JPH05508838A

JPH05508838A - Ｈｔｌｖ―ｉおよびｈｔｌｖ―ｉｉウイルスに対する抗体を検出するためのペプチドおよびアナログおよびその混合物

Info

Publication number: JPH05508838A
Application number: JP91511591A
Authority: JP
Inventors: ラクロワ，マーシャル; ズレイン，マーン
Original assignee: バイオケム・イムノシステムズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1990-07-18
Filing date: 1991-07-10
Publication date: 1993-12-09
Anticipated expiration: 2018-03-24
Also published as: IE912497A1; CS221391A3; IL98770A0; AU658144B2; EP0539405B1; JP3390002B2; NZ238855A; IL98770A; WO1992001713A1; CA2087436A1; ES2076538T3; EP0539405A1; PT98356B; MX9100257A; DE69110891D1; AP9100296A0; ATE124419T1; AU8211991A; CA2087436C; PT98356A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１１ＴＬＶ−１およびＩＩＴＬＶ−目ウイルスに対する抗体を検出するためのペプチドおよびアナログおよびその　Ａ本出願は、１９９０年７月１８日出願の米国特許出願第０７１５５４．２５８号の一部継続出願である。

及五象旦！本発明は、ＨＴＬ　Ｖ−１およびＩ［ＴＬＶ−目感染を検出し定量するのに有用な、新規の直鎖状ペプチドおよび混合物並びにその化学的組み合せに関する。これらのペプチドは、ＨＴＬＶ−［およびＩＴＬＶ−１１ウイルス性感染症に対するワクチンにも有用である。

ｉ豆旦！量ヒトＴ細胞白血病ウィルスサブグループＩ　（ＩＩＴＬＶ−１）は、成人Ｔ細胞白血病／リンパ＠　（ＡＴＬ）に密接に関連するレトロウィルスである（Ｐｏｆｅｓｚら、１９８０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１゜Ｕ、Ｓ、Ａ、、　ｌ：、　７４１５−７４１９）。これは、熱帯性痙筆性不全体麻痺およびＨＴＬＶ−１関連ミニロバシー（ＲＡＭ）と呼ばれる神経学的疾病にも関連している（ＧｅｓｓａＩｎら、１９８５．　Ｌａｎｃｅｔ　ｉｆ、　４０？−４１０）。ヒトＴ細胞白血病ウィルスサブグループＩ　Ｉ　（ＨＴＬＹ−１１）は、屋切に、Ｔ＠胞ヘアリーセル白血病の患者から単離された（にａｌｙｔｔｎａｒａｗａｎら、１９Ｊｔ２．５ｃｉｅｎｃｅ、　ｉＪＪ、　５７１−５７３）。

これは、ヘアリーセル白血病の子細胞変異体に関連している。

ＨＴＬＶ−［およびＨＴＩＪ−目ゲ／ムは、白血病細胞のヒト染色体ＤＮＡ中にプロウィルスとして存在する。その完全なヌクレオチド配列はすでに解明されている（　５ｅｆｋｉら、１９８３．　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｅｔ、Ｕ、Ｓ、＾、、ｕ、３６１ｇ−３６２２：　５ｈｉｓｏｔｏｈｒ＋ｏら、１９８５、　Ｉｂ１ｄ、、　ＦＪＪ−、３１０１−３１０５）。その他のレトロウィルスと同様に、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−＋１ゲノムは、１．ＴＲ（ｅＴ　７グ９−　！　ｆ　ｋリピート）構造によりフランキングされている。この構造は、プロウィルスＤＮＡの宿主染色体ＤＮＡへの組み込みに重要な役割を果たすと考えられている。４個の主要遺伝子が同定され、ゲノムにおいて以下の相対的な位置を占めている：　ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ｐＸ−ＬＴＲ（Ｓｅｉｋｉらｉ　５ｈａｖら、Ｌ９８４．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、、　、ＬＬ、　４５４４−４５４８）。ｇａｇ遺伝子は、４２９個のアミノ酸（、［ＩＴＬＶ−Ｉ　＋テは４３３個）からなる４８．０００ダルトンノ前駆体タンパク質（ｐ５３と呼ばれることが多い）をコードする。この前駆体タンパク質は、少なくとも３つの小さなタンパク質に開裂される（図２）。ｐｏｌ遺伝子は、ウィルス性逆転写酵素をコードする。ｅｎｖ遺伝子！±、グリフシル化され、その後、ｇｐ４ａおよヒｇｐ２１という２個の糖タンパク質に開裂される５４．０００ダルトンのタンパク質をコードすると思われる。　（同じｅｎｖ遺伝遺伝子タンパク酸生成物われるものについて、わずかに異なる分子量が報告されている）。最後のフード領域はｐＸと呼ばれ、遺伝子の発現および調節にかかわる４個のタンパク質（ｔａｘ＋、ｔａＫ２、ｒｅＸＩ、ｒａｘ２）をコードすると考えられている０図１および２に示すように、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１のｅｎｖタンパク質およびｇａｇタンパク質は、アミノ酸配列の相同性が高い。さらに、ＨＴＬＶ−１のタンパク質とＨＴＬ、Ｖ−２１のタンパク質との間の血清学的な交差反応が報告されている（　Ｌｅｅら、１９１１４．　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、。ＬＬ、　７５７９−７５８３）、このような構造的な類似性および交差反応があるにもかかわらず、これらのｅｎｖおよびｇａｇタンパク質の領域には、ＩＩＩＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−１１ウイルスのいずれかに感染した患者に存在するいずれかの抗体によってのみ区議される領域もある。

１１１ＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−［１は共に、形態学的および遺伝子的構造において、ヒト免疫不全ウィルス（旧Ｖｓ）とは異なっている。

その結果、ＨＩＶタンパク質に対する抗体は、Ｉｌ［ＴＬＶ−１抗原および＋（ＴＬＶ−＋！抗原と交差反応するはずはない。しかし、エイズ患者から採取した血清試料には、ＨＴＬＶ抗原に、ある程度の交差反応を示すものもある（　Ｅｓ５ｅｘら、１９１１３．５ｃｉｅｎｃｅ、　、ｉＪｊ；ｊ、　８５９−４６２）。

成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）は、日本の南西部、カリブ海域、および中央アメリカ並びに南アメリカの一部で主に発生する。これらの地域では、血清学的有病率は一般集団では５％から１５％の間であり、より高齢者グループでは３０％に達する。米国ではＩＩＴＬＶ−１／ＩＩ感染症は、主に静脈注射による麻薬使用者（ＩＶＤＵ）の間に存在する。最近のアメリカ赤十字社の調査では（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９８ｇ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　■、　６４３−６４６）、ＨＴＬＶ−１に対する抗体は、米国の８都市における３９．８９８人の無作為な血液提供者のうち１０人に検出された：これは血清学的有病率０．０２５％に当たる。北部エジプトからの３１５８人の個体を用いた同様の研究では、２人のキャリアが確認された（有病率０．０６％）　（Ｅｌ−Ｆａｒｒａｓｈら、１９８Ｌ　Ｍｉｅｒｏｂｆｏｌ、１ｍ＋１ｕｎｏ１．、且＠、　９８１−９８４）。

これらの２つの研究において、ＨＴＬＹ−［ｉ：よる感染とＨＴＬＶ−１１による感染とは明確に区別されていなかった。

これらのデータかられかることは、血液生成物受血者へのウィルスの不注意な蔓延を防ぐためには、血液銀行に持ち込まれるすべての血液試料をスクリーニングするための、信頼性のあるテストが必要とされていることである。

このようなテストを開発するために、従来から様々な努力が重ねられてきた。このうち、ＩＩＴＬＶ感染流体の、十分に特徴づけがなされた市販パネルの一部である、血清および血漿試料を、すべて検出することに成功したものはなかった。

さらに、非常に低いレベルのＢＴＬＶ感染症を検出して、血液供給の安全性、および迅速で早期のＨＴＬＶ惑染症感染療を確実にできるものもない。

Ｓａｘｉｎｇｅｒら（１９８４，５ｃｉｅｎｃｅ、　ＬＬＬ、　１４７３−１４７５）は、ウィルスに対する抗体を検出するために、酵素免疫アッセイ（Ｉｌ’ ｌＡ）において、ＩＩＴＬＹ−１粒子を免疫吸着剤として泪いることを報告している。このような第一世代のテストの改良においては、ウィルスの粒子の代わりに、特異的ＨＴＬＶ抗原が免疫吸着剤として用いられてきた。たとえば、Ｓａｍｕｅｌら（１９８４，５ｃｉｅｎｃｅ。

ｌ、　１０９４−１０９７）は、組換えＤＮＡ技術によって得られた抗原について述べている。これらの抗原は、Ｓａｘｉｎｇｅｒらによって開発されたものと類似の全ウィルス溶解産物によるＥＩＡによって、ｌｌ［ＴＬＶ−１に対する抗体を含有していることが示された１１の血清をそれぞれ検出した。　Ｓｌａｍｏｎら（ＰＣＴ／ＵＳ８５１０１８０３）は、ＨｎＪ−１およ゛びＨＴＩｖ−１１のｐＸ（０１域のタンパク質に存在する免疫原田位に関連する、ポリペプチドおよびその切片を泪いたアッセイについて述べている。これらの報告されたアッセイの精度は７７％と８７％との間であった。Ｆｕｋｕｆら（Ｈ−ｃｒ　ツバ特許出願８７１１６７８７）は、ｇａｇ遺伝子のすべてまたは一部と、ａｎｙ遺伝子のすべてまたは一部とを含む融合遺伝子によってコードされた、ポリペプチドを用いるアッセイについて述べている。

偽陽性のない１００％（５７１５７）の感度であったと報告されている。

これらの結果は好印象には見えるが、米国においては非常に一般的であるように、上記アッセイを実行するのに用いられる血清の抗体価が日本よりずっと低いという特徴を有している、血清で反復させることは難しい。

ＨＴＬＶ−１またはＩＩＩＴＬＶ−１１タンパク質に由来するペプチドを用いるアッセイも報告されている。たとえば、Ｐａ１ｋｅｒら（１９８９゜Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　■、　９７１−９７８）は、３６人の患者のうち２８人（７８％）の血清中の、抗体が、ＨＴＬＶ−１エンベロープの、１９０位から２０９位のペプチドに広がるアミノ酸（ペプチド４ａ：　ｅｎｖ　１９０−２０９）と反応したと報告している。°（°　本明細書においては、ＨＴＬＶ−１および１［ＴＬＶ−Ｉ　Ｉ遺伝子生成物について、（参照を容易にする目的のみで）　５ｅｉｋｉら（上記）およびＳｈｆｍｏｔｏｈｎｏら（上記）によって発表されたアミノ酸配列および番号が用いられている。）３５個の血清試料のうち１０個（２９％）がペプチド６　（ｅｎｖ　０６−３ｆ２）と反応し、３３１Ｗのうち６個（１８％）がペプチド７　（ｅｎｖ　３７４−３９２＞と結合した。　Ｐａ１ｋｅｒら（１９８６，Ｊ、ＩＮｍｕｎｏｌ、、　出、　２３９３−２３９７）も、ＩＩＴＬＶ−１に血清学的に陽性の１８個の試料のうち１６１１Ｉと反応するペプチド（５Ｐ−７１；　ｇａｇ　１２０−１３０）について述べている。

ＨＴＬＶ−１に対して血清学的に陽性な１２人の個体のうちの４人由来の抗体を認識するペプチド（ＳＰ−７０；　ａｎｙ　２９６−３０６＞が、Ｃｏｐａｌａｎｄら（１９８６，Ｊ、　ＩＮｍｕｎｏｌ、、　ｕ！、　２９４５−２９５１）によって報告されている。

ｆａｎｇら（米国特許４．１１３３．０７１）は、ＦｉＴＬＹ−１の膜貫通タンパク質（ｇｐ２１）の、重複する３つの直鎖状ペプチドスバンニング領域について言及している。これらのペプチドＣｅｎｖ　３８１−４００、ｅｎｙ　３７７ −４００およびａｎｙ　３７１１−３９３）は、混合物で用いられると、ＡＴＬ患者からの１０２個の血清試料のうち１０２個を、そしてエイズ／ＡＲＣ患者３０人やうち５人を検出した。１２人の正常被検者からの血清または自己免疫疾病の１２人の患者からの血清には、まったく免疫反応性を示さなかった。

Ｒｅｙｅｓ　（ＰＣＴ／ＷＯ３９１０６５４３）は、ＨＴＬ、Ｖ−１のｇｐ４ｇに由来する、グリフシル化されていない、４１−アミノ酸組換えペプチド抗原について述べている。この組換えペプチドである、ａｎｙ（１６３−２０３）は、ＨＴＬＶ−１感染した６人の患者中の、血清抗体を測定するための固相アッセイに用いられたと報告されている。

Ｖａｈｌｎｅ　（ＰＣＴ／Ｗ０１１９１０１１６６４）は、４つの合成ペプチドＡＳＢ。

ＣおよびＨｌつまりＨＴＬＶ−１のエンベロープタンパク質のａｎｙ　（３８１ −４０４）、ｅｎｖ　（２７３−２９３）、ａｎｙ　（２２３−２４２）およびｅｎｖ（１７６−１９９）に広がるペプチドについて言及している。提供された実施例から、ペプチドＡのみが、テストされた試料に存在するＩＩＴＬＶ−１に特異的な抗体を検出するＥＬＩＳＡにおいて有用であったと思われる。

ＨＴＬＶに感染した血液生成物を血液銀行に入り込ませず、そして感染した個体が迅速で早期の治療を受けられるようにするために必要な、高い特異性（偽陽性がないこと）および高い感度（血清が非常に低いレベルのＨＴＬＶ抗体を含有している時でさえも、全ての陽性を検出すること）を示したものは、上記のアッセイにはなかった。本発明のペプチドはこれらの欠点を改善するものである。

及五二！量本発明のペプチドは、以下のものからなる群から選択される：（ｉ）以下の式を有するペプチド：ａ　−ス１−ｂここで、ＸＩはｇｐ４５　ｅｎＶタンパク質（ＨＴＬＶ−１）のＡＡ２１＋３− ＡＡ３１１９からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列、およびそのアナログであり；ａは、アミノ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基であり；そしてｂは、カルボキシ末端であって、ｌから８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基である；（ｉｆ）以下の式を有するペプチド：ａ　−Ｘ２−　ｂここで、ｘ２は、ｇｐｔａ　ｅｎＶタンパク質（ＨＴＬＶ−１１）のＡＡ２７３ −ＡＡ３ａ５からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列、およびそのアナログであり、ａおよびｂは上記と同義である；（ｔｉｔ）以下の式を有するペプチド：ａ　−Ｚｌ　−ｂこコテ、ｚｌは、ｇａｇ　ｐ２４タンパク質（ＩＩＴＬＶ−１）のＡＡ２３６− ＡＡ２５７からブロックとして取られた、少な（とも６個のアミノ酸の配列、およびそ９アナログであり、３およびｂは上記と同義である；（ｉｖ）以下の式を有するペプチド：ａ　−７２−ｂこコテ、ｚ２は、ｇａｇ　ｐ２４タンパク質（ＩＩＴＬＶ−１１）のＡＡ２ｊ２ −ＡＡ２６３からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列、およびそのアナログであり、ａおよびｂは上記と同義である；（ｖ）以下の式を有するペプチド：ｘ　−８２−ｂここで、Ｂ２は、ｇｐ４５　ｅｎｖタンパク質（ＨＴＬＶ−１１）のＡＡ＋７＋ −ＡＡ２＠７からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列、およびそのアナログであり、ａおよびｂは上記と同義である；ｈｉ）以下の式を有する縦列ペプチド：ａ　−＜（（（Ｊ）。−ｃ）ｏ　−（（Ｅｌ）ｐｅａ　−ｄ）ｒ）ｓ　−ｂここで、ＪおよびＵは、ｇｐ４６　ｅｎｖタンパク質（ＨＴＬＶ−１＞のＡＡ＋５３−ＡＡ２＋ｓまたはＡＡ２ｓｓ−ＡＡ３ｓｓＢ　ｐ２４　ｇａｇタンパク質（ＨＴＬＶ−１）のＡＡ２３６−ＡＡ２Ｓ７：　ｐ１９　ｇａｇタンパク質（ＩＩＴＬ、Ｖ−１）のＡＡＩ２１１−ＡＡＩ３＠　；　ｇｐ４６　ａｎｙタンパク質（ＨＴＬＶ−１１）のＡＡＩ７１−ＡＡ２９７またはＡＡ２ｒｓ−ＡＡｓｔａｓ　；　ｐ２４　ｇａｇタンパク質（ＩＩＴＬＶ−１１）のＡＡ２ｔ２−ＡＡ２ａ３およびｐ１９　ｇａｇタンパク質（ＨＴＬＶ−目）のＡＡ＋２ｓ−ＡＡ＋３ｓ　：およびこれらのアナログからなる群から、独立して選択される配列からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列であり；ａおよびｂは上記と同義であり：Ｃおよびｄは、存在する場合には、ｌから８！のアミノ酸、または、結合を容易にするのに効果的な置換基であり、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基であり；ｎ　ｓ＋　１−５であり；Ｃが存在する場合にはｏ　ｍ　１−５であり、それ以外の場合には０冨１であり；ｐ　−１−５であり；ｑ　−１−５であり；ｄが存在する場合にはｒ・１−ｉであり、それ以外の場合にはｒ＋ｓｌであり：そしてａ　１１１−５である。

本発明のペプチドおよびその混合物は、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−Ｉ＋感染の存在について、血液および体液のスクリーニングに有用であり、モしてＥＩＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１感染症に対する安全で効果的なワクチンの調製において有用である。たとえば、本発明のペプチドおよびその混合物は、ＨＴＬＶ −１およびＨＴＩＪ−［■に対する抗体を検出するための、様々な特異的結合アッセイにおいて、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１抗原の検出に有用な抗体を誘起する免疫原として有用である。さらに、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１ウイルス性感染症に対するワクチンの調製に有用である。

区画旦１亜ユ且亘図１は、ＨＴＬＶ−１幇よびＨＴＬ　Ｖ−１１のａｎｙ遺伝子生成物（ｇｐ４６およびｇｐ２１）のアミノ酸配列を示す。この配列のアミノ酸残基は、以下の一文字コードを用いて示されている：　Ａ＝Ｉａｌａｘ　Ｃｇｃｙｓ％Ｄｘａｓｐ％Ｅ＝ｇｌｕ、　Ｆ＝ｐｈｅ、、Ｇ＝ｇｌｙ、　Ｈ＝ｈｉｓ、１＝ｔｌｅ、、Ｃ１ｙｓ、　Ｌ＝１ｅｕ％Ｍｓ＋＊ｅｔ、、Ｎ＊ａｓｎＳＰ＝ｐｒｏ、　Ｑ＝ｇｌｎ％Ｒ＝ａｒｇ、　５＝ｓｅｒ、　Ｔ＊ｔｈｒ。

ｖ＝ｖｇｌ、Ｗ”ｔｒｐ、　Ｙ”ｔｙｒｏ　°３０．”は、示された配列をできる限り相同性が高くなるように並べるために加えた空白部分である。

図２は、ＩＩＴＬＶ−１およびＢＴＬＶ−１１＋７）　ｇａｇ遺伝子生成物（７）７ミ／酸配列を示す。同じく、“１８．”は、示された配列をできる限り相同性が高くなるように並べるために加えた空白部分である。

発」【９１１食本発明は、ＢＴＬＶ−１およびＩｌ［ｎ、Ｖ＝　Ｉ　Ｉのｅｎｖ遺伝子およびｇａｇ遺伝子産物の免疫優性領域に相当する、新規のペプチドおよびそのアナログを提供する。また、これらのペプチドおよびアナログの混合物および化学的組み合せも提供する。以下の説明から明瞭になるように、これらのペプチド、アナログ、混合物および化学的組み合せは、ＨＴＬＶ−［およびｆ［ＴＬＶ−１ｆおよびそれらに起因する感染症に関して、様々な治療および予防方法、手段並びに組成物において有用である。本発明のペプチド、アナログ、混合物および化学的組み合せの中には、特定の患者が、ＨＴＬＶ−１またはＩｌ［ＴＬＶ−Ｉ　Ｔのいずれのウィルスに感染しているかも区別することができるものもある。

上述したように、本発明のペプチドは、以下のものからなる群から選択される：（ｉ）以下の式を有するペプチド：ａ　−Ｈ−ｂここで、Ｘｉはｇｐ４６　ｅｎｖタンパク質（ｆｌＴＩｌ、Ｖ−ｒ）のＡＡ２ｓｔ−ＡＡ３ｇ９からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列、およびそのアナログであり；ａは、アミノ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基であり；そしてｂは、カルボ牛シ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基である；（ｉｆ）以下の式を有するペプチド：ａ　−Ｘ２−　ｂここで、ｘ２は、ｇＤ４６　ｅｎｖタンパク質（ＨＴＩ、Ｖ−１１）のＡＡ２７３−ＡＡ３＠５からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列、およびそのアナログであり、ａおよびｂは上記と同義である；（Ｈｉ）以下の式を有するペプチド：ａ　−Ｚｌ　−ｂここで、Ｚｌは、ｇａｇ　ｐ２４タンパク質（ＩＩ丁ＩＪ−１）のＡＡ２３６− ＡＡ２５７からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列、およびそのアナログであり、ａおよびｂは上記と同義である；（ｉｖ）以下の式を有するペプチド：ａ　−２２−ｂここで、ｚ２は、ｇａｇ　ｐ２４タンハク賀（ＨＴＬＶ−ＩＩ＞　のＡＡ２ａ２ −ＡＡ２６３からブロックとして取られた、少なくとも６０Ｉｉのアミノ酸の配列、およびそのアナログであり、ａおよびｂは上記と同義である；（Ｖ）以下の式を有するペプチド：ａ　−８２−ｂここで、Ｂ２は、ｇｐ４６　ａｎｙタンパク質＜ＨＴＬＶ−（１）のＡＡｌ？Ｉ −ＡＡ２ｉＩ７からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列、およびそのアナログであり、ａおよびｂは上記と同義である；（ｖｆ）以下の式を有する縦列ペプチド：ａ　−（（（（Ｊ）。−ｃ）ｏ　−（（Ｕ）ｏ）ａ　−ｄ）ｒ）ｓ　−ｂここで、ＪおよびＵは、ｇｐ４８　ｅｎｖタンパク質（ＨＴＬＶ−［）のＡＡ１９３−ＡＡ２１＠またはＡＡ２３１１−ＡＡ３＠９；　ｐ２４８ａｌＥタンパク質（ＨＴＬＶ−１）のＡＡ２３６−ＡＡ２５７；　ｐ１９　ｇｕタンパク質（、ＨＴＬＶ−１）のＡＡ＋２ｓ−ＡＡ＋３＠　；　ｇｐ４６　ｅｎｖタンパク質ＣＨＴＬＶ−１１’）のＡＡ＋ｙ＋−ＡＡ２ａｙまたはＡＡ２ｙ３−ＡＡ３ｓｓ　；　ｐ２４　ｇａｇタンパク質（ＨＴＬＶ− ［１）の＾Ａ２ａ２−ＡＡａｅａおよびｐ１９　ｇａｇタンパク質（、ＨＴＬＶ −１１）のＡＡ１２６−ＡＡＩ３８：およびこれらのアナログからなる群から、独立して選択される配列からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列およびそのアナログであり５ａおよびｂは上記と同義であり；Ｃおよびｄは、存在する場合には、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換、基であり；ｎ　ｍ　１−５であり；Ｃが存在する場合にはｏ　＊　１−５であり、それ以外の場合には０富１であり；ｐ冨１−５であり；ｑ　−１−５であり；ｄが存在する場合にはｒ　＊　Ｌ−５であり、それ以外の場合にはｒｓｌであり；そしてＳ皺１−５である。

本明細書において、「アナログ」とは、天然のＩＩＴＬＶ−１またはＨＴＬＹ− １１アミノ酸配列のブロックからなる、ペプチド鎖の１つまたはそれ以上の部位における、アミノ酸の挿入、欠失、置換および変形を指す。

本発明のペプチドの、天然アミノ酸配列への好ましい改変および置換は、保存的ならのくつまり、ペプチドの二次構造およびバイトロバシーの性質にわずかな影響しか及ぼさないもの）である。これには、Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ　’１．１９７１１においてＤａｙｈｏｆｆにより、そしてＥＭＢＯＪ。

昼、　７７９−７８５．１９８９においてＡｒｇｏｓにより説明されているような置換が含まれる。たとえば、以下の群のうちの１つに属するアミノ酸同士が、堡存的変化の例となる：　ａｌａ、　ｐｒｏｓ　ｇｔｙ、　ｇｌｕ％ａｓｐ％ｇＩｎ％ａＳｎ％５ｅｒｓ　ｔｈｒ；　Ｃａｍ５５ｅｒｓ　１ｙｒｓ　ｔｈｒ　；　ｖａｌ。

１１ｅ−１ｅｕｓ　ｍｅｔ％　ａｌａＳｐｈｅ：　１７Ｓｓ　ａｒｇｓ　ｈ１ｇ＋およびｐｈｅｓ　ｔｙｒ。

ｔｒｐｓ　ｈｔｓ、同様に、酸化しやすいアミノ酸であるメチオニンは、ノルロイシンに置換され得る。さらに、好ましい置換には、Ｄ異性体の、対応するしアミノ酸への置換が含まれる。

しかし、上述したように、このような挿入、欠失、置換および改変に関係なく、本発明のペプチドは、以下のうちの１つからブロックとして取られた少なくとも６個のアミノ酸を含有していなければならない：　ｇｐ４６　ａｎｙタンパク賀（ＢＴＬＶ−１）のＡＡ２１＋３−ＡＡ］ｌＢ９　；　ｅｎｖ遺伝子のｇｐ４６生成物（ＩＩＩＴＬＶ−１１）のＡＡ２７３−ＡＡｚｅ５；　ｇａｇタンパク質＜ＦｉＴＬＶ−１＞の９２４生成物のＡＡ２３６−ＡＡ２Ｓ７　；　ｇａｇタンパク質（ＨＴＬＹ−Ｉｆ）のｐ２４生成物のＡＡ２ａ２−ＡＡ２ｓ３　；および６ｎＶタンパク質（ＨＴＬＶ−１１）のｇｐ４６生成物のＡＡ１７１−ＡＡ２１１７゜同様に、本発明の縦列ペプチドは、上記と同義のＪおよびＵからブロックとして取られた、少な（とも６個のアミノ酸を含有していなければならない。

好ましくは、本発明のペプチドの式において、プロ、り配列ｘ１、ｘ２、ｚｌ、ｚ２、Ｂ２、ＪおよびＵは、少なくとも１０個＋７）アミノ酸の配列である。より好ましくは、少なくとも１５個のアミノ酸の配列である。さらに好ましくは、少な（とも２０個のアミノ酸の配列であり、最も好ましくは、少なくとも２５個のアミノ酸の配列である。好ましくは、本発明の縦列ペプチドの式において、ｎ５Ｏ１ｐＳｑｓ　ｒおよび＄は１−３である。より好ましくは、ｎＳＯ％ｐ％　ｑｓ　ｒおよびＳは１−２である。

この明細書中で（たとえば、ａおよびｂの定義において）用いられている「アミノ酸Ｊという用語は、　ＨＴＬＶ−［またはＩＩＴＬＶ−Ｉｆの遺伝子産物のアミノ酸配列を指す時は除いて、すべての天然アミノ酸、Ｄ配置におけるアミノ酸、および、ホモシスティン、オルニチン、ノルロイシンおよびβバリンなどの既知の、非天然、合成および改変アミノ酸を包含する。

本明細書における「ブロック」という用語は、ＨＴＬＶ−１またはＢＴＬＶ−１１の天然ポリペプチドに存在するものと同一のアミノ酸配列を指す。

上記（ｖ　ｉ）に示したように、縦列ペプチドを用いることも本発明の範囲に含まれる。これらのペプチドは、ポモポリマー、コポリマーまたはマルチマーであり得る。我々は、これらの縦列ペプチドが、ＨＴＬ’ｉ抗体に対して非常に高い度合の反応性を示すことを、予期せず見いだした。本発明のペプチドと縦列ペプチドとの物理的混合物もまた、本発明の範囲に含まれる。

ＨＴＬ　Ｖ−１のｅｎｖ遺伝子のｇＪ）４６に由来する、本発明のペプチドの実例は以下の通りである：ＢＣＨ−４１６ａ−ＡＩＶＳＳＰＳＨＮＳＬｒＬＰＰＦＳＬＳＰＶＰＴＬＧＳＲ −ｂ　ｅｎｖ（２８３−３０９）ここで、２８９位のシスティン残基は、↓リンに置換され、ａおよびｂは上記と同義である。

１１ＴＬＹ−１１のｅｎｖ遺伝子の１ｐｔｅに由来する、本発明のペプチドの実例は以下の通りである：ＢＣＨ−２１９ａ−ＬＶＨＤ５ＤＬ藷孔’！’Ｐ５Ｔ５ＷＴＴＫＩＬ−ｂ　ａｎｙ（ｌｌｉ＋６−２０７６−２０７）ＥＣａ−’！’！’ＤＮ５ＮＮ５ＺｒＬＰＰＦＳＬｕＶ−ｂ　ａｎｖ（２Ｅ１１−２９９）ＢＣＨ−４０７ａ−ＹＱＰＲＬＱＡＸＴＴＤＮＳ’ＭＮＳＸＸＸＪＰＦＳＬ）ＪＩＶ−ｂ　ｅｎｖ（２７］−２９９）ＢＣＨ−４１８ａ−ＴＴＤＮ５ＮＮ５ｘＺＬＰＰＦＳＬＡＪＩＶＰＰＰＡＴＲ−ｂ　ｅｎｖ（２８１−３０５）ＢＣＨ−４４７ａ−ＦＸＴＳＥＦＩＴＱＰＰＭ’５ＰＰＸ、ＩＮＤＳＤＬＥｋｒＶＬＴＰＳＴＳ−ｂ　ａｎｖ（１７１−ＢＣＨ−４８６ａ−ＴＳΣ？’１ＰＰＰＴＳＰＰＬＶＫＤ！；ＤＸＸＷＬ−ｂ　ａｌｍＶ（ユ７コー１９６ンｎｄＢＣＨ−４５６ａ−ＴＳＥＦ！’ＱＰＰＰＴＳＰＰｕ、ＶＨＤＳＤＬＥＨＶＬ− ｂａｎｖ（Ｘ７コー１！１６−Ｌ−１８７−ここで、ａおよびｂは上記と同義である。

１１ＴＬＶ−１のｇ３ｇ遺伝子の９２４に由来する、本発明のペプチドの実例は以下の通りである：ＢＣＨ−４１１ａ−ＱＱＧＬＲＲＥＹＱＱＬＷＬＡＡＦＡＡＬＰＧＳ−ｂ　ｇａｇ（２３６−２５７）ここで、ａおよびｂは上記と同義である。

ＨＴＬＶ−１１のｇａｇ遺伝子の９２４に由来する、ペプチドの実例は以下の通りである：ＢＣＨ−４１２ａ−ＱＱＧＬＲＲＥＹＱＮＩＪＬＡＡＦＳＴＬＰＧＮ−ｂ　ｇａｇ（２４２−２６３）ここで、ａおよびｂは上記と同義である。

本発明の好ましい縦列ペプチドは以下の式によって示される：ａ−Ｊ−ｃ−Ｕ−ｂここで、ａ、　ｂ％Ｃ％ＪおよびＵは上記と同義である。最も好ましくは、ＪおよびＵの一方がＨＴＬＶ−１ペプチドから選択され、もう列ペプチドの実例は以下の通りである：ＢＣＨ−２３４　ａ−ＰＨ３ＮＬＤＨＩＬＥＰＳＩＰＷＩＳＩ：ＰＹＶＥＰＴＡＰＱＶＬ−ｂここで、Ｊは、Ｎ−末端（ａ）にＰｒｏ残基が加えられ、Ｃ末端のＬｅＵ残基が取り除かれた、ＢＣト１５２（ＨＳＮＬＤＨ［ＬＥＰＳＩＰＷＫＳＫＬ）　（ＨＴＬＶ−２のｅｎｖ遺伝子に由来：　ａｎｙ（１９３−２１０））であり、Ｃは存在せず、Ｕは、８０１２２ｇ（ＰＹＶＥＰＴＡＰＱＶＬ）　（ＨＴＬＹ−１）ｇａｇ遺伝子に由来′：ｇ３ｇ（１２Ｇ−１３０）、ｐ１９の最後の１１個のアミノ酸（図２））である。

本発明の好ましいペプチドは、ＢＣｌｌ−２１９、ＢＣｌｌ−４０７、ＢＣＩＩ −４１６、ＢＣト４１ｇ、ＢＣｌｌ−４４７、ＢＣＨ−４５６，８０１４ｇ６、および縦列ペプチドＢＣト２３４である。本発明の最も好ましいペプチドは、ＢＣＩＴ−４１６、ＢＣＨ−４５６、ＢＣＨ−４８６、およびＢＣＢ−２３４である。本発明の好ましいペプチド混合物は、少なくともＢＣｌｌ−４１５を含有している。

より好ましくは、少なくともＢＣｌ２−４１５およびＢＣト２３４を含有し、最も好ましくは、少なくともＢＣＨ−４１６、ＢＣＨ−２３４およびＢＣＨ−４５６を含有している。

ＨＴＬＶ−１およびＩ＋の診断手段、方法および組成物において使用することに加えて、本発明のペプチドは、ＩＩＩＴＬＶ−Ｉ感染を■ＴＬＶ−１１感染と区別するためにも用いられ得る。このような診断上の区別は、たとえば、試料を本発明のＨＴＩＪ−１由来ペプチドで、またはその混合物をその他のＨＴＬＶ−１由来ペプチドで、そして、本発明のＨＴＬＹ−１１由来ペプチドで、またはその混合物をその他のＨＴＬＶ−１１由来ペプチドで、それぞれ別個にテストし、どのペプチドが最も強（反応したかを判断することによって行われる。このような方法にとって好ましいペプチドは、１ｆＴＬＹ−１感染の同定にとッテはＢＣＨ −２３４”Ｃ’あり、ＨＴＬＹ−１１！！染の同定についてはＢＣＨ−４５６およびＢ（Ｈ−４８６である。

本発明のペプチドおよびその混合物は、ＨＴＬＶ感染症に対するワクチンにおいても有用である。ＨＴＩＪ−１およびＩ＋に対する抗体価は、非常に低く、これらのウィルスが、あまり免疫原性がないか、または正常の免疫反応を低下させる免疫抑制エピトープを有していることを示している。このように、中和抗体の誘発の原因であるこれらのエピトープのみを再現する合成ペプチドを用いることは、合成ワクチン候補の開発に有意義である得る。従って、ＨＴＬＶ−１およびｌ ’ｆＴＬ　Ｖ−目感染症に対するワクチンにおいて、これらのペプチドを用いることも本発明の範囲に含まれる。

本発明のペプチドおよびその混合物の、予期せぬ利点はその高い感度にある。これらのペプチドおよび混合物は、抗１１ＴＬＶ−１／ＩＩ用キットの性能を検査するために販売されている、市販のパネルに存在する、血清学的に陽性と確認された試料の大半、時には全てについて、ＨＴＬＶ−１／Ｉ　ｌ特異性抗体を検出し得る。本発明のペプチドおよび混合物のもう１つの利点は、その高い特異性− 一偽陽性の数の少なさである。たとえば、上記のペプチド混合物（ＢＣト２１９、ＢＣＨ−２３４およびＢＣＨ−４１６）を用いて、正常な血液提供者集団から得た１５０個の試料をテストすると、偽陽性は全く記録されなかった。さらに、これらの陰性の試料について、カットオフで記録された平均０．　Ｄ、率は０゜２５であった。

上記に簡単に触れたように、選択したペプチドを、免疫診断試薬として、またはワクチンの活性成分としてより有用にするために、本発明のペプチドを改変することは、有用であることが多く、かつ、確実に本発明の範囲に含まれる。このような変化には、たとえば以下のようなものが含まれるニー　スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートなどの異種二官能基架橋試薬による、ペプチドの適切なキャリアへの結合を容易にするために、１つまたは両方の末端にシスティン残基を加えること。このような結合を行うのに好ましい試薬は、スルホスクシンイミジル−スルホスクシンイミジル−４−（トマレイミドメチル）シクロへ牛サンー１−カルボ牛シレートおよびＮ−スクシンイミジル− ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートである； −支持体またはより大きなペプチドまたはタンパク質への結合のため、あるいは、ペプチドの物理的または化学的特性を改変するため、ペプチド相互の結合を容易にするように、ペプチドの一方または双方の末端に、１から８個のアミノ酸をさらに追加すること。このような変化の例としては、リンカ−として、トまたはＣ−末端チロジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸をエステル化反応によって添加すること、およびシッフ塩基またはアミド形成を介して結合し得るリジンを添加することが挙げられる。上記のように、このように追加されるアミノ酸には、あらゆる天然アミノ酸、Ｄ−配置のアミノ酸、および既知の非天然の合成および改変アミノ酸が含まれる； −たとえばアシル化またはアミド化によって、ペプチドの一方または双方の末端を誘導体化すること。このような改変の結果、ペプチドの実効電荷が変化し、固体支持体、キャリアまたは別のペプチドへの、このペプチドの共有結合を高めることもできる。結合を容易にする、またはペプチドの免疫原性あるいは抗原活性を改善するのに効果的な置換基の例としては、Ｃ２−ＣＩｅアシル基、ポリエチレングリコールおよびリン脂質が挙げられる。

本発明の新規なペプチドを調製するためには、従来のペプチド生成方法のいずれをも用い得る。例としては、合成、組換えＤＮＡ技術およびその組み合せが挙げられる。我々は、固相合成が好ましいと考える。この合成方法においては、樹脂支持体は、ペプチドの固相調製の分野で従来から用いられるあらゆる適切な樹脂であり得る。好ましくは、ｐ−ベンジルオ牛ジアルコールポリスチレンまたはｐ −メチルベンジドリルアミン樹脂である。第一の保護アミノ基の樹脂支持体への結合の後、このアミノ保護基を当該分野で従来用いられる常法によって除去する。アミノ保護基の除去の後、選択されたペプチドを得るのに所望の順番で、残った保護アミノ酸、および、必要に応じて、引き続いて側鎖保護アミノ酸を結合させる。

あるいは、樹脂に固定されたアミノ酸配列の結合に先だって、溶解方法を用いて多数のアミノ酸基を結合し得る。

適切な結合試薬の選択は、従来技術に準する。たとえば、適切な結合試薬は、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、またはＮ、　Ｎｏ−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）　、または単独、あるいは１−ヒドロ牛ジベンゾトリアゾール存在下でのベンゾトリアゾール−１−イルオ手シートリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムへ牛すフルオローホスフェートである。その他の有用な結合方法では、前もって形成された、保護アミノ酸の対称無水物を用いる。

伸長していくポリペプチド鎖に導入された各アミノ酸に用いられる、必要なα− アミノ保護基１ヨ、好ましくは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）であるが、結合条件の下で劣化せず、かつ、伸長していくペプチド鎖にすでに存在しているその他のすべての保護基の存在下で、容易に選択的に除去できる限り、その他のあらゆる適切な保護基をも用い得る。

側鎖アミノ酸の保護基の選択基準は以下の通りである：（ａ）合成の各段階において、α−アミノ保護基の除去を選択的に行うための反応条件の下での、保護基の様々な試薬に対する安定性：（ｂ）保護基の有利な特性を保持する力（つまり、結合条件の下で分裂しないこと）および；（Ｃ）ペプチド合成の終了時に、ペプチド構造に影響を及ぼさない条件下で、保護基が容易に除去できること。

十分に保護され、樹脂に固定されたペプチドは、５０％から６０％のトリフルオロ酢酸の塩化メチレン溶液を用いて、アニソール、チオアニソール、硫化エチルメチル、１．２−エタンジチオールおよび類似の試薬などの適切な不純物除去剤の存在下で、ｌから６時間、室温で、ｐ−ベンジルオキシアルコール樹脂から開裂されることが好ましい。同時に、はとんどの酸不安定側鎖保護基が除去される。より多くの酸耐性保護基が、一般に［ｌＦ処理によって除去される。

本発明のペプチドは、当該分野で公知の方法による、ＨＴＬＶ−■およびＨＴＬＶ−１１関連抗体の検出および定量のための診断試薬としてｌｒ眉である。これらの方法には、ＥＬＩＳＡ、血球凝集反応、シングルドツトおよびマルチドツト法およびアッセイが含まれる。

本発明のペプチドま−たはペプチド混合物を用いた、ＨＴＬ’／−［および［ＩＴＬＶ−１１に対する抗体を測定するための、好適で、筒便で従来から用いられている技術は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。このアッセイにおいて、たとえば、本発明のペプチドまたは混合物は、マイクロタイタブレートのウェルに、吸着または共有結合される。そしてウェルは、テストされる血清または分析物で処理される。洗浄後、ペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＭをウェルに加える。ペルオキシダーゼの測定は、相当する基質、たとえば３，３°、５，５−テトラ−メチルベンジジンで行われる。ペルオキシダーゼを、その他の標識に、たとえば、放射性、蛍光性、化学ルミネセンス、または赤外線放射標識に代えても、この例に挙げたアツセイの有用性を失うことはない。

本発明のペプチドおよび混合物を用いた、■ＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１に対する抗体の、もう１つの測定方法は、いわゆる「二重抗原サンドイッチアッセイ」による酵素免疫学的テストである。この方法は、ｆｍｕｎｏｌｏｇｉｃａＩ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　２０．２５−３４．１９７８に説明されている、Ｍａｉｏｌｉｎｉの研究に基づいている。この方法によると、テストされる血清またはその他の分析物を、本発明のペプチドが被覆された固相（捕捉層）と、ペルオキシダーゼまたはその他の標識で標識された本発明のペプチド（プローブ層）とに接触させる。

免疫学的反応は、１つまたは２つの工程で行われ得る。免疫学的反応が２つの工程で行われる場合には、通常２つのインキユベーシヨンの間に洗浄工程を行う。

この免疫学的反応の後にも、通常、洗浄工程が行われる。その後、ペルオキシダーゼまたはその他のシグナルが測定される。この時、たとえばペルオキシダーゼについてはＯ−フェニレンジアミンを用いる。すでに説明したものも含めて、その他の酵素およびクロモゲンもこのアッセイで用い得る。

上述のアッセイおよびアッセイ法で用いられる適切な固相としては、アミラーゼ、デキストラン、天然または改変セルロース、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガロース、マグネタイト、多孔性ガラスパウダー、フッ化ポリビニルジエン（ｋｙｎａｒ）およびラテックスなどの無機および有機ポリマー、テスト容器（つまり、試験管、タイタープレートまたはガラスあるいは人工材料のキュベツト）の内壁、および固体物（つまり、ガラスあるいは人工材料の桿状体、末端が厚くなった桿状体、末端にローブまたはラメラを有する桿状体）の表面が挙げられる。固相キャリアとしては、ガラスおよび人工材料の球が特に適切である。

本発明のペプチドおよび混合物は、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬ　Ｖ−目に対する抗体の測定および定量にのみ有用なわけではない。■ＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ −１１抗原そのものの測定および定量にも有用である。なぜなら、本発明のペプチドは、遊離していても、適切なキャリアに重合または接合していても、抗体、特に、そして好ましくは、ＨＴＬ’ｉ−１およびＦＩＴＬＹ−目の抗原に対して免疫学的に交差反応するモノクローナル抗体を誘起するのに有用だからである。

このような抗体は、たとえば、哺乳動物または鳥類に十分な量のペプチドを注射して、所望の免疫反応を引き起こし、その動物の血清からその抗体を回収することによって生成し得る。抗体を誘起するのに適切な宿主動物としては、たとえば、ウサギ、ウマ、ヤギ、モルモット、ネズミ、マウス、ウシ、ヒツジおよびニワトリなどが挙げられる。好ましくは、所望のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、本発明のペプチドおよび従来の技術を用いて調製される。

たとえば、モノクローナル抗体を生成する、公知のｌ［ｏｈｌｅｒおよびＭｉｓｔｅｉｎの技術が用いられ得る。同一の抗原に対する、モノクローナル抗体と異なったエピトープに対するモノクローナル抗体とを区別するために、５ｔａｈｌｆら（Ｊ、　ｏｆ　ｌｍ５ｒｕｎｏｌ。

ｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　３Ｊ−、２９７−３０４，１９８０）の方法が用いられ得る。

上記の抗体を用いた、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１、あるいはその一部の測定または定量においては、一般に公知の様々な方法が用いられ得る。このような方法のうちの１つにおいて、既知量の、アッセイされるべき血清試料またはその他の分析物、放射線標識された本発明のベプチβまたは混合物、および標識されていない本発明のペプチドまたは混合物を、混合し、一定量の抗ペプチド抗体、好ましくはモノクローナル抗体を加え、この混合物を放置する。その後、得られた抗体／抗原複合体を、当該分野に公知の方法、つまり硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、過剰の、または不溶性支持体に結合された箪二の抗体、あるいはデキストラン被覆された炭で処理することによって、非結合試薬から分離する。そして、標識されたペプチドの濃度を、結合相または非結合相のいずれかで測定し、公知の方法で、標識された成分のレベルを標準曲線と比較することによって、試料のＨＴＬ　Ｖ−１またはＨＴＩ、Ｖ−１夏抗原含有量を測定する。

これらの抗体をアッセイで用いる他の適切な方法は、「二重抗体サンドイッチアッセイ」である。このアッセイでは、テストする試料をたとえば、ヒツジとウサギなどの異なる動物を本発明のペプチドまたは混合物で免疫することによって得られる、２つの異なる抗体で処理する。抗体のうちの一方は標識され、他方は固相にコートされる。好ましい固相はプラスチックビーズであり、好ましい標識はホースラディツシュパーオキシダーゼである。

「二重抗体サンドイッチアッセイ」においては、典型的には、試料は固相抗体および標識された抗体と共にインキュベートされる。しかし、まず、試料を固相抗体に接触させ、その後、任意に洗浄した後、試料を標識された抗体に接触させることも可能である。しかし、試料は、固相抗体と標識された抗体と共に処理されることが好ましい。この免疫学的反応の後、混合物を洗浄し、当該分野に公知の方法で標識を測定する。パーオキシダーゼをａｌ識として用いる場合には、たとえば０−フェニレンジアミンまたはテトラメチルベンジジンを有する基賀を用いて、この測定を行ってもよい。標識された成分の童は、分析物または血清試料に存在する抗原の量に比例する。

ＨＴＬ　Ｖ−ｒおよびｌｌＴｌ、Ｖ−目抗原またはこれらのウィルスに対する抗体の、測定および定量を行う方法およびアッセイは、上述Ｉ　のように、本発明のペプチドまたは混合物、あるいはそのペプチドおよび混合物によって誘起されたＩｌ［ＴＬＶ−［またはＥ［ＴＩ、Ｖ−ｒＩに対する抗体によって特徴付られる、適切なテストキットを用いても行い得る。

ｊ　上記のように、本発明のペプチドおよび混合物は、ワクチンの活性成分としても有用である。このワクチンは、Ｉｌ［ＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１に対する保護的免疫性を、これらのウィルスに感染しやすい宿主において誘発できる。投与経路、抗原の投与量、注入の回数と頻度は、個体によって異なり、他のウィルス性感染に対する免疫性を与えるのに現在用いられているものと同様である。たとえば、本発明のワクチンは、ヒトを含む哺乳動物に効果的な量で、少なくとも１つの本発明のペプチドまたは混合物を含有している薬学的に許容し得る組成物である。この効果的な量とは、該哺乳動物が、ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ −１１感染から一定期間保護されるのに十分な抗体を誘起するのに、十分な雪のことである。

ワクチンは公知の方法で開裂される。本発明のワクチン組成物は、従来から、薬学的グレードの生理食塩水、破傷風毒素、およびキーホールリンベットホモシアニンなどの、薬学的に許容できるキャリア物質に、都合よく簡便に結合され得る。本発明のワクチン組成物は、ミＭウバン製剤、リポソームまたは免疫調節剤などの、アジユバントまたはその他の免疫反応のエンハンサ−も含有し得る。さらに、これらのワクチン組成物は、■ＴＬＩ／−１またはＨＴＬＶ−１１の他に、その他のウィルスＣＨＥＷ−１および旧ｖ−２、サイトメガロウィルス）または病原体に対する免疫性を提供するために、その他の抗原を含有し得る。これらのその他の抗原の量も、処置される哺乳動物および疾病の病因による。しかし、抗原は、処置される哺乳動物を、病原体またはウィルスから一定期間保護するのに十分な抗体を誘起するのに効果的な量で、存在しなければならない。

本発明のペプチドの合成および側層の一般的方法は下記の通りである。

ム二−ｏｃ　アミ／　がム　の塩化メチレン（ＣＨ２Ｃ１２）とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の混合液（４：１）中の、所望のＮ−ＦＭＯＣ保護アミノ酸残基を、Ｏ’Ｃで、Ｃ）１２Ｃ１２：ＤＭＦ　（４：１）のｐ−ベンジルオキシアルコール樹脂懸濁液に加えた。

この混合物を、数秒間、手動で撹拌し、Ｎ、　Ｎ’−ジシクロへキシル−カルボジイミド（ＤＣＣ）で、続いて、触媒量の４−（ジメチルアミノ）ピリジンで処理した。この混合物を、０℃で、さらに３０分間撹拌し、その後、室温で一晩撹拌した。濾過した樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２、ＤＭＦおよびインプロパツール（各３＠洗浄）、そして最後にＣＨ２Ｃ２２で、順に洗浄した。こンを撹拌した懸濁液に加え、続いて塩化ベンゾイルを加えた。

０℃で３０分間、その後、室温で６０分間撹拌を続けた。濾過した後、この樹脂を、Ｃ１１２Ｃ１２、ＤＭＦおよびインプロパツール（各３回洗浄）、そして最後に石油エーテル（２回）で、順に洗浄し、真空中で乾燥して、定重量にした。

Ｍｅｉｅｎｂｏｆｅｒら（Ｉｎｔ、Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、、　ｌｊ、３５゜１９７９）による置換の分光光度計測定によって、この樹脂の置換の度合が示される。

方法ｌ工　その′のアミノ　の　ＡＮ−ＦＭＯＣ保護された、第一のアミノ酸残基が結合した樹脂を、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　９６００　Ｐｅｐｔｆｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｆｚｅｒの反応器に入れ、以下のように処理した：１）ｌ）ＭＰで洗浄（２０秒ずつ、４回）２）ピペリジンの３０％ＤＭＰ溶液で前洗浄（３分）３）ピペリジンの３０％ＤＭＰ溶液で脱保護（７分）４）ＤＭＦで洗浄（２０秒ずつ、８回）５）ａ離アミノ基をチェック−Ｋａｉｓｅｒテスト（陽性でなければならない）６）ペプチド樹脂を、１６等量の４−メチルモルホリンを含有する、乾燥再蒸留されたＤＭＦに溶解している、８等量の所望のＦＭＯＣ保護アミノ酸、および１ −ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびベンゾトリアゾール−１−イロ牛シートリス（ジメチル−アミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートと共に、１または２時間、ゆっくりと撹拌した。

７）ＤＭＦで洗浄（２０秒ずつ、６回）工程７の後、ニンヒドリンテストのために一部を取り出した。このテストが陰性の場合には、工程１に戻って次のアミノ酸を結合する。このテストが陽性、またはわずかに陽性の場合には、工程６と７とを繰り返す。

上記のスキームは、本発明のペプチドの各アミノ酸を結合するのに用い得る。ＦＭＯＣにょるＮ−保護は、合成全体を通じて、残りのアミノ酸それぞれに用い得る。

上記の結合プロトコルを用いて、トリチウム化されたアミノ酸を導入することによって、放射線標識されたペプチドが調製され得る。

最後のアミノ酸を加えた後、ト末端残基のＮ−ＦＭＯＣを、上記ス４−ムの工ｒｔｘ〜７に戻ることによって除去する。このペプチド樹脂を、ＣＢ２Ｃ１２で洗浄し、真空中で乾燥し、粗製の保護ペプチドを得た。

万洗ｌ二　ｕか゛のペプチドの　およ保護されたペプチド樹脂を、２．５％エタンジチオールおよび２．５％のアニソールを含有する、５５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液に懸濁した。この混合物をＮ２で洗い流し、室温で１．５時間撹拌した。混合物を濾過し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。この樹脂を再び、２ｏ％ＴＦＡのＣＢ２ｃ１２溶液で、室温で５分間処理した。この混合物を濾過し、樹脂を２ｏ％ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液で洗浄し、その後ＣＨ２ＣＩ　２で洗浄した。結合した濾過物を、真空中で、３５℃未満でエバボレートし、残滓を乾燥ジメチルエーテルで数回粉砕した。この固体を、１０％の酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥して粗製の生成物を得た。

ａｒｇおよびｅｙｓ残基を含有するペプチドは、アニソールおよび硫化ジメチルの存在下、０℃で、１時間、ＨＦ処理することによって、さらに脱保護される。

ペプチドを、１０％の酢酸水溶液で抽出し、ジメチルエーテルで洗浄し、凍結乾燥して、粗製のペプチドを得た。

立法まエ　ニヱｉ上亘星Ｉ粗製のペプチドを、Ｃ１８またはＣ４逆相のＶｙｄａｃカラム（２，５Ｘ　２５　ａｍ）で移動相を勾配させた、分取ＨＰＬＣによって精製した。

流出物を、２２０ｎｖａでモニターし、続いて、分析用ＨＰＬＣでモニターした。関連した画分をプールし、エバボーレートし、凍結乾燥した。合成ペプチドの同定は、分析用逆相クロマトグラフィーおよびアミノ酸分析によって確認された。

左ＬＬ：　ウシ　゛アルブミン　たはキーホールｉンペット？モジアニンへのペプチドの　へスルホスクシンイミジルト＜ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）　、またはスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）にあらかじめ結合したＢＳＡまたはＫＬＩＩに、ペプチドを結合させた。

スルホ−ＳＭＰＢまたはスルホ−ＳＭＣＣの水溶液（ピアス化学薬品）を、ＢＳＡまたはＫＬＨの、０．０２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７、０）溶液に加えた。この゛混合液を室温で４５分間撹拌し、即座に、活性化されたキャリアを、４℃で、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムにかけた。

活性化したキャリアに相当する、軍−ピークの吸収（２８０ｎｍ）の画分は、ペプチドの、０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，２）溶液を加えた、丸底フラスコ内で結合させた。この混合物を、Ｎ２で完全に洗い流し、室温で一晩インキコベートした。３■−標識されたペプチドを用いて、接合のアミノ酸分析によって、結合効率をモニターした。

ｍ　ムイムノソルベントア・・セイ　Ｉｓ　によＶ−たは　Ｖ−に・　る　のマイクロタイタブレートの各ウェルを、１００１のペプチドまたはペプチド混合物を含有する溶液（１０Ｍｇ／■ｌ）で満たし、−晩装置した。そのウェルを空にし、洗浄緩衝液（トリス、０．０４３Ｍ；　ＮａＣ１，０，５Ｍ；チメロサール、０．０１％ｖ／ｖ；）ウィーンｚｏ、　ｏ、ｏｓ％ｖ／ｖ；　ｐＨ７，４）で２回洗浄した。次に、そのウェルを、３７℃で１時間、０．３５■ｌの洗浄緩衝液で満たし、同じ緩衝液で１回洗浄した。分析する血清試料を標本緩衝液（洗浄緩衝液プラスカゼイン、Ｏ，ＯＳ％Ｖ／Ｖ）で希釈した。ウェルを洗浄緩衝液ですすいで、希釈した血清試料（０，１ｍ１）を加えた。これを室温で１時間インキュベートした。そして、ウェルを空にし、洗浄緩衝液で、素早（２回、その後２分間にわたって１回洗浄した。１％Ｗ／Ｖウシ血清アルブミンの洗浄緩衝溶液で希釈した結合溶液（ペルオキシダーゼ標識され、アフィニティーで精製された、ヒトＩｇＧまたはヒトＩｇＭに対するヤギ抗体、５■ｌの５０％グリセロール中の０．５ｍｇ）を、各ウェルに加え（０，１■ｌ）、室温で１時間インキュベートした。その後ウェルを空にし、洗浄緩衝液で５回洗浄した。基貫溶液（３゜３’、５．５−テトラメチルベンジジン、ＤＭＳＯ１■ｌにつき８ｍｇ）を、０．１％ｖ／ｙの３０％■２０２を含有する１００容量の０．１Ｍクエン酸−酢酸緩衝液（ｐＨ５，６）で希釈し、各ウェルに加えた（ウェル１つにつきｏ、　１ｍ１）。３０分後、各ウェルの内容物をＯ，１■ｌの２Ｎ　Ｈ２ＳＯ４で処理し、４５０ｎ■での光学濃度を計測した。すべての測定を２回行った。

上述したような一般的方法を用いて、以下の特定のペプチドを調製した：　ＢＣｌｌ−１５２、ＢＣト２１９、ＢＣＩＩ−２２１、ＢＣＨ−２２８、ＢＣＨ−４１２、ＢＣＨ−４１６、ＢＣＨ−４１８、ＢＣＨ−４４７、ＢＣＨ−４５６およびＢＣＨ−４１１６゜次に、ＨＴＬＶ−１および■ＴＬＶ−１１に特異的な抗体を検出する能力について、これらのペプチドを評価した。

（以下余白）案ＪＬＬ実験１においては、個々のペプチドＢＣ１１−１５２、ＢＣＩＩ−２２８、等量のＢＣ［１−１５２とＢＣＨ−２２８との混合物によって形成したカクテル、および個々のペプチドＢＣＢ−２３４を、血清学的に陽性の、および陰性の血清試料と血漿試料との、ｆネルを用いて、ＥＬＩＳＡアツセイで比較した。ＢＣＩＩ −２３４は、縦列ペプチドであり、（ト末端にＰｒｏ残基を有する）　ＢＣＨ− １５２がＢＣＨ−２２１１に結合して−する。その結果を、シグナルのカットオフに対する比率で表わし、表１１こ示す。

（以下余白）表１イ１ベヤフ・千ド１；；３　ε工ＡＢＢｒ−１６５１　ＫＥＧ　Ｏ，５００，５８０，５００，４４Ｂ−１４ＰＯ５Ｏ，８５６，３７２，１０１１，５Ｂ−：１１　ＦｏｓＬ５５　５．０５１　２．１０　１２．８ＡＯ２−５ＰＯ５″　０．３２　０．３９　０．２８ＡＯ２− ６ＸＮＤ會會　０．３Ｂ　０．３６　０，２３ＡＯ２−７ＰＯ５Ｏ４００，７９２，７２ＡＯ２−８ＰＯ５０，５２０，６コ　。１４３ＡＯ２−９ＰＯ５Ｏ，７８０，６６０，４７ＡＯ２−１０ＰＯ５ｇ、７Ｚ　４．７３　１０．５表１において、Ｂ−という番号をつけた試料は、日本で得られたものであり、ＢＢＩ−１６８、ＳＣ１＊１／２５０およびＡＯ２−という番号をつけた試料は米国で得られたものである。上述のように、アメリカで得られた感染試料は、日本で得られた血液試料で計測された抗体価より低い抗体価を有している。

この実験において、ＥＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１に対する抗体の存在下で陽性と考えられる試料のカプトオフは、陰性の対照試料（ＢＢ［−１６８）で得られるＯ、Ｄ、値プラス０．１０と等しいと定義した。示した結果は、シグナルのカットオフに対する比率である。１．０以上の比率を示す血清試料は、陽性と考えられる。

ベブチ）’ＢＣ１ｉ−１５２ハ、これらのＨＴＬＶ−１／ＨＴＬＶ−１１１ｍ対して血清学的に陽性である２１個の試料のうち８個を認識した。ペプチドＢＣＨ −２２１１は、２１個の試料のうち１４個を検出した。ペプチドＢＣＨ（２８は、日本で得られた試料はすべて検出し得た（抗体価は比較的低いものの）が、アメリカの試料は１０個のうち２個しか検出しなかった。このように、血清の起源が、これらの個々のペプチドを用いた最終的な感度の違いにつながっている。

ペプチドＢＣＨ−１５２および５ｃｍ−２２ｓは、ＨＴＬＶ−１ウィルスの別々のエピトープを表しているため、検出感度を増大しようとして、我々はこれらを混合した。表１に示すよう４、こ、この混合物で計測したシグナルは、すべての場合において、２つのペプチドをそれぞれ単独で用いて計測したシグナルの最高より低かった。従って、これら２つのペプチドを混合しても、さらなる効果は見られなかった〇驚くべきことに、たとえばＢＣＩＩ−２３４などの２つのペプチドの縦列は、ＨＴＬＶ−１７Ｈに対する抗体の検出ｇＲを著しく増大した。

イスレの場合においても、記録されたシグナル／カットオフ比率は、個々のペプチドまたはカクテルについてよりも、縦列ペプチドＢＣ■−２３４についての方が高かった。ＢＣＨ−２３４は、テストした２１個の試料のうち１５個を検出した。さらに、アメリカのパネルでさらに試料（ＡＯ２−７）を検出できただけではなく、日本のパネル（Ｂ−シリーズ）をＢＣト２３４で計測したシグナル／カットオフ比率は、いずれの場合にも、個々のペプチドで得られた比率より高かった。

裏腹主実験２では、Ｂｏｓｔｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ　Ｉｎｃ、から得られた、血清学的に陽性の、および陰性の血清試料ならびに血漿試料のパネルを用いて（すべて米国の系統）、ペプチドＢＣＨ−２１９、ＢＣＨ−２２１、ＢＣＨ−２９６およびＢＣＨ−２９８を、ＥＬＩＳＡでテストした。

（以下余白）表２ペプチドＢＣト２１９は、テストされた２６個の血清学的に陽性の試料のうち１７個を検出した。より重要なことには、ペプチドＢＣＨ−２１９は、ＢＣＨ−２３４で検出できなかった試料中の■ＴＬＶ抗体の存在を検出し得た（表１参照）。ペプチドＢＣＨ−２９８（ａ−ＴＴＤＮＳＮＮＳＩＩＬＰＰＦＳＬＡＰＶＰＰＰＡＴＲＲＩＩＲ−ｂ；　ＨＴＬＶ−１１ｅｎｙ　２８１−３０８）　は、　ペプチドＢｅ■−２２１の長いバージ璽ンであり、天然のシスティン残基の代わりに２８５位にセリン残基を有しており（これは、ペプチドの二量体化を防ぐため、安定性を上げるため、そしてテストの特異性を上げるためになされた）、ＺＳａの試料のうち２３個を検出した。この後者の結果は、性能がよくないペプチドＢＣＨ−２２１（ａ−ＰＦＳＬＡＰＶＰＰＰＡＴＲＲＩ！Ｒ−ｂ　ＨＴＬＶ（Ｉ　ｅｎｖ（２９３−４０８））には存在せず、ペプチドＢＣト２９ｇの抗原性を向上させるのに大きく貢献している残基ａｎｙ（２８１−２９２）の重要性を示している。

ベプｆ　ＦＢＣト２９６　（ａ−ＡＩＶＳＳＰＳＨＮＳＬＩＬＰＰＦＳＬＳＰＶＰＴＬＧＳＲＳＲＲ−ｂ　ＨＴＬＶ−■ｅｎｖ　（２８３−３１２））は、２６個の試料のうち２２個を検出したが、一般に、そのシグナルはＢＣト２９ｇを用いて得られたシグナルより低かった。しかし、後になって、ＢＣト２９ｇまたはＢＣＨ−２９６をカクテルに用いた時には、多くの数の偽陽性を検出し得るということが見い、だされた。たとえば、正常な血液提供者から得られた５００個の試料をスクリーニングすると、ＢＣＢ−２９１１が３つのペプチドを含むカクテルの一部である時には、３８個が血清学的に陽性であるとされた。これらの非特異的応答の原因となる、ＢＣｌｌ［−２９８およびＢＣＨ−２９６の領域を同定して除去するために、様々なペプチドアナログを合成した。ペプチドＢＣト４０４、ＢＣＨ−４０７、ＢＣｌｌ−４１６およびＢＣＨ−４１８は、この目的を達成するためには、特に青用であった（表３参照）。

裏簾主実験３においては、それぞれ１０μｇ／■Ｉでの、ペプチドＥＣＨ−４０４、ＢＣｌｌ−４０７、ＢＣＩＩＩ−４１６およびＢＣＩＩ−４１８で調製した溶液を、上述したように、ＥＩＡプレートを」−卜するのに用いた。ペプチドのカクテルも、上記の３つのペプチド溶液（ＢＣＨ−２１９、ＢＣＨ−２３４およびＢＣＨ−４１６）を等量混合することによって調製し、他の一連のプレートをコートするのに用いた。テストした血清学的に陽性の試料はすべて、Ｂｏｓｔｏｎ　Ｂｉｏｉ＋ｅｄｉｃａ　Ｉｎｃ、から入手した。

結果を、シグナルのカプトオフに対する比率で表し、表３に示す。この実験では、カットオフ（０，２０）は、正常血液提供者集団から得た５０の試料で計測した平均０．Ｄ、に、４標準偏差を加えたものである。　（カットオフ＝　Ｘ５ｉａ　＋　４３．Ｄ、）（以下余白）表３冷威ヤ７°−＋哨２メふ　Ｅ１八ＢＣト２９８　（ａ−ＴＴＤＮＳＮＮＳＩＩＬＰＰＦＳＬＡＰＶＰＰＰＡＴＲＲＲＲ−ｂ　ＨＴＬマーＩＩ　ｅｎｖ　（２８１−３０８））と同程度の感度を有し、偽陽性シグナルを起こさないペプチドを見つけるために、ペプチドＢＣＨ− ４０４、ＢＣＨ−４０７およびＢＣＨ−４１８を合成した。ペプチドＢＣＨ−４１８は、血清学的に陽性の試料の検出においてはＢＣＢ−２９８と同様に宵月であり正常血液提供者から得た５００個の血清試料でテストすると、偽陽性シグナルは得られなかった。このように、（最後の３個のアルギニン残基がないことを除けばＤｅｌｌ−２９８と同一の）　ＢＣＨ−４１８は、訂ＬＶ−１抗体および ■ＴＬＶ−１１抗体の検出においてはＢＣＩＩＩ−２９８と同様の感度を有し、また、さらに特異的であった。ＨＴＬＶ−１ペプチドＢＣト２９６の短いバージ１ンである。合成ペプチドＢＣ［１−４１６についても、同様の観察を行った。

その結果、Ｉｌ［ＴＬＶ−■およびＨＴＬＶ−１１双方のｇｐ４６タンパク質のＣ−末端付近に存在する、これらの３個のアミノ酸残基は、ＨＴＬＶ−１感染およびＦｉＴＬ　Ｖ〜Ｉ！感染に関連しない抗体分子の結合に寄与する、という結論が得られた。

また、好適なＨＴＬ’／−１縦列ペプチドＢＣＩＩ−２３４およびＨＴＬＶ−目の配列に由来するペプチド（ＢＣＨ−２１９およびＢＣＩｉ−４１６）を含有するペプチドカクテルをもテストした。表３に示した結果から、このカクテルは、驚くべきことに、■ＴＬＶ−１およびＨＴＬ、Ｖ−１１に対して、血清学的に陽性と確認されている、テストされたすべての試料を検出できたことがわかる。標本ＡＱ２−６は、ウェスタンプロットおよび免疫蛍光検査（ＩＦＡ）によって未決定であったが、このテストでは陰性であった。この試料は、２つのテストのうち１つではわずかに陽性であった。

支致土実験４において、１０μｇ／ｍｌの合成ペプチドＢｅト４１１およびＢＣト４１２で調製した溶液を、上記のようにＥＩ＾プレートをコードン・　するのに用いた。テストされた試料は日本から入手した。

瓢　結果を、シグナルのカットオフへの比率で表わし、表４に示す。この実験における力γトオフは、３つの陰性試料で得られた平均０．Ｄ、値に、４樟準偏差を加えたものである。

表４裏１」− 実験５においては、Ｂｏｓｔｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ　Ｉｎｃ、がら入手した、血清学的に陽性の、および陰性の血清試料と血漿試料とのパネルを用いて、ペプチドＢＣト２１９、ＢＣＨ−４４７、ＢＣ［ｌ−４５６オヨヒ５ＣＢ−４８６を、ＥＬＩＳＡセテストした。

結果（表５）を、シグナルのカットオフに対する比率で表わす。カー／　トオフは、３つの陰性血清試料で計測した吸光度の値の平均に０．１００を加えたものである。

ペプチドＢＣＨ−２１９は、テストした、２５＠の血清学的に陽性の試料のうち１８個を検出した（表５）、試料のうち２個（Ｎｏ。

Ａ０２−６およびＡＯ２−１７）は、ＢＣト２１９によると失敗し、ＷＢ未決定である。この実験では、試料ＡＯ２−２は、ＨＴｒ、Ｖ−ｆ感染の患者から得たものであるが、陽性であった。必ずしも常にこのようになるわけではなかった。

他の実験においては、この試料はＢＣト２１９では、陽性であるとは検出されない場合もあった。同様に、試料ＡＯ２−１６は、この実験では陽性と検出されなかったが、他のテストではＢＣｌｌ−２１９で検出できた。

ペプチドＢＣ１１−４４７ｉ＊、テストしたすべてのＩＩＴＬＹ−［試料およびＨＴＬＶ−１１試料を検出した。ペプｆ　）’ＢＣト４５６１１、ＨＴＬ’１− Ｅｆ）試料４個をいずれも検出せず、１個のｒａ未決定試料（Ａｏ２−６）でも陰性であった。ＢＣＢ−４８６のプロフィールまたは反応性は、ＢＣ１１〜４５６に類似している。ＢＣト４８６で計測したシグナルは、一般に、ＢＣト４５６で得られたシグナルより高いが、ＢＣＨ−４８６は、１４のＨＴＬＶ−１ｆ試料（ＡＯ２−４）で、きわどい陰性シグナル（０，９４）を示したため、後者が好ましい。

（以下余白）表５含べへ°７〜チドＩ＝、ｍｉ　Ｅ工Ａ凱１Ｎｏ、　Ｗ、Ｂ、　２１９　４４７　４５６　４８６実１」− 実験６では、ペプチドのカクテル３側を調製しく溶液ｌ聰ｌにつき、合計１０μ ｇのペプチド）、上記のように、　ＥＩＡプレートをコートするのに用いた。各ペプチドカクテルの組成物および得られた結果を表６に示す。テストした試料はすべて、Ｂ。

５ｔｏｎ　ＢｉｏｍｅｄｉｅｓＩｎｃ、から入手し、結果を、上述のように、シグナルのカットオフに対する比率として示す。

ＢＣＨ−２１９を含有する茶−のカクテルは、試料ＡＯ２−４およびＡ０２−６を検出せず；試料ＡＯ２−３はきわどい陰性であった。試料ＡＯ！−８１１ＶＢ未決定テアルが、試料ＡＯ２−３およびＡＯ２−４は、ＨＴＬＶ−１１に対して陽性であると確認されており、失敗ではなかった。

ＢＣｌｌ−４４７を含有する系三のカクテルも、試料４および６で失敗したが、試料ＡＯＺ−３は陽性と認識できた。ＢＣＨ−４４７のカクテルで記録されたシグナルは、ＢＣＨ−２１９カクテルを用いて計測されたシグナルより高かった。

最後に、ＢＣＨ−４５６を含有するカクテルは、ＨＴＬＶ−１または［ＩＴＬＶ −１１に対して陽性であると確認された全ての試料を検出し、はとんどの場合において、比率は、その他の２つのカクテルよりも高かった。この実験で、ＢＣＨ −２３４、ＢＣＨ−４５６およびＢＣｌｌ−４１６からなるカクテルは、ＩＩＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１両方に対して、血清学的に陽性である試料の検出において、最高の感度を示すことがわかる。

この実験において、正常の血液提供集団から入手した３６個の試料（Ｎｏ、　３０１から３３６）もテストした。ＢＣＨ−２１９を含有するペプチドカクテルで計測した時に、強い陽性シグナルを示した試料３１０を除いて、すべてが陰性であることがわかった。この試料は、その後、ＷＢによって陰性であると確認された。最後に、ＢＣｌｌｌ−２３４：ＢＣ）１−２１９：ＢＣＨ−４１６カクテルによって、他の試料Ｅｌｌ−２１０９−２７２は、同様に陽性であることがわかったが、これは、ＶＢ陰性であった。この試料は、他の２つのペプチドカクテルでは偽シグナルを示さず、従って、その特異性の度合が高いことを示している。

実験６で、Ｅ［ＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−１１特異的抗体を検出することを目的とする、ペプチドカクテルの感度、および特異性の両方を向上させることにおいて、ペプチドＢＣト４４７、よす好マしくはＢＣｌｌｌ−４５６が、ＢＣＨ− ２１９より優れていることがわかる。

（以下余白）表６少ベ　ヘ′フ・＋ドｒ＝Ｊｉ　ＥＩＡＮｏ、　２３４：２１９：４１６　２３４：４４フ：４１６　２コ４：４５６：４１６表６（続き）冶ブスへ°７°ラド　１−ｐ３　ε工ＡｉｍＦ角Ｎ口、　２コ４：２１９：４１６　２コ４：４４フ：４Ｌ６　２コ４：４５６＝４１６皇鳳り実験７では、ポリメラーゼチェーンリアクシ冒ン（ＰＣＲ）にようｒＨＴＬＶ− ＋　（ＨＴ−１００シ’／−ズ）またはＨＴＬＶ−ＩＩ　（ＨＴ−２００シ’） −ズ）のキャリアであると確認された患者から入手した２５個の血清試料を、ＢＣＩＩ−２３４（ＨＴＬＶ−ｒ特異性）またはＢＣＨ−２１９あるいはＢＣＨ− ４５６（ＨＴＬＹ−１１特異性）でコートされたプレートで分析した。表７に示す結果は、上述のように計算した、シグナルのカットオフに対する比率である。

表７は、ベブｆ　ＶＢＣＨ−Ｚ３４およびＢＣＨ−４５６が、ＨＴＬＶ−１ニ感染した患者から入手した試料を、ＨＴＬＶ−１１に感染した患者から入手した試料から、たやすく選択的に区別し得ることを示している。５人のＨＴＬＶ−１感染患者から得た試料を、［ＩＴＬＶ−１特異的ペプチド（ＢＣト２３４）でテストすると、強いシグナルを示し、ＢＣ）ｌ−２１９では低いシグナルしか示さない。これらの５個の試料は、ＢＴＬＶ−１１特異的ペプチドＢＣＩＩ−４５６でテストすると、すべて陰性であることに留意されたい。さらに、ＨＴＬＶ−目感染患者から得られた２０個の試料は、すべて、ＢＣＨ−４５６でたやすく検出され、ＢＴＬＶ−１１感染患者から得られた試料を、ＨＴＬＶ−１感染患者からの試料と選択的に区別する点で、その優れた能力を示している。

（以下余白）表７ＰＣＲ分析　有べＸアチμ゛ｊ；工３εｍＡＨＴ−２０工Ｈ？ＬＶ−１１１，０３５，５２２５，００）ｆＴ−２０７ＨＴＬＶ−１１，８２１，９４１４，３７これまで、本発明の実施態様を数多く説明してきたが、本発明の方法および組成物を用いる、その他の実施態様を提供するために、我々の基本的な構造を改変し得ることは明白である０従って、本発明の範囲は、上記に実施例として示された特定の実施態様によってではなく、以下の特許請求の範囲によって限定されるものである。

キｂ′ｉ″ｉ一本発明は、■ＴＬ’／−１およびＨＴＬＶ−１［感染症を検出および定量するのに有用な、新規の直鎖状ペプチド、およびその混合物ならびに化学的組み合せに関する。これらのペプチドは、ＨＴＬＶ−■およびＨＴＬＶ−１１ウイルス感染症に対するワクチンにも有用である。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法箪１８４条の８）平成５年１月１８唱

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下の式を有するペプチド：ａ−Ｘ１−ｂここで、Ｘ１はｇｐ４６　ｅｎｖタンパク質（ＨＴＬＶ−Ｉ）のＡＡ２８３−ＡＡ３０９からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列、あるいはそのアナログであり；ａは、アミノ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基であり；そしてｂは、カルボキシ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基である。
２．前記Ｘ１が、【配列があります】（ＢＣＨ−４１６）およびそのアナログである、請求項１に記載のペプチド。
３．以下の式を有するペプチド：ａ−Ｘ２−ｂここで、Ｘ２は、ｇｐ４６　ｅｎｖタンパク質（ＨＴＬＶ−ＩＩ）のＡＡ２７３ −ＡＡ３０５からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列、あるいはそのアナログであり；ａは、アミノ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基であり；そしてｂは、カルボキシ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基である。
４．前記Ｘ２が、【配列があります】（ＢＣＨ−４０４）、【配列があります】（ＢＣＨ−４０７）、【配列があります】（ＢＣＨ−４１８）およびこれらのアナログからなる群から選択される、請求項３に記載のペプチド。
５．以下の式を有するペプチド：ａ−Ｚ１−ｂここで、Ｚ１は、ｇａｇ　ｐ２４タンパク質（ＨＴＬＶ−Ｉ）のＡＡ２３６−ＡＡ２５７からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列、あるいはそのアナログであり；ａは、アミノ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基であり；そしてｂは、カルボキシ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基である。
６．前記Ｚ１が、【配列があります】（ＢＣＨ−４１１）およびそのアナログである、請求項５に記載のペプチド。
７．以下の式を有するペプチド：ａ−Ｚ２−ｂここで、Ｚ２は、ｇａｇ　ｐ２４タンパク質（ＨＴＬＶ−ＩＩ）のＡＡ２４２− ＡＡ２６３からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列、あるいはそのアナログであり；ａは、アミノ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基であり；そしてｂは、カルボキシ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基である。
８．前記Ｚ２が、【配列があります】（ＢＣＨ−４１２）およびそのアナログである、請求項７に記載のペプチド。
９．以下の式を有するペプチド：Ａ−Ｂ２−ｂここで、Ｂ２は、ｇｐ４６　ｅｎｖタンパク質（ＨＴＬＶ−ＩＩ）のＡＡ１７１ −ＡＡ２０７からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列、あるいはそのアナログであり；ａは、アミノ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基であり；そしてｂは、カルボキシ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基である。
１０．前記Ｂ２が、【配列があります】（ＢＣＨ−２１９）およびそのアナログである、請求項９に記載のペプチド。
１１．前記Ｂ２が、【配列があります】（ＢＣＨ−４４７）、【配列があります】（ＢＣＨ−４５６）、【配列があります】（ＢＣＨ４８６）、およびこれらのアナログからなる群から選択される、請求項９に記載のペプチド。
１２．以下の式を有するペプチド：ａ−（（（（Ｊ）ｎ−ｃ）ｏ−（（Ｕ）ｐ）ｑ−ｄ）ｒ）ｓ−ｂここで、ＪおよびＵは、ｇｐ４６　ｅｎｖタンパク質（ＨＴＬＶ−Ｉ）のＡＡ１９３−ＡＡ２１０またはＡＡ２８３−ＡＡ３０９；ｐ２４　ｇａｇタンパク質（ＨＴＬＶ−Ｉ）のＡＡ２３６−ＡＡ２５７；ｐ１９　ｇａｇタンパク質（ＨＴＬＶ−Ｉ）のＡＡ１２０−ＡＡ１３０；ｇｐ４６　ｅｎｖタンパク質（ＨＴＬＶ−ＩＩ）のＡＡ１７１−ＡＡ２０７またはＡＡ２７３−ＡＡ３０５；ｐ２４　ｇａｇタンパク質（ＨＴＬＶ−ＩＩ）のＡＡ２４２−ＡＡ２６３およびｐ１９　ｇａｇタンパク質（ＨＴＬＶ−ＩＩ）のＡＡ１２６−ＡＡ１３６；あるいはこれらのアナログからなる群から、独立して選択される配列からブロックとして取られた、少なくとも６個のアミノ酸の配列であり；ａは、アミノ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基であり；そしてｂは、カルボキシ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基であり；ｃおよびｄは、存在する場合には、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基であり；ｎ＝１−５であり；ｃが存在する場合にはｏ＝１−５であり、それ以外の場合にはｏ＝１であり；ｐ＝１−５であり；ｑ＝１−５であり；ｄが存在する場合にはｒ＝１−５であり、それ以外の場合にはｒ＝１であり；そしてｓ＝１−５である。
１３．前記（（（（Ｊ）ｎ−ｃ）ｏ−（（Ｕ）ｐ）ｑ−ｄ）ｒ）ｓが、【配列があります】（ＢＣＨ−２３４）およびそのアナログである、請求項１２に記載のペプチド。
１４．請求項１から１３のいずれかに記載のペプチドを１つより多く含む、混合物または組み合せ。
１５．少なくとも以下のペプチド、およびそのアナログを含む、請求項１４に記載の混合物または組み合せ：【配列があります】（ＢＣＨ−４１６）ここで、ａは、アミノ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基であり；そしてｂは、カルボキシ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基である。
１６．少なくとも以下のペプチド、およびそのアナログを含む、請求項１４に記載の混合物または組み合せ：【配列があります】（ＢＣＨ−４１６）【配列があります】（ＢＣＨ−２３４）ここで、ａは、アミノ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基であり；そしてｂは、カルボキシ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基である。
１７．少なくとも以下のペプチド、およびそのアナログを含む、請求項１４に記載の混合物または組み合せ：【配列があります】（ＢＣＨ−４１６）【配列があります】（ＢＣＨ−２３４）【配列があります】（ＢＣＨ−４５６）ここで、ａは、アミノ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基であり；そしてｂは、カルボキシ末端であって、１から８個のアミノ酸、または結合を容易にするのに効果的な置換基、あるいはペプチドの免疫原的または抗原的活性を改善するのに効果的な置換基である。
１８．分析物中の、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩ抗原に対する抗体の存在を検出する手段であって、請求項１から１３のいずれかに記載のペプチド、または請求項１４から１７のいずれかに記載の組み合せまたは混合物によって特徴づけられる手段。
１９．分析物中の、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩ抗原に対する抗体の存在を検出する方法であって、該分析物の一部を、請求項１から１３のいずれかに記載のペプチド、または請求項１４から１７のいずれかに記載の組み合せまたは混合物に接触させる工程を包含する方法。
２０．ＥＬＩＳＡ、血球凝集反応、シングルドットまたはマルチドットストリップアッセイ法からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
２１．請求項１から１７のいずれかに記載のペプチド、またはペプチド混合物あるいは組み合せに対して、免疫学的に交差反応性のある抗体、または該抗体の混合物。
２２．前記抗体が、モノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の混合物である、請求項２１に記載の抗体。
２３．分析物中の、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩ抗原の存在を検出する手段であって、請求項２１または２２に記載の抗体によって特徴づけられる手段。
２４．分析物中の、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩ抗原の存在を検出する方法であって、該分析物の一部を、請求項２１または２２に記載の抗体に接触させる工程を包含する方法。
２５．請求項１から１３のいずれかに記載のペプチド、または請求項１４から１７のいずれかに記載の組み合せあるいは混合物を含む、薬学的に許容される組成物であって、該組成物によって処置される、ヒトを含む哺乳動物において、該処置される哺乳動物がＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩウイルス性感染から一定期間保護されるのに十分な抗体を誘起するのに効果的な量で、該ペプチド、該組み合せまたは該混合物が含有されている、組成物。
２６．生理学的に許容できるキャリアを含有する、請求項２５に記載の組成物。
２７．アジュバントまたは免疫反応のエンハンサーを含有する、請求項２５に記載の組成物。
２８．ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩウイルス以外の病原体に対する第二の抗原を含有する、請求項２５に記載の組成物であって、該第二の抗原が、処置される哺乳動物が、該病原体から一定期間保護されるのに十分な抗体を誘起するのに効果的な量で含有されている、組成物。
２９．ヒトを含む哺乳動物を保護する方法であって、該哺乳動物を、請求項２５から２８のいずれかに記載の組成物で処置する工程を包含する方法。