MXPA03006263A

MXPA03006263A - Peptidos que representan afinidad con la proteina viral gp120, y usos para estos peptidos.

Info

Publication number: MXPA03006263A
Application number: MXPA03006263A
Authority: MX
Inventors: Veas Francisco
Original assignee: Commissariat Energie Atomique
Priority date: 2001-01-23
Filing date: 2002-01-21
Publication date: 2005-04-29
Also published as: CN1487951A; FR2819809A1; DE60221805D1; IL156799A; CN1304421C; ATE370160T1; FR2819809B1; KR100910199B1; AU2002233424B2; ES2291439T3; IL156799A0; US7374875B2; WO2002059146A3; WO2002059146A2; ZA200305576B; DK1368372T3; JP4307838B2; US20060121538A1; JP2004535366A; EP1368372B1

Abstract

La presente invencion se refiere a una familia de peptidos que presentan gran afinidad y especificidad a la proteina viral gp120, a metodos para producir estos peptidos, 5 y al uso de estos peptidos. El peptido de la presente invencion se caracteriza en que comprende la siguiente secuencia (A): TPA - P1 - Cis - P2 - CIS - P3 - Cis - Ala o Gln - Gly o (D) Asp o Ser - Ser o His o Asn - XaaJ - Cis Thr o Ala - Cis - Xaak - NH2 donde TPA representa acido tiopropionico, XaaJ representa ??- naftilalanina, fenilalanina o difenilalanina, Xaak representa Gly, Val o Ileu, P1 representa 3 a 6 aminoacidos, P2 representa 2 a 4 aminoacidos y P3 representa 6 a 10 aminoacidos, donde los aminoacidos en P1, P2 y P3 son naturales o no naturales, identicos o diferentes, y donde P1, P2 y P3 posiblemente poseen una secuencia comun, donde el peptido presenta una conformacion de horquilla ?? donde el giro ?? esta formado por residuos de los aminoacidos Ala o Gln - Gly o DAsp o Ser-Ser o His o Asn - XaaJ de su secuencia (A). Puede utilizarse para producir un producto medicinal, una vacuna y una columna cromatografica, y para realizar muestreos.

Description

PÉPTIDOS QUE PRESENTAN AFINIDAD CON LA PROTEÍNA VIRAL GP120, Y USOS PARA ESTOS PÉPTIDOS CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una familia de péptidos que presentan alta afinidad y especificidad para la proteina viral gpl20, a métodos para producir estos péptidos, y a los usos para estos péptidos. La proteina viral gpl20 es una glucoproteina de la envoltura del virus de inmunodeficiencia. Está implicada en el primer paso del ciclo de replicación del virus, es decir, en el paso que consiste en que la envoltura del virus reconoce la proteina CD4 de la membrana del linfocito, y en la fusión de la membrana para internalizar la nucleocápsida. De hecho, es la proteina más externa del lugar en que la envoltura del virus reconoce la proteina CD4. Existen muchos virus de inmunodeficiencia que comprenden una proteina de envoltura similar a la proteina viral gpl20. Entre estos, cabe mencionar el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , el virus de inmunodeficiencia simia (VIS) , el virus de inmunodeficiencia ovina (VIO) , el virus de inmunodeficiencia bovina (VIB) y el virus de inmunodeficiencia felina (VIF) . Algunos péptidos de la presente invención son capaces de unirse a la proteina viral gpl20 de la envoltura viral, y de inhibir la unión de la proteina viral gpl20 cib el receptor CD4, con valores CI50 de entre 0.1 y 400 nM, dependiendo de su secuencia. Algunas de estas moléculas con capaces de inhibir la infección de linfocitos con el virus VIH con, por ejemplo, una DE50 (dosis efectiva al 50%) de entre 100 y 900 nM. Además, la unión de estas moléculas con la proteina viral gpl20 recombinante induce una variación conformacional en ésta que desenmascara nuevos epitopos, con la misma efectividad que la molécula soluble CD$. los péptidos de la presente invención pueden tener aplicaciones terapéuticas y para vacunas. También hacen posible diseñar nuevas moléculas útiles, por ejemplo, en la detección, y también en la purificación, de la proteina de la envoltura del VIH y en el descubrimiento de nuevos fármacos anti-SIDA. TÉCNICA ANTERIOR Se han realizado muchos estudios con el fin de hallar tratamientos efectivos y formas para prevenir la infección con un virus de inmunodeficiencia, y en particular el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) . Las principales dificultades se refieren al desarrollo de vacunas y de tratamientos inmunoterapéuticos efectivos. Esto se debe, en particular, a la variabilidad del virus, y a la dificultad para comprender el mecanismo de su entrada a las células blanco y de la reacción inmunológica necesaria para protegerse contra la infección del virus.

En la siguiente descripción, las referencias entre paréntesis cuadrados se refieren a los documentos en la lista de referencias anexa a la presente. Como se ha demostrado mediante análisis de la estructura tridimensional del complejo CD$-gpl20 [1] (ver referencias anexas) , los elementos estructurales de CD4 esenciales para su unión con la glucoproteina viral gpl20 incluyen los aminoácidos Gly38, Gln40, Gly41, Ser42, Fe43 y Thr45, que están incluidos en la región 36-47, y arginina-59 de CD4. La región 36-47 de CD4 ha sido comparada con la región CDR2 de inmunoglobulinas, y presenta una estructura ordenada de horquilla. Esta estructura está formada por una hoja ß (C ) , correspondiente a la secuencia 36-40, seguida por un giro correspondiente a la secuencia 40-43 que permite una segunda hoja ß (C") , correspondiente a la secuencia 43-47, para formar, con la primera, una estructura de hoja ß antiparalela. Esta estructura se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno entre los nitrógenos de las amidas de los residuos Gly38, Gln40, Fe43, Thr45 y Gly47 de la primera hoja p y el oxigeno de los carbonilos de los residuos Thr45, Fe43, Gln40, Gly38 e Ile36, respectivamente, de la segunda hoja ß. Esta estructura en horquilla juega un papel central en la interacción de CD4 con la proteina viral gpl20, y desempeña una doble función. En primer lugar, permite que los aminoácidos Gly38, Gln40, Gly41, Ser42, Fe43 y Thr45 formen una superficie molecular complementaria a la superficie de interacción de la proteina viral gpl20 y, en particular, permite que la cadena lateral de Fe43 se inserte en la entrada de una cavidad hidrófoba en la superficie molecular de la proteina viral gpl20; en segundo lugar, permite una interacción del tipo lámina ß entre las estructuras polipéptidas de la hoja ß C" de CD4 y la hoja ß15 (residuos 365-368) de la proteina viral gpl20. La arginina 59 (Arg59) también desempeña una función crucial en la interacción CD4-gpl20, puesto que el grupo guanidina de su cadena lateral forma un doble puente de hidrógeno con la cadena lateral del residuo Asp368 de la proteina viral gpl20, permitiendo la estabilización de la interacción de tipo hoja ß entre la hoja C" de CD4 y la hoja ß15 de la proteina viral gpl20. Experimentos de mutagénesis dirigidas a sitios han demostrado que todos estos residuos de CD4 juegan un papel crucial en la interacción con la proteina viral gpl20 [2], [3]. La reproducción de esta estructura de horquilla ordenada y de la conformación de las cadenas laterales de sus residuos es esencial en una molécula que debe fijarse a la proteina viral gpl20 en el sitio de interacción de CD4. Esto queda demostrado por el hecho de que los constructos de péptidos simples, como un péptido lineal correspondiente a la secuencia 37-53 y un péptido cíclico correspondiente a la secuencia 37-46 de CD4, no posean una afinidad mensurable para la proteina viral gpl20 [4] . La infección con VIH de linfocitos CD4 es mediada por una interacción de alta afinidad entre la envoltura viral y CD4. Los experimentos consistentes en mutagénesis y en competencia con anticuerpos permitieron ubicar la superficie de contacto con la proteína viral gpl20 de la envoltura viral, en el dominio DI de CD4. Recientemente se resolvió mediante cristalografía la estructura tridimensional de una forma recombinante de la glucoproteína gpl20 que es funcional pero en la que se han eliminado los giros V1-V2-V3 y las regiones terminales N y C, en un complejo con dominios D1D2 de CD4 y con el fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal [1] . En esta estructura, CD4 interactúa con una gran depresión en la superficie molecular (800 Á2) de la proteína viral gpl20, utilizando una gran superficie molecular (742 Á2) , que está centrada alrededor de la región que se comparó con la región CDR2 de inmunoglobulinas . En el centro de la depresión molecular se abre una cavidad estrecha y profunda de la proteína viral gpl20, llamada "cavidad Fe43", cuya entrada está ocupada por la cadena lateral de Fe 3, en la parte superior de la región CDR2 de CD4. La resolución de esta estructura confirma los datos precedentes de mutagénesis, lo cual indica que el residuo Fe43 y toda el giro CDR2 son funcionalmente muy importantes, y propone a este último como un posible blanco para inhibir la unión de viriones VIH-1 a células. La interacción gpl20-CD4 permite al virus unirse a la membrana de las células blanco y representa la primera interacción proteina-proteina en el mecanismo de infección. Sin embargo, se requieren otros co-receptores para una entrada efectiva de VIH a células. Estos son CXCR-4 [5], [6], que está implicado en la entrada de las cepas virales linfotrópicas (X4), y CCR-5 [7], [8], implicado en la entrada de cepas M-trópicas (R5) y de la mayoría de los aislados primarios . Varias evidencias indican que la unión de la proteina viral gpl20 con CD4 podría producir variaciones conformacionales en la glucoproteína de la envoltura, que podrían exponer nuevos sitios, detectables mediante anticuerpos específicos, llamados CD4i, e incrementarían la afinidad de la envoltura para los receptores de quimiocina [9], [10], los co-receptores para la entrada. Luego de la unión de CD4 y del co-receptor mediante la proteína viral gpl20, otras variaciones conformacionales producirían una reorganización estructural de gp41, lo cual resultaría en la exposición de su péptido fusogénico, y luego a la fusión de las membranas viral y celular y, finalmente, con la entrada de la carga viral a la célula. La estructura cristalográfica de la proteína viral gpl20, formando un complejo con CD4, ha permitido elucidar uno de los mecanismos que utiliza el VIH para invadir el sistema inmunológico. Ya se sabía que la proteína de envoltura gpl20 posee regiones hipervariables y fuertemente glucosiladas . De hecho, la estructura cristalográfica demuestra que las regiones hipervariables y regiones altamente glucosiladas forman la superficie molecular expuesta de la proteina viral gpl20, que también corresponde a la superficie accesible de los viriones. Se conservan sólo unas cuantas regiones de la superficie molecular de la proteina viral gpl20, y puede ser el blanco de anticuerpos. Estas regiones normalmente no son accesibles, y probablemente están protegidas por los giros hipervariables (V1-V2-V3) que, en la proteina cristalizada, han sido eliminados y por consiguiente son invisibles. Una de estas regiones es una superficie cercana al lugar de interacción para receptores de quimiocina, y accesible a los anticuerpos CD4i, luego de que la envoltura se une a CD4. El sitio de unión CD4 es otra superficie expuesta y conservada: sin embargo, esta superficie está presente en una cavidad de la proteina viral gpl20, y por consiguiente no es accesible a anticuerpos, aunque puede acomodar CD4, que posee un solo dominio de inmunoglobulina, a diferencia de los anticuerpos, que utilizan dos dominios para el reconocimiento molecular. Los medios actualmente disponibles para reconocer la proteina de envoltura (gpl20) son limitados. Éstas son los anticuerpos CD4i [11], [12], [13], que son capaces de unirse a un amplio espectro de envolturas primarias; sin embargo, su afinidad con la envoltura viral es baja y sólo se incrementa en la presencia de CD4, lo que significa que no pueden utilizarse fácilmente. Se piensa que otros anticuerpos, como IgGlbl2, F105 o 15e, no son capaces de reconocer todos los aislados primarios. Una molécula CD4 marcada con biotina también podría representar una solución. Esta molécula está comercialmente disponible (Intracel). Desafortunadamente, es costosa y sus propiedades funcionales de unión con la proteina viral gpl20 disminuyen grandemente (a una centésima parte) por la reacción de biotinilación, lo que limita grandemente su uso . La inhibición de la interacción de la proteina viral gpl20 con el receptor principal de entrada, CD4, con un CD4 recombinante soluble o con quimeros que contienen dominios CD4, fue uno de los primeros enfoques terapéuticos sugeridos y experimentalmente investigados para inhibir la infección de VIH-1. Estas moléculas son efectivas in vitro para inhibir la infección viral solamente en el caso de cepas adaptadas en laboratorio, aunque son inefectivas en el caso de muchos aislados primarios. La rápida degradación in vivo de estos constructos derivados de CD4, y su menor afinidad con la envoltura primaria de los aislados primarios, fueron propuestas como causas principales de su inefectividad. No obstante, los estudios han demostrado que la afinidad, en el caso de CD4, de gpl20 recombinantes monómeras de ciertos aislados primarios, no es significativamente distinta de la afinidad de gpl20 derivadas de especies de laboratorio. La naturaleza oligomérica de la proteina viral gpl20 en la superficie viral, la densidad y estructura de CD4 en la superficie de las células permisivas, y posiblemente la presencia de otras interacciones moleculares hasta ahora no elucidadas claramente, o de otras moléculas secundarias para la entrada, podrían jugar un importante papel en el mecanismo de entrada, además de representar otras causas para la inefectividad de las proteínas CD4 solubles como antagonistas de entrada. El desarrollo de agentes virales que tengan como blanco la proteína viral gpl20 representa un importante desafío, debido a la gran variabilidad genética de la proteína de la envoltura, un factor que podría explicar la inefectividad de muchos inhibidores de la proteína viral gpl20. No obstante, el hecho de que los residuos que contribuyen a la formación del núcleo del sitio de unión de la proteína viral gpl20 para CD4 estén hechos de residuos muy conservados sugieren que los inhibidores de la proteína viral gpl20 podrían ser efectivos contra un amplio espectro de aislados VIH-1. Se han propuesto constructos péptidos derivados de CD4 como inhibidores de la infección viral: son un péptido mimético estructural del giro CDR2 de CD4 que incorpora un grupo fenilo que imita el Fe43 [14] y un péptido cíclico que corresponde al giro CDR3 de CD4 y que incorpora residuos aromáticos adicionales [15] . Sin embargo, estos constructos presentan baja actividad antiviral limitada a un aislado en laboratorio y, aún cuando fueron inicialmente diseñados como imitadores estructurales de CD4, no son activos en el paso de entrada [16] . Se ha propuesto cierto número de inhibidores de la interacción gpl20-CD4 y tienen una aplicación clínica. Son, por ejemplo, una gran proteína recombinante formada por la fusión genética de los dominios D1D2 de CD4 con los dominios constantes de una inmunoglobulina IgG2 [17] . Este constructo PR0542 está en fase clínica 1/11. Esta gran proteína recombinante parece ser bien tolerada por el cuerpo humano, aunque su efectividad depende de una alta dosis circulante difícil de obtener. Se han propuesto moléculas menores como inhibidores de la interacción gpl20-CD4, y están en la fase de pruebas clínicas. Son: un tinte bisazo FP21399 [18], identificado por un enfoque combinatorio, el oligonucleótido fosforotioato zintevir (AR177) [19], un polímero con base de natalenosulfonato, PRO2000 [20] y un derivado de almidón, dextrina 2-sulfato (D2S) [21], que inhiben los aislados químicos VIH-1 en cultivos de células, aunque requieren de altas concentraciones. Entre los inhibidores de entrada, también está SPC3 [22] , un constructo de péptido sintético multirramificado que, inicialmente propuesto como inhibidor de la interacción CD4-gpl20, demostró posteriormente ser activo en un paso luego de la unión de viriones a las células. Se han propuesto otras moléculas pequeñas como inhibidores de la entrada: bicyclam AMD3100 [23], NSC651016 [24] , el péptido T22 [25] , y su versión más reciente T134 o T140 [26], y TAK779 [27]. Estas moléculas son inhibidores de la entrada viral que son activas en los co-receptores de entrada CXCR4 y CCR5, pero que no tienen actividad en la interacción CD4-gpl20. Los péptidos derivados de la secuencia de la región C-terminal de la glucoproteína gp41, el péptido T20 (o DP178) [28] y su versión recientemente perfeccionada DT1249 [29] son otros inhibidores de la infección cuyo blanco es una etapa transitoria de entrada, subsiguiente a la unión de la envoltura viral con CD4 y que precede a la fusión del virus con la membrana celular: estos péptidos son inactivos en la interacción gpl20-CD4. La mayoría de estos productos están actualmente en la fase de pruebas clínicas I/II, aunque su efectividad terapéutica aún está por comprobarse. El régimen terapéutico anti-SIDA que actualmente se utiliza clínicamente, triterapia, comprende una combinación de tres inhibidores cuyo blanco son dos enzimas virales, retrotranscriptasa y proteasa. Aún cuando la triterapia ha logrado reducir significativamente la carga viral de muchos pacientes, no es capaz, aún en los casos más favorables, de erradicar la enfermedad, puesto que persisten reservas latentes de infección [30] . El éxito parcial de la triterapia, por una parte, y la imposibilidad de detener la infección de SIDA con los actuales protocolos terapéuticos, por otra, han incrementado la demanda de nuevos fármacos que podrían ser activos en otros blancos virales y que pueden incrementar el repertorio y efectividad de los actuales fármacos clínicos. Los experimentos en el laboratorio de J.H. Nunberg, Centro Biotecnológico de Montana, Universidad de Montana, Missoula, EE. UU., han demostrado que la vinculación química de formas proteínicas presentes en el paso precedente a la fusión virus-célula representa nuevos inmunogénicos capaces de inducir la formación de anticuerpos neutralizantes de virus [31] . El complejo pre-fusión de la envoltura viral con los receptores de entrada, por consiguiente, representa una estructura que actualmente es de gran interés, porque esta estructura podría representar el componente más importante de formación de una proteína en la preparación de una vacuna contra el SIDA. Experimentos en el laboratorio de A. DeVico, Instituto de Virología Humana, Universidad de Maryland, Baltimore, EE.UU., han demostrado que el complejo gpl20-CD4, estabilizado por vinculación química o como proteína recombinante de fusión, representa una forma macromolecular que expone sitios antigénicos crípticos de la proteína viral gpl20 y que es capaz de inducir anticuerpos neutralizantes [32] , [33] . Obtener este complejo antigénico mediante vinculación química no es satisfactorio, puesto que no es homogéneo y es difícil de reproducir. Obtenerlo como proteína recombinante no produce una forma estructuralmente estable y efectiva. Sin embargo, especialmente, la presencia de CD4 en estas preparaciones podría plantear el peligro de inducir una reacción auto-inmune en un organismo ya inmunosuprimido.

TPA - P1 - Gis - P2 - CIS - P3 - Cis - Ala ó Gln - Gly ó (D) Asp ó Ser - Ser ó His ó Asn - XaaJ - Cis Thr ó Ala - Cis -Xaak - NH2 donde TPA representa ácido tiopropiónico, XaaJ representa ß-naftilalanina, fenilalanina ó difenilalanina, Xaak representa Gly, Val ó Ileu, P1 representa 3 a 6 aminoácidos, P2 representa 2 a 4 aminoácidos y P3 representa 6 a 10 aminoácidos, donde los aminoácidos en P1, P2 y P3 son naturales o no naturales, idénticos o diferentes, y donde P1, P2 y P3 posiblemente poseen una secuencia común, donde el péptido presenta una conformación de horquilla ß donde el giro ß está formado por residuos de los aminoácidos Ala ó Gln - Gly ó DAsp ó Ser-Ser ó His ó Asn - XaaJ de su secuencia (A) . De conformidad a una modalidad de la presente invención, el péptido de la presente invención se caracteriza por comprender la siguiente secuencia (I): TPA - Xaaa - Xaab - Ala ó Gln ó His - Arg ó Phe - 1 5 Cis - Xaa° - Xaad - Arg - Cis - Lys - Xaae - Xaaf - 10 Xaag - Xaah - Leu ó Lys - Xaa1 - Lys - Cis - Ala 15 ó Gln -Gly ó ¦ (D) Asp ó Ser - Ser ó His ó Asn -20 Xaaj - Cis - Thr ó Ala - Cis - Xaak - N¾ 25 donde TPA representa ácido tiopropiónico, Xaaa, Xaab, Xaac, Xaad, Xaae, Xaaf, Xaa?, Xaah y Xaa1 son aminoácidos naturales o no naturales, idénticos o distintos, Xaaj representa Nal, Phe o Dip, y Xaak representa Gly, Val o lie. El residuo (D)Asp representa el isómero D óptico de ácido aspártico, Nal representa ß-naftilalanina, y Dip representa difenilalanina . Los inventores demostraron que el péptido de la presente invención definido por la secuencia (I), que comprende un ácido tiopropiónico en la posición 1 de la secuencia, un residuo Fe, Nal o Dip en la posición 23 de la secuencia (Xaaj) y un residuo Gly, Val o lie en la posición 27 de la secuencia (Xaa ) , presenta una alta afinidad y especificidad a la unión para la proteina gpl20 de la envoltura viral del virus de inmunodeficiencia. Este péptido comprende solamente 27 o 28 residuos, y posee una estructura de horquilla que consiste en dos hojas ß enlazadas por un giro ß de cuatro residuos. Las dos hojas antiparalelas, puesto que están a una distancia entre si que puede producir interacciones intramoleculares de enlaces de hidrógeno, estabiliza la estructura. En particular, la distancia entre los nitrógenos de amidas y oxígenos de carbonilo del enlace péptido es de 2.5 a 3.6 Á. Esta estructura estable y bien definida reproduce elementos estructurales de CD4 que son esenciales para enlazarse con la glucoproteína gpl20. La estructura tridimensional del péptido de la presente invención ha sido resuelta experimentalmente mediante resonancia magnética nuclear (RMN) . Este análisis demuestra que la organización tridimensional de este péptido reproduce el esqueleto peptidico de la estructura de horquilla de CD4, y la región 37-46 de este péptido puede superponerse a la región 36-37 de CD4 con una desviación RMS de sólo 1.05 Á. Además, las cadenas laterales de los residuos Ala o Gln 20, Ser 22, Xaaj 23 (Nal, Fe o Dip) , y Thr o Ala 25 tienen una orientación comparable a la de los residuos correspondientes de CD4, específicamente Gln 40, Ser 42, Fe 43 y Thr 45. En particular, la cadena lateral de Xaa3 23 sobresale del motivo de horquilla en una conformación similar a la de Fe 43 de CD4 para insertarse en la entrada de una cavidad hidrófoba de la proteina viral gpl20, reforzando asi el enlace con gpl20. Arg y Lys en las posiciones 9 y 18 son topológicamente equivalentes a los residuos Arg5 y Lys 35 de la proteina CD4. TPA y el 5 cis del péptido forman enlaces de disulfuro que presentan apareamientos de los tipos 1-3, 2-4 y 3-6, y estabilizan la estructura de horquilla. El motivo estructural de horquilla posee una superficie accesible al solvente o a una molécula mayor, como una proteína, que puede promover su interacción con la proteína de la envoltura viral. Las cadenas laterales de los aminoácidos de la superficie accesible a solventes de este motivo están espacialmente cerca y forman una superficie molecular continua que reproduce la estructura de varios residuos importantes para la unión CD4-gpl20. La plataforma estructural que contiene el motivo estructural de horquilla también contiene otras regiones estructurales capaces de aceptar funcionalidades químicas adicionales en una posición especial bien definida en relación al motivo estructural de horquilla, que puede así reforzar su función biológica de unirse o proporcionar grupos marcadores. Por ejemplo, se ha incorporado un grupo de biotina o de fluoresceina en la cadena lateral de Usina 11, sin causar pérdida alguna en la actividad biológica del derivado. La incorporación de estos grupos ha permitido utilizar estos derivados en análisis de la interacción con la proteina de la envoltura, como se describirá a continuación. De conformidad a la presente invención, la secuencia (I) también puede comprender un residuo de prolina enlazado con el residuo Xaafc. Un residuo de prolina añadido en la posición 28 estabiliza el extremo de terminal C y hace más flexible la hoja ß de la terminal C del motivo estructural de horquilla. De conformidad a la presente invención, en la secuencia (I), Xaa1 puede ser Gly. Por ejemplo, el péptido de la presente invención puede comprender una secuencia elegida de las secuencias ID No. 4, ID No. 5, ID No. 6, ID No. 7, ID No. 8, ID No. 9, ID No. 10, ID No. 11, ID No. 12, ID No. 13, ID No. 14, ID No. 15 y ID No. 16 de la lista de secuencias anexa. El péptido de la presente invención puede ser obtenido mediante síntesis química de fase sólida o mediante recombinación genética. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método para producir el péptido de conformidad a la presente invención como se definió anteriormente, donde el método comprende la síntesis química de fase sólida de este péptido. La síntesis química puede realizarse, por ejemplo, con un sintetizador automático de péptidos de Applied Biosystems, mod. 433A. Se puede realizar, por ejemplo, mediante química Fmoc que utiliza el grupo fluoroenilmetiloxicarbonilo para protección temporal de la función -amino de los aminoácidos . El péptido de la presente invención también puede ser producido mediante un método que comprende los siguientes pasos : a) integrar una secuencia de ácido nucleico en un vector de expresión, donde la secuencia de ácido nucleico codifica el péptido de la presente invención. b) introducir en una célula huésped el vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico. c) cultivar la célula huésped que comprende el ácido nucleico bajo condiciones de cultivo, que permitan la síntesis del péptido. d) recuperar el péptido sintetizado. e) injertar TPA en la posición C-terminal. Los elementos técnicos para realizar este método de síntesis de péptido son sabidos entre los conocedores de la técnica. Se describen, por ejemplo, en la obra de Sambrook, Fritsch y Maniatis, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2a. edición. El injerto de un TPA en la posición C-terminal del péptido puede realizarse mediante un método convencional de química orgánica aplicable a un péptido. Los inventores sintetizaron una familia de péptidos reproduciendo una porción de la estructura de la región de CD$ similar a la región CDR2 de inmunoglobulinas que, como se demostró mediante los resultados de análisis cristalográficos y de mutagénesis, están entre las regiones esenciales para la unión de CD4 con la proteína viral gpl20. Los péptidos de la presente invención son capaces de unirse a la región de la glucoproteína gpl20 que interactúa con CD4, el principal receptor de la entrada de VIH-1 a los linfocitos blanco CD . Constituyen una familia de inhibidores, cuya afinida con la glucoproteína viral monómera recombinante pgl20 varía entre valores CI5o de 0.1 nM a 400 nM. Representan poderosos inhibidores específicos de la interacción CD4-gpl20 que se basan en la estructura de CD4. El enlace con la proteína viral gpl20 recombinante ocurre en competencia con CD4 soluble, y es específico a la forma correctamente estructurada. Debido a la estructura e imitación funcional de CD4, estos péptidos pueden utilizarse en los diversos campos que se describen a continuación. Los péptidos de la presente invención pueden unirse a la envoltura de VIH-1 en su forma recombinante, como se demostró mediante análisis ELISA. Estos péptidos, luego de ser marcados con una adecuada sonda fluorescente o radioactiva, permite detectar la presencia de la envoltura VIH-1 en solución o en la superficie de una célula, y por consiguiente detectar la presencia de una célula infectada y de la infección VIH-1. Los péptidos de la presente invención inhiben in vitro la interacción entre las proteínas recombinantes CD4-gpl20 y, con esto, también son capaces de impedir la entrada del virus VIH-ILM (aislado primario) y el virus VIH-1LEM (aislado clínico) a linfocitos circulantes. Los péptidos más poderosos de la presente invención son, de hecho, capaces de inhibir la infección de linfocitos con un DE50 de entre 100 y 900 nM. Por consiguiente, estas moléculas representan agentes antivirales que pueden tener aplicaciones clínicas. Debido a su naturaleza péptída, pueden utilizarse mediante inyección o infusión, o en aplicaciones locales externas. La capácidoad de los péptidos de la presente invención para inhibir la unión de la proteína viral gpl20 con CD4 es una demostración de la capácidoad de estos péptidos para inhibir la infección viral, puesto que previenen uno de los primeros pasos de la entrada viral. Estos inhibidores de entrada son por consiguiente componentes de la acción antiviral. Por consiguiente, los péptidos de la presente invención representan moléculas que pueden utilizarse en la terapia anti-SIDA. Los péptidos de la presente invención son capaces de inducir variaciones en la conformación de la proteina viral gpl20 recombinante y de la envoltura, lo que permite que sean detectados por anticuerpos monoclonales específicos, llamados CD4i, como CG10, 17b y 48D. Estas variaciones conformacionales, por consiguiente, son aparentemente similares a las inducidas por la unión de CD4. La unión de estos péptidos de la presente invención con la proteína viral gpl20 recombinante y con la envoltura viral por consiguiente desenmascaran epítopos de la envoltura que normalmente son inaccesibles sin CD4. Estos epítopos representan nuevos sitios antigénicos potencialmente muy importantes para desarrollar anticuerpos que neutralicen VIH-1. Los péptidos de la presente invención pueden por consiguiente utilizarse también en una aplicación de vacuna, en particular en una formación que comprende formar un complejo de estos con una proteína de la envoltura viral. Algunos péptidos de la presente invención presentan menor afinidad a la proteína viral gpl20 recombinante que otros . Estos péptidos son también de gran uso práctico en la purificación de formas funcionales de la envoltura viral. Específicamente, la unión de la proteína viral con estos péptidos es más fácilmente reversible. Para demostrarlo, los inventores unieron covalentemente uno de estos péptidos con un soporte polimérico hidrófilo (Sefaróse 4B) utilizado en cromatografía líquida, utilizando un brazo flexible unido al lado opuesto de la superficie activa de la molécula. Esta molécula, unida de tal manera, puede seguir interactuando con la proteina viral gpl20 recombinante y es capaz de retener esta proteina viral en la matriz polimérica. Luego puede separarse mediante ácidoificación del medio. Un soporte funcionalizado de esta manera permite purificar la proteina viral gpl20 recombinante, y opcionalmente otras formas de la envoltura viral e incluso todo el virus, en preparaciones a gran escala. Además, los péptidos de la presente invención pueden ser marcados, por ejemplo con fluoresceína o biotina, o con marcadores radiactivos, sin por ello alterar la afinidad para unirse con la proteina de envoltura viral gpl20. Estos péptidos marcados pueden utilizarse como trazadores, en experimentos que impliquen competencia para enlazarse con gpl20, por ejemplo para realizar selecciones moleculares. Los métodos que pueden utilizarse son aquellos accesibles a los conocedores de la técnica en la literatura relacionada con el estudio de interacciones moleculares (ver, por ejemplo, [37, 38, 39 y 40]). En el método de selección, cualquier molécula capaz de inhibir la interacción entre un péptido de la presente invención y una proteina viral gpl20 puede representar un inhibidor de la interacción CD4-gpl20, y por consiguiente un inhibidor de la infección viral. Es por consiguiente posible, en virtud de los péptidos de la presente invención, seleccionar cualquier molécula capaz de interactuar con la proteína gpl20, o una proteína análoga a gpl20, en particular moléculas con actividad antiviral o moléculas útiles para producir un producto medicinal. Por consiguiente, la presente invención también se relaciona con el uso del péptido de conformidad a la presente invención como se definió anteriormente, para preparar un producto medicinal. También se refiere al uso del péptido de conformidad a la presente invención como se definió anteriormente, para preparar un agente antiviral. También se refiere al uso del péptido de conformidad a la presente invención como se definió anteriormente, para preparar un producto medicinal destinado al tratamiento de SIDA. También se refiere a una vacuna que comprende un complejo de un péptido de conformidad a la presente invención y una envoltura de proteína de un virus. El virus puede ser un virus de SIDA, como el anteriormente mencionado. También se refiere al uso del péptido de conformidad a la presente invención como se definió anteriormente, para producir un producto diagnóstico, por ejemplo para diagnosticar SIDA. También se refiere al uso del péptido de conformidad a la presente invención como se definió anteriormente, para detectar moléculas de la envoltura viral de VIH. También se refiere al uso del péptido de conformidad a la presente invención como se definió anteriormente, para seleccionar moléculas que inhiben la interacción de gpl20, o de sus análogos, con la molécula CD4, para seleccionar moléculas con actividad antiviral y para seleccionar moléculas que sean útiles para producir un producto medicinal. También se refiere al uso del péptido de conformidad a la presente invención como se definió anteriormente, como un ligando inmovilizado para funcionalizar una matriz de cromatografía. Aún más ventajas se harán aparentes al leer los siguientes ejemplos, haciendo referencia a la lista de secuencias y las figuras anexas. Breve descripción de la lista de secuencias La lista de secuencias anexa proporciona las siguientes secuencias de péptidos: Secuencia ID No. 1: secuencia sCD4. Secuencia ID No. 2: secuencia de escilatoxina (ScTx) . Secuencia ID No. 3: secuencia CD4M9: péptido derivado de escilatoxina, que no presenta TPA en la posición 1 de la secuencia.

Secuencias ID Nos 4-16: secuencias llamadas CD4M9T, CD4M26, CD4M27, CD4M27A, CD4M27B, CD4M27C, CD4M30, CD4M31, CD4M32, CD4M33, CD4M35, K15 y K16, respectivamente, de conformidad a la presente invención. Secuencia ID No. 17: secuencia llamada CD4M3, derivada de escilatoxina, que no presenta TPA en la posición 1 de la secuencia. Secuencia ID No. 18: secuencia llamada CD4M0, derivada de caribdotoxina. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 son curvas de inhibición de la unión de CD4 con la proteina viral gpl20, con peptidos de la presente invención, obtenidos por ELISA de competencia. Los péptidos analizados son: CD4M9, CD4M9T, CD4M27, CD4M32, CD4M33 y CD4M35. Los datos experimentales aparecen como porcentaje de enlace (%F) en la función de la concentración de péptidos. La Figura 2 son curvas de inhibición de la unión de CD4 con la proteina viral gpl20, con el péptido marcado CD4M33-fluoresceina, CD4M33-F, obtenido por ELISA de competencia. También se presentan las curvas para los péptidos CD4M9 (secuencia ID No. 3), CD4M33 (secuencia ID No. 13) y CD4M35 (secuencia ID No. 14) para comparación. Los datos experimentales aparecen como porcentaje de enlace (%F) en la función de la concentración de péptidos. La Figura 3 son curvas de interacción de la proteina viral gpl20-HXB2 recombinante con el péptido CD4M33 (secuencia ID No. 13) unido a la superficie de un chip de un instrumento de resonancia de superficie de plasmón. Las curvas de asociación (0-300s) y disociación (300-800s) fueron registradas tras inyectar la proteina viral gpl20 a las concentraciones 13.2(1), 19.8(2), 29.6(3), 44.4(4)1, 66.6(5) y 100(6) nM. Los datos aparecen en unidades de resonancia (ÜR) en función del tiempo (t) en segundos. las Figura 4(a) y (b) son curvas de interacción de VIH-1, inactivado con AT-2 [34], con el anticuerpo 48d [11] (a) y CG10 [35] (b) , unido a la superficie de un chip de un instrumento de resonancia de superficie de plasmón en presencia del péptido CD4M33 (10 µg/ml) , en presencia de un péptido inactivo (Ala23) CD4M9 (Fe23 sustituido con Ala en la secuencia de péptidos de CD4M9) (10 µg/ral) , y en ausencia de péptidos. Las curvas de asociación (0-180s) y disociación (180-600s) fueron registradas tras inyectar VIH-1, pre-incubado con los péptidos a 20°C durante 1 h. Los datos aparecen en unidades de resonancia (UR) en función del tiempo (t) en segundos. Las Figuras 5 (A) -(C) son efectos de los péptidos CD4M30 (secuencia ID No. 10) (Figura 4A) , CD4M33 (secuencia ID No. 13) (Figura 4B) y CD4M35 (secuencia ID No. 14) (Figura 4C) sobre la replicacion de la cepa ???-?^ en PBMC activados con FA-P. Los datos aparecen como porcentaje de inhibición (%I) de la actividad de retrotranscriptasa (RT) en los supernatantes del cultivo, como función de la concentración de péptidos en nM. Las Figuras 6(A) y (B) son efectos de la presencia de CD4 soluble y de los péptidos de la presente invención sobre la interacción de la proteina viral gpl2C>HXB2 recombinante con los anticuerpos CG10 (A) y 48d (B) , unido a la superficie de un chip de un instrumento de resonancia de superficie de plasmón. Las curvas de asociación (0-18Os) y disociación (180-400, 180-450s) están dadas para la proteina viral gpl20 sola y la proteina viral gpl20 en presencia de CD4M27 (1.5 equivalentes, secuencia ID No. 6), de CD4M9 (1.5 equivalentes), del mutante inactivo (Ala23)CD4M9 (1.5 equivalentes) y de CD4 soluble (1.5 equivalentes). Los datos aparecen en unidades de resonancia (UR) en función del tiempo (t) en segundos. La Figura 7 son ejemplos de secuencias de péptidos de la presente invención representados con los códigos de una letra para los residuos de aminoácidos . TPA y B representan ácido tiopropiónico y difenilalanina, respectivamente, y "d" representa la forma óptica D del ácido aspártico. La Figura 8 es un perfil cromatográfico de la purificación de la proteina recombinante g l20HXB2 en una columna de Sef róse 4B (1.2 4 cm) funcionalizada con el péptido de la presente invención CD4M9 (secuencia ID No. 3) .

Los datos aparecen como absorbencia a 280 nm como función del tiempo (min) , tras añadir 0.5 M de ácid acético. EJEMPLOS Ejemplo 1 : Síntesis de los péptidos de la presente invención Los péptidos de la presente invención fueron producidos en este ejemplo mediante síntesis química de fase sólida con un sintetizador automáticos de péptidos Applied Biosystems mod. 433A, y por química Emoc, que utiliza el grupo fluoroenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) para la protección temporal de la función oc-amino de los aminoácidos. Los grupos protectores utilizados para prevenir las reacciones secundarias de las cadenas laterales de los aminoácidos, en esta estrategia Fmoc, fueron tert-butil éter (tBu) para los residuos Ser, Thr y Tyr; tert-butil éster (OtBu) para Asp, Glu; trifilo (Trt) para Gln, Asn, Cis, His; tert-butiloxicarbonilo (Boc) para Lys, y 2, 2, 5, 7 , 8-penta-metilcromano-6-sulfonil (Pmc) para Arg. La reacción de acoplamiento tiene lugar con un excedente 10-equivalente de aminoácidos (1 mmol) relativo a la resina (0.1 mmol). El aminoácido protegido se disuelve en 1 mi de N-metilpirrolidona (NMP) y 1 mi de una solución de 1M de l-N-hidroxi-7-azabenzotriazole (HOAt) en el solvente NMP. Luego se añade 1 mi de una solución de 1M ?,?'-diciclo-hexilcarbonodiimida (DCC) . Luego de activarse durante 40 a 50 minutos, el éster activo es transferido al reactor que contiene la resina. Antes de este paso de transferencia y acoplado, se desprotege la resina respecto a su grupo Fmoc, con una solución de piperidina al 20% en NMP. Se elimina el exceso de piperidina lavándolo con NMP durante aproximadamente 5 a 10 minutos. Durante la desprotección, la detección de aductos de dibenzofulveno-piperidina a 305 nm hace posible seguir la progresión correcta de la síntesis. Específicamente, la cuantificación del aducto permite estimar la efectividad de la desprotección del grupo Emoc y, en consecuencia, del acoplamiento del aminoácido final incorporado.

Modificaciones químicas incorporadas a los péptidos de la presente invención Se acoplaron una sonda fluorescente y también un grupo de biotina a dos de los péptidos de la presente invención que se estudiaron, CD4M9T (secuencia ID No. 4) y CD4M33 (secuencia ID No. 13) . La incorporación a estos dos compuestos ocurrieron en el residuo lisina 11, en una cara opuesta al lugar de enlace de la proteína viral gpl20. La elección de esta lisina estuvo condicionada por sus posibilidades de proteger su cadena lateral con un grupo protector, llamado ortogonal, como el grupo 1- (4, 4-dimetil-2, 6-dioxociclohexilideno) etil . De hecho, este grupo es estable respecto al tratamiento con piperidina al 20% utilizado para desproteger el grupo Emoc, pero se parte específicamente con un tratamiento de solución de hidrazina al 2%. Una vez eliminado el grupo Dde, fue posible acoplar la fluoresceína y también la biotina. Introducción de fluoresceí a. Se introdujo el grupo fluorescente a la cadena lateral de lisina 11 del péptido de la presente invención CD4M33 y de lisina 15 o 16 del péptido 15 (secuencia ID No. 15) o K16 (secuencia ID No. 16), respectivamente, de la presente invención. Por consiguiente, se utilizó el grupo Dde para proteger la cadena lateral de la lisina durante la síntesis del péptido, y luego fue liberado mediante dos tratamientos durante 5 minutos con hidrazina al 2% en dimetilformamida (DMF) . Se acopló la molécula de fluoresceína directamente al péptido sintetizado o mediante un brazo, que funciona para alejar la fluoresceína, una molécula grande, que podría obstaculizar la actividad de enlace. En este último caso, la molécula que permite introducir un brazo es ácido Fmoc-8-amino-3r 6-dioxaoctanoico. Así, se añaden 17 equivalentes de ácido Fmoc-8-amino-3, 6-dioxaoctanoico, 60 equivalentes de diisopropiletilamina (DIEA) y 17 equivalentes de hexafluorofosfato de 2- (IH-benzotriazol-l-il) -1, 1, 3, 3-tetrametiluronio (HBTÜ) a un equivalente de resina. Luego de acoplar durante 1 hora a temperatura ambiente, se desprotege el grupo Fmoc con piperidina al 20%. Luego se llevó a cabo el acoplado de la sonda utilizando éster N-hidroxisuccinimidilo fluoresceína 5 (6) -carboxilato. Para tal fin se añadieron 4 equivaLENtes de éster activado de fluorescexna a un equivaLENte de resina, en presencia de 14 equi alentes de diisopropiletilamina (DIEA) . La reacción tiene lugar de un día para el otro en el solvente NMP. Finalmente, se lleva a cabo la desprotección final. Introducción de biotina. En un primer paso, se añadió un brazo separador 8-amino-3, 6-dioxaoctanoico a lisina 11 previamente desprotegida respecto al grupo Dde. La reacción es similar a la descrita en el párrafo anterior. Luego se incorpora la biotina en forma de un éster N-hidroxisuccinimidilo biotinamidocaproato: de este modo, se añaden 4 equivaLENtes de éster activado de biotina a un equivaLENte de resina, en presencia de 14 equivaLENtes de diisopropiletilamina (DIEA) . La reacción ocurre de un día para el otro a temperatura ambiente . Luego se lava la resina antes de ser tratada con la solución de desprotección final. Introducción de un grupo tiol . Se sintetiza el péptido CD4M9 siguiendo el procedimiento anteriormente descrito, con la lisina en la posición 11 teniendo el grupo Dde como grupo de protección para la cadena lateral. Tras la síntesis del péptido, se trata la péptido-resina 5 veces con una solución de hidrazina al 2% en DMF. Se realiza el acoplamiento de un brazo de enlace durante una hora a temperatura ambiente en DMF con 10 equivalentes de ácido Fmoc-8-amino-3, 6-dioxaoctanoico, utilizando el reactivo HBTÜ en presencia de diisopropiletilamina . A continuación se desprotege el grupo Fmoc con piperidina al 20% en DMF. Subsiguientemente se trata la péptido-resina con 10 equivaLENtes de reactivo de Traut (clorhidrato de 2-iminotiolano (Sigma) ) en presencia de DIEA. Finalmente se libera y desprotege el péptido como se describe a continuación. Desprotección final de la resina Se fisionó simultáneamente la resina y los grupos protectores presentes en las cadenas laterales tratando el péptido enlazado a la resina con ácido trifluoroacetico (TFA) . Antes de realizar la fisión, se lavó varias veces la resina con diclorometano (DCM) y finalmente se secó. El reactivo utilizado en la fisión es una mezcla de ácidos que contiene 81.5% de TFA y los eliminadores fenol (5%), tioanisole (5%), agua (5%), etanoditiol (2.5%) y triisopropilsilano (1%) . Se trató la resina con esta mezcla durante tres horas con agitación y a temperatura ambiente, en una proporción de 100 mi de solución por gramo de resina. Se recuperó el péptido libre en solución mediante filtración. Luego se precipitó el péptido y se lavó en condiciones frías en éter diisopropilo, para luego disolverse en ácido acético al 20% y liofilizado. Plegamiento de los péptidos de la presente invención mediante la formación de puentes de disulfuro El péptido recuperado por liofilización, la materia prima de la síntesis, está en forma reducida, es decir, no están formados los puentes de disulfuro entre cadenas. La formación de estos enlaces covaLEHtes fue realizada utilizando la pareja redox cistamina/cisteamina . Se abosrbió la materia prima de la síntesis en agua a la que se habla añadido 0.1% (v/v) TFA y 6M de cloruro de guanidinio para facilitar la disolución de éste, a razón de 2.0 mg/ml-1. Luego se añadió esta solución a gotas, diluida hasta 0.2 mg/ml-1, al amortiguador reductor compuesto de de 100 mM Tris/HCl, ph 7.8, y 5 mM de cisteamina. Se añadió cistamina (oxidante) a una concentración final de 0.5 mM tras la reacción durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se llevó al medio a un pH de 3.0 tras 30 minutos . La cisteamina permite reducir los grupos tiol presentes en el péptido. Al aire libre, se oxida y permite la oxidación de cisternas y por consiguiente el plegamiento del péptido mediante la formación de puentes de disulfuro entre cadenas. La cistamina añadida al final de la manipulación permite terminar el plegamiento. Se verifica la correcta progresión de la oxidación mediante cromatografía analítica, comparando el tiempo de retención de la materia prima y el producto oxidado, siendo más prolongado en el primer caso. La oxidación del péptido CD4M9, que presenta un grupo tiol en la posición 11, difiere ligeramente de la descrita en el párrafo anterior. El medio de la reacción de plegamiento, compuesto de 20 mM de amortiguador de fosfato que contiene 200 mM NaCl, ajusado a un pH de 7.8, se desgasifica durante un lapso considerable y luego se añaden 5 mM de cisteamina y 5 mM de cistamina. Luego se añade el péptido que comprende siete funciones SH libres y se interrumpe la reacción de oxidación añadiendo ácido luego de tan sólo 10 minutos, un lapso lo suficientemente largo para el plegamiento y para la formación de los tres puentes naturales de disulfuro, y lo suficientemente breve para limitar la formación de productos secundarios correspondientes a estados de oxidación más elevada. Purificación de los péptidos de la presente invención Los péptidos de la presente invención fueron purificados mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de retrofase en una columna de preparación Vydac C18 (1.0 x 25.0 cm) . Se utilizó un gradiente lineal 0-60% de acetonitrilo en una solución acuosa de ácido trifluoroacético al 0.1%, durante 90 minutos. Se analizaron las fracciones de los máximos mediante HPLC analítico; se juntaron y liofilizaron las fracciones que presentaron un solo máximo.

El producto asi obtenido fue analizado mediante espectrometría de masa. Ejemplo 2 : Análisis de competencia mediante ELISA indirecto Se midió la inhibición de la interacción rgpl20-CD4 mediante ELISA {Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay; Análisis de Inmunosorbentes Enlazados con Enzimas) indirecto. Se inmovilizaron 50 ng por pozo de anticuerpo anti-gpl20 antibody, D7324, en una placa de 96 pozos {Maxisorb, Nunc) durante una noche a 4°C. Tras pasivación con albúmina de suero bovino y tres lavados con el amortiguador de enjuague (10 mM Tris, pH 7.8, 0.05% T een 20), se añadieron 15 ng de rgpl20HXB2 por pozo. Luego se añadieron varias concentraciones de competidores, tras tres enjuagues, y además 0.4 ng de CD4 soluble por pozo. Se prepararon controles al 100% que contenían únicamente CD4 soluble. Tras incubarlos toda una noche a 4°C y tres lavados, se añadió 5 ng de anticuerpo anti-CD4 L120.3 de ratón por pozo, seguido por un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra acoplado con peroxidasa (GAMPO) . Se realizó la revelación añadiendo 3, 3 ' , 5, 5 '-tetrametilbenzi-dina, a fluorescent substrate for peroxydase. Se interrumpió la reacción luego de 30 minutos añadiendo 2M de ácido sulfúrico. Se calculó la inhibición de la interacción rgpl20-CD4 con las lecturas de la absorbencia A a 450 nm. Los controles sin competidor permitieron determinar la absorbencia Ai0o% (absorbencia en ausencia de competidor) . Se calculó el porcentaje de inhibición de cada concentración de péptido de la presente invención utilizando la fórmula: porcentaje de inhibición = 100 * {A10o%-A) /A10o% Se realizaron los análisis por duplicado, y se expresaron los resultados como la media de duplicados experimentales . Se analizaró la actividad biológica del péptido CD4MO (secuencia ID No. 18) derivado de caribdotoxina y del péptido CD4M3 (secuencia ID No. 17) derivado de escilatoxina (secuencia ID No. 2) mediante un análisis ELISA indirecto. Estos péptidos presentan una capacidad de inhibir la interacción rgpl20uu:-CD4 soluble con una concentración inhibitoria del 50% (o CIS0) de 4.0 ? 10~5 M y de 2.0 ? 10"5 M, respectivamente (Tabla 1) [4], Estos valores son 10,000 veces mayores que los CI50 obtenido por CD4 soluble (CI50 = 4.0 ? 10"9 M) [4]. La Figura 1 agrupa los resultados obtenidos en este ejemplo con los péptidos de la presente invención. Son representaciones del porcentaje de enlace (%F) de la proteina viral gpl20HXB2-CD4 como función de la concentración molar (C(M)) de competidor, es decir, de péptido de la presente invención. Esta Figura muestra la inhibición de la interacción CD4-gpl20HXB2- Se analizó CD4M9 (secuencia ID No. 3) por competencia con ELISA. Presenta la capacidad de inhibir la interacción gpl20LM_CD soluble con una concentración inhibitoria del 50% (o CI50) de 4 ? 10~7 M (Tabla I), 50 veces más en la capacidad de inhibición comparada con el péptido de la presente invención CD4M3 (secuencia ID No. 17). El péptido de la presente invención CD4M9, en un análisis de compentencia ELISA también es capaz de inhibir la interacción de CD4 con otras proteínas gpl20 recombinantes originadas de virus T- y M-trópicos: VIH-lme, VIH-IMU, VIH-lBa-i,, VIH-IJR-FL, VIH-1w6ID, con una concentración inhibitoria del 50% (o CI50) de entre 0.1 y 1.0 * 10~6 M [4]. Este péptido inhibe la interacción g l20iKB2-CD4 soluble a CIS0 de 9 ? 10"8 M (Figura 1, Tabla I). Un mutante, CD4MV, que comprende la sustitución de la secuencia Gly-Pro en la C-terminal de CD4M9 con Val, presenta una CI50 de 3.0 ? 10~7 M en la inhibición de la interacción gpl20iAi-CD4 (Tabla 1), lo que representa un ligera incremento en la capacidad inhibitoria. El mutante CD4M9Dip comprende la sustitución Fe23Dip comparado con CD4M9; este péptido presenta una CI5o de 1.0 ? 10-7 M en la inhibición de la interacción gpl20LM-CD4 (Tabla 1), que representa un incremento adicional en la capacidad inhibitoria. El mutante CD4M9T (secuencia ID No. 4), que comprende un ácido tiopropiónico como sustitución del aminoácido Cys de C-terminal, presenta una CI50 de 3.0 ? 10"8 M en la inhibición de la interacción gpl20LM-CD4 (Figura 1; la CI50 en la interacción gpl20H B2 es 1.1 ? 10~8 M, Tabla 1) , lo que representa un incremento de diez veces en la capacidad inhibitoria, en comparación a CD4M9. Lo siguientes mutantes presentan un residuo tiopropiónico (???) y valina (Val o lie) en la posición N- y C-terminal posición, respectivamente, y fueron probados con gpl20, derivados de los virus T-trópicos VIH-1HXB2 y VIH-ILAI- El péptido de la presente invención CD4M27 (secuencia ID No. 6) comprende las mutaciones ArgSFe (para eliminar una arginina no esencial y para proteger el puente de disulfuro 6-24) y Gly27Val, y eliminar el residuo de prolina de la C-terminal (para dar mayor estabilidad a la ß-structura) . Presenta un incremento en la capacidad de inhibir el enlace CD4-gpl20HxB2, CI50 de 7 ? 10"9 M (Fig. 1, Tabla I) . Se obtienen los péptidos CD4M27 A, B y C, respectivamente, por una motación Gly21Ser(a), Ser22His(b) y Ser22Asn(c) a partir del péptido CD4M27. Presentan una capacidad inhibitoria comparable a la del péptido CD4M27. El péptido de la presente invenciónCD4M32 (secuencia ID No. 12), comparado con CD4M9T, comprende eliminar el residuo de prolina de la C-terminal, la mutación de Gly27Val y la mutación de Fe23 a difenilalanina (Dip) : la mutación Fe23Dip añade una estensión hidrófoba a la cadena lateral de Phe23, para incrementar la interacción con la cavidad hidrófoca de la proteína viral gpl20. CD4M32 presenta un incremento en la inhibición del enlace CD4-gpl20HXB2 (CI50 de 8xl0-10 M, Fig. 1). El CD4M30 mutante (secuencia ID No. 10) , comparado con CD4M32, comprende la mutación Arg5Fe (ya introducida a CD4M27) y Ala4Gln para incrementar la solubilidad de la molécula. Este péptido de la presente invención presenta una CI50 de 3.0 nM en los análisis de inhibición de la interacción CD4-gpl201Ai. El mutante CD4M33 (secuencia ID No. 13) incluye las mutaciones presentes en los dos péptidos precedentes, en particular CislTPA, Arg5Fe, Fe23Dip, Gly27Val, la eliminación de un residuo en la posición de la C-terminal y, además, la mutación Ala4His (para incrementar la solubilidad de la molécula) . Estas mutaciones producen un efecto aditivo y permiten al péptido de la presente invención CD4M33 inhibir las interacciones CD4-gpl20HXB2 y CD -gpl20Lai con una CI50 de 1.2xl0-10 M y de 2.5xl0-10 M (Fig. 1 y Tabla 1), es decir, un incremento de 1,000 veces en la capacidad de inhibir el enlace CD4-gpl20 en comparación a CD4M9. Un péptido adicional, CD4M35 (secuencia ID No. 14), fue sintetizado con, en comparación al péptido CD4M33 de la presente invención, las mutaciones Val2711e y Gly21(D)Asp. Estas mutaciones permiten al péptido de la presente invención inhibir la interacción CD4-gpl20HXB2 con una CI50 de 7.0 ? 10"11 M (Fig. 1, Tabla 1). Se sintetizaron otros dos péptidos, K15 (secuencia ID No. 15) y K16 (secuencia ID No. 16) : comprenden las sustituciones GlnWal, Leu8Gln y LysIlHis, comparados con el péptido CD4M33 de la presente invención, y un residuo Lys en la posición 15 o 16, respectivamente. Luego se unió por covaLEtiCia un grupo fluoresecente de fluoresceina a la cadena lateral de este residuo de lisina, de conformidad al protocolo descrito en el Ejemplo 1. los péptidos fluorescentes K15 y K16 presentan una CI50 de 5.0 ? 10~8 M y 6.0 x 10~9 M en la inhibición de la interacción gpl20LAI-CD4, donde la afinidad con la proteina viral gpl20 no se modifica con la marcación. En conclusión, la presente invención proporciona una familia de péptidos que representan poderosos inhibidores de la interacción CD4-gpl20. TABLA 1 Concentación inhibitoria al 50% (CI50) de los péptidos miméticos CD4 en la interacción de CD4 soluble recombinante para la proteina de envoltura viral gpl20LAI y g l20HXB2- la desviación estándar de cada valor es menor a 30%. Nombre No. Id. de Secuencia ciso (gpi20LAI) CI50 (gpl20HXB2) CD4MO 18 40 µ? - CD4M3 17 20 µ? - CD4M9 3 400 nM 90 nM CD4M9V - 300 nM - CD4M9T 4 30 nM 11 nM CD4M9Dip - 100 nM - CD4M27 6 10 nM 7 nM CD4M30 10 3.0 nM - CD4M32 12 2.0 nM 800 PM CD4M33 13 250 pM 120 pM CD4M35 14 - 70 pM 15FR 15 50 nM - 16FR 16 6 nM - Ejemplo 3 : Experimentos de resonancia de plasmon de superficie Los experimentos de resonancia de plasmon de superficie fueron realizados con un sistema Biacore 2000 (Biacore, Uppsala, Suecia) . Los péptidos a probarse fueron acoplados a biotina (como se describió anteriormente) y luego se inmobilizó sobre un chip al que previamente se había enlazado estreptavidina . Se inmovilizó la estreptavidina sobre el chip de la manera siguiente: primero se activió la superficie del chip inyectando 50 L de agente acoplador proporcionado por el constructor y capaz de formar los enlaces amidicos: N-etil-N'- (dimetilaminopropil ) carbodiimida (EDC) /N-hidroxi-succinimida (NHS), 50/50; luego, se inyectaron 20 L de estreptavidina, 0.2 mg.mL-1 en 10 mM de acetato de sodio, pH 4.5, a 5 µ??.p???""1, seguido por la neutralización de los grupos carboxilicos activados con 2 ? 20 µ? de 1.0 M etanolamina, pH 8.5. Se inyectaron las moléculas biotiniladas (10 µ?,.p???"1 en un amortiguador Hepes 10 mM que contenia 0.3 M NaCl, pH 7.4) en tres de las cuatro hileras del chip. En la primera hilera se inmovilizó CD4M9 (10~7 M) hasta alcanzar un valor UR (unidad de resonancia) de 100; la segunda hilera fue dejada sin utilizar (control); se cubrió la tercera hilera con CD4 soluble (10~7 M) hasta alcanzar un valor de 450 UR; en la cuarta hilera, se inmovilizó CD4M33 (10~7 M) hasta alcanzar un valor de 100 UR. Para cada análisis, se inyectaron varias concentraciones de diversos gpl20 (especies HXB2, BAL y JRFL) , a un ritmo de 50 µ?,.p???-1 a 25°C, para un tiempo de asociación de 4 min. Luego se enjuagó el chip con un amortiguador corriente, Hepes 10 mM que contenia 150 mM NaCl, 3.4 M EDTA y 0.05% P20, pH 7.4, para analizar la fase de disociación. Tras cada experimento, se regeneró el chip con 25 µL de 1.0 M ácido fórmico. Se calcularon las constantes de disociación mediante el programa de computadora Bia-evaluación 3.0. Ejemplo 4 : Actividad antiviral de los miméticos CD4 El manejo del material infeccioso fue llevado a cabo en un laboratorio de alta seguridad de tipo L3. Para tener condiciones lo más semejante posibles a las fisiopatológicas, se llevó a cabo el estudio utilizando cultivos primarios de linfocitos mononucleares sanguíneos periféricos humanos (PBMC) . En todos los experimentos, se compararon los efectos de las nuevas moléculas con los de AZT. Aislamiento, cultivo y activación de las células Medio de cultivo El medio A está compuesto de medio de cultivo de células RPMI 1640 (Life Technologies) complementado con suero vacuno fetal al 10% (SVF, Producto Roche) descomplementado a +56°C durante 30 min, de 2 mM de L-glutamina (Producto Roche) y de una solución de 100 uL/ml de tres antibióticos (penicilina, estreptomicina, neomicina; PSN, Life Technologies). El medio B consiste en medio A suplementado con 20 Ul/ml de IL-2 humano recombinante (Producto Roche) . Aislamiento y activación de PBMC Se separan los PBMC de los demás elementos representados en la sangre con centrifugación de gradientes de ficoll (MSL 2000, Eurobio) : 30 mi de sangre, de un donante sano, diluida en una tercera parte, se depositan en 20 mi de un amortiguador ficoll. Luego de centrifugar durante 20 min a 850 g, se elimina el anillo de PBMC y luego se lava dos veces con RPMI 1640, tras centrifugar a 750 g durante 10 min y a 400 g durante 5 min. Luego se activan los PBMC durante 48 h con 1 µg/ml de fitohemaglutinina-P (PHA-P; Difco Laboratories) . Se cultivan los PBMC a +37 °C, en una atmósfera saturada con humendad, bajo 5% de C02. Al final de las 48 horas de activación mitogénica, se muestrean los supernantantes del cultivo, y se renueva el medio de cultivo cada tres o cuatro días . A cada renovación del medio de cultivo, se evalúa la viabilidad de células mediante observación microscópica. Evaluación de la actividad retroviral de las moléculas Los compuestos de la presente invención CD4M30, CD4M33 and CD4M35 se solubilizan en agua esterilizada para preparación inyectable (Aguettant), se prorratean y luego se almacenan a -20°C. El compuesto SAH-CD4 (CD4 soluble acoplado a albúmina de suero humano proporcionado por Aventis (Vitry-sur-Seine) ) fue almacenado a -80°C hasta que fue utilizado. Las soluciones y diluciones luego fueron preparadas extemporáneamente en el Medio A. Se pre-trataron los PBMC con los compuestos durante 1 hora, para luego infectarse con el aislado de referencia con tropismo linfocitico, VIH-ILAI O con el aislado clínico VIH-1LEN. Las características biológicas de este aislado son: rápido/elevado, inductor de scyncitia (SI), X : por consiguiente es preferencialmente capaz de infectar linfocitos. Se constituyó esta cepa viral amplificando la especie in vitro, utilizando células mononucleares de sangre de cordón umbilical (CMSCU) con 1 µg/ml de PHA-P y cultivado en Medio B. Para eliminar los factores solubles como citocinas, los supernatantes del cultivo fueron centrifugados a 360,000 g durante 5 min, y los gránulos fueron resuspendidos en RPMI 1640. La especie viral constituida fue luego valorada utilizando PBMC PHA-P-activados . Se calculó la DITC50 (Dosis Infecciosa de Tejido Cultivado 50%) was utilizando la fórmula de Kárber. Se infectó a los PBMC con varias dosis virales, 10-100 DITC50, de la especie VIH-ILM y con 50 DITC50 de la especie VIH-1LEN (multiplicidad de la infección m.o.i. = 0.001) . Análisis de la replicación viral en los supernatantes del cultivo Se midió la replicación viral el dia 7 del cultivo, analizando la actividad de retrotranscriptasa en los supernantantes del cultivo utilizando el equipo RetroSys (marca registrada) , siguiendo las recomendaciones de la compañía Innovagen. Análisis de los resultados y determinación de las dosis efectivas al 50% Las dosis efectivas al 50% (ED50) se calculan utilizando el programa de computadora "Dose-effects analysis with microcomputers" desarrollado por J. Chou y T.C. Chou. Ejemplo 5: Protocolo para producir la proteina viral gp!20 recombinante Se amplificó el fragmento que expresa la proteína viral gpl20 (aminoácidos V12 a R481) mediante PCR en el plásmido VIHIIIB/HXB2R, utilizando dos iniciadores, lo que permitió generar un fragmento que contenía los sitios BamHI (corriente arriba del sitio Kpnl de la proteína viral gpl20) y PstI (corriente arriba del codón final añadido al final de la secuencia de la proteína viral gpl20) . El fragmento BamHI/PstI fue clonado en el vector Bluescript (pBS, Stratagene), produciendo el plásmido pBSml. La secuencia que expresa el extremo N-terminal de la proteína viral gpl20 (TI a Gil) , como también la que expresa la señal péptida de la ecdisteroide glucosiltransferasa del Autographa californica baculovirus, fueron insertados entre los sitios BamHI y Kpnl de pBSml, produciendo pBSm2. Luego se insertó el fragmento BamHI-Pstl de pBSm2 entre los sitios BglII-PstI del vector de transferencia pll9P del baculovirus PIO. Se cotransfectaron células de insecto Sf9 con el AND viral purificado del baculovirus AcSLPlO modificado y el ADN del vector recombinante pll9P gpl20. Los virus recombinantes fueron purificados mediante un método convencional . Se mantuvieron células Sf 9 scla (línea adaptada para crecer sin suero, depositadas en la colección del Instituto Pasteur) en una centrifugadora en medio sin suero. Luego se infectaron estas células (5 x 105 células/mL) con los virus recombinantes a una multiplicidad de infección de 1 UFP (unidad formadora de placa) por célula, para incubarse a 28 °C. Luego de infectarse durante seis días, se centrifugaron las células (500 g) , concentrándose la proteina viral gpl20 y purificándola directamente del supernatante del cultivo por cromatografía de afinidad en una columna de Sefarosa bromoacetilada acoplada con el anticuerpo D7324anti-gpl20. Ejemplo 6: Unión de la envoltura viral Con el fin de caracterizar rigurosamente su actividad biológica, el péptido de la presente invención CD4M33 (secuencia ID No. 13) fue marcado con biotina y con la sonda fluorescente fluoresceina, como se describe en el Ejemplo 1, en la Lys-11 colocada en la superficie activa del péptido de la presente invención CD4M33. Su actividad permanece sin alteraciones en análisis ELISA (Figura 2) . La Figura 2 agrupa los resultados obtenidos en este Ejemplo. Son curvas que muestran la evolución del porcentaje de unión (%F) de péptidos de la presente invención con la proteína viral gpl20nxB2 como función de la concentración molar de estos péptidos (C(M)). Estos resultados demuestran que el péptido CD4M33 puede incorporar un grupo marcador sin que se altere su actividad biológica. Para obtener una primera evaluación de la afinidad del péptido de la presente invención CD4M33 con la proteína viral gpl20, se utilizó un análisis de interacciones bioespecíficas (descrito en el Ejemplo 3), basado en la detección mediante resonancia de plasmones de superficie. En esta técnica, el péptido CD4M33 biotinilado de la presente invención (preparado como en el Ejemplo 1) fue específicamente unido a la matriz de dextrano caboxilado de un chip en el que previamente se había injertado estreptavidina. Luego se inyectaron soluciones de varias proteínas gpl20 recombinantes (gpl20HxB2r gpl20BAL and gpl20JRFIl) a esta matriz y luego se detectó una señal indicadora de una asociación específica y de alta afinidad. La Figura 3 muestra la evolución de la señal de resonancia del plasmón como función del tiempo, luego de la interacción de la proteína gpl20HXB2 (a diferentes concentraciones) con el péptido CD4M33 de la presente invención. Luego de obtener una regresión no lineal de las curvas de asociación y disociación, se obtuvo una constante de disociación KD de 2.4 ? 10~9 M para la proteína viral gpl20HXB2r de 7.4 ? 109 M para la proteína viral gpl20B¾i, y de 8.5 x 10~9 M para la proteína viral gpl20jRFIj. Estos valores son comparables al valor de KD = 1.9 ? 10-8 M, reportado en la literatura [34] para la interacción CD4-gpl20. La misma técnica, basada en la detección mediante resonancia de plasmones de superficie, fue también utilizada para verificar si el péptido de la presente invención CD4M33 podría unirse a la envoltura viral en su forma nativa. Para este fin, se inyectó una suspensión de partículas virales inactivadas con aldritiol-2 [35] al mismo chip, injertado con los anticuerpos 48d y CG10. Se detectó claramente una señal de interacción altamente especifica y afín con el péptido de la presente invención CD4M33, pero no cuando la suspensión viral fue incubada con el péptido CD4M9, que es mucho menos activo, o en auscencia de péptido (Figura 4) . Figura 4 muestra que la presencia del péptido CD4M33 es esencial para la interacción de la envoltura viral con los anticuerpos específicos a envoltura viral 48d y CG10, y que VIH-1 no se une a los anticuerpos en su auscencia: ésta es una demostración indirecta de la unión del péptido CD4M33 con la envoltura viral de VIH-1. Estos experimentos demuestran que el péptido de la presente invención CD4M33, con o sin marcador, tiene la capacidad de unirse a la envoltura viral VIH en sus formas tanto aislada como recombinante purificada, y en su forma nativa presente en la superficie del virus . Ejemplo 7: Inhibición de la infección con VIH-1 Para evaluar la capacidad antiviral de los péptidos de la presente invención, los inventores realizaron experimentos que consistieron en infección, con virus VIH-1un virus y con el aislado químico VIH-ILENÍ de cultivos primarios de linfocitos mononucleares sanguíneos periféricos humanos (PBMC) . En todos los experimentos, se compararon los efectos de las nuevas moléculas con las de AZT. Se añadió el virus VIH-ILRI a varias dosis virales (10-100 DITC50, Tabla 2) en presencia de diversas concentraciones de CD4M30, CD4M33, CD4M35 y SAH-CD4. Luego se añadió el virus VIH-1 IEN virus a DITC50 (Tabla 4) en presencia de CD4M33. Se realizaron pruebas de toxicidad de CD4 miméticos en estas mismas células. a. Toxicidad de los CD4 miméticos. A las dosis probadas, ninguno de los compuestos, AZT, SAH-CD4 o anti-CD4 miméticos, disminuyó la viabilidad de los PBMC PHA-P-activados . b. Actividad Anti-VIH-liai de los CD4 miméticos b.l. Replicación de la especie VIH-lug en PBMC. La especie VIH-l^ se replica a un alto nivel en PBMC PHA-P-activados. El máximo de la replicación viral ocurre al dia 7 del cultivo, y se cuantificaron los efectos de los péptidos CD4M30, CDM33 y CD4M35 en este instante post-infección. b.2. Efectos de AZT sobre la replicación de la especie VIE-l x en PBMC. AZT inhibe fuertemente la replicación de la especie VIH-ILAI en PBMC PHA-P-activados (Tabla 2) . La ED50 es igual a 3-14 nM. b .3. Efectos del compuesto SAH-CD4 sobre la replicación de la especie VIH-ILAI en PBMC. La actividad antiretroviral del compuesto SAH-CD4 respecto a los PBMC activados con PHA-P e infectados con la especie VIH-lu^ resulta en una inhibición de 85 ± 15% de la replicacion viral a una concentración de 2.5 µ?. b.4. Efectos de los CD4 miméticos sobre la replicacion de la especie VIH-lum en PBMC. Los péptidos de la presente invención CD4M30, CD4M33 y CD4M35 demostraron actividad antirretroviral (Tabla 3) en los cultivos de PBMC activados con PHA-P e infectados con la especie VIH—1???· El compuesto CD4M33 es el más antiviral de los tres a las diversas dosis virales probadas. Su actividad es menor que la de AZT : ED50 = 100-500 nM contra AZT : ED50 = 3 nM (Tabla 3 a continuación) , aunque es cuando menos 1 logaritmo base 10 mayor que el derivado SAH-CD4 del receptor CD4. Las Figuras 5A-C agrupan los resultados obtenidos: porcentaje de inhibición (%I) como función de la concentración del péptido en nM. c. Actividad antirretroviral del compuesto CD4M33 respecto al aislado clínico VIH—??,?? el . Efectos de AZT sobre la replicacion del aislado VIH-ILEN en PBMC AZT inhibe fuertemente la replicacion de la especie VIH-ILEN en los PBMC activados con PHA-P e infectados con el aislado VIH-ILEN, con un ED50 igual a 2.2 nM (Tabla 4). El grado de inhibición es idéntico al observado respecto a la especie de referencia con tropismo linfocítico, VIH-ILAI. c2. Efectos del mimético CD4M33 sobre la replicación del aislado clínico VIH-ILEN en PBMC La- actividad retroviral del mimétic CD4M33 con respecto a los PBMC activados con PHA-P e infectados con el VIH-ILEN se relaciona en un decremento dependiente con la dosis en la replicación viral y una ED50 igual a 367 nM (Tabla 4) . Por consiguiente, el mimético CD4M33 conserva una significativa actividad anti-VIH-1, aún cuando se descubrió que es ligeramente menor en comparación a la observada en la especie VIH-ILM. Estos experimentos demuestran que estos p ptidos de la presente invención son capaces de inhibir la infección de las células, aún a altas dosis virales, con valores ED50 de 900-35 nM (Tabla 3) . El péptido de la presente invención CD4M33 es el más antiviral, y su ED5o es aproximadamente 100 nM para la dosis viral convencional para infección (Fig. 4 a-c, Tabla 3) . Además, el péptido CD4M33 posee una actividad antirretroviral mayor en un 1 logaritmo base 10 que la observada en cualquier otro derivado de receptor CD4, SAH-CD4, y especialmente demostró una actividad anti-VIH respecto a un aislado clínico (Tabla 4) . En conclusión, el péptido de la presente invención CD4M33, que es capaz de unirse a la proteína viral gpl20 recombinante con un KD de 2.4-8.0 nM (experimentos de resonancia de plasmones de superficie) y de inhibir la interacción entre las proteínas recombinantes CD4-gpl20 en ELISA, con una CI50 de 120-250 pM, también presenta la capacidad de inhibir esta interacción en cultivos primarios de células humanas, de inhibir el paso inicial de entrada, y por consiguiente de bloquear la infección incluso de un aislado clínico de VIH-1. TABLA 2 Efecto de AZT sobre la replicación e la especie VIH-1L¾I en PBMC PHA—P—acti ados · Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición + desviación estándar: TABLA 3 Dosis efectivas al 50% (ED50) de los péptidos de la presente invención y de AZT en cultivos de linfocitos mononucleares sanguíneos periféricos (PMBC) activados con fitohemoglutinina-P (PHA-P) e infectados con la especie VIH-ILAI a varias dosis infecciosas (DITC50 : Dosis Infecciosa de Cultivo de tejido al 50%) : ED50 (riM) Secuencias 100 DITC50 50 DITC50 10 DITC50 CD4M30 894 235 253 CD4M33 534 133 118 CD4M35 154 428 266 AZT 14 3 5 TABLA 4 Efecto de AZT y de CD4M33 mimético sobre replicación del aislado clínico VIH-IIEN en cultivos de linfocitos mononucleares sanguíneos periféricos (PMBC) activados con fitohemoglutinina-P (PHA-P) . Las células fueron infectadas con 50 DITC50 de virus: Ejemplo 8 : Exposición de sitios antigenicos de la envoltura Para evaluar la capacidad del péptido de la presente invención CD4M33 a inducir variaciones conformacionales en la proteina gpl20, caracterizadas por la exposición de epítopos sensibles a anticuerpos neutralizantes, se llevó a cabo la interacción de estos anticuerpos humanos, 48d y CG10, con la envoltura VIH en presencia de CD4M33 y, en comparación, de CD4 recombinante, utilizando la técnica de resonancia de plasmones de superficie. Se unió por covalencia a los anticuerpos 48d y CG10 a la superficie de los chips, y se inyectaron las soluciones de gpl20, tanto en ausencia de CD4 como en presencia de un exceso de CD4 y de CD4M33. Al añadirse CD4M33 a la proteina viral gpl20nB2 con un exceso molar de 1.5 veces y 20 veces, la proteina viral presenta una fuerte interacción con los anticuerpos (Figuras 6a-b) ; por otra parte, en su ausencia (y en ausencia de CD4 soluble), la proteina de la envoltura interactúa muy débilmente con los anticuerpos (Fig. 6a-b) . Además, el efecto de añadir CD4M33 sobre el incremento de afinidad de la interacción de la proteina viral gpl20 para los anticuerpos es comparable a la que se obtiene añadiendo cantidades equivalentes de CD4 soluble. Los inventores también llevaron a cabo experimentos similares de resonancia de plasmones, utilizando directamente VIH-1, especie HXB2. La Figura 4 muestra los resultados obtenidos en estos experimentos, y demuestra la evolución de la señal de resonancia de plasmones como función del tiempo tras la interacción tas la suspensión de partículas virales VIH-1HXB2 con un chip que presenta los anticuerpos inmovilizados 48d y CG10: VIH-l interactúa con los anticuerpos tras la incubación con el péptido CD4M33 de la presente invención y, por otra parte, en ausencia o presencia del péptido inactivo [Ala23] CD4M9, la interacción es virtualmente cero. Por consiguiente, la técnica de resonancia de plasmones de superficie hizo posible demostrar que la unión de CD4M33 a la proteina de envoltura gpl20 es capaz de inducir una modificación de la proteina viral, que subsiguientemente expone preferencialmente ciertas superficies moleculares a los anticuerpos neutralizantes (17b, CG10) , aislados de individuos infectados con VIH-l [11], [12], [13]. La exposición de estos epitopos crípticos, inducidos por el péptido CD4M33 de la presente invención, es efectivo tanto en la proteina de la envoltura en forma recombinante y en la envoltura de los viriones. Además, en vista de los recientes experimentos que demuestran que el complejo de proteina gpl20 con CD4 puede ser una forma molecular capaz de inducir la formación de anticuerpos neutralizantes [31, 32, 33], el complejo CD4M33-gpl20 representa un candidato muy ventajoso como inmunógeno para inducir anticuerpos neutralizantes, en particular en aplicaciones para vacunas. CD4M33 tiene la propiedad de desenmascarar epitopos de proteina viral gpl20, al igual que CD4 soluble, con la ventaja de que no es capaz de inducir una reacción inmunológica contra CD4 y que, además, debido a lo reducido de su tamaño, permitirá un acceso aún más favorable a los epítopos desenmascarados de la proteína viral gpl20. Ejemplo 9: Síntesis de un soporte eromatográ ico para purificar la envoltura viral VIH Para evaluar la posibilidad de utilizar el péptido mimético CD4 de la la presente invención como ligando inmovilizado para funcionalizar una matriz cromatográfica para purificar la proteina viral gpl20, se funcionalizó un soporte polimérico hidrófilo Sepharose 4B (Pharmacia, Uppsala, Suecia) con uno de nuestros miméticos CD4, que luego se usó para unir la proteína viral gpl20 directamente del medio de cultivo de proteína viral. Para evitar el uso de condiciones demasiado drásticas durante la evolución de la proteína gpl20 desde el soporte y por consiguiente limitar las posibilidades de desnaturalización, se eligió un ligando con menor afinidad a la proteína viral gpl20. Es CD4M9, el cual, mediante ELISA, presenta una afinidad (CI50) a la proteína viral gpl20 de entre 0.1 µ? y 1.0 µ?, dependiendo del aislado VIH-1. Se modificó CD4M9 en la posición Lysll, ya utilizado en los marcados precedentes, para incluir un grupo tiol adicional (descrito en el Ejemplo 1), que luego fue utilizado por su inmovilización covalente del soporte Sepharase 4B, como se describe posteriormente.

La resina EAH Sepharose (marca registrada, comercializada por Pharmacia Biotech) , que comprende de 7 a 12 µp??? de funciones primarias por mi de resina seca, es funcionalizada con un grupo maleimida. Para esto, se tratan 12 mi de resina pre-equilibrados en 24 mi de agua durante 12 con 1.05 mg de reactivo sulpho-SMCC (3-sulfo-M hidroxisuccinimida éster de 4- (N-maleimidoetil ) ciclohexana-1-ácido carboxilico (Sigma)), manteniendo el pH a aproximadamente 4.5. El grado de sustitución es de 200 nmol de función maleimida por mi de resina seca. Luego se elimina el exceso de reactivo mediante enjuages sucesivos con 100 mM Tris-HCl, 500 M NaCl, pH 8.0, y luego con un amortiguador de 100 mM de acetato de sodio que contiene 500 nM NaCl, pH 4.0. Las funciones amina libres restantes son luego acetiladas mediante dos tratamientos con una solución de anhídrido acético al 1%. Se añaden 3.8 mg de péptido CD4M9 tiolado are a la resina funcionalizada con maleimida. Se agita la reacción a 4°C durante 12 horas. Luego se lava y equilibra la resina con el amortiguador de uso, 20 mM de fosfato de sodio, 100 MM NaCl, pH 7.4. Se preparó una columna c ornatográfica de 6.0 mi con esta matriz que contenía aproximadamente 0.1 mg/ml de péptido inmovilizado CD4M9 de conformidad a la presente invención. Luego se cargó en la columna el medio de cultivo gpl20, y la proteína viral retenida en la columna fue luego eluida de la columna con un tratamiento de 0.5 M de ácido acético. Se analizaron las fracciones eluidas con ácido acético con SDS-PAGE para luego ser liofilizadas . El análisis de estas fracciones demostró que contenia la proteina viral gpl20. La Figura 8 es una gráfica que representa el perfil cromatográfico obtenido en este Ejemplo: absorbencia a 280 nm (A280) como función del tiempo en minutos (t (min) ) . El perfil cromatográfico en la Figura 8 muestra varios máximos de elución de proteina de envoltura. Los inventores piensan que los diversos máximos representan la proteina viral gp!20 a diferentes grados de desnaturalización causada por el ácido acético utilizado en la elución de la columna. Ejemplo 10 : uestreo Las moléculas de la presente invención fueron marcadas con fluoresceina o biotina, sin modificar la afinidad para unirse a la proteina viral gpl20. En este ejemplo, se lleva a cabo un marcado con metales lantánidos fluorescentes o isótopos radioactivos, sin alterar la actividad de unión de los péptidos de la presente invención respecto a la proteina viral gpl20. Estos péptidos son utilizados como trazadores, en experimentos que consisten en muestrear, por competencia, la interacción de estos péptidos con la proteína viral gpl20. En un primer experimento, la proteína viral gpl20 se inmoviliza en microplacas de 96 pozos, y el péptido CD4M33, marcado con el lantánido europio (III), es puesto en contacto con esta proteina bajo condiciones que permiten la interacción entre el péptido CD4M33 y la proteina gpl20. las mediciones de señales (por ejemplo mediciones de fluorescencia resueltas respecto al tiempo) hacen posible cuantificar la capacidad de las moléculas muestreadas de desplazar los péptidos marcados . En un segundo experimento, se marca el péptido CD4M33 con fluoresceina y se une a la proteina viral gpl20, y se protege mediante mediciones de polarización de fluorescencia en solución, en sistemas miniaturizados . Estos dos sistemas, utilizdos para muestrear moléculas capaces de inhibir la interacción CD4-gpl20, no son limitantes . Las moléculas detectadas mediante este muestreo representan inhibidores de la interacción CD4-gpl20, y por consiguiente inhibidores potenciales de la infección viral. las técnicas de instrumentación utilizadas en este ejemplo aparecen descritas en la literatura, en particular en los documentos [37, 38, 39 y 40] .

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Claims

REIVINDICACIONES 1. Un péptido caracterizado por comprender la siguiente secuencia (I) : TPA - Xaaa - Xaab - Ala ó Gln ó His - Arg ó Phe - Cis - Xaac - Xaad - Arg - Cis - Lys - Xaae - Xaaf - Xaag - Xaah - Leu ó Lys - Xaa1 - Lys - Cis - Ala ó Gln -Gly ó (D) Asp ó Ser - Ser ó His ó Asn - Xaaj - Cis - Thr ó Ala - Cis - Xaak - N¾ donde TPA representa ácido tiopropiónico, Xaaa, Xaa , Xaac, Xaad, Xaae, Xaaf, Xaag, Xaah y Xaa1 son aminoácidos naturales o no naturales, idénticos o distintos, aaj representa ß-naftilalanina o fenilalanina o difenilalanina, y Xaak representa Gly, Val o lie.
2. El péptido de conformidad a la reivindicación 1, donde la secuencia (I) puede también comprender un residuo de prolina enlazado con el residuo Xaak.
3. El péptido de conformidad a la reivindicación 1 o 2, donde Xaa1 es Gly.
4. Un péptido que comprende una secuencia elegida de las secuencias ID No. 4, ID No. 5, ID No. 6, ID No. 7, ID No. 8, ID No. 9, ID No. 10, ID No. 11, ID No. 12, ID No. 13, ID No. 14, ID No. 15 y ID No. 16 de la lista de secuencias anexa.
5. Un método para producir un péptido de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el método comprende la síntesis química en fase sólida del péptido.
6. El uso de un péptido de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para preparar un producto medicinal .
7. El uso de un péptido de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para preparar un agente antiviral .
8. El uso de un péptido de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para preparar un producto medicinal destinado al tratamiento del SIDA.
9. Una vacuna que comprende un complejo de un péptido de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y una envoltura de proteína de un virus.
10. Una vacuna de conformidad a la reivindicación 9, donde el virus es un virus del SIDA.
11. El uso de un péptido de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para detectar moléculas de la envoltura viral del VIH.
12. El uso de un péptido de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para producir un producto diagnóstico.
13. El uso de un péptido de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, como ligando inmovilizado para funcionalizar una matriz cromatográfica.
14. El uso de un péptido de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en un método muestreo.