FI111645B - Immuunimäärityksen reagenssi ja menetelmä hepatiitti C-viruksen (HCV) vasta-aineiden havaitsemiseksi - Google Patents

Description

111645 i

Immuunimäärityksen reagenssi ia menetelmä hepatiitti C-viruksen (HCV) vasta-aineiden havaitsemiseksi Tämä keksintö liittyy aineisiin ja menetelmiin hepatiitti C -5 virus (HCV) -infektion leviämisen taltuttamiseksi. Keksintö koskee erityisemmin polypeptidejä sisältäviä immunologisia reagensseja HCV-infektioiden ilmaisemiseen ja menetelmää HCV-vasta-aineiden havaitsemiseksi.

10 Houghton et ai. identifioi ja karakterisoi ensimmäisenä HCV:n ei-A,ei-B -hepatiitin (NANBH) aiheuttajana. Tämä johti joidenkin imunologisina reagensseina käyttökelpoisten yleisten ja spesifisten polypeptidien julkistamiseen. Lähemmin esim., Houghton et ai., EPO-julkaisu 318 216; Houghton et ai., EPO-15 julkaisu 388 232; Choo et ai., Science (1989) 244:359-362;

Kuo et ai., Science (1989) 244:362-364; Houghton et ai., Hepatology (1991) 14:381-388. Nämä julkaisut tuovat alalle perusteellisen perustan HCV:stä yleensä, samoin kuin HCV:n immunologisten polypeptidireagenssien valmistuksesta ja käyttö-20 kohteista. Nämä julkaisut ovat sen vuoksi erityisesti sisällytettyinä lyhyesti tässä yhteydessä viitteinä.

Toiset ovat helposti soveltaneet ja laajentaneet Houghtonin et ai. työtä. Lähemmin, Highfield et ai., GB-patenttihakemus 25 2 239 245 (The Wellcome Foundation Ltd.); Wang, EPO-julkaisu ♦· 442 394 (United Biomedical Inc.); Leung et ai., EPO-julkaisu 445 423 (Abbott Laboratories); Habits et ai., EPO-julkaisu 451 891 (Akzo N.V.); Reyes et ai., PCT-julkaisu W0 91/15516 (Genelabs Inc.); Mäki et ai., EPO-julkaisu 468 657 (Tonen 30 Corp.) ja Kamada et ai., EPO-julkaisu 469 348 (Shionogi Sei-, yaku K.K.).

*

Herkät spesifiset menetelmät HCV-kantajien ja HCV:llä kontaminoidun veren tai verituotteiden seulomiseksi ja identifioi-35 miseksi ovat tärkeä edistysaskel lääketieteessä. Verensiirron jälkeistä hepatiittia (PTH) esiintyy suunnilleen 10 %:illa verensiirtopotilaista ja HCV on aiheuttanut jopa 90 % näistä tapauksista. Tärkein ongelma tässä sairaudessa on usein 2 111645 esiintyvä taudin eteneminen krooniseksi maksavaurioksi (25-55 %) . Potilashuolto sekä HCV:n siirtymisen estäminen veren ja verituotteiden tai läheisen henkilökosketuksen välityksellä edellyttävät luotettavia ja ennustavia työvälineitä, kuten 5 esim. HCV-polypeptidejä, HCV:hen liittyvien vasta-aineiden ilmaisemiseksi. Sellaiset polypeptidit ovat käyttökelpoisia myös rokotteina ja immunoterapeuttisina hoitoaineina sairauden ehkäisemiseksi ja/tai hoitamiseksi.

10 Koska HCV on verrattain uusi agenssi, on jatkuva tarve määritellä immunologisia lisäreagensseja, joiden avulla on mahdollista tutkia taudin kliinistä etenemistä ja HCV:n epidemiologiaa väestössä.

15 Keksintö liittyy uusien HCV-epitooppien karakterisointiin. Näiden epitooppien karakterisointi mahdollistaa polypeptidi-tuotteiden valmistuksen, jotka reagoivat immunologisesti HCV-vasta-aineiden kanssa ja/tai aiheuttavat anti-HCV -vasta-ainetuotannon in vivo. Nämä polypeptidituotteet ovat käyttökö kelpoisia standardeina tai reagensseina diagnostisissa testeissä ja/tai rokotekomponenteissa. Vasta-aineet, käsittäen esimerkiksi sekä polyklonaaliset että monoklonaaliset vasta-aineet, jotka on kohdistettu näihin polypeptidisekvensseihin sisältyviä HCV-epitooppeja vastaan, ovat myös käyttökelpoisia 25 reagensseja esimerkiksi diagnostisissa testeissä, terapeutti-·;· sinä aineina, virusvastaisten aineiden seulonnassa ja HCV-po- lypeptidien tai -partikkeleiden eristämiseen tai eristämi-seen/puhdistamiseen. 1 2 3 4 5 6

Laajimmassa merkityksessään tämä keksintö liittyy poly- 2 peptideihin, jotka sisältävät tässä esille tuotavia vasta ka- 3 » 4 rakterisoituja HCV-epitooppeja, sellaisten polypeptidien val 5 mistusmenetelmiin (esim. yhdistelmämenetelmiin tai synteettisiin menetelmiin), sellaisten polypeptidien käyttöme- 6 netelmiin (esim. diagnostisiin, rokotteisiin liittyviin ja terapeuttisiin) ja valmistustuotteisiin, koostumuksiin tai formulaatioihin, jotka on sovitettu sellaisia käyttöjä varten (esim. polypeptidit, jotka on kiinnitetty immunomääritysalus- 3 111645 taan tai muuhun kantajaan, oraalisiin tai ruiskeena annettaviin farmaseuttisiin koostumuksiin). Tähän keksintöön liittyvät myös vastaavasti vasta-aineet (polyklonaaliset, mono-' klonaaliset tai niiden vastineet kuten sitoutumisfragmentit, 5 yksiketjuiset antigeeniin tarttuvat proteiinit jne.) tässä esille tuotuja HCV-epitooppeja vastaan, sekä sellaisten vasta-aineiden valmistusmenetelmät, sellaisten vasta-aineiden käyttömenetelmät (esim. diagnostiset, rokotteisiin liittyvät ja terapeuttiset) ja valmistustuotteet, koostumukset tai for-10 mulaatiot, jotka on sovitettu sellaisia käyttöjä varten (esim. vasta-aineet, jotka on kiinnitetty immunomääritysalus-taan tai muuhin kantajaan, oraalisiin tai ruiskeina annettaviin farmaseuttisiin koostumuksiin).

15 Polypeptidi, joka sisältää vasta esille tuotuja HCV- epitooppeja, voidaan valmistaa menetelmällä, joka käsittää isäntäsolujen inkuboinnin, jotka on transformoitu ekspres-siovektorilla, joka sisältää HCV-epitoopin sisältävää poly-peptidiä koodittavan sekvenssin, olosuhteissa, jotka mahdol-20 listavat mainitun polypeptidin ilmentymisen.

Tämä keksintö liittyy myös immunomäärityksiin. Näitä ovat im-munomääritys HCV-antigeenin ilmaisemiseksi, joka käsittää näytteen inkuboinnin, jonka epäillään sisältävän HCV-antigee-25 nin, vasta-aineen kanssa kuten edellä on kuvailtu olosuhteis-v . sa, jotka mahdollistavat vasta-aine-antigeeni -kompleksin muodostumisen; ja vasta-aineen sisältävän vasta-aine-antigeeni -kompleksin ilmaisemisen. Immunomääritys HCV-vasta-aineiden ilmaisemiseksi käsittää näytteen inkuboinnin, jonka 30 epäillään sisältävän anti-HCV -vasta-aineita, polypeptidin kanssa kuten edellä on kuvailtu olosuhteissa, jotka mahdol-c *·. listavat vasta-aine-antigeeni -kompleksin muodostumisen; ja polypeptidin sisältävän vasta-aine-antigeeni -kompleksin ilmaisemisen.

Voidaan valmistaa kaavan 3-3.x~3.3y 35 -111645 4 mukaisia epitooppeja, jossa kaavassa aa tarkoittaa aminohappoa? x ja y ovat kokonaislukuja siten, että y-x > 6? aax-aay esittää osaa kuvion 1 mukaisessa aminohapposekvenssissä; ja x valitaan ryhmästä: 5 23-34,36, 66-79, 81-94, 96-98,101-103,186-189,191, 206, 223, 232, 256,286, 297-299, 321, 347, 357, 413,414,432,465-471,480-484, 501, 502,521,540-549, 579,594-599, 601-613, 641, 662-665, 685, 705, 706, 729, 782-789, 801, 851-855, 893, 916, 928, io 946, 952-954,1026,1072,1109,1112-1117,1218, 1240,1280-1285,1322, 1338, 1371, 1384, 1410,1411,1454, 1492, 1493, 1532-1535, 1560, 1561,1566-1568, 1571-1577, 1601-1607, 1615-1620, 1655,1695,1710-1712,1728, 1729,1758-1762, 1781, 1808, 1821, 1851, 1880,1908-1913,1925,1940-1948,1951, 1966-1969, 1999, 2001-2004, 2006-2014, 2024,2048-2053,2055-2057, 2071,2088-15 2093, 2108, 2122-2148, 2165, 2187, 2226-2232,2244-2249,2267,2281-2286, 2288, 2289, 2325-2327,2346, 2347, 2349, 2382, 2401,2417-2422, 2439-2444, 2446-2456, 2469,2471-2476, 2495, 2533, 2534, 2573-2578, 2602-2604, 2606-2612, 2632-2638, 2660, 2676-2679, 2688-2693, 2707, 2721, 2757-2762, 2779, 2Q 2794, 2795, 2797-2799, 2801, 2802,. 2817-2843, 2863-2867, 2878-2884, 2886-2895.

Edellä määritellyt päämäärät saadaan aikaan myös käyttämällä kaavan mukaisia HCV-epitooppeja 25 aax-aay jossa kaavassa aa tarkoittaa aminohappoa; x ja y ovat kokonaislukuja siten, että y-x > 6; aax-aay esittää osaa kuvion 1 30 mukaisessa aminohapposekvenssissä; x valitaan ryhmästä: 35 (kun y on pienempi kuin 45), 95 (kun y on pienempi kuin 110), 99 (kun y on pienempi kuin 120) , 100 (kun y pienempi kuin « * « 150), 190 (kun y pienempi kuin 210), 500 (kun y pienempi kuin 550) , 600 (kun y pienempi kuin 625) , 1260 (kun y pienempi 35 kuin 1280), 1569 (kun y pienempi kuin 1931), 1570 (kun y pienempi kuin 1590) , 1694 (kun y pienempi kuin 1735) , 1949 (kun y pienempi kuin 2124), 1950 (kun y pienempi kuin 1985), 2000 (kun y pienempi kuin 2050), 2005 (kun y pienempi kuin 2025), 5 111645 2054 (kun y pienempi kuin 2223) , 2250 (kun y pienempi kuin 2330) , 2287 (kun y pienempi kuin 2385) , 2290 (kun y pienempi kuin 2310), 2345 (kun y pienempi kuin 2375), 2348 (kun y pienempi kuin 2464), 2445 (kun y pienempi kuin 2475), 2470 (kun 5 y pienempi kuin 2490), 2605 (kun y pienempi kuin 2620), 2780 (kun y pienempi kuin 283 0) , 2796 (kun y pienempi kuin 2886) , 2800 (kun y pienempi kuin 2850) ja 2885 (kun y pienempi kuin 2905).

10 Kummassakin edellä määritellyssä kaavassa x-y voi olla vähemmän tai yhtä suuri kuin 10, 20, 30, 40 tai 50 joissakin keksinnön mukaisissa suoritusmuodoissa.

Kuvio 1 esittää HCV:n prototyyppieristyksen HCVl:n polyprote-15 iinia.

Kuvio 2 esittää cDNA-sekvenssikoostetta HCVl:lle.

Kuvio 3 esittää ihmisen eristys-23:n konsensusnukleotidisek-20 venssiä, muunnelmasekvenssit on esitetty sekvenssilinjan alapuolella. Konsensussekvenssissä kooditettuna olevat aminohapot on myös esitetty.

Kuvio 4 esittää ihmisen eristys-27:n konsensusnukleotidisek-25 venssiä, muunnelmasekvenssit on esitetty sekvenssilinjan ala-- puolella. Konsensussekvenssissä kooditettuna olevat aminoha pot on myös esitetty.

Kuvio 5 esittää ihmisen eristys-23:n ja eristys-27:n ja 50 HCV1:n rinnakkain asetettuja nukleotidisekvenssejä. Homo- .·· logiset sekvenssit on esitetty symbolilla (*) . Ei-homologiset ' *' sekvenssit ovat pienillä kirjaimilla.

Kuvio 6 esittää ihmisen eristys-23:n ja eristys'-27 :n ja 35 HCVl:n rinnakkain asetettuja aminohapposekvenssejä. Homologiset sekvenssit on esitetty symbolilla (*). Ei-homologiset sekvenssit ovat pienillä kirjaimilla.

6 111645

Kuvio 7 esittää vertailun rinnakkain asetetuista nukleotidi-sekvenssiyhdistelmistä eristyksistä Thorn, EC1, HCT#18 ja HCV1.

5 Kuvio 8 esittää vertailun EC10:n nukleotidisekvensseistä ja HCVl-sekvenssin koosteesta; EClO-sekvenssi käsittää pisteiden yläpuolisen linjan ja HCV1-sekvenssi käsittää pisteiden alapuolella olevan linjan.

10 Kuvio 9 esittää vertailun aminohapoposekvensseistä 117-308 (suhteessa HCVl:een), jotka ovat kooditettuina konsensusse-kvenssien "EnvL"-alueissa ihmisen eristyksissä HCT#18, JH23, JH 27, Thorne, EC1 ja HCV1.

15 Kuvio 10 esittää vertailun aminohapposekvensseistä 330-360 (suhteessa HCVl:een), jotka ovat kooditettuina konsensusse-kvenssien "EnvR"-alueissa ihmisen eristyksissä HCT#18, JH23, JH 27, Thorne, EC1 ja HCV1.

20 Täydelliset viittaukset tässä referoituihin julkaisuihin voidaan löytää "Tausta11- tai "Kirjallisuus"-jaksoista.

I. Määritelmiä 25 "Hepatiitti C -virus" tai "HCV" tarkoittaa alalla tunnettua ♦: viruslajeja, joiden patogeeniset kannat aiheuttavat NANBH:n, ja niistä saatuja heikennettyjä kantoja tai vajavaisia ehkäiseviä partikkeleita. Lähemmin yleisesti julkaisuissa, joita on siteerattu "Tausta"-jaksossa. HCV-genomi on RNA:ta.

30 Tiedetään, että RNA:ta sisältävillä viruksilla spontaanimu-taatiofrekvenssit ovat verrattain korkeat, so., ilmoitettuna luokkaa 10'3 - 10"4 inkorporoitua nukleotidiä kohti (Fields & Knipe (1986)). Koska RNA-viruksille on luonteenomaista geno-tyypin heterogeenisuus ja epävakaisuus, HCV-lajin sisällä 35 esiintyy sen vuoksi useita kantoja/isolaatteja, jotka voivat olla virulentteja tai ei-virulentteja. Kirjallisuudessa on hyvin dokumentoituna erilaisten HCV-kantojen tai -eristysten lisääminen, identifiointi, ilmaiseminen ja eristäminen. Sen 7 111645 lisäksi, tämän esityksen avulla on mahdollista valmistaa diagnostisia aineita ja rokotteita eri kantoja/isolaatteja varten, samoin kuin koostumuksia ja menetelmiä, jotka ovat käyttökelpoisia seulontaprosesseissa virusvastaisille aineille 5 farmakologiseen käyttöön, kuten aineille, jotka inhiboivat ‘ HCV:n replikoitumista.

Tässä yhteydessä tuodaan esille tietoja useista erilaisista HCV-kannoista/isolaateista, erityisesti kannasta tai isolaa-10 tista CDC/HCVl (toiselta nimeltä HCV1). Informaatio yhdestä kannasta tai isolaatista, kuten esimerkiksi osa genomisesta sekvenssistä tai aminohapposekvenssistä on riittävä, jotta alaa tuntevat henkilöt pystyvät standarditekniikkaa käyttäen eristämään uusia kantoja/isolaatteja ja identifioimaan sen, 15 ovatko uudet kannat/isolaatit HCV. Useita erilaisia kantoja/isolaatteja kuvaillaan esimerkiksi jäljempänä. Nämä kannat, jotka saatiin joistakin ihmisen seerumeista (ja eri maantieteellisiltä alueilta), eristettiin käyttäen hyväksi informaatiota HCVlm genomisesta sekvenssistä.

20 Tässä yhteydessä annettava informaatio osoittaa, että HCV voi selvästi liittyä flaviviruksiin. Flavivirus-ryhmä sisältää suuren virusjoukon, jotka ovat pieniä vaipallisia ihmispato-geenejä. Flavivirus-partikkeleiden morfologia ja koostumus 25 tunnetaan ja niitä käsittelee Brinton (1986) . Yleisesti ot-'·: , taen morfologian osalta flavivirukset sisältävät keskisen nukleokapsidin, jota ympäröi lipidikaksoiskerros. Virionit ovat pallomaisia ja niiden läpimitta on noin 40-50 nm. Niiden ydinten läpimitta on noin 25-30 nm. Virionin vaipan ulkopin-30 nalla on ulokkeita, jotka ovat noin 5-10 nm pitkiä ja joiden päässä on noin 2 nm läpimittaisia nuppeja. Tyypillisiä esimerkkejä ryhmästä ovat keltakuumevirus, Länsi-Niilin virus ja dengue-kuumevirus. Niillä on juosteeltaan positiiviset RNA-genomit (noin 11 000 nukleotidiä) , jotka ovat vähän suurempia 35 kuin HCV:n genomi ja koodittavat noin 3500 aminohappoa sisältävää polyproteiiniprekursoria. Yksittäiset virusproteiinit lohkaistaan tästä prekursoripolypeptidistä.

8 111645 HCV:n genomisen RNA:n genomirakenne ja nukleotidisekvenssi on johdettu. Genomi näyttää olevan yksijuosteista RNA-.ta, joka sisältää noin 10 000 nukleotidiä. Genomi on juosteeltaan positiivinen ja sisältää yhtenäisen translaationaalisen avoimen 5 lukukehyksen (ORF), joka koodittaa noin 3000 aminohappoa sisältävää polyproteiinia. ORF:ssä rakenneproteiini (-proteiinit) näyttää olevan kooditettuna suunnilleen N-pään alueen ensimmäisessä neljänneksessä, suurimman osan polyproteiinista vastatessa ei-rakenteellisia proteiineja. Verrattaessa kaik-10 kiin tunnettuihin virussekvensseihin, pientä mutta merkittävää kolineaarista homologiaa havaitaan flavivirusryhmän ei-rakenteellisten proteiinien suhteen ja pestivirusten suhteen (joiden katsotaan nyt myös olevan osa Flavivirus-ryhmää).

15 Perustuen pääteltyihin aminohappoihin, jotka ovat kooditet-tuina HOVI:n nukleotidisekvenssissä, ja muuhun todistusaineistoon, kooditetun HCV-polyproteiinin mahdolliset prote-iinidomeenit samoin kuin arvioidut rajakohdat on esitetty seuraavassa: 20

Oletettu domeeni Arvioidut rajakodonit (aminohapponumerot) C (nukleokapsidiproteiini) 1-191 25 Ei (virionin vaippaproteiini) 192-383 E2/NS1 (vaippa?) 384-800 NS2 (tuntematon funktio) 800-1050 NS3 (proteaasi?) 1050-1650 NS4 (tuntematon funktio) 1651-2100 30 NS5 (polymeraasi) 2100-3011 (loppu) * Nämä domeenit ovat kuitenkin epävarmoja. E1-NS2 -raja esimerkiksi on luultavasti 750-810 -alueella ja NS3-NS4 -raja on suunnilleen 1640-1650. On myös ilmeistä, että 191 ah'C-versio 35 on prekursori, joka jatkoprosessoidaan (esim. noin 170 ah pituuteen) ,· ja että NS2-, NS4 ja NS5-proteiinit jatkoprosessoidaan kukin kahdeksi toimintavalmiiksi proteiiniksi.

9 111645 HCV:n eri kantojen, eristysten tai alatyyppien odotetaan sisältävän eroavuuksia aminohappojen ja nukleiinihappojen osalta verrattuna HCVl:een. Monen isolaatin kokonaisaminohappo-sekvenssin odotetaan olevan hyvin homologinen (so., enemmän 5 kuin noin 40 %) HCVl:n suhteen. Voidaan kuitenkin myös havaita, että vähemmän homologisia HCV-isolaatteja löytyy. Nämä määriteltäisiin HCV:ksi erilaisten arviointiperusteiden mukaan, joita ovat esimerkiksi suunnilleen 9000 - suunnilleen 12000 nukleotidiä sisältävä ORF, joka koodittaa HCVl:n poly-10 proteiinin kanssa samankokoista polyproteiinia, HCVl:n poly-proteiinin kanssa hydrofobisuudeltaan ja/tai antigeenisuudel-taan samanlainen kooditettu polyproteiini ja kolineaaristen peptidisekvenssien läsnäolo, jotka ovat säilyneet HCVl:n suhteen. Lisäksi uskotaan, että genomi olisi juosteeltaan posi-15 tiivistä RNA:ta.

HCV koodittaa vähintään yhtä epitooppia, joka on immunologi-sesti identtinen HCVl-polyproteiinin epitoopin kanssa. Epi-tooppi on HCV:lie tunnusomainen verrattaessa aikaisemmin tun-20 nettuihin flaviviruksiin. Epitoopin tunnusomaisuus voidaan määrittää sen immunologisen reaktiivisuuden avulla anti-HCV -vasta-aineiden kanssa ja immunologisen reaktiivisuuden puuttumisella tunnettujen Flavivirus-lajien vasta-aineiden suhteen. Alalla tunnetaan menetelmät immunologisen reaktiivisuu-25 den määrittämiseksi, esimerkiksi radioimmunomäärityksen avul-·: _ la, ELISA-määrityksen avulla, hemagglutinaation avulla, ja tässä esitetään useita esimerkkejä sopivista määritystekniikoista. "Tunnusomaisuuden" arviointiin voidaan vaihtoehtoisesti käyttää HCV-epitoopin sekvenssin vertaamista Flavi-30 virus-ryhmän jäsenten aikaisemmin tunnettuihin sekvensseihin.

Edellä esitetyn lisäksi seuraavat parametrit koskien nuk-leiinihappohomologiaa ja aminohappohomologiaa ovat käyttökelpoisia joko yksin tai yhdistelmänä identifioitaessa HCV-kan-35 ta/isolaatti. Koska HCV-kannat ja -isolaatit ovat kehityksellisesti läheisiä, on odotettavissa, että genomien koko-naishomologia nukleotiditasolla voi olla noin 10 % tai enemmän, luultavasti noin 40 % tai enemmän, luultavasti noin 60 % 10 111645 tai enemmän ja vielä luultavammin noin 80 % tai enemmän, ja että ne käsittävät vähintään noin 13 nukleotidiä sisältäviä toisiaan vastaavia viereisiä sekvenssejä. Tulisi huomata, että HCV-genomin alueella on variaabeleita ja hypervariaabe-5 leita alueita; homologian näillä alueilla otaksutaan sen vuoksi olevan merkittävästi vähäisempää kuin homologian ko-konaisgenomissa. Vastaavuus HCV-kannan oletetun genomisen sekvenssin ja esimerkiksi CDC/HCV1 cDNA:n välillä voidaan määrittää alalla tunnetuilla menetelmillä. Ne voidaan esimer-10 kiksi määrittää vertaamalla suoraan polynukleotidi-informaatiota oletetusta HCV:stä ja tässä kuvailtua HCV cDNA -sekvenssiä (sekvenssejä) toisiinsa. Ne voidaan määrittää myös polynukleotidien hybridisaation avulla olosuhteissa, joissa muodostuu pysyviä duplekseja homologisten alueiden välillä 15 (esimerkiksi olosuhteissa, joita käytettäisiin ennen Si-pil-kontaa), jota hybridisaatiota seuraa pilkkominen yksijuos-teisen spesifisen nukleaasin (nukleaasien) avulla, jota seuraa pilkontafragmenttien koon määrittäminen.

20 Johtuen HCV-kantojen tai -isolaattien evolutionistisestä yhteydestä, oletetut HCV-kannat tai -isolaatit voidaan identifioida homologiasta polypeptiditasolla. HCV-kantojen tai -isolaattien homologian otaksutaan yleisesti olevan vähintään 10 %, enemmän kuin noin 40 %, luultavasti enemmän kuin noin 25 70 % ja vielä luultavammin enemmän kuin noin 80 %, ja joiden- ·;· kin homologia voi olla jopa enemmän kuin 90 % polypeptidi tasolla. Menetelmät aminohapposekvenssihomologian määrittämiseksi tunnetaan alalla. Aminohapposekvenssi voidaan esimerkiksi määrittää suoraan ja sitä voidaan verrata tässä yhtey-30 dessä esitettyihin sekvensseihin. Vaihtoehtoisesti voidaan määrittää oletetun HCV:n genomisen aineen nukleotidisekvenssi ♦· (tavallisesti cDNA-välituotteen kautta), sen koodittama ole tettu aminohapposekvenssi voidaan määrittää ja vastaavia alueita vertailla.

Tässä yhteydessä käytettynä, määrätystä sekvenssistä "saatu" polynukleotidi tarkoittaa polynukleotidisekvenssiä, joka käsittää sekvenssin, joka sisältää suunnilleen vähintään noin 6 35 11 111645 nukleotidiä, edullisesti vähintään noin 8 nukleotidiä, edullisemmin vähintään noin 10-12 nukleotidiä ja vielä edullisemmin vähintään noin 15-20 nukleotidiä, jotka vastaavat aluetta määrätyssä nukleotidissä. "Vastaava" tarkoittaa mää-5 rätylle sekvenssille homologista tai komplementaarista. Alueen sekvenssi, josta polynukleotidi saadaan, on edullisesti homologinen tai komplementaarinen HCV-genomille tunnusomaiselle sekvenssille. Se, onko sekvenssi tunnusomainen HCV-genomille, voidaan määrittää alaa tuntevien tuntemilla tek-10 nilkoilla. Sekvenssiä voidaan esimerkiksi verrata sekvens-seihin tietopankeissa, esim., Genebank, sen määrittämiseksi, onko se läsnä infektoitumattomassa isännässä tai muissa organismeissa. Sekvenssiä voidaan verrata myös muiden virusten tunnettuihin (kuten prioriteettipäivämäärän) sekvensseihin, 15 mukaan lukien ne, joiden tiedetään aiheuttavan hepatiittia, esim., HAV, HBV ja HDV, ja Flaviviridae-ryhmän jäsenet. Saadun sekvenssin vastaavuus tai vastaamattomuus muiden sekvenssien suhteen voidaan määrittää myös hybridisaation avulla sopivan kovissa olosuhteissa. Hybridisaatiomenetelmät nukleii-20 nihapposekvenssien komplementaarisuuden määrittämiseksi ovat alalla tunnettuja ja niitä käsitellään jäljempänä. Lähemmin myös esimerkiksi Maniatis et ai., (1982). Sen lisäksi hybri-disaatiolla muodostuneet dupleksipolynukleotidien vastinpa-rittomuudet voidaan määrittää tunnetuilla menetelmillä, mu-25 kaan lukien esimerkiksi pilkkominen nukleaasilla kuten ·; Slrllä, joka pilkkoo spesifisesti yksijuosteiset alueet po- lynukleotididuplekseissa. Alueisiin, joista tyypilliset DNA-sekvenssit voidaan "saada", lukeutuvat niihin rajoittumatta esimerkiksi spesifisiä epitooppeja koodittavat alueet samoin 30 kuin ei-kopioidut ja/tai ei-luetut alueet.

Saatu polynukleotidi ei välttämättä ole fysikaalisesti saatu esitetystä nukleotidisekvenssistä, vaan se voidaan luoda jollakin tavalla, mukaan lukien esimerkiksi kemiallinen synteesi 35 tai DNA:n replikaatio tai käänteiskopiointi tai kopiointi. Alueyhdistelmiä, jotka vastaavat määrätyn sekvenssin sekvenssiä, voidaan lisäksi modifioida alalla tunnetuilla tavoilla aiottua käyttöä vastaavaksi.

12 111645

Polypeptidi- tai aminohapposekvenssi, joka on "saatu" määrätystä aminohappo- tai nukleiinihapposekvenssistä, tarkoittaa vastaavasti polypeptidiä, jonka aminohapposekvenssi on ident-5 tinen polypeptidisekvenssin kanssa, joka on kooditettuna sekvenssissä tai sen osassa, jolloin osa käsittää vähintään 3-5 aminohappoa ja edullisemmin 11-15 aminohappoa, tai joka on immunologisesti identtinen, polypeptidin kanssa, joka on kooditettuna sekvenssissä. Tämä terminologia käsittää myös po-10 lypeptidin, joka on ilmennetty määrätystä nukleiinihapposekvenssistä .

Yhdistelmäpolypeptidi tai johdettu polypeptidi ei välttämättä ole luettu määrätystä nukleiinihapposekvenssistä; se voidaan 15 saada aikaan jollakin tavalla, joita ovat esimerkiksi kemiallinen synteesi tai yhdistelmäekspressiosysteemin ilmentäminen tai eristäminen HCV:stä, mukaan lukien mutatoitu HCV. Yhdistelmäpolypeptidi tai johdettu polypeptidi voi sisältää yhden tai useamman aminohappoanalogin tai ei-luonnollisena esiintykö vän aminohapon sekvenssissään. Menetelmät aminohappoanalogien liittämiseksi sekvenssiin ovat alalla tunnettuja. Ne voivat sisältää myös yhden tai useamman leiman, jotka ovat alaa tuntevien tiedossa.

25 Tässä yhteydessä käytettynä ilmaus "yhdistelmäpolynukleotidi" *: tarkoittaa alkuperältään genomista, cDNA:sta saatua, puo lisynteettistä tai synteettistä polynukleotidiä, joka alkuperänsä tai manipuloinnin nojalla: (1) ei liity kokonaan tai osaksi polynukleotidiä, jonka kanssa se on liittynyt yhteen 30 luonnossa, (2) on liittynyt polynukleotidiin, joka on eri kuin mihin se on liittynyt luonnossa tai (3) ei esiinny luon-*; nossa.

Tässä yhteydessä käytettynä ilmauksella "polynukleotidi" tar-35 koitetaan minkä tahansa pituista polymeeristä nukleotidimuo- toa, joko ribonukleotidejä tai deoksiribonukleotidejä. Tämä ilmaus tarkoittaa vain molekyylin primäärirakennetta. Tämä ilmaus sisältää siten kaksi- ja yksijuosteisen DNA:n ja 13 111645 RNA:n. Se sisältää myös tunnetut modifikaatiot, esimerkiksi alalla tunnetut leimat, metylaation, "cap"-alueet, yhden tai useamman luonnossa esiintyvän nukleotidin korvaamisen analogilla, nukleotidien väliset modifikaatiot, kuten esimerkiksi 5 modifikaatiot varauksettomien liitosten kanssa (esim., metyy-‘ lifosfonaatit, fosfotriesterit, fosfoamidaatit, karbamaatit jne.) ja varauksellisten liitosten kanssa (esim., fosforitio-aatit, fosforiditioaatit jne.), modifikaatiot, jotka sisältävät sivuryhmäosia, kuten esimerkiksi proteiineja (mukaan lu-10 kien esim., iiukleaasit, toksiinit, vasta-aineet, signaalipep-tidit, poly-L-lysiini jne.), modifikaatiot väliin sijoitettujen aineiden kanssa (esim., akridiini, psoraleeni jne.), modifikaatiot, jotka sisältävät kelaatinmuodostajia (esim., metallit, radioaktiiviset metallit, boori, hapettavat metallit 15 jne.), modifikaatiot, jotka sisältävät alkylaattoreita, modi fikaatiot modifioitujen liitosten kanssa (esim., alfa-anomeeriset nukleiinihapot jne.) samoin kuin polynukleotidin modifioimattomat muodot.

20 "Puhdistettu" polypeptidi tarkoittaa polypeptidiä, joka on tilassa, joka ei olennaisesti sisällä muita polypeptidejä, so., koostumuksessa, joka sisältää vähintään noin 50 paino-% (haluttu polypeptidi/kokonaispolypeptidi koostumuksessa), edullisesti vähintään noin 70 % ja vielä edullisemmin vähin-25 tään noin 90 % haluttua polypeptidiä välittämättä ei-prote- ·: iinisista aineista koostumuksessa. Alalla tunnetaan menetel mät viruspolypeptidien puhdistamiseksi. Puhdistetut vasta-aineet määritellään samalla tavoin. 1 2 3 4 5 6 "Yhdistelmäisäntäsolut", "isäntäsolut", "solut", "solulin- 2 jat", "soluviljelmät" ja muut sellaiset ilmaukset, jotka mer- 3 kitsevät mikro-organismeja tai korkeampia eukaryoottisia so- 4 lulinjoja viljeltyinä yksisolukokonaisuuksina, tarkoittavat 5 soluja, joita voidaan tai joita on käytetty vastaanottajina 6 yhdistelmävektorille tai muulle siirto-DNA:lie, ja käsittävät alkuperäisen transfektoidun solun jälkeläisiä. On ymmärrettävä, että yksittäisen lähtösolun jälkeläiset eivät välttämättä ole täysin identtiset morfologian ja genomisen DNA:n tai ko- 14 111645 konais-DNA:n osalta kuin alkuperäinen lähtösolu johtuen luonnollisesta, satunnaisesta tai tarkoituksellisesta mutaatiosta .

5 "Replikoni" on mikä tahansa geneettinen elementti, esim., plasmidi, kromosomi, virus, kosmidi yms., joka käyttäytyy itsenäisen yksikön tavoin polynukleotidireplikaatiossa solussa; so., kykenee itseohjattuun replikaatioon.

10 "Vektori" on replikoni, johon toinen polynukleotidiosa on kiinnittynyt, jotta saadaan aikaan kiinnittyneen osan repli-kaatio ja/tai ilmentyminen.

"Säätelysekvenssi" tarkoittaa polynukleotidisekvenssejä, jot-15 ka ovat välttämättömiä kooditussekvenssien ilmentymisen toteuttamiselle, joihin ne on liitetty. Sellaisten säätelysek-venssien luonne on erilainen isäntäorganismista riippuen; prokaryooteilla sellaiset säätelysekvenssit käsittävät yleensä promoottorin, ribosomin sitoutumiskohdan ja terminaatto-20 rit; eukaryooteilla sellaiset säätelysekvenssit käsittävät yleensä promoottorit, terminaattorit ja joissakin tapauksissa tehostinsekvenssit. Ilmauksen "säätelysekvenssit" on tarkoitettu sisältävän ainakin kaikki komponentit, joiden läsnäolo on välttämätön ilmentymiselle, ja siihen voi sisältyä myös 25 lisäkomponentteja, joiden läsnäolo on edullista, esimerkiksi ·; ohjaussekvenssejä.

"Toimivasti kytketty" viittaa vierekkäisyyteen, jolloin siten kuvaillut komponentit ovat yhteydessä toisiinsa, mikä mahdol-30 listaa niiden toiminnan tarkoituksenmukaisella tavalla. Koodi tussekvenssiin "toimivasti kytketty" säätelysekvenssi lii-tetään siten, että kooditussekvenssin ilmentyminen saadaan aikaan olosuhteissa, jotka sopivat säätelysekvensseille.

35 "Avoin lukukehys" (ORF) on polynukleotidin alue, joka koodit-taa polypeptidiä; tämä alue voi käsittää osan kooditussek-venssistä tai kokonaisen kooditussekvenssin.

15 ' 111645 "Kooditussekvenssi" on polynukleotidisekvenssi, joka kopioidaan mRNA:ksi ja/tai luetaan polypeptidiksi asetettaessa sopivien säätelysekvenssien ohjaukseen. Translaation aloitus-kodoni 5'-päässä ja translaation lopetuskodoni 3'-päässä mää-5 räävät kooditussekvenssin rajat. Kooditussekvenssi voi sisältää niihin rajoittumatta mRNA-, cDNA- ja yhdistelmäpo-lynukleotidisekvenssit.

"Immunologisesti identifioitava" viittaa epitoopin (epitoop-10 pien) ja polypeptidi(e)n läsnäoloon, jotka ovat läsnä myös kyseisessä polypeptidissä (polypeptideissä), tavallisesti HCV-proteiineissa. Immunologinen identtisyys voidaan määrittää vasta-aineen sitoutumisella ja/tai kilpailulla sitoutumisessa; nämä tekniikat ovat tuttuja alaa yleisesti tunteville. 15 "Epitooppi" tarkoittaa tässä yhteydessä käytettäessä polypep-tidin antigeenistä determinanttia. Epitooppi voisi sisältää 3 tai useampia aminohappoja, jotka määräävät vasta-aineen sitoutumiskohdan. Epitooppi sisältää yleensä 5 aminohappoa ja 20 joskus vähintään 8 aminohappoa. Epitooppikartoitusmenetelmät ovat alalla tunnettuja.

Polypeptidi on "immunologisesti reaktiivinen" vasta-aineen kanssa, jos se sitoutuu vasta-aineeseen johtuen vasta-aineen 25 tunnistamisesta spesifisen, polypeptidin sisältämän epitoopin ·: avulla. Immunologinen reaktiivisuus voidaan määrittää vasta- aineen sitoutumisen avulla, erityisemmin vasta-aineen sitou-misen kinetiikan avulla ja/tai sitoutumiskilpailulla käyttäen kilpailijana (kilpailijoina) tunnettua polypeptidiä (polypep-30 tidejä), joka sisältää epitoopin, jota vastaan vasta-aine on kohdistettu. Alalla tunnetaan menetelmät sen määrittämiseksi, onko polypeptidi immunologisesti reaktiivinen vasta-aineen kanssa.

35 'Ilmauksella "vasta-aine" tarkoitetaan tässä yhteydessä käytettynä polypeptidiä tai polypeptidiryhmää, joka sisältää vähintään yhden vasta-aineen tarttumiskohdan. "Vasta-aineen tarttumiskohta" tai "sitoutumisdomeeni" muodostuu vasta-ai- 16 111645 nemolekyyli(e)n variaabelidomeenien laskostumisesta, jolloin muodostuu kolmiulotteisia sitoutumistiloja, joiden sisäpinnan muoto ja varausjakautuma ovat komplementaariset antigeenin epitoopin tunnusmerkkien kanssa, mikä mahdollistaa immunolo-5 gisen reaktion antigeenin kanssa. Vasta-aineen tarttumiskohta voi olla muodostunut raskas- ja/tai kevytketjudomeenista (VH ja vastaavasti Vl) , jotka muodostavat hypervariaabeleita silmukoita, jotka myötävaikuttavat antigeenin sitoutumiseen. Ilmaus "vasta-aine" käsittää esimerkiksi selkärankaisten vasta-10 aineet, hybridivasta-aineet, kimeeriset vasta-aineet, muutetut vasta-aineet, yhdenarvoiset vasta-aineet, Fab-proteiinit ja yksidomeeniset vasta-aineet.

Tässä yhteydessä käytettynä "yksidomeeninen vasta-aine" (dAb) 15 on vasta-aine, joka käsittää VH-domeenin, joka reagoi immuno-logisesti määrätyn antigeenin kanssa. dAb ei sisällä VL-do-meenia mutta se voi sisältää muita antigeenin sitoutumisdo-meeneja, joita tiedetään vasta-aineilla olevan, esimerkiksi kappa- ja lambdadomeeneja. Alalla tunnetaan menetelmiä dAb:n 20 valmistamiseksi. Lähemmin esimerkiksi Ward et ai., (1989).

Vasta-aineet voivat koostua myös VH- ja VL-domeeneista samoin kuin muista antigeeniä sitovista domeeneista. Esimerkkejä tämäntyyppisistä vasta-aineista ja menetelmistä niiden val-25 mistamiseksi tunnetaan alalla (lähemmin esim., US-patentti 4 ·: . 816 467, joka on tässä sisällytetty viitteenä) ja sisältävät seuraavia. Esimerkiksi "selkärankaisen vasta-aineet" tarkoittavat vasta-aineita, jotka ovat tetrameerejä tai niiden yhdistelmiä, jotka sisältävät raskas- ja kevytketjuja, jotka 30 ovat tavallisesti ryhmittyneet "Y"-konfiguraatioon, ja joiden ketjujen välillä voi olla tai ei ehkä ole kovalenttisia sidoksia. Selkärankaisten vasta-aineissa tietyn vasta-aineen kaikkien ketjujen aminohapposekvenssit ovat homologisia ketjujen kanssa, joita tavataan lymfosyytin yhdessä vasta-35 aineessa, joka lymfosyytti tuottaa mainittua vasta-ainetta in situ tai in vitro (esimerkiksi hybridoomissa). Selkärankaisten vasta-aineet käsittävät tyypillisesti natiiveja vasta-aineita, esimerkiksi puhdistettuja polyklonaalisia vasta- .111645 17 aineita ja monoklonaalisia vasta-aineita. Esimerkkejä näiden vasta-aineiden valmistusmenetelmistä kuvaillaan jäljempänä.

"Hybridivasta-aineet" ovat vasta-aineita, joissa yksi raskas-5 ja kevytketjupari on homologinen ensimmäisen vasta-aineen raskas- ja kevytketjuparin kanssa, kun taas toinen raskas- ja kevytketjupari on homologinen toisen, erilaisen vasta-aineen raskas- ja kevytketjuparin suhteen. Kumpikin näistä kahdesta parista sitoo tyypillisesti erilaisia epitooppeja, erityises-10 ti eri antigeenien pinnoilla. Tästä on seurauksena "kaksiarvoisuus" -ominaisuus, so., kyky sitoa kahta antigeeniä samanaikaisesti. Sellaisia hybridejä voidaan muodostaa myös käyttäen kimeerisiä ketjuja kuten jäljempänä on esitetty.

15 "Kimeeriset vasta-aineet" ovat vasta-aineita, joissa raskas-ja/tai kevytketjut ovat fuusioproteiineja. Ketjujen konstant-tialue on tyypillisesti yhdestä tietystä lajista ja/tai ryhmästä ja variaabelidomeenit ovat eri lajista ja/tai ryhmästä. Mukaan luetaan myös mikä tahansa vasta-aine, jossa jompikumpi 20 tai kumpikin raskas- ja kevytketjuista koostuvat sekvenssiyh-distelmistä, jotka jäljittelevät vasta-ainesekvenssejä eri lajeissa, olivatpa nämä lähteet peräisin eri ryhmistä tai eri lajeista, ja sijaitsipa fuusiokohta variaabeli/konstanttira-jalla tai ei. On mahdollista siten tuottaa vasta-aineita, 25 joissa sekä konstantti- että variaabelialue ei jäljittele ♦; tunnettuja vasta-ainesekvenssejä. Sen jälkeen oli mahdollista konstruoida vasta-aineita, joiden variaabelialueella on korkeammat spesifiset af fiinisuudet tiettyyn antigeeniin, tai joiden konstanttialue voi saada aikaan komplementin fiksaati-30 on, tai tehdä muita parannuksia tietylle konstanttialueelle kuuluvissa ominaisuuksissa.

* * • «

Toinen esimerkki käsittää "muunnetut vasta-aineet", joka tarkoittaa vasta-aineita, joissa luonnollisena esiintyvä amino-35 happosekvenssi selkärankaisen vasta-aineessa on vaihdettu toiseen. Käyttämällä hyväksi yhdistelmä-DNA -menetelmiä voidaan konstruoida vasta-aineita haluttujen ominaisuuksien saavuttamiseksi. Mahdollisia muunnelmia on useita ja ne kä- 18 111645 sittävät yhden tai useamman aminohapon vaihtamisen tai alueen, esimerkiksi konstanttialueen kokonaan uudelleenkonst-ruoinnin. Muutoksia konstanttialueella voidaan yleisesti tehdä, jotta saadaan aikaan haluttuja soluprosessiominaisuuksia, 5 esim., muutoksia komplementin fiksaatiossa, vuorovaikutuksessa membraaneilla ja muita säätelytekijäfunktioita. Muutoksia variaabelialueella voidaan tehdä antigeenin sitovissa ominaisuuksissa. Vasta-aine voidaan myös muokata, kun halutaan auttaa molekyylin tai aineen spesifisessä kuljetuksessa tiettyyn io soluun tai kudospaikkaan. Halutut muutokset voidaan tehdä tunnetuilla molekyylibiologian menetelmillä, esim., yhdistel-mä-DNA -menetelmillä, paikkakohdennetun mutatoinnin avulla jne.

15 Vielä toisena esimerkkinä ovat "yhdenarvoiset vasta-aineet", jotka ovat yhdistelmiä, jotka käsittävät raskasketju/kevyt-ketjudimeerin sitoutuneena toisen raskasketjun Fc (so., kons-tanttiin) -alueeseen. Tämäntyyppinen vasta-aine välttyy antigeeniseltä modulaatiolta. Lähemmin esim., Glennie et ai. , 20 (1982) .

Vasta-ainemääritelmä pitää sisällään myös vasta-aineiden "Fab"-fragmentit. "Fab"-alue tarkoittaa niitä raskas- ja ke-vytketjujen osia, jotka ovat suunnilleen vastaavia tai analo-25 gisia sekvensseihin nähden, jotka käsittävät raskas- ja ke-vytketjujen haarautuneen osan, ja joiden on osoitettu im-munologisesti sitoutuvan spesifiseen antigeeniin, mutta joista puuttuu Fc-säätelyosa. "Fab" sisältää yhden raskasketjun ja yhden kevytketjun yhdistelmiä (tunnetaan yleensä nimellä 30 Fab') samoin kuin tetrameerejä, jotka sisältävät 2H- ja 2L-ketjut (nimellä F{ab)2), jotka kykenevät valikoivasti reagoi- » maan määrätyn antigeenin tai antigeeniperheen kanssa. "Fab"-vasta-aineet voidaan jakaa alaryhmiin analogisesti edellä kuvailtujen ryhmien kanssa, so., "selkärankaisen Fab", "hyb-35 ridi-Fab", "kimeerinen Fab" ja "muunnettu Fab". Alalla tunnetaan menetelmät vasta-aineiden "Fab"-palojen tuottamiseksi, esimerkiksi proteolyysi ja synteesi yhdistelmämenetelmien avulla.

19 111645

Ilmaukseen "vasta-aineet" luetaan myös yksiketjuiset antigeenin sitovat (SCA) proteiinit kuten sellaiset, joita Schlom, J. on kuvaillut julkaisussa Cancer research, 15. kesäkuuta, 5 1992 (samoin kuin siinä siteeratuissa artikkeleissa).

Tässä yhteydessä käytettynä ilmaus "immunogeeninen polypepti-di" on polypeptidi, joka saa aikaan soluun liittyvän tai elimistön nesteisiin liittyvän immuunivasteen, joko yksin tai 10 kytkettynä kantajaan adjuvanssin läsnäollessa tai sen puuttuessa .

Ilmaus "polypeptidi" tarkoittaa aminohappopolymeeriä eikä viittaa tuotteen määrättyyn pituuteen; polypeptidimääritelmän 15 piiriin luetaan siten peptidit, oligopeptidit ja proteiinit. Tämä ilmaus ei myöskään tarkoita polypeptidin ilmenemisen jälkeisiä modifikaatioita eikä sulje niitä pois, esimerkiksi glykosylaatio, asetylaatio, fosforylaatio ja vastaavat modifikaatiot. Määritelmä sisältää esimerkiksi polypeptidit, jot-20 ka sisältävät yhden tai useamman aminohappoanalogin (mukaan lukien esimerkiksi luonnossa esiintymättömät aminohapot jne.), polypeptidit, joiden sidokset on korvattu, samoin kuin muut alalla tunnetut modifikaatiot, sekä luonnollisina esiintyvät että ei-luonnollisina esiintyvät.

25 "Transformaatiolla" tarkoitetaan tässä yhteydessä käytettynä ulkopuolisen polynukleotidin liittämistä isäntäsoluun, riippumatta liittämiseen käytetystä menetelmästä, esimerkiksi suora sisäänotto, transduktio, f-pariutus tai elektroporaa-30 tio. Ulkopuolinen polynukleotidi voidaan säilyttää ei-integ-roituvana vektorina, esimerkiksi plasmidina, tai se voidaan vaihtoehtoisesti integroida isännän genomiin.

"Yksilöllä" tarkoitetaan tässä yhteydessä käytettynä sel-35 kärankaisia, erityisesti nisäkkäisiin kuuluvia jäseniä, ja termi käsittää niihin rajoittumatta eläimet (esim. koirat, kissat, nautakarjan, siat, vuohet, kanit, hiiret, rotat, mar- 20 111645 sut jne.) ja kädelliset, mukaan lukien apinat, simpanssit, paviaanit ja ihmiset.

Tässä yhteydessä käytettynä nukleiinihapon "templaattijuoste" 5 ("sense strand") sisältää sekvenssin, joka on sekvenssihomo-loginen mRNA:n kanssa. "Kooditusjuoste" ("anti-sense strand") sisältää sekvenssin, joka on komplementaarinen "templaatti-juosteen" sekvenssin kanssa.

10 Tässä yhteydessä käytettynä viruksen "juosteeltaan positiivinen genomi" on genomi, joko RNA tai DNA, joka on yksijuostei-nen, ja koodittaa viruspolypeptidiä (-polypeptidejä). Esimerkkeihin juosteeltaan positiivisista RNA-viruksista lukeutuvat ryhmät Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picor-15 naviridae ja Caliciviridae. Mukaan luetaan myös ryhmä Fla-viviridae, joka aikaisemmin luokiteltiin ryhmään Togaviridae. Katso Fields & Knipe (1986).

Ilmauksella "vasta-aineen sisältävä kehon osa" tarkoitetaan 20 tässä yhteydessä yksilön kehon osaa, joka on kiinnostuksen kohteena olevan vasta-aineen lähde. Alalla tunnetaan vasta-ainetta sisältäviä kehon osia ja niitä ovat niihin rajoittumatta esimerkiksi plasma, seerumi, selkäydinneste, imuneste, ihon ulkopuoliset osat, hengitys-, suolisto- ja sukupuoli- ja 25 virtsaelinkanavat, kyyneleet, sylki, maito, valkosolut ja myeloomat.

"Biologisella näytteellä" tarkoitetaan tässä yhteydessä käytettynä yksilöstä eristettyä kudos- tai nestenäytettä, mukaan 30 lukien niihin rajoittumatta esimerkiksi plasma, seerumi, selkäydinneste, imuneste, ihon ulkopuoliset osat, hengitys-, ♦♦ suolisto- ja virtsa- ja sukupuolielinkanavat, kyyneleet, syl ki, maito, verisolut, tuumorit, elimet ja myös näytteet in vitro soluviljelyaineosista (mukaan lukien niihin rajoittu-35 matta solujen osittain käyttämä alusta, joka on tuloksena solujen kasvusta soluviljelyalustassa, oletettavasti virusin-fektoidut solut, yhdistelmäsolut ja solukomponentit).

21 111645 II. Keksinnön kuvailu

Keksinnön mukaisessa käytännössä käytetään, ellei toisin ole ilmoitettu, molekyylibiologian, mikrobiologian, yhdistelmä-5 DNA -tekniikan ja immunologian tavanomaisia menetelmiä, jotka ovat alan tietämyksen mukaisia. Sellaisia menetelmiä tuodaan esille kokonaisuudessaan kirjallisuudessa. Lähemmin, esimerkiksi Maniatis, Fitsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 81982); "DNA Cloning, volyymit I ja II (D.N. 10 Glover edit. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait edit. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins edit. 1984); "Transcription and Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins edit. 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney edit. 1986); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRL 15 Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984); Sarja "Methods in Enzymology" (Academic Press Inc.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.H. Miller ja M.P. Calos edit. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Meth. Enzymol. Vol. 154 ja 155 (Wu ja Grossman, ja vastaavas-20 ti Wu, edit.), Mayer ja Walker, edit. (1987), "Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology" (Academic Press, London) ; Scopes, (1987) "Protein Purification: Principles and

Practice", toinen painos (Springer-Verlag, N.Y.); ja "Handbook of Experimental Immunology", volymit I-IV (D.M. Weir ja 25 C.C. Blackwell edit. 1986). Kaikki tässä yhteydessä mainitut _ patentit, patenttihakemukset ja julkaisut, sekä edellä että jäljempänä, ovat tässä sisällytettyinä viitteinä. 1 22 111645 II.A. Typistettyjä HCV-poIypeptidejä Tämän keksinnön mukaiset aineet ja menetelmät tehdään mahdollisiksi identifioimalla jäljempänä uusia HCV-epitooppeja.

5 Tietämys näistä epitoopeista (tai antigeenisistä alueista) mahdollistaa typistettyjä HCV-sekvenssejä sisältävien poly-peptidien konstruoinnin, joita voidaan käyttää immunologisina reagensseina.

10 Vähintään yhden virusepitoopin koodin sisältävät typistetyt HCV-aminohapposekvenssit ovat käyttökelpoisia immunologisina reagensseina. Esimerkiksi, polypeptidejä, jotka sisältävät sellaisia typistettyjä sekvenssejä, voidaan käyttää reagensseina immunomäärityksessä. Nämä peptidit ovat myös ehdolla 15 olevia antigeenialayksikköjä koostumuksissa antiseerumituotantoon tai rokotteisiin. Vaikka näitä typistettyjä sekvenssejä voidaan tuottaa natiivin virusproteiinin erilaisten tunnettujen käsittelyjen avulla, on yleensä edullista valmistaa HCV-sekvenssin sisältäviä synteettisiä peptidejä tai yhdis-20 telmäpolypeptidejä. Näitä typistettyjä HCV-sekvenssejä sisältäviä polypeptidejä voidaan valmistaa kokonaan HCV-sekvens-seistä (yksi tai useampi epitooppi, joko vierekkäinen tai ei-vierekkäinen) tai HCV-sekvensseistä ja heterologisista sekvensseistä fuusioproteiinissa. Käyttökelpoisia heterologisia 25 sekvenssejä ovat sekvenssit, jotka saavat aikaan erittymisen *: yhdistelmäisännästä, tehostavat HCV-epitoopin (-epitooppien) immunologista reaktiivisuutta tai helpottavat polypeptidin kytkemistä imunomäärityskantajaan tai rokotekantajaan. Lähemmin esim., EPO-julkaisu 116 201; US-patentti 4 722 840; EPO-30 julkaisu 259 149; US-patentti 4 629 783, jotka julkaisut ovat tässä sisällytettyinä viitteenä.

• ·

Typistettyjä HCV-sekvenssejä sisältävien peptidien koko voi vaihdella laajasti, minimikoon ollessa HCV-epitoopin aikaan-35 saamiseksi riittävän kokoinen sekvenssi, kun taas maksimikoko ei ole ratkaiseva. Maksimikoko ei mukavuussyistä tavallisesti ole olennaisesti suurempi kuin mikä tarvitaan aikaansaamaan halutut HCV-epitoopit ja heterologisen sekvenssin toiminto 23 111645 (toiminnot), jos mahdollista. Typistetyn HCV-aminohapposekvenssin koko vaihtelee tyypillisesti alueella noin 5 (tai 8) - noin 100 aminohappoa pituutta. Tyypillisemmin kuitenkin HCV-sekvenssi on pituudeltaan enintään 50 (tai 40) aminohap-5 poa, ja joskus enintään noin 20, 25 tai 30 aminohappoa. On tavallisesti edullista valita HCV-sekvenssit sisältämään vähintään noin 8, 10, 12 tai 15 aminohappoa.

Esimerkkejä typistetyistä, käyttökelpoisista tässä kuvailit) luista HCV-aminohapposekvensseistä (oktameereistä) esitetään jäljempänä esimerkeissä. Tulisi ymmärtää, että nämä peptidit eivät välttämättä kartoita täsmällisesti yhtä epitooppia. Sekvenssin ei-immunogeeniset osat voidaan määritellä käyttäen tavanomaisia menetelmiä ja poistaa kuvailluista sekvensseis-15 tä. Sen lisäksi voidaan identifioida muita typistettyjä HCV- aminohapposekvenssejä, jotka sisältävät epitoopin tai ovat immunogeenisiä kuten tässä on kuvailtu.

Polypeptidituotteita, jotka sisältävät jäljempänä esitettäviä 20 typistettyjä HCV-aminohapposekvenssejä, voidaan valmistaa erillisinä peptideinä tai liitettyinä suurempaan polypepti-diin, ja niille voi olla käyttöä kuten tässä on kuvailtu.. Edullisissa käyttösovellutuksissa typistetyillä sekvensseillä El- ja/tai E2-domeeneista on käyttöä rokotteissa ja terapeut-25 tisissa tuotteissa. Vaikka yleisesti ottaen kaikilla domee-neilla on jonkin verran diagnostista käyttöä, C, NS3, NS4 ja NS5 ovat erityisen edullisia, C-epitooppien yhdistelmien epi-tooppien kanssa yhdestä tai useammasta NS3-, NS4- tai NS5-domeenista ollessa erityisen edullisia.

30 II.B. Polypeptidien valmistaminen o * ( HCV-aminohapposekvenssejä koodittavien DNA-sekvenssien saatavuus mahdollistaa ekspressiovektoreiden konstruoinnin, jotka 35 koodittavat polypeptidin antigeenisesti aktiivisia alueita (lähemmin esim. kuvio 2) . Näitä antigeenisesti aktiivisia alueita voidaan saada kuoren tai vaipan antigeeneistä tai ydinantigeeneistä tai antigeeneistä, jotka eivät ole raken- 111645 teellisiä, esimerkiksi polynukleotidin sitoutumisproteiin.it, polynukleotidipolymeraasi(t) ja muut virusproteiinit, joita tarvitaan replikaatioon ja/tai viruspartikkein kokoamiseen. Haluttuja peptidejä koodittavat fragmentit saadaan esimerkik-5 si virus-cDNA -klooneista käyttäen tavanomaista restriktio-pilkontaa tai synteettisillä menetelmillä, ja ligoidaan vek-toreihin, jotka voivat esimerkiksi sisältää osia fuusiosek-vensseistä, kuten esimerkiksi beeta-galaktosidaasi tai supe-roksididismutaasi (SOD), edullisesti SOD. Menetelmiä ja vek-10 toreita, jotka ovat käyttökelpoisia polypeptidien tuotantoon, jotka sisältävät SOD-fuusiosekvenssejä, kuvaillaan EP-jul-kaisussa 0196056, julkaistu 1. lokakuuta, 1986. Jaksoissa IV.B.l, IV.B.2 ja vastaavasti IV.B.4 kuvaillaan vektoreita, jotka koodittavat SOD- ja HCV-polypeptidien fuusiopolypepti-15 dejä, so., NANB5-1-1, NANBsi ja C100-3, joka on kooditettuna HCV-cDNA -yhdistelmässä. Mitä tahansa HCV cDNA:n osaa, joka sisältää avoimen lukukehyksen (tai sen synteettisen version), voidaan käyttää yhdistelmäpolypeptidin kuten valmiin proteiinin tai fuusioproteiinin ilmentämiseksi.

20 HCV-epitooppeja sisältävä polypeptidi voidaan vaihtoehtoisesti saada aikaan kemiallisen synteesin avulla käyttäen va-kiomenetelmiä, jotka perustuvat kuvioiden ja esimerkkien mukaiseen aminohapposekvenssiin.

25 •\ . Haluttua polypeptidiä koodittava DNA, joko fuusiomuodossa tai fuusioitumattomana, ja joko sisältäen tai ei sisältäen erityksen mahdollistavan signaalisekvensin, voidaan liittää eks-pressiovektoreihin, jotka sopivat mille tahansa sopivalle 30 isännälle. Tällä hetkellä käytetään sekä eukaryoottisia että prokaryoottisia isäntäsysteemejä yhdistelmäpolypeptidien muo-dostamiseen ja isäntäsolulinjoja esitetään EPO-julkaisussa 318 216. Polypeptidi eristetään sen jälkeen solulysaatista tai kasvualustasta ja puhdistetaan aiottua käyttöä varten 35 tarvittavassa määrin. Puhdistus voidaan suorittaa alalla tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi differentiaaliuutolla, suolafraktioinnilla, kromatografoimalla ioninvaihtohartseil-la, affiniteettikromatografiällä, sentrifugoimalla ja vastaa- 25 111645 villa menetelmillä. Lähemmin esimerkiksi, Methods in Enzymo-logy, erilaisia menetelmiä proteiinien puhdistamiseksi. Sellaisia peptidejä voidaan käyttää diagnostisina aineina, tai ne, jotka synnyttävät neutraloivia vasta-aineita, voidaan 5 formuloida rokotteiksi. Näitä peptidejä vastaan tehtyjä vasta-aineita voidaan myös käyttää diagnostisina aineina tai passiiviseen immunoterapiaan. Kuten jäljempänä on kuvailtu, vasta-aineet näitä polypeptidejä vastaan ovat lisäksi käyttökelpoisia esimerkiksi eristettäessä ja identifioitaessa HCV-10 partikkeleita.

HCV-polypeptidit voidaan eristää myös HCV-virioneista ja typistää (jos eivät jo ole). Virioneja voidaan kasvattaa HCVrllä infektoiduissa soluissa kudosviljelmässä tai infek-15 toituneessa isännässä.

II.C. Antigeenisten polypeptidien valmistaminen ja konjugointi kantajaan 20 Peptidin antigeeninen alue on yleensä verrattain pieni- - tavallisesti pituudeltaan 8-10 aminohappoa tai vähemmän. Niinkin vähän kuin 5 aminohappoa sisältävät fragmentit voivat karakterisoida antigeenisen alueen. Nämä osat voivat vastata HCV-antigeenin alueita. Sen mukaisesti, käytettäessä HCV:n 25 cDNA:ta pohjana, HCV-polypeptidien lyhyitä osia koodittavat ':· DNA:t voidaan ilmentää yhdistelmämuodossa joko fuusioprote- iineina tai eristettyinä polypeptideinä. Lyhyitä aminohappo-sekvenssejä voidaan lisäksi saada kemiallisen synteesin avulla. Tapauksissa, joissa syntetisoitu peptidi on oikeassa kon-30 figuraatiossa niin, että saadaan aikaan oikea epitooppi mutta on liian pieni ollakseen immunogeeninen, peptidi voidaan ··· kiinnittää sopivaan kantajaan.

Muutamia menetelmiä sellaisen liitoksen aikaansaamiseksi tun-35 netaan alalla, mukaanlukien disulfidisidosten muodostaminen käyttäen N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyylitio)propionaattia (SPDP) ja sukkinimidyyli-4-(N-maleimido-metyyli) sykloheksaa-ni-l-karboksylaattia (SMCC) saatuina Pierce Companyltä, Rock- 26 111645 ford,.Illinois, (jos peptidistä puuttuu sulfydryyliryhmä, tämä voidaan saada aikaan lisäämällä kysteiinitähde). Nämä rea-genssit muodostavat disulfidisidoksen niiden ja toisen proteiinin peptidikysteiinitähteiden välille ja amidisidoksen ly-5 siinissä olevan epsilon-aminon välityksellä, tai muun vapaan aminoryhmän välille toisessa proteiinissa. Useita sellaisia disulfidi/amidin muodostavia aineita tunnetaan. Lähemmin esim. Immun. Rev. (1982) 62:185. Toiset bifunktionaaliset kytkentäaineet muodostavat tioeetterisidoksen ennemmin kuin 10 disulfidisidoksen. Monet näistä tioeetterin muodostavista aineista ovat kaupallisesti saatavissa ja sisältävät 6-malei-midokapronihapon, 2-bromietikkahapon, 2-jodietikkahapon, 4-N-maleimido-metyyli)sykloheksaani-l-karboksyylihapon ja vastaavien happojen reaktiivisia estereitä. Karboksyyliryhmät voi-15 daan aktivoida yhdistämällä ne sukkinimidin tai 1-hydrok-syyli-2-nitro-4-sulfonihapon natriumsuolan kanssa. Muissa menetelmissä antigeenien kytkemiseksi käytetään rotavirus/ "sitoutumispeptidi" -systeemiä, jota kuvaillaan EPO-jul-kaisussa 259 149, joka julkaisu on sisällytetty tässä yh- 20 teydessä viitteenä. Edellä olevan luettelon ei ole tarkoitettu olevan kattava ja mainittujen yhdisteiden modifikaatioita voidaan selkeästi käyttää.

Mitä tahansa kantajaa voidaan käyttää, joka ei itse aiheuta 25 isännälle haitallisten vasta-aineiden tuotantoa. Sopivat kan-·: . tajat ovat tavallisesti suuria, hitaasti metaboloituvia mak romolekyylejä kuten proteiineja; polysakkaridejä, kuten la-teksifunktionalisoitu SepharoseR, agaroosi, selluloosa, sel-luloosahelmet ja vastaavat; polymeerisiä aminohappoja kuten 30 polyglutamiinihappo, polylysiini ja vastaavat; amino-happokopolymeerejä ja inaktiivisia viruspartikkeleita (lähemmin esimerkiksi Jakso II.D.). Erityisen käyttökelpoisia pro-teiinisubstraatteja ovat seerumin albumiinit, maljakotilon hemosyaniini, immunoglobuliinimolekyylit, tyroglobuliini, mu-35 nanvalkuainen, tetanustoksoidi ja muut alaa tuntevien hyvin tuntemat proteiinit.

27 111645 II.D. HCV-epitooppeia sisältävien hybridipartikkeli-immuno geenien valmistaminen HCV-epitooppien immunogeenisuutta voidaan myös tehostaa val-5 mistamalla ne nisäkäs- tai hiivasysteemeissä yhdistettynä tai kokoonpantuna partikkelin muodostavan proteiinin kanssa, kuten esimerkiksi sellaisen, joka liittyy hepatiitti B -pinta-antigeeniin. Lähemmin esim. US-patentti 4 722 840. Rakenteet, joissa HCV-epitooppi on kytketty suoraan partikkelin muodos-10 tavaan proteiiniin, kooditussekvenssit tuottavat hybridejä, jotka ovat immunogeenisiä HCV-epitoopin suhteen. Kaikki valmistetut vektorit sisältävät lisäksi HBV:lle spesifisiä epi-tooppeja, joiden immunogeenisuusaste vaihtelee, kuten esimerkiksi pre-S -peptidi. Partikkelin muodostavasta proteiinista 15 konstruoidut partikkelit, jotka sisältävät HCV-sekvenssejä, ovat siten immunogeenisiä HCV:n ja HBV:n suhteen.

Hepatiittipinta-antigeenin (HBSAg) on osoitettu muodostuvan ja tiivistyvän partikkeleiksi S. cerevisiaessa (P. Valenzuela 20 et ai. (1982)) samoin kuin esimerkiksi nisäkässoluissa (P. Valenzuela et ai. (1984). Sellaisten partikkeleiden muodostumisen on osoitettu tehostavan monomeerialayksikön immunogeenisuutta. Rakenteet voivat sisältää myös immunodominoivan HBSAg:n epitoopin, joka sisältää esipinta (pre-S) -alueen 55 25 aminohappoa. Neurath et ai. (1984). Hiivassa ilmentyviä pre-.. S-HBSAg -partikkelirakenteita kuvaillaan EPO-julkaisussa 174 444, julkaistu 19. maaliskuuta, 1986; hybridejä, jotka sisältävät heterologisia virussekvenssejä hiivaekspressiota varten, kuvaillaan EPO-julkaisussa 175 261, julkaistu 26. maa-30 liskuuta, 1966. Nämä rakenteet voidaan ilmentää myös nisä kässoluissa kuten kiinanhamsterin munasarjan (CHO) -soluissa ... käyttäen SV40-dihydrofolaattireduktaasivektoria (Michelle et ai. (1984)).

35 Osia partikkelin muodostavan proteiinin kooditussekvensseistä voidaan lisäksi korvata HCV-epitooppia koodittavilla kodo-neilla. Tässä korvauksessa alueet, joita ei tarvita välittämään yksikköjen kasautumista immunogeenisten partikkeleiden 111645 28 muodostamiseksi hiivassa tai nisäkkäässä, voidaan poistaa eliminoiden siten antigeenisten HBV-lisäpaikkojen kilpailu HCV-epitoopin kanssa.

5 II.G. Vasta-aineiden valmistaminen HCV-epitooppeja vastaan Tässä kuvailtuja immunogeenisiä polypeptidejä käytetään vasta-aineiden, mukaan lukien polyklonaaliset ja monoklonaaliset vasta-aineet, tuottamiseen. Jos halutaan polyklonaalisia vas-10 ta-aineita, valikoitu nisäkäs (esim., hiiri, kani, vuohi, hevonen yms.) immunisoidaan HCV-epitoopin (epitooppeja) sisältävän immunogeenisen polypeptidin kanssa. Immunisoidun eläimen seerumi kerätään talteen ja käsitellään tunnetuilla menetelmillä. Jos seerumi, joka sisältää polyklonaalisia vasta-15 aineita HCV-epitoopille, sisältää vasta-aineita muille antigeeneille, polyklonaaliset vasta-aineet voidaan puhdistaa im-munoaffiniteettikromatografiän avulla. Alalla tunnetaan tekniikat polyklonaalisten antiseerumien tuottamiseen ja prosessointiin, lähemmin esimerkiksi Mayer ja Walker (1987). Po-20 lyklonaalisia vasta-aineita voidaan vaihtoehtoisesti eristää nisäkkäästä, joka on aikaisemmin infektoitunut HCV:llä.

HCV-epitooppeja vastaan kohdistettuja monoklonaalisia vasta-aineita voidaan myös helposti tuottaa alaa tuntevan henkilön 25 toimesta. Yleinen teknologia monoklonaalisten vasta-aineiden •v valmistamiseksi hybridoomien avulla on hyvin tunnettua. Jat kuvasti lisääntyviä, vasta-aineita tuottavia solulinjoja voidaan saada aikaan solufuusion kautta ja myös muilla menetelmillä, kuten esimerkiksi B-lymfosyyttien suoralla trans-30 formoinnilla onkogeenisella DNA:11a tai transfektoinnilla Ep-stein-Barr -viruksen avulla. Lähemmin, esimerkiksi M. Schrei-er et ai. (1980) ; Hammerling et ai. (1981) ; Kennett et ai. (1980); myös US-patentit 4 341 761; 4 399 121; 4 427 783; 4 444 887; 4 466 917; 4 472 500; 4 491 632 ja 4 493 890. HCV-35 epitooppeja vastaan tuotettujen monoklonaalisten vasta-aineiden paneeleista voidaan seuloa erilaisia ominaisuuksia; so., isotooppi, epitooppiaffiinisuus jne.

29 111645

Vasta-aineet, sekä monoklonaaliset että polyklonaaliset, jotka on kohdistettu HCV-epitooppeja vastaan, ovat erityisen käyttökelpoisia diagnoosissa ja neutraloivat vasta-aineet ‘ ovat käyttökelpoisia passiivisessa immunoterapiassa. Erityi- 5 sesti monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää aikaansaamaan anti-idiotyyppisiä vasta-aineita.

Anti-idiotyyppiset vasta-aineet ovat immunoglobuliineja, jotka sisältävät infektiivisen agenssin antigeenin "sisäisen kulo van", jota vastaan suojaa halutaan. Lähemmin esimerkiksi Ni-sonoff, A., et ai., (1981) ja Dreesman et ai., (1985). Alalla tunnetaan menetelmät anti-idiotyyppisten vasta-aineiden tekemiseksi. Lähemmin esimerkiksi Grzych (1985), MacNamara et ai. (1984) ja Vytdehaag et ai. (1985). Nämä anti-idiotyyppiset 15 vasta-aineet voivat olla käyttökelpoisia myös NANBH:n hoitamiseen, rokottamiseen ja/tai diagnoosiin samoin kuin HCV-antigeenien immunogeenisten alueiden selvittämiseen.

II.H. Immunomääritvkset ia diagnostiset määritvspakkaukset 20

Sekä tässä kuvatut polypeptidit että vasta-aineet ovat käyttökelpoisia immunomäärityksissä HCV-vasta-aineiden läsnäolon tai viruksen ja/tai HCV-polynukleotidien (tai epitooppien) läsnäolon ilmaisemiseksi esimerkiksi biologisissa näytteissä. 25 Immunomääritysten suunnittelu on altis suurille vaihteluille .. ja alalla tunnetaan useita kokoonapanoja. Immunomäärityksessä käytetään hyväksi vähintään yhtä HCVrstä saatua virusepitoop-pia. Nämä epitoopit voivat olla peräisin samoista tai eri vi-ruspolypeptideistä ja ne voivat olla erillisissä yhdis-30 telmäpolypeptideissä tai luonnollisissa polypeptideissä tai yhdessä samoissa yhdistelmäpolypeptideissä. Im- r ' munomäärityksessä voidaan käyttää esimerkiksi monoklonaalista vasta-ainetta, joka on kohdistettu virusepitooppia (epitoop-peja) vastaan, monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmää, 35 joka on kohdistettu yhden virusantigeenin epitooppeja vastaan, monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on kohdistettu eri virusantigeenien epitooppeja vastaan, polyklonaalisia vasta-aineita, jotka on kohdistettu samaa virusantigeeniä vastaan 30 111645 tai polyklonaalisia vasta-aineita, jotka on kohdistettu eri virusantigeenejä vastaan. Toimintaohjeet voivat perustua esimerkiksi kilpaileviin tai suoraan reaktioon perustuviin tai kerrostyyppisiin määrityksiin. Toimintaohjeet voivat perustua 5 myös esimerkiksi kiinteiden alustojen (kantajien) käyttöön tai ne voivat käsittää immunosaostuksen. Useimmissa määrityksissä käytetään leimattua vasta-ainetta tai polypeptidiä; leimat voivat olla esimerkiksi entsymaattisia, fluoresoivia, kemiluminesoivia, radioaktiivisia tai värimolekyylejä. Määri-10 tykset, joissa signaalit monistetaan koettimesta, ovat myös tunnettuja; joista esimerkkejä ovat määritykset, joissa käytetään hyväksi biotiinia ja avidiinia, ja entsyymileimatut ja entsyymi välitteiset immunomääritykset kuten ELISA-määritykset (kuvailtu jäljempänä).

15 anti-HCV -vasta-aineen (-vasta-aineiden) immunomääritys käsittää tyypillisesti vasta-aineita sisältäväksi epäillyn tes-tinäytteen kuten biologisen näytteen valitsemisen ja preparoinnin, sen jälkeen sen inkuboinnin antigeenisen (so., epi-20 toopin sisältävän) HCV-polypeptidi(e)n kanssa olosuhteissa, jotka mahdollistavat antigeeni-vasta-ainekompleksien muodostumisen, ja sen jälkeen sellaisten kompleksien muodostumisen ilmaisemisen. Sopivat inkubointiolosuhteet tunnetaan alalla hyvin. Immunomääritys voi olla rajoituksetta heterogeenisessä 25 tai homogeenisessä kokoonpanossa ja tyypiltään standardi tai ·* kompetitiivinen.

Heterogeenisessä kokoonpanossa polypeptidi on tyypillisesti sidottu kiinteään kantajaan näytteen erottamisen helpottami-30 seksi polypeptidistä inkuboinnin jälkeen. Esimerkkejä käytettävissä olevista kiinteistä kantajista ovat nitroselluloosa » (esim., membraanin tai mikrotitrauskaivon muodossa), poly-vinyylikloridi (esim., levyinä tai mikrotitrauskaivoina, po-lystyreenilateksi (esim., helminä tai mikrotitrauslevyinä), 35 polyvinylidiinifluoridi (nimnellä ImmulonR) , diatsotoitu paperi, nailonmembraanit, aktivoidut helmet ja proteiini A -helmet. Esimerkiksi Dynatech ImmulonR 1 tai ImmulonR 2 -mikrot it raus levyjä tai 6,35 mm:set polystyreenihelmiä (Precision 31 111645

Plastic Ball) voidaan käyttää heterogeenisessä kokoonpanossa. Antigeenisen polypeptidin sisältävä kiinteä kantaja pestään tavallisesti sen erottamisen jälkeen testinäytteestä ja ennen sitoutuneiden vasta-aineiden ilmaisemista. Alalla tunnetaan 5 sekä vakiot että kompetitiiviset kokoonpanot.

Homogeenisessä kokoonpanossa testinäytettä inkuboidaan antigeenin kanssa liuoksessa. Se voi olla esimerkiksi olosuhteissa, jotka saostavat muodostuvat antigeeni-vasta-aine -komp-10 leksit. Näille määrityksille tunnetaan alalla sekä vakiot että kompetitiiviset kokoonpanot.

Standardikokoonpanossa vasta-aine-antigeeni -kompleksin muodostavien HCV-vasta-aineiden määrää seurataan suoraan. Tämä 15 voidaan toteuttaa määrittämällä, sitoutuvatko leimatut anti-ksenogeeniset (esim., anti-ihminen) vasta-aineet, jotka tunnistavat epitoopin anti-HCV -vasta-aineissa, johtuen komplek-sinmuodostuksesta. Kompetitiivisessä kokoonpanossa näytteen sisältämien HCV-vasta-aineiden määrä päätellään seuraamalla 20 tunnetun leimatun vasta-ainemäärän (tai muun kilpailevan li-gandin) kompetitiivistä vaikutusta sitoutumiseen kompleksissa.

Muodostuneet kompleksit, jotka sisältävät anti-HCV -vasta-25 aineen (tai kun kyseessä ovat kompetitiiviset määritykset, ... _ kilpailevan vasta-aineen määrä) , ilmaistaan jollakin muuta mista tunnetuista menetelmistä kokoonpanosta riippuen. Lei-maamattomat HCV-vasta-aineet kompleksissa esimerkiksi voidaan ilmaista käyttäen antiksenogeenisen Ig:n konjugaattia leiman 30 kanssa (esim., entsyymileiman kanssa).

* "·. Immunomäärityksissä, joissa HCV-polypeptidit muodostavat ana- lyytin, testinäytettä, tyypillisesti biologista näytettä, inkuboidaan anti-HCV -vasta-aineiden kanssa olosuhteissa, jotka 35 mahdollistavat antigeeni-vasta-aine -kompleksien muo dostumisen. Useita erilaisia kokoonpanoja voidaan käyttää. Esimerkiksi kerrosmääritystä ("sandwich") voidaan käyttää, jossa kiinteään kantajaan sitoutunutta vasta-ainetta inkuboi- 32 111645 daan testinäytteen kanssa; pestään; inkuboidaan toisen, leimatun, analyytin vasta-aineen kanssa ja kantaja pestään jälleen. Analyytti ilmaistaan määrittämällä onko toinen vasta-aine sitoutunut kantajaan. Kompetitiivisessä kokoonpanossa, 5 joka voi olla joko heterogeeninen tai homogeeninen, testi-näytettä inkuboidaan tavallisesti vasta-aineen kanssa ja leimattua kilpailevaa antigeeniä inkuboidaan myös joko perättäi-sesti tai samanaikaisesti. Alalla tunnetaan hyvin nämä ja muut kokoonpanot.

10

Tehokkaat järjestelmät HCV-infektion ilmaisemiseksi voivat käsittää epitooppipaneelien käyttämisen kuten edellä on kuvailtu. Epitoopit paneelissa voidaan konstruoida yhdeksi tai useammaksi polypeptidiksi. Vaihtelevien epitooppien määrityk-15 set voivat olla perättäisiä tai samanaikaisia.

Entsyymikytkeistä immunosorbenttimääritystä (ELISA) voidaan käyttää joko antigeeni tai vasta-aine-pitoisuuksien määrittämiseen. Tämä menetelmä perustuu entsyymin konjugaatioon jo-20 ko antigeeniin tai vasta-aineeseen ja siinä käytetään sidottua entsyymiaktiivisuutta kvantitatiivisena leimana. Vasta-aineen määrittämiseksi tunnettu antigeeni kiinnitetään kiinteään faasiin (esim., mikrolevy tai muovikuppi), inkuboidaan testiseerumilaimennusten kanssa, pestään, inkuboidaan 25 entsyymillä leimatun anti-immunoglobuliinin kanssa ja pestään .. uudelleen. Alalla tunnetaan leimaamiseen sopivia entsyymejä ja niitä ovat esimerkiksi piparjuuriperoksidaasi. Kiinteään faasiin sitoutunut entsyymiaktiivisuus mitataan lisäämällä spesifistä substraattia ja määrittämällä tuotteen muodostumi-30 nen tai substraatin kulutus kolorimetrisesti. Sitoutunut entsyymiaktiivisuus on suoraan verrannollinen sitoutuneen vasta- *· aineen määrään.

Antigeenin määrittämiseksi tunnettu spesifinen vasta-aine 35 kiinnitetään kiinteään faasiin, antigeenin sisältävä testiaine lisätään, kiinteä faasi pestään inkuboinnin jälkeen ja toinen entsyymileimattu vasta-aine lisätään. Pesun jälkeen lisätään substraatti ja entsyymiaktiivisuus arvioidaan kolo- 33 111645 rimetrisesti ja suhteutetaan antigeenipitoisuuteen. Reagens-sipakkaukset immunodiagnoosia varten, jotka sisältävät sopivia leimattuja reagensseja, konstruoidaan pakkaamalla sopivat aineet, mukaan lukien keksinnön mukaiset HCV-epitooppeja si-5 sältävät polypeptidit tai HCV-epitooppeja vastaan suunnatut vasta-aineet, sopiviin astioihin yhdessä muiden reagenssien ja aineiden kanssa, joita tarvitaan määrityksen suorittamiseen, samoin kuin sopiva määrä määritysohjeitä.

10 III. Yleiset menetelmät

Yleiset menetelmät tämän keksinnön mukaiseen käytäntöön voidaan löytää esimerkiksi tässä siteeratuista viitejulkaisuis-ta, erityisesti EPO- julkaisuista 318 216 ja 388 232, sekä 15 kirjallisuusluettelon viitejulkaisuista, jotka on tässä sisällytetty viitteinä.

IV. Esimerkit 20 Jäljempänä on kuvailtu tämän keksinnön mukaiset esimerkit, jotka esitetään valaiseviin tarkoituksiin eivätkä ne rajoita tämän keksinnön piiriä. Tämän selityksen valossa lukuista suoritusmuodot patenttivaatimuksien puitteissa selviävät alaa tavallisetsi tunteville henkilöille.

25 .. IV.A. HCV-genomin epitooppikartoitus

Seuraava esimerkki on tulosta epitooppikartoituskokeesta, joka on suoritettu HCVl-polyproteiinisekvenssillä, joka on esi-30 tetty kuviossa 1. Kuten kuvioissa 3-11 on esitetty, HCV-isolaattien joukossa esiintyy heterogeenisuuksia, mikä osoit- • · · *. taa, että nämä aminohapposubstituutiot voidaan tehdä oktamee- reissä kuvattuna jäljempänä. Substituutioiden lisäksi aminohapoilla vastaavasta paikasta muissa HCV-isolaateissa, subs-35 tituutiot tiettyjen aminohappojen synteettisillä analogeilla tai konservatiiviset, varaukseen perustuvat yms. substituutiot (erityisesti, kun substituutio ei tuhoa vasta-aineen sitoutumista) kuuluvat keksinnön piiriin.

34 111645 IV.A.1. Peittävien peptidien synteesi

Polyetyleenikärjet, järjestettyinä kasettiin 8x12 järjestyk-5 sessä (Coselco Mimetopes, Victoria, Australia) preparoidaan sijoittamalla kärjet hauteeseen (20 % tilavuus/tilavuus pi-peridiini dimetyyliformamidissa (DMF)) 30 min. ajaksi huo neenlämpötilassa. Kärjet poistettiin, pestiin DMF:ssä 5 minuutin ajan, pestiin sen jälkeen metanolissa neljä kertaa (2 10 min/pesu). Kärkien annettiin ilmakuivua vähintään 10 minuutin ajan ja pestiin sen jälkeen viimeisen kerran DMF:ssä (5 min.). 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBt, 367 mg) liuotettiin DMF:ään (80 μΐ) käytettäväksi Fmoc-suojattujen aminohappojen kytkentään: 15 Fmoc-L-Ala-OPfp, Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp, Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OPfp, Fmoc-L-Glu(O-tBu)-OPfp, Fmoc-L-Phe-OPfp, Fmoc-Gly-OPfp, Fmoc-L-His(Boc)-OPfp, Fmoc-L-Ile-OPfp, Fmoc-L-Lys(Boc)-OPfp, Fmoc-L-Leu-OPfp, Fmoc-L-Met-OPfp, Fmoc-L-Asn-OPfp, Fmoc-L-Pro-OPfp, Fmoc-L-Gln-OPfp, FMoc-L-Arg(Mtr)-OPfp, Fmoc-L-20 Ser(t-Bu)-ODhbt, Fmoc-L-Thr(t-Bu)-ODhbt, Fmoc-L-Val-OPfp ja Fmoc-L-Tyr-OPfp.

Suojatut aminohapot sijoitettiin mikrotitrauslevyn kaivoihin HOBt:n kanssa ja kärkikasetti asetettiin levyn päälle, upot-25 taen kärjet kaivoihin. Kokoonpano suljettiin sitten muovipus-·· siin ja sen annettin reagoida 25°C:ssa 18 tunnin ajan ensim mäisten aminohappojen liittämiseksi kärkiin. Kasetti poistettiin sitten ja kärjet pestiin DMF:llä (2 min.), MeOH:lla (4 x 2 min.) ja jälleen DMF:llä (2 min.) sitoutuneiden aminohap-30 pojen puhdistamiseksi ja suojauksen poistamiseksi. Menettely toistettiin kunkin lisäksi kytketyn aminohapon osalta kunnes kaikki oktameerit oli valmistettu.

Vapaat N-päät asetyloitiin sen jälkeen vapaalla amidilla kom-35 pensoimiseksi, koska useimmat epitoopeista eivät sijaitse N-päässä eikä se siten sisältäisi siihen liittyvää positiivista varausta. Asetylointi suoritettiin täyttämällä mikrotitrauslevyn kaivot liuoksella DMF/asetanhydridi/trietyyliamiini 35 111645 (5:2:1 tilavuus/tilavuus/tilavuus) ja antamalla kärkien reagoida kaivoissa 90 minuuttia 20°C:ssa. Kärjet pestiin sen jälkeen DMF:llä (2 min.) ja MeOH:lla (4x, 2 min.) ja ilma- kuivattiin vähintään 10 minuuttia.

5

Sivuketjujen suojaryhmät poistettiin käsittelemällä kärkiä trifluorietikkahappo/fenoli/ditioetaanilla (95:2,5:2,5, tilavuus/tilavuus/tilavuus) polypropyleenipusseissa 4 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kärjet pestiin sitten dikloorime-10 taanissa (2x2 min.), 5 %:isessa di-isopropyylietyyliamii-ni/dikloorimetaanissa (2x5 min.), dikloorimetaanissa ja ilmakuivat tiin vähintään 10 minuutin ajan. Kärjet pestiin sitten vedessä (2 min.), MeOH.-ssa (18 tuntia), kuivattiin alipaineessa ja säilytettiin tiiviisti suljetuissa muovipus-15 seissa silikageelin päällä.

IV.A.2 Peptidimääritykset

Edellä kuvaillulla tavalla valmistetut oktameerin omaavat 20 kärjet käsiteltiin ensin sonikoimalla 30 minuuttia hajotus-puskurissa (1 % natriumdodekyylisulfaattia, 0,1 % 2-merkap-toetanolia, 0,1 M NaH2P04:ää) 60°C:ssa. Kärjet kastettiin sen jälkeen useita kertoja veteen (60°C) , jota seurasi keittäminen MeOH:ssa (2 min.), ja annettiin ilmakuivua. Kärkiä esi-25 päällystettiin sitten 1 tunnin ajan 25°C:ssa mikrotitraus-kaivoissa sekoituksessa, jotka sisältävät 200 μΐ sulkupusku-ria (1 % munanvalkuaista, 1 % BSA:ta, 0,1 % Tweeniä ja 0,05 % NaN3: a PBS:ssä). Kärjet upotettiin sitten mikrotitraus-kaivoihin, jotka sisältävät 175 μΐ antiseerumeita, jotka on 30 saatu ihmispotilaista, joista oli diagnosoitu HCV, ja annettiin inkuboitua 4°C:ssa yli yön. Kärjet määritettiin vas-taseerumeita vastaan kolmesta yksittäisestä henkilöstä. Näyte #PAA 3663-s ("A) reagoi voimakkaasti HCV:n western-blottei-hin, HCV:n kompetitiiviseen ELISA:aan, HCV-ELISA:aan klooniin 35 C100-3 (1:1000 laimennuksessa) ja RIBA-vasteisiin >4+ C100:aan, 5-l-l:een ja C33c:hen (C22 ei tehty). (Antigee-ni/klooninimet ovat EPO-julkaisun 318 216 ja 388 232 mukaiset kuten ne, joita on kuvailtu kirjallisuudessa koskien HCV- 36 111645 immuno.määrityksiä, jotka on saatavissa Ortho Diagnostics Systems Inc.'lta). Raakaa plasmaa laimennettiin 1:500 esto-puskuriin. Näyte #PAA 33028 ("B") reagoi voimakkaasti HCV:n western-blotteihin, HCV:n kompetitiiviseen ELISA:aan, HCV-5 ELISA:aan klooniin C100-3 /1:500 laimennuksessa) ja RIBA- vasteisiin >4+ C100:aan, C33C:hen ja C22:een. Polyklonaaliset vastaserumit puhdistettiin osittain ajamalla proteiini A -kolonnin läpi ja käytettiin laimennuksessa 1:200 estopusku-rissa. Näyte #PAA s32931 ("C") reagoi kohtalaisesti HCV:n 10 western-blotteihin (3+), HCV:n kompetitiiviseen ELISA:aan, HCV-ELISA:aan klooniin C100-3 (1:64 laimennuksessa) ja RIBA- vasteisiin 3+ ja 4+, C100:aan ja vastaavasti 5-l-l:een (C33c ja C22 ei tehty). Polyklonaaliset vastaseerumit puhdistettiin osittain ajamalla proteiini A -kolonnin läpi ja käytettiin 25 laimennuksessa 1:500 estopuskurissa.

Kärjet pestiin PBS/TweenR 20:ssä (4 x 10 min.) huoneen lämpötilassa, inkuboitiin sen jälkeen mikrotitrauskaivoissa, jotka sisälsivät piparjuuriperoksidaasilla leimattuja vuohen anti-20 ihminen Ig -vastaseerumeita (175 μΐ, 1:2000 laimennus esto-puskurissa ilman NaN3:a) 1 tunnin ajan 25°C:ssa sekoittaen. Anti-ihminen vastaseerumi on spesifinen ihmisen Ig:n kevyt-ja raskasketjuille ja reagoi sekä IgG- että IgM-ryhmien kanssa. Kärjet pestiin jälleen PBS/TweenR 20:ssä (4 x 10 min.) 25 huoneen lämpötilassa. Substraattiliuos valmistettiin liuotta-·: . maila NaH2P04: ää (1 M, 200 ml) ja sitruunahappoa (1 M, 160 ml) 2 1:aan tislattua vettä säätäen pH arvoon 4,0. Atsino-di- 3-etyylibentstiatsodiinisulfonaattia (ABTS, 50 mg) ja vetyperoksidia (0,3 μΐ/ml) lisättiin 100 ml:aan puskuria vä-30 littömästi ennen käyttöä substraattiliuoksen täydentämiseksi. Substraattiliuosta (150 μΐ) lisättiin kuhunkin mikrotitraus-levyn kaivoon ja kärjet kastettiin kaivoihin ja inkuboitiin 25°C:ssa pimeässä. Värin kehittymisen jälkeen reaktiot pysäytettiin poistamalla kärjet ja liuosten absorbanssit luet-35 tiin 405 nrrussä.

Jäljempänä luetellut oktameerit olivat immunoreaktiivisia anti -HCV-antiseerumien kanssa. Peptidit, jotka reagoivat kaik- 37 111645 kien kolmen antiseerumin kanssa, luetellaan epitooppeina, kun taas peptidit, jotka reagoivat vain yhden tai kahden antiseerumin kanssa, luetellaan heikkoina epitooppeina (osoitettu :11a). Erityisen voimakkaat epitoopit on merkitty kirjai-5 millä mieluummin kuin numeroilla (esim., EpAA). 1 ( v 38 111645 AA# Sekvenssi AA# Sekvenssi

23 KEPGGGQA 87 GNEGCGWA

24 EPGGGQAV Ep2

25 PGGGQAVG 88 NEGCGWAG

5 26 GGGQAVGG 89 EGCGWAGW

27 GGQAVGGV 90 GCGWAGWL

28 GQAVGGVY 91 CGWAGWLL

29 QAVGGVYL - 92 GWAGWLLS

30 AVGGVYLL 93 WAGWLLSP

31 VGGVYLLP 94 AGWLLSPR

32 GGVYLLPR 95 GWLLSPRG

10 33 GVYLLPRR .96 WLLSPRGS

34 VYLLPRRG 97 LLSPRGSR

35 YLLPRRGP 98 LSPRGSRP

36 LLPRRGPR 99 SPRGSRPS

66 FKARRPEG Epl 100 PRGSRPSW ^>3

67 KARRPEGR 101 RGSRPSWG

15 68 ARRPEGRT 102 GSRPSWGP

69 RRPEGRTW 103 SRPSWGPT

70 RPEGRTWA

71 PEGRTWAQ 186 TVPASAYQ Ep4

72 EGRTWAQP 187 VPASAYQV

73 GRTWAQPG Efc>A 188 PASAYQVR

74 RTWAQPGY 189 ASAYQVRN

20 75 TWAQPGYP 190 SAYQVRNS

76 WAQPGYFW 191 AYQVKNST

77 AQPGYPWP

78 QPGYPWPL 206 DCPNSSIV ~

79 PGYFWPLG

80 GYPWPLYG 223 TPGCVPCV -

81 YPWPLYGN

25 82 PWPLYGNE 232 EGNASRCW Ep5

83 WPLYGNEG

*· 84 PLYGNEGC 256 TQLRRHID, —

85 LYGNEGCG

86 YGNEGCGW 286 LVGQLFTF ~ 297 RHWTTQGC Έρ6

30 298 HWTTQGCN

299 WTTQGCNC

321 MMMNWSH - 347 DMIAGAHW Ep7 35 357 LAGIAYFS Ep8 39 111645

413 IINTNGSW EpB 594 YSRCGSGP FA

414 INTNGSWH 595 SRCGSGFW

596 RCGSGPWL

5 432 SLNTGWLA - 597 CGSGPWLT

598 GSGPWLTT

465 FDQGWGPI EpC 599 SGFWLTPR

466 DQGWGHS (600 GPWLTPRC

467 QGWGHSY 601 PWLTPRCL

468 GWGHSYA 602' WLTPRCLV

469 WGP1SYAN 603 LTPRCLVD EpF

10 470 GPISYANG 604 TPRCLVDY

471 P1SYANGS 605 PRCLVDYP

606 RCLVDYPY

480 PDQRFYCW^jD 607 CLVDYPYR

481 DQRPYCWH 608 LVDYPYRL

482 QRPYCWHY 609 VDYPYRLW

483 RPYCWHYP 610 DYPYRLWH

15 484 PYCWHYPP 611 YPYRLWHY FB

612 PYRLWHYP

500 KSVCGPVY^)9 613 YRLWHYPC

501 SVCGFVYC

502 VGGPVYCE 641 EAACNWTR

Epl2 521 RSGAPTYS Q)10 20 662 LSPTJJJT Epl3 540 NNIRPPLG ΈρΈ 663 SPTJJJn

541 NTRPPLGN 664 PULLHIQ

542 TRPPLGNW 665 LLLUIQW

543 RPPLGNWF

544 PPLGNWFG 685 LSTGLEHL -

545 PLGNWFGC

25 546 LGNWFGCT 705 VGSSIASW -

547 GNWFGCTW 706 GSSIASWA

548 NWFGCTWM

549 WFGCTWMN 729 ARVCSCIW Epl4

579 LHCPTDCF ~ 782 WVPGAVYT

ΈρΟ

30 783 VPGAVYTF

784 PGAVYTFY

785 GAVYTFYG

786 AVYTFYGM

787 VYTFYGMW

788 YTFYGMWP

789 TFYGMWPL

35 801 LALPQRAY - 40 111645 851 RVEAQLHV EpH 1384" VIKGGRHL Ep20

852 VEAQLHVW

853 EAQLHVWI 1410 LG1NAVAY ^21

5 854 AQLHVWIP 1411 GINAVAYY

855 QLHVWIPP

1454 CNTCVIQT - 893 LAVFGPLW - 1492 GRGKPG1Y Ep22

916 QGLLRFCA ~ 1493 RGKPGIYR

1Q 928 MIGGHYVQ Epl5 1532 PAETTVRL^>23

1533 ABITVRLR

946 TGTYVYNH ^>1 1534 EITVRLRA

1535 TTVRLRAY

952 NHLTPLRDEpJ

953 HLTPURDW 1560 GVFIGUH ^24

954 LTPLRDWA 1561 VFIGLIHI

15 1026 LAPTTAYA - 1581 ENLPYLVA

Ep25

1072 TONGVCW^pK 1567 NLPYLVAY

1568 LPYLVAYQ

1109 LVGWPAPQE*>16 1569 PYLVAYQA

1570 YLVAYQAT

20 1171 CPAGHAVG Epl7 1571 LVAYQATV

1113 PAGHAVGI 1572 VAYQATVC

1114 AGHAVGIF 1573 AYQATVCA

1115 GHAVGIFR 1574 YQATVCAR

1116 HAVCTERA 1575 QATVCARQ

1117 AVGIFRAA 1576 ATVCARQA

1577 TVCARQAP

1218 WPQSEQV EpL

1601 PPSWDQMW

1240 VPAAYAAQ - Έ&6

1602 PSWDQMWK

1260 ATLGFGAY ~ 1603 SWDQMWKC

1604 WDQMWKCL

1280 GVRTITGS Epl8 ' 1605 DQMWKCU .

1281 VRITTGSP / 1606 QMWKCUR

1282 RTITGSH 1607 MWKCIIRL

1283 nTGSPIT

1284 TTGSPTTY 1615 KPTLHGPI Ep27

1285 TGSPTTYG 1616 FIIUGFIP

1617 TLHGPIPL

1322 DATSILGI ~ 1618 LHGPIPLL

1619 HGHPLLY

1338 TAGARLW - 1620 GPUPLLYR

1371 GEEPFYGK Epl9 1655 WTSTWVL - 41 111645

1694 IIPDREVL^>M 1966’ SECTEPCS EpS

1695 IPDREVLY 1967 ECUPCSG

1968 CTIPCSGS

5 1710 ECSQHLPY Q>N 1969 UPCSGSW

1711 CSQHLFYI

1712 SQHLPYIE 1999 LMPQLPGI^T

2000 MPQLPGEP

1728 EKQKALGLQjO 2001 PQ1PGIPE

1729 KQKALGLL 2002 QLPGIPEV

2003 LPGIPEVS

10 1758 EIEWAKLM EpP 2004 PdPEVSC

1759 IEWAKLMW 2005 G1PEVSCQ

1760 EtyAKLMWN 2006 IPEVSCQR

1761 WAKLMWNE 2007 PEVSCQRG

1762 AKLMWNH 2008 EVSCQRGY

2009 VSCQRGYK

1781 LPGNPAIA - 2010 SCQRGYKG

15 2011 GQRGYKGV

1808 LFNILGGW Ep28 2012 QRGYKGVW

2013 RGYKGVWR

1821 AAPGAATA ~ 2014 GYKGVWRG

1851 HAGYGAG Ep29 2024 IMHTRCHC

Ep31 20 1880 VNLLPAIL -

2048 VGPRICRN ^)U

1908 PGEGAVQW BpG 2049 GPRICRNY

1909 GEGAVQWM 2050 PRICRNYW

1910 EGAVQWMN 2051 RICRNYWS

1911 GAVQWMNR 2052 ICRNYWSG

1912 AVQWMNRL 2053 CRNYWSGT

1913 VQWMNRLI 2054 RNYWSGTE

2055 NYWSGTEP

.. 1925 RGNHVSPI EpR 2056 YWSGTEPI

2057 WSGTEPIN

1940 AAARVTAI ^>30 1941 AARVTAIL 2071 TPIPAPNY Ep32

1942 ARVTAILS

30 1943 RVTAILSS 2088 EEYVIRQV EpV

1944 VTAUSSL 2089 EYVIRQVG

1945 TAILSSLV 2090 YVIRQVGD

1946 AILSSLVT 2091 VIRQVGDF

1947 ILSSLVTQ 2092 IRQVGDFH

1948 LSSLVTQL 2093 RQVGDFHY

1949 SSLVTQLL

1950 SLVTQLLR 2108 DNLKCPCQ -

1951 LVTQLLRR

42 111645

2122 EEELDGVR EpW 2280 REAQALPV EpZ

2123 IELDGVRL 2281 EAQALPVW

2124 ELDGVRLH 2282 AQAUPVWA

5 2125 LDGVRLHE 2283 QALFVWAR

2126 DGVRLHRF 2284 ALPVWARP

2127 GVRIHRFA 2285 LPVWARPD

2128 VRLHRFAP 2286 PVWAKPDY

2129 RLHRFAPP 2287 VWARPDYN

2130 LBRFAPPC 2288 WARPDYNP

2131 HRFAPPCK 2289 ARPDYNPP

2132 RFAPPCKP 2290 RPDYNPPL

2133 FAPPCKPL

2134 APPCKPLL 2325 PPPRKKRT Ep35

2135 ‘ PPCKPLLR 2326 PPRKKRTV

2136 PGKPLLRE 2327 PRKKRTW

2137 CKPLLRHE

2138 KPLLREEV 2345 AELASRSEQ>36

2139 PLLREEVS 2346 ELASRSEG

2140 LLREEVSF Q)X 2347 LASRSEGS

2141 LREEVSFR 2348 ASRSEGSS

2142 REEVSFRV 2349 SRSEGSSS

2143 EEVSERVG

2144 EVSFRVGL 2382 AESYSSMP 1^)37

2145 VSFRVGLH

2146 SFRVGLHE 2401 SDGSWSTV

2147 FRVGLHEY ^>38

2148 RVGLHEYP

2417 WCCSMSY

2165 EPEPDVAV — ΈρΑΑ

2418 VCCSMSYW

2187 GRRLARGS ~ 2419 CCSMSYWI

2420 CSMSYWIG

25 2226 UEANLLW EpY 2421 SMSYWIGA

2227 IEANLLWR 2422 MSYWIGAL

2228 EANLLWRQ

2229 ANLLWRQE

2230 NLLWRQEM

2231 LLWRQEMG .

2232 LWRQEMGG

30 2244 VESENKW Έρ33

2245 ESENKWI

2246 SENKWIL

2247 ENKWILD

2248 NKWILDS

2249 KWILDSF

35 2250 WILDSED

2267 EISVPAH Ep34 43 111645

2439 QKLHNAL EpBB 2602 IPLAVMGS

2440 KLPINALS EpDD

2441 LMNALSN 2603 PLAVMGSS

2442 PENALSNS 2604 LAVMGSSY

2443 INALSNSL 2605 AVMGSSYG

2444 NALSNSLL 2606 VMGSSYGE

2445 ALSNSLLR 2607 MGSSYGEQ

2446 LSNSLLRH 2608 GSSYGEQR

2447 SNSLLRHH 2609 SSYGEQRV

2448 NSULRHHN 2610 SYGEQRVE

2449 SLLRHHNL 2611 YGEQRVEE

10 2450 LLRHHNLV 2612 GEQRVEEL

2451 LRHHNLVY

2452 ‘ RHHNLVYS 2632 KTPMGFSY

2453 HHNLVYST Ep41

2454 HNLVYSII 2633 TPMGFSYD

2455 NLVYSTTS 2634 PMGFSYDT

2456 LVYSHSR 2635 MGFSYDTR

15 2636 GFSYDTRC

2469 QKKVTFDR Ep39 2637 FSYDTRCE

2470 KKVTFDRL 2638 SYDTRCED

2471 KVTFDRLQ

2472 VTFDRLQV 2660 YQCCDLDP -

2473 TFDRLQVL

2474 FDELQVLD 2676 LTERLYVG

20 2475 DRLQVLDS EpEE

2476 RLQVLDSH 2677 TERLYVGG

2678 EKLYVGGP

2495 ASKVKANL — 2679 RLYVGGPL

2533 RKAVTH3N EjpCC 2688 NSRGENCG

2534 KAVTHINS ^>EF

25 2689 SRGENCGY

2573 GRKPÄRU Ep40 2690 RGENCGYR

2574 RKPARUV 2691 GENCGYRR

2575 KPARUVF 2692 ENCGYRRC

2576 PARUVFP 2693 NCGYRRCR

25T7 ARLIVFPD , 2578 RLTVFPDL 2707 TSCGNTLIΈΜ2 30 2721 AACRAAGL -

2757 AFTEAMTR

Ep43

2758 FTEAMTRY

2759 TEAMTRYS

35 2760 EAMTRYSA

2761 AMTRYSAP

2762 MTRYSAPP

44 111645 2779 DLELUSC Ερ44 2878 DLPPIIQR Ep47

2780 LELIISCS 2879 UPHIQRL

2880 PPHQRLH

5 2794 HDGAGKRV 2881 PIIQRLHG

Ep45 2882 IIQRLHGL

2795 DGAGKRVY 2883 IQRLHGLS

2796 GAGKRVYY 2884 QRLHGLSA

‘ 2797 AGKRVYYL 2885 RLHGLSAF

2798 GKRVYYLT 2886 LHGLSAFS

2799 KRVYYLTR 2887 HGLSAFSL

10 2800 RVYYLTRD 2888 GLSAFSLH

2801 VYYLTRDP 2889 LSAFSLHS

2802 YYLTKDPT 2890 SAFSLHSY

2891 AFSLHSYS

2817 WETARHTP 2892 FSLHSYSP

EpGG 2893 SLHSYSPG

2818 ETARHIPV 2894 LHSYSPGE

is 2819 TARHTPVN 2895 HSY;SPGEI

2820 ARHTPVNS

2821 RH1PVNSW

2822 HTPVNSWL

2823 TPVNSWLG

2824 PVNSWLGN

2825 VNSWLGNI

20 2826 NSWLGNH

2827 SWLGNHM

2828 WLGNHME

2829 LGN1IMEA

2830 GNIIMEAP

2831 NUMEAPT

2832 IIMEAPTL

25 2833 IMEAPTLW

2834 MEAPTLWA

2835 EAPTLWAR

2836 APTLWARM

2837 PTLWARMI

2838 TLWARMIL , 2839 LWARMELM.

30 2840 WARMUMT

2841 ARMUMTH

2842 RMILMTHF

: 2843 MILMTHFE

2863 LDCETYGA Ep46

2864 DCEIYGAC

35 2865 CETYGACY

2866 EIYGACYS

2867 IYGACYSI

45 111645 2912 LGVFPURA Ep48

2913 GVPPLRAW

5 2914 VPPLRAWR

2938 AAICGKYLEp49

2939 AICGKYLE

2940 ICGKYLEN

2966 DLSGWETA

10 ^>HH

2984 VSHARPRW ΕρΠ 15 IV.B. Erottava määritys 20 Seuraava määritys suoritettiin aikaisten antigeenien erottamiseksi myöhäisistä antigeeneistä. Vasta-aineet aikaisille antigeeneille voidaan ilmaista ja käyttää HCV-infektion diagnoosiin nopeammin.

25 Verinäytesarja saatiin potilaasta, jolla oli kohonnut ALT, mutta joka oli negatiivinen anti-C100-3 -vasta-aineen suh- * > teen. Viisi verinäytettä, jotka saatiin ennen täydellistä se-rokonversiota (C100-3 -positiiviset) koottiin yhteen ja käytettiin määrityksessä laimennuksessa 1:2000. Määritys suori-30 tettiin kuten jaksossa IV.A. edellä on kuvailtu. Kuitenkin toista kaksoiskärkisarjaa inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-leimattujen vuohen anti-ihminen IgG-spesifisten antiseerumien kanssa, kun taas toista ryhmää inkuboitiin pipar-juuriperoksidaasi-leimattujen vuohen anti-ihminen IgM-spesi-35 fisten antiseerumien kanssa. IgM-vasta-aineiden kanssa immu-noreaktiiviset epitoopit ovat aikaisia epitooppeja.

Tulokset osoittivat, että useimmat aikaiset epitoopit tava- 46 111645 taan alueella, joka ulottuu aminohaposta noin 480 aminohappoon noin 650. Erityisen voimakkaita IgM-epitooppeja olivat oktameerit, jotka alkoivat aminohapoilla 506, 510, 523, 553, 562, 580 ja alue 590-620. Määritykset, joissa käytetään an- 5 tigeenejä, jotka sisältävät epitooppeja tältä alueelta, mahdollistavat HCV-infektion diagnoosin varhaisessa vaiheessa verrattuna määrityksiin, joissa käytetään muita antigeenejä.

Keksinnön mukaisesti on lisäksi testattu plasmanäytesarjoja, 10 jotka on otettu viideltä potilaalta, joilla on avatun sydämen jälkitransfuusio -NANB-hepatiitti, ja tutkimuksia on jatkettu 3-12 vuotta. Alkuverinäytepäivät olivat alle yhden viikon sisällä toisaistaan. Kustakin näytteestä testattiin IgG ja IgM EIA:n avulla yhtä ydinantigeeniä (C22), kahta vaippa-15 antigeeniä (El ja E2) ja kolmea ei-rakenteellisen alueen antigeeniä (C33c, C100 ja NS5) vastaan. Todettiin, että IgM- vaste C22:een ja C33c:hen edelsi IgG-vastetta noille antigeeneille. NS5 aiheutti myös IgM-vasteen mutta tämä vaste ei edeltänyt IgG-vastetta tuole antigeenille. Voidaan siten val-20 mistaa määrityksiä, joiden avulla kyetään määrittämään infektion hyvin varhaiset vaiheet käyttäen hyväksi epitooppeja, jotka on saatu C22- ja C33c-alueilta ja määrittämällä IgM-sitoutuminen. C33c-alueen vasta-aineet pysyivät pisimmän ajan viitaten siihen, että C33c:hen suunnatut diagnostiset määri-25 tykset olisivat luotettavimpia.

• · < IV.C. Sekvenssivaihtelut HCV-isolaateissa eri yksilöistä HCV-isolaatit, jotka sisältävät sekvenssejä, jotka poikkeavat 30 CDC/HCV1:stä, identifioitiin ihmisyksilöissä, joista jotkut olivat serologisesti positiivisia anti-ClöO-3 -vasta-aineille • · (EC10 oli vasta-ainenegatiivinen) . Näiden uusien isolaattien identifiointi suoritettiin kloonaamalla ja sekvensoimalla HCV-genomin osaset, jotka oli monistettu PCR-tekniikalla 35 käyttäen CDC/HCV1-sekvenssejä. Menetelmässä käytetään aluk-keita ja koettimia, jotka perustuvat tässä kuvailtuihin HCV cDNA -sekvensseihin. Menetelmän ensimmäinen vaihe käsittää cDNA-synteesin joko HCV-genomiin tai sen replikoituvaan väli- 47 111645 tuotteeseen käyttäen käänteistranskriptaasia. HCV cDNA:n synteesin jälkeen ja ennen monistamista näytteen sisältämä RNA hajotetaan alalla tunnetuilla menetelmillä. Määrätty osa HCV cDNA:sta monistetaan sitten käyttäen sopivia alukkeita. Mo-5 nistetut sekvenssit kloonataan ja monistettuja sekvenssejä sisältävät kloonit ilmaistaan koettimen avulla, joka on komplementaarinen alukkeiden välissä sijaitsevan sekvenssin suhteen, mutta joka ei peitä alukkeita.

10 IV.C.l. HCV-isolaatit, jotka on eristetty ihmisistä USAtssa

Verinäytteet, joita käytettiin HCV-virionilähteenä, saatiin the American Red Cross'lta, Charlotte, North Carolina, ja the Community Blood Center of Kansas'lta, Kansas City, Missouri. 15 Näytteistä seulottiin vasta-aineet HCV cl00-3 -antigeenille käyttäen ELISA-määritystä ja niillä suoritettiin täydentävä western-blot -analyysi käyttäen polyklonaalista vuohen anti-ihminen HRP:tä anti-HCV -vasta-aineiden määrittämiseksi. Kaksi näytteistä the American Red Cross'Itä ja vastaavasti the 20 Community Blood Center of Kansas1lta määritettiin HCV-positiivisiksi näillä määrityksillä.

Näiden näytteiden seerumissa läsnäolevat viruspartikkelit eristettiin ultrasentrifugoimalla Bradleyn et ai. (1985) ku-25 vailemissa olosuhteissa. RNA uutettiin partikkeleista pilkko-.. maila proteinaasi K:11a ja SDS:llä loppupitoisuuksien ollessa 10 pg/ml proteinaasi K:ta ja 0,1 % SDS:ää, pilkkominen kesti 1 tunnin 37°C:ssa. Virus-RNA jatkopuhdistettiin uuttamalla kloroformi-fenolilla.

30 RNA-valmisteen HCV RNA käänteiskopioitiin cDNA:ksi. Sen jäl-’· keen kun kumpikin cDNA-juosteista oli syntetisoitu, tuloksena saatu cDNA monistettiin PCR-menetelmän avulla. HCV cDNA:t kolmessa kloonissa, jotka saatiin kustakin HCV-isolaatista, 35 sekvenssianalysoitiin. Analyysi oli pääasiallisesti Chen ja Seeburgin (1985) kuvaileman menetelmän mukainen.

HCV:stä näytteissä 23 ja 27 saatujen kloonien konsensusse- 48 111645 kvenssit esitetään kuviossa 3 ja vastaavasti 4. Variaabelit sekvenssit esitetään myös näissä kuvioissa kuten myös konsensus sekvenssi en koodittamat aminohapot.

5 Kuviot 5 ja 6 esittävät vertailuja rinnakkain asetetuista positiivisen juosteen nukeotidisekvensseistä (kuvio 5) ja oletetuista aminohapposekvensseistä (kuvio 6) näytteistä 23, 27 ja HCV1. HCVl:n aminohapposekvenssi kuviossa 6 edustaa amino-happonumeroita 129-467 HCV-polyproteiinissa, joita koodittaa 10 suuri ORF HCV:n genomisessa RNA:ssa. Kuvien 5 ja 6 tarkastelu osoittaa, että kolmen eristetyn kloonin sekvensseissä esiintyy vaihteluja. Sekvenssivaihtelut nukleotiditasolla ja ami-nohappotasolla esitetään tiivistettynä taulukossa välittömästi jäljempänä. Taulukossa Sillä ja NSlillä merkityt polypep-15 tidit edustavat aminohapponumeroita 130 - -380 ja vastaavasti 380 - -470, koska nuo domeenit olivat ennalta tunnettuja. Numerointi alkaa oletetusta initiaattorimetioninista. Terminologia S ja NS1 perustuvat sekvenssien sijoitteluun, jotka koodittavat polypeptidejä, käyttäen flavivirusmallia. Kuten 20 edellä kuitenkin on esitetty, viineaikaiset todisteet viit-taavat siihen, että HCV:n ja flavivirusten välillä ei ole ko-konaiskorrelaatiota mitä tulee virusten polypepti-didomeeneihin, erityisesti oletettuihin E/NSl-domeeneihin. HCV:n polypeptidit ja niiden kooditusdomeenit voivat todella-25 kin poiketa olennaisesti flavivirusmallista.

Taulukko:

Sekvenssihomologia

Nukleotidi koodit. Aminohappo koodit.

30 kokon. S NS1 kokon. S NS1 %%%%%% HCV1/HCV23 93 95 91 92 95 87 35 HCV1/HCV27 89 93 84 89 95 82 HCV23/HCV27 89 93 85 90 93 84

Vaikka vasta eristetyissä HCV-sekvensseissä esiintyy vaih- 49 111645 teluita, kloonatut sekvenssit näytteistä 23 ja 27 (nimeltä HCV23 ja HCV27) sisältävät kukin 1019 nukleotidiä, mikä osoittaa deleetio- ja additiomutanttien puuttumisen tällä alueella valittuissa klooneissa. Sekvenssit kuvioissa 5 ja 6 5 osoittavat myös, että eristetyt sekvenssit eivät ole uudel-leenjärjestäytyneet tällä alueella.

Konsensussekvenssien vertailu HCVl:n osalta ja muiden HCV-isolaattien osalta esitetään tiivistettynä taulukossa edellä. 10 Sekvenssivaihtelut simpanssi HCV-isolaatin ja ihmisestä eristetyn HCV:n välillä ovat suunnilleen samat, jotka havaitaan ihmisalkuperäisissä HCV-sekvensseissä.

On kiinnostavaa, että sekvenssivaihtelut kahdessa oletetussa 15 domeenissa eivät ole yhtenäisiä. Sekvenssi oletetussa S-alueessa näyttää olevan verrattain vakio ja umpimähkäisesti hajautuneena alueelle. Päinvastaisesti, oletettu NSl-alue vaihtelee suuremmassa määrin kuin kokonaissekvenssi ja vaihtelevuus näyttää olevan hypervariaabelissa, 28 aminohappoa 20 sisältävässä taskussa, joka sijaitsee noin 70 aminohapon päässä oletetun polyproteiinin oletetun N-pään alapuolella.

Vaikka voidaan väittää, että havaitut vaihtelut tuotettiin monistusprosessin aikana, on epätodennäköistä, että kaikki 25 vaihtelut ovat seurausta tästä. On arvioitu, että Taq-polyme-v . raasi saa aikaan virheitä sekvenssiin tasolla suunnilleen yk si emäs/10 kiloemästä DNA-templaatissa jaksoa kohti (Saiki et ai. (1988)). Tähän arviointiin perustuen, enintään 7 virhettä voi olla tuotettu 1019 ep DNA-fragmentin PCR-monistuksen ai-30 kana. HCV-23:n ja HCV-27:n kolme alakloonia tuottivat kuitenkin 29 ja vastaavasti 14 muunnelmaa. Seuraavassa esitetään, että nämä variaatiot ovat luonnollisina esiintyviä. Noin 60 % emäsmuutoksista on hiljaisia mutaatioita, joissa aminohappo ei muutu. Taq-polymeraasin PCR-monistuksen aikana tuottamien 35 vaihteluiden odottaisi tapahtuvan sattumanvaraisesti; tulokset osoittavat kuitenkin, että muunnelmasekvenssit ovat ryhmittyneet vähintään yhdellä spesifisellä alueella.

111645 50 IV.C.2. HCV-isolaatit ihmisistä Italiassa ja USA:ssa HCV RNA:n osia eri isolaateista monistettiin HCV/cPCR-mene-telmällä. Nämä osat kattoivat alueen -0,6 ke - -1,6 ke olete-5 tun HCV-polyproteiinin metioniinia koodittavan aloituskodonin alapuolella. Eristykset ovat biologisista näytteistä, jotka on saatu HCV-infektoituneista yksilöistä. Erityisemmin, eristys HCT#18 on ihmisen plasmasta henkilöstä USA:ssa, EC1 ja EC10 ovat italialaisen potilaan maksabiopsiasta ja Th on ame-10 rikkalaisen potilaan perifeeriveren mononukleosyyttifrak-tiosta. Vastaavat HCV RNA -osat on eristety simpanssista.

RNA uutettiin ihmisen plasmanäytteistä käyttäen fenoli:-CHCI3: isoamyylialkoholiuuttoa. Joko 0,1 ml tai 0,01 ml plas-25 maa laimennettiin lopputilavuuteen 1,0 ml TENB/proteinaasi K/SDS -liuoksella (0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,001 M EDTA, 0,1 M NaCl, 1 mg/ml proteinaasi K ja 0,5 % SDS), joka sisälsi 10-40 pg/ml polyadenyylihappoa, ja inkuboitiin 37°C:ssa 60 minuuttia. Tämän proteinaasi K:11a pilkonnan jälkeen tuloksena 20 saadut plasmat deproteinoitiin uuttamalla TE-puskurilla (50 mM Tris.HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) kyllästetyllä fenolilla pH:ssa 6,5. Fenolifaasi erotettiin sentrifugoimalla ja uutettiin uudelleen TENB:llä, joka sisälsi 0,1 % SDS:ää. Kustakin uutosta tuloksena saadut vesifaasit koottiin yhteen ja uutet-25 tiin kahdesti vastaavalla tilavuudella fenoli-.kloroformi: iso-amyylialkoholia [1:1(99:1)], ja sen jälkeen kahdesti vastaavalla tilavuudella 99:1 seosta kloroformi/isoamyylialkoholia. Faasien tultua erotetuiksi sentrifugoimalla vesifaasin loppu-pitoisuudeksi säädettiin 0,2 M Na-aetaattia ja nukleiinihapot 30 saostettiin lisäämällä kaksi tilavuuta etanolia. Saostetut nukleiinihapot ottetiin talteen ultraentrifugoimalla SW 41 -roottorissa 38K, 60 minuutin ajan 4°C:ssa tai mikrofugissa 10 minuutin ajan 10K:ssa, 4°C-.ssa.

35 Maksabiopsiasta uutettu RNA saatiin Dr. F. Boninolta, Ospeda-le Maggiore di S. Giovanni Battista, torino, Italia. Mononuk-leosyyttifraktio saatiin laskeutamalla yksilön verinäyte-erä Ficoll-PaquenR läpi (Pharmacia Corp.) käyttäen valmistajan ohjeita. Kokonais-RNA uutettiin fraktiosta käyttäen Choon et.

ai. (1989) kuvailemaa guanidiinitiosyanaattimenetelmää.

51 111645 HCV cDNA:n synteesi näytteistä suoritettiin käyttäen kään-5 teistranskriptaasia. Etanolisaostuksen jälkeen saostetu RNA tai nukleiinihappofraktio kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen DEPC:llä käsiteltyyn tislattuun veteen. Nukleiinihappojen sekundäärirakenteet hajotettiin kuumentamalla 65°C:ssa 10 minuutin ajan ja näytteet jäähdytettiin välittömästi jäi-io den päällä. 'cDNA syntetisoitiin käyttäen 1-3 pg kokonais-RNA:ta maksasta tai nukleiinihapoista (tai RNAista) uutettuna 10-100 piistä plasmaa. Synteesissä käytettiin hyväksi kään-teistranskriptaasia ja se suoritettiin 25 piin reaktiossa käyttäen valmistajan BRL määräämää toimintaohjetta. Kaikki 15 reaktioseokset cDNA-synteesiä varten sisälsivät 23 yksikköä RNaasin inhibiittoria, RNasiiniaR (Fisher/Promega). cDNA-synteesin jälkeen reaktioseokset laimennettiin vedellä, keitettiin 10 minuutin ajan ja jäähdytettiin nopeasti jäiden päällä.

20

Kullekin näyteryhmälle suoritettiin kaksi PCR-monistusjaksoa. Alukkeet reaktioihin valittiin alueiden "EnvL" ja "EnvR" monistamiseksi. "EnvL"-alue käsittää nukleotidit 669-1243 ja oletetut aminohapot 117-308; "EnvR"-alue käsittää nukleotidit 25 1215-1629 ja koodittaa oletettuja aminohappoja 300-408 (ole- «: tetut aminohapot numeroidaan lähtien oletetusta metioniini- aloituskodonista).

PCR-reaktiot suoritettiin olennaisesti valmistajan (Cetus-30 Perkin-Elmer) ohjeiden mukaisesti, lukuunottamatta 1 pg:n RNaasi A -lisäystä. Reaktiot suoritettiin lopputilavuudessa 100 pl. PCRin suoritus käsitti 30 jaksoa, käyttäen ohjelmaa 94°C (1 min.), 37°C (2 min.) ja 72°C (3 min.), käyttäen 7 minuutin pidennystä 72°C:ssa viimeisen jakson osalta. Näytteet 35 uutettiin sen jälkeen fenoli:CHC13:11a, saostettiin etanolilla kaksi kertaa, suspendoitiin uudelleen 10 mM Tris-HCl:iin pH 8,0 ja väkevöitiin käyttäen Centricon-30 (Amicon) suodatusta. Tämä menettely poistaa tehokkaasti oligonukle- otidit, joiden pituus on vähemmän kuin 30 nukleotidiä; näin ollen alukkeet PCR-monistuksen ensimmäiseltä kierrokselta poistetaan.

52 111645 5 Centricon-30:llä väkevöidyt näytteet vietiin sen jälkeen toiselle PCR-monistuskierrokselle. PCR-monistus käsitti 35 jaksoa, joissa käytettiin ohjelmaa 94°C (1 min.), 60°C (1 min.) ja 72°C (2 min.), käyttäen 7 minuutin pidennystä 72°C:ssa viimeisessä jaksossa. Näytteet uutettiin sen jälkeen fe-10 noli:kloroformilla, saostettiin kaksi kertaa ja pilkottiin EcoRI:llä. PCR-reaktiotuotteet analysoitiin erottamalla tuotteet elektroforeesin avulla 6 %:isillä polyakryyliamidigee-leillä. DNA, jonka koko vastasi suunnilleen arvioitua odotettua PCR-tuotetta, elektroeluoitiin geeleistä ja subkloonat-15 tiin joko pGEM-4 -plasmidivektoriin tai Agtllriin. Odotetut tuotekoot EnvLrlle ja EnvR:lle ensimmäisen monistuskieron jälkeen olivat 615 ep ja vastaavasti 683 ep; toisen monistus-kierroksen jälkeen odotetut tuotekoot EnvL:lle ja EnvR:lle olivat 414 ep ja vastaavasti 575 ep. Monistettuja tuotteita 20 sisältäviä plasmideja käytettiin isäntäsolujen transformoin-tiin; pGEM-4 -plasmidia käytettiin transformoitaessa DH5-alfa, ja Ägtll:a käytettiin transformoitaessa C600 delta-HFL. Transformoitujen solujen kloonit, jotka joko hybridisoituivat sopiviin HCV-koettimiin, tai joissa oli sopivankokoiset in-25 sertit, valikoitiin. Insertit kloonattiin sen jälkeen M13:iin ... ja sekvensoitiin. Koettimet kaikille HCV/cPCR-tuotteille kä sittivät 1 2 3 4 5 6P-leimattuja osia HCV cDNA:sta, joka oli valmistettu PCR-monistuksella.

Sekvenssi-informaatio muunnelmille EnvL-alueella saatiin 3 2 kloonista HCT#18.-sta, 2 kloonista TH.-sta, 3 kloonista ECl.-stä 3 '.. ja HCVl-klooneista. Vertailu kunkin näistä klooneista saadun 4 isolaatin yhdistelmänukleotidisekvensseistä esitetään kuvios 5 sa 7. Kuviossa kukin sekvenssi esitetään 51-31-suunnassa 6

EnvL-alueen templaattijuosteelle (sense) ja sekvenssit on asetettu rinnakkain. Pystyviivat ja isot kirjaimet osoittavat sekvenssihomologian, viivan ja isojen kirjainten puuttuminen osoittavat homologian puuttumisen. Riveissä esitetyt sekvens- 53 111645 sit ovat seuraavat: rivi 1, Thorn; rivi 2, EC1; rivi 3, HCT#18; rivi 4, HCV1.

Sekvenssi-informaatio muunnelmille EnvR-alueella saatiin kah-5 desta EC10:n kloonista ja HCV1-klooneista. Kaksi EC10-kloonia erosivat vain yhden nukleotidin osalta. EC10:n nukleotidisek-venssien (klooni 2) ja HCVl:n yhdistelmäsekvenssien vertailu esitetään kuviossa 8; kukin sekvensi on esitetty 5'-3'-suunnassa EnvR-alueen templaattijuosteelle (sense) ja sekvenssit 10 on asetettu rinnakkain. Kaksoispisteet sekvenssien välissä osoittavat sekvenssihomologian.

Vertailu aminohapposekvensseistä, jotka ovat kooditettuina EnvL-alueella (aminohapot #117-308) ja EnvR-alueella . (amino-15 hapot #300-438) kullakin isolaatilla esitetään kuviossa 9 ja vastaavasti kuviossa 10. Kuvioissa on esillä sekvenssit iso-laateille JH23 ja JH27, joita edellä on kuvailtu. Esitettynä ovat myös sekvenssit japanilaisesta eristyksestä; nämä sekvenssit toimitti Dr. T. Miyamura, Japani. Kuvioissa alueen 20 aminohapposekvenssi esitetään kokonaisuudessaan HCVl:lle ja ei-homologiset aminohapot eri isolaateilla on osoitettu.

Kuten kuviosta 9 nähdään, EnvL-alueella vallitsee kaikkiaan noin 93 %:n homologia HCVl:n ja muiden isolaattien välillä. 25 HCT18, Th ja EC1 ovat noin 97 %:isesti homologisia HCVl:n .. suhteen; JH23 ja JH27 ovat noin 96 %:isesti ja vastaavasti noin 95 %:isesti homologiset HCVlrn suhteen. Kuvio 10 osoittaa, että homologiat EnvR-alueella ovat merkittävästi pienemmät kuin EnvL-alueella; sen lisäksi yksi alaalue näyttää ole-30 van hypervariaabeli (so., aminohaposta 383-405). Nämä tulokset esitetään tiivistettynä taulukossa välittömästi jäljempä-nä.

54 111645

Taulukko: EnvR-alueen homologia

Eristys Homologiaprosentti HCVlm suhteen AA330-AA438 AA383-AA405 5 JH23 (U.S.) 83 57 JH27 (U.S.) 80 39 japanil. 73 48 EC10 (Italia) 84 48 10 VI. Teollinen käytettävyys Tässä identifioituja epitooppeja voidaan käyttää polypep-tidituotteiden valmistukseen kuten edellä on kuvailtu käyttösovellutuksiin, joita ovat HCV-infektion seulonta verestä, 15 HCV:n klininen diagnoosi, vasta-ainetuotanto ja lääkkeiden valmistaminen. Muita käyttösovellutuksia on kuvailtu edellä ja vielä muut sovellutukset tulevat helposti selviksi alaa tunteville henkilöille. 1 · 111645 55

Kirjallisuusluettelo

Barr et aL, Biotechniaues (1986) 4:428.

Bradley et ai. Gastroenterology (1985) 88:773.

5 Botstein, Gene (1979) £:17.

M.A. Brinton, (1986) julkaisussa "The Viruses: The Togaviridae and Flaviviridae" eidlfjF^nkel-Comal ja Wagner, voi. edit. Schlesinger ja Schlesinger, Plenum Presses. 327-374.

Breach (1981) julkaisussa: "Molecular Biology of the Yeast-Saccharanyces", 10 .

Voi. 1, s. 445, Cold Sprang Harbor Press.

Broach et al., Meth Enzvmol (1983) 101:307.

Catty (1988), 'Antibodies, Volume 1: A Practical Approach1 (ERL Press).

Chanev et al.. Cell Mol Genet Γ1986) 12:237. i5 Chakrabarti et aL, Mol Cell Biol (1985) 5:3403.

Chang et al., Mature (1977) 198:1056.

Chen ja Seebmg, DNA (1985) 4:165.

Chiigwin et aL. Biochemistry (1979Y 18:5294.

Chomczynski ja SacchL Anal Biochem (1987¾ 162:156.

20 Cboo et al., Science (1989) 244:359.

ClewelletaL. ProcNatl AcadSci USA (1969) 62:1159.

CleweH, J Bacteriol (1972) 11&667.

Cohen. Proc Natl Acad Set USA Π972> 69:2110.

Cousens et al.T Gene (1987) 61:265.

~5 De Boer era/., Proc Natl Acad Sci PSA (1983) 222:128.

Dreesman etoi. J Infect Pis (19851151:761.

S.M. Feinstone ja J.H. Hoofnagle, New Engl J Med (1984) 311:185.

Feigner et aL, Proc Natl Acad Sci USA (1987) £4:7413.

30 Fields & Knipe (1986), "Fundamental Virology1 (Raven Press, N.Y.).

Hers et eL, Nature (1978) 273:113.

R.J. Gerety etaL julkaisussa "Viral Hepatitis and Liver Disease” (B.N. Vyas, J.L. Dienstag, ja J.H. Hoofnagle, eds)

Glennie et al., Nature (1982) 295:712.

35 Gluzman. Cell /19811 23:175.

Goeddel et al., Nuc.Acids Res (1980) £:4057.

i 5fi 111645

Graham ja Van der 2sb, Virology (1978) 52:546. 1

Gnmstein jaHogsess, Proc Natl Acad Sci.USA (1975) 72:3961.

Grych etaL, Nature (1985) 316:74. ·

Gablet ja. Hoffman Gene (1983) 25.-263.

Hahn, (1988) 162:167.

Hammeriing et aL, (1981), “Monoclonal Antibodies and T-CeII Hybridomas".

Han, gjjfighgaisig (1987) 26:1617.

1 o Haliman, Proc Natl Acad Sd USA (1983) £Q:31.

Hess etaL, J Adv Enzvroe Ree (1968) 2:149.

Hinnen et aL, Proc Natl Acad Sei USA (1978) 25:1929.

Hitzeman et aL, J Biol Chem (1980) 255:2073.

Holland et aL, Biochemistry (1978) 12:4900.

15 Holland. J Bioi Chem (1981) 256:1385.

Holland j*. Holland. 1 Biol Chem (1980) 255:2596.

Hocpes et aL, N«c Acids Res (1981) 2:5493.

Houghton et aL, Nuc Acids Res (1981) £:247 T.V. Hunyh et aL, (1985) in "DNA Closing Techniques; A Practical Approach" 20 (D. Glover, Ed., XRL Press, Oxford, U.K.) ss. 49-78.

Immun Rgv (1982) 62:185.

Bo et aL, Agri9.Biol. Ctem (1984) 4&341.

Iwarson. British Medical 1 (1987) 295:946.

2s Kennett et aL (1980) “Monoclonal Antibodies”.

Kniskern etaL, Gene (1986) 46:135.

Kyte ja Doolittle, J Mol Bio (1982) 152:105-132.

Laemmli, Nature (1970) 227:630.

Lee etaL, Science (1988)229:12881 30 lacker ja Summers. Virol f1989117:31.

Msckett et ai., J Virol (1984) 42:857.

T. Maniatis et al. (1982) "Molecular Cloning; A Laboratory Manual’ (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Sambrook et aL (1989), “Molecular Cloning; A Laboratory Manual", Second 35

Edition (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Manning ja Mocarski, Virol (1988)162:477.

111645 57

Mayer 3a Walter, eds. (1987), "Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology* (Academic Press, London).

Maxam er al., Meth Snzvrnol (1980) (£:499.

MacNamaia er aL, Science (1984) 226:1325.

Messing ef , Ncc Acids Res (1981) 2:309.

Messing, Meth Enzvmol (1983) Jfil :20-37.

Michelle et al., Int. Symposium on Viral Hepatitis, 10 Monalh (1986) julkaisussa "The Viruses': The Togaviradae and Flaviviridae" ^^m^Conrat ja Wagner, vol. edit. Schlesinger ja Schlesinger, Plenum Press),ss. 375-440.

Moss (1987) julkaisussa "Gene Transfer Vectors For Martmalian Cells" (Miller ^.,C0oi? Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), p. 10.

15 Nagahuma et al., Anal Biochem (1984) 141:74.

Neuratb et al, Science (1984) 224:392.

Nisonoff et al, Clin Immunol ImmunOpathol (1981) 21:397-406.

L.R. Overby, Carr Heoatol (1985) 5:49.

2Q LR. Overby, Cwx.Hg?afrl (1986) 5:65.

L.R. Overby, CviT fl?P3tt>l(1987) 7:35.

Pachl et al, J Virol (1987) 61:315.

Peleg, Nature (1969) 221:193.

Pfeffericom and Shapiro (1974), julkaisussa "Conprehensive Virology”, Vol. 2 25 (Fraenkel-Conrat & Wagner., edit. Plenum, N.Y.) ss. 171-230.

A.M. Prince, Ann Rev Microbiol (1983) 22:217.

• t

Rice etal. Science (19851229:726.

Rice ef al (1986)^julkaisussa "The. Viruses: Ttfe Tfcgpviridae and Elavdviddae" (Secies eds. Fraenkel-Conrat. ja Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum 30 Press), p.279-328.

Rodbrig (1986) jultednussa "The Viruses: The Tbc^viridae and Flaviviridae'' (Series edit.

* Fraenkel-Conrat ja Wagner, vol.®3it. Schlesinger Schlesinger, Pierun

Press) 35 Sadler er al, Gene (1980) 2:279.

Saiki et al,., Nature (1986) 324:163.

Saiki et al, Science (1988) 239:487.

111645 58

Sanger et aL, Proc Natl Acad Sci USA (1977) 74:5463.

Setlow, ed. (1988), "Genetic Engineering” Vol. 10, ss. 195-219 (Plenum 5 Publishing Co., N.Y.

Schlesmger et aL, J Virol (1986) £2:1153.

M. Schreierer aL, (1980) "Hybridoma Techniques”

Scopes (1984), "Protein Purification, Principles and Practice", 2. painos (Springer-Veriag, N.Y.).

10 Shimatakeef aL, Nature (1981) 292:128.

Sineh er g/.. Nuc Acids Res (1983) 11:4049.

Sippd. Eur XBiochem (19731 37:31.

Smith et aL. MolJCeU Biol (1983) 3:2156-2165.

Steimer etaL. J Virol (1986158:9.

15 Stollar (1980), in "The Togavinises* (R.W. Schlesinger, edit.), ss. 584-622.

Stuve eraJL. J Virol (1987) 61:326.

Sumivoshi et aL. Virol fl987V 161:497.

Taylor et aL, BiocMm Biophvs Acta (1976) 442:324.

20 Towbin er aL. Proc Natl Acad Sci USA (1979176:4350.

Tsu ja Herzenberg (1980), in "Selected Methods ln Cellular Immunology" (W.H. Freeman and. Co.) ss. 373-391.

Vytdehaag et aL. J Immunol (1985) 134:1225.

P. Valenzuela et aL, Nature (1982) 298:344.

25 P. Valenzuela et aL, (1984), in "Hepatitis B" (I. Millman etaL, ed, Plenum

Press) ss. 225-236.’ '

Warner, DNA (1984) 2:401.

Ward etaL. Nature (1989) 341:544.

Wu ia Grossman. Meth Enzvmol Π9871- 154 "Recombinant DNA", osa E.

on __

Wu, Meth Enzvmol (1987), 155. "Recombinant DNA", osa F.

ZoUer, Nuc Acids Res (1982) 10:6487.

US-pa baitti nro 4,341,761 LB-patentti nro. 4,466,917 tE-patantti mq 4,399,121 IB-pataitti nro 4,472,500 t^iata±ti nro 4,427,783 tB-^atentti nro 4,491,632 IS-patmlU mao 4,444,887 ps-patentti. ^ 4,493,890 US-pataiLti nro 4,816,467

Claims (2)

59 -111645

1. Immuunimäärityksen reagenssi, tunnettu siitä, että se 5 käsittää polypeptidiä, jossa a) polypeptidin immunoreaktiivinen osuus on HCV-polypeptidin segmentti, joka käsittää aminohapot 413-420 (AA413 - AA420), aminohapot 540-547 (AA540 -AA547) tai aminohapot 2244-2251 (AA2244 - AA2251) ku- 10 vion 1 mukaisesti ja jossa mainitun segmentin pituus on enintään noin 25 aminohappoa, tai b) polypeptidi on oktameeri, jolla on asemissa 2280-2287 (AA2280 - AA2287), 1218-1225 (AA1218 - AA1225) tai 1940-1947 (AA1940 - AA1947) esitetty aminohappose- 15 kvenssi kuvion 1 mukaisesti, tai c) polypeptidin immunoreaktiivinen osuus on HCV-polypeptidin enintään 20 aminohapon segmentti, jonka aminoterminaalinen aminohappo on kuvion 1 aminohappo 1218 tai aminohappo 1940, tai 20 d) polypeptidin immunoreaktiivinen osuus on HCV- polypeptidin segmentti, joka käsittää aminohapot 465-472 (AA465 - AA472) kuvion 1 mukaisesti ja jossa mainitun segmentin pituus on enintään noin 20 aminohappoa . 25

2, Menetelmä hepatiitti-C viruksen (HCV) proteiinien kanssa • « immunoreaktiivisten vasta-aineiden läsnäolon toteamiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraa-vat vaiheet: 30 a) patenttivaatimuksen 1 mukainen immobilisoitu im- muunimääritysreagenssi saatetaan kosketukseen mainitun näytteen kanssa, ja b) havaitaan mainittuun reagenssiin sitoutuneet vasta-aineet käyttäen havaittavissa olevaa leimaa. 35 -111645