, akik egy ♦ ·»

** része önti-Cl00--3 ellenanyagokra nézve .szerolőgiailag pozitív volt (EC10 ellenanyag negatív volt; , amelyek a CD-C/HCVi-tői eltérő szekvenciákat tartalmaztak. Ezen új izolátumok .azonosítását a HCV genom szakaszainak klónozásával és szekvenálásával végeztük, amelyet CDC./HCI szekvenciákat alkalmazva PCR technikával felerősítettünk. Az eljárás során a találmány szerinti HCV cDNS szekvenciákon alapuló primereket és próbákat alkalmazzuk. Az eljárás első lépése reverz transzkriptáz segítségével a HCV genomnak, vagy annak repiikatív közti termékének megfelelő cDNS szintézise. A HCV cDNS szintézisét követően és az ampilfikácíőt megelőzően a mintában levő RNS~t. a gyakorlatban szokásos módon roncsoljuk, A HCV .cDNS adott szakaszát ezután megfelelő primerek alkalmazásával amplifíkál juk.. Az amplífikélt szekvenciákat klónozzuk és az azokat tartalmazó kiónokat egy olyan próbával azonosítjuk, amely a primerek közötti szekvenciával komplementer, de amely nem fedi át a primereket.

IV.C.l. Emberből izolált HCV izolátumok az Egyesült Államokban HCV virionok forrásaként használt vérmintákat az Egyesült Államok Vörös Kereszt szervezetétől (American. Red Üross, Chariotte,

Észak-Karolina) és a Kansas Állami Vérellátó Központtól (Community Blood Center of Kansas City, Missouri) szereztük be.

A mintákat a HCV C10D-3 antigén elleni ellenanyagok jelenlétére szűrtük ELISA próbával és kiegészítő Western lenyomat technikával tormaperoxidázzal jelölt polikionális kecske anti-humán ellenanyagot használva az anti-HCV ellenanyagok kimutatására. Az első, illetve a második forrásból származó két minta, a #23, illetve a #27 jelű , ezen vizsgálatok szerint pozitívnak bizonyult. Ezen minták szérumában levő vírus részecskéket Bradley és munkatársai •0 ♦ x‘ <*»» » » « .

(1985) leírása szerinti feltételek mellett ultracentrifugálással izoláltuk. A részecskékből az RNS-t proteináz-K (10 mikrogramm/ml) és SDS (0,1 %) emésztéssel vontuk, ki; az emésztést egy érán át 37 oC-on végeztük. A vírus RNS-t kloroform-fenol extrahálá.ssál. tovább tisztítottuk.

Az RNS készítményben levő HCV RNS-t reverz transzkripcióval cDNS-sé alakítottuk. Miután a cDNS mindkét szálát szintetizáltuk, az igy keletkezett cDNS-t PCR eljárással amplifikáltuk. Mindegyik

HCV izolátumbői három-három kién HCV cDNS-ét szekvencia analízisnek vetettünk alá. A vizsgálatot alapvetőén Chen és Seeburg (1985) eljárása szerint végeztük. A 23-as, illetve 27-es mintákból származó klánok konszenzus szekvenciáit a 3., illetve a

4. ábra mutatja. Ezek az ábrák mutatják a változó szekvenciákat, valamint a konszenzus szekvenciákban kódolt aminosavakat is.

Az 5. és 6. ábra a 23-as és a 27-es jelű minták és a HCV1 pozitív nukleotid szál szekvenciájának. (5. ábra) , valamint kikövetkeztetett aminosav sorrendjének (6. ábra) összehasonlítását mutatja. A

HCV1 6. ábra szerinti aminosav sorrendje a HCV poliprotein 129. töl a 467.-ig terjedő aminosavjának felel meg, amelyet a HCV genomiális RNS nagy ORF~je kódol. Az 5. és a 6. ábra szerint léteznek különbségek a három izolált klón szekvenciái között. A nukleotídok, illetve aminosavak szintjén jelentkező szekvencia eltéréseket közvetlenül alatta, táblázatban foglaltuk össze. A táblázatban az S, illetve NS1 jelű polipeptidek a 130.-tól a körülbelül 380.-ig, illetve a 330.-tól a körülbelül 47ö.~ik aminosavakig terjednek, mivel ezek a domének már korábbról ismertek. A számozás a feltételezett iniciátor metionintói kezdődik. Az S és az NS1 elnevezés a polipeptideket kódoló székκ ««*

Κ* ** ***:

».♦ X »·« * venciák pozícióján alapul, a Flavivírus model szerint,. A fent említettek szerint azonban újabb bizonyítékok alapján nincs teljes egyezés a HCV és a Flavivírusok között a vírus domének, különösen a feltételezett E./NS-1 -doménok tekintetében. Valójában a HCV polipeptidek és az azokat kódoló bőmének lényeges eltérést mutathatnak a Flavivírus modellhez képest.

Sz^kysnciajwmológia

Ködolö.._nnkleotid_Kódglt_jrninosuy

	összes	S	NS 1	összes S	NS1
	%	%	%	% %	%
HCV1/HCV23	9 3	95	91	92 95	87
HCV1/HCV27	SS		84	89 95	82
HCV23/HCV27	89	'93	SS	90 9 3	84
Sár léteznek	eltérések	az újonnan i	zolált HCV szekvenciák között,
a 23-as és 2?	-es (HCV23	-nak és	HCV2	7 -nek neve ze 11)	minták kiönc-

zott szekvenciái egyaránt 1019 nukleotídot tartalmaznak, jelezve, hogy a kiválasztott klón ok -ezen régiójában nincsenek deléciós és addíciós mutánsok. Az 5. és 6. ábra azt is mutatja, hogy az izolált szekvenciák nincsenek átrendezve ebben a régióban. A HCV1 és más HCV izolátumok konszenzus szekvenciáinak összehasonlítását foglalja össze a fenti táblázat. A HCV1 csimpánz izdátum, és az emberből izolált HCV-k közötti szekvencia eltérések körülbelül azonos mértékűek, mint az egyes humán eredetű izolátumok közötti ex.

Érdekesség, hogy a feltéteze-tt doménok közül kettőnek a szökvén cla eltérése nem egyforma. Egy feltételezett S régió szekvenciája relatíve állandónak, és a régióban random szétszórva látszik.

xí ί

Ezzel szemben egy feltételezett NS1 régió magasabb fokú variabilitást mutat mint az egész szekvencia, és úgy tűnik, hogy az eltérés a feltételezett poliprotein feltételezett N-terminális végétől 3'irányban 70 aminosav távolságra levő agy 28 aminosavat tartalmazó hípervariábilis batüremkedésben található.

Vitatható, hogy az észlelt eltérések az amplifikálás folyamán keletkeztek, kicsi a valószínűsége azonban annak,, hogy valamennyi eltérés abból származik. Becslések szerint a Tag polimeráz ciklusonként 10 kilobázis DNS templátra. vonatkoztatva körülbelül egy bázis hibát visz egy szekvenciába iSaíki és munkatársai,(1988)}. Ezen becslés alapján legfeljebb 7 hibát vihettünk a szekvenciába az 1019 házispár hosszúságú DNS fragmens PCR ampiifikSeiőja során, Ezzel szemben a HCV-23, illetve a HCV27 három szubklönja 29, illetve ii bázis eltérést mutatott. Az alábbiak ezt feltételezik, hogy ezek az eltérések a természetben előfordulnak,. A bázis cserék körülbelül 60%-a csendes mutáció, amely nem. változtatja meg az aminosav sorrendet. A Tag polimerás által a PCR amplifikálás során, bevitt változások, várhatóan ranöom fordulnak elő; eredményeink szerint azonban a variáns szekvenciák legalább egy jellemző régióban csoportosulnak.

IV. C. 2, Humán HCV izolátumok Olaszországban és az Amerikai Egyesült Államokban

Különböző izolátumok HCV RNS szakaszait a HCV/oPCR technikával ampiísikáltuk, Ezek a szakaszok, egy körülbelül 0.6 kilobázistoj

1.6 kilobázisig terjedő régiót fognak át a feltételezett HCV poliprotein. metionint kódoló start kódonjától 3’ irányban. Az izolátumok HCV fertőzött egyénekből vett biológiai mintákból * U.

» » « ,χ származnak. Pontosabban, a HCT IS egy amerikai beteg plazmájából, az EC1 és EC10 egy olasz beteg májbiopsziás mintájából, és a Th egy amerikai beteg perifériás vérének mononukleocita frakciójából származik. Összevethető HCV RÉS szegmenseket izoláltunk egy csimpánzból.

A humán plazma mintákból az .RNS-t a fenol;CHC13:izoamii alkohol extrahálássai vontuk ki. Vagy 0.1 mililiter, vagy 0.01 mililiter plazmát 1.0 mii.1.1 itér végtérfogatig hígítottunk. 10-től 4.0 mikrogramm/mi Ilii tér poliadsniisavat tartalmazó TENS/proteináz K/EDS oldatban (0.05 mól/liter Tris-HCI, pH 8,0, 8.001 möl/liter EDTA, 0.1 mől/liter HaCl, 1 mg/miláiiter proteinás K, 0.5% súly/térfogat SSS5 és 37 oC-on 60 percig inkubáltuk. A fenti proteináz K emésztés utáni plazma frakciókat TE telített fenol (pH 5.)(50 miiimől/líter Tris.HCI, pH 8.0, 1.0 milimői/liter EDTA) extraháiással protein mentesítettük. A fenol fázist centríingái ássad. elválasztottuk és 0.1% SDS tartalmú TEHS pufTérrel újra extraháltuk. Az extraháiásofcből származó vizes fázisokat kétszer extraháltak azonos mennyiségű fenol/klotoform/izoamii alkohol [1:1(99:1)] keverékével, majd kétszer azonos mennyiségű kloroform/ízoamil alkohol 99:1 arányú keverékével, Centrifugálással elválasztottuk a fázisokat és a vizes fázist 0.2 mól/liter Ea-aoetát végkoncentráciőra állítottuk., majd a nukieinsavakat két térfogat etanol hozzáaőásávafc kicsaptuk. A precipítált nukleinsavakat ultrscentrifugatással nyertük ki (SW 41 rotor, 36K, 60 perc, 4 oC, vagy mikrocentrifaga.., lök, 4 oü) .

A májbiopszia mintákból kivont RNS Dr. F< 3oníno-től származik (Ospedaie Maggiore di S. Ciovanni Battista, Torino, Olaszország).

A mononukleocita frakciót a beteg vérmintájának Fícoll-Pague

(Pharmacia Corp.) gradiensen való elépítésével nyertük, a gyártó utasításai szerint. A frakció teljes RNS tartalmát a Choo és munkatársai által leírt guan.idin tiocianát eljárással végeztük.

A mintákból. HCV oDNS-t reverz transzkríptáz alkalmazásával készítettünk. Etanol precipítácíot követően a kicsapódott RNS-t, vagy nukleinsav frakciót megszórítottuk, majd DEPC kezeit desztillált vízben szuszpendáitűk. A nukleinsavak másodlagos szerkezetét 10 percig 65 oC-ra történő hevítéssel szüntettük meg majd a mintákat azonnal, jégen hűtöttük. A cDNS szintézis 1-tői 3 mikrogramm teljes máj RNS, vagy 10-től 100 mikroliter plazmából kivont nukleinsav frakció (vagy RNS) felhasználásával történt. A szintézishez reverz transzkríptázt használtunk 25 mikrolíter reakciótérfogatban, a gyártó (BRL) által előirt eljárás szerint.

A cDNS- szintézishez szükséges valamennyi reakció elegy 23 egység Rnasín (Fisher/Promega) ribcnukleáz gátiét tartalmazott. A cDNS szintézist követően a reakcióelegyet vízzel hígítottuk, 10 percig forraltuk, majd jégen gyorsan hűtöttük.

Minden minta sort kér kör PCR amplifíkáolónak vetettük alá, A reakciókhoz a primereket úgy választottuk meg, hogy az Envn valamint aCEnvR nevezetű régiókat amplífikáiják, Az EnvL régió a 699-1243. nukieotidokat, és a feltételezett 117-308.

aminosavakat tartalmazza; az EnvR régió a 1213-162S. nukieotidokat tartalmazza, -é.s a feltételezett 300-4 08. aminosavakat kódolja (a feltételezett aminosavakat a feltételezett metionin kezdő kődontói kezdve számoztuk),

A PCR reakciókat lényegében a gyártó utasításai szerint végeztük (Cetus-Perkin-Eimer), azzal a kivétellel, hogy ahhoz i mikrogramm ribon.ukleáz-A-1 adtunk. A PCR amplífíkáciöt 30 cík-

luson. át végeztük, az alábbi rend szerint:. 94 oü, (1 perc), 37 oü (2 perc), és 72 cC (3 perc), és az utolsó ciklusban 72 oü-on 7 perc. Ezután a mintákat fenol:CHüi3 elegyével extraháltuk, kétszer etanolial kicsaptuk, 10 mmol/l TrisHCl pufferben (pH 8,0) oldottuk, és üentrÍcon-30 {Amiconj szűrővel koncentráltuk. A fenti eljárás hatásosan eltávolítja a 30 nukleotiánái kisebb méretű oligonukleotidokat; így az első kór PCR ampiiiikáciőbói származó primereket eltávolíróttuk,

A üentricon-3ö szűrővel koncentrált mintákat ezután egy második kor PCR amplifikáclónak vetettük alá. A PüR ampiifikácíót 35 cikluson át végeztük, az alábbi rend szerint: 34 oC, (1 perc), 60 oC (1 perc), és 72 oü (2 perc), és az utolsó ciklusban 72 oC~on 7 perc. Ezután a mintákat fenol:CHC13 elegyével extraháltuk, kétszer kicsaptuk, és EcoRl enzimmel emésztettük. A PCR reakció termékeit azoknak 6 %-os poliak.rilam.id gélen való szétválasztásával vizsgáltuk. A várt PÜR termék becsült méretének körülbelül megfelelő méretű DNS-t elektroeiuáltuk a gélekből, és vagy pGEM-4 piazmid vektorba, vagy iamböa-gtll-be szubkiőnoztuk.. Az Envb-nek és EnvR-nek megfelelő termékek várható mérete az első amplifikáciös kör után 615. illetve 683 bázispár voltak; a második kör amplifikáciöt követően az Envü-nek és EnvR-nek megfelelő termékek várható mérete 414, illetve 575 bázispár voltak. Az ampiifíkált terméket tartalmazó plazmidokat gazdasejtek transzformálására használtuk; a pGEM píazmiddal DK5~aifa, a lambda-gtii-el Ü600 deita-HFE sejtemet transzformáltunk. Kiválogattuk a meg felelő HCV próbákkal hiforidisáló, vagy a megfelelő méreti inszertet tartalmazó transzformáit sejtek által képzett klónokat. Az inszerteket ezután Ml3-ba klónoztuk és szekvenált.uk. Mindegyik KCV/cPCR

X * termékhez használt próba PC.R ampiifikáclévai előállított, P32-vei jelölt HCV cDNE szakaszokat tartalmazott.

Az EnvL régié variánsairól szekvencia információt a HCT#1S izolátum 3 klánjától, a TH izolátum 2 klórjából, az EC1 izolátum 3 klórjából, valamint a HCVI klőnokbői kaptunk. Az ezekbői a klánokból származó izolátumok összetett nukleotid szekvenciájának összehasonlítását a 7. ábra mutatja, Az ábrán mindegyik szekvenciát as Envi régió sssse” szálának megfelelő 5’-3’ irányba tüntettünk fel, és a szekvenciákat sorba, rendeztük, A függőleges vonalak és a nagybetűk szekvencia azonosságot jelölnek, a vonalak hiánya és a kisbetűk az azonosság hiányára utalnak, A sorokban bemutatott szekvenciák a következek: 1. sor: Thorn; 2. sor: EC1;

3. sor: HC?#13; 4. sor: HCVI.

Az EnvR régió variánsairól szekvencia információt az EC10 izolátum két klórjából, valamint a HCV klőnokbői nyertünk, A két EC1Q klón csak egy nukieotíoban különbözött egymástól. Az EC10 (2. klón) nukleotid szekvenciájának és a HCVi szekvenciák összetételének összehasonlítását a 8. ábra szítat ja. Az ábrán mindegyik szekvenciát az EnvR régió seuse'' szálának megfelelő 5' - 3 '

Irányba tüntettünk fel, és a szekvenciákat sorba rendeztük. A szekvenciák között a dupla pontozás szekvencia azonosságot jeléi.

Az egyes izolátumoknál az Envl régió (#117-308. aminosavak) és az EnvR régió (#300-438. aminosavak) által kódolt em.in.osav szekvenciák összehasonlítását a 0., illetve a 10, ábra mutatja. Az ábrák tartalmazzák a fent ismertetett ÜH23 és ŰH27 izolátumok szekvenciáit. Feltüntettük egy japán izolátum szekvenciáit is; ezeket a szekvenciákat Dr. T. Xlvamura··tői kaptuk (napán.) . Az ábrákon í i.

X * ♦

M és szintén megadtuk a HCVI régió teljes aminosav szekvenciáját, j elöltük az különböző izol.á.tumokban található nem homológ ami.nosavakat..

Amint. az a 9. ábrán látható, az Envb régióban összesen 93 %-nyi azonosság található a HCVI, és a többi izolátum között. A R.CT18, a Th és az EC1 izolátumok körülbelül 93 %-nyi azonosságot mutatnak a HCVl-hes képest; a JH23 és JH27 izolátumok SS %-nyi, illetve 95 %-nyi homológiaval rendelkeznek a HCVl-ei összehasonlítva. A 10. ábrán látható, hogy az EnvR régióban lényegesen kevesebb az azonosság, mint az EnvL, régióban; a régió egy része (azaz a 383-405. aminosavaktől) hipervariábilisnak tűnik. Ezeket az adatokat az alábbi táblázatban összegeztük.

Táblázat: Az. EnvR régióban., található azonosság. izolátum A HCVI-el mutatott azonosság

..............................százalékban kifejezve ..............

AA330-AA438 AA38.3-AA405

JH23(U.5.)	83	57
J.H27(ü.S.)	80		39
Japán	78		48
EC10(Olasz)	84		48

VT. Ipari célú alkalmazhatóság

A találmány szerinti epitopok £elhasználhatok a fent ismertetett polipeptid termékek előállítására vérből HCV fertőzés megáiiapitása, HCV klinikai diagnózisa, ellenanyagok eidáliicása, és gyógyászati készítmények előállítása céljából. Egyéb alkalmazási módokat a fentiekben ismertettünk, és továbbiak nyilvánvalóak a gyakorlatban járatos személy számára.

♦* ψΚ *Χ *♦

VII. Szakirod-almí ne 1 ye k jegyz é ke

Sarr és munkatársai, Bíotechníques 4, 428, (1986;

Bradly és munkatársai, Gastroenterology, 88, 773, {1985} öotstein, Gene, 8, 17

Brinton M.A., The Vírusos: The Togaviridae and Elavivirídae (Fraenkei-Conrat és Wagner sorozat szerk., Schlesinger és Schle sláger kötet szerk., Pienum Press), 327-374, (1986)

Broach, Molecular Biology oi the Yeast-Saccharomyces, 1. kötet, 445. oldal, Cold Spring Karbor Press, (1981.1

Broach és munkatársai, Meths Enzymol, 181, 307, (1983)

Catty, Antibodies, 1. kötet: A Praoticai Approaoh, (IRL Press), (1988)

Chaney és munkatársai, Cell Mól Génét, 12, 237, (1985)

Chakrabarti és munkatársai., Mól.. Cell. Bioi., 5, 3403, (1985)

Chang és munkatársai, Natúré, 198, 1056, (197?)

Chen és Seehurg, DNA., 4, 165, (1985)

Chirgwin és munkatársai, Bioehemistry, 18, 3294, (1379)

Chomczynski és Saceni, Anal Biochem., 162, 156, (1987)

Choo és munkatársai, Science, 244, 359, (1389)

Cieweii és munkatársai, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 62, 1159, (1969)

Cleweil, J. Bacteriol., 110, 667, (1972)

Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2118, (1972) uousens ss munkatarsár, Gene, 6r, zóo, \za8>)

De Boer és munkatársai, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 292, 128, (1983)

Brsesman és munkatársai, 8. Infect. Dis., 151, 761, (1.985) reinstone S. M. és Hooinagle 0,H.,New Engl. J.Med., 311, 185, (1984)

Feigner és munkatársai, Proc, Natl. Acad, Sci, USA, 84, 7413, (1987)

Fields és Knipe, 'Fundamental Virology Rraven Press, N.Y.), (1986)

Fiers és munkatársai, Natúré, 273, 113, (1978)

Gerety R.J. és munkatársai, ”Várai Hepatitis and Livsr Diseass' (szerk. B.N. Vyas, d.L, Díen.stag és Hoofnaglo)

Giennie és munkatársai, Natúré, 295, 712, (1988)

Giuzman, Cell, 23, 175, (1981)

Goeddel és munkatársai, Nuc. Acids Rés,, 8, 4057, (1989)

Graham és Van dér Ed, Virology, 52, 546, (1978)

Grunstein és Hogness, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 73, 39 61, (197 5)

Grych és munkatársa

Gubier és Hoffman, Gene, 25, 263, (1983)

Hahn, Virology, 162, 167, (1988)

Hammerling és munkatársai, Monoclonal Antibodies and T-Cell

Hybr idomas, (1981)

Han, Biochemistry, 26, 1617, (1987)

He 1 imán, Proc. Nat 1. Acad. Sci. US A, 80, 31, (19 8 3) hess és munkatársai, J, Adv, Snsyme Reg,, 7, 149, (1968)

Hinnon és munkatársai, Proc, natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, (1978)

Hitzeman ás munkatársai, J, Bioi, Chem., 255, 2073, (1380)

Holland és munkatársai, Biochemistry, 17, 4900, (1978)

Holland, J. Bioi. Chem,, 256, 1385, (1981)

Natúré, 316, 74, (1986) « <*·**· *'♦. *'**·$, * » » * < *

X * $** +

Holland és Holland, d. Bioi. Chem,, 255, 2596, (198Q)

Hoopes és munkatársai, H'uc. Acids Rés., 9, 5493, (1931;

Houghtorx és munkatársai, Nuc. Acids Kés., 9, 247, (1981)

Hunyd T.V, és munkatársai, DMA Cloning Techniques; A Practical Approach (D. Giover szerk., 1KL Press, Oxford, IhR.), 49-78 old a 1 .Immun Re v. , 62, 185, (1982) lto és munkatársai, Agric Bioi. Chem., 43, 341, (1984) iwarson, British Medical 295, 946, (1987)

Kennelt és munkatársai, Mcnoclonal Antibodies, (1980)

Kniskern és munkatársai, Gene, 46,	135 ,	(1986)
Kyte és Doolittle, J. Mól.	Bioi.,	157,	105-132, (1982)
Laemmli, Natúré, 227, 680,	(1970)
Lee és munkatársai, Science, 239,	1288 ,	(1988)
Luckow és Summers, Virol.,	17, 31	(1989	)
Mackett és munkatársai, J.	Virol .	. 49,	857, (1984)
Mániátís T. és munkatársai	, Molecular	Cloning; A Laboratory

Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, M.Y.), (1982)

Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, második kiadás, (Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, N.Y.)

Manníng és Mocarski, Virol., 167, 477, (198S)

Mayer és Walker szerk,, ImmunochemicsI Methods In Cell And Molecular Blology, (Academlc Prése, London), (1987)

Maxam és munkatársai, meth. Enzymoi.,65, 499, (1980)

Mac Kamara és munkatársai, Science, 226, 1325, (1984) .Mess ing és munkatársai, Nuc. Acids Rés., 8, 3Ό9, (1981) «« ·$♦.«< **

X, Χ>* * »*♦ » ♦ * * * *

04« jf* ♦* **

Messing, iheth. Enzymol., 101, 20-37, (1083}

Micheile és munkatársai, Int. Symposium on Virul Hepatitis

Monath, The Viruses: The Togavirídae And Fiaviviridae (sorozat szerk.: Fraenkel-conrat és Wagner, kötet szerkSchlesinger és Sohlesinger, Plenum Press), 375-440. oldal, (1980)

Moss, Gene Transfer Vectors Fór Mammaiian Cells, (szerk.:

Miller és Cal-os, Colé Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), 10, oldal, (1987)

Nagabuma és munkatársai, Anni Biochem, 141, 74, (1984)

Reurath és munkatársai, Science, 224, 392, (1984)

Nisonoff és munkatársai, Clin. Immunoi. Immunnáuhol,, 21, 397406, (19 81)

Overby b.R.

Overby L.R. , Curr. Hepatoi. , 6,, 65, Í19S6)

Overby L.R., Curr. Hepatoi., 7, 35, (1987)

Pacái és munkatársai. ű. Virol,, 61, 315, (1987)

Peieg, Natúré, 221, 193, (1969)

Pfeiierkorn és Shapi.ro, Comprehensive Virology”, 2. kötet, (szerk.: Fraenkel-Conrat és Wagner, Plenum Press, N.Y.), 171-230, (1974)

Prlnce A.M., Ann. Rév. Microbiol., 37, 217, (1983)

Rice ás munkatársai, Science, 229, 726, (1985)

Rice és munkatársai, The Vírusos: The Togavirídae And

Fiaviviridae (sorozat szerk.: Fraenkel-Conrat és Wagner, kötet szerk.: Schlesinger és Schiesimger, Plenum Press), 279-328. oldal, (19865

Roehrlg, The Viruses: The Togavirídae And Fiaviviridae (sorozat szerk.: Fraenkel-Conrat és Wagner, kötet szerk.:Schlesinger és ** «·Μ·*

Schlesinger, Plenum Press), (1.986)

Sadler és munkatársai, Gene, 8, 279, (1980)

Sarki és munkatársai, Wature, 324, 163, (1986)

Saikí és munkatársai, Science, 239, 487, (1938)

Sanger és munkatársai, Proc. natl. Acad. Sci, USA, 74., 5463, (1977)

Setlow szerk, ,Genetic Engineering, 10. kötet, 195-219, (Plenum Pubiishing Co., N.Y.), (1388:

Schlesinger és munkatársai, J. Virol., 60, 1153, (1986)

Schreíer M. és munkatársai, Hybridoma Technigues'¹, (1.980)

Scopes, ”Protein Purification, Principies and Praotice’', 2.

kiadás,	(Springer“Verlag.	N.Y.) ,	(1984)
Shimatake és munkatársai,	Natúré,	232, 128	, (1981)
Singd és	munkatársai, Nuc	. Acids	Re s - .· i i t	4049, (1983	)
Sippei,	Eur. o. Biochem,	37, 31,	(1973)
Smith és	munkatársai. Mól	. cell.	Bioi., 3,	2156-2165,	(198 3
Steimer	és munkatársai, J	. virol.	., 5 8, 9,	(1986)
Stoilar,	The Togaviruses	, (szerk.: H.W.	Schlesinger)	, 584
oldal, (1980)
S'tuve és	munkatársai, J.	Virol.,	61, 326,	(1987)

Sumiyoshi és munkatársai, 161, 497, (1987)

Taylor és munkatársai, Bio-chim. Biophys. Acta, 442, 324, (1976)

Towbin és munkatársai, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 76, 4350, (1979)

Vsa ás Hersenberg, Selected Methods In Celiuiai Ι«νηο1ο§>'^!ί, (W.H. Preeman and Co,) 373-391. oldal, (1980)

Vytdehaag és munkatársai, J. Immunoi., 134, 1225, (1985)

Vaienzueia és munkatársai. Natúré, 298, 344, (1982) «4»

4» »» '*·» **·

Val.en.zue.la és munkatársai, 'Hepatitis S, (szerk..: I.. Mi Ilmán és munkatársai, Plen-um Press). 225-236. oldal, (1934)

Warner, DNA, 3, 401, (1984)

Várd és- munkatársai, Natúré, 341, 544, (1989)

Wu és Grossman, Meth. Enzymol., 154, Recombinant DNA, S, (1987 Wu, Meth- Enzymol., 155, Recombínant DNA, F, (1387)

Zeller, Nnc. Acids Rés., lö, 8487, (1982)

341 761 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás

399 121 sz. .amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás

427 783 S2. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás

444 887 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás

816 467 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás

466 917 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás

472 50Ö sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás

491 632 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás

493 898 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.

Claims (15)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1, Egy HCV antitesttel immunoreaktív poíipepttd, ahol a HCV antitesttel reaktív immunoreaktív részlet egy szegmense a HCV polipeptidnek, amely a/ szekvencialísta szerinti 413-420 {ΆΑ413-ΑΆ420} aminosavat tartalmazza, és ahol a szegmens maximális hosszúsága mintegy 25 aminosav.
2. 2, Az 1. igénypont szerinti immunoreaktív polipeptid, ahol a szegmens maximális hosszúsága mintegy 21 aminosav.
3. 3, . Az 1. igénypont szennti immunoreaktív polipeptid, ahol a szegmens maximális hosszúsága mintegy 15 aminosav.
4. 4. A HCV antitesttel immunoreaktív oktamér polipeptid, ahol az oktamér aminosav szekvenciája az szekvencialista szerinti 2280-2287-as helyzet (AA2280AA2287),
5. 5. A HCV antitesttel immunoreaktív polipeptid, ahol a HCV antitesttel reaktív immunoreaktív részlet egy szegmense a HCV polipeptidnek, amely a szekvenciaüsta szerinti 540-547 (AA540-AA547) aminosavat tartalmazza, és ahol a szegmens maximális hosszúsága mintegy 25 aminosav.

   8. Az 5, igénypont szerinti immunoreaktív polipeptid, ahol a szegmens maximális hosszúsága mintegy 20 aminosav..
6. 7. A HCV antitesttel reaktív immunoreaktív polipeptid , ahol a HCV antitesttel reaktív immunoreaktív részlet egy szegmense a HCV poíipeptídnek és amely 20 vagy annál kevesebb aminosavat tartalmaz, ahol az amíno-termináíis ^mieosevj & szekvencialista szerinti 1218-as aminosav-szegmens.

   « « f

   Jf* ♦ ♦
7. 8. A 7. igénypont szerinti polipeptid, ahol az immunoreaktív részle^reaktív a HCV antitesttel, szekvenciaiísta szerinti 1218-1225 aminosavból áll.
8. 9. A HCV antitesttel immunoreakiív polipeptid, ahol a HCV antitesttel reaktív immunoreakiív részlet egy szegmense a HCV polipeptldnek, amely a szekvencialista szerinti 465-472 (AA465-AA472) aminosavat tartalmazza, és ahol a szegmens maximális hosszúsága mintegy 20 aminosav.
9. 10. A HCV antitesttel immunoreaktiv polipeptid, ahol a HCV antitesttel reaktív immonoreaktív részlet egy szegmense a HCV polipeptldnek, amely a szekvencialista szerinti 2244-2251 (ΆΑ2244-ΆΑ2251) aminosavat tartalmazza, és ahol a szegmens maximális hosszúsága mintegy 25 aminosav,
10. 11. A 10. igénypont szerinti immonoreaktív polipeptid, ahol a szegmens maximális hosszúsága mintegy 20 aminosav.
11. 12. A HCV antitesttel reaktív immonoreaktiv polipeptid , ahol a HCV antitesttel reaktív immonoreaktív részlet egy szegmense a HCV polipeptidnek és amely 20 >

    vagy annál kevesebb aminosavat tartalmaz, ahol az amino-terminális ^minesaV a szekvencialista szerinti 1940-es aminosav-szegmens.
12. 13. A 11. igénypont szerinti polipeptid, ahol az immunoreakiív részletiVeaRtfv a HCV antitesttel, jamefy|a szekvencialista szerinti 1940-1947 aminosavból áll,
13. 14. Immunoassay reagens, amely az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti:
14. 15. Kimutatási módszer a hepatitis C vírus (HCV) immunoreakiív antitestjei egy mintában való jelenlétének meghatározására, azzal jellemezve, hogy

    - a 14. igénypont szerinti immobilizált immunoassay reagenst érintkeztetjük a mintával, és

    - az antitesteket a reagenshez kötve egy detektálásra alkalmas eszközzel meghatározzuk.

    * ** *

    18. Rekombináns eljárás egy polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-13, igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódoló DNS~t tartalmazó expressziós vektor segítségével a polipeptidet kifejezzük és izoláljak.
15. 17. Eljárás az 1-13. Igénypontok bármelyike szerinti polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy kémiai szintézissel in vitro állítják elő a polipeptidet