JP2931100B2

JP2931100B2 - Ｈｉｖ−１、ｈｉｖ−２、ｈｔｌｖ−▲ｉ▼およびｈｔｌｖ−▲ｉｉ▼抗体の同時検出用イムノアッセイ

Info

Publication number: JP2931100B2
Application number: JP5503132A
Authority: JP
Inventors: マーシャルラクロワ; ロバートジェイドワイアー; マーンツライン
Original assignee: BAIOKEMU IMUNOSHISUTEMUZU Inc
Current assignee: BAIOKEMU IMUNOSHISUTEMUZU Inc
Priority date: 1991-07-29
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 1999-08-09
Anticipated expiration: 2014-08-09
Also published as: JPH06509868A; DE69207200D1; ATE132268T1; IL102615A; WO1993003376A1; DE69207200T2; ZA925492B; EP0605433B1; CN1070484A; CA2114220A1; IE922452A1; IL102615A0; PT100731A; AU2340992A; EG20183A; ES2085631T3; PT100731B; EP0605433A1; NZ243636A

Description

【発明の詳細な説明】発明の技術分野本発明は生物学的検体中の次のウイルス:HIV−１、HI
V−２、HTLV−ＩおよびHTLV−IIに対する抗体を同時に
検出するのに用いることができるイムノアッセイキット
に関する。また本発明はこれらのイムノアッセイキット
を製造する方法に関する。

発明の背景ヒトＴ細胞白血病ウイルスサブタイプＩ（HTLV−Ｉ）
は成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）と密接に関連す
るレトロウイルスである〔ポイエッツ（Poiesz）等の、
1980年、「Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.」、77、7415〜7
419〕。またはこのウイルスは熱帯性痙攣性麻痺（parap
aresis）およびHTLV−Ｉ関連脊髄障害（HAM）と称する
神経学的疾病にも関連する〔ゲッサイン（Gessain）等
の、1985年、「Lancet ii」、407〜410〕。ヒトＴ細胞
白血病ウイルスサブタイプII（HTLV−II）は最初にＴ細
胞へアリーセル白血病から単離された〔カリヤナラマン
（Kalyanaraman）等の、1982年、「Science」218、571
〜573〕。このウイルスはヘアリーセル白血病のＴ細胞
変異体に関連する。

成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）は主として日本
の南西地方、カリブ海地域および中央および南アメリカ
地域に発生する。これらの領域では、血清学的流行は一
般的な人口の５〜15％で変動し一層高い年齢のグループ
で30％に達する。米国では、HTLV−I/II感染は主として
静脈内薬物ユーザーに発生する。最近の米国赤十字の調
査〔ウィリアムズ（Williams）等の、1988年の、「Scie
nce」、240、643〜646〕では、HTLV−Ｉに対する抗体が
８つの米国都市で39,898名のランダムな血液ドナーの10
名に検出され；このことは0.025％の血清学的流行率を
示す。北エジプトからの3158名の患者を含める同様の研
究は２名のキャリアの同定を可能にした（0.06％の流行
率）〔エル−ファラッシュ（El−Farrash）等の、1988
年、「Microbiol.Immunol.」、32、981〜984〕。これら
２種の研究では、HTLV−ＩとHTLV−IIとの感染の間の区
別を明瞭に確立できなかった。

また後天性免疫不全症候群（AIDS）、AIDS関連複合体
（ARC）およびプレAIDSはレトロウイルス、特にヒト免
疫不全ウイルス（HIV）により発生すると考えられる。
最初のAIDS関連ウイルス、HIV−１（HTLV−III、LAV−
１およびARVとしても知られる）はよく特徴付けられて
いる。他のHIV−２と称される病原性ヒトレトロウイル
ス（以前はLAV−２）は現在AIDSを患った西アフリカの
患者から単離されている。例えば、PCT出願第WO87/0445
9号を参照。最近HIV−２がHIV−１およびサル免疫不全
ウイルス（SIV）の多数の保存配列を共有することが示
された〔グヤダー（Guyader）等の、1987年、「Natur
e」、326、662〜669〕。

HTLV−ＩおよびHTLV−IIはこれらの形態学的および遺
伝学的構造においてヒト免疫不全ウイルスHIV−１およ
びHIV−２とは異なる。結果として、HIV抗原に対する抗
体はHTLV−ＩおよびHTLV−II抗原と交差反応しない。し
かし、AIDSを患った患者から採取した血清試料はHTLV抗
原と若干の程度の交差反応性を示した〔エックス（Esse
x）等の、1983年、「Science」、220、859〜862〕。

HTLV抗原またはHIV抗原に対する個々の抗体を検出す
るよう設計された診断アッセイの技術において種々の例
が存在する。例えば、サクシンガー（Saxinger）等の、
1984年、「Science」、225、1473〜1476はHTLV−Ｉ抗体
の検出に関するエンザイムイムノアッセイ（EIA）にお
ける免疫吸着剤としてHTLV−Ｉ抗原を使用することを述
べている。他の例はグナン（Gnann）等の、1987年、
「J.Virol.」61、2639〜41の例であり、この例はHIV−
１抗体を検出するのに有効であるといわるれペプチド配
列について述べている。

最近、HTLVおよびHIV抗原に対する抗体を同時に検出
することができる診断キットを提供することがこの技術
において試みられた。例えば、カナダ国特許第1,245,98
2号および欧州特許出願第136,798号明細書にはHTLV−
Ｉ、HTLV−IIおよびHTLV−III（HIV−１）に対する抗体
を同時に検出するためのアッセイキットが記載されてい
る。これらのキットにおいてHTLV抗原はHTLVウイルス粒
子から誘導し、種々の形質転換細胞系から得た。一方、
PCT出願第WO90/08162号にはHTLV−１のエンベロープタ
ンパク質および合成HIVペプチドから誘導した抗原を用
いてHTLV−１、HIV−１およびHIV−２に対する抗体を同
時に検出するイムノアッセイキットが記載されている。

しかし、上述のアッセイはいずれもHTLV−Ｉ、HTLV−
II、HIV−１およびHIV−２に対する抗体を同時に検出す
る感度のよい方法を提供しない。実際に、HIV−１、HIV
−２、HTLV−ＩおよびHTLV−IIに対する抗体を独自に検
出することが単独で考えられる場合でさえも、上述のい
ずれのアッセイも十分に受け入れることができる診断試
験を提供しない。

これらの従来のアッセイは種々の方法において欠点が
ある。いくつかの場合、これらの試験はウイルス全体ま
たは細菌学的に製造した免疫吸着剤を用いる。これらの
調製物の使用は特異性の欠如に悩ませられる−−すなわ
ち、迷惑な陽性結果（falsepositives）−−この理由は
普通多くの非感染患者の血液が調製物において通常見出
される汚染物に対する抗体を含んでいるからである。ま
た迷惑な陽性結果はウイルスでエピトープが共有される
結果として発生し、これらのウイルスはHIVまたはHTLV
に関連せずこれらの調製物中に存在する場合がある。こ
れら従来のアッセイの他の問題点は感度の欠如である。
感度の欠如により汚染された血液が検出されずこれによ
り潜在的に血液製品の容器を感染し診断未確定のHIVま
たはHTLVキャリアにより伝染力が維持される。これら従
来の組み合わせアッセイの感度の欠如はウイルス全体ま
たは細菌学的に製造された調製物を用いる場合のアッセ
イの固体相上のエピトープの低い表面密度のためである
と考えられる。これらおよび他の理由から、HIV−１、H
IV−２、HTLV−ＩおよびHTLV−IIに対する抗体を同時に
検出するアッセイはなお大いに必要とされている。かか
る試験は感染した血液製品が血液銀行に受け入れられず
感染した患者が迅速な初期の処置を求めることを一層良
好に保証する。

発明の開示本発明のアッセイキットは体液の試料中のHIV−１、H
IV−２、HTLV−ＩおよびHTLV−IIに対する抗体を同時に
検出する感度のよい特定の手段および方法を提供するこ
とにより上記概略した問題を解決する。

本発明のアッセイキットは、固形支持体上にコートし
た、HTLV−Ｉ、HTLV−II、HIV−１およびHIV−２に対す
る抗体の同時検出に有用な、ペプチドを含む。

さらに本発明はHTLV−Ｉ、HTLV−II、HIV−１およびH
IV−２に対する抗体の同時検出用アッセイキットを製造
し使用する方法を提供する。

本発明のアッセイキットは少なくとも４種の異なるHI
VおよびHTLVペプチド、２種のHIVペプチドおよび２種の
HTLVペプチドを含む。少なくとも１種のHIVペプチドはH
IV−１に対する抗体を認識することができ少なくとも１
種の他のHIVペプチドはHIV−２に対する抗体を認識する
ことができる。同様に、少なくとも１種のHTLVペプチド
はHTLV−Ｉに対する抗体を認識することができ少なくと
も１種の他のHTLVペプチドはHTLV−IIに対する抗体を認
識することができる。

驚くべきことに、HTLV−ＩおよびIIペプチド、さらに
一層好ましくはそれらを含むカクテルを、まず固形支持
体に添加し、次いでHIVペプチドを、別々にまたは一層
好ましくはカクテルにおいて添加する場合、得られるア
ッセイの感度は著しく改良される。従って、さらに本発
明の目的はHIV−１、HIV−２、HTLV−ＩおよびHTLV−II
に対する抗体の同時検出用アッセイキットを製造する方
法を提供し、このHTLV−ＩおよびIIのペプチド、好まし
くはカクテルの形状で、まず支持体に添加し次にHIV−
１およびHIV−２ペプチドを、さらに好ましくはカクテ
ルとして、支持体に添加する。

本発明のキットは広範な生物学的検体および体液をス
クリーニングするのに用いることができる。これらの試
料には血液、血漿、血清、唾液、尿、涙、ミルクまたは
髄液が含まれる。

本発明のキットおよび方法に有用なHIV−１ペプチド
は式、ａ−Ｘ−ｂ、で表されるペプチドから成る群から
選択し、式中Ｘは：およびその類似体より成る群から選択し；ａはアミノ末端で、１〜８個のアミノ酸、しかし好ま
しくは１〜５個のアミノ酸さらに一層好ましくは１〜３
個のアミノ酸、またはカップリングを促進しあるいはペ
プチドの免疫原性または抗原性の活性を改良するのに効
果的な置換基であり；さらに、ｂはカルボキシ末端で、１〜８個のアミノ酸、しかし
好ましくは１〜５個のアミノ酸さらに一層好ましくは１
〜３のアミノ酸、またはカップリングを促進しあるいは
ペプチドの免疫原性または抗原性の活性を改良するのに
効果的な置換基である。

本発明のキットおよび方法で有用なHIV−２ペプチド
は式、ａ−Ｙ−ｂ、で表わされるペプチドから成る群か
ら選択し、式中Ｙは：およびその類似体より成る群から選択し、a:およびｂは
上記と同様のものである。

本発明のキットおよび方法で有用なHTLV−Ｉペプチド
は式、ａ−Ｚ−ｂ、で表されるペプチドより成る群から
選択し、式中Ｚは：およびその類似体より成る群から選択し;aおよびｂは上
記と同様のものである。

本発明のキットおよび方法で有用なHTLV−IIペプチド
は式、ａ−Ｗ−ｂ、で表されるペプチドより成る群から
選択し、式中Ｗは：およびその類似体より成る群から選択し;aおよびｂは上
記と同様のものである。

各群−−HIV−１、HIV−２、HTLV−ＩおよびHTLV−II
−−からの少なくとも１種のペプチドを本発明のアッセ
イキットおよび方法に用いる。

発明の詳細な説明本発明は、それぞれが、HIV−１、HIV−２、HTLV−Ｉ
およびHTLV−IIに対する抗体を認識し選択的に結合する
エピトープを含む少なくとも４つのペプチドから成るイ
ムノアッセイキットを提供する。

上述したように、これらの４つの群の個々のペプチド
はそれぞれ、式:a−Ｘ−ｂ、ａ−Ｙ−ｂ、ａ−Ｚ−ｂお
よびａ−Ｗ−ｂを有する。各群に１つのメンバーは本発
明のキットおよび方法で用いられる。しかし、本発明は
これらに限定されない。例えば、また少なくとも１つの
群の１種以上のペプチドまたは各群からの種々のペプチ
ドを用いることができる。ペプチドａ−Ｘ−ｂ、ａ−Ｙ
−ｂ、ａ−Ｚ−ｂおよびａ−Ｗ−ｂの各群の少なくとも
１つのメンバーを用いることが全ての場合に必要であ
る。

ここで用いる「類似体」とは記載したペプチド鎖の１
種以上の部位でアミノ酸が挿入し、欠失、置換および修
飾されたものを意味する。

本発明のペプチドのアミノ酸配列に対する好ましい修
飾および置換は保存的なもの（すなわち、ペプチドの二
次構造および水治療の性質（hydropathic nature）に最
小の影響しか及ぼさないもの）である。これらにはデイ
ホッフ（Dayhoff）による「Atlas of Protein Sequence
and Structute」５、1978年およびアルゴス（Argos）
による「EMBO J.」８、779〜785、1989年に記載された
ような置換が含まれる。例えば、次の群:ala、pro、gl
y、glu、asp、gln、asn、ser、thr;cys、ser、tyr、th
r;val、ile、leu、met、ala、phe;lys、arg、his;およ
びphe、tyr、trp、hisの１種に属するアミノ酸は保存的
変化を示す。同様の方法で、メチオニンは、酸化し易い
アミノ酸で、ノルロイシンにより置換することができ
る。また好ましい置換には対応するＬ−アミノ酸につい
てのＤ−アイソマーの置換が含まれる。

この明細書で用いる「アミノ酸」（例えば、ａおよび
ｂの定義で）とはすべての天然アミノ酸、Ｄ−型アミノ
酸、および非天然、合成、ならびにホモシステイン、オ
ルニチン、ノルロイシンおよびβ−バリンのような、修
飾アミノ酸を、含む。

以上に簡単に説明したように、本発明のペプチドを免
疫診断試薬またはワクチンの活性成分として一層有効な
ペプチドを選択するために修飾することはしばしば有用
であり実際に本発明の範囲内である。かかる変更には、
例えば： − 硫酸コハク酸イミド（sulfosuccinimidyl）−４−
（ｐ−マレイミド−フェニル）ブチレートのような異種
二官能架橋剤を用いてペプチドが適当なキャリアにカッ
プリングするのを促進するためにシステイン基を一方ま
たは両方の末端に加えること、かかる結合に影響を及ぼ
す好ましい試薬は硫酸コハク酸イミド−４−（Ｎ−マレ
イミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
トおよびＮ−コハク酸イミド−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネートである； − １〜８個の追加のアミノ酸（好ましくは１〜５、お
よび最も好ましくは１〜３個のアミノ酸）をペプチドの
一方または両方の末端に加え、支持体または一層大きな
ペプチドもしくはタンパク質に結合させるためあるいは
ペプチドの物理的または化学的特性を修飾するために、
相互にペプチドの結合を促進する。かかる変更の例はＮ
−またはＣ−末端チロシン、エステル化反応を介したリ
ンカーとしてのグルタミン酸またはアスパラギン酸およ
びシッフ塩基またはアミド形成を介して結合することが
できるリジンを加えることである。上述のようにかかる
追加のアミノ酸には任意の天然アミノ酸、これらのＤ−
型アミノ酸、および既知の非天然、合成および修飾した
アミノ酸が含まれる；および − ペプチドの一方または両方の末端を、例えば、アシ
ル化またはアミド化により誘導体化すること。これらの
修飾はペプチドの総電荷を変化させさらにペプチドが固
形支持体、キャリアまたは他のペプチドに共有結合する
のを促進することができる。カップリングを促進しペプ
チドの免疫原性および抗原性の活性を改良するのに有効
な置換基の例はC₂〜C₁₆アシル基、ポリエチレングリコ
ールおよびリン脂質である。

本発明のペプチドを調製するために任意の通常のペプ
チド製造方法を用いることができる。これらには合成、
組換えDNA技術およびそれらの組み合わせが含まれる。
本発明者らは固形相合成を用いるのが好ましいと考え
る。この合成法では、樹脂支持体はペプチドの固形相調
製のためにこの技術で通常用いられる適当な樹脂でよ
い。これにはＰ−ベンジルオキシアルコールポリスチレ
ンまたはＰ−メチルベンジルドリルアミン樹脂が好まし
い。第１の保護されたアミノ酸を樹脂支持体に結合させ
た後、アミノ保護基をこの技術で通常用いる標準法によ
り除去する。アミノ保護基を除去した後、残留する保護
されたアミノ酸および、必要なら、側鎖の保護されたア
ミノ酸を、次に、所望の順に結合して選択されたペプチ
ドを得る。あるいはまた、多数のアミノ酸基を樹脂に支
持されたアミノ酸配列を用いて結合する前に溶液法（so
lution methodology）を用いて結合させる場合がある。

適当なカップリング試薬の選択は確立された技術によ
る。例えば、適当なカップリング試薬はＮ、Ｎ′−ジイ
ソプロピル−カルボジイミドまたはＮ、Ｎ′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（DCC）あるいはベンゾトリア
ゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホ
スフォニウムヘキサフルオロホスフェートの単独または
１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下のものが好
ましい。他の有用なカップリング法は保護されたアミノ
酸の予め形成した対称性無水物を用いる。

成長中のポリペプチド鎖に導入される各アミノ酸に用
いられた必要なα−アミノ保護基は９−フルオレニル−
メチルオキシカルボニル（FMOC）が好ましいが、任意の
他の適当な保護基はカップリング条件下に分解せず成長
するペプチド鎖に既に存在する他の任意の保護基の存在
下に容易に選択的に除去されるかぎり用いることができ
る。

側鎖アミノ酸の保護基を選択するための基準は：
（ａ）合成の各工程でα−アミノ保護基の除去について
選択される反応条件下での種々の試薬に対する保護基の
安定性；（ｂ）保護基の有利な特性の保持（すなわち、
カップリング条件下に分離しない）および（ｃ）ペプチ
ド合成の終りにおよびその他の点ではペプチド構造に影
響を及ぼさない条件下で保護基を容易に除去できること
である。

本発明の十分に保護された樹脂で支持されたペプチド
はアニソール、チオアニソール、エチルメチルサルファ
イド、1,2−エタンジチオールおよび関連する試薬のよ
うな適当なスカベンジャーの存在下に室温で１〜６時間
塩化メチレン中の50％〜60％のトリフルオロ酢酸溶液を
用いてＰ−ベンジルオキシアルコール樹脂から切断する
のが好ましい。同時に、最も酸に不安定な側鎖保護基を
除去する。一層酸に抵抗性のある保護基は代表的にHF処
理により除去される。

本発明のペプチドはHIV−１、HIV−２、HTLV−Ｉまた
はHTLV−II関連抗体をこの技術でよく知られた方法によ
り同時に検出するための診断試薬として有用である。こ
れらはELISA、血球凝集、シングルドットおよびマルチ
ドット法ならびにアッセイが含まれる。

本発明の試験キットはエンザイムリンクドイムノソル
ベントアッセイ（ELISA）を含むのが好ましい。この好
ましい例では、本発明のペプチドまたは種々のペプチド
の混合物は固形支持体と同様なもの、例えば、マイクロ
タイタープレートの上に吸着し、あるいは共有結合す
る。驚くべきことに、HTLV−I/IIのペプチド（あるいは
好ましくはそれらの混合物）をまずウエルに添加する場
合、すなわちHIV1/2ペプチドをウエルに添加する前に、
アッセイの感度が著しく高まる。従って、本発明の好ま
しい具体例はキット、およびかかるキットを製造する方
法を含み、これにはHTLV−ＩおよびIIのペプチドの混合
物またはカクテルをまず支持体に結合させて次いでHIV
−１およびHIV−２のペプチド、および一層好ましくは
それらの混合物を支持体に結合させる。

本発明のアッセイおよび方法のために適当な固形支持
体には有機および無機重合体、例えば、アミラーゼ、デ
キストラン、天然または修飾セルロース、ポリエチレ
ン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガロース、
磁鉄鉱、多孔性ガラス粉末、ポリフッ化ビニリデン（po
lyvinyldiene fluoride）〔キナール（Kynar）〕および
ラテックス、試験容器の内壁（すなわち、試験管、タイ
タープレートもしくはガラスのキュベットまたは人工材
料）ならびに固形体（solid body）の表面（すなわち、
ガラスおよび人工材料のロッド、末端が太くなったロッ
ド、末端に丸い突出部または薄板を有するマルチウエル
ロッド）が含まれる。マルチウエルプラスチックマイク
ロタイタープレートが、固形相キャリアとして、特に適
しており、好ましい。

本発明で用いるペプチドおよびその混合物は任意の方
法によりおよび得られるキットの感度および特異性を最
大にするのに効果的な量で固体支持体に適用することが
できる。本発明者らは緩衝液中に溶解した本発明の１種
以上のペプチドを含む溶液と固形支持体を接触させるこ
とが好ましいと考える。この緩衝液はペプチドを溶解し
それらを固形支持体に適用するのに通常用いる任意の緩
衝液でよいが、本発明者らは0.05Mの炭酸ナトリウム−
重炭酸ナトリウム溶液（pH9.6）を用いるのが好ましい
と考える。

緩衝液中のペプチドの濃度はペプチドが固形支持体の
表面に付着するのに効果的な量になるよう十分であるべ
きである。ここで用いるように、「効果的な量」とは固
形支持体上で、生物学的検体中の、HIV−１、HIV−２、
HTLV−ＩまたはHTLV−IIに対するそれぞれの抗体を効果
的に検出するペプチドの量を意味する。

本発明にかかるマイクロタイタープレートのウエルを
コートするのに用いるペプチド溶液は５μg/ml〜10μg/
ml、さらに好ましくは10μg/mlのペプチド濃度を有す
る。かかるペプチド濃度は単一のペプチドが溶液中に存
在するにすぎない場合には単一のペプチドに起因しまた
はカクテルの場合はすべてのペプチドの総濃度に起因す
る。本発明のペプチドカクテルが５μmg/ml〜10μg/ml
の本発明の個々のペプチドを含む溶液を混合することに
より調製することが代表的で好ましい。例えば、２種の
ペプチドのカクテルを調製する場合、ペプチド１の５μ
g/ml〜10μg/mlで選択された容量の溶液をペプチド２の
５μg/ml〜10μg/mlで選択された容量の溶液と混合す
る。得られるカクテルは結果としては５μg/ml〜10μg/
ml、さらに好ましくは10μg/mlの総ペプチド濃度を有す
る。

本発明のペプチドカクテルを製造するのに選定した特
定の容量は結果として得られるアッセイキットをHIV−
１、HIV−２、HTLV−ＩおよびHTLV−IIに対する抗体の
検出における感度および特異性について試験することに
より経験的に決定されることがある。次いでペプチドカ
クテルを形成するのに混合されるペプチド溶液の実際の
容量は結果として得られるアッセイキットで最大の感度
と最大の特異性を達成するために上述のパラメータ内で
個別に変更することができ、これらのペプチドカクテル
は等量の各成分ペプチドを含む必要がないと考えられ
る。実際、本発明者等は、BCH132よりも多いBCH−408お
よびBCH−202ckの各々さらにそれぞれのBCH234およびBC
H416よりも多いBCH456を含むペプチドカクテルを用いる
のが好ましいと考える。

本発明の好適例では、本発明者等はペプチドを固形支
持体に適用する前にHTLVペプチドカクテルを形成するた
めにHTLV−ＩとHTLV−IIのペプチド溶液（５μg/ml〜10
μg/ml、さらに好ましくは10μg/ml）を混合する。同様
の方法で、本発明者らはペプチドを固形支持体に適用す
る前にHTLVペプチドカクテルを形成するためにHIV−１
とHIV−２のペプチド溶液（５μg/ml〜10μg/ml、さら
に好ましくは10μg/ml）を混合するのが好ましいと考え
る。本発明のキットで有用な好ましいペプチド組成は：
（１）BCH−132、BCH−202 ckおよびBCH−408を1:40:60
の比で含HIV−1/2ペプチドカクテルならびに（２）BCH
−234、BCH−416およびBCH−456を1:1:4の比で含むHTLV
−I/IIペプチドカクテルである。本発明の他のアッセイ
キットでのペプチドのこれらの比および濃度は、もちろ
ん、得られるキットの感度および特異性を最大にするよ
うに変更することができる。

通常の方法を用いてペプチド溶液を本発明にかかるウ
エルに接触させる。ウエルが各々個別のペプチドを用い
て別々にコートされる具体例では、本発明者らは代表的
に60μｌの第１のペプチド溶液;120μｌの第２の溶液、
180μｌの第３の溶液および240μｌの第４の溶液を用い
る。これによりウエルの異なる表面が各ペプチドでコー
トされる。本発明者らがHTLVカクテルおよびHIVカクテ
ルを用いる好適例では、上記と同じ理由から、本発明者
らは代表的に120μｌのHTLVカクテルおよび240μｌのHI
Vカクテルを用いる。

ペプチド溶液またはペプチドカクテルが固形支持体と
接触している時間の長さはペプチドまたはペプチドの混
合物の効果的な量が支持材料の表面に付着するのに十分
である必要がある。好ましくは、室温で１時間が十分で
ある。しかし、本発明者らは通常ペプチドとウエルを４
℃で一昼夜接触させる。かかる時間の後、本発明者らは
任意の結合していないペプチドを除去するのが好ましい
と考える。この工程は固形支持体から過剰の液体を除去
するための任意の通常の方法を用いて実施することがで
きる。本発明者らは吸引を用いるのが好ましいと考え
る。吸引後、またウエルをリン酸ナトリウム緩衝液（Na
Cl、0.15M;NaH₂PO₄、0.06M;チメロサル、0.01％および
トゥイーン20、0.05％;pH7.4）のような洗浄緩衝液を用
いて洗浄することできる。しかし、この洗浄工程は必要
ではない。吸引および／または洗浄後、次いで上述した
適用法を繰り返すことにより追加のペプチドまたはその
混合物を支持体に適用することができる。

本発明の他の例では、本発明者らはウエルからの第１
のペプチドまたはカクテルの過剰量をウエルが次のペプ
チドまたはカクテルと接触する前に除去はしない。この
具体例では、本発明者らは各ペプチドまたはカクテルの
ほぼ等量を用いることが好ましいと考える。例えば、単
一のペプチド溶液を個別に用いる場合、本発明者らは60
μｌの第１のペプチドを用いさらに１時間後、60μｌの
第２のペプチド等を添加する。HTLVおよびHIVのペプチ
ドカクテルを用いる場合、本発明者らは120μｌのHTLV
カクテルを用いさらに１時間後120μｌのHIVカクテルを
添加した。追加の時間後、過剰の溶液を除去したウエル
を緩衝液で普通に洗浄した。

所望のペプチドを支持材料に結合させさらに過剰の材
料を除去した後、ウエルを試験すべき生物学的検体で処
理する。この検体は血清であるが血液、血漿、唾液、
尿、涙、ミルクまたは髄液のような他の検体も用いるこ
とができる。また生物学的検体はアッセイ前に検体緩衝
液を用いて希釈することができる。かかる緩衝液の例は
リン酸ナトリウム緩衝液（リン酸ナトリウム、6mM;NaC
l、0.15M;BSA、２％；ペプトン、1.5％；ベンズアミ
ン、80mM;トゥイーン20、１％；熱不活化ヤギ血清、40
％；チメロサル、0.01％、最終pH7.2）である。ウエル
当たりに添加した検体溶液の量はウエルをコートするの
に用いた最大容量の5/6に等しいのが好ましい。例え
ば、ウエルをコートするのに240μｌのペプチド溶液を
用いた場合次に添加すべき検体溶液の量は200μｌが好
ましい。

分析すべき試料に曝した後、好ましくは吸引を用いて
ウエルを空にし、さらに洗浄する。洗浄後、ペルオキシ
ダーゼで標識した抗ヒトIgGまたは抗ヒトIgMをウエルに
添加する。ペルオキシダーゼの測定は代表的に対応する
基質、例えば、３、３′、５、５′−テトラ−メチルベ
ンジジンを用いて行う。この例示したアッセイの有用性
からそれることなく、ペルオキシダーゼを他の標識によ
り、例えば放射能、蛍光、化学ルミネセンスまたは赤外
放射あるいは吸収ラベルにより代えることができる。

本発明のペプチドの合成および利用に関する一般的方
法を次に説明する。

方法1:N−FMOCで保護されたアミノ酸残基を有する樹脂
の調製塩化メチレン（CH₂Cl₂）とジメチルホルムアミド（DM
F）（4:1）との混合物中の所望のＮ−FMOCで保護された
アミノ酸残基を０℃でCH₂Cl₂:DMF（4:1）中のＰ−ペン
ジルオキシアルコール樹脂の懸濁液に添加した。この混
合物を数秒間手動で混合し、次いでＮ、Ｎ′−ジシクロ
ヘキシル−カルボジイミド（DCC）次に４−（ジメチル
アミノ）ピリジンの触媒量を用いて処理した。混合物を
追加の30分間０℃で次いで室温で一昼夜混合した。濾過
した樹脂を連続してCH₂Cl₂、DFMおよびイソプロパノー
ル（各３回洗浄）ならびに最後に、CH₂Cl₂で洗浄した。
この樹脂をCH₂Cl₂中で懸濁させ、氷浴中で冷し再蒸留し
たピリジン次に塩化ベンゾイルをこの混合した懸濁液に
添加した。混合は０℃で30分間維持し次に室温で60分間
維持した。濾過した後、この樹脂を高真空下で一定の重
量にまで乾燥する前に連続してCH₂Cl₂、DMFおよびイソ
プロパノール（各３回洗浄）ならびに最後に、石油エー
テル（２回）で洗浄した。

マイエンホッファー（Meienhofer）等（「Int.J.Pept
ide Protein Res.」、13、35、1979年）に従った置換基
の分光測光法による測定は樹脂上の置換の程度を示す。

方法2:連続したアミノ酸のカップリングＮ−FMOCで保護された第１のアミノ酸残基を有する樹
脂をバイオサーチ9600ペプチドシンセサイザーの反応容
器に配置し次のように処理した：１）DMFで洗浄した（各々20秒間で４回）２）DMF中のピペリジンの30％溶液で予め洗浄した（３
分）３）DMF中のピペリジンの30％溶液で保護を解除した
（７分）４）DMFで洗浄した（各々20秒間で８回）５）遊離アミノ基をチェックした−カイザー試験（陽性
である必要がある）６）次にペプチド樹脂を所望のFMOCで保護されたアミノ
酸の８等量およびすべてを16等量の４−メチルモルフォ
リンを含む乾燥し再蒸留させたDMFに溶解した１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾールならびにベンゾトリアゾール
−１−イルオキシ−トリス（ジメチル−アミノ）ホスホ
ニウムヘキサフルオロホスフェートと共に１または２時
間緩徐に振盪させた７）DMFで洗浄した（各々20秒間で６回）工程７の後、アリコートをニンヒドリン試験用に採取
した。試験が陰性の場合、次のアミノ酸のカップリング
のために工程１に戻る。試験が陽性あるいはわずかに陽
性である場合、工程６および７を繰り返す必要がある。

本発明に記載したペプチドの各アミノ酸をカップリン
グさせるために上記機構を用いることができる。またFM
OCを用いたＮ−保護を合成中に残留するアミノ酸と共に
用いることができる。

放射性元素で標識したペプチドを上記カップリング法
を用いてトリチウム化したアミノ酸の結合により調製す
ることができる。

最後のアミノ酸の添加後、Ｎ−末端残基のＮ−FMOCを
上記機構の工程１〜７に戻すことにより除去する。ペプ
チド樹脂をCH₂Cl₂を用い洗浄しさらに粗製の保護された
ペプチドが得られるまで真空中で乾燥する。

方法3:樹脂からのペプチドの保護の解除および切断保護されたペプチド樹脂を、2.5％のエタンジチオー
ルおよび2.5％のアニソールを含む、CH₂Cl₂中にトリフ
ルオロ酢酸（TFA）を55％含む溶液に懸濁させた。混合
物をN₂を用いてフラッシュし室温で、1.5時間混合し
た。混合物を濾過しこの樹脂をCH₂Cl₂を用いて洗浄し
た。さらに樹脂をCH₂Cl₂中の20％TFAを用いて室温で５
分間処理した。混合物を濾過しこの樹脂をCH₂Cl₂中の20
％TFAを用いて洗浄しさらにCH₂Cl₂を用いて洗浄した。
組み合わせた濾液を35℃未満で真空状態で蒸発させ乾燥
したジメチルエーテルと共に残留物を数回粉砕した。固
体を10％の酢酸水溶液に溶解し凍結乾燥して粗生成物を
得た。

argおよびcys残基を含むペプチドをアニソールおよび
酸化ジメチルの存在下に０℃で１時間HFで処理すること
によりさらに保護を解く。これらのペプチドを10％の酢
酸水溶液を用いて抽出し、ジメチルエーテルを用いて洗
浄しさらに凍結乾燥して粗ペプチドを得た。

方法4:ペプチドの精製粗ペプチドをC₁₈またはC₄逆相のVydacカラム（2.5×2
5mm）上で移動相の勾配を用いた調製HPLCにより精製し
た。流出液を220nmで監視し次いで分析HPLCにかけた。
適切な画分をプールし、蒸発させ凍結乾燥させた。合成
ペプチドの確認を分析逆相クロマトグラフィーおよびア
ミノ酸分析により行った。

方法5:エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ
（ELISA）によるHIV−１、HIV−２、HTLV−ＩまたはHTL
V−IIに対する抗体の同時検出合成ペプチドを約５μg/ml〜約10μg/mlのペプチド濃
度を有するペプチド溶液を形成するように0.05Mの炭酸
ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）中で可
溶化した。次に２種のペプチドカクテルをこれらの個別
のペプチド溶液の容量を混合することにより調製した。
第１のカクテルはHTLV−ＩおよびHTLV−IIに対する合成
ペプチドを含んでいた。第２のカクテルはHIV−１およ
びHIV−２に対する合成ペプチドを含んでいた。各々の
カクテルの総ペプチド濃度は５μg/ml〜10μg/mlであっ
た。

HTLV−I/IIカクテルをまずウエルに添加した。次い
で、HIV−1/2ペプチドカクテルを支持体に結合させた。
次の例において、まず120μｌのHTLV−I/II誘導合成ペ
プチドカクテルを各々のウエルに添加しこれらのプレー
トを４℃で一昼夜インキュベーションした。次にウエル
を空にし240μｌのHIV−1/2誘導合成ペプチドカクテル
で満たした。これらのプレートを４℃で一昼夜インキュ
ベーションした。本発明者らはオイスターベイバーサフ
ィルディスペンジングシステムを用いてウエルを満たし
た。これらのウエルを吸引により空にし洗浄緩衝液（Na
Cl、0.15M;NaH₂PO₄、0.06M;チメロサル、0.01％および
トゥイーン20、0.05％;pH7.4［0.3ml/ウエル］）を用い
て２回洗浄した。次にウエルを37℃で１時間9.35mlの洗
浄緩衝液で飽和させトゥイーン20を除いた同一の緩衝液
で１回洗浄した。空のプレートを37℃で１時間乾燥させ
用いるまで真空密封（vacuum seal）する。

分析すべき血清試料を検体緩衝液（リン酸ナトリウ
ム、6mM;NaCl、0.15M;BSA、２％；ペプトン、1.5％；ベ
ンザミジン、80mM;トゥイーン20、１％；熱不活性化ヤ
ギ血清、40％；チメロサル、0.01％、最終pH7.2）を用
いて希釈しさらに希釈した血清試料（0.2ml）をウエル
に添加した。充填したウエルを室温で30分間インキュベ
ーションした。次いでこれらのウエルを空にして洗浄緩
衝液を用いて５回洗浄した。

トリス、0.05M;NaCl、0.5M;トゥインー20、0.05％；
チメロサル、0.01％、（pH7.2）を含む溶液中の１％のW
/Vのウシ血清アルブミンで希釈したコンジュゲート溶液
（ヒトIgGに対するペルオキシダーゼで標識しアフィニ
ティで精製したヤギ抗体、5mlの50％グリセロール中の
0.5mg）を各々のウエルに添加（0.2ml）して室温で30分
間インキュベーションした。次にウエルを空にし洗浄緩
衝液で５回洗浄した。酢酸緩衝液（0.1M;pH5.6）中の基
質溶液〔Ｎ−メチルピロリドン（NNP）中の2mg/mlの
３、３′、５、５′−テトラ−メチル−ベンジジン〕を
0.015V/V％の30％H₂O₂を含む５容量のペルオキシド溶液
で希釈し各々のウエルに添加（ウエル当たり0.2ml）し
た。30分後、各ウエルの中身を0.1mlの1N H₂SO₄で処理
し光学強度を450nmで測定した。すべての測定は２回行
った。

上述したように連続した方法を用いて、以下に述べる
特定のペプチドを調製し次にHIV−１、HIV−２、HTLV−
ＩおよびHTLV−II特異的抗体を検出するそれらの能力に
ついて評価した。

実験１この実験で、HTLV−ペプチドカクテルは10μg/mlの総
ペプチド濃度を有しBCH−219、BCH−234およびBCH−416
の1:1:1の比の混合物から成り、各ペプチドはまず10μg
/mlの濃度にまで方法５に記載の炭酸ナトリウム緩衝液
において可溶化した。上述したように、120μｌのこのH
TLV−I/II合成ペプチドカクテルを各ウエルに添加し４
℃で一昼夜インキュベーションした。ウエルを空にし24
0μｌのHIV−1/2ペプチドカクテルを添加した。このHIV
−1/2カクテルを３容量のBCH−408ペプチド溶液（10μg
/ml）と２容量のBCH−202ck溶液（10μg/ml）とを混合
することにより形成して10μg/mlの総ペプチド濃度を有
し、3:2の比でBCH−408およびBCH−202ckを含むカクテ
ルを得た。

この第２のカクテルに存在するペプチドの吸着および
プレートのさらなる処理を方法５に記載したように行っ
た。また２種の連続したプレートを120μｌの各ペプチ
ドカクテルを用いて調製した（すなわち、HIV−1/2誘導
合成ペプチドのためのものおよびHTLV−I/II誘導合成ペ
プチドのためのもの）。これらのプレート（HIV−EIAお
よびHTLV−EIA）をHTLV/HIVの組み合わせプレート（組
み合わせたHIV/HTLV−EIA）と共にサイドバイサイド研
究に用いて血液血清試料中のHIVおよびHTLVに対する抗
体を検出するそれらの能力について比較した。表１には
この比較を示す。

表１の結果は切断に対する信号の比を示す。切断は0.
10の値を加えた３種の正常血液ドナーから取り出した血
漿試料を用いて得た平均吸光度である。比≧1.0は陽性
の試料を示す。

表１中で「NC」と表示された試料はHIV−1/2陰性およ
びHTLV−I/II陰性として証明された患者から得た陰性の
対照であった。「PC」と表示された試料はそれぞれHIV
−１のみ陽性、HIV−２のみ陽性、HTLV−Ｉのみ陽性お
よびHTLV−IIのみ陽性として証明された患者から得た陽
性の対照であった。「A02」（１〜25）、「Ｃ」（20〜2
5）および「Ｇ」（80〜86）と表示された試料はボスト
ンバイオメディカインコーポレーション（BBI）から得
た。これらの状態はBBIにより決定された。「Ind.」は
未確定のウエスタンブロットプロファイルを示す。「HI
V−1 seroc.」はこれらの血漿試料をHIV−１に感染した
と遡及的に考えられるドナーから連続して収集したこと
を示す。これらの患者はHIV−１に対する抗体をこれら
の同一の抗体について陰性である試験の後数週間生産し
た。試料は年代順に番号を付ける。

一般に、HIV/HTLVの組み合わせたプレートを用いて測
定した切断に対する信号の比をHIV−ペプチドのみで別
々にコートしたプレートを用いてあるいはHTLV−ペプチ
ドのみで別々にコートしたプレートを用いて測定したも
のと比較する。このことは驚くべき結果である。この理
由は有意な信号の減少が所定の抗体を認識するエピトー
プの希釈に際し考えられるからである。同時感染HIV/HT
LV試料、すなわち、A02−４の場合、HIV/HTLVプレート
を用いて記録した切断に対する信号の比（＞12）はHIV
−ペプチドのみでコートしたプレート上で測定したもの
（2.95）より有意に高い。

抗体HIV−１陰性から抗HIV−１陽性までの患者Ｃおよ
びＧのHIV−１血清交換はHIV−プレートおよび組み合わ
せたHIV/HTLV−プレート上で同時に検出される。

組み合わせたHIV/HTLV−プレートはHTLV−プレートと
同様に処理するが、種々の場合（試料A02−３、A02−1
3、およびA02−17）においてHTLV−IIに対する抗体を含
む試料は組み合わせたHIV−HTLVまたは単独のHTLVプレ
ートのいずれにも陽性として検出されなかった。このよ
うにして他のカクテルはHTLV−抗体に対する感度を改良
する試みでアセンブルされ試験された。

実験２この実験は先のものと極めて類似している。２種のペ
プチドカクテルの組成を次に示す:HTLVペプチドカクテ
ルは10μg/mlの総ペプチド濃度を含み1:1:4の比でBCH−
234、BCH−416およびBCH−456から成る。HIV−ペプチド
カクテルは５μg/mlの総ペプチド濃度を含みBCH−132、
BCH−202ckおよびBCH−408の1:40:60の比で構成され
る。これは個々の10μg/mlのペプチド溶液を用いて調製
された。HIV−ペプチドカクテルは５μg/mlの総ペプチ
ド濃度を含みBCH−234、BCH−202ckおよびBCH−408を1:
40:60の比で構成される。これは個々の５μg/mlのペプ
チド溶液を用いて調製された。表２はこれらのペプチド
でコートされたウエルで得られた結果を示す。

表２に示した結果は新規なペプチド組成物がHTLV特異
性抗体に対する感度を著しく改善することを示す。例え
ば、試料A02−３は新規なペプチド混合物により0.69
（表１）から1.08まで変化する。実験１で用いたカクテ
ルで低い陽性結果（1.02〜1.70）を示す８種の試料は実
験２に記載したペプチドカクテルで強い陽性の切断に対
する信号の比（1.93〜9.79）を与えた。

またHIV−抗体検出に対する感度はより少ない程度で
あるが改良された。最も注目すべきことは試料Ｃ−22の
0.60から0.89の切断に対する信号の比の増加である。か
かる増加はこの試料を「境界線上の陰性」として分類す
る。多数の研究所では境界線上の陰性試料がさらなる試
験に対し制限されこのようにして陽性として検出される
一層大きな機会を有する。

他の一連の試験は同一のペプチド比を有するプレート
を用いて行われさらにそれらの感度および特異性を評価
するために実験２に記載されたようにした。次の表3aお
よび表3bは得られたデータを要約する。

これらの結果はこのアッセイキットにより示された印
象的な感度を示す。表3aには、HIV−１、HIV−２、HTLV
−ＩおよびHTLV−IIに対する抗体を含むすべての試料が
組み合わせたHIV/HTLV試験キットにより正確に陽性であ
ることが検出された。これらの試料にはHIV−１に対す
る抗体の極めて低い濃度を含む血清試料の低いタイター
パネルを含んでいた。

表3bはこのアッセイキットにより証明された驚くべき
特異性を例示する。スクリーニングした1295種の試料
中、１種に迷惑な陽性が確認されるにすぎない。この程
度の特異性は約99.5％の受け入れることができる程度よ
りも有意に好ましい。

本発明者等は上記に本発明の多数の具体例を示すが、
本発明者らの基本的構成を変更し本発明の方法および組
成を用いる他の具体例を提供することができる。従っ
て、本発明の範囲は上記に例を用いて特定の具体例によ
るよりは以下に添付した請求項によって規定されると考
えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ドワイアーロバートジェイカナダ国エイチ７ティー２エル１ケベックラヴァルスイート 600 ダニエルジョンソンブールバード 2550 バイオケムファルマインコーポレイテッド内 (72)発明者ツラインマーンカナダ国エイチ７ティー２エル１ケベックラヴァルスイート 600 ダニエルジョンソンブールバード 2550 バイオケムファルマインコーポレイテッド内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/569

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】固形支持体に結合し、ペプチド基式がａ−
Ｘ−ｂ、ａ−Ｙ−ｂ、ａ−Ｚ−ｂおよびａ−Ｗ−ｂ、式
中：Ｘを次のおよびその類似物より成る群から選択し；Ｙを次のおよびその類似物より成る群から選択し；Ｚを次のおよびその類似物より成る群から選択し；ａはアミノ末端で、１〜８個のアミノ酸またはカップリ
ングを促進しあるいはペプチドの免疫原性または抗原性
の活性を改良するのに効果的な置換基であり；さらに、ｂはカルボキシ末端で、１〜８個のアミノ酸またはカッ
プリングを促進しあるいはペプチドの免疫原性または抗
原性の活性を改良するのに効果的な置換基である、各々
の４種の群のペプチドの少なくとも１種のペプチドを含
むHIV−１、HIV−２、HTLV−ＩおよびHTLV−IIに対する
抗体を同時に検出するイムノアッセイキット。
【請求項２】ペプチドを固形相合成により作成したこと
を特徴とする請求項１記載のキット。
【請求項３】固形支持体に結合したHIV−１ペプチド
が：でありさらに固形支持体に結合したHIV−２ペプチド
が：であることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項４】固形支持体に結合したHTLV−１ペプチド
が：でありさらに固形支持体に結合したHTLV−IIペプチド
が：であることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項５】固形支持体がマルチウエルプラスチックマ
イクロタイタープレートであることを特徴とする請求項
１に記載のキット。
【請求項６】次の工程：（ａ）第１にHTLV−ＩおよびHTLV−IIペプチドを固形支
持体に結合し：（ｂ）次にHIV−１およびHIV−２ペプチドを固形支持体
に結合することから成る請求項１に記載のイムノアッセ
イキットを製造する方法。
【請求項７】前記HTLV−Ｉペプチド、前記HTLV−IIペプ
チド、前記HIV−１ペプチドおよび前記HIV−２ペプチド
をまず0.05Mの炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝
液で希釈して固形支持体に結合させる前にそれぞれHTLV
−Ｉペプチド溶液、HTLV−IIペプチド溶液、HIV−１ペ
プチド溶液およびHIV−２ペプチド溶液を得ることを特
徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記HTLV−Ｉペプチド溶液、HTLV−IIペプ
チド溶液、HIV−１ペプチド溶液およびHIV−２ペプチド
溶液が各々５μg/ml〜10μg/mlのペプチド濃度であるこ
とを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記HTLV−ＩおよびHTLV−IIペプチド溶液
を混合して固形支持体に結合させる前にHTLVペプチドカ
クテルを得ることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】前記HTLVペプチドカクテルが５μg/ml〜
10μg/mlの総ペプチド濃度を有することを特徴とする請
求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記HIV−１およびHIV−２ペプチド溶液
を混合して固形支持体に結合させる前にHIVペプチドカ
クテルを得ることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１２】前記HIVペプチドカクテルが５μg/ml〜1
0μg/mlの総ペプチド濃度を有することを特徴とする請
求項11に記載の方法。
【請求項１３】次の工程：（ａ）固形支持体に生物学的検体を適用し；（ｂ）固形支持体から過剰の生物学的検体を除去し；（ｃ）コートした固形支持体を洗浄し；（ｄ）洗浄した固形支持体を適当な標識で処理し；（ｅ）固形支持体上の標識の存在をアッセイすることを
特徴とする請求項１に記載のイムノアッセイキットを用
いる方法。
【請求項１４】前記生物学的検体を血液、血漿、血清、
唾液、尿、涙、ミルクおよび髄液より成る群から選択す
ることを特徴とする請求項13に記載の方法。
【請求項１５】前記生物学的検体が血清であることを特
徴とする請求項13に記載の方法。
【請求項１６】前記生物学的検体を固形支持体に適用す
る前にまず検体緩衝液を用いて希釈することを特徴とす
る請求項13に記載の方法。
【請求項１７】工程（ｂ）を吸引により実施することを
特徴とする請求項11に記載の方法。
【請求項１８】前記標識がペルオキシダーゼで標識した
抗ヒト免疫グロブリンＧまたはペルオキシダーゼで標識
した抗ヒト免疫グロブリンＭであることを特徴とする請
求項11に記載の方法。