PT100731B - Estojo de imunoensaio para a deteccao simultanea de anticorpos de hiv-1,hiv-2,htlv-i e htlv-ii e metodo para a sua preparacao - Google Patents

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ESTOJO DE IMUNOENSAIO PARA A DETECÇÃO SIMULTÂNEA DE ANTICORPOS DE HIV-1, HIV-2, HTLV-I E HTLV-II E MÉTODO PARA A SUA PREPARAÇÃO

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-ss a estojos para imunoensaio os quais podem ser utilizados para detec-tar simultaneamente anticorpos num espécime biológico para os vírus seguintes: HIV-1 (VIH-1), VIH-2 (VIH-2), HTLV-I (HLTH-I) e HTLV-II (HLTV-II). A presente invenção refere-se também a um processo para a produção desses estojos de imunoensaio.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 vírus da leucémia,.. das células T huma nas do subtipo I (VLTH-I) é um retrovírus estreitamente associado com o linfoma/leucemia das células T no estado adulto (ALT), (Poiesz et ai., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 77 7415-7419). Está também associado às doenças neurológicas designadas por paraparese espástica tropical e à mieiopatia associada ao VLTH-I (HAM) (Gessain et al. , 1985 , Lancet ii, 407-410). O vírus da leucemia das céljj las T humanas do subtipo II (VLTH-II) foi isolado inicialmente a partir de um paciente com leucemia celular polifila s :m >sa · a ja des o- re u ! ílois : et sses i htre efici- l(CAS) j ium re- a humana

3 (VIH). 0 primeiro vírus associado à SIDA o VIH-1 (também conhecido por VLTH-III, VAL-1 e RVS) foi bem caracteri-zado. Recentemente foi isolado outro retrovírus humano pato génico designado por VIH-2 (inicialmente conhecido por VAL-2) a partir de pacientes da África Ocidental com SIDA. Veja-se por exemplo a patente de invenção WO 87/04459. Demonstrou-se recentemente que o VIH-2 (Guyader et ai., 1987 Nature , 326 , 662 - 669) partilha diversas sequncias prote gidas com o VIH-1 e com o vírus da imunodeficiência dos símios (VIS) . 0 VLTH-I e o VLTH-II diferem ambos dos vírus da imunodeficiência humana VIH-1 e VIH-2 pelas suas estruturas morfológicas e genéticas. Em consequência, os anticorpos para os antigenos para o VIH não deveriam in-terreagir com os antigenos do VLTH-I e do VLTH-II. Todavia, amostras de soro extraídas de pacientes com SIDA demons traram que há algum grau de interreacção com os antigenos VLTH (Essex et al., 1983., Science, 220, 859-862).

Existem diversos exemplos na técnica dos ensaios para diagnóstico concebidos para detectar independentemente anticorpos para-qualquer dos antigéneos de VLTH ou de VIH. Por exemplo, Saxinger e os seus colaboradores, 1984, Science, 225, 1473-1476 referem-se à utili zação de um antígeno VLTH-I como imunoabsorvente num imu noensaio enzimático (IEE) para a detecção de anticorpos para o VLTH-I.. Outro exemplo foi descrito por Gnann e os 4- ( "» seus colaboradores, 1987, J. Viroi. 6j_, 2639 -41, os quais se referem às sequências peptídicas consideradas úteis para a detecção de anticorpos para o VIH-1.

Recentemente, houve tentativas para pro porcionar estojos de diagnóstico capazes de detectar simol taneamente anticorpos para os antígenos de VLTH e de VIH.

Por exemplo, a patente de invenção canadiana 1 245 982 e o pedido de patente de invenção europeia N2 136 798 refe re-se a estojos de ensaio para detecção simultânea de anticorpos para os VLTH-I, VLTH-II e VLTH-III (VIH-1). Nesses estojos os antígenos dos VLTH foram obtidos a partir de partículas virais de VLTH obtidas a partir de diversas linhas celulares transformadas. Por outro lado o pedido de patente de invenção mundial WO 90/08162 refere-se a um estojo de imunoensaio para detectar simultaneamente os ant_i corpos para os VLTH-I, VIH-1 e VIH-2 utilizando antígenos obtidos a partir da proteína envolvente de VLTH-I e de péptidos de síntese dos VIH.

Todavia, nenhum dos ensaios descritos antes proporcionam um-método sensível para detectar siraul '1» taneamente os anticorpos para os VLTH-I, VLTH-II, VIH--1 e VIH-2. Na realidade, ainda que se considere separadamente a detecção independente dos anticorpos para os VIH-1, VIH-2, VLTH-I e VLTH-II, nenhum dos ensaios descritos antes proporciona um teste de diagnóstico completamente aceitável. - ο -

Esses ensaios de acordo com a técnica anterior são desvantajosos em diversos aspectos. Em alguns casos esses testes utilizam todo o vírus ou imunoadsor ventes produzidos por via bacteriana. A utilização dessas preparações é incómoda e inconveniente devido a uma falta de especificidade, isto é, origina resultados positivos falsos, uma vez que o sangue de muitos indivíduos não infectados contem normaimente anticorpos para os contaminan-tes vúigarmente existentes nas preparações. Os resultados positivos falsos ocorrem também como consequência de epi-topes partilhados com os vírus, os quais não estão relacionados com qualquer dos VIH ou VLTH e os quais podem estar presentes nessas preparações. Outro probeima que existe com esses ensaios de acordo com a técnica anterior é a falta de sensibilidade. A falta de sensibilidade permjÍ te que o sangue contaminado escape à detecção e consequentemente infecte potencialmente os recebedores do produto sanguíneo ao mesmo tempo que permite a manutenção da infec-ciosidade dos portadores de VIH ou VLTH não diagnosticados. Admite-se que a falta de sensibilidade nesses ensaios combinados na técnica anterior seja devida à fraca densidade superficial dos epitopes na fase sólida do ensaio quando se utiliza o vírus total ou preparações produzidas por via bacteriana. Por essas e por outras razões continua a existir uma necessidade enorme de poder realizar um ensaio que detecte simultaneamente os anticorpos para os VIH--1, VIH-2 e VLTH-II. Um teste desse tipo iria assegurar - 6 - 9 de modo mais conveniente que os produtos sanguíneos infectados não entrariam nos bancos de sangue e que os indivíduos infectados procurassem tratamento imediato e atempado .

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os estojos de ensaio de acordo com a presente invenção resolvem os problemas identificados antes devido ao facto de proporcionarem um meio sensível e específico e um método para detectar simultaneamente os anticorpos para os VIH-1, VIH-2, VLTH-I e VLTH-II em amostras de fluídos corporais.

Os estojos de ensaio da presente invenção contêm péptidos que são úteis para a detecção simultânea de anticorpos contra os VLTH-I, VLTH-II, VIH-1 e VIH-2, dispostos sobre um suporte sólido.

Além disso,a-’presente invenção propor^ ciona processos para preparar e para utilizar os estojos de ensaio para a detecção simultânea de anticorpos contra os VLTH-I, VLTH-II, VIH*1 e VIH-2.

Os estojos de ensaio da presente invenção contêm pelo menos quatro péptidos diferentes para os VIH e VLTH, sendo dois para os VIH e dois para os VLTH.

Peio menos um dos péptidos para os VIH têm capacidade para reconhecer um anticorpo para o VIH-1 e pelo menos um dos 7 outros péptidos para os VIH tem capacidade para reconhecer um anticorpo para o VIH-2. De um modo idêntico, pelo menos um dos péptidos para os VLTH tem capacidade para reconhecer um anticorpo para o VLTH-I e pelo menos um aos outros péptidos para os VLTH tem capacidade para reconhecer um anticorpo para o VLTH-II.

De modo surpreendente, descobriu-se que quando se adiciona primeiro ao suporte sólido os péptidos para os VLTH-I e II e mais preferencialmente quando se adi ciona uma mistura que os contenha e se adiciona depois os péptidos para os VIH, separadamente ou de modo preferencial numa mistura, a sensibilidade do ensaio resultante é bastante aumentada. Em consequência, constitui também um objectivo da presente invenção proporcionar um método para a preparação de um estojo de ensaio para detectar simultaneamente anticorpos para os VIH-1 , VIH-2, VLTH-I e VLTH-II, em que os péptidos para os VLTH-I e II, de preferência sob a forma de uma mistura, são adicionados primeira-mente ao suporte adicionando-se depois os péptidos para os VIH-1 e VIH-2, também preferencialmente sob a forma de uma mistura, a esse suporte.

Os estojos da presente invenção podem ser utilizados para despistar uma ampla diversidade de espécimes e fluídos biológicos. Como exemplos refere-se, o plasma, o soro, a saliva, a urina, as lágrimas, o leite ou o fluído cerebrospinal. 8- 8- ara o VIH-1 úteis nos invenção são seiecciona- fórmula gerai a-X-b, na radical seleccionado en-

Os péptidos p estojos e nos métdos da presente dos entre o grupo de péptidos de qual o símbolo X representa um tre o grupos constituído por:

Arg Ile Leu Ala. Vai Glu Arg Tvr Leu Lys Asp Gin Gin Leu

Leu Gly lie Trp Glv Cvs Ser Gly Lvs Leu Ile Cys Thr Thr Ala Vai Pro Trp Asn Ala Ser (SCH-37c)

Lys Ile Leu Ala Vai Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gin Leu I-1

Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Vai Pro Trp Asn Ala Ser (SCH-87ck)

Lys Ile Glu Pro Leu Gly Vai Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Vai Vai Gin Arg Glu Lys Arg (BCH-132)

Lys Lys Ile Leu Ala Vai Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gin

Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Vai Pro Trp Asn Ala Ser (BCK-266)

Lys Ile Leu Ala Vai Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gin Leu

Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr

Ala Vai Pro Trp Asn Ala Ser Gly Lys Leu Ile (BCH-408)

Lys Lys Ile Leu Ala Vai Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gin I-ΓΊ

Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr

Thr Ala Vai Pro Trp Asn Ala Ser Gly Lys Leu Ile (BCH-408k) 9 o símbolo a representa um terminai as grupo amino, entre um e oito aminoácidos, mas preferencia^ mente entre um e cinco aminoácidos e mais preferencialmente entre um e três aminoácidos, ou representa um substituinte eficaz para facilitar o acoplamento ou para melhorar a ac- tividade imunogécnica do péptido,· e o símbolo b representa um terminal de grupo carboxi, entre um e oito aminoácidos, mas preferen cialmente entre um e cinco aminoácidos e mais preferencialmente entre um e três aminoácidos, ou representa um substituinte eficaz para facilitar o acoplamento ou para melho rar a actividade imunogécnica ou antigénica do péptido.

Os péptidos para o VIH-2 úteis nos estojos e nos métodos da presente invenção são seleccionados entre o grupo de péptidos de fórmula geral a-Y-b, na qual o símbolo Y representa um radical seleccionado entre o grupo constituído por:

Arg Vai Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gin Asp Gin Ala Arg I -1

Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala ?he Arg Gin Vai Cys His Thr Thr Vai Pro Trp Vai Asn Asp Ser (3CH-202c)

Lys Vai Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gin Asp Gin Ala Arg I-1

Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala ?ha Arg Gin Vai Cys Kis Thr Thr Vai Pro Trp Vai Asn Asp Ser (BCH-202ck)

Lys Lys Vai Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gin Asp Gin Ala I-1

Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gin Vai Cys His

Thr Thr Vai Pro Trp Vai Asn Asp Ser (BCH-265)

Lys Vai Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gin Asp Gin Ala Arg r-1

Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gin Vai Cys Kis Thr Thr Vai Pro Trp Vai Asn Asp Ser Ala Phe Arg Gin Vai (BCK-417)

Lys Vai Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gin Asp Gin Ala Arg i---1

Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gin Vai Cys His Thr Thr Vai Pro Trp Vai Asn Asp Ser Gly Lys His Ile (BCK-422) e os seus análogos: e os símbolos a e b possuem as sig nificações definidas antes. - 11 -

Os peptidos para o VLTH-I uteis nos estojos e nos métodos da presente invenção são selecciona- dos ent: re o grui po cons titu ído por pépt: idos de fórmula , a-Z -b, na qual 0 s írabo. lo Z r epre sent; a um rad ical sei nado en tre o grupo cons tituído por: Pro His Ser Asn Leu Asp His Ile Leu Glu Pro Ser Ile Pro Trp Lys Ser Lys Pro Tyr Vai Glu Pro Thr Ala Pro Gin Vai Leu (BCH-; 234) Ala Ile Vai Ser Ser Pro Ser His Asn Ser Leu Ile Leu Pro Pro Phe Ser Leu Ser Pro Vai Pro Thr Leu Giy Ser Arg (BCH-416) e os seus análogos; e os símbolos a e b possuem as significações definidas antes.

Os peptidos para o VLTH-II úteis nos estojos e nos métodos da presente invenção são selecciona-dos entre o grupo constituído por péptidos de fórmula geral a-W-b, na qual o símbolo 'W representa um radical selec-cionado entre o grupo constituído por:

Leu Vai His Asp Ser Asp Leu Glu His Vai Leu Thr Pro Ser Thr Ser Trp Thr Thr Lys Ile Leu (BCH-219

Thr Ser Glu Pro Thr Gin Pro Pro Pro Thr Ser Pro Pro Leu Leu Vai His Asp Ser Asp Leu Glu His Vai Leu (BCH-456) 12 ( •a

Thr Ser Giu Pro Thr Gin Pro Pro Pro Thr Ser Pro Pro Leu Vai His Aso Ser Asp Leu C-lu His Vai Leu (BCH-486) e os seus análogos; e os símbolos a e b possuem as si£ nificações definidas antes.

Nos estojos e nos métodos da presente invenção utiliza-se pelo menos um péptido de cada grupo: VIH-1, VIH-2, VLTH-I e VLTH-II.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona estojos para imunoensaio caracterizados pelo facto de conterem pelo menos quatro péptidos os quais contêm respectivamente epi-topes que reconhecem e que aglutinam selectivamente os anti corpos para os VIH-1, VIH-2, VLTH-I e VLTH-II.

Conforme definido antes, os péptidos individuais desses quatro grupos possuem as fórmulas gerais: a-X-b, a-Y-b, a-Z-b e a-W-b, respectivamente. De preferência utiliza-se um componente de cada grupo nos estojos e nos métodos da presente invenção. Contudo, isso não constitui qualquer limitação. Por exemplo, também é possível utilizar mais do que um péptido de pelo menos um dos grupos ou vários péptidos de cada grupo. A única coisa que é neces sária é que se utilize peio menos um componente de cada grupo de péptidos de fórmulas gerais a-X-b, a-Y-b, a-Z-b 13 e a-W-b.

Tal como é aqui utilizado o termo "análogos" significa inserções, deleções, substituições e modificações de aminoácidos em um ou em vários sítios na cadeia peptídica descrita.

As modificações e substituições preferidas realizadas sobre a sequência de aminoácidos dos pép-tidos da presente invenção são do tipo protegido (isto é, do tipo que possui uma influência mínima na estrutura secundária e na natureza hidropática do péptido) . Essas operações englobam as substituições tais como as descritas por Dayhoff na publicação Atlas of Protein Sequence and Struc-ture 5, 1978 e também por Argos em EMBO J. 8, 779 - 785, 1989. Por exemplo, os aminoácidos pertencentes a um dos grupos adiante indicados apresentam modificações de tipo protegido: ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; cys, ser, tyr, thr; vai, ile, leu, met, ala, phe; lys, arg, his; e phe, tyr, trp, his. De um modo idêntico, a metionina que é um aminoácido propenso a oxidação pode ser substituída por norieucina.

As substituições preferenciais abrangem também as substituições dos isómeros D para os L-ami noácidos correspondentes. 0 termo "aminoácido" tal como é utilizado na presente memória descritiva (por exemplo,na definição dos símbolos a e b) abrange todos os aminoácidos 14

de origem natural, os aminoácidos nas suas configurações D e também os aminoácidos de origem sintética não naturais e os aminoácidos modificados tais como a homocisteína, a orni tina, a norleucina e a o<-valina.

Conforme anteriormente especificado de modo resumido é frequentemente útil e consentâneo com o âmbito da presente invenção modificar os péptidos da presen te invenção com o objectivo de tornar o péptido seieccionado mais útil como reagente de imunodiagnóstico ou como ingredi ente activo de uma vacina. Essas modificações englobam, por exemplo: a adição de um resíduo cisteína a um ou aos dois terminais para facilitar o acoplamento do péptido a um veículo adequado com reagentes de reticulação heterobifuncionais tais como o butirato de sulfossuccinimidil-4-(p--maleimido-fenilo) , sendo os reagentes preferenciais para efectuar esses acoplamentos os compostos ciclo-hexano-1-carboxilato de sul-fossuccinimidil-4-(N-maleimido-metilo) e o propionato dé N-succinimidil-3-(2-piridil-tio) ; a adição de 1 a 8 aminoácidos adicionais (de preferência de 1 a 5 e mais preferencialmente entre 1 e3 aminoácidos) a um ou dois terminais 15

do péptido para facilitar a união dos péptidos entre si, para acoplamento a um suporte ou a um péptido maior ou a uma proteína ou para modificar as propriedades físicas ou químicas do péptido. Como exemplos dessas modificações re fere-se a adição dos ligadores tirosina, ácido glutâmico ou ácido aspártico ao terminal N ou ao terminal C através de uma reacção de esteri. .fi cação e a adição de lisina a qual pode ser ligada através de uma base de Schiff ou por formação de amida. Conforme descrito antes es ses aminoácidos adicionais podem englobar quai£ quer dos aminoácidos de origem natural, os aminoácidos nas suas configurações D e também os aminoácidos conhecidos não naturais de origem sintética e modificados; e a transformação de um dos dois terminais do péptido, por exemplo, por acilação ou por ami-dação. Essas modificações originam alterações na carga líquida sobre o péptido e podem facilitar também a união covalente do péptido a um suporte sólido, a um veículo ou a outro péptido. Como exemplos de substituintes eficazes para facilitar o acoplamento ou para melhorar a actividade imunogénica ou antigénica do péjD tido refere-se os grupos acilo CC^—C η g) , 0 polietileno-glicol e os fosfolípidos. 16

Para a preparação dos péptidos da presente invenção é possível utilizar quaisquer metodologias convencionais para a produção de péptidos. Essas metodologias englobam os processos de síntese, a tecnologia do ADN recombinante e suas combinações. Considera-se preferencial a síntese em fase sólida. Nesta abordagem a um. processo de síntese, o tipo de suporte de resina pode ser qualquer resina adequada utilizada convencionalmente na especialidade para a preparação de péptidos em fase sólida. Preferencialmente é uma resina à base de p-benziloxialcool--polistireno ou p-metiibenzidrilamina. Após o acoplamento ao suporte de resina do primeiro aminoácido protegido proce de-se à remoção do grupo de protecção amino por métodos no£ malizados convencionalmente utilizados na especialidade.Após a remoção do grupo de protecção amino procede-se ao acoplamento sequencial dos restantes aminoácidos protegidos e, se necessário, dos aminoácidos protegidos da cadeia lateral, segundo a ordem desejada para proporcionar o péptido preten dido. Em alternativa é possível acoplar grupos de aminoácjL dos múltiplos utilizando uma metodologia em solução antes do acoplamento com a sequência de aminoácidos suportada em resina . A selecção de um reagente de acoplamento adequado é efectuada de acordo com os princípios conhecidos na técnica. Por exemplo, os reagentes de acoplamento adequados são os compostos N,N'-di-isopropil-carbo- 17 -di-imida ou N , N ' -ciclo-hexil-carbo-di-iniida (DCC) ou hexafluoro-fosíato de benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetil-amino)-fosfónio utilizados sozinhos ou de preferência na presença de 1-hidroxibenzotriazol. Outro procedimento útil de acoplamento utiliza anidridos simétricos pré-forma dos de aminoácidos protegidos. 0 grupo de protecção c< -amino necessário que se utiliza para cada aminoácido introduzido na cadeia peptídica em crescimento é preferencialmente ovgrupo 9-fiuoroenii-metiloxi-carboniio (FMOC), embora possa ser utilizado qualquer outro grupo de protecção adequado na me dida em que ele não se degrade sob as condições de acoplamento e se for facilmente removível de forma selectiva na presença de qualquer outro grupo de protecção já existente na cadeia peptídica em crescimento.

Os critérios para seleccionar os grupos de protecção para os aminoácidos da cadeia secundária são: (a) estabilidade do grupo de protecção na presença de diversos reagentes sob condições de reacção selectivas para a remoção do grupo de protecção 0(. -amino em cada passo da síntese; (b) retenção das propriedades estratégicas dos grupos de protecção (isto é, não serem cindidos sob as con dições de acoplamento) e (c) possibilidade de remoção do grupo de protecção de um modo fácil após a conclusão da sín tese do péptido e sob condições que de forma nenhuma afectem a estrutura do péptido. 18

Os péptidos suportados em resina totai-mente protegidos da presente invenção são clivados preferencialmente a partir de uma resina à base de o-benziloxi-àlco-ol com uma solução contendo entre 50? e 60 % de ácido tri-fluoroacético em cloreto de metileno durante 1 a 6 horas à temperatura ambiente na presença de purificadores adequados tais como os compostos anisol, tioanisol, sulfureto de etil--metilo, 1,2-etano-ditiol e reagentes afins. Simultaneamente efectua-se a remoção da maior parte dos grupos de protecção da cadeia lateral instáveis aos ácidos. Muitos grupos de protecção resistentes aos ácidos são removidos tipicamente por tratamento com HF.

Os péptidos da presente invenção são úteis como reagentes de diagnóstico para a detecção simultânea dos anticorpos associados aos VIH-1, VIH-2, VLTH-I ou VLTH-II de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Esses méto dos e*iglobam o protocolo ELISA e os métodos e ensaios de hemaglutinação, do ponto único e dos pontos múltiplos.

De preferência, os estojos para teste da presente invenção permitem um ensaio imunoabsorvente ligado á enzima (ELISA). De acordo com este aspecto preferencial faz--se absorver um péptido ou uma mistura de vários péptidos da presente invenção, ou efectua-se o acoplamento de modo cova-lente a um suporte sólido tal como, por exemplo, as cavidades de uma placa de microtitulação. Verificou-se surpreendentemente que no caso de se adicionar primeiro os péptidos 19 para os VLTH-I/II (ou de preferência uma sua mistura) às cavidades, isto é, antes de se adicionar os peptidos para os VIK-1/2 às cavidades, a sensibilidade do. ensaio aumenta bastante. Por consequência, esta variante preferencial da presente invenção consiste num estojo e num método para a preparação desse estojo em que se liga primeiro ao suporte uma mistura ou uma combinação dos peptidos para os VLTH-I e II, ligando-se depois ao suporte os peptidos para os VIH-1 e VIH-2 e mais preferencialmente uma sua mistura.

Os suportes sólidos adequados para os ensaios e métodos da presente invenção englobam os polímeros orgânicos e inorgânicos, por exemplo, amilases, dextranos,^ celuloses naturais ou modificadas, polietileno, polisti-reno, poliacrilamidas, agaroses, magnetite, pó de vidro poroso, fluoreto de polivinildieno ("Kynar") e latex, as paredes interiores dos recipientes de ensaio (isto é, tubos de ensaio, placas de titulação ou tinas (covetes) de vidro ou de um material artificial) e também a superfície de corpos sólidos (isto é, varetas de vidro e de qualquer mat£ rial artificial, varetas com uma parte terminal mais grossa varetas para cavidades múltiplas com lobos ou lamelas terminais). As placas de microtitulação de plástico com 'cavidades múltiplas são especiaimente adequadas e preferenciais com veículos de fase sóiida.

Os péptidos e misturas correspondentes 20 utilizados na presente invenção podem ser aplicados ao suporte sólido por qualquer método e em qualquer quantidade que seja eficaz para maximizar a sensibilidade e a especificidade do estojo resultante. Considera-se preferível fazer contactar o suporte sólido com uma solução que incorpore um ou vários péptidos da presente invenção dissolvidos numa substância tampão. Embora esse tampão possa ser de qualquer tipo convencionalmente utilizado para dissolver péptidos e para proceder à sua aplicação aos suportes sóli-' dos, é preferível utilizar uma solução de carbonato/bicar-bonato de sódio 0,05 M (pH 9,6). A concentração do péptido na substância tampão deve ser suficiente para permitir que uma quantidade eficaz de péptido adira à superfície do suporte sólido. Tal como é aqui utilizada a expressão "quantidade eficaz" ref£ re-se a uma quantidade de péptido existente sobre um suporte sólido que detecta eficientemente os anticorpos para os VIH-1, VIH-2, VLTH-I ou VLTH-II, num espécime biológico.

De preferência, a solução péptídica uti. lizada para revestir as cavidades de uma placa de microtitu-lação de acordo com a presente invenção possui uma concentra ção péptídica compreendida entre 5 /ig/ml e 10 jjg/ml, sendo mais preferencialmente igual a 10 jig/ml. Essa concentração péptídica pode ser conseguida com um péptido de uma única espécie se apenas houver esse tipo de péptido na solução ou pode corresponder eventualmente à concentração total de todos 21 os péptidos existentes na mistura. As misturas de péptidos da presente invenção são preparadas típica e preferencialmente misturando soluções que contêm entre 5 ^ig/ml e 10 ^ig/ml dos péptidos individuais da presente. Por exemplo, no caso de se pretender preparar uma mistura de dois péptidos dever-se-à misturar um volume seleccionado de solução de péptido 1 numa concentração compreendida entre 5 ^g/ml com um volume seleccionado de uma solução do péptido 2 numa concentração compreendida entre 5 ^ug/ml e 10 ^ag/ml. A mistura resultante apresentará uma concentração peptídica total compreendida entre 5 ^Jig/ml· e 10 jig/mi e preferencialmente será de 10 yug/mi.

Os volumes particulares escolhidos para a preparação das misturas peptídicas da presente invenção são determinados de forma empírica testando a sensibilidade e a especificidade do estojo de ensaio resultante na detecção de anticorpos para os VIH-1, VIH-2, VLTH-I e VLTH-II. Os volumes reais das soluções peptídicas misturadas para proporcionar a mistura pepfídica podem depois variar independen temente dentro dos limites paramétricos especificados antes de modo a conseguir-se uma sensibilidade máxima e uma especificidade máxima no estojo de ensaio resultante, subentendendo-se que essas combinações peptídicas não necessitam de conter quantidades iguais de cada componente peptídico. Na realidade é preferível utilizar combinações peptídicas que contenham mais de cada um dos péptidos BCH-408 e BCH-202ck, do que do péptido BCH 132 e mais quantidade de péptido BCH 22 22

456 do que qualquer aos péptidos BCH 234 e BCH 416.

De acordo com um aspecto preferencial da presente invenção procede-se á combinação das soluções dos péptidos para os VLTH-I e VLTH-II (na concentração de 5 ps/ /ml e de preferência na concentração de 10 ^jg/ml) para proporcionar uma combinação de péptidos para os VLTH antes de se aplicar esses péptidos ao suporte sólido. De forma idên tica é preferível combinar as soluções dos péptidos para os VIH-1 e VIH-2 (numa concentração compreendida entre 5 yjg/ /ml e 10 fig/ml e de preferência na concentração de 10 ^jg/ml) para proporcionar a combinação dos péptidos para os VIH antes de esses péptidos serem aplicados ao suporte sólido. As composições peptídicas preferenciais'.'· úteis nos estojos da · presente invenção são: (1) uma combinação pèptídica para os VIH-1/2 contendo os péptidos BCH-132, 3CH-202 ck e BCH-408 numa proporção correspondente a 1:40:60 e (2) uma combinação pèptídica para os VLTH-I/II contendo os péptidos BCH-234, BCH-416 e BCH-456 numa proporção correspondente a 1:1:4. As proporções e concentrações dos péptidos noutros estojos de ensaio de acordo com a presente invenção podem, como é evidente, variar de modo a maximizar a sensibilidade e a especificidade dos estojos resultantes.

Faz-se contactar as soluções peptídicas com as cavidades de acordo com a presente invenção utilizando técnicas convencionais. De acordo com a variante segundo a qual a cavidade é revestida separadamente com cada 23 23 /

péptido individual, utiliza-se tipicamente 60 μ 1 da primeira solução peptídica; 120 jai da segunda, 180 μι da terceira e 240 yul da quarta. Isto permite que superfícies diferentes da cavidade sejam recobertas com cada péptido. Em conformidade com a variante preferenciai segundo a qual se utiliza a combinação para os VLTH e uma combinação para os VIH utiliza-se tipicamente 120 jal da combinação para os VLTH e 240 μΐ da combinação para os VIH, ainda pelo mesmo motivo. 0 intervalo de tempo durante o qual a solução peptídica ou a combinação de péptidos permanece em contacto com o suporte sólido deve ser o suficiente para. per mitir que uma quantidade eficaz do péptido ou da mistura de péptidos adira à superfície do material de suporte. De . um modo geral e mais vantajoso é suficiente 1 hora à temperatura ambiente. Todavia, à temperatura de 4°C permite-se nor malmente que o contacto entre os péptidos e cada cavidade se prolongue durante a noite. Decorrido esse intervalo de tempo é preferível remover qualquer péptido não acoplado. Este passo pode ser executado utilizando quaisquer métodos convencionais para a remoção do líquido em excesso a partir de suportes sólidos. É preferível recorrer ao método de aspiração. Após a aspiração também é possível lavar a cavidade com uma substância tampão de lavagem tal como um tampão de fosfato de sódio (NaCl 0,15 M; NaHgPO^ 0,06 M; timerosal 0,01 % e Tween 20 0,05 %', pH 7,4). Contudo este passo de lavagem não é absolutamente necessário. Após a - 24 - aspiração e/ou lavagem é possível acrescentar péptidos adicionais ou as suas misturas ao suporte sólido repetindo o procedimento de aplicação especificado antes.

De acordo com uma outra variante da presente invenção, não se procede à remoção do excesso do primeiro péptido ou da mistura peptídica da cavidade antes ,de se fazer contactar essa cavidade com o péptido ou com a mistura seguintes. De acordo com esta variante é preferível utilizar aproximadamente volumes iguais de cada péptido ou de cada mistura. Por exemplo, no caso de se utilizar separa damente soluções de um único péptido recomenda-se a aplicação de 60 jj 1 do primeiro péptido e decorrida 1 hora adiciona-se 60 yUl do segundo péptido e assim sucessivamente. No caso de se estar a utilizar misturas de péptidos para os VLTH e para os VIH recomenda-se a utilização de 120 yul da mistura para os VLTH e decorrida 1 hora adiciona-se 120 jul da mistura para os VIH. Decorrida mais 1 hora recomenda-se a remoção da solução em excesso e geralmente lava-se a cavidade com uma substância tampão. o plasma, a saliva

Depois de os péptidos desejados estarem acoplados ao material de suporte e depois de se ter removido quaisquer materiais procede-se ao tratamento das cavidades cora o espécime biológico que se pretende testar. De preferência esse espécime é o soro embora se possam utilizar tara bém outros espécimes tais como o sangue, - 25 a urina, as lágrimas, o leite ou o fluído cerebrospinal. 0 espécime biológico também pode ser diluído com uma solução tampão do espécime antes do ensaio. Como exemplo dessa substância tampão refere-se o tampão de fosfato de sódio (fosfato de sódio 6 mM; NaCl 0,15 M; BSA a 2 %; peptona a 1,5 benzamidina a 80 mM; Tween 20 a 1 %; soro de ca bra inactivado pelo calor a 40 %; timerosal a 0,01 %, valor final do pH igual a 7,2). O volume da solução do espé cime adicionada por cavidade é preferencialmente igual a cinco sextos do volume máximo utilizado para recobrir a cavidade. Por exemplo, no caso de se utilizar 240 μΐ da solução pep-tídica para recobrir a cavidade então o volume preferido da solução do espécime que se vai adicionar deve ser de 200 yui.

Após a exposição à amostra que se pretende analisar procede-se ao esvaziamento das cavidades de preferência por aspiração e depois lava-se. Após lavagem, adiciona-se às cavidades anti-IgG humano ou anti-IgM humano marcado com peroxidase. A determinação da peroxidase é efec_ tuada tipicamente com o substrato correspondente, por exera pio 3,3',5,51-tetrametilbenzidina. Sem qualquer afastamento relativamente á utilidade deste ensaio ilustrativo, refere-se que a peroxidase pode ser substituída por outro agente identificador, por exemplo, por um agente radioactivo, por um identificador por fluorescência, por um agente de quimiolu-minescência ou por agentes de infravermelhos ou por agentes identificadores absorventes.

Os procedimentos gerais para a síntese e 26 / para a utilização aos peptidos da presente invenção encon-tram-se descritos a seguir.

Procedimento 1: Preparação de Resinas que Suportam Resí

duo Aminoácido Protegido por N-FMOC

Preparou-se uma solução do desejado resí duo do aminoácido protegido por N-FMOC numa/.mistura de' cio reto de metileno (CF^Cl^) e de dimetilformamida (DMF) (4:1) e adicionou-se a uma suspensão de resina à base de p--benziloxi-àlcool numa mistura de CHgCip : DMF (4:1) à tem peratura de 0°C. Agitou-se a mistura manualmente durante alguns segundos e depois tratou-se com N,N'-diciclo-hexil--carbo-di-imida (DCC) seguindo-se o tratamento com uma quan tidade catalítica de 4-(dimetilamino)-piridina. Agitou-se a mistura á temperatura de 0°C durante mais 30 minutos e d£ pois agitou-se á temperatura ambiente durante a noite. A resina filtrada foi submetida a lavagem sucessivamente com CH2CI2 1 com DMF e com isopropanol (3 lavagens com cada um desses compostos) e finalmente com CHgC^· Com a resina preparou-se uma suspensão em Cí^C^> arrefeceu-se em banho de gelo e adicionou-se piridina bidestilada à suspensão agitada seguindo-se a adição de cloreto de benzoílo. Mante-ve-se sob agitação à temperatura de 0°C durante 30 minutos e depois à temperatura ambiente durante 60 minutos. Após filtração lavou-se a resina sucessivamente cora CH.2CI2, com isopropanol (3 lavagens com cada um desses compostos) e 27 / ί"~7^ finalmente com éter de petróleo (2 vezes) antes de se submeter a secagem sob vácuo intenso até peso constante. A determinação espectrofotométrica de acordo com Meienhofer et al. (Int. J. Peptide Protein Res. , 13, 35, 1979) indica o grau de substituição na resina.

Procedimento 2: Acoplamento dos Aminoácidos Subsequentes

Colocou-se a resiraque suporta o primeiro aminoácido protegido por N-FMOC num vaso de reacção de um sintetizador de péptidos de tipo Biosearch 9600 e tratou-se do modo seguinte: 1) Lavagem com DMF (4 vezes durante 20 segundos de cada vez). 2) Pré-lavagem com uma solução a 30 % de piperi-dina em DMF (3 minutos). 3) Desprotecção com uma solução a 30 % de piperi-dina em DMF (7 minutos). 4) Lavagem com DMF (8 vezes durante 20 segundos de cada vez) . 5) Verificação dos grupos amino livres - teste de Kaiser (deve ser positivo).

Depois agitou-se suavemente a resina peptídica durante 1 hora ou 2 horas com 8 equivalentes do 6) - 28 / desejado aminoácido protegido por FMOC e com 1-hidroxi-benzotriazol e hexafiuoro-fosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetil-amino)-fos fónio dissolvidos em DMF bidestilada e seca contendo 16 equivalentes de 4-metil-morf olina. 7) Lavagem com DMF (6 vezes durante 20 segundos de cada vez).

Após o passo 7 extraiu-se uma aliauota para um teste com ninidrina. No caso de este teste ser negativo retoma-se o passo 1 para acoplamento do aminoácido se guinte. No caso de o teste ser positivo ou ligeiramente positivo é necessário repetir os passos 6 e 7. 0 esquema anterior pode ser utilizado para o acoplamento para cada um dos aminoácidos dos péptidos descritos na presente invenção. Também se pode recorrer à utili_ lização da protecção em N com FMOC com cada um dos restantes aminoácidos durante o processo de síntese.

Os péptidos radioidentifiçados podem ser preparados por incorporação de um aminoácido tritiado utilizando-se o protocolo de acoplamento descrito antes.

Após a adição do último aminoácido remove-se o agente N-FMOC do resíduo do terminal N repetindo os passos 1-7 do esquema anterior. Lava-se a resina peptídica com CH2CI2 e seca-se _in vacuo para proporcionar o péptido protegido impuro. 29

Procedimento 3 - Desprotecção e Clivagem dos Péptidos a partir da Resina

Com a resina peptídica protegida preparou-se uma suspensão numa solução a 55 % de ácido trifiuoro acético (TFA) em CHpCl^ contendo 2,5 í de etanoditiol e 2,5 % de anisoi. Limpou-se a mistura com azoto e agitou-se durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Filtrou-se a mi£ tura e lavou-se a resina com CH^Clp. Tratou-se a resina novamente com uma solução contendo 20 % de TFA em 0^012 durante 5 minutos à temperatura ambiente. Filtrou-se a mistura e lavou-se a resina com uma solução de 20 % de TFA em CH2CI2 e depois lavou-se com Cí^C^· Evaporou-se in vacuo os filtrados combinados a uma temperatura inferior a 35°C e triturou-se o resíduo várias vezes com éter dimetílico seco. Dissolveu-se o sólido numa solução aquosa contendo 10 % de ácido acético e liofilizou-se para proporcionar o produto impuro.

Os péptidos que continham arg e cys foram ainda desprotegidos por tratamento com HF à temperatura de 0°C durante 1 hora na presença de anisoi e sulfureto de dimetilo. Os péptidos foram extraídos com uma solução aquosa contendo 10 % de ácido acético e lavados com éter dimetílico e liofilizados para proporcionar os péptidos impuros . 30

Procedimento 4: Purificação dos PéptLdos

Os péptidos impuros foram purificados por cromatografia líquida de alta pressão (CLEP = HPLC) preparatória numa coluna Vydac (2,5 X 25 mm) de fase inversa tipo C.jg ou Cjj com um gradiente da fase móvel. Verificou--se o efluente a 220 nm e subsequentemente por CLEP (HPLC) analítica. Juntou-se as fracções relevantes, evaporou-se e liofilizou-se . Verificou-se a identidade dos péptidos de síntese por cromatografia de fase inversa analítica e por análise dos aminoácidos.

Procedimento 5: Detecção simultânea dos anticorpos para os YIH-1, VIH-2, VLTH-I e VLTH-II através de um ensaio imunoabsorvente; ligado à enzima (ELISA)

Os péptidos de síntese foram solublizados numa mistura tampão constituída por bicarbonato e carbonato de sódio 0,05 M (pH 9,6) para proporcionar soluções peptí-dicas que possuíam concentrações peptídicas compreendidas aproximadamente entre 5 ^ig/ral e 10 ^jg/ml. Depois preparou--se duas misturas peptídicas misturando volumes dessas soluções peptídicas individuais. A primeira mistura continha os péptidos de síntese para os VLTH-I e VLTH-II. A segunda mistura continha os péptidos de síntese para os VIH-1 e VIH-2. A concentração peptídica total de cada mistura ficou compreendida entre 5 ^ug/ml e 10 yug/ml.

Claims (18)

1 /

:r~C5 cccãenco ceio — U.iUS___ Jiji__UU :u=ãro ;r;:c: O. !C5 3u:r.co io zs.c; λ ser 32_ecci Arg lie leu Ais Vai Glu Arg Tyr leu Lys .Asp Gin Gir. Leu (3CH-=7c) Leu Giy lia Trp Giy Cys Ser Giy Lys Leu ãie cys Ala Vai ?m Tm Asn A'- a Ser Lys ãie Leu Ai a Vai Gin Arg Tyr Leu Lys. Asp Gin Gin Leu Leu Giy Xia Trp Giy Cys Ser Giy Lys Leu lie C/3 Tbr TLr Aia Vai Pm Trp Asn A_ia Ser (30:-37ck) uys are Gau 7 —. a-eu Gay Vai Aaa Pm Tir Lys Aàa avs Arg· Arg Vai Vai Gin Arg Giu Lys Arg (SC-r-iãã) Lvs Lvs ãis Leu Aia "ai Giu Am T/r Leu Lvs Asn Gin Gir ?u Leu Giv ãis Tm Giv C«s Ser Glv 'Lvs Leu lis Cvs Thr Tnr Aia ·/ Vai La Ser Lys ãis Leu Aia Vai Giu Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gir. Leu Leu Giy ãis ãrp Giy Cys Ser Giy Lys Leu ãis Cys Ti_r Tir Aia Vai Pm Trp Asn Aia Ser Giy Lys Leu ãie (2Cã-:-4G3) Lys Lys ãie Leu Aia Vai Glu Am Tvr Leu Lvs Am Gin Gin ( :3θ"—4wOvC) e os seus análogos ; V i. ser sei eccionaáo encre o gruoo cor.sclculgo cor Arç Vai Thr Ala lie Glu Lys Tyr Leu GLr Asp Gin Aia Arç Leu Asr. Ser Trp Gly 1 Cys .Ala ?he Arç Gir. Val i 0/3 His Or Thr Vai Prc Trp Vai Asn rtSp Ser (3O-:-202c) -ys Vai Τ’-! — Ala lie G1 u l,V3 i y"T Leu Gin .Asp r* í _ υι.. .Aia Arp Leu Asn Ser Trp Gly t Cys Ala ?he Arç Gin Vai 1 Cys :-LLs Thr Tíir Val ?ro Trp Vai Asn Asp Ser (303-202ck) Lys Ly3 Vai Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gin Asp Gin Aia Arg Leu Asn Ser Trp Gly i Cys Ala ?he Arç Gin Val Ϊ Cys Sis ts— Tlir· Vai Pm Trp Vai Asn Asp Ser (30-:-255) Lys Val Thr Ala lie Glu Lys Tyr Leu Gin Asp Gin Ala Arç 1 1 Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala ?he Arç Gin Val Cys His Thr tv·»* Val ?ro Trp Val Asn Asp Ser Ala ?he Arç Gin Val ( 30-:-417) Lys Val Tíir Ala lie Glu Lys Tyr Leu Gin Asp Gin Ala Arç i Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala ?he Arç Gin Vai Cys His Thr Thr Vai ?ro Trp Vai Asn Asp Ser Gly Lys His Ile e os seus Z ser ssleccionaco encre o grupo constituído oor: ?ro His Ser Asn La·.: Asp His lie Leu Giu Pra Ser ria Pro Tra Lys Ser Lys ?ra Tyr Vai Giu Pra Thr Aia Pra Gir. Vai Lau (3CH-234) Aia lie Vai Ser Ser Pra Ser His Asn Ser Leu lie Leu Pra ?ra ?he Ser Lau Ser Pra Vai Pra Thr Leu Giy Ser Arç (3CH-4ÍS) e os seus análogos; w ser seleccionado encre o grupo constituído por: Lau Vai His Asp Ser Asa Lau Giu His Vai Lau Thr Pra Ser Thr Ser Trp Thr Thr Lys lia Leu {3CK-2Í9) Thr Ser Giu Pro Thr Gin Pro Pro Pro Thr Ser Pra Pro Leu Leu Vai His Asp Ser Asa Leu Glu His Vai Leu (3CH-455) Thr Ser Giu Pro Thr Gin Pro Pro Pro Thr Ser Pro Pro Leu Vai Eis Asp Ser Asp Lau Giu His Vai Leu (3CH-486) e os seus análogos; o símbolo a representar um grupo amino terminal, entre um e oito amináácidos ou um substituinte eficaz para facilitar o acoplamento ou para melhorar a actividace imunogénica ou an-tigénica do péptido; e o símbolo b representar um grupo carboxi terminal, entre um e oito aminoácidos ou um substituinte eficaz para facilitar o acoplamento ou para melhorar a actividade imunogénica ou an-tiginica do péptido.

2.- Estojo de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo facto de os peptidos serem preparados por síntese em fase sólida.

e· o peptico do KIV-2 acoplado ao suporte sólido ser: Lys Vai Ttr Aia lie Glu lys Tyr Lau Gin Asp Glr. Aia Arç I i Leu Asr. Ser Trp Giy Cys Ala Phe Arg Gin Vai Cys Eis Thr Thr Vai Pro Trp Vai Asn Asp Ser- (3CE-202ck).

4.- Estojo de acordo com a reivindicação 1, caracteri. zado pelo facto de os péptidos do HTLV-1 acoplados ao suporte sólido serem: Pro Eis Ser Asr. Leu Asp Eis Ile Leu Glu Pro Ser ile Pro Trp Lys Ser Lys Pro Tyr Vai Glu Pro Thr Aia Pro Gin Vai Leu (BCE-234); e Aia lis Vai Ser Ser Pro Ser Eis Asr. Ser Lau lie Leu Pro Pro Phe Ser Lau Ser Pro Vai Pro Thr Lau Giy Ser Arg (30--413) e o piptido do HT1V-II acoplado ao suporte sólido ser: ( í —; 5 5). Ττ~ Ser Glu ?rv Thr GLr. ?m Pro ?rr Tr-teu vai His Asp Ser Asp teu Glv Kis Vai o de

5.- Estojo áe acorda coe a reivindicação 1, caracz do pelo facto de o suporte sólido ser una placa de plásti microtituiaçao de cavidades múltiplas.

6.- Método para a preparaçao de um estojo de imuneensaio de acordo com a reivindicação 1, caraccerizaco pelo facto: (a) de se efectuar primeiro o acoplamento dos péptidos dos HTLV-I e HTLV-II ao suporte sólido; (b) se efectuar depois, o acoplamento dos péptidos dos HIV-1 e HIV-2 ao suoorte sólido.

7.- Método de acordo com a reivindicação 6, caraçteriza do pelo facto de os referidos péptidos do HTLV-1, os referidos péptidos do HTLV-II, os referidos péptidos do EIV-1 e os referidos péptidos do HIV-2 serem primeiramente diluídos-conuma solução tampao de carbonato-hidrogenocarbonato de sódio 0,05 M para proporcionar respectivamente uma solução peptldica de HTLV-I, uma solução peptldica de HTLV-II, uma solução peptldi. ca de HIV-I e uma solução peptldica de HIV-2 antes do acoplamento ao suporte sólido.

8.- Método Ge acordo com a reivindicação 7, caracte-rizado pelo facto de a solução peptldica do HTLV-I, a solução peptldica do HTLV-II, a solução peptldica do HIV-1 e a solução

/ q _ Método de acordo com a reivindicação 7, c 2 7- 2 r zado pelo facto de se misturar as soluçoes peptídicas do τ"* t; _ 7 £ do HTLV-II para proporcionar uma mistura dos pep dos HTLV antes do acoolamento ao suoorte sólido.

10.- Método de acordo com a reivindicação 9, caracte-rizado peio facto de a referida mistura de péptidos dos HTLV possuir uraa concentração em péptidos totais compreendida entre 5 yug/ml e 10 jj.g/ml.

11.- Método de acordo com a reivindicação 7, caracteri. zado pelo. facto de se misturar as soluçoes peptídicas do HIV-1 e do HIV-2 para proporcionar uma mistura dos péptidos dos HIV antes do acoolamento ao suoorte sólido.

12.- Método de acordo com a reivindicação... 11, caracte-rizado pelo facto de a referida mistura de péptidos dos HIV possuir uma cor.centraçao em péptidos tocais compreendida entre 5 yog/ml e 10^ug/ml.

13.- Método para a utilização de um estojo de imunoen saio de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos

sólido; (b) renoçao do excesso de espécime biológico dc suoor ta sólido; (c) lavagem do suporte sólido revestido; (c) tratamento do suporte sólido lavado com um marcador adequado; (e) ensaio para a determinação da presença da marca no suoorte sólido.

14. - Método de acordo com a reivindicação 13, caracte-rizado pelo facto de o referido espécime biológico ser selec-cionado entre o grupo constituído por sangue, plasma, soro, saliva, urina, lágrimas, leite e fluido cerebral.

15. - Método de acordo com a reivindicação 14, caracte-rizado pelo facto de o referido espécime biológico ser o soro.

16.- Método de acordo com a reivindicação 13, caracte-rizado pelo facto de o referido espécime biológico ser diluído primeiramente com um tampao para o espécime antes de se apli car ao suoorte sólido.

17.- Método de acordo com a reivindicação 13, caracte- 31 Primeiro adicionou-se às cavidades a mis tura peptídica para os VLTH-I/II. Depois acopiou-se ao su porte a mistura peptídica para os VIH-1/2. Nos exemplos que se seguem adicionou-se primeiro a cada cavidade 120 jil da mistura peptídica de síntese derivada dos VLTH-I/II e procedeu-se- à incubação das placas durante a noite à tempe ratura de 4 C. Depois procedeu-se ao esvaziamento das cavi dades e ao seu enchimento com 240 yul da mistura peptídica de síntese derivada dos VIH-1/2. As placas foram incubadas durante a noite à temperatura de 4°C. Utilizou-se um sistema de tipo "Oyster Bay Versafill" para enchimento das cavidades. Essas cavidades foram esvaziadas por aspira ção e lavadas duas vezes cora uma solução tampão de lavagem (NaCl 0,15 M; Na^PO^ 0,06 M; timerosal 0,01 % e Tween 20 0,05 $; pH 7,4 [0,3 ml/cavidade ]). Saturou-se as cavidades com 0,35 ml de solução tampão de lavagem durante 1 hora à temperatura de 37°C e efectuou-se a lavagem uma vez com a mesma solução tampão sem Tween 20. Procedeu-se à secagem das placas esvaziadas durante 1 hora à temperatura de 37°C e efectuou-se a sua vedação no vácuo até posterior utilização. As amostras de soro que se pretendia ana lisar foram diluídas com solução tampão contendo o espécime (fosfato de sódio 6 mM; NaCl 0,15 M; BSA a 2 %; peptona a 1,5 %; benzamidina 80 mM; Tween 20 a 1 %; soro de cabra inactivado a quente a 40 $; timerosal a 0,01'$, valor final do pH igual a 7,2 ) e adicionou-se às cavidades as I 32 I 32

amostras de soro diluídas (0,2 ml). Deixou-se incubar as cavidades carregadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. Depois procedeu-se ao esvaziamento das cavidades e la vou-se 5 vezes com solução tampão de lavagem. Diluiu-se uma solução de conjugado (anti. corpo para a IgG humana conjugado na cabra e purificado por afinidade e marcado com peroxidase, segundo uma quanti_ dade de 0,5 mg em 5 ml de glicerol a 50 %) com 1 % (p/v) de albumina de soro bovino numa solução contendo Tris 0,05 M; NaCi 0,5 M; Tween 20 a 0,05 %; timerosal 0,01 % (pH 7,2) e adicionou-se a cada cavidade (0,2 ml) e efectuou-se a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. Depois procedeu-se ao esvaziamento das cavidades e lavou-se 5 vezes com solução tampão da lavagem. Preparou-se uma solja ção de substracto [2 mg/ml para 3,3',5,5'-tetra-metil-ben zidina em N-metil-pirrolidona (NNP)] em tampão de acetato (0,1 m; pH 5,6) e diluiu-se com 5 volumes de solução de peróxido contendo 0,015 % v/v de ^2^2 a 30 £ e adicionou--se a cada cavidade (0,2 mi por cavidade). Decorridos 30 minutos tratou-se o conteúdo de cada cavidade com 0,1 ml de H2S0íj 1 N e procedeu-se à leitura da densidade óptica a 450 nm. Todas as determinações foram efectuadas em duplicado . Utilizando procedimentos praticamente idên ticos aos descritos antes preparou-se os péptidos específicos adiante revelados e procedeu-se à avaliação da sua capa cidade para detectar os anticorpos específicos dos VIH-1 , 33 VIH-2, VLTH-I e VLTH-II. Experiência 1 Nesta experiência a mistura de péptidos para os VLTH possuía uma concentração total em péptidos cor respondente a 10 ^ig/mi e era constituída pelos péptidos BCH-219, e BCH-416 numa proporção correspondente a 1:1:1, sendo cada peptido solubiiizado primeiro no tampão de carbonato descrito no procedimento 5 até se obter uma con_ centração de 10 ^ig/ml. Conforme descrito antes adicionou-se 120 μ! desta mistura de péptidos de síntese para os VLTH-I/ /II a cada cavidade e procedeu-se à incubação durante a noite à temperatura de 4°C. Depois efectuou-se o esvaziamento das cavidades e adicionou-se 240 μΐ da mistura de péptidos para os VIH-1/2. Esta mistura de péptidos para os VIH-1/2 foi preparada misturando 3 volumes da solução do péjD tido BCH-408 (10 μg/ml) com dois volumes de uma solução do péptido BCH-202 ck (10 μg/ml) de modo a proporcionar uma mistura que possuia uma concentração total em péptidos correspondentes a 10 jig/ml contendo os péptidos BCH-408 e BCH--202 ck na proporção de 3:2. A absorção dos péptidos existen tes nesta.segunda mistura e posterior processamento das pia cas foi efectuada conforme descrito no procedimento 5. Prepa rou-se também duas séries de placas utilizando 120 ^μΐ de cada mistura péptídica (isto é, uma série para os péptidos de síntese derivados dos VIH-1/2 e uma série para os péptidos de síntese derivados dos VLTH-I/II). Essas placas (VIH- - 34 -ΙΕΕ e VLTH-IEE) foram utilizadas em estudos comparativos a par e passo com placas combinadas de VLTH/VIH (combinado de VIH/VLTH-IEE) de modo a permitir comparar o seu desempenho na detecção de anticorpos para os VIH e para os VLTH era amostras de soro sanguíneo. No quadro 1 encontra--se representada esta comparação. 35 QUADRO 1 Proporção sinal/vaior de tran- sição registados uti lizar.do : Amostra Combinado de N2 Estado VIH-IE E VLTH-IEE HIV/VLTH-IEE NC Negativo 0,22 0,11 0,29 NC Negativo 0,24 0,37 0,31 NC Negativo 0,24 0,20 0,34 PC/VIH-1 VIH-1 dos 11,11 0,25 > 12 PC/VIH-2 VIH-2 pos 10,45 0,24 >12 PC/VLTH-I VLTH-I pos 6,55 8,73 PC/VLTH-II VLTH-II pos 6,82 8,98 A02-1 VLTH-II pos 5,62 4,04 A02-2 VLTH-I ·pΘs >12 >12 A02-3 VLTH-II pos 0,84 0,69 A02-4 VLTH-II/ VIH-1 pos 2,95 > 12 A02-5 VLTH-II pos 1 ,26 1 ,62 A02-6 Ind . 0,18 0,45 A02-7 A02-8 A02-9 VLTH-I pos VLTH-II pos VLTH/II pos 8,73 10,15 VIH-1 A02-10 VLTH-I pos >12 >12 37 37

QUADRO 1 (Cont.) Proporção sinal/valor de transição registados utilizando: Amostra Estado VIH-IEE VLTH-IEE Combinado de HIV/VLTH-IEE C-23 VIH - 1 seroe. 2,91 2,54 C-24 VIH-' 1 seroe. 4,17 3,58 C-25 VIH - ' 1 Seroe. 5,99 4,89 G-80 VIH-1 seroe 0,18 0,37 G-8 1 VIH-/ 1 seroe. 0,26 0,30 G-82 VIH- 1 1 seroe. 0,30 0,39 G-83 VIH-1 1 seroe. 4,96 4,03 G-84 VIH- 1 seroe . 5,79 3,84 G-85 VIH-1 seroe. 4,85 3,67 G-86 VIH- 1 seroe. 5,89 5,01 - 38 - Os resultados do Quadro 1 representam as proporções entre o sinal e o valor de transição. 0. valor de transição é o valor médio da absorvência obtido com amostras de plasma extraídas de três doadores de sangue normal a que se adicionou um valor de 0,10. Uma proporção maior ou igual a 1,0 indica uma amostra positiva. As amostras identificadas por "NC" no quadro 1 eram controlos negativos obtidos a partir de um paci_ ente que havia sido confirmado como negativo para os VIK-1/2 e como negativo para os VLTH-I/II. As amostras identificadas por "PC" eram controlos positivos obtidos a partir de pacientes para os quais se havia confirmado que eram respec-tivamente apenas positivos para o VIH-1, positivos apenas para o VIH-2, positivos apenas para o VLTH-I e positivos apenas para o VLTH-II. As amostras identificadas por "A02" (1 a 25), "C" (20 a 25) e "G" (80 a 86) foram obtidas em "Boston Biomedica Inc." (BBI). 0 seu estado foi determinado pelo BBI. 0 símbolo "Ind." indica um perfil indeterminado para a mancha de Western. 0 símbolo "VIH-1 seroe." indica que essas amostras de plasma foram recolhidas sequencialmente a partir de um doador para o qual se verificou retro£ pectivamente que tinha sido infectado com o VIH-1. Esses pacientes produziram anticorpos para o VIH-1 decorridas várias semanas após se ter efectuado um teste negativo para esses mesmos anticorpos. As amostras foram numeradas crono logicamente. 39 De um modo geral as proporções entre o sinal e os valores de transição com placas de péptidos combinados para os VIH/VLTH são comparáveis às proporções med_i das com placas revestidas separadamente apenas com péptidos para os VIH ou com os valores obtidos com placas revestidas separadamente apenas com péptidos para os VLTH. Isto é um resultado surpreendente uma vez que seria de esperar uma re_ dução significativa do sinal por diluição do epitope que re_ conhece um determinado anticorpo. No caso das amostras co--infectadas pelos VIH/VLTH, isto é, ao2-4, a proporção en tre o sinal e o valor de transição registada com a placa dos VIH/VLTH ( Z? 12 é significativamente superior ao valor medido na placa recoberta apenas com os péptidos para os VLTH (2,95). As seroconversões de VIH-1 de paciente C e G a partir de testes negativos anti-VIH-1 para testes positivos anti--VIH-1 são detectadas simultaneamente sobre a placa para os VIH e sobre a placa da combinação para os VIH/VLTH. Embora a placa da combinação para os VIH/ /VLTH se comporte tão bem como a placa recoberta com péptido para os VLTH, em diversos casos (amostras A02-3, A02-13 e A02-17) as amostras que continham os anticorpos para o VLTH--II não foram detectadas como sendo positivas nem nas placas da combinação para os VIH/VLTH nem nas placas preparadas apenas para os VLTH. Desta forma foram preparadas ou- - 40 - I - 40 - I

tras misturas e testadas numa tentativa de melhorar a sensibilidade para os anticorpos para os VLTH. Experiência 2 Esta experiência é bastante semelhante à experiência precedente. A composição das duas misturas peptí-dicas foi a seguinte: a mistura dos péptidos para os VLTH continha uma concentração total pepfcídica correspondente a 10 jjíg/ml e era constituída pelos péptidos BCH-234, BCH-416 e BCH-456 numa proporção correspondente a 1:1:4. Foi prepa rada utilizando soluções de péptidos individuais na proporção de 10 ^ug/ml. A mistura de péptidos para os VIH continha uma concentração total em péptidos correspondente a 5 jig/ mi e era constituída pelos péptidos BCH-132, BCH-202 ck e BCH-408 numa proporção correspondente a 1:40:60. Preparou-se utilizando soluções de péptidos individuais na propo£ ção de 5 ^ug/ml. 0 quadro 2 indica os resultados obtidos nas cavidades recobertas com esses péptidos. 41

QUADRO 2 Relação sinal/ /valor de trans Amostra Combinado de NO Estado VIH/VLTH-IEE crição med MC Negativo 0,32 NC Negativo 0,68 MC Negativo 0,40 PC/VIH-1 VIH - 1 pos 7 10 PC/VIH-2 VIH-2 DOS 7 10 PC/VLTH-I VLTH-I DOS 8,63 PC/VLTH-II VLTH-II pos 8,74 A02-1 VLTH-II A02-2 VLTH-I A02-3 VLTH-II A02-4 VLTH/VIH A02-5 VLTH-II A02-6 Ind , A02-7 VLTH-I A02-8 VLTH-II A02-9 VLTH/VIH A02-10 VLTH-I A02-11 VLTH-II A02-12 VLTH-II pos 7 10 pos >10 pos 1 ,08 pos 710 pos 8,76 0,51 pos 9,53 pos 4,30 pos 7 10 pos >10 pos 5,19 pos 9 ,79 42 ! j QUADRO 2 (Cont.) Amostra N2 stado Combinado de VIH/VLTH-IEE Relação sinal/ /valor de trans crição medida A02-13 Ind. A02-14 VLTH-II AO2 - 1 5 VLTH-II A02-1 6 VLTH-II A02-1 7 Ind, A02-18 VLTH-II A02-19 VLTH-II A02-20 VLTH-I A02-21 VLTH-II A02-22 VLTH-II A02-23 VLTH-II A02-24 VLTH-II A02-25 VLTH-II 1 ,41 pos 10,64 DOS 4,78 DOS 4,49 1 ,93 DOS 2,79 pos > 10 pos >10 pos 4,32 pos 7,26 pos 7,22 pos >10 pos 2,51 C-20 VIH-1 seroe. C-21 VIΗ -1 seroe . C-22 VIH-1 seroe. C-2 3 VIH-1 seroe. C-24 VIH-1 seroe. C-25 VIH-1 seroe C-26 VIH-1 seroe. 0,32 0,39 0,89 2,29 3,60 5,36 5,33 - 43 - QUADRO 2 (Cont.) Relação sinal/ Amos tra N2 Estado Combinado de VIH/VLTH-IEE /vaior de trans crição medida C-27 VIH-1 seroe. 8,41 C-28 VIH-1 seroe. 9,78 C-29 VIH-1 seroe. > 10 C-30 VIH-1 seroe. >10 C-3 1 VIH-1 seroe. > 10 C- 3 2 VIH - 1 seroe. > 10 C-33 VIH-1 seroe . >10 C-34 VIH-1 seroe. >1 0 C-35 VIH-1 seroe. >10 C-36 VIH-1 seroe. >10 C-37 VIH-1 seroe. > 10 G-80 Vi-H·-1 seroe. 0,43 G-8 1 VIH-1 seroe. 0,51 G-82 VIH-1 seroe. 0,50 G-83 VIH-1 seroe. 4,35 G-84 VIH-1 seroe. 5,15 G-8 5 VIH-1 seroe . 4,39 G-86 VIH-1 seroe. 6,15 G-87 VIH-1 seroe . > 10 G-88 VIH-1 seroe . > 10 G-89 VIH-1 seroe . > 10 G-90 VIH-1 seroe . > 10 G-9 1 VIH-1 seroe. > 10 44 ί Os resultados apresentados no quadro 2 demonstram que as novas composições peptídicas melhoram bastan te a sensibilidade para os anticorpos específicos para os VLTH. Por exemplo a amostra A02-3 aumentou de 0,69 (Quadro 1) para 1,08 com a nova mistura peptídica. A oito amostras que apresentaram resultados fracamente positivos (1,02 e 1,70) com os misturas utilizadas na experiência 1 originaram relações entre o sinal e o valor de transição fortemente positi^ vas (1,93 a 9,79) com as misturas peptídicas descritas na Ex periência 2. A sensibilidade no que diz respeito á dete£ ção dos anticorpos para os VIH também foi melhorada mas rela tivamente menosMais notável foi o acréscimo na relação en tre o sinal e o valor de transição da amostra C-22 passando de 0,60 para 0,89- Tal aumento permite classificar esta amostra como "negativa no limite". Em muitos laboratórios,as amostras negativas no limite são apuradas para testes adicio nais e consequentemente possuem uma grande possibilidade de serem detectadas como positivas. Efectuou-se outra série de testes utiiizan do placas que possuiam as mesmas relações entre péptidos e as quais foram preparadas conforme descrito na Experiência 2 com o objectivo de se avaliar melhor a sua sensibilidade e a sua especificidade. 0 Quadro 3a e o Quadro 3b seguintes resumem os dados obtidos. 45 45 / QUADRO 3a Estado das amostras testadas Não tes tada Não reac tiva Não conf irmada reactiva Anti-VIH-1 positivo 45 45 45 Anti-VIH-2 positivo 19 19 19 Anti-VIH-1 (painel de titulação inferior) 14 14 14 Anti-VLTH-I positivo 44 44 44 Anti-VLTH-IX positivo 12 12 12 46

QUADRO 3b Estado das amostras testadas Não testada Não reactiva Não confirmada reactiva /0 Especix" icidade Amostras sólidas a partir de mulheres grávidas 432 2 1 99,8 % Rotinas da VIH negativas 37 0 0 100 % Rotinas dos VLTH negativas 34 2 2* 100 % Doadores de sangue normal 792 2 ND >99,7 % * As duas amostras foram confirmadas como sendo anti-VIH-1 positivas . mostram a extraordinária estojo de ensaio. No Qua- Estes resultados sensibilidade-demonstrada por este ο * (a) aplicaçao de un espécime biológico a um supcr-e sólido; (o) remoção do excesso de esoecime biológico do suoor de sólido; (c) lavagem do suporte sólido revestido; (d) tratamento do suporte sólido lavado com um marcador adequado; (e) ens.aio para a determinação da presença da marca no suoorte sólido. 14.- Método de acordo com a reivindicação 13, caracte-rizado pelo facto de o referido espécime biológico ser selec-cionádo entre o grupo constituído por sangue, plasma, soro, saliva, urina, lágrimas, leite e fluido cerebral.

15. - Método de acordo com a reivindicação 14, caracte-rizado pelo facto de o referido espécime biológico ser o soro.

16. - Método de acordo com a reivindicação 13, caracte-rizado pelo facto de o referido espécime biológico ser diluído primeiramente com um tampao para o espécime antes de se apl_i car ao suporte sólido.

17.- Método de acordo com a reivindicação 13, caracte-