JPH06509868A

JPH06509868A - Ｈｉｖ−１、ｈｉｖ−２、ｈｔｌｖ−１およびｈｔｌｖ−２抗体の同時検出用イムノアッセイ

Info

Publication number: JPH06509868A
Application number: JP5503132A
Authority: JP
Inventors: ラクロワ　マーシャル; ドワイアー　ロバート　ジェイ; ツライン　マーン
Original assignee: バイオケム　イムノシステムズ　インコーポレイテッド
Priority date: 1991-07-29
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 1994-11-02
Anticipated expiration: 2014-08-09
Also published as: EP0605433A1; CN1070484A; IL102615A0; PT100731B; JP2931100B2; WO1993003376A1; IL102615A; NZ243636A; PT100731A; AU2340992A; ATE132268T1; ZA925492B; ES2085631T3; DE69207200T2; IE922452A1; EG20183A; DE69207200D1; EP0605433B1; CA2114220A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＩＶ−１、旧Ｖ−２、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１抗体の同時検出用イムノアッセイ発明の技術分野本発明は生物学的検体中の次のウィルス：旧Ｖ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１に対する抗体を同時に検出するのに用いることができるイムノアッセイキットに関する。また本発明はこれらのイムノアッセイキットを製造する方法に関する。

発明の背景ヒトＴ細胞白血病ウィルスサブタイプＩ　（ＨＴＬＶ−１）は成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）と密接に関連するレトロウィルスである〔ポイエッッ（Ｐｏｉｅｓｚ）等の、１９８０年、ｒ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、Ｊ　、７７．７４１５〜７４１９）　。またこのウィルスは熱帯性痙牽性麻痺（ｐａｒａｐａｒｅｓｉｓ）およびＨＴＬＶ−［関連を髄障害（ＲＡＭ）と称する神経学的疾病にも関連する〔ゲラサイン（Ｇｅｓｓａｉｎ）等の、１９８５年、ｒＬａｎｃｅｔ　ｉｉ　Ｊ、４０７〜４１Ｏ〕。ヒトＴ細胞白血病ウィルスサブタイプＩ［（ＨＴＬＶ−１１）は最初にＴ細胞へアリ− セル白血病から単離された〔カリャナラマン（にａｌｙａｎａｒａｍａｎ）等の、１９８２年、ｒＳｃｉｅｎｃｅ　Ｊ　２１８．５７１〜５７３）、このウィルスはへアリ−セル白血病のＴ細胞変異体に関連する。

成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）は主として日本の南西地方、カリブ海地域および中央および南アメリカ地域に発生する。これらの領域では、血清学的流行は一般的な人口の５〜１５％で変動し一層高い年齢のグループで３０％に達する。米国では、ＨＴＬＶ−［／ＩＩ感染は主として静脈内薬物ユーザーに発生する。最近の米国赤十字の調査〔ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）等の、１９８８年の、ｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｊ、２４０．６４３〜６４６　）では、ＨＴＬＶ− １に対する抗体か８つの米国都市で３９．８９８名のランダムな血液ドナーの１０名に検出され：このことは０．０２５％の血清学的流行率を示す。

北エジプトからの３１５８名の患者を含める同様の研究は２名のキャリアの同定を可能にした（０．０６％の流行率）〔エルーファラッシ、：Ｌ　（Ｅｌ−Ｆａｒｒａｓｈ）等の、１９８８年、ｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｊ、３２．９８１〜９８４〕。これら２種の研究では、ＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ −１１との感染の間の区別を明瞭に確立できなかった。

また後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ＡＩＤＳ関連複合体（ＡＲＣ）およびプレＡＩＤＳはしｌ−ロウィルス、特にヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）により発生すると考えられる。最初のＡＩＤＳ関連ウィルス、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ− ＩＩＩ、　ＬＡＶ−１およびＡＲＶとしても知られる）はよく特徴付けられている。他のＨＩＶ−２と称される病原性ヒトレトロウィルス（以前はＬＡＶ−２）は現在ＡＩＤＳを患った西アフリカの患者から単離されている。例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ８７１０４４５９号を参照。最近旧Ｖ−２が旧Ｖ−１およびサル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）の多数の保存配列を共有することか示された〔グヤダー（Ｇｕｙａｄｅｒ）等の、１９８７年、ｒＮａｔｔ＋ｒｅＪ、３２６．６６２〜６６９　）。

ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−［［はこれらの形態学的および遺伝学的構造においてヒト免疫不全ウィルス旧Ｖ−１および旧Ｖ−２とは異なる。結果として、ＨＩＶ抗原に対する抗体はＨＴＬＶ−ｆおよびＨＴＬＶ−［Ｉ抗原と交差反応しない。しかし、ＡＩＤＳを患った患者から採取した血清試料は１（ＴＬＶ抗原と若干の程度の交差反応性を示した〔エセックス（Ｅｓｓｅｘ）等の、１９８３年、ｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｊ、２２０．　８５９〜８６２〕。

ＨＴＬＶ抗原または旧■抗原に対する個々の抗体を検出するよう設計された診断アッセイの技術において種々の例が存在する。

例えば、サクシンガー（Ｓａｘ　ｉｎｇｅｒ）等の、１９８４年、ｒＳｃｉｅｎｃｅ　Ｊ、２２５．１４７３〜１４７６はＨＴＬＶ−１抗体の検出に関するエンザイムイムノアッセイ（ＥＲＡ）における免疫吸着剤としてＨＴＬＶ−［抗原を使用することを述べている。他の例はグナン（Ｇｎａｎｎ）等の、１９８７年、ｒＪ、Ｖｉｒｏ’１．Ｊ　６１．２６３９〜４１の例であり、この例は旧Ｖ−１抗体を検出するのに有効であるといわれるペプチド配列について述べている。

最近、ＨＴＬＶおよび旧■抗原に対する抗体を同時に検出することができる診断キットを提供することがこの技術において試みられた。例えば、カナダ国特許第１．２４５．９８２号および欧州特許出願第１３６．７９８号明細書にはＨＴＬＶ−１、ＩＴＬＶ−［［およびＨＴＬＶ−１１１（旧■−１）に対する抗体を同時に検出するためのアッセイキットが記載されている。これらのキットにおいてＨＴＬＶ抗原はＨＴＬＶウィルス粒子から誘導し、種々の形質転換細胞系から得た。一方、ＰＣＴ出願第Ｗ０９０１０８１６２号にはＨＴＬＶ−１ｃ７）　工：／ベローブタンバク質および合成ＨＩＶペプチドがら誘導した抗原を用いてＨＴＬＶ−１、旧Ｖ−１および旧Ｖ−２に対する抗体を同時に検出するイムノアッセイキットか記載されている。

しかし、上述のアッセイはいずれもＨＴＬＶ−［、ＨＴＬＶ−ＩＩ　、ＨＩＶ− １および旧Ｖ−２に対する抗体を同時に検出する感度のよい方法を提供しない。

実際に、旧ｖ−１、旧Ｖ−２、ＨＴＬＶ−１およヒＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体を独自に検出することが単独で考えられる場合でさえも、上述のいずれのアッセイも十分に受け入れることができる診断試験を提供しない。

これらの従来のアッセイは種々の方法において欠点がある。

いくつかの場合、これらの試験はウィルス全体または細菌学的に製造した免疫吸着剤を用いる。これらの調製物の使用は特異性の欠如に悩ませられる−すなわち、迷惑な陽性結果（ｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）−一この理由は普通多くの非感染患者の血液が調製物において通常見出される汚染物に対する抗体を含んでいるからである。また迷惑な陽性結果はウィルスでエピトープが共有される結果として発生し、これらのウィルスは旧■またはＨＴＬＶに関連せずこれらの調製物中に存在する場合がある。これら従来のアッセイの他の問題点は感度の欠如である。感度の欠如により汚染された血液が検出されずこれにより潜在的に血液製品の容器を感染し診断未確定の旧■またはＨＴＬＶキャリアにより伝染力が維持される。これら従来の組み合わせアッセイの感度の欠如はウィルス全体または細菌学的に製造された調製物を用いる場合のアッセイの固体桁上のエピトープの低い表面密度のためであると考えられる。これらおよび他の理由から、ＨＩＶ− １、旧Ｖ−２、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−［１に対する抗体を同時に検出するアッセイはなお大いに必要とされている。かかる試験は感染した血液製品か血液銀行に受け入れられず感染した患者が迅速な初期の処置をめることを一層良好に保証する。

発明の開示本発明のアッセイキットは体液の試料中の旧Ｖ−１、Ｈ［Ｖ−２、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１に対する抗体を同時に検出する感度のよい特定の手段および方法を提供することにより上記概略した問題を解決する。

本発明のアッセイキットは、固形支持体上にコートした、ＨＴＬＶ−１，ＨＴＬＶｉ［、旧Ｖ−１および旧Ｖ−２＋、：対する抗体の同時検出に有用な、ペプチドを含む。

さらに本発明ハＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ　、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２＋：対する抗体の同時検出用アッセイキットを製造し使用する方法を提供する。

本発明のアッセイキットは少なくとも４種の異なる旧■およびＨＴＬＶペプチド、２種の旧Ｖペプチドおよび２種のＨＴＬＶペプチドを含む。少なくとも１種の旧Ｖペプチドは旧Ｖ−１に対する抗体を認識することができ少なくとも１種の他の旧Ｖペプチドは旧Ｖ−２に対する抗体を認識することができる。同様に、少なくとも１種のＨＴＬＶペプチドはＨＴＬＶ−１に対する抗体を認識することかでき少なくとも１種の他のＨＴＬＶペプチドはＨＴＬＶ−１１に対する抗体を認識することができる。

驚くべきことに、ＨＴＬＶ−１および１１ペプチド、さらに一層好ましくはそれらを含むカクテルを、まず固形支持体に添加し、次いて旧■ペプチドを、別々にまたは一層好ましくはカクテルにおいて添加する場合、得られるアッセイの感度は著しく改良される。従って、さらに本発明の目的は旧Ｖ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−［およびＨＴＬＶ−［［に対する抗体の同時検出用アッセイキットを製造する方法を提供し、このＨＴＬＶ−１および１１のペプチド、好ましくはカクテルの形態で、まず支持体に添加し次にＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ペプチドを、さらに好ましくはカクテルとして、支持体に添加する。

本発明のキットは広範な生物学的検体および体液をスクリーニングするのに用いることかできる。これらの試料には血液、血漿、血清、唾液、尿、涙、ミルクまたは髄液が含まれる。

本発明のキットおよび方法に有用な旧Ｖ−１ペプチドは式、ａ−ｘ−ｂ　、て表されるペプチドから成る群から選択し、式中Ｘは：ん：ｑ　Ｘ１ｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　（ｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ｃｌｎ　Ｇｉｎ　ＩａｕＬｅｕ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　’Ｌｅｕ　Ｘ１ｅ　Ｃｙｅ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＡｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　（ＢＣ）Ｉ−Ｂ７ｅｌＬｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｓｓ　Ｌｙｅ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　５ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｘ１ｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＡｌａ　ＶａＬ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ａｎｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　（ＢＯＩ−８７ｃｋｌＬｙｅ　Ｘ１ｅ　にｌｕ　ＰｒｏＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ＋　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇｋｒｑ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　ｋｒｑ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　（ＢＧ＋’ｌ−１３２）Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＩｌｅしＮ　Ｍａ　ＶａＩＧｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　ｔａｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　ＧｉｎＬｅｕ　ｔａｕ　Ｇｌｙ　１１＠τｒｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＬｙｌＬｅｕ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　ＴｈｒＴｈｒＡｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｊｕａ　Ｓｅｒ　（ＢＯ４−２６６）Ｌｙ＋＋　Ｉｌｅ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　ＬａｕＬａｕ　にｌｙ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｃｙｅ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＡｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　八ｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＬｙＢ　Ｌａｕ　Ｉｌｅ　（ＢＯＩ−４０ＱＩＬＹ９　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　ＧｉｎＬｊ？ＩＪ　Ｉａｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｘ１ｅ　Ｃｙｓ　ＴｈｒＴｈｒ　八ｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　八ｓｎ　八ｌａ　Ｓｅｔ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｘ１ｅ（Ｒｏｔ−４０１３ｋｌおよびその類似体より成る群から選択し。

ａはアミノ末端で、１〜８個のアミノ酸、しかし好ましくは１〜５個のアミノ酸さらに一層好ましくは１〜３個のアミノ酸、またはカップリングを促進しあるいはペプチドの免疫原性または抗原性の活性を改良するのに効果的な置換基であり；さらに、ｂはカルボキシ末端で、１〜８個のアミノ酸、しかし好ましくは１〜５個のアミノ酸さらに一層好ましくは１〜３個のアミノ酸、またはカップリングを促進しあるいはペプチドの免疫原性または抗原性の活性を改良するのに効果的な置換基である。

本発明のキットおよび方法で有用な旧Ｖ−２ペプチドは式、ａ−Ｙ−ｂ　、で表されるペプチドから成る群から選択し、式中Ｙは：Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　ｊｕａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　にｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　ＡＬ□ｑＬｅｕ　Ａａｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　ｅｙｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｈｌｓ　ＴｈｒＴｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａａｎ　Ａｊｐ　Ｓｅｒ　（Ｂｏ（−２０２ｃ）Ｌｙｓνａ１τｈｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ、　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　ＡｒｇＬａｕ　Ｊｌｕｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　ＴｈｒＴｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　（Ｂｅ）ｌ−２０２ｅｋ）Ｌｙ＋＋　Ｌｙｅ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ｆｆ１ｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｌａｋｇ　ｔＡＩＡｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｂｅ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　ＨｉｓＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　（ＢＯＩ−２６５１Ｌｙｅ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ＸＬｅ　Ｃ１ｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　ＡｒｇＬａｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｂｅ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　ＴｈｒＴｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ（ＢＯＩ−４１７１Ｌｙｅ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　八１ａ　工ｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　入１ａＡｒｇｔａｕ　Ａａｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　ＴｈｒＴｈｒＶａｌＰｒｏＴｒｐＶａｌＡｓｎＡｊｐＳｅｒＧｌｙＬｙｓＨｉｓＩｌｅ（聞−４２２）およびその類似体より成る群から選択し：ａおよびｂは上記と同様のものである。

本発明のキットおよび方法で有用なＨＴＬＶ−［ペプチドは式、ａ−ｚ−ｂ　、で表されるペプチドより成る群から選択し、式中Ｚは：Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　（ｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ工ｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐ’ｒｏ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒ。

ＴｒｐＬｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｅ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｈａ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｖａｌム？ｕ　（ＥＫΣ−２３４）入１ａ　ｌｉｅ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　工ｌｅ　ｔａｕ　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　ＧＩＹ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ（ＢＣＨ−４１６１およびその類似体より成る群から選択し：ａおよびｂは上記と同様のものである。

本発明のキットおよび方法で有用なＨＴＬＶ−１１ペプチドは式、ａ−Ｗ−ｂ　、て表されるペプチドより成る群から選択し、式中Ｗはｔａｕ　Ｖａｌ　）ｌｉｉ　Ａｓｐ　Ｓａｒ：　Ａｌｐ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　）ｌｉｓ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　５ｅｒＴｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　ｔａｕ　（８０４−２１９，）Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ −Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａｊｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　ｔａｕ　Ｇｌｕ　）ｌｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　（ＢＯＩ−４５６１Ｔｈｒ　Ｓａｒ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＬｅｕＶａｌ　）ｌｉｓ　Ａ９Ｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　（ＢＯ（−４８６１およびその類似体より成る群から選択し、ａおよびｂは上記と同様のちのである。

各群−Ｈ）Ｖ−Ｉ　５ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１オ、ｉ　ヒＨＴＬＶ−１１−かラノ少なくとも１種のペプチドを本発明のアッセイキットおよび方法本発明ハ、ソレソレカ、）（ＩＶ−１、ＨｒＶ−２、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体を認識し選択的に結合するエピトープを含む少なくとも４つのペプチドから成るイムノアッセイキットを提供する。

上述したように、これらの４つの群の個々のペプチドはそれぞれ、式：　ａ−Ｘ −ｂ　、　ａ−Ｙ−ｂ　、　ａ−Ｚ−ｂおよびａ−Ｗ−ｂを有する。各群の１つのメンバーは本発明のキットおよび方法で用いられる。しかし、本発明はこれに限定されない。例えば、また少なくとも１つの群の１種以上のペプチドまたは各群からの種々のペプチドを用いることができる。ペプチドａ−Ｘ−ｂ　、　ａ− Ｙ−ｂ　、　ａ−Ｚ−ｂおよびａ−Ｗ−ｂの各群の少なくとも１つのメンバーを用いることが全ての場合に必要である。

ここで用いる「類似体」とは記載したペプチド鎖の１種以上の部位でアミノ酸が挿入、欠失、置換および修飾されたものを意味する。

本発明のペプチドのアミノ酸配列に対する好ましい修飾および置換は保存的なもの（すなわち、ペプチドの二次構造および水治療の性質（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｎａｔｕｒｅ）に最小の影響しか及ぼさないもの）である。これらにはディホッフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）によるｒＡｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｊ　５．１９７８年およびアルゴス（Ａｒｇｏｓ）によるｒＥＭＢＯＪ、　Ｊ　８．７７９〜７８５．１９８９年に記載されたような置換か含まれる。例えば、次の群：　ａｌａ　。

ｐｒｏ　、ｇｌｙ　、ｇｌｕ　、ａｓｐ　、ｇｉｎ　、ａｓｎ　Ｓ　ｓｅｒ　、ｔｈｒ　；　ｃｙｓ　Ｓ　ｓｅｒ　、ｊｙｒ　、ｔｈｒ　；　ｖａｌ　、ｉｌｅ　、ｌｅｕ　、　ｍｅｔ　、　ａｌａ　５ｐｈｅ　；　ｌｙｓ、ａｒｇ、　ｈｉｓ　；およびｐｈｅ　−ｔｙｒ　、　ｔｒｐ　、　ｔｎｓの１種に属するアミノ酸は保存的変化を示す。同様の方法で、メヂオニンは、酸化し易いアミノ酸で、ノル口・イシンにより置換することかできる。また好ましい置換には対応する１、−アミノ酸についてのＤ−アイソマーの置換か含まれる。

この明細書で用いるしアミノ酸ｊ　（例えば、ａおよびｂの定義で）とはすべての天然アミノ酸、ロー型のアミノ酸、および非天然、合成、ならびにホモパノステイン、オルニチン、ノルロイノンおよびβ−バリ゛ノのような、修飾アミノ酸、を含む。

以上に簡単に説明したように、本発明のペプチドを免疫診断試薬またはワクチンの活性成分として一層有効なペプチドを選択するために修飾する、：とはしばしば有用であり実際に本発明の範囲内である。かかる変更には、例えばニー　硫酸コハク酸イミド（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）−４−（１）−マレイミド−フェニル）ブチレートのような異種二官能架橋剤を用いてペプチドが適当なキャリアにカップリングするのを促進するためにシスティン基を一方または両方の末端に加えること、かかる結合に影響を及はず好ましい試薬は硫酸コハク酸イミド−４−（Ｎ−マレイミド−メチル）ソクロへギザシーｌ−カルボキシレートおよびＮ−コハク酸イミド−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートである；一１〜８個の追加のアミノ酸（好ましくは１〜５、および最も好ましくは１〜３個のアミノ酸）をペプチドの一方または両方の末端に加え、支持体または一層大きなペプチドもしくはタンパク質に結合させるためあるいはペプチドの物理的または化学的特性を修飾するために、相互にペブヂＩ・の結合を促進する。かかる変更の例はＮ−またはＣ−末端チロジン、エステル化反応を介したリンカ−としてのグルタミン酸またはアスパラギン酸およびシッフ塩基またはアヘド形成を介して結合す″る、二とがてきるリジンを加えることである。上述のようにががる追加のアミノ酸には任意の天然アミノ酸１．７れらのＤ−型アミノ酸、および既知の非天然、合成および修飾し７′二アミノ酸が含まれる：および −ペプチドの一方または両方の末端を、例えば、アソル化またはアー、１−化により誘導体化すること。これらの修飾はペプチドの総電荷を変化させさらじペプチドが固形支持体、キャリアまたは他のベブチＩ・に共有結合するのを促進することができる。カップリングを促進しペプチドの免疫原性および抗原性の活性を改良するのに仔効な置換基の例は０２〜・Ｃ３，アシル基、ポリエチレングリコールおよびリン脂質である。

本発明のペプチドを調製するために任意の通常のペプチド製造方法を用いることができる。これらには合成、絹換えＤＮＡ技術およびそれらの組み合わせが含まれる。本発明者らは固形和合成を用いるのか好ましいと考える。この合成法では、樹脂支持体はペプチドの固形用調製のためにこの技術で通常用いられる適当な樹脂でよい。これにはＰ−ベンジルオキシアルコールポリスチレンまたはＰ−メチルベンジルドリルアミン樹脂が好ましい。第１の保護されたアミノ酸を樹脂支持体に結合さぜた後、アミノ保護基をこの技術で通常用いる標準法により除去する。

アミン保護基を除去した後、残留する保護されたアミノ酸および、必要なら、側鎖の保護されたアミノ酸を、次に、所望の順に結合して選択されたペプチドを得る。あるいはまた、多数のアミノ酸基を樹脂に支持されたアミノ酸配列を用いて結合する前に溶液法（ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）を用いて結合させる場合かある。

適当なカップリング試薬の選択は確立された技術による。例えば、適当なカップリング試薬はＮ、Ｎ’　−ジイソプロピル−カルボジイミドまたはＮＳＮ’　− ジシクロへキンル力ルポジイミド（ＤＣＣ）あるいはベンゾトリアゾール−１− イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスフォニウムへキザフルオロホスフエ −１・の単独または１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下のものか好ましい。他の有用なカップリング法は保護されたアミノ酸の予め形成した対称性無水物を用いる。

成長中のポリペプチド鎖に導入される各アミノ酸に用いられた必要なα−アミノ保護基は９−フルオレニルーメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）か好ましいか、任意の他の適当な保護基はカップリング条件下に分解せず成長するペプチド鎖に既に存在する他の任意の保護基の存在下に容易に選択的に除去されるかぎり用いることかできる。

側鎖アミノ酸の保護基を選択するための基準は、（ａ）合成の各工程てα−アミノ保護基の除去について選択される反応条件下での種々の試薬に対する保護基の安定性：（ｈ）保護基の有利な特性の保持（すなオ）ち、カップリング条件下に分離しない）および（ｅ）ペプチド合成の終りにおよびその他の点てはペプチド構造に影響を及はさない条件下で保護基を容易に除去できることである。

本発明の十分に保護された樹脂で支持されたペプチドはアニソール、チオアニソール、エチルメチルザルファイド、１．２−二タンジチ才一ルおよび関連する試薬のような適当なスカベンジャーの存在下に室温で１〜６時間塩化メチレン中の５０９６〜６０％のトリフルオロ酢酸溶液を用いてＰ−ベンジルオキシアルコール樹脂から切断するのか好ましい。同時に、最も酸に不安定な側鎖保護基を除去する。一層酸に抵抗性のある保護基は代表的にＨＰ無処理より除去される。

本発明のペプチドｉ；ｔＨ［Ｖ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−［マフ’、：ハＨＴＬＶ−１１関連抗体をこの技術でよく知られた方法により同時に検出するための診断試薬として有用である。これらにはＥＬ［ＳＡ　、血球凝集、シングルドツトおよびマルチドツト法ならびにアッセイが含まれる。

本発明の試験キットはエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含むのが好ましい。この好ましい例では、本発明のペプチドまたは種々のペプチドの混合物は固形支持体と同様なもの、例えば、マイクロタイタープレートの上に吸着し、あるいは共有結合する。驚くへきことに、ＨＴＬＶ−１／ｌ　［のペプチド（あるいは好ましくはそれらの混合物）をまずウェルに添加する場合、すなわち旧ｖ１／２ペプチドをウェルに添加する前に、アッセイの感度か著しく高まる。従って、本発明の好ましい具体例はキラ１へ、およびかがるキットを製造する方法を含み、これにはＨＴＬＶ−１およびＩＩのペプチドの混合物またはカクテルをまず支持体に結合させ次いて旧Ｖ利および旧Ｖ−２のペプチド、および一層好ましくはそれらの混合物を支持体に結合させる本発明のアッセイおよび方法のために適当な固形支持体には有機および無機重合体、例えば、アミラーゼ、デギスｌ−ラン、天然または修飾セルロース、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガロース、磁鉄鉱、多孔性ガラス粉末、ポリフッ化ヒニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｄｉｅｎｅ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ）　（キナール（ｋｙｎａｒ）　：ｌおよびラチソクス、試験容器の内壁（すなわち、試験管、ケイタープｔ、−＋−もしくはガラスのキュベツトまたは大王（（料）ならひに固形体（ｓｏｌｉｄ　ｂｏｄｙ）の表面（すなわち、ガラスおよび人工。材料のロット、末端が太くなったロッド、末端に丸い突出部または薄板を有するマルチウェルロッド）が含まれる。′−，“ルーｆ−・″フェルプラスチックマイクロタイタープレートが、固形用キャリアどして、特に適しており、好ましい。

本発明で用いるペプチドｔ々よぴその混合物は任意の方法によりｂよび得ら第１るキラｌの感１ｖＪ、、よび特異性を最大にするのに効果的な量て固形支持体上適用することができる。本発明者らは緩＃液中に溶解した本発明の１種以上のペプチドを含む溶液と固形支持体を接触させることか好ましいと考える。この緩衝液はペプチドを溶解し、それらを固形支持体に適用するのに通常用いる任意の緩衝液でよいか、本発明者らは０．０５Ｍの炭酸ナトリウｌ、−重炭酸すトリウム溶液（ｐｈｉ　９．６）を用いるのが好ましいと考える。

緩ＷＩｉ液中のペプチドの濃度はペプチドが固形支持体の表面に付着ヂるのに効果的な量になるよう十分であるべきである。ここで用いるように、「効果的な量Ｊとは固形支持体上て、生物学的検体中の、旧ＶＩ　、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ− １またｌ；！　ＨＴＬＶ−１１＋：対するそれぞれの抗体を効果的に検出するペプチドの量を意味する本発明にかかるマイクロタイタープレー１・のウェルをコートするのに用いるペプチド溶液は５μｇ／ｍｌ〜ｌＯμｇ／ｍｌ、さらに好ましくはｌＯμｇ／ｍｌのペプチド濃度を有する。かかるペプチド濃度は単一のペプチドか溶液中に存在するにすぎない場合には単一のペプチドに起因しまたはカクテルの場合はすべてのペプチドの総濃度に起因する。本発明のペプチドカクテルは５μｇ／ｍｌ〜ｌＯμｇ／ｍｌの本発明の個々のペプチドを含む溶液を混合することにより調製することが代表的で好ましい。例えば、２種のペプチドのカクテルを調製する場合、ペプチド１の５μｇ／ｍｌ’−ｔ。

μｇ／ｍｌで選択された容量の溶液をペプチド２の５μｇ／ｍ１−１０μｇ／ｍｌて選択された容量の溶液と混合する。得られるカクテルは結果として５　μｇ／ｍ１−１０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０Ｍｇ／ｍｌの総ペプチド濃度を有する。

本発明のペプチドカクテルを製造するのに選定した特定の容量は結果として得られるアッセイキットを＋（［Ｖ−１、旧Ｖ−２、ＨＴＬＶ−１および１（ＴＬＶ −１１に対する抗体の検出における感度および特異性について試験することにより経験的に決定されることがある。次いてペプチドカクテルを形成するのに混合されるペプチド溶液の実際の容量は結果として得られるアッセイキットで最大の感度と最大の特異性を達成するために上述のパラメータ内で個別に変更することができ、これらのペプチドカクテルは等量の各成分ペプチドを含む必要かないと考えられる。実際、本発明者等は、ＢＣＨ１３２よりも多いＢＣＨ−４０８およびＢＣ）ｌ−２０２ｃｋの各々さらにそれぞれのＢＣＨ２３４およびＢＣＨ４１６よりも多いＢＣＨ４５６を含むペプチドカクテルを用いるのが好ましいと考える。

本発明の好適例では、本発明者等はペプチドを固形支持体に適用する前にＨＴＬＶペプチドカクテルを形成するためにＨＴＬＶ−［とＨＴＬＶ−１［のペプチド溶液（５ｔｔ　ｇ／ｍ１−１ｏ　ｔｔ　ｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０Ｍｇ／ｍｌ）を混合する。同様の方法で、本発明者らはペプチドを固形支持体に適用する前にＨＴＬＶペプチドカクテルを形成するために旧Ｖ−１とＨＩＶ−２のペプチド溶液（５ｕ　ｇ／ｍ１−１０１ｔ　ｇ／ｍｌ、さらに好ましくはＩＯμｇ／ｍｌ）を混合するのが好ましいと考える。本発明のキラ１−で有用な好ましいペプチド組成は＝（１）ＢＣＨ−１３２、ＢＣＨ−２０２ｃｋおよびＢＣＨ−４０８を１：４０：６０の比で含む旧Ｖ−１／２ペプチドカクテルならびニ（２）ＢＣＨ−２３４、ＢＣＩ（−４１６オヨびＢＣＨ−４５６を１１．４の比で含むＨＴＬＶ−１／ＩＩペプチドカクテルである。本発明の他のアッセイキットでのペプチドのこれらの比および濃度は、もぢろん、得られるキットの感度および特異性を最大にするように変更することかできる。

通常の方法を用いてペプチド溶液を本発明にがかるウェルに接触させる。ウェルか各々個別のペプチドを用いて別々にコートされる■体側では、本発明者らは代表的に６０μｌの第１のペプチド溶液、１２０μｌの第２の溶液、１８０μｌの第３の溶液および２４０μＩの第４の溶液を用いる。これによりウェルの異なる表面か各ペプチドでコートされる。本発明者らがＨＴＬＶカクテルおよび旧■カクテルを用いる好適例では、上記と同じ理由から、本発明者らは代表的に１２０ μｌのＨＴＬＶカクテルおよび２４０μｍの旧■カクテルを用いる。

ペプチド溶液またはペプチドカクテルが固形支持体と接触している時間の長さはペプチドまたはペプチドの混合物の効果的な量か支持材料の表面に付着するのに十分である必要がある。

好ましくは、室温で１時間か十分である。しかし、本発明者らは通常ペプチドとウェルを４°Ｃて一昼夜接触させる。かかる時間の後、本発明者らは任意の結合していないペプチドを除去するのか好ましいと考える。この上程は固形支持体から過剰の液体を除去するだめの任意の通常の方法を用いて実施することができる。本発明者らは吸引を用いるのか好ましいと考える。吸引後、またウェルをリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＣ１，０，１５Ｍ　；ＮａＨ２ＰＯ４，０，０６Ｍ　；チメロサル、ｏ、ｏｔ９６およびトウィーン２０．０．０５％：　ｐＨ７，４）のような洗浄緩衝液を用いて洗浄することができる。しかし、この洗浄工程は必要ではない。吸引および／または洗浄後、次いで上述した適用法を繰り返すことにより追加のペプチドまたはその混合物を支持体に適用することかできる。

本発明の他の例では、本発明者らはウェルからの第１のペプチドまたはカクテルの過剰量をウェルが次のペプチドまたはカクテルと接触する前に除去はしない。

この具体例では、本発明者らは各ペプチドまたはカクテルのほぼ等量を用いることが好ましいと考える。例えば、単一のペプチド溶液を個別に用いる場合、本発明者らは６０μＩの第１のペプチドを用いさらに１時間後、６０μＩの第２のペプチド等を添加する。ＨＴＬＶおよび旧Ｖのペプチドカクテルを用いる場合、本発明者らは１２０μｌのＩ（ＴＬＶカクテルを用いさらに１時間後１２０μＩの旧■カクテルを添加した。追加の時間の後、過剰の溶液を除去しウェルを緩衝液で普通に洗浄した。

所望のペプチドを支持材料に結合させさらに過剰の材料を除去した後、ウェルを試験すべき生物学的検体で処理する。この検体は血清であるか血液、血漿、唾液、尿、涙、ミルクまたは髄液のような他の検体も用いることができる。また生物学的検体はアッセイ前に検体緩衝液を用いて希釈することができる。

かかる緩衝液の例はリン酸ナトリウム緩衝液（リン酸ナトリウム、６　ｍＭ　；　ＮａＣ１，０，１５Ｍ　、　ＢＳＡ、２％：ペプトン、１．５％、ベンズアミジン、８０ｍＭ；トウィーン２０．１％；熱不活化ヤギ血清、４０％：チメロサル、０．０１％、最終ｐＨ７，２）である。ウェル当たりに添加した検体溶液の量はウェルをコートするのに用いた最大容量の５／６に等しいのか好ましい。例えば、ウェルをコ−トするのに２４０μｌのペプチド溶液を用いた場合法に添加すべき検体溶液の量は２００μｌが好ましい。

分析すべき試料に曝した後、好ましくは吸引を用いてウェルを空にし、さらに洗浄する。洗浄後、ペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＭをウェルに添加する。ペルオキシダーゼの測定は代表的に対応する基質、例えば、３．３′、５．５′−テトラ−メチルベンジジンを用いて行う。この例示したアッセイの有用性からそれることなく、ペルオキシダーゼを他の標識により、例えば放射能、蛍光、化学ルミネセンスまたは赤外放射あるいは吸収ラベルにより代えることができる本発明のペプチドの合成および利用に関する一般的方法を次に説明する。

互広↓・Ｎ−ＦＭＯＣて保護されたアミノ酸残基を有する樹脂の調製塩化メチレン（ＣＨ，Ｃｌ２）とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　（４：　ｌ）との混合物中の所望のＮ−ＦＭＯＣで保護されたアミノ酸残基を０″ＣでＣ）１２ｃＩ２：ＤＭＦ（４：Ｉ）中のＰ−ベンジルオキシアルコール樹脂の懸濁液に添加した。この混合物を数秒間手動で混合し、次いでＮ、Ｎ′−ノシクロへキシル−カルボジイミド（ＤＣＣ）次に４−（ジメチルアミノ）ピリジンの触媒量を用いて処理した。混合物を追加の３０分間０°Ｃて次いて室温で一昼夜混合した。濾過した樹脂を連続してＣ１２Ｃ１□、ＤＭＦおよびイソプロパツール（各３回洗浄）ならびに最後に、ＣＨ２Ｃｌ□で洗浄した。この樹脂をＣＨ２Ｃｌ２中で懸濁させ、水浴中で冷し再蒸留したピリジン次に塩化ベンゾイルをこの混合した懸濁液に添加した。混合は０″Ｃで３０分間維持し次に室温で６０分間維持した。濾過した後、この樹脂を高真空下で一定の重量にまで乾燥する前に連続してＣＨ，Ｃ１，、ＤＭＰおよびイソプロパツール（各３回洗浄）ならびに最後に、石油エーテル（２回）で洗浄した。

マイエンホッフｙ　−（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）等（ｒ［ｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、Ｊ　、１３．３５．１９７９年）に従った置換基の分光測光法による測定は樹脂上の置換の程度を示す。

Ｊｍ２：連続したアミノ酸のカップリングＮ−ＦＭＯＣで保護された第１のアミノ酸残基を有する樹脂をパイオサ−千９６００ペプチドシンセサイザーの反応容器に配置し次のように処理した・１）ＤＭＦで洗浄した（各々２０秒間で４回）２）ＤＭＦ中のピペリジンの３０％溶液で予め洗浄した（３分）３）ＤＭＦ中のピペリジンの３０％溶液で保護を解除した（７分）４）ＤＭＦで洗浄した（各々２０秒間で８回）５）遊離アミノ基をチェックしたーカイザー試験（陽性である必要かある）６）次にペプチド樹脂を所望のＦＭＯＣで保護されたアミノ酸の８等量およびすへてを１６等量の４−メチルモルフ十リンを含む乾燥し再蒸留させたＤＭＦに溶解したｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾールならびにベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチル−アミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートと共にｌまたは２時間緩徐に振盪させた７）ＤＭＦで洗浄した（各々２０秒間で６回）工程７の後、アリコートをニンヒドリン試験用に採取した。

試験か陰性の場合、次のアミノ酸のカップリングのために工程ｌに戻る。試験か陽性あるいはわずかに陽性である場合、工程６および７を繰り返す必要がある。

本発明に記載したペプチドの各アミノ酸をカップリングさせるために上記機構を用いることができる。またＦＭＯＣを用いたＮ−保護を合成中に残留する各アミノ酸と共に用いることができる放射性元素で標識したペプチドを上記カップリング法を用いてトリチウム化したアミノ酸の結合により調製することができる。

最後のアミノ酸の添加後、Ｎ−末端残基のＮ−ＦＭＯＣを上記機構の工程１〜７に戻すことにより除去する。ペプチド樹脂をＣＨ２Ｃｌ２を用い洗浄しさらに粗製の保護されたペプチドが得られるまで真空中で乾燥する。

方法３　樹脂からのペプチドの保護の解除および切断保護されたペプチド樹脂を、２．５％のエタンジチオールおよび２．５！％のアニソールを含む、ＣＨ，Ｃ１２中にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を５５％含む溶液に懸濁させた。混合物をＮ２を用いてフラッシュし室温で１．５時間混合した。混合物を濾過しこの樹脂をＣＩ（２Ｃ１，を用いて洗浄した。さらに樹脂をＣＩ（、ＣＩ２中の２０％ＴＦＡを用いて室温で５分間処理した。混合物を濾過しこの樹脂をＣＨ，Ｃ１２中の２０？６ＴＦＡを用いて洗浄しさらにＣＨ２Ｃｌ、を用いて洗浄した。

組み合わせた濾液を３５°Ｃ未満で真空状態で蒸発させ乾燥したジメチルエーテルと共に残留物を数回粉砕した。固体を１０％の酢酸水溶液に溶解し凍結乾燥して粗生成物を得た。

ａｒｇおよびｃｙｓ残基を含むペプチドをアニソールおよび硫化ジメチルの存在下に０°Ｃて１時間ＨＦで処理することによりさらに保護を解く。これらのペプチドを１０％の酢酸水溶液を用いて抽出し、ツメチルエーテルを用いて洗浄しさらに凍結乾燥して粗ペプチドを得た。

方法４：ペプチドの精製粗ペプチドをＣｌｓまたはＣ４逆相のＶｙｄａｃカラム（２，５ｘ　２５ｍｍ）上で移動相の勾配を用いた調製ＨＰＬＣにより精製した。流出液を２２０ｎｍて監視し次いて分析ＨＰＬＣにかけた。適切な画分をプールし、蒸発させ凍結乾燥させた。合成ペプチドの確認を分析逆相クロマトグラフィーおよびアミノ酸分析により行った。

方法５：エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬ［ＳＡ）によルＨ［Ｖ−１、Ｈ［Ｖ−２、ＨＴＬＶ−１またｌ；！ＨＴＬＶ−１１＋、：対する抗体の同時検出合成ペプチドを約５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍ　ｌのペプチド濃度を有するペプチド溶液を形成するように０．０５Ｍの炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）中で可溶化した。次に２種のペプチドカクテルをこれらの個別のペプチド溶液の容量を混合することにより調製した。第１のカクテルはＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１に対する合成ペプチドを含んでいた。第２のカクテルはＨ［Ｖ−１および旧Ｖ−２に対する合成ペプチドを含んでいた。各々のカクテルの総ペプチド濃度は５μｇ／ｍ１〜１０μｇ／ｍｌであった。

ＨＴＬＶ−［／ＩＩカクテルをまずウェルに添加した。次いで、ＨＩＶ−１／２ペプチドカクテルを支持体に結合させた。次の例において、まず１２０μｍのＨＴＬＶ−［／Ｉ＋誘導合成ペプチドカクテルを各々のウェルに添加しこれらのプレートを４°Ｃで一昼夜インキユベーションした。次にウェルを空にし２４０μ ｌの旧Ｖ−１／２誘導合成ペプチドカクテルで満たした。これらのプレートを４ °Ｃて一昼夜インキユベーションした。本発明者らはオイスターベイバーサフィルディスペンジングシステムを用いてウェルを満たした。これらのウェルを吸引により空にし洗浄緩衝液（ＮａＣ１，０゜１５μ：髄１（、ＰＯ，，０，０６Ｍ　；チメロサル、０．０１％およびトウィーン２０．０．０５％；　ｐｌ（７，４［０，３ｍｌ／ウェル］）を用いて２回洗浄した。次にウェルを３７°Ｃて１時間０．３５ｍ１の洗浄緩衝液で飽和させトウイーン２０を除いた同一の緩衝液で１回洗浄した。空のプレートを３７°Ｃで１時間乾燥させ用いるまで真空密封（ｖａｃｕｕｍ　５ｅａｔ）する。

分析すべき血清試料を検体緩衝液（リン酸ナトリウム、６ｍＭ；ＮａＣ１，０，１５Ｍ　；　ＢＳＡ、２％：ペプトン、１．５％：ベンザミジン、８０ｍＭ　；　Ｉ−ウィーン２０．１％：熱不活化ヤギ血清、４０％；チメロサル、０．０１９６、最終ｐＨ７，２）を用いて希釈しさらに希釈した血清試料（０，２ｍｌ　）をウェルに添加した。充填したウェルを室温で３０分間インキユベーソヨンした。次いでこれらのウェルを空にして洗浄緩衝液を用いて５回洗浄した。

ｌ・リス、０．０５　Ｍ　；　ＮａＣ１，０，５Ｍ　ニドウィーン２０．０．０５％；チメロサル、０．０１％、（ｐＨ７，２）を含む溶液中の１％のＷ／Ｖのウシ血清アルブミンで希釈したコンジュゲート溶液（ヒトＩｇＧに対するペルオキシダーゼで標識しアフイニテイで精製したヤギ抗体、５ｍｌの５０％グリセロール中の０．５　ｍｇ）を各々のウェルに添加（０，２ｍ１）　シて室温で３０分間インキュベーションした。次にウェルを空にし洗浄緩衝液で５回洗浄した。

酢酸緩衝液（０，１Ｍ；ｐＨ５，６）中の基質溶液〔Ｎ−メチルピロリドン（ＮＮＰ）中の２　ｍｇ／ｍ１の３．３′、５．５′−テトラ−メチル−ベンジジン〕を０゜０＋５Ｖ／Ｖ％の３０％Ｈ，０２を含む５容量のペルオキシド溶液で希釈し各々のウェルに添加（ウェル当たり０．２ｍ１）Ｌ、た。３０分後、各ウェルの中身を０，１ｍｌのＩＮ　Ｈ２ＳＯ４て処理し光学強度を４５０ｎｍで測定した。すべての測定は２回行った。

上述したように連続した方法を用いて、以下に述へる特定のペブチトヲ調製シ次１：ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１特異的抗体を検出するそれらの能力について評価した。

実験ｌこの実験で、ＨＴＬＶ−ペプチドカクテルはｌＯμｇ／ｍｌの総ペプチド濃度を有しＢＣＩ（−２１９、ＢＣＨ−２３４およびＢＣ）１−４１６の１：１：１の比の混合物から成り、各ペプチドはまずＩＯμｇ／ｍｌの濃度にまで方法５に記載の炭酸ナトリウム緩衝液において可溶化した。上述したように、　１２０μｌのこのＨＴＬＶ−１／Ｉ１合成ペプチドカクテルを各ウェルに添加し４°Ｃで一昼夜インキユベーションした。ウェルを空にし２４０μｌの旧Ｖ−１／２ペプチドカクテルを添加した。この旧Ｖ−１／２カクテルを３容量のＢＣＨ−４０８ペプチド溶液（１０μｇ／ｍｌ）と２容量のＢＣＨ−２０２ｃｋ溶液（１０，ｃｚｇ／ｍｌ）とを混合することにより形成してＩＯμｇ／ｍｌの総ペプチド濃度を有し、３：２の比でＢＣＩ−４０８およびＢＣＨ−２０２ｃｋを含むカクテルを得た。

この第２のカクテルに存在するペプチドの吸着およびプレートのさらなる処理を方法５に記載したように行った。また２種の連続したプレートを１２０μｌの各ペプチドカクテルを用いて調製した（すなわち、１（ＩＶ−１／２誘導合成ペプチドのためのものおよびＨＴＬＶ−１／Ｉ　ｒ誘導合成ペプチドのためのもの）。これらのプレート（旧■−εＩＡおよびＨＴＬＶ−ＥＩＡ）をＨＴＬＶ／旧■ の組み合わせプレート（組み合わせた旧Ｖ／ＨＴＬＶ−Ｅ　［Ａ）と共にサイドバイサイド研究に用いて血液血清試料中の旧■およびＨＴＬＶに対する抗体を検出するそれらの能力について比較した。表１にはこの比較を示す。

表１記録された信号／切断比組み合わせた試料Ｎｏ、　状態　旧Ｖ−ＥＩＡ　ＨＴＬＶ−ＥＲＡ　旧Ｖ／ＨＴＬＶ−Ｅ　（ＡＡＯ２−２３ＨＴＬＶ−ＩＩ陽性　３．２９　２．８４ＡＯ２−２４Ｈ且■− １１陽性　１３．５３　１２．３５ＡＯ２−２５ＨＴＬＶ−１［陽性　１．０３　１．０６表１　（つづき）記録された信号／切断比Ｃ−２０ＨＩＶ−１５ｅｒｏｃ、　０．１４　０．２９Ｃ−２１旧Ｖ−１５ｅｒｏｃ、　０．２４　０．３８Ｃ−２２ＨＩＶ−１５ｅｒｏｃ、　０．４６　０．６０Ｃ−２３旧Ｖ−１５ｅｒｏｃ、　２．９１　２．５４Ｃ−２４旧Ｖ−１５ｅｒｏｃ、　４．１７　３．５８Ｃ−２５Ｈ［Ｖ−１５ｅｒｏｃ、　５．９９　４．８９Ｇ−８０ＨＩＶ−１５ｅｒｏｃ、　０．１８　０．３７Ｇ−８１ＨＩＶ− １５ｅｒｏｃ、　０．２６　０．３０Ｇ−８２旧Ｖ−１５ｅｒｏｃ、　０．３０　０．３９Ｇ−８３旧Ｖ−１５ｅｒｏｃ、　４．９６　４．０３Ｇ−８４旧Ｖ− １５ｅｒｏｃ、　５．７９　３．８４Ｇ−８５旧Ｖ−１５ｅｒｏｃ、　４．８５　３．６７Ｇ−８６Ｈ［Ｖ−１５ｅｒｏｃ、　５．８９　５．０１表１の結果は切断に対する信号の比を示す。切断は０．１０の値を加えた３種の正常血液ドナーから取り出した血漿試料を用いて得た平均吸光度である。比≧１．０は陽性の試料を示す。

表１中てｒＮｃ」　と表示された試料はＨｔＶ−１／２陰性およびＨＴＬＶ−１／＋１陰性として証明された患者から得た陰性の対照であった。「ＰＣ」　と表示された試料はそれぞれ旧Ｖ−１のみ陽性、旧Ｖ−２のみ陽性、ＨＴＬＶ−１のみ陽性およびＨＴＬＶ−１１のみ陽性として証明された患者から得た陽性の対照であった。ｒＡＯ２Ｊ　（１〜２５）、ｒＣＪ　（２０〜２５）およびｒＧ」　（８０〜８６）と表示された試料はボストンバイオメゾイカインコーポレーション（ＢＢ［）から得た。これらの状態は８８１により決定された。ｒ　［ｎｄ、　Ｊは未確定のウェスタンプロットプロファイルを示す。［旧Ｖ−１５ｅｒｏｃ、Ｊはこれらの血漿試料を旧Ｖ−１に感染したと遡及的に考えられるドナーから連続して収集したことを示す。これらの患者は旧Ｖ−１に対する抗体をこれらの同一の抗体について陰性である試験の後数週間生産した。試料は年代順に番号を付ける。

一般に、旧Ｖ／ＨＴＬＶの組み合わせたプレートを用いて測定した切断に対する信号の比を旧■−ペプチドのみで別々にコートしたプレートを用いであるいは１（ＴＬＶ−ペプチドのみで別々にコートしたプレートを用いて測定したものと比較する。このことは驚くへき結果である。この理由は有意な信号の減少が所定の抗体を認識するエピトープの希釈に際し考えられるからである。同時感染旧Ｖ／ＨＴＬＶ試料、すなわち、ＡＯ２−４（７）場合、旧Ｖ／ＨＴＬＶプレートを用いて記録した切断に対する信号の比（＞１２）はＨＴＬＶ−ペプチドのみてコートしたプレート上で測定したもの（２，９５）より有意に高い。

抗旧Ｖ−Ｉ　ＦｊＥ性から抗旧Ｖ−１陽性までの患者ＣおよびＧの旧■−１血清交換は旧■−プレートおよび組み合わせた旧Ｖ／ＨＴＬＶ−プレート上で同時に検出される。

組み合わせた旧Ｖ／ＨＴＬＶ−プレートはＨＴＬＶ−プレートと同様に処理するか、種々の場合（試料ＡＯ２−３、Ａ０２−１３、およびＡＯ２−１７）においてＨＴＬＶ−Ｉ＋に対する抗体を含む試料は組み合わせた旧Ｖ−ＨＴＬＶまたは単独のＨＴＬＶプレートのいずれにも陽性としては検出されなかった。このようにして他のカクテルはＨＴＬＶ−抗体に対する感度を改良する試みてアセンブルされ試験された。

実験２この実験は先のものと極めて類似している。２種のペプチドカクテルの組成を次に示す：　ｔ（ＴＬ’／ペプチドカクテルは１０μｇ／ｍｌの総ペプチド濃度を含みｌ；１・４の比てＢＣＨ−２３４、ＢＣＨ−４１６およびＢＣＨ−４５６から成る。１（ＩＶ−ペプチドカクテルは５μｇ／ｍｌの総ペプチド濃度を含みＢＣＨ−１３２、ＢＣＨ−２０２ｃｋおよびＢＣＨ−４０８のｌ；４０二６０の比で構成される。これは個々の１０μｇ／ｍｌのペプチド溶液を用いて調製された。旧ソ−ペプチドカクテルは５μｇ／ｍｌの総ペプチド濃度を含みＢＣＨ−２３４、ＢＣＨ−２０２ｃｋおよびＢＣＨ−４０８を１−４０：６０の比で構成される。これは個々の５μｇ／ｍｌのペプチド溶液を用いて調製された。表２はこれらのペプチドでコートされたウェルて得られた結果を示す。

表２表２（つづき）ＡＯ２−２５１（ＴＬＶ−１［陽性　２．５１表２に示した結果は新規なペプチド組成物かＨＴＬＶ特異性抗体に対する感度を著しく改善することを示す。例えば、試料Ａ０２−３は新規なペプチド混合物により０．６９（表１）から１．０８まで変化する。実験１て用いたカクテルで低い陽性結果（１，０２〜１．７０）を示す８種の試料は実験２に記載したペプチドカクテルで強い陽性の切断に対する信号の比（１，９３〜９．７９）を与えた。

また旧ソー抗体検出に対する感度はより少ない程度であるが改良された。最も注目すべきことは試料Ｃ−２２の０．６０から０．８９の切断に対する信号の比の増加である。かかる増加はこの試料を「境界線上の陰性」として分類する。多数の研究所では境界線上の陰性試料かさらなる試験に対し制限されこのようにして陽性として検出される一層大きな機会を有する。

他の一連の試験は同一のペプチド比を有するプレートを用いて行われさらにそれらの感度および特異性を評価するために実験２に記載されたようにした。次の表３ａおよび表３ｂは得られたデータを要約する。

表３ａ表３ｂこれらの結果はこのアッセイキットにより示された印象的な感度を示す。表３ａには、旧Ｖ−１、ｌｌ［Ｖ−２、ＨＴＬＶ−［およびＨＴＬＶ−［ｌに対する抗体を含むすべての試料か組み合わせた旧Ｖ／ＨＴＬＶ試験キソ１−により正確に陽性であることか検出された。これらの試料には旧Ｖ−１に対する抗体の極めて低い濃度を含む血清試料の低いタイターパネルを含んでいた。

表３ｂはこのアッセイキットにより証明された驚くべき特異性を例示する。スクリーニングした１２９５種の試料中、１種に迷惑な陽性が確認されるにすぎない。この程度の特異性は約９９．５％の受け入れることかできる程度よりも有意に好ましい。

本発明者等は上記に本発明の多数の具体例を示すが、本発明者らの基本的構成を変更し本発明の方法および組成を用いる他の具体例を提供することができる。従って、本発明の範囲は上記に例を用いて示した特定の具体例によるよりは以下に添付した請求項によって規定されると考えられる。

国際調査報告　Ｃ＾９２００３２２フロントページの続き（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、５Ｅ（７２）発明者　ドワイアー　ロバート　ジェイカナダ国　エイチアティー　２エル１　ケベック　ラヴアル　スィート　６００　ダニエル　ジョンソン　ブールバード　２５５０バイオケム　ファルマ　インコーホレイテッド内（７２）発明者　ツライン　マーンカナダ国　エイチアティー　２エル１　ケベック　ラヴアル　スィート６００　ダニエル　ジョンソン　ブールバード　２５５０バイオケム　ファルマ　インコーポレイテッド内

Claims

【特許請求の範囲】

１．固形支持体に結合し、ペプチド基が式ａ−Ｘ−ｂ、ａ−Ｙ−ｂ、ａ−Ｚ−ｂもおよびａ−Ｗ−ｂ、式中：Ｘを次の【配列があります】（ＢＣＨ−８７ｃ）【配列があります】（ＢＣＨ−８７ｃｋ）【配列があります】（ＢＣＨ−１３２）【配列があります】（ＢＣＨ−２６６）【配列があります】（ＢＣＨ−４０８）【配列があります】（ＢＣＨ−４０８ｋ）およびその類似物より成る群から選択し；Ｙを次の【配列があります】（ＢＣＨ−２０２ｃ）【配列があります】（ＢＣＨ−２０２ｃｋ）【配列があります】（ＢＣＨ−２６５）【配列があります】（ＢＣＨ−４１７）【配列があります】（ＢＣＨ−４２２）およびその類似物より成る群から選択し；Ｚを次の【配列があります】（ＢＣＨ−２３４）【配列があります】（ＢＣＨ−４１６）およびその類似物より成る群から選択し；Ｗを次の【配列があります】（ＢＣＨ−２１９）【配列があります】（ＢＣＨ−４５６）【配列があります】（ＢＣＨ−４８６）およびその類似物より成る群から選択し；ａはアミノ末端で、１〜８個のアミノ酸またはカップリングを促進しあるいはペプチドの免疫原性または抗原性の活性を改良するのに効果的な置換基であり；さらに、ｂはカルボキシ末端で、１〜８個のアミノ酸またはカップリングを促進しあるいはペプチドの免疫原性または抗原性の活性を改良するのに効果的な置換基である、各々の４種の群のペプチドの少なくとも１種のペプチドを含むＨＩＶ −１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体を同時に検出するイムノアッセイキット。
２．ペプチドを固形相合成により作成したことを特徴とする請求項１記載のキット。
３．固形支持体に結合したＨＩＶ−１ペプチドが：【配列があります】（ＢＣＨ −１３２）および【配列があります】（ＢＣＨ−４０８）でありさらに固形支持体に結合したＨＩＶ−２ペプチドが：【配列があります】（ＢＣＨ−２０２ｃｋ）であることを特徴とする請求項１に記載のキット。
４．固形支持体に結合したＨＴＬＶ−Ｉペプチドが：【配列があります】（ＢＣＨ−２３４）および【配列があります】（ＢＣＨ−４１６）でありさらに固形支持体に結合したＨＴＬＶ−ＩＩペプチドが：【配列があります】（ＢＣＨ−４５６）であることを特徴とする請求項１に記載のキット。
５．固形支持体がマルチウエルプラスチックマイクロタイタープレートであることを特徴とする請求項１に記載のキット。
６．次の工程：（ａ）第１にＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩペプチドを固形支持体に結合し；（ｂ）次にＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ペプチドを固形支持体に結合することから成る請求項１に記載のイムノアッセイキットを製造する方法。
７．前記ＨＴＬＶ−Ｉペプチド、前記ＨＴＬＶ−ＩＩペプチド、前記ＨＩＶ−１ペプチドおよび前記ＨＩＶ−２ペプチドをまず０．０５Ｍの炭酸ナトリウムー重炭酸ナトリウム緩衝液で希釈して固形支持体に結合させる前にそれぞれＨＴＬＶ −Ｉペプチド溶液、ＨＴＬＶ−ＩＩペプチド溶液、ＨＩＶ−１ペプチド溶液およびＨＩＶ−２ペプチド溶液を得ることを特徴とする請求項６に記載の方法。
８．前記ＨＴＬＶ−Ｉペプチド溶液、ＨＴＬＶ−ＩＩペプチド溶液、ＨＩＶ−１ペプチド溶液およびＨＩＶ−２ペプチド溶液が各々５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのペプチド濃度であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
９．前記ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩペプチド溶液を混合して固形支持体に結合させる前にＨＴＬＶペプチドカクテルを得ることを特徴とする請求項７に記載の方法。
１０．前記ＨＴＬＶペプチドカクテルが５μｇ／ｍ１〜１０μｇ／ｍｌの総ペプチド濃度を有することを特徴とする請求項９に記載の方法。
１１．前記ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ペプチド溶液を混合して固形支持体に結合させる前にＨＩＶペプチドカクテルを得ることを特徴とする請求項７に記載の方法。
１２．前記ＨＩＶペプチドカクテルが５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの総ペプチド濃度を有することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
１３．次の工程：（ａ）固形支持体に生物学的検体を適用し；（ｂ）固形支持体から過剰の生物学的検体を除去し；（ｃ）コートした固形支持体を洗浄し；（ｄ）洗浄した固形支持体を適当な標識で処理し；（ｅ）固形支持体上の標識の存在をアッセイすることを特徴とする請求項１に記載のイムノアッセイキットを用いる方法。
１４．前記生物学的検体を血液、血漿、血清、唾液、尿、涙、ミルクおよび髄液より成る群から選択することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
１５．前記生物学的検体が血清であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
１６．前記生物学的検体を固形支持体に適用する前にまず検体緩衝液を用いて希釈することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
１７．工程（ｂ）を吸引により実施することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
１８．前記標識がペルオキシダーゼで標識した抗ヒト免疫グロブリンＧまたはペルオキシダーゼで標識した抗ヒト免疫グロブリンＭであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。