JP2003277396A

JP2003277396A - Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）ポリペプチド

Info

Publication number: JP2003277396A
Application number: JP2003054819A
Authority: JP
Inventors: David Y Chien; ワイ．チェンデイビッド; William Rutter; ルターウィリアム
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1991-06-24
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2003-10-02
Anticipated expiration: 2019-03-31
Also published as: JP3926817B2; HU9303703D0; CA2110058C; JP3514751B2; JP2009084285A; AU671594B2; RU2148587C1; EP0591431B1; JP2007077168A; JP2000139485A; JP2005053920A; JP3619827B2; FI935808A0; EP0591431A1; RO117329B1; WO1993000365A3; KR0185426B1; ES2188583T3; FI20021626A; JP4456596B2

Abstract

(57)【要約】【課題】信頼性のある診断および予後の手段、病気の
予防および/または治療のためのワクチンおよび免疫療
法的な治療薬を提供すること。【解決手段】新しく特徴付けられたＨＣＶエピトープ
を含有するポリペプチド、そのようなポリペプチドを製
造する方法、そのようなポリペプチドを使用する方法
（例えば、診断薬、ワクチンおよび治療薬）、およびそ
のような使用に適合した製造物、組成物または製剤（例
えば、イムノアッセイ法または他の支持体に固定された
ポリペプチド、経口のまたは注入可能な薬学的組成
物）。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）感染の流行を管理する物質および方法に関す
る。さらに詳細には、本発明は、ＨＣＶ感染の検出、予
防および治療において免疫学的試薬として有用なポリペ
プチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＨＣＶは、最初、Ｈｏｕｇｈｔｏｎらに
より非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の原因として同定さ
れ、そして特徴付けられた。このことは、免疫学的試薬
として有用な、多くの一般的かつ特異的なポリペプチド
の開示を導いた。Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、ヨーロッパ公開
公報第３１８,２１６号；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、ヨーロ
ッパ公開公報第３８８,２３２号；Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９−３６２；Ｋｕｏ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３６２−３６
４；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９
９１）１４：３８１−３８８を参照。これらの刊行物
は、ＨＣＶ一般に関する広範な背景およびＨＣＶポリペ
プチド免疫学的試薬の製造および使用を当該技術分野に
提供する。それゆえ、簡潔さのために、特にこれらの刊
行物の開示は、参考として本明細書中に援用される。

【０００３】他者により、Ｈｏｕｇｈｔｏｎらの研究が
直ちに利用され、そして拡大された。例えば、Ｈｉｇｈ
ｆｉｅｌｄら、英国特許出願第２,２３９,２４５号（Ｗ
ｅｌｌｃｏｍｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＬｔｄ．）；
Ｗａｎｇ、ヨーロッパ公開公報第４４２,３９４（Ｕｎ
ｉｔｅｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＩｎｃ．）；Ｌｅｕ
ｎｇら、ヨーロッパ公開公報第４４５,４２３（Ａｂｂ
ｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；Ｈａｂｉｔｓ
ら、ヨーロッパ公開公報第４５１,８９１号（Ａｋｚｏ
Ｎ．Ｖ．）；Ｒｅｙｅｓら、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ
９１/１５５１６（ＧｅｎｅｌａｂｓＩｎｃ．）；Ｍ
ａｋｉら、ヨーロッパ公開公報第４６８,６５７号（Ｔ
ｏｎｅｎＣｏｒｐ．）；およびＫａｍａｄａら、ヨー
ロッパ公開公報第４６９,３４８号（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ
ＳｅｉｙａｋｕＫ．Ｋ．）を参照。

【０００４】ＨＣＶのキャリアおよびＨＣＶ汚染された
血液または血液製剤をスクリーニングおよび同定する高
感度で特異的な方法は、医療における重要な進歩であ
る。輸血後肝炎（ＰＴＨ）は、輸血患者の約１０％で起
こり、そしてＨＣＶは、これらの患者の９０％までの割
合を占める。これらの病気の主要な問題は、慢性的な肝
損傷へしばしば進行することである（２５〜５５％）。
患者の看護、そして血液および血液製剤による、または
密接な対人接触によるＨＣＶ感染の予防には、ＨＣＶに
関連する抗体を検出するために、信頼性のある診断およ
び予後の手段（例えば、ＨＣＶポリペプチド）が必要と
される。そのようなポリペプチドはまた、病気の予防お
よび/または治療のためのワクチンおよび免疫療法的な
治療薬として有用である。

【０００５】ＨＣＶは、比較的新しい因子なので、病気
の臨床経過および集団におけるＨＣＶの疫学の一層の研
究を可能にすべく、さらなる免疫学的試薬を明らかにし
続ける必要性がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがって、信頼性の
ある診断および予後の手段、病気の予防および/または
治療のためのワクチンおよび免疫療法的な治療薬を提供
することが、本発明が解決しようとする課題である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、新規なＨＣＶ
エピトープの特徴付けに関する。これらのエピトープの
特徴付けをすることにより、ＨＣＶに対する抗体と免疫
学的に反応する、および/またはインビボで抗ＨＣＶ抗
体の産生を起こすポリペプチド生成物の製造が可能とな
る。これらのポリペプチド生成物は、診断テストにおけ
る標準物または試薬として、および/またはワクチンの
成分として、有用である。これらのポリペプチド配列内
に含まれるＨＣＶエピトープに対する抗体、例えば、ポ
リクローナルおよびモノクローナルの両方を含有する抗
体は、例えば、診断テストにおいて、治療薬として、抗
ウイルス剤のスクリーニング用に、そしてＨＣＶポリペ
プチドまたは粒子の単離/精製のうち単離用に有用な試
薬である。

【０００８】最も広い意味では、本発明は、本明細書中
に開示された新しく特徴付けられたＨＣＶエピトープを
含有するポリペプチド、そのようなポリペプチドを製造
する方法（例えば、組換え方法および合成方法）、その
ようなポリペプチドを使用する方法（例えば、診断薬、
ワクチンおよび治療薬）、およびそのような使用に適合
した製造物、組成物または製剤（例えば、イムノアッセ
イ法または他の支持体に固定されたポリペプチド、経口
のまたは注入可能な薬学的組成物）に関する。同様に、
本明細書中に開示されたＨＣＶエピトープに対する抗体
（ポリクローナル、モノクローナル、または、例えば結
合フラグメント、一本鎖抗原結合タンパク質などの等価
物）はまた、本発明の範囲内に包含される。さらに、そ
のような抗体を作製する方法、そのような抗体を使用す
る方法（例えば、診断薬、ワクチンおよび治療薬）、お
よびそのような使用に適合した製造物、組成物または製
剤（例えば、イムノアッセイ法または他の支持体に固定
された抗体、経口のまたは注入可能な薬学的組成物）も
また、本発明の範囲内に包含される。

【０００９】本発明の別の局面は、適切な容器内に上記
の抗体を含有して、ＨＣＶ抗原の存在について試料を分
析するキットに関する。本発明のさらに別の局面は、適
切な容器内に上記のようなポリペプチドを含有して、Ｈ
ＣＶ抗原に対する抗体の存在について試料を分析するキ
ットに関する。

【００１０】本発明のさらに別の局面は、以下の通りで
ある：新たに開示されたＨＣＶエピトープを含有するポ
リペプチドを産生する方法であって、該方法が、該ポリ
ペプチドを発現させる条件下でＨＣＶエピトープを含有
するポリペプチドをコードする配列を含有する発現ベク
ターで形質転換された宿主細胞を培養することを包含す
る方法であり；そしてこの方法により産生したそのよう
なＨＣＶエピトープを含有するポリペプチドである。

【００１１】イムノアッセイ法もまた、本発明に包含さ
れる。その例として、ＨＣＶ抗原を検出するイムノアッ
セイ法であって、抗原−抗体複合体を形成させるような
条件下で上記のような抗体と共にＨＣＶ抗原を含有する
と思われる試料を培養すること；および、その抗体を含
有する抗原−抗体複合体を検出することを包含するイム
ノアッセイ法がある。抗ＨＣＶ抗体を検出するイムノア
ッセイ法であって、抗原−抗体複合体を形成させるよう
な条件下で、上記のようなポリペプチドと共に抗ＨＣＶ
抗体を含有すると思われる試料をインキュベーションす
ること；および、そのポリペプチドを含有する抗原−抗
体複合体を検出することを包含するイムノアッセイ法も
ある。

【００１２】さらに、本明細書中に記載されるＨＣＶエ
ピトープを含有する免疫原性ペプチドを含有する、ＨＣ
Ｖ感染の治療用ワクチンが、本発明中に包含される。

【００１３】本発明のさらに別の局面は、ＨＣＶに対す
る抗体を産生する方法であって、該方法が、免疫応答を
生じるのに十分な量で本明細書中に記載のＨＣＶエピト
ープを含有する単離された免疫原性ポリペプチドを対象
に投与することを包含する方法である。

【００１４】本発明の上記の局面は、以下の式ａａ_x−ａａ_y で表されるＨＣＶエピトープを発見したことにより達成
されている。ここで、ａａはアミノ酸を示す；ｘおよび
ｙは、ｙ−ｘ≧６である整数である；ａａ_x−ａａ_yは、
図１のアミノ酸配列の一部分を示す；そして、ｘは、以
下の２３−３４、３６、６６−７９、８１−９４、９６
−９８、１０１−１０３、１８６−１８９、１９１、２
０６、２２３、２３２、２５６、２８６、２９７−２９
９、３２１、３４７、３５７、４１３、４１４、４３
２、４６５−４７１、４８０−４８４、５０１、５０
２、５２１、５４０−５４９、５７９、５９４−５９
９、６０１−６１３、６４１、６６２−６６５、６８
５、７０５、７０６、７２９、７８２−７８９、８０
１、８５１−８５５、８９３、９１６、９２８、９４
６、９５２−９５４、１０２６、１０７２、１１０９、
１１１２−１１１７、１２１８、１２４０、１２８０−
１２８５、１３２２、１３３８、１３７１、１３８４、
１４１０、１４１１、１４５４、１４９２、１４９３、
１５３２−１５３５、１５６０、１５６１、１５６６−
１５６８、１５７１−１５７７、１６０１−１６０７、
１６１５−１６２０、１６５５、１６９５、１７１０−
１７１２、１７２８、１７２９、１７５８−１７６２、
１７８１、１８０８、１８２１、１８５１、１８８０、
１９０８−１９１３、１９２５、１９４０−１９４８、
１９５１、１９６６−１９６９、１９９９、２００１−
２００４、２００６−２０１４、２０２４、２０４８−
２０５３、２０５５−２０５７、２０７１、２０８８−
２０９３、２１０８、２１２２−２１４８、２１６５、
２１８７、２２２６−２２３２、２２４４−２２４９、
２２６７、２２８１−２２８６、２２８８、２２８９、
２３２５−２３２７、２３４６、２３４７、２３４９、
２３８２、２４０１、２４１７−２４２２、２４３９−
２４４４、２４４６−２４５６、２４６９、２４７１−
２４７６、２４９５、２５３３、２５３４、２５７３−
２５７８、２６０２−２６０４、２６０６−２６１２、
２６３２−２６３８、２６６０、２６７６−２６７９、
２６８８−２６９３、２７０７、２７２１、２７５７−
２７６２、２７７９、２７９４、２７９５、２７９７−
２７９９、２８０１、２８０２、２８１７−２８４３、
２８６３−２８６７、２８７８−２８８４、２８８６−
２８９５から成る群から選択される。

【００１５】上記の目的はまた、以下の式ａａ_x−ａａ_y で表されるＨＣＶエピトープを用いて達成される。ここ
で、ａａはアミノ酸を示す；ｘおよびｙは、ｙ−ｘ≧６
である整数である；ａａ_x−ａａ_yは、図１のアミノ酸配
列の一部分を示す；そして、Ｘは、以下の３５（ｙが４
５以下の場合）、８０（ｙが９０以下の場合）、９５
（ｙが１１０以下の場合）、９９（ｙが１２０以下の場
合〉、１００（ｙが１５０以下の場合）、１９０（ｙが
２１０以下の場合）、５００（ｙが５５０以下の場
合）、６００（ｙが６２５以下の場合）、１２６０（ｙ
が１２８０以下の場合）、１５６９（ｙが１９３１以下
の場合）、１５７０（ｙが１５９０以下の場合）、１６
９４（ｙが１７３５以下の場合）、１９４９（ｙが２１
２４以下の場合）、１９５０（ｙが１９８５以下の場
合）、２０００（ｙが２０５０以下の場合）、２００５
（ｙが２０２５以下の場合）、２０５４（ｙが２２２３
以下の場合）、２２５０（ｙが２３３０以下の場合）、
２２８７（ｙが２３８５以下の場合）、２２９０（ｙが
２３１０以下の場合）、２３４５（ｙが２３７５以下の
場合）、２３４８（ｙが２４６４以下の場合）、２４４
５（ｙが２４７５以下の場合）、２４７０（ｙが２４９
０以下の場合）、２６０５（ｙが２６２０以下の場
合）、２７８０（ｙが２８３０以下の場合）、２７９６
（ｙが２８８６以下の場合）、２８００（ｙが２８５０
以下の場合）、および２８８５（ｙが２９０５以下の場
合）、から成る群から選択される。

【００１６】上記式のいずれかにおいて、ｘ−ｙは、本
発明のいくつかの実施態様において、１０、２０、３
０、４０または５０より小さいか、または、等しい数で
あり得る。

【００１７】

【発明の実施の形態】本明細書中で言及される刊行物へ
の完全な引用は、「背景」または「参考文献」の節に見
い出され得る。

【００１８】Ｉ．定義「Ｃ型肝炎ウイルス」または「ＨＣＶ」は、その病原性
株がＮＡＮＢＨを引き起こす当該分野で認識されたウイ
ルス種、および弱毒化株またはそれから誘導される欠陥
干渉粒子を表す。一般的には、「背景」と題する節に引
用された刊行物を参照。ＨＣＶゲノムは、ＲＮＡから成
っている。ＲＮＡを含有するウイルスは、比較的高い割
合で自然突然変異を有することが知られており、すなわ
ち組み入れられたヌクレオチド当り１０^-3〜１０^-4の頻
度で起こることが報告されている（Ｆｉｅｌｄｓおよび
Ｋｎｉｐｅ（１９８６））。それゆえ、遺伝子型の異質
性および流動性は、ＲＮＡウイルスに固有であり、ＨＣ
Ｖ種内で毒性または無毒性であり得る多種類の株/分離
株がある。種々のＨＣＶ株/分離株の増殖、同定、検出
および分離は、文献に十分に記載されている。さらに、
本明細書中での開示は、種々の株/分離株に対する診断
薬およびワクチンの調製を可能にし、そして薬学的使用
のための抗ウイルス剤、例えば、ＨＣＶの複製を阻害す
る薬剤、に対するスクリーニング手法において使用する
組成物および方法の調製を可能にする。

【００１９】ＨＣＶの幾つかの異なった株/分離株の情
報は、本明細書中に開示され、特にＣＤＣ/ＨＣＶ１株
または分離株（ＨＣＶ１とも呼ばれる）が開示されてい
る。１つの株または分離株、例えば、部分的ゲノムまた
はアミノ酸配列、からの情報は、当業者が、標準的技法
を用いて新しい株/分離株を分離し、そしてそのような
新しい株/分離株がＨＣＶであるかどうかを同定するこ
とを十分可能にする。例えば、幾つかの異なった株/分
離株が以下に記載されている。これらの株は、多くのヒ
ト血清から（および異なった地域から）得られ、ＨＣＶ
１のゲノム配列からの情報を利用して分離された。

【００２０】本明細書中で提供される情報によれば、Ｈ
ＣＶはフラビウイルス科と遠い関係にあり得ることが示
される。フラビウイルス科は、小さな膜で包まれたヒト
の病原体である多数のウイルスを包含する。フラビウイ
ルス粒子の形態および構成は公知であり、そしてＢｒｉ
ｎｔｏｎ（１９８６）により考察されている。一般に、
形態に関しては、フラビウイルスは、中央に脂質二重層
で囲まれたヌクレオキャプシドを含有している。ビリオ
ンは、球状であり、直径が約４０〜５０ｎｍである。そ
れらのコアは、直径が約２５〜３０ｎｍである。ビリオ
ンのエンベロープの外表面に沿って、末端に直径約２ｎ
ｍのこぶを有する長さ約５〜１０ｎｍ突出部がある。こ
の科の代表的な例としては、黄熱病ウイルス、西ナイル
ウイルスおよびデング熱ウイルスがある。それらは、Ｈ
ＣＶのゲノムよりわずかに大きく、約３５００個のアミ
ノ酸を有するポリタンパク質前駆体をコードする正鎖Ｒ
ＮＡゲノム（〜１１,０００ヌクレオチド）を有してい
る。個々のウイルスタンパク質は、この前駆体ポリペプ
チドから開裂されて生じる。

【００２１】ＨＣＶゲノムＲＮＡのゲノム構造およびヌ
クレオチド配列が推定されている。そのゲノムは、〜１
０,０００ヌクレオチドを含有する一本鎖ＲＮＡのよう
である。そのゲノムは、正鎖であり、そして約３,００
０個のアミノ酸を有するポリタンパク質をコードしてい
る連続的で翻訳されるオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）を有している。そのＯＲＦにおいて、構造タ
ンパク質はＮ末端領域の最初の約４分の１においてコー
ドされており、ポリタンパク質の大部分は非構造タンパ
ク質に対応するようである。すべての既知のウイルス配
列と比較すると、小さいが重要な共直線性の相同性が、
フラビウイルス科の非構造タンパク質および（現在フラ
ビウイルスの一部分であるとも考えられている）ペスチ
ウイルスで見られる。

【００２２】ＨＣＶ１のヌクレオチド配列においてコー
ドされる推定アミノ酸および他の証拠に基づくと、コー
ドされたＨＣＶポリタンパク質の可能なタンパク質ドメ
インおよびおよその境界は、次の通りである：

【００２３】

【表１】

【００２４】しかしながら、これらのドメインは仮のも
のである。例えば、Ｅ１−ＮＳ２の境界は、多分７５０
〜８１０領域にあり、そしてＮＳ３−ＮＳ４の境界は、
約１６４０〜１６５０領域である。Ｃの１９１個のアミ
ノ酸バージョンは、（例えば、約１７０アミノ酸の長さ
に）さらにプロセシングされる前駆体であり、そしてＮ
Ｓ２、ＮＳ４およびＮＳ５のタンパク質は、各々さらに
プロセシングされて２つの成熟タンパク質になることも
また立証されている。

【００２５】ＨＣＶの異なった株、分離株またはサブタ
イプは、ＨＣＶ１と比べて、アミノ酸および核酸におけ
る変異を含有すると予想される。多くの分離株は、ＨＣ
Ｖ１と比べて、全アミノ酸配列において高い（すなわ
ち、約４０％より高い）相同性を示すと予想される。し
かし、他より相同性の少ないＨＣＶ分離株があることも
また見い出され得る。これらは、種々の判定基準に従っ
てＨＣＶとして定義される。それらの基準としては、例
えば、ＨＣＶ１のポリタンパク質と同様の大きさのポリ
タンパク質をコードしている約９,０００ヌクレオチド
から約１２,０００ヌクレオチドまでのＯＲＦ、ＨＣＶ
１のポリタンパク質と同様の疎水性および/または抗原
性を有するコードされたポリタンパク質、およびＨＣＶ
１で保存される共直線性ペプチド配列の存在である。さ
らに、ゲノムは、正鎖ＲＮＡであろう。

【００２６】ＨＣＶは、少なくとも１つのエピトープを
コードし、そのエピトープは、ＨＣＶ１ポリタンパク質
中のエピトープで免疫学的に同定される。エピトープ
は、既知のフラビウイルスと比較した場合、ＨＣＶに特
有である。このエピトープの特有性は、抗ＨＣＶ抗体と
の免疫反応性および既知のフラビウイルス種に対する抗
体との免疫反応性の欠如により測定され得る。免疫反応
性を測定する方法は、当該分野では公知であり、例え
ば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、赤血
球凝集反応、およびアッセイに適切な方法のいくつかの
例が、本明細書中で提供される。あるいは、ＨＣＶエピ
トープの配列とフラビウイルス科のメンバーの既知の配
列との比較が、「特有性」を評価するために用いられ得
る。

【００２７】上記に加えて、核酸の相同性およびアミノ
酸の相同性の以下のパラメーターが、単独または組合せ
のいずれかで利用され、ＨＣＶとして株/分離株が同定
される。ＨＣＶ株および分離株は、進化的に関連してい
るので、ヌクレオチドレベルでのゲノムの全体の相同性
は、約１０％またはそれより高いものであり得、おそら
く約４０％またはそれより高く、おそらく約６０％また
はそれより高く、そしてなおいっそうおそらく約８０％
またはそれより高いものであろうし、そして、少なくと
も約１３個のヌクレオチドの対応する連続した配列があ
るであろう。ＨＣＶゲノム内に可変領域および超可変領
域があることは注目すべきである；それゆえ、これらの
領域の相同性は、ゲノム全体の相同性より有意に低いと
予想されることが注目されるべきである。推定のＨＣＶ
株ゲノム配列と、例えばＣＤＣ/ＨＣＶｌｃＤＮＡと
の間の対応が、当該分野の公知の方法により決定され得
る。例えば、それらは、推定ＨＣＶからのポリヌクレオ
チドの配列情報と、本明細書中に記載のＨＣＶｃＤＮ
Ａ配列との直接の比較により決定され得る。例えば、さ
らに、相同領域間で安定な二量体（例えば、Ｓ₁消化の
前に用いられる二量体）を形成するような条件下で、ポ
リヌクレオチドのハイブリダイゼイションを行い、次い
で一本鎖に特異的なヌクレアーゼで消化し、次いで消化
されたフラグメントの大きさを決定することにより、そ
れらは決定され得る。

【００２８】ＨＣＶ株または分離株の進化上の関係によ
り、推定ＨＣＶ株または分離株が、ポリペプチドレベル
での相同性により同定され得る。一般に、ＨＣＶ株また
は分離株は、ポリペプチドレベルで、少なくとも１０％
の相同性があり、約４０％以上の相同性があり、おそら
く約７０％以上の相同性があり、そしてなおいっそうお
そらく約８０％以上の相同性があることが予想され、そ
してある種のものは約９０％以上の相同性さえあり得
る。アミノ酸配列相同性の決定方法は、当該分野では公
知である。例えば、アミノ酸配列は直接決定され得、そ
して本明細書中に記載の配列と比較され得る。あるい
は、推定ＨＣＶのゲノム物質のヌクレオチド配列が決定
され（通常は、ｃＤＮＡ中間体を経て）、その中にコー
ドされるアミノ酸配列が決定され、そして対応する領域
が比較され得る。

【００２９】本明細書中に用いられるところの、指定さ
れた配列「に由来する」ポリヌクレオチドとは、指定さ
れたヌクレオチド配列の領域に対応して、およそ少なく
とも約６個のヌクレオチド配列、好ましくは少なくとも
約８個のヌクレオチド配列、より好ましくは少なくとも
約１０〜１２個のヌクレオチド配列、そしていっそうよ
り好ましくは少なくとも約１５〜２０個のヌクレオチド
配列から成るポリヌクレオチド配列を示す。「対応す
る」とは、指定された配列に相同的であるか、または、
相補的であることを意味する。好ましくは、ポリヌクレ
オチドの由来する領域の配列は、ＨＣＶゲノムに特有の
配列に相同的であるか、または、相補的である。配列が
ＨＣＶゲノムに特有であるかどうかは、当業者に公知の
方法により決定され得る。例えば、その配列は、（優先
日の時点での）データバンク（例えば、Ｇｅｎｅｂａｎ
ｋ）の配列と比較されて、非感染の宿主または他の生物
中に存在するかどうかが決定され得る。その配列はま
た、（優先日の時点での）他のウイルス性因子の肝炎を
誘発することが知られているウイルス性因子、例えば、
ＨＡＶ、ＨＢＶおよびＨＤＶを含む既知の配列およびフ
ラビウイルス科のメンバーと比較され得る。由来する配
列と他の配列との対応性または非対応性はまた、適切に
厳密な条件下でのハイブリダイゼイションにより決定さ
れ得る。核酸配列の相補性を決定するハイブリダイゼイ
ション法は、当該分野では公知である。例えば、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら（１９８２）を参照。さらに、ハイブリダ
イゼイションにより形成される二量体ポリヌクレオチド
のミスマッチはまた、例えば、二重体ポリヌクレオチド
内の一本鎖領域を特異的に消化するＳ１のようなヌクレ
アーゼとの消化を包含する公知の方法により決定され得
る。典型的なＤＮＡ配列が「由来」し得る領域は、例え
ば、特異的なエピトープをコードする領域、および非転
写および/または非翻訳の領域を包含するが、それらに
限定されるものではない。

【００３０】由来するポリヌクレオチドは、必ずしも示
されたヌクレオチド配列に物理的に由来せず、例えば、
化学合成またはＤＮＡ複製または逆転写または転写を包
含するような任意の方法により生じ得る。さらに、指定
の配列の領域に対応する領域の組合せは、意図する方法
と合致するように、当該分野で公知の方法で改変され得
る。

【００３１】同様に、指定されたアミノ酸配列または核
酸配列「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列
は、配列内でコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
またはその一部分と同一のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを示す。ここで、その一部分は、少なくとも３〜
５個のアミノ酸、そしてより好ましくは、少なくとも８
〜１０個のアミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも
１１〜１５個のアミノ酸から成り、あるいは配列内でコ
ードされるポリペプチドと免疫学的に同一であり得る。
この用語はまた、指定された核酸配列から発現されるポ
リペプチドを包含する。

【００３２】組換えまたは由来するポリペプチドは、必
ずしも指定された核酸配列から翻訳されない；それは、
例えば、化学合成、または組換え発現系の発現、または
変異ＨＣＶを含むＨＣＶからの分離を包含する任意の方
法により生じ得る。組換えまたは由来のポリペプチド
は、その配列内にアミノ酸または非天然アミノ酸の１個
またはそれ以上の類似体を含有し得る。アミノ酸の類似
体を配列内に挿入する方法は、当該分野では公知であ
る。それはまた、１個またはそれ以上の標識を含有し
得、これは当該分野では公知である。

【００３３】本明細書中で用いられる「組換えポリヌク
レオチド」という用語は、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、
半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味
し、そしてそれは、その起源または操作により、（１）
天然で会合しているポリヌクレオチドの全部または一部
分と会合していない、（２）天然で結合しているポリヌ
クレオチド以外のポリヌクレオチドに結合している、ま
たは（３）天然には存在しない。

【００３４】本明細書中で用いられる「ポリヌクレオチ
ド」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマ
ー形、すなわちリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌ
クレオチドのいずれかを示す。この用語は、分子の一次
構造のみを示す。それゆえ、この用語は、二本鎖および
一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。それはまた、
既知のタイプの改変、例えば、当該分野で公知の標識、
メチル化、「キャップ化」、１個またはそれ以上の天然
由来のヌクレオチドの類似体との置換、ヌクレオチド間
の改変（例えば、非電荷的結合による改変（例えば、メ
チルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデ
ート、カルバメートなど）および電荷的結合による改変
（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオニート
など）、ペンダント部分を含有する改変、例えばタンパ
ク質（例えば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナ
ルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを包含する）、イン
ターカレーターによる改変（例えば、アクリジン、プソ
ラレンなど）、キレーターを含有する改変（例えば、金
属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）、アルキレ
ーターを含有する改変、改変された結合による改変（例
えば、α−アノマー性核酸など）、およびポリヌクレオ
チドの非改変形を包含する。

【００３５】「精製された」ポリペプチドは、そのポリ
ペプチドが、実質的に他のポリペプチドのない状態で存
在すること、すなわち、組成物中に所望のポリペプチド
を最低約５０重量％（組成物中、所望のポリペプチド/
総ポリペプチド）、好ましくは最低約７０重量％、そし
てより好ましくは最低約９０重量％を、組成物中の非タ
ンパク質様物質に関係なく含有することを示す。ウイル
ス性ポリペプチドを精製する方法は、当該分野では公知
である。精製された抗体が同様に定義される。

【００３６】「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細
胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、および微生物また
は単細胞体として培養される高等真核細胞系を表すよう
な他の用語は、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡに
対するレシピエントとして用いられ得る、または用いら
れて来た細胞を示し、そして形質転換された元の細胞の
子孫を包含する。単一の親細胞の子孫は、元の親細胞と
形態学的に、あるいは相補的なゲノムＤＮＡまたは全Ｄ
ＮＡにおいて、自然変異、偶発性変異または意図的変異
によって、必ずしも完全に同一ではないことが理解され
る。

【００３７】「レプリコン」は、任意の遺伝的要素であ
り、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、コスミッ
ドなどであり、細胞すなわち、自身の制御下で複製し得
る細胞内のポリヌクレオチド複製の独立単位として挙動
する。

【００３８】「ベクター」は、結合したセグメントの複
製および/または発現を引き起こすように別のポリヌク
レオチドセグメントが結合しているレプリコンである。

【００３９】「制御配列」は、それらが連結するコード
配列を発現するのに必要なポリヌクレオチド配列を示
す。そのような制御配列の性質は、宿主生物によって異
なる；原核細胞では、一般に、そのような制御配列は、
プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネー
ターを含有する；真核細胞では、一般に、そのような制
御配列は、プロモーター、ターミネーターおよび、ある
場合にはエンハンサーを含有する。「制御配列」という
用語は、最低限その存在が発現に必要であるすべての成
分を含有することを意味し、そしてその存在が有益であ
る他の成分、例えば、リーダー配列もまた含有し得る。

【００４０】「作動可能に連結された」は、上記の成分
が、それらの成分を意図した方法で機能させる関係であ
るように並べて配置することを示す。コード配列に「作
動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が
制御配列に適合する条件下で行われるような方法で連結
される。

【００４１】「オープンリーディングフレーム」（ＯＲ
Ｆ）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの
領域である；この領域は、コード配列の一部分または全
コード配列を表す。

【００４２】「コード配列」は、適切な調節配列の制御
下に置かれた場合、ｍＲＮＡに転写され、そして/また
はポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列であ
る。コード配列の境界は、５'末端での翻訳開始コドン
および３'末端での翻訳終止コドンにより決定される。
コード配列は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび組換えポリヌ
クレオチド配列を包含し得るが、それらに限定されるも
のではない。

【００４３】「により/として免疫学的に同定可能な」
は、指定されたポリペプチド、通常ＨＣＶタンパク質中
にもまた存在するエピトープおよびポリペプチドの存在
することをいう。免疫学的な同一性は、抗体による結合
および/または結合における競合により決定され得る；
これらの方法は、当業者には公知である。

【００４４】本明細書中で用いられるように、「エピト
ープ」は、ポリペプチドの抗原性決定基をいう。エピト
ープは、抗体の結合部位を決定する３個またはそれ以上
のアミノ酸を含有し得る。一般に、エピトープは、少な
くとも５個のアミノ酸から成り、そしてある場合には少
なくとも８個のアミノ酸から成る。エピトープのマッピ
ングの方法は、当該分野では公知である。

【００４５】ポリペプチド内に含まれる特異的エピトー
プを抗体が認識することによりそのポリペプチドが抗体
に結合するとき、そのポリペプチドは抗体と「免疫学的
に反応」する。免疫学的な反応性は、抗体結合により、
特に抗体結合の反応速度論により、および/または抗体
が反応するエピトープを含有する既知のポリペプチドを
競合因子として用いて結合する際の競合反応により、決
定され得る。ポリペプチドが抗体と免疫学的に反応する
かどうかを決定する方法は、当該分野では公知である。

【００４６】本明細書中で用いられる「抗体」という用
語は、少なくとも１個の抗体結合部位から成るポリペプ
チドまたはポリペプチド群をいう。「抗体結合部位」ま
たは「結合ドメイン」は、抗体分子の可変ドメインの折
りたたみで形成されており、エピトープの特徴と相補的
であるような、内部表面の形状および電荷の分布を有す
る三次元結合空間を形成し、抗原と免疫学的に反応させ
る。抗体結合部位は、重鎖ドメインおよび/または軽鎖
ドメイン（それぞれＶ_HおよびＶ_L）から形成され得、そ
してそれらのドメインは、抗原結合に寄与する超可変ル
ープ構造を形成する。「抗体」という用語は、例えば、
脊推動物抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、変異抗
体、一価抗体、Ｆａｂタンパク質および単一ドメイン抗
体を包含する。

【００４７】本明細書中で用いられる「単一ドメイン抗
体」（ｄＡｂ）は、ＶＨドメインから成る抗体であり、
指定された抗原と免疫学的に反応する。ｄＡｂは、Ｖ_L
ドメインを含有しないが、抗体中に存在することが知ら
れている他の抗原結合ドメイン、例えばκドメインおよ
びλドメインを含有し得る。ｄＡｂを調製する方法は、
当該分野では公知である。例えば、Ｗａｒｄら（１９８
９）を参照。

【００４８】抗体はまた、Ｖ_HおよびＶ_Lドメイン、およ
び他の既知の抗原結合ドメインから成り得る。これらの
タイプの抗体およびそれらの調製方法の例は、当該分野
では公知であり（例えば、米国特許第４,８１６,４６７
号を参照。本明細書中に援用されている。）、そして以
下のことを包含する。例えば、「脊椎動物抗体」は、テ
トラマーまたはその凝集体である抗体を示し、軽鎖およ
び重鎖を含有する。その軽鎖および重鎖は、通常、
「Ｙ」立体配置内に凝集され、そして鎖間の共有結合的
連結を有し得るか、または有し得ない。脊椎動物抗体に
おいて、特定の抗体のすべての鎖のアミノ酸配列は、イ
ンサイチュまたはインビトロ（例えば、ハイブリドーマ
で）でその抗体を産生するリンパ球により産生されるあ
る種の抗体において見い出される鎖と相同性がある。脊
椎動物抗体は、典型的に、自然抗体、例えば、精製され
たポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を包含
する。これらの抗体の調製方法の例としては、下記に示
す。

【００４９】「ハイブリッド抗体」は、一方の対の重鎖
および軽鎖が、第一抗体の重鎖および軽鎖と相同的であ
るが、他方の対の重鎖および軽鎖が、異なる第二抗体の
重鎖および軽鎖と相同的である、という抗体である。典
型的には、これら２つの対の各々は、異なるエピトープ
と結合し、特に異なる抗原上で結合する。この結果、
「二価」の性質、すなわち２つの抗原を同時に結合する
能力を生じる。そのようなハイブリッドはまた、下記の
ように、キメラ鎖を用いて形成され得る。

【００５０】「キメラ抗体」は、重鎖および/または軽
鎖が融合タンパク質である抗体である。典型的には、そ
の鎖の定常ドメインは、ある特定の種および/またはク
ラスに由来し、そして可変ドメインは、異なる種および
/またはクラスに由来する。さらに、重鎖または軽鎖の
いずれかまたは両方が、異なる起源の抗体の配列を模倣
する配列の組合せから成ることは、これらの起源のクラ
スが異なるか、または起源の異なった種であるかどう
か、そして融合点が、可変部/定常部の境界にあるかど
うか、を包含する。それゆえ、その定常領域または可変
領域のいずれも既知の抗体配列を摸倣しない抗体を産生
することは可能である。次いで、例えば、可変領域が特
定の抗原に対して高い特異的な親和性を有し、または定
常領域への補体結合の程度を大きくし得るような抗体を
構築すること、あるいは特定の定常領域が有する性質を
他に改良することが可能となる。

【００５１】別の例としては「変異抗体」があるが、そ
れは、脊椎動物抗体における天然由来のアミノ酸配列が
変異された抗体をいう。組換えＤＮＡ技術を用いて、抗
体を、所望の特徴を得るために再設計し得る。可能な変
異は多数あり、そしてそれは、１個またはそれ以上のア
ミノ酸の変化からある領域、例えば、定常領域、の完全
な再設計までの範囲で可能である。定常領域における変
化は、一般的に、所望の細胞プロセス特性を得る変化で
あり、例えば、補体結合、膜との相互作用、および他の
エフェクター機能における変化がある。可変領域におけ
る変化は、抗原結合特性を変化させるためになされ得
る。抗体はまた、分子または物質の特異的な細胞または
組織部位への特異的な送達を促進するように設計され得
る。所望の改変は、分子生物学における既知の方法、例
えば、組換え法、部位特異的突然変異誘発によってなさ
れ得る。

【００５２】また別の例は「一価抗体」であり、これ
は、別の重鎖のＦｃ（すなわち、定常）領域に結合した
重鎖/軽鎖のダイマーから成る集合体である。このタイ
プの抗体は、抗原転調を生じない。例えば、Ｇｌｅｎｎ
ｉｅら（１９８２）を参照。

【００５３】抗体の定義内には、抗体の「Ｆａｂ」フラ
グメントもまた含まれる。「Ｆａｂ」領域は、重鎖およ
び軽鎖の部分に関し、この部分は、重鎖および軽鎖の枝
部分を含有し、かつ特殊化された抗原に対し免疫学的結
合を示すが、Ｆｃ部分を欠く配列と、およそ等価である
か、または類似している。「Ｆａｂ」は、１本の重鎖お
よび１本の軽鎖の集合体（通常Ｆａｂ'として知られ
る）、および２本のＨ鎖および２本のＬ鎖を含有するテ
トラマー（Ｆ（ａｂ）₂と呼ばれる）を含み、選択的に
所望の抗原または抗体ファミリーと反応し得る。「Ｆａ
ｂ」抗体は、上記に類似のサブセット、すなわち、「脊
椎Ｆａｂ」、「ハイブリッドＦａｂ」、「キメラＦａ
ｂ」、および「改変Ｆａｂ」に分けられ得る。抗体の
「Ｆａｂ」フラグメントを生成する方法は、当該分野に
おいて周知であり、例えば、タンパク質分解、および組
換え法による合成を包含する。

【００５４】また「抗体」という用語には、一本鎖抗原
結合（ＳＣＡ）タンパク質が含まれ、例えば、１９９２
年６月１５日に発行のＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ
中のＳｃｈｌｏｍ、Ｊ．共著の論文（および本明細書中
に援用された論文）に記戟されたタイプがある。

【００５５】本明細書中で用いられている「免疫原性ポ
リペプチド」という用語は、単独であるいはキャリアと
結合して、アジュバンドの存在または非存在下で、細胞
性および/または体液性の免疫応答を生じさせるポリペ
プチドをいう。

【００５６】「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸
のポリマーについていい、特定の長さの生成物をいうわ
けではない；従って、ペプチド、オリゴペプチド、およ
びタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。こ
の用語はまた、ポリペプチドの発現後の改変物（例え
ば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）につい
て言わず、すなわちこれを除外する。本定義内には、例
えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸のアナログ（例え
ば、非天然アミノ酸などを包含する）を含有するポリペ
プチド、置換された結合を有するポリペプチド、および
当該分野で知られる他の改変物が、天然産生および非天
然産生のいずれであっても含まれ得る。

【００５７】本明細書中で用いられている「形質転換」
は、挿入に用いられる方法に関わらず、外因性ポリヌク
レオチドを宿主細胞へ挿入することをいう。挿入に用い
られる方法には、例えば、直接取込み、形質導入、ｆ交
配、またはエレクトロポーレーションがある。外因性ポ
リヌクレオチドは、非組込みベクター（例えば、プラス
ミド）として維持され得るか、あるいは宿主ゲノム中に
組み込まれ得る。

【００５８】本明細書中で用いられている「処置」は、
予防および/または治療についていう。

【００５９】本明細書中で用いられている「個体」は、
脊推動物、特に多数の哺乳類種についていい、動物（例
えばイヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、
マウス、ラット、モルモットなど）および霊長類（サ
ル、チンパンジー、ヒヒ、およびヒトを包含する）を包
含するが、これに限定されない。

【００６０】本明細書中で用いられている核酸の「セン
ス鎖」は、ｍＲＮＡの配列と配列相同性を有する配列を
含む。「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」の配列に相
補性である配列を含む。

【００６１】本明細書中で用いられているウイルスの
「正鎖ゲノム」は、そのゲノム、すなわちＲＮＡまたは
ＤＮＡのいずれかが一本鎖であり、ウイルスポリペプチ
ドをコードするゲノムである。正鎖ＲＮＡウイルスの例
には、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、コ
ロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、レト
ロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナ
ウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、および
カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）が含
まれる。フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａ
ｅ）もまた含まれ、このウイルスは、以前トガウイルス
科として分類されていた。ＦｉｅｌｄｓおよびＫｎｉｐ
ｅ（１９８６）を参照。

【００６２】本明細書中で用いられている「生体成分含
有抗体」は、目的とする抗体源である個体生体の成分を
いう。生体成分含有抗体は、当該分野において周知であ
り、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、気道の外
分泌、腸管の外分泌、生殖管の外分泌、涙、唾液、乳、
白血球、および骨髄腫を包含するが、これに限定されな
い。

【００６３】本明細書中で用いられている「生体試料」
は、個体から単離した組織または液状物の試料を言い、
血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外分泌、気道の
外分泌、腸管の外分泌、生殖管の外分泌、涙、唾液、
乳、血球、腫瘍、器官、およびインビトロ細胞培養成分
の試料（細胞培地における細胞の増殖から得られる馴化
培地、推定上ウイルスに感染した細胞、組換え細胞、お
よび細胞成分を包含するがこれに限定されない）もまた
包含するが、これに限定されない。

【００６４】ＩＩ．発明の説明本発明の実施においては、他に指示されていなければ、
分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の
従来の技法が用いられ、これらは当該分野の技術範囲内
である。このような技法は、文献に充分に説明されてい
る。例えば、以下を参照。Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｆｉｔｓ
ｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ」（１９８２）；「ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏ
ｌｕｍｅｓＩａｎｄＩＩ」（Ｄ．ＮＧｌｏｖｅ
ｒ編１９８５）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編１９８
４）；「ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇ
ｇｉｎｓ編１９８４）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ
ｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．Ｈａ
ｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編１９８４）；
「ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．
Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉ
ｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓＡｎｄＥｎｚｙｍｅｓ」
（ＩＲＬＰｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａ
ｌ、「ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅＴｏＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）；シリ
ーズ、「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ」（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；
「ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓＦｏｒ
ＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌ
ｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編１９８７、Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）、ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ第１５４巻および第１
５５巻（それぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、およ
びＷｕ編）ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８
７）、「ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄ
ｓＩｎＣｅｌｌＡｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇｙ」（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｌｏ
ｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ（１９８７）「Ｐｒｏｔｅｉ
ｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ」、第２版（Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．）；および「Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ，ＷｅｉｒおよびＣ．
Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編１９８６）。本明細書中に
記載の全ての特許、特許出願、および刊行物は、上記お
よび下記ともに、本明細書中に参考として援用されてい
る。

【００６５】ＩＩ．Ａ．短型ＨＣＶポリペプチド本発明の有用な物質および方法は、新規なＨＣＶエピト
ープを以下のように同定することにより実行可能とな
る。これらのエピトープ（または抗原領域）を知ること
により、短縮型ＨＣＶ配列を含有するポリペプチドの構
築が可能となる。このポリペプチドは、免疫学的試薬と
して用いられ得る。

【００６６】少なくとも１つのウイルスエピトープをコ
ードする短縮型ＨＣＶアミノ酸配列は、有用な免疫学的
試薬である。例えば、このような短縮型配列を含むポリ
ペプチドは、イムノアッセイの試薬として用いられ得
る。これらのポリベプテドはまた、抗血清の生成または
ワクチンのための組成物における候補サブユニット抗原
である。これらの短縮型配列は天然ウイルスタンパク質
の種々の既知の処理により生成され得るが、一般に、Ｈ
ＣＶ配列を含む合成または組換えポリペプチドを調製す
ることが好ましい。これらの短縮型ポリペプチドを含む
ポリペプチドは、ＨＣＶ配列（連続したまたは連続しな
い１つまたはそれ以上のエピトープ）のみから、または
ＨＣＶ配列および融合タンパク質中の異種配列から、形
成され得る。有用な異種配列は、組換え宿主から分泌さ
せるか、ＨＣＶエピトープの免疫反応性を高めるか、ま
たはポリペプチドのイムノアッセイ支持体またはワクチ
ンキャリアヘの結合を容易にする配列を包含する。例え
ば、ヨーロッパ公開公報第１１６,２０１号；米国特許
第４,７７２,８４０号；ヨーロッパ公開公報第２５９,
１４９号；米国特許第４,６２９,７８３号。これらの文
献の開示は、本明細書中に参考として援用されている。

【００６７】短縮型ＨＣＶ配列を含むポリペプチドのサ
イズは、広い範囲で変化し得る。最小サイズは１つのＨ
ＣＶエピトープを与えるのに充分なサイズの配列であ
り、一方最大サイズは重要ではない。便宜上、最大サイ
ズは、通常、所望のＨＣＶエピトープ、および異種配列
がある場合にはその機能を与えるのに必要なサイズより
も実質的に大きいサイズではない。典型的には、短縮型
ＨＣＶアミノ酸配列は、長さが約５（または８）から約
１００アミノ酸までの範囲内にある。しかし、より典型
的には、ＨＣＶ配列は、最大の長さが約５０（または４
０）アミノ酸であり、時には最大の長さは約２０、２
５、または３０アミノ酸である。少なくとも約８、１
０、１２、または１５アミノ酸のＨＣＶ配列を選択する
ことが、通常望ましい。

【００６８】本明細書中に記載のように有用である短縮
型ＨＣＶアミノ酸配列（オクタマー）の例は、以下の実
施例中で説明される。これらのペプチドは１つのエピト
ープを必ずしも正確にマッピングしないことが理解され
るべきである。配列中の非免疫原性部分は、従来の方法
を用いて定められ、記載の配列から除かれ得る。さら
に、エピトープを含有するか、または免疫原性である付
加的な短縮型ＨＣＶアミノ酸配列が、本明細書中に記載
のようにして同定され得る。

【００６９】以下で開示される短縮型ＨＣＶアミノ酸配
列を含むポリペプチド生成物は、個々のペプチドとして
調製され得るか、またはより大きなポリペプチド中に取
り込まれ得て、本明細書中に記載のような使用に用いら
れ得る。好ましい適用においては、Ｅ１および/または
Ｅ２ドメインから得られる短縮型配列が、ワクチンおよ
び治療生成物に適用される。通常、ドメインのいずれも
が診断上の有用性を有し得るが、Ｃ、ＮＳ３、ＮＳ４、
およびＮＳ５が特に好ましく、Ｃエピトープと１つまた
はそれ以上のＮＳ３、ＮＳ４、またはＮＳ５ドメインか
ら得られるエピトープとの組合せが特に好ましい。

【００７０】ＩＩ．Ｂ．ポリペプチドの調製ＨＣＶアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が得られる
ことにより、ポリペプチドの抗原活性領域をコードする
発現ベクターの構築が可能となる（例えば、図２を参
照）。これらの抗原活性領域は、コートまたはエンベロ
ープ抗原、コア抗原、または非構造性の抗原から由来し
得る。非構造性の抗原には、例えば、ポリヌクレオチド
結合タンパク質、ポリヌクレオチドポリメラーゼ、およ
びウイルス粒子の複製および/または集合に必要とされ
る他のウイルスタンパク質が包含される。所望のポリペ
プチドをコードするフラグメントは、例えば、従来の制
限消化を用いてウイルスｃＤＮＡクローンから、または
合成法により誘導され、そして、例えば、β−ガラクト
シダーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）のような融合配列の部分、好ましくはＳＯＤを含み
得るベクターに連結される。ＳＯＤの融合配列を含むポ
リペプチドの産生に有用である方法およびベクターは、
１９８６年１０月１日に発行されたヨーロッパ公開公報
第０１９６０５６号に記載されている。ＳＯＤおよびＨ
ＣＶポリペプチドの融合ポリペプチドをコードするベク
ター、すなわちＮＡＮＢ_5-1-1、ＮＡＮＢ₈₁、およびＣ
１００−３（これはＨＣＶｃＤＮＡの合成体中でコー
ドされる）は、それぞれ、ＩＶ．Ｂ．１、ＩＶ．Ｂ．
２、およびＩＶ．Ｂ．４の部に記載されている。オープ
ンリーディングフレームを含むＨＣＶｃＤＮＡのいず
れの所望の部分（あるいはそれらの合成変形物）も、組
換えポリペプチド、例えば、成熟タンパク質または融合
タンパク質を発現するために用いられ得る。

【００７１】あるいは、ＨＣＶエピトープを含有するポ
リペプチドは、図面および実施例のアミノ酸配列に基づ
いて、標準的方法を用いる化学合成により与えられ得
る。

【００７２】所望のポリペプチド配列をコードするＤＮ
Ａは、融合型か非融合型かに関わらず、そして分泌を可
能にするシグナル配列を含むかどうかに関わらず、いず
れかの便利な宿主に適切である発現ベクター中に連結さ
れ得る。真核生物および原核生物の両方の宿主系が、組
換えポリペプチドの形成に現在用いられており、宿主細
胞株は、ヨーロッパ公開公報第３１８,２１６号に提示
されている。次いで、ポリペプチドを、溶解させた細
胞、または細胞培地から単離し、目的とする使用に必要
とされる程度にまで精製する。精製は、当該分野におい
て既知である方法によりなされ得、その方法には、例え
ば、分別抽出、塩分画、イオン交換樹脂クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離な
どがある。例えば、タンパク質を精製する種々の方法に
関するＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙを
参照。このようなポリペプチドは、診断用薬として用い
られ得、または中和抗体を生じるポリペプチドは、ワク
チンに処方され得る。これらのポリペプチドに対して生
成させた抗体もまた、診断用薬として、または受動免疫
療法のために用いられ得る。さらに、以下で議論される
ように、これらのポリペプチドに対する抗体は、例え
ば、ＨＣＶ粒子を単離し、同定するのに有用である。

【００７３】ＨＣＶポリペプチドはまた、ＨＣＶビリオ
ンから単離され、（まだ短縮されていない場合は）短縮
され得る。ビリオンは、組織培養におけるＨＣＶ感染細
胞中で、または感染宿主中で生育し得る。

【００７４】ＩＩ．Ｃ．抗原ポリペプチドの調製、およ
びキャリアとの複合体化ポリペプチドの抗原領域は、一般的に比較的短い。典型
的には８個から１０個のアミノ酸またはそれより短い長
さである。わずか５個程度のアミノ酸のフラグメントで
も、抗原領域を特徴付け得る。これらのセグメントは、
ＨＣＶ抗原の領域に対応し得る。従って、基準としてＨ
ＣＶのｃＤＮＡを用いて、ＨＣＶポリペプチドの短いセ
グメントをコードするＤＮＡが、融合タンパク質とし
て、または単離されたポリペプチドとして、組換えによ
り発現され得る。さらに、短いアミノ酸配列は、化学的
合成により、好都合に得られ得る。合成されたポリペプ
チドが、正確に形成されて正しいエピトープを提供する
ものの、短すぎるので免疫原性でない場合には、このポ
リペプチドは適切なキャリアと連結され得る。

【００７５】このような連結を行うための多くの技法
が、当該分野において知られている。その例としては、
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロ
ピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４−
（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カル
ボキシレート（ＳＭＣＣ）（ＰｉｅｒｃｅＣｏｍｐａ
ｎｙ（Ｒｏｏｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入
手）を用いるジスルフィド結合の形成がある（ペプチド
がスルフヒドリル基を有しない場合には、これはシステ
イン残基の付加により提供され得る）。これらの試薬
は、試薬自身と１方のタンパク質上のペプチドシステイ
ン残基との間でジスルフィド結合を創り出し、そして他
方のタンパク質におけるリジン上のε−アミノ基または
他の遊離アミノ基を介してアミド結合を創り出す。種々
のそのようなジスルフィド/アミド形成剤が既知であ
る。例えば、ＩｍｍｕｎＲｅｖ（１９８２）６２：１
８５を参照。他の二官能性カップリング剤は、ジスルフ
ィド結合ではなくチオエーテルを形成する。多くのこれ
らのチオ−エーテル形成剤が市販されている。例えば、
６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨー
ド酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサ
ン−１−カルボン酸などの反応性エステルがある。これ
らのカルボキシル基は、コハク酸イミドまたは１−ヒド
ロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩と
の結合により活性化され得る。カップリング剤のさらな
る方法は、ヨーロッパ公開公報第２５９,１４９号に記
載のロタウイルス/「結合ペプチド」系を用い、それら
の開示は、本明細書中に援用されている。上記のリスト
は包括的ではなく、指定の化合物の改変物が使用され得
ることは明らかである。

【００７６】宿主に有害な抗体の産生をそれ自身誘発し
ない任意のキャリアが使用され得る。適切なキャリア
は、典型的には、代謝速度の遅い巨大分子、例えば、タ
ンパク質；ポリサッカライド（例えば、ラテックス官能
化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（登録商標）、
アガロース、セルロース、セルロースビーズなど）；ポ
リマー性アミノ酸（例えば、ポリグルタミン酸、ポリリ
ジンなど）；アミノ酸コポリマー；および不活性ウイル
ス粒子である。例えば、セクションＩＩ.Ｄ.を参照。特
に、有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホ
ールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サ
イログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、
および当業者に公知の他のタンパク質である。

【００７７】ＩＩ．Ｄ．ＨＣＶエピトープを含有するハ
イブリッド粒子免疫原の調製ＨＣＶのエピトープの免疫原性は、粒子形成タンパク質
と融合させるかまたは構築させた哺乳類系または酵母系
においてエピトープを調製することによっても高められ
得る。粒子形成タンパク質としては、例えば、Ｂ型肝炎
表面抗原に関連するものなどがある。例えば、米国特許
第４,７２２,８４０号を参照。粒子形成タンパク質コー
ド配列にＨＣＶエピトープが直接連結している構築物
は、ＨＣＶエピトープに関して免疫原性であるハイブリ
ッドを生成する。さらに、調製される全てのベクター
は、ＨＢＶに対して特異的であり、例えばプレ−Ｓペプ
チドのような種々の程度の免疫原性を有するエピトープ
を含有している。従って、ＨＣＶ配列を含む粒子形成タ
ンパク質から構築される粒子は、ＨＣＶおよびＨＢＶに
関して免疫原性である。

【００７８】肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）は、Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｐ．Ｔａｌｅｎｚｕｅｌａら（１９
８２））、および例えば哺乳類細胞（Ｐ．Ｖａｌｅｎｚ
ｕｅｌａら（１９８４））において、形成され、構築さ
れて粒子となることが示されている。このような粒子の
形成により、モノマーサブユニットの免疫原性が高めら
れることが示されている。この構築物は、プレ表面（プ
レ−Ｓ）領域の５５アミノ酸を含むＨＢＳＡｇの免疫優
性エピトープをも含有し得る。Ｎｅｕｒａｔｈら（１９
８４）。酵母において発現し得るプレ−Ｓ−ＨＢＳＡｇ
の構築物は、１９８６年３月１９日に発行されたヨーロ
ッパ公開公報第１７４,４４４号に開示されており；酵
母の発現のための非相同のウイルス配列を含むハイブリ
ッドは、１９６６年３月２６日に発行されたヨーロッパ
公開公報第１７５,２６１号に開示されている。これら
の構築物はまた、ＳＶ４０−ジヒドロ葉酸レダクターゼ
ベクターを用いて、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞のような哺乳類細胞においても発現され得る
（Ｍｉｃｈｅｌｌｅら（１９８４））。

【００７９】さらに、粒子形成タンパク質コード配列の
一部は、ＨＣＶエピトープをコードするコドンで置換さ
れ得る。この置換では、酵母または哺乳類において免疫
原性粒子を形成するためにユニットが集合することを仲
介するのに必要でない領域は削除され得、これによりＨ
ＣＶエピトープとの競合から付加的なＨＢＶ抗原部位が
除去され得る。

【００８０】ＩＩ．Ｅ．ワクチンの調製ワクチンは、１つあるいはそれ以上の、ＨＣＶ由来の免
疫原性ペプチドから調製され得る。これらのポリペプチ
ドは種々の宿主細胞（例えば、バクテリア、酵母、昆
虫、または哺乳類細胞）で発現され得、またはウイルス
調製物から単離され得るか、あるいは合成により生成さ
れ得る。ＨＣＶに対する１価または多価のワクチンは、
１つあるいはそれ以上の構造タンパク質由来の１つある
いはそれ以上のエピトープ、および/または１つあるい
はそれ以上の非構造タンパク質由来の１つあるいはそれ
以上のエピトープから構成され得る。これらのワクチン
は、例えば組換えＨＣＶポリペプチドおよび/またはビ
リオンから単離されたポリペプチドから構成され得る。
特に、１つあるいはそれ以上の以下に示すＨＣＶタンパ
ク質、またはそれら由来のサブユニット抗原を含むワク
チンが考察される：Ｅ１、Ｅ２、Ｃ、ＮＳ２、ＮＳ３、
ＮＳ４、およびＮＳ５。特に好ましいワクチンは、Ｅ１
および/またはＥ２、またはそれらのサブユニットを含
んでいる。

【００８１】上記に加え、１つあるいはそれ以上の組換
えＨＣＶポリペプチドを発現する弱毒化微生物の生ワク
チンを調製することもまた可能である。適切な弱毒化微
生物は、当該分野で既知であり、例えばウイルス（例、
ワクチニアウイルス（Ｂｒｏｗｎら（１９８６）を参
照））、およびバクテリアを包含する。

【００８２】活性成分として免疫原性ポリペプチドを含
有するワクチンの調製は、当業者に既知である。典型的
には、このようなワクチンは、溶液または懸濁液のいず
れかとして、注入可能に調製される；注入前の液体中の
溶解または懸濁に適した固形物の形態でもまた調製され
得る。調製物はまた乳濁され得、またはタンパク質がリ
ポソームにカプセル化され得る。活性免疫原性成分は、
薬学的に受容可能であって、活性成分に適合した賦形剤
としばしば混合される。適切な賦形剤には、例えば、
水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタ
ノールなど、およびそれらの混合物がある。さらに、所
望であれば、ワクチンは、少量の補助剤（例えば加湿剤
または乳化剤）、ｐＨ緩衝剤、および/またはワクチン
の効能を高めるアジュバントを含有し得る。有効であり
得るアジュバントの例は、限定されないが、以下を包含
する：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−
Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤ
Ｐ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−
Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤ
Ｐと称せられる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニ
ル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１'
−２'−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロ
キシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８
３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称せられる）、およびＲＩＢ
Ｉ。ＲＩＢＩは、バクテリアから抽出した３成分、すな
わちモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレー
ト、および細胞壁骨格（ＨＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２
％スクアレン/Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０エマルジョ
ン中に含有している。アジュバントの効能は、ＨＣＶ抗
原配列を含む免疫原性ポリペプチドおよび種々のアジュ
バントから構成されるワクチンを投与することにより生
じる、この免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測
定することにより決定され得る。

【００８３】本ワクチンは、通常非経口的に、例えば皮
下注射または筋内注射のような、注射により投与され
る。他の投与態様に適切な別の処方としては、坐薬、お
よびある場合には経口処方薬が挙げられる。坐薬につい
て、従来の結合剤および担体には、例えば、ポリアルキ
レングリコールまたはトリグリセリドが含まれ得る；こ
のような坐薬は、活性成分を０.５％から１０％までの
範囲で、好ましくは１％から２％までの範囲で含有する
混合物から形成され得る。経口処方薬は、通常用いられ
る賦形剤を含有する。この賦形剤としては、例えば、薬
学的なグレードのマンニトール、ラクトース、デンプ
ン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウ
ム、セルロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。
これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセ
ル剤、持続放出処方剤、または粉末剤の形態をとり、１
０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を
含有する。タンパク質は、中性または塩基性の形態で
ワクチンに処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、酸
付加塩（ペプチドの遊離アミノ基により形成される）で
あって、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有
機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸など）によ
り形成される塩を包含する。遊離カルボキシル基による
塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸
化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、
または水酸化第２鉄）、および有機塩基（イソプロピル
アミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノー
ル、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。

【００８４】ＩＩ．Ｆ．ワクチンの投与量および投与本ワクチンは、投与処方に適した方法で、そして予防お
よび/または治療効果があるような量で投与される。投
与されるべき量は、通常投与当たり抗原を５μｇから２
５０μｇまでの範囲であり、これは、処置される患者、
その患者の免疫系での抗体合成能、および所望の防御の
程度に依存する。投与されるべき活性成分の正確な量
は、医師の判断に依存し得、各患者に特有であり得る。

【００８５】本ワクチンは、単独投与スケジュールで、
または好ましくは複合投与スケジュールで与えられ得
る。複合投与スケジュールでは、予防接種の開始時期に
１〜１０の個別の投与を行い、続いて免疫応答を維持す
るおよびまたは強化するのに必要とされる時間間隔で、
例えば２回目の投与として１〜４ヵ月後に、別の投与を
行い得る。必要であれば、数ヶ月後に引続き投与を行い
得る。投与のレジメもまた、少なくとも部分的には、個
体の必要性により決定され、医師の判断に依存する。

【００８６】さらに、免疫原性ＨＣＶ抗原を含有するワ
クチンは、他の免疫制御剤（例えば、免疫グロブリン）
と共に投与され得る。

【００８７】ＩＩ．Ｇ．ＨＣＶエピトープに対する抗体
の調製本明細書中に記載される免疫原性ポリペプチドは抗体を
産生するために用いられ、この抗体はポリクローナルお
よびモノクローナルを包含する。ポリクローナル抗体が
所望である場合、選択された哺乳類（例えば、マウス、
ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、ＨＣＶエピトープを有す
る免疫原性ポリペプチドで免疫感作する。感作動物由来
の血清を採集し、既知の手法に従って処理する。ＨＣＶ
エピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清
が他の抗原に対する抗体を含有する場合、このポリクロ
ーナル抗体はイムノアフィニティークロマトグラフィー
により精製され得る。ポリクローナル抗血清を産生およ
び処理する方法は当該分野で既知であり、例えばＭａｙ
ｅｒおよびＷａｌｋｅｒ（１９８７）を参照。あるい
は、ポリクローナル抗体は、既にＨＣＶに感染した哺乳
類から単離され得る。

【００８８】ＨＣＶエピトープに対するモノクローナル
抗体もまた、当業者により容易に製造され得る。ハイブ
リドーマによりモノクローナル抗体を産生する一般的な
方法は、周知である。不朽抗体産生細胞株は、細胞融合
により生成され得、また、腫瘍遺伝子ＤＮＡによるＢリ
ンパ球の直接形質転換またはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ
ウイルスでの形質移入のような他の方法によっても生成
され得る。例えば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９８
０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（１９８１）；Ｋｅｎｎ
ｅｔｔら（１９８０）；さらに米国特許第４,３４１,７
６１号；第４,３９９,１２１号；第４,４２７,７８３
号；第４,４４４,８８７号；第４,４６６,９１７号；第
４,４７２,５００号；第４,４９１,６３２号；および第
４,４９３,８９０号を参照。ＨＣＶエピトープに対して
産生されたモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性
（例えばイソタイプ、エピトープ親和性など）について
スクリーンされ得る。

【００８９】ＨＣＶエピトープに対する抗体は、モノク
ローナルおよびポリクローナルとも、特に診断に有用で
あり、また中和抗体は受動免疫療法に有用である。モノ
クローナル抗体は、特に、抗イディオタイプ抗体を増大
させるために用いられ得る。

【００９０】抗イディオタイプ抗体は、それに対する防
御が望まれる感染因子の抗原の「内部イメージ」を有す
る免疫グロブリンである。例えば、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ．
Ａ．ら（１９８１）およびＤｒｅｅｓｍａｎら（１９８
５）を参照。抗イディオタイプ抗体を増大させる方法
は、当該分野において既知である。例えば、Ｇｒｚｙｃ
ｈ（１９８５）、ＭａｃＮａｍａｒａら（１９８４）、
およびＶｙｔｄｅｈａａｇら（１９８５）を参照。これ
らの抗イディオタイプ抗体はまた、ＮＡＮＢＨの治療、
予防接種、および/または診断、およびＨＣＶ抗原の免
疫原性領域の解明のために有用であり得る。

【００９１】ＩＩ．Ｈ．イムノアッセイおよび診断キッ
ト本発明のポリペプチドおよび抗体共に、例えば、生体試
料における、ＨＣＶ抗体の存在、またはウイルスおよび
/またはＨＣＶポリペプチド（またはエピトープ）の存
在を検出するイムノアッセイにおいて有用である。イム
ノアッセイの設計は多くの変化を受け易く、多くの形式
が当該分野において既知である。このイムノアッセイ
は、ＨＣＶ由来の少なくとも１つのウイルスエピトープ
を利用する。１つの実施態様においては、イムノアッセ
イは、ＨＣＶ由来の複数のウイルスエピトープの組合せ
を利用する。これらのエピトープは、同一のまたは種々
のウイルスポリペプチドに由来し得、個々の組換えまた
は天然のポリペプチド中に存在し得るか、または同一の
組換えポリペプチド中に存在し得る。イムノアッセイ
は、例えば、ウイルスエピトープに対する１つのモノク
ローナル抗体、１つのウイルス抗原の複数のエピトープ
に対するモノクローナル抗体の組合せ、種々のウイルス
抗原の複数のエピトープに対するモノクローナル抗体、
同一のウイルス抗原に対するポリクローナル抗体、また
は種々のウイルス抗原に対するポリクローナル抗体を用
い得る。プロトコルはまた、例えば、競合、または直接
反応、またはサンドウィッチ型アッセイに基づき得る。
プロトコルはまた、例えば固体支持体を用い得るか、ま
たは免疫沈降によるものであり得る。ほとんどのアッセ
イは、標識抗体または標識ポリペプチドの使用を包含す
る；この標識は、例えば酵素、蛍光、ケミルミネッセン
ス、放射線、または染色分子であり得る。プローブから
のシグナルを増幅するアッセイもまた既知である；この
ようなアッセイの例としては、ビオチンとアビジンとを
用いるアッセイ、および酵素標識および媒介イムノアッ
セイ（例えばＥＬＩＳＡアッセイ（以下に記載する））
が挙げられる。

【００９２】典型的には、抗ＨＣＶ抗体に対するイムノ
アッセイは、抗体を含有する疑いのある試験試料（例え
ば生体試料）を選別および調製すること、次いでその試
験試料を、抗原抗体複合体が形成し得る条件下で抗原性
（すなわちエピトープ含有）ＨＣＶポリペプチドと共に
インキュベートすること、さらに次いでそのような複合
体の形成を検出することを包含する。適切なインキュベ
ーション条件は、当該分野において周知である。このイ
ムノアッセイは、限定はされないが、均一または不均一
な形式であり得、標準タイプまたは競合タイプからなり
得る。

【００９３】不均一形式では、インキュベーション後の
ポリペプチドからの試料の分離を容易にするために、ポ
リペプチドを典型的には固体支持体に結合させる。用い
られ得る固体支持体の例には、ニトロセルロース（例え
ば、膜状またはマイクロタイターウェル状）、ポリ塩化
ビニル（例えば、シート状またはマイクロタイターウェ
ル状）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ状ま
たはマイクロタイタープレート状）、ポリフッ化ビニリ
ジン（Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）として知られる）、
ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、およびプロテ
インＡビーズがある。例えば、ＤｙａｎａｔｅｃｈＩｍ
ｍｕｌｏｎ（登録商標）１またはＩｍｍｕｌｏｎ（登録
商標）２マイクロタイタープレートまたは０.２５イン
チポリスチレンビーズ（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＰｌａｓ
ｔｉｃＢａｌｌ）が、不均一形式において用いられ得
る。抗原性ポリペプチドを含有する固体支持体は、典型
的には試験試料から分離した後で、結合された抗体の検
出前に洗浄される。標準形式および競合形式共に、当該
分野において既知である。

【００９４】均一形式では、試験試料は溶液中の抗原と
共にインキュベートされる。例えば、このインキュベー
トは、形成される抗原抗体複合体のいずれもを沈降させ
る条件下で行われ得る。これらのアッセイの標準形式お
よび競合形式共に、当該分野において既知である。

【００９５】標準形式では、抗体抗原複合体を形成する
ＨＣＶ抗体量は、直接モニターされる。これは、抗ＨＣ
Ｖ抗体上のエピトープを認識する標識抗異種（例えば、
抗ヒト）抗体が複合体形成により結合するかどうかを測
定することにより行われ得る。競合形式では、試料中の
ＨＣＶ抗体量は、複合体中の既知の量の標識抗体（また
は他の競合リガンド）の結合への競合効果をモニターす
ることにより推定される。

【００９６】抗ＨＣＶ抗体を含有する形成された複合体
（または、競合アッセイの場合では、競合抗体の量）
は、多くの既知の方法のいずれかにより検出され、その
方法は形式に依存する。例えば、複合体中の非標識ＨＣ
Ｖ抗体は、標識と複合体化された抗異種Ｉｇの複合体
（例えば、酵素標識）を用いて検出され得る。

【００９７】ＨＣＶポリペプチドが分析物であるイムノ
アッセイでは、試験試料、典型的には生体試料は、抗原
抗体複合体が形成され得る条件下で、抗ＨＣＶ抗体と共
にインキュベートされる。種々の形式が採用され得る。
例えば、「サンドウィッチアッセイ」が採用され得る
が、このアッセイでは、固体支持体に結合した抗体を試
験試料と共にインキュベートし、洗浄して、分析物に対
する標識された第２の抗体と共にもう一度インキュベー
トし、そして支持体を再び洗浄する。分析物は、第２の
抗体が支持体に結合されていることを測定することによ
り検出される。競合アッセイでは、これは不均一または
均一のいずれかであり得るが、通常、試験試料を抗体と
インキュベートし、そして標識した競合抗原もまた、続
けてまたは同時にインキュベートする。これらおよび他
の形式は、当該分野において周知である。

【００９８】ＨＣＶ感染について有効な検出システム
は、上述のようにエピトープのパネルの使用を包含し得
る。パネル中のエピトープは、１つまたは複数のポリペ
プチド中に構築され得る。種々のエピトープに対するア
ッセイは、連続的にまたは同時に行い得る。

【００９９】固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、抗
原濃度または抗体濃度のいずれかを測定するために用い
られ得る。この方法は、抗原または抗体に対する酵素の
複合体化に依存し、定量標識として結合した酵素活性を
用いる。抗体を測定するためには、既知の抗原を固相
（例えば、マイクロプレートまたはプラスチックカッ
プ）に固定し、それを試験血清希釈液とインキュベート
し、洗浄し、さらに酵素で標識した抗免疫グロブリンと
インキュベートし、再び洗浄する。標識するのに適切な
酵素は、当該分野において既知であり、例えばワサビダ
イコン（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼを
包含する。特異的な基質を加え、生成物の形成または基
質の利用を比色法により測定することにより、固相に結
合した酵素活性を測定する。結合した酵素活性は、結合
した抗体の量の正の関数である。

【０１００】抗原を測定するためには、既知の特異的な
抗体を固相に固定し、抗原を含有する試験物質を加え、
インキュベーション後に固相を洗浄し、さらに別の酵素
標識抗体を加える。洗浄後、基質を加え、酵素活性を比
色法により評価し、抗原濃度に関連づける。免疫診断に
好適であり適切な標識化試薬を含むキットは、適切な材
料を包装することにより組み立てられる。このキット
は、適切な容器の中に、ＨＣＶエピトープを含有する本
発明のポリペプチドまたはＨＣＶエピトープに対する抗
体を含み、さらにこのアッセイの実施に必要とされる他
の試薬および材料、および適切なアッセイの指示書を含
む。

【０１０１】ＩＩＩ．一般方法本発明の実施に用いられる一般的な方法は、例えば本明
細書中に引用した参考文献、特にヨーロッパ公開公報第
３１８,２１６号および第３８８,２３２号、および文献
目録に載せた参考文献中に見いだされ得る。これらの文
献は、本明細書中に参考として援用される。

【０１０２】

【実施例】ＩＶ．実施例以下に記載する本発明の実施例は、例示の目的でのみ提
示され、本発明の範囲を制限しない。本明細書の開示を
考慮すると、請求項の範囲内にある多くの実施態様が当
業者に明らかである。

【０１０３】ＩＶ．Ａ．ＨＣＶゲノムのエピトープマッ
ピング以下の実施例は、図１に示されるＨＣＶ１ポリタンパク
質配列上で行われたエピトープマッピング実験の結果で
ある。図３〜１１に示されるように、ＨＣＶ分離株間に
は異質性があり、これらのアミノ酸の置換が以下に記載
のオクタマー中でなされ得ることを示している。他のＨ
ＣＶ分離株の対応する位置でのアミノ酸での置換に加
え、特定のアミノ酸の合成アナログでの置換または電荷
に基づく保存的置換など（特に置換が抗体結合を破壊し
ない場合）は、本発明の範囲内にある。

【０１０４】ＩＶ．Ａ．１．重複ペプチドの合成８×１２配列のブロックに配置したポリエチレン製ピン
（ＣｏｓｅｌｃｏＭｉｍｅｔｏｐｅｓ，Ｖｉｃｔｏｒ
ｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、室温で３０分間ピンを
浴槽（２０％ｖ/ｖピペリジンのジメチルホルムアミド
（ＤＨＦ）溶液）中に置くことにより調製した。次いで
このピンを取り出してＤＭＦ中で５分間洗浄し、次いで
メタノール中で４回（各洗浄に２分）洗浄した。ピンを
少なくとも１０分間空気乾燥させ、次いでＤＭＦ中で最
終的に洗浄した（５分）。１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール（ＨＯＢｔ、３６７ｍｇ）をＤＭＦ（８０ｍＬ）
に溶解し、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を結合させるために用
いた：Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａ１ａ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ
−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ
（Ｏ−ｔＢｕ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｏ
−ｔＢｕ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＰｆ
ｐ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉ
ｓ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＰ
ｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐ、Ｆ
ｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ
−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏ
ｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｏ
Ｐｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−ＯＰｆｐ、
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＤｈｂｔ、Ｆｍ
ｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＤｈｂｔ、Ｆｍｏｃ
−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＰｆｐ、およびＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ
−ＯＰｆｐ。

【０１０５】保護アミノ酸をＨＯＢｔと共にマイクロタ
イタープレートウェル中に置き、ピンブロックをプレー
ト上に配し、ピンをウェル中に浸漬した。次いでこの組
合せをプラスチックバッグ中にシールし、２５℃で１８
時間反応させて最初のアミノ酸をピンに結合させた。次
いでブロックを取り外し、ピンをＤＨＦ（２分）、Ｍｅ
ＯＨ（４×２分）で洗浄し、さらにＤＭＦ（２分）で洗
浄して、結合アミノ酸を清浄化し、脱保護した。この手
順を繰り返して、さらに各アミノ酸を結合させ、全ての
オクタマーを調製した。

【０１０６】次いで遊離Ｎ末端をアセチル化し、遊離ア
ミドを代償した。これは、エピトープのほとんどはＮ末
端に存在せず、従って関連する正の電荷を有さないこと
による。マイクロタイタープレートのウェルをＤＭＦ/
無水酢酸/トリエチルアミン（５：２：１ｖ/ｖ/ｖ）で
満たし、ピンをウェル中で２０℃で９０分間反応させる
ことにより、アセチル化を行った。次いでこのピンをＤ
ＭＦ（２分）およびＭｅＯＨ（４×２分）で洗浄し、少
なくとも１０分間空気乾燥した。

【０１０７】ピンをトリフルオロ酢酸/フェノール/ジチ
オエタン（９５：２.５：２.５ｖ/ｖ/ｖ）を用いてポリ
プロピレンバッグ中室温で４時間処理し、側鎖保護基を
除去した。次いでピンをジクロロメタン（２×２分）中
で洗浄し、さらに５％ジイソプロピルエチルアミン/ジ
クロロメタン（２×５分）、ジクロロメタン（５分）中
で洗浄し、そして少なくとも１０分間空気乾燥した。次
いでピンを水（２分）、次いでＭｅＯＨ（１８時間）中
で洗浄し、減圧下で乾燥し、シールしたプラスチックバ
ッグ中にシリカゲル上で保存した。ＩＶ．Ａ．２．ペプチドのアッセイ上記のように調製したオクタマー含有ピンを、初めに破
壊緩衝液（１％ドデシル硫酸ナトリウム、０.１％２−
メルカプトエタノール、０.１ＭＮａＨ₂ＰＯ₄）中６
０℃で３０分間超音波処理した。次いでピンを水（６０
℃）に数回浸漬し、続いて沸騰ＭｅＯＨ（２分）に浸漬
し、空気乾燥した。次いで遮断緩衝液２００μＬ（１％
オボアルブミン、１％ＢＳＡ、０.１％Ｔｗｅｅｎ（登
録商標）、および０.０５％ＮａＮ₃のＰＢＳ溶液）を含
有するマイクロタイターウェル中で、２５℃で１時間攪
拌しながらピンを前被覆した。次いで、このピンを、Ｈ
ＣＶを有すると診断されたヒト患者から得られた抗血清
１７５μＬを含有するマイクロタイターウェル中に浸漬
し、４℃で一晩インキュベートした。ピンは３人の患者
から得た抗血清に対してアッセイした。標本＃ＰＡＡ
３６６３−ｓ（「Ａ」）は、ＨＣＶウェスタンブロッ
ト、ＨＣＶ競合ＥＬＩＳＡ、クローンＣ１００−３
（１：１０００希釈）に対するＨＣＶＥＬＩＳＡで強
い反応を示し、Ｃ１００、５−１−１、およびＣ３３ｃ
（Ｃ２２は行わず）に対するＲＩＢＡ応答で＞４＋を示
した。（抗原/クローン名は、ヨーロッパ公開公報第３
１８,２１６号および第３８８,２３２号、およびＯｒｔ
ｈｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ．から入手可能なＨＣＶイムノアッセイに関する文献
中に記載されている名前による。）血漿原液は遮断緩衝
液中で１：５００に希釈した。標本＃ＰＡＡ３３０２
８（「Ｂ」）は、ＨＣＶウェスタンブロット、ＨＣＶ競
合ＥＬＩＳＡ、クローンＣ１００−３（１：５００希
釈）に対するＨＣＶＥＬＩＳＡで強い反応を示し、Ｃ
１００、５−１−１、Ｃ３３Ｃ、およびＣ２２に対する
ＲＩＢＡ応答で＞４＋を示した。ポリクローナル抗血清
は、プロテインＡカラムを通すことにより部分的に精製
し、遮断緩衝液中で１：２００に希釈して用いた。標本
＃ＰＡＡｓ３２９３１（「Ｃ」）は、ＨＣＶウェスタ
ンブロット（３＋）、ＨＣＶ競合ＥＬＩＳＡ、クローン
Ｃ１００−３（１：６４希釈）に対するＨＣＶＥＬＩＳ
Ａで中程度の反応を示し、Ｃ１００および５−１−１に
対する（Ｃ３３ｃおよびＣ２２は行わず）ＲＩＢＡ応答
でそれぞれ３＋および４＋を示した。ポリクローナル抗
血清は、プロテインＡカラムを通すことにより部分的に
精製し、遮断緩衝液中で１：５００に希釈して用いた。

【０１０８】ピンをＰＢＳ/Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２
０（４×１０分）中で室温で洗浄し、次いでワサビダイ
コンペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇ抗血清（１７
５μＬ、ＮａＮ₃を含まない遮断緩衝液中に１：２００
０で希釈）を含有するマイクロタイターウェル中で２５
℃で１時間攪拌しながらインキュベートした。抗ヒト抗
血清はヒトＩｇ軽鎖および重鎖に対して特異的であり、
ＩｇＧクラスとＩｇＭクラスの両方と反応する。ピンを
再びＰＢＳ/Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（４×１０
分）中で室温で洗浄した。ＮａＨ₂ＰＯ₄（１Ｍ、２００
ｍＬ）およびクエン酸（１Ｍ、１６０ｍＬ）を２Ｌに蒸
留水で希釈し、ｐＨを４.０に調整することにより、基
質溶液を調製した。使用する直前に、アジノ−ジ−３−
エチルベンズチアゾジンスルホネート（ＡＢＴＳ、５０
ｍｇ）および過酸化水素（０.３μＬ/ｍＬ）を１００ｍ
Ｌの緩衝液に加えて、基質溶液を完成した。この基質溶
液（１５０μＬ）をマイクロタイタープレートの各ウェ
ルに加え、ピンをウェル中に浸漬し、暗所で２５℃でイ
ンキュベートした。発色後、ピンを取り出して反応を停
止させ、この溶液の吸光度を４０５ｎｍで読み取った。

【０１０９】以下に示したオクタマーを、抗ＨＣＶ抗血
清と免疫反応させた。３つの抗血清全てと反応するペプ
チドをエピトープとして記し、一方１つまたは２つの抗
血清とのみ反応するペプチドを弱エピトープ（「〜」で
示した）として記した。特に強いエピトープは、番号で
はなく文字で示した（例えば、ＥｐＡＡ）。

【０１１０】

【表２】

【０１１１】

【表３】

【０１１２】

【表４】

【０１１３】

【表５】

【０１１４】

【表６】

【０１１５】

【表７】

【０１１６】

【表８】

【０１１７】

【表９】

【０１１８】ＩＶ．Ｂ．識別アッセイ初期抗原を後期抗原と区別するために以下のアッセイを
行った。初期抗原に対する抗体が検出され得、そしてそ
の抗体はＨＣＶ感染をより迅速に診断するのに用いられ
得る。

【０１１９】高ＡＬＴを有するが、抗Ｃ１００−３抗体
に対して陰性であるヒト患者から連続して採血を行っ
た。血清転換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）（Ｃ−
１００−３陽性）が完了する前に得た５人の血液をプー
ルし、そして１：２０００に希釈してアッセイに使用し
た。このアッセイは、上記のセクションＩＶ．Ａ．の記
載の通りに行った。しかし、一方のセットのピンをワサ
ビダイコンペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ特異
的抗血清とインキュベートし、他方のセットのピンをワ
サビダイコンペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ特
異的抗血清とインキュベートした。ＩｇＭ抗体と免疫反
応するエピトープが初期抗原である。

【０１２０】この結果は、ほとんどの初期のエピトープ
はアミノ酸約４８０位からアミノ酸約６５０位までの範
囲の領域内で見い出されることを示した。特に、強Ｉｇ
Ｍエピトープは、アミノ酸番号５０６、５１０、５２
３、５５３、５６２、５８０から始まるオクタマーであ
り、そして５９０位から６２０位までの領域であった。
この領域に由来するエピトープを有する抗原を用いるア
ッセイは、他の抗原を用いるアッセイよりも早い時点で
ＨＣＶ感染の診断を行い得る。

【０１２１】さらに、開心術輸血後に非Ａ非Ｂ型肝炎に
なった５人の患者から採取した血漿標本を試験し、この
研究は３〜１２年続けた。最初の採血日は１週間未満で
行った。１つのコア抗原（Ｃ２２）、２つのエンベロー
プ抗原（Ｅ１およびＥ２）、および３つの非構造領域抗
原（Ｃ３３ｃ、Ｃ１００、およびＮＳ５）に対するＥＩ
Ａにより、各標本をＩｇＧおよびＩｇＭに対して試験し
た。Ｃ２２およびＣ３３ｃに対するＩｇＭ応答は、それ
らの抗原のＩｇＧ応答を上回ったことが分かった。ＮＳ
−５もまたＩｇＭ応答を誘導したが、この応答はその抗
原のＩｇＧ応答を上回るものではなかった。従って、Ｃ
２２およびＣ３３ｃ領域に由来したエピトープを用いる
ことにより、そしてＩｇＭ結合に対してアッセイするこ
とにより、感染の極めて初期の段階を測定し得るアッセ
イが作製され得る。Ｃ３３ｃ領域に対する抗体は長期間
持続するので、Ｃ３３ｃに関する診断用アッセイが最も
信頼性があることが示唆される。

【０１２２】ＩＶ．Ｃ．種々の固体由来のＨＣＶ分離株
における配列変異ＣＤＣ/ＨＣＶ１から外れる配列を含むＨＣＶの分離株
をヒト個体において同定し、そのうちいくつかは抗Ｃ１
００−３抗体に対して血清学的に陽性であった（ＥＣ１
０は抗体陰性）。ＣＤＣ/ＨＣ１配列を用いてＰＣＲ法
により増幅したＨＣＶゲノムのセグメントをクローニン
グし、配列決定することにより、これらの新規な分離株
の同定が行われた。この方法は、本明細書中に記載のＨ
ＣＶｃＤＮＡ配列に基づいたプライマーおよびプロー
ブを用いる。本方法の最初の工程は、逆転写酵素を用い
て、ＨＣＶゲノムまたはその複製中間体のいずれかに対
するｃＤＮＡの合成である。ＨＣＶｃＤＮＡの合成
後、そして増幅前に、試料中のＲＮＡを当該分野で周知
の方法により分解する。次いで、ＨＣＶｃＤＮＡの指
定されたセグメントを適切なプライマーの使用により増
幅した。増幅された配列をクローニングし、そして増幅
された配列を含むクローンをプローブにより検出する。
そのプローブは、プライマー間にある配列に相補的であ
るが、プライマーとは重複していない。

【０１２３】ＩＶ．Ｃ．１．米国においてヒトから単離
されたＨＣＶ分離株ＨＣＶビリオン源として用いられる血液試料を、Ｎｏｒ
ｔｈＣａｒｏｌｉｎａ州、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅにある
米国赤十字社（ＡｍｅｒｉｃａｎＲｅｄＣｒｏｓ
ｓ）、およびＭｉｓｓｏｕｒｉ州、ＫａｎｓａｓＣｉ
ｔｙのカンザス州地域血液センター（Ｃｏｍｍｕｎｉｔ
ｙＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒｏｆＫａｎｓａｓ）
から得た。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＨＣＶＣ１
００−３抗原に対する抗体に対して試料をスクリーニン
グし、そしてポリクローナルヤギ抗ヒトＨＲＰを用いて
補足的なウェスタンブロット分析を行い、抗ＨＣＶ抗体
を測定した。米国赤十字社およびカンザス州地域血液セ
ンターからそれぞれ得た２つの試料の＃２３および＃２
７は、これらのアッセイによりＨＣＶ陽性であることが
決定された。

【０１２４】これらの試料の血清に存在するウイルス粒
子をＢｒａｄｌｅｙら（１９８５）により記載された条
件下で超遠心分離により単離した。１０μｇ/ｍＬのプ
ロテナーゼＫ、および０.１％ＳＤＳの最終濃度で、プ
ロテナーゼＫおよびＳＤＳで消化することによりＲＮＡ
を粒子から抽出した；消化は３７℃で１時間行った。ウ
イルスＲＮＡをクロロホルム−フェノールで抽出するこ
とによりさらに精製した。

【０１２５】ＲＮＡの調製におけるＨＣＶＲＮＡをｃ
ＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡの両鎖を合成した後、次
いで、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。各
ＨＣＶ分離株に由来する３つのクローン中のＨＣＶｃ
ＤＮＡを配列分析にかけた。分析は本質的にＣｈｅｎお
よびＳｅｅｂｕｒｇ（１９８５）に記載された方法によ
った。

【０１２６】試料２３および２７のＨＣＶ由来のクロー
ンのコンセンサス配列を、それぞれ図３および図４に示
す。これらの図中に可変配列もまた示されており、これ
はコンセンサス配列中にコードされたアミノ酸である。

【０１２７】図５および図６は、試料２３、２７、およ
びＨＣＶ１の一列に並んだプラス（＋）鎖ヌクレオチド
配列（図５）および推定アミノ酸配列（図６）の比較を
示す。図６中のＨＣＶ１のアミノ酸配列は、ＨＣＶゲノ
ムＲＮＡにおける大きなＯＲＦによりコードされたＨＣ
Ｖポリタンパク質のアミノ酸番号１２９〜４６７を表し
ている。図５および図６の試験は、３つの単離クローン
の配列において変異があることを示す。ヌクレオチドレ
ベルおよびアミノ酸レベルでの配列変異を以下に記載の
表にまとめた。表では、ＳおよびＮＳ１を示すポリペプ
チドは、それぞれアミノ酸番号１３０から〜３８０ま
で、および３８０から〜４７０までを表し、これらのド
メインは既知である。番号付けは、推定のイニシエータ
ーメチオニンから開始する。用語ＳおよびＮＳ１は、フ
ラビウイルスモデルを用いてポリペプチドをコードする
配列の位置決定に基づく。しかし、上記のように、最近
の証拠により、ＨＣＶとフラビウイルスとの間では、ウ
イルスポリペプチドドメインに関して、特に推定Ｅ/Ｎ
Ｓ１ドメインにおいて、全体的な相関性がないことが示
唆される。実際、ＨＣＶポリペプチドおよびそれらのコ
ーディングドメインは、フラビウイルスモデルから実質
的に外れていることを示し得る。

【０１２８】

【表１０】

【０１２９】新たに単離されたＨＣＶ配列中には変異が
あるが、試料２３および２７（ＨＣＶ２３およびＨＣＶ
２７と呼ばれる）から得たクローン配列は、各々１０１
９個のヌクレオチドを含んでおり、選択されたクローン
において、この領域では欠失および付加による突然変異
がないことを示す。図５および図６中の配列はまた、単
離された配列が、この領域内では転位が生じていないこ
とを示す。

【０１３０】ＨＣＶ１およびＨＣＶの他の分離株に対す
るコンセンサス配列の比較を、上記の表にまとめる。チ
ンパンジーＨＣＶ１分離株とヒトから単離されたＨＣＶ
との間の配列変異は、ヒト起源のＨＣＶ間で見られる変
異とほぼ同じである。

【０１３１】２つの推定ドメイン中の配列変異が一様で
ないことは重要である。推定Ｓ領域の配列は、比較的定
常的であり、領域を通じてランダムに散在していると思
われる。それに対して、推定ＮＳ１領域は全配列よりも
変異の割合が高く、そして変異は約２８個のアミノ酸か
らなる超可変区域にあると考えられている。この超可変
区域は、推定ポリタンパク質の推定Ｎ末端から下流の約
７０個のアミノ酸の位置に存在する。

【０１３２】検出された変異は増幅過程で生じたと考察
され得るが、全ての変異がこの結果により生じた訳では
ないと考えられる。Ｔａｑポリメラーゼが、１サイクル
につきＤＮＡ鋳型１０キロ塩基当り約１塩基の割合で配
列中にエラーをもたらすと判断されている（Ｓａｉｋｉ
ら（１９８８））。この判断によれば、７エラーまでは
１０１９ｂｐのＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅中にも
たらされ得る。しかし、ＨＣＶ−２３およびＨＣＶ−２
７の３つのサブクローンは、それぞれ２９塩基および１
４塩基の変異を生じた。以下のことにより、これらの変
異は天然に生じていることが示唆される。塩基の変化の
うち約６０％は、アミノ酸配列を変化させないサイレン
ト突然変異である。ＰＣＲ増幅中にＴａｑポリメラーゼ
によりもたらされた変異は、ランダムに生じていると考
えられる；しかし、この結果により、可変配列は少なく
とも１つの特異的領域内に固まって存在していることが
示される。

【０１３３】IV.Ｃ.２.イタリアおよび米国においてヒ
トから単離されたＨＣＶ分離株異なる分離株に存在するＨＣＶＲＮＡのセグメントを
ＨＣＶ/ｃＰＣＲ法により増幅した。これらの断片は、
推定ＨＣＶポリタンパク質の開始コドンをコードするメ
チオニンの下流〜０.６Ｋｂから〜１.６Ｋｂの領域に及
ぶ。この分離株は、ＨＣＶ感染体から得た生物学的標本
に由来する。さらに詳細には、ＨＣＴ＃１８分離株は米
国の個体から得たヒト血漿に由来し、ＥＣ１およびＥＣ
１０はイタリア人患者の肝生検から得たものであり、そ
してＴｈはアメリカ人患者の末梢血液の単核細胞画分に
由来する。比較のＨＣＶＲＮＡセグメントをチンパン
ジーから単離した。

【０１３４】フェノール：ＣＨＣｌ₃：イソアミルアル
コール抽出液を用いて、ヒト血漿標本からＲＮＡを抽出
した。０.１ｍＬまたは０.０１ｍＬの血漿のいずれか
を、１０〜４０μｇ/ｍＬのポリアデニル酸を含有する
ＴＥＮＢ/プロテナーゼＫ/ＳＤＳ溶液（０.０５ＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８.０）、０.００１ＭＥＤＴ
Ａ、０.１ＭＮａＣｌ、１ｍｇ/ｍＬプロテナーゼＫ、
および０.５％ＳＤＳ）により、最終容量を１.０ｍＬに
まで希釈し、そして３７℃で６０分間インキュベートし
た。このプロテナーゼＫ消化の後、得られた血漿画分を
ＴＥ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍ
ＭＥＤＴＡ）飽和フェノール（ｐＨ６.５）を用いて
抽出することにより除タンパクした。遠心分離によりフ
ェノール相を分離し、そして０.１％ＳＤＳを含有する
ＴＥＮＢで再抽出した。各抽出で生じた水相をプール
し、そして等量のフェノール/クロロホルム/イソアミル
アルコール［１：１（９９：１）］で２回抽出し、次い
で等量のクロロホルム/イソアミルアルコールの９９：
１混合液で２回抽出した。遠心分離による相分離に続い
て、水相に最終濃度０.２Ｍとなるように酢酸ナトリウ
ムを加え、核酸を２倍容量のエタノールを加えて沈澱さ
せた。沈澱した核酸を、ＳＷ４１ローター中で３８Ｋ、
４℃で６０分間、またはマイクロヒュージ管中で１０
Ｋ、４℃で１０分間、超遠心分離により回収した。

【０１３５】肝生検から抽出したＲＮＡは、Ｄｒ．Ｆ．
Ｂｏｎｉｎｏ（ＯｓｐｅｄａｌｅＭａｇｇｉｏｒｅｄ
ｉＳ．ＧｉｏｖａｎｎｉＢａｔｔｉｓｔａ，Ｔｏｒ
ｉｎｏ，Ｉｔａｌｙ）により提供された。単核細胞画分
は、個人の血液の一部をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登
録商標）（ＰｈａｒｍａｃｉａＣｏｒｐ）によって、
製造会社の指示書に従って用いて沈澱させることにより
得た。全ＲＮＡを、Ｃｈｏｏら（１９８９）に記載のグ
アニジニウムチオシアネート法を用いて画分から抽出し
た。

【０１３６】試料から得たＨＣＶｃＤＮＡの合成を逆
転写酵素を用いて行った。エタノール沈澱に続いて、沈
澱したＲＮＡ画分または核酸画分を乾燥し、そして蒸留
水で処理したＤＥＰＣ中に再懸濁した。核酸の二次構造
を６５℃で１０分間加熱して破壊し、そして試料を氷上
で急冷した。肝臓由来の全ＲＮＡ１〜３μｇを用いて、
または１０〜１００μＬの血漿から抽出した核酸（また
はＲＮＡ）から、ｃＤＮＡを合成した。合成は逆転写酵
素を使用し、製造会社であるＢＲＬにより指定されたプ
ロトコルを用いて、そして２５μＬ反応液中で行った。
ｃＤＮＡ合成のための全ての反応混合物には、２３単位
のＲＮＡａｓｅインヒビター、Ｒｎａｓｉｎ（登録商
標）（Ｆｉｓｈｅｒ/Ｐｒｏｍｅｇａ）を含ませた。ｃ
ＤＮＡ合成に続いて、反応混合物を水で希釈し、そして
１０分間沸騰させ、氷上で急冷させた。

【０１３７】各セットの試料を２ラウンドのＰＣＲ増幅
にかけた。反応用のプライマーを選択し、「ＥｎｖＬ」
および「ＥｎｖＲ」と称する領域を増幅した。「Ｅｎｖ
Ｌ」領域は、ヌクレオチド６６９〜１２４３位を含有
し、そして推定アミノ酸１１７〜３０８位をコードす
る；「ＥｎｖＲ」領域は、ヌクレオチド１２１５〜１６
２９位を含有し、そして推定アミノ酸３００〜４０８位
をコードする（推定アミノ酸は推定メチオニン開始コド
ンを起点に番号を付けている）。

【０１３８】ＰＣＲ反応は、１μｇのＲＮａｓｅＡを
加えたこと以外は、基本的に製造者の指示書（Ｃｅｔｕ
ｓ−Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に従って行った。この
反応は１００μＬの最終容量で行った。１サイクルを９
４℃で１分、３７℃で２分、および７２℃で３分行い、
最終サイクルでは７２℃で延長して７分間行うというレ
ジメにより、ＰＣＲを３０サイクル行った。次いで、試
料をフェノール：ＣＨＣｌ₃で抽出し、エタノール沈澱
を２回行い、１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８.
０）中で再懸濁し、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０
（Ａｍｉｃｏｎ）濾過を用いて濃縮した。この手法によ
り、３０ヌクレオチド未満のサイズのオリゴヌクレオチ
ドが効率よく除去される；従って、最初のラウンドのＰ
ＣＲ増幅のプライマーが除去される。

【０１３９】次いで、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０濃縮試
料を２回目のラウンドのＰＣＲ増幅にかけた。１サイク
ルを９４℃で１分、６０℃で１分、および７２℃で２分
行い、最終サイクルでは７２℃で延長して７分間行うと
いうレジメにより、ＰＣＲによる増幅を３５サイクル行
った。次いで、試料をフェノール：ＣＨＣｌ₃で抽出
し、２回沈澱させ、そしてＥｃｏＲＩで消化した。ＰＣ
Ｒ反応生成物を、６％ポリアクリルアミドゲルの電気泳
動によりその生成物を分離することにより分析された。
得られるＰＣＲ生成物の推定サイズのＤＮＡをゲルから
電気溶出し、そしてｐＧＥＭ−４プラスミドベクター内
またはλｇｔ１１内のいずれかにサブクローニングし
た。増幅の最初のラウンド後のＥｎｖＬおよびＥｎｖＲ
について得られた生成物のサイズは、それぞれ６１５ｂ
ｐおよび６８３ｂｐであった；２回目ラウンドの増幅後
のＥｎｖＬおよびＥｎｖＲについて得られた生成物のサ
イズは、それぞれ４１４ｂｐおよび５７５ｂｐであっ
た。宿主細胞を形質転換するために、増幅生成物を含有
するプラスミドを用いた；ＤＨ５−αを形質転換するた
めにｐＧＥＭ−４プラスミドを用い、Ｃ６００デルタ−
ＨＦＬを形質転換するためにλｇｔｌｌを用いた。適切
なＨＣＶプローブとハイブリダイズする形質転換細胞の
クローンか、または正確なサイズの挿入部分を有する形
質転換細胞のクローンのいずれかを選択した。次いで、
挿入部分をＭ１３内にクローニングし、そして配列決定
した。ＨＣＶ/ｃＰＣＲ生成物の全てに対するプローブ
は、ＰＣＲ増幅により調製されたＨＣＶｃＤＮＡの³²Ｐ
標識断片から成っていた。

【０１４０】ＥｎｖＬ領域内の変異に関する配列情報
は、ＨＣＴ＃１８から得た３つのクローン、ＴＨから得
た２つのクローン、ＥＣ１から得た３つのクローン、お
よびＨＣＶ１クローンから得られた。これらのクローン
に由来する各分離株の混成ヌクレオチド配列の比較を図
７に示す。この図では、各配列は、ＥｎｖＬ領域のセン
ス鎖の５'から３'までを示しており、そしてこの配列は
一列になっている。縦列および大文字は配列相同性を示
し、列の欠如および小文字は相同性がないことを示す。
列内に示された配列を以下に示す：第１列、Ｔｈｏｒ
ｎ；第２列、ＥＣ１；第３列、ＨＣＴ＃１８；第４列、
ＨＣＶ１。

【０１４１】ＥｎｖＲ領域内の変異に関する配列情報
は、ＥＣ１０の２つのクローンおよびＨＣＶ１クローン
から得られた。この２つのＥＣ１０クローンは、ただ１
個のヌクレオチドが異なっていた。ＥＣ１０（クローン
２）および混成のＨＣＶ１配列のヌクレオチド配列の比
較を図８に示す；各配列は、ＥｎｖＲ領域のセンス鎖の
５'から３'までを示しており、そしてこの配列は一列に
なっている。配列間の２重点は配列相同性を示す。

【０１４２】ＥｎｖＬ領域（アミノ酸番号１１７〜３０
８）およびＥｎｖＲ領域（アミノ酸番号３００〜４３
８）内にコードされたアミノ酸配列の各分離株に対する
比較を、それぞれ図９および図１０に示す。上記のよう
に、図中には、ＪＨ２３およびＪＨ２７分離株の配列が
包含される。日本人の分離株から得た配列もまた示す；
これらの配列は日本のＤｒ．Ｔ．Ｍｉｙａｍｕｒａから
提供された。これらの図では、ＨＣＶ１に対する領域全
体において、その領域に対するアミノ酸配列が示され、
そして種々の分離株における非相同的アミノ酸が示され
る。

【０１４３】図９に見られるように、ＥｎｖＬ領域で
は、ＨＣＶ１と他の分離株との間で全体で約９３％の相
同性がある。ＨＣＴ１８、Ｔｈ、およびＥＣ１は、ＨＣ
Ｖ１と９７％の相同性を有し；ＪＨ２３およびＪＨ２７
は、それぞれＨＣＶ１と約９６％および約９５％の相同
性を有する。図１０は、ＥｎｖＲ領域での相同性が、Ｅ
ｎｖＬ領域での相同性よりも顕著に低いことを示す；さ
らに、１つのサブ領域が超可変部（すなわち、アミノ酸
３８３〜４０５位の部分）であると思われる。このデー
タを以下の表にまとめる。

【０１４４】

【表１１】

【０１４５】VI．産業上の利用性本明細書中で同定されたエピトープは、例えば、ＨＣＶ
感染に対する血液のスクリーニング、臨床上のＨＣＶ診
断、抗体の産生、および医薬品の製造などの適用に対し
て、上記のようなポリペプチド生成物を製造するために
用いられ得る。他の適用は上記の通りであり、そしてさ
らに別の適用も当業者には極めて明らかである。

【０１４６】VII.文献目録 Barrら、Biotechniques（1986）4:428. Bradleyら、Gastroenterology（1985）88:773 Botstein、Gene（1979）8:17. M.A. Brinton、(1986）「The Viruses: The Togavirida
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Flaviviridae」（シリーズ編者Fraenkel-Conratおよび
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nant DNA」Part E. Wu、Meth Enzymol（1987）155「Recombinant DNA」part
F. Zoller、Nuc Acids Res（1982）l0:6487. 米国特許第4,341,76l号米国特許第4,466,917号米国特許第4,399,121号米国特許第4,472,500号米国特許第4,427,783号米国特許第4,491,632号米国特許第4,444,887号米国特許第4,493,890号米国特許第4,816,467号

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】ＨＣＶプロトタイプ分離株のＨＣＶ１のポ
リタンパク質を示す。

【図１ｂ】図１ａの続きである。

【図１ｃ】図２ｂの続きである。

【図２ａ】ＨＣＶ１の混成ｃＤＮＡを示す。

【図２ｂ】図２ａの続きである。

【図２ｃ】図２ｂの続きである。

【図２ｄ】図２ｃの続きである。

【図２ｅ】図２ｄの続きである。

【図２ｆ】図２ｅの続きである。

【図３ａ】ヒト分離株２３のヌクレオチドコンセンサ
ス配列を示す。変異株の配列は上記配列の下に示す。コ
ンセンサス配列中にコードされるアミノ酸もまた示す。

【図３ｂ】図２ａの続きである。

【図４ａ】ヒト分離株２７のヌクレオチドコンセンサ
ス配列を示す。変異株の配列は上記配列の下に示す。コ
ンセンサス配列中にコードされるアミノ酸もまた示す。

【図４ｂ】図４ａの続きである。

【図５ａ】ヒト分離株２３および２７、およびＨＣＶ
１の一列に並んだヌクレオチド配列を示す。相同的な配
列は、記号（＊）で示す。非相同的な配列は、小文字で
示す。

【図５ｂ】図５ａの続きである。

【図５ｃ】図５ｂの続きである。

【図６】ヒト分離株２３および２７、およびＨＣＶ１
の一列に並んだアミノ酸配列を示す。相同的な配列は、
記号（＊）により示す。非相同的な配列は、小文字で示
す。

【図７ａ】分離株のＴｈｏｒｎ、ＥＣ１、ＨＣＴ＃
１８、およびＨＣＶ１の一列に並んだ混成ヌクレオチド
配列の比較を示す。

【図７ｂ】図７ａの続きである。

【図７ｃ】図７ｂの続きである。

【図８】ＥＣ１０のヌクレオチド配列および混成のＨ
ＣＶ１配列の比較を示す；ＥＣ１０配列は、点の上の列
であり、そしてＨＣＶ１配列は、点の下の列である。

【図９】ヒト分離株のＨＣＴ＃１８、ＪＨ２３、Ｊ
Ｈ２７、Ｔｈｏｒｎｅ、ＥＣ１、およびＨＣＶ１のコン
センサス配列の「ＥｎｖＬ」領域内にコードされるアミ
ノ酸配列１１７〜３０８（ＨＣＶ１と比較して）の比較
を示す。

【図１０】ヒト分離株のＨＣＴ＃１８、ＪＨ２３、
ＪＨ２７、Ｔｈｏｒｎｅ、ＥＣ１、およびＨＣＶ１のコ
ンセンサス配列の「ＥｎｖＲ」領域内にコードされるア
ミノ酸配列３３０〜３６０（ＨＣＶ１に比較して）の比
較を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者ウィリアムルターアメリカ合衆国カリフォルニア 94131 サンフランシスコ，エバーソンストリート 80

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＨＣＶ抗体と免疫反応し得るポリペプチ
ドであって、該ＨＣＶ抗体と反応し得る免疫反応性部分
は、アミノ酸配列ＦＤＱＧＷＧＰＩを含むＨＣＶポリペ
プチドの一部分であり、ここで該一部分が最大で約２０
アミノ酸の長さを有する、免疫反応性ポリペプチド。
【請求項２】前記一部分が最大で約１５アミノ酸の長
さを有する、請求項１に記載の免疫反応性ポリペプチ
ド。
【請求項３】ＨＣＶ抗体と免疫反応し得るポリペプチ
ドであって、該ＨＣＶ抗体と反応し得る免疫反応性部分
は、アミノ酸配列ＦＤＱＧＷＧＰＩからなる、免疫反応
性ポリペプチド。
【請求項４】ＨＣＶ抗体と免疫反応し得るオクタマー
ポリペプチドであって、ここで該オクタマーはアミノ酸
配列ＲＥＡＱＡＬＰＶを有する、ポリペプチド。
【請求項５】ＨＣＶ抗体と免疫反応し得るポリペプチ
ドであって、該ＨＣＶ抗体と反応し得る免疫反応性部分
は、ＨＣＶポリペプチドの２０個以下のアミノ酸が連続
した一部分であり、ここで該一部分のアミノ末端のアミ
ノ酸は、図１の１２１８位のアミノ酸である、免疫反応
性ポリペプチド。
【請求項６】前記ＨＣＶ抗体と反応し得る免疫反応性
部分がアミノ酸配列ＶＶＰＱＳＥＱＶからなる、請求項
５に記載のポリペプチド。
【請求項７】ＨＣＶ抗体と免疫反応し得るポリペプチ
ドであって、該ＨＣＶ抗体と反応し得る免疫反応性部分
は、アミノ酸配列ＶＥＳＥＮＫＶＶを含むＨＣＶポリペ
プチドの一部分であり、ここで該一部分が最大で約２５
アミノ酸の長さを有する、免疫反応性ポリペプチド。
【請求項８】前記一部分が最大で約２０アミノ酸の長
さを有する、請求項７に記載の免疫反応性ポリペプチ
ド。
【請求項９】ＨＣＶ抗体と免疫反応し得るポリペプチ
ドであって、該ＨＣＶ抗体と反応し得る免疫反応性部分
は、ＨＣＶポリペプチドの２０個以下のアミノ酸が連続
した一部分であり、ここで該一部分のアミノ末端のアミ
ノ酸は、図１の１９４０位のアミノ酸である、免疫反応
性ポリペプチド。
【請求項１０】前記ＨＣＶ抗体と反応し得る免疫反応
性部分がアミノ酸配列ＡＡＡＲＶＴＡＩからなる、請求
項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】請求項１〜１０のいずれかに記載のポ
リペプチドを含む、イムノアッセイ試薬。
【請求項１２】試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
タンパク質と免疫反応し得る抗体の存在を検出する方法
であって、固定化した、請求項１１に記載のイムノアッセイ試薬を
該試料と接触させる工程、および検出可能な標識を使用
して、該試薬に結合した抗体を検出する工程、を包含す
る、方法。
【請求項１３】請求項１〜１０のいずれかに記載のポ
リペプチドを製造する方法であって、該ポリペプチドが
組換え発現または化学合成によって調製される、方法。