JP2017512200A

JP2017512200A - ＨＴＬＶキャプシド抗原ｐ２４の可溶性かつ免疫反応性バリアント

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Publication number: JP2017512200A
Application number: JP2016553811A
Authority: JP
Inventors: ファーツ，エルケ; ショルツ，クリスティアン; ムエンフ，ペーター
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-02-28
Filing date: 2015-02-26
Publication date: 2017-05-18
Anticipated expiration: 2035-02-26
Also published as: CN106029687B; CA2938712A1; EP3110831B1; US20170184591A1; WO2015128394A2; EP3110831A2; US11567079B2; CN106029687A; US20200033342A1; WO2015128394A3; US10466242B2; ES2662611T3; CA2938712C; EP2913338A1; JP6491228B2

Abstract

本発明は、シャペロンに融合できる可溶性かつ抗原性のＨＴＬＶｐ２４バリアント、および診断適用における、たとえば単離した生体試料においてＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体を検出するためのイムノアッセイにおける、それらの使用に関する。特に、本発明は、ｐ２４のＮ末端またはＣ末端のどちらかのドメインを含み、他方のドメインを欠如する、可溶性ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４抗原に関する。さらに、本発明は、これらのＨＴＬＶ−Ｉおよび−ＩＩ融合抗原をコードする組換えＤＮＡ分子、ならびに発現ベクターを用いるそれらの組換え製造、ならびにそのような発現ベクターで形質転換した宿主細胞を含む。そのほか、本発明は、これらのＨＴＬＶｐ２４抗原とＨＴＬＶｇｐ２１抗原の組成物、および本発明の抗原を用いてＨＴＬＶ抗体を検出するためのイムノアッセイ法に注目する。in vitro 診断アッセイにおけるＨＴＬＶｐ２４抗原の使用、および抗ＨＴＬＶ抗体を検出するためのそれらのＨＴＬＶ抗原を含む試薬キットも包含される。【選択図】図１

Description

本発明は、ＨＴＬＶキャプシド抗原ｐ２４の可溶性かつ免疫反応性バリアントに関する。

ヒトＴリンパ球向性ウイルス(human T-cell lymphotropic virus)（ＨＴＬＶ）Ｉ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）は、１９８０年にヒトにおいて発見された最初のレトロウイルスであった。それはＴ細胞性の白血病および／またはリンパ腫、ならびにＨＴＬＶ関連脊髄障害、すなわち最終的に局所痙性不全対麻痺に至る重篤な脱髄性状態の原因因子である。これらの致命的な不治の疾患を発症する累積生涯リスクは、無症候性ＨＴＬＶ−Ｉ保因者の約５％に達する。ＨＴＬＶ−Ｉは主にＣＤ４陽性Ｔ細胞に感染する。それは成人Ｔ細胞性リンパ腫ウイルスＩ型とも呼ばれる。ＨＴＬＶ−ＩＩはＨＴＬＶ−Ｉとほぼ７０％の遺伝子相同性（タンパク質レベルで８０〜９５％の構造類似性に換算される）をもつ。ＨＴＬＶ−ＩＩの病原能はまだ完全には解明されていないが、それは世界的に主に静脈内薬物使用者に見られるので、輸血のリスクマーカーとみなされている(Vandamme et al., Evolutionary strategies of human T-cell lymphotropic virus type II, Gene 261 (2000) 171-180)。両ウイルスとも世界的に拡散しているが、ＨＴＬＶ−Ｉの有病率は南部日本（九州、四国および沖縄）、サハラ以南アフリカ、カリブ地域（ジャマイカおよびハワイ）および南米のホットスポット領域において最高である。

ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩの主な伝播様式は性的接触、輸血、注射針の共有、および授乳による母子間伝播によるものである。ＨＴＬＶ感染後のセロコンバージョン期間は、他の感染性疾患と比較すると長い。ウインドウ期間、すなわち感染後にそのウイルスに対する抗体を検出できない時間枠は、数週間から数か月に及ぶ可能性がある。

ＨＴＬＶに関する供血者スクリーニングが最初に日本で１９８６年に、米国およびカナダで１９８８／１９８９年に、フランスで１９９１年に、そして欧州および南米の数か国で１９９１年以後に導入された。これまでのところＨＴＬＶ感染についてのゴールドスタンダードは現われていない。組換えおよび／または合成ペプチド抗原に基づく幾つかのイムノアッセイがこの数年間に導入された。

抗ＨＴＬＶ抗体を検出するための市販のイムノアッセイは、しばしばウイルスのエンベロープに由来するポリペプチド（ｇｐ４６表面タンパク質およびｇｐ２１膜貫通タンパク質）またはｇａｇコードされたｐ２４キャプシドタンパク質に由来するポリペプチドを用いている。

セロコンバージョン時間が長いため、感染後の初期に抗体が出現した時点でごく少量の抗体ですら検出することが重要である。したがって、高感度イムノアッセイに適した抗原の開発が必須である。当然のこととして、不慮のウイルス拡散および伝播を防ぐためには、感染と検出の診断ギャップを詰めることが望ましい。

ＨＴＬＶ感染するとセロコンバージョンの初期にｇａｇタンパク質に対する抗体が出現することがかねてから知られていた。特に、ｇａｇコードされたキャプシド抗原ｐ２４は、体液性免疫応答の好ましい初期ターゲットである(Manns et al., Blood (1991) 77: 896-905)。これまで、ｐ２４キャプシドタンパク質のペプチドバリアントおよび組換えバリアントがイムノアッセイにおける抗原として用いられてきた。これらの抗原により、Ｇタイプの抗ｐ２４免疫グロブリンが高い正確度および満足できる感度で検出されている。しかし、この種類のｐ２４キャプシド抗原は、Ｍタイプの免疫グロブリンを結合して検出することはできない。ＩｇＭ分子は通常はセロコンバージョンに際してＩｇＧ分子以前に出現するので、本発明者らは組換えｐ２４キャプシド抗原をＩｇＭにより認識および結合されるように修飾するのは価値があるはずであると判断した。要するに、ｐ２４キャプシド抗原をテイラリングおよび工学操作することにより抗ｐ２４免疫グロブリン検出の感度を改善することが可能かどうかを思案した。特に、ＩｇＭ分子と相互作用してそれを検出できるｐ２４バリアントを設計しようとしていた。

Vandamme et al., Evolutionary strategies of human T-cell lymphotropic virus type II, Gene 261 (2000) 171-180 Manns et al., Blood (1991) 77: 896-905

したがって、本発明の基礎となる課題は、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体を検出するための、これまでに得られているイムノアッセイの制限されたセロコンバージョン感度を克服するイムノアッセイを開発することである。

この課題は特許請求の範囲に特定される本発明により解決される。
本発明は、シャペロンに融合する可溶性ＨＴＬＶｐ２４抗原、および診断適用における、たとえば単離した生体試料においてＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体を検出するためのイムノアッセイにおける、それらの使用に関する。特に、本発明は、ｐ２４配列のＮ末端またはＣ末端のどちらかのドメインを含む可溶性ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４抗原フラグメントに関するものであり、その際、ＨＴＬＶｐ２４抗原フラグメントはシャペロンに融合していてもよい。さらに、本発明は、これらのＨＴＬＶ−Ｉおよび−ＩＩ融合抗原をコードする組換えＤＮＡ分子、ならびに発現ベクターを用いるそれらの組換え製造、ならびにそのような発現ベクターで形質転換した宿主細胞を含む。そのほか、本発明は、これらの数種類のＨＴＬＶｐ２４抗原の組成物、および本発明の抗原を用いてＨＴＬＶ抗体を検出するためのイムノアッセイ法に注目する。in vitro 診断アッセイにおけるＨＴＬＶｐ２４抗原の使用、および抗ＨＴＬＶ抗体を検出するためのそれらのＨＴＬＶ抗原を含む試薬キットも包含される。

開示するアミノ酸配列の説明：
SEP ID NO. 1 : p24/HTLV-I (146-344)// P10274, １９９アミノ酸残基
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースＩＤＰ１０２７４から検索したＨＴＬＶ−Ｉｐ２４配列（ヒトＴ細胞白血病ウイルス１，株ＪａｐａｎＡＴ−１サブタイプＡに由来する１４６−３４４Ｇａｇ−Ｐｒｏポリタンパク質）の配列を示す。ナンバリングは未成熟ポリタンパク質前駆体を参照する（アミノ酸１−１３０の配列はマトリックスタンパク質ｐ１９を表わす）。アミノ酸１３１−１４５（プロリンリッチ配列）からのＮ末端１５アミノ酸残基は除かれていることを留意されたい。

SEQ ID NO. 2 : p24 NTD (146-260)/HTLV-I, １１５アミノ酸残基
ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４のアミノ酸１４６−２６０からのＮ末端ドメインを示す（アミノ酸位置のナンバリングについてはＳＥＱＩＤＮＯ．１も参照されたい）。１つの位置をＸ（下線付き）とマークしたことに注目されたい；これは、天然配列のシステイン残基がアラニンまたはセリンで置き換えられていてもよいことを意味する（Ｘ＝Ｃ、ＡまたはＳ）。

SEQ ID NO. 3 : p24 CTD (261-344)/HTLV-I, ８４アミノ酸残基
ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４のアミノ酸残基２６１−３４４からのＣ末端ドメインを示す（アミノ酸位置のナンバリングについてはＳＥＱＩＤＮＯ．１も参照されたい）。２つの位置をＸ（下線付き）とマークしたことに注目されたい；これは、天然配列のシステイン残基がアラニンまたはセリンで置き換えられていてもよいことを意味する（Ｘ＝Ｃ、ＡまたはＳ）。

SEQ ID NO. 4 : p24(146-344)/HTLV-I, １９９アミノ酸残基
長さおよび位置に関してＳＥＱＩＤＮＯ．１と同様なＨＴＬＶ−Ｉｐ２４の配列を示す。ただし、３つのアミノ酸位置はＸ（下線付き）を示す；これは、これらの位置において天然のシステイン（前駆体ポリペプチド配列に従ってナンバリングした位置ｎｏ．１９３、３１１および３３２）がアラニンまたはセリンで置き換えられていてもよいことを意味する（Ｘ＝Ｃ、ＡまたはＳ）。

SEQ ID NO. 5 : p24/HTLV-II (152-350)//P03353, １９９アミノ酸残基
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースＩＤＰ０３３５３から検索したＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４の配列（ヒトＴ細胞白血病ウイルス２由来の１５２−３３５０Ｇａｇ−Ｐｒｏポリタンパク質）を示す。ナンバリングは未成熟ポリタンパク質前駆体を参照する（アミノ酸１−１３６の配列はマトリックスタンパク質ｐ１９を表わす）。アミノ酸１３７−１５１（プロリンリッチ配列）からのＮ末端１５アミノ酸残基は除かれていることを留意されたい。

SEQ ID NO. 6 : p24 NTD (152-266)/HTLV-II, １１５アミノ酸残基
ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４のアミノ酸１５２−２６６からのＮ末端ドメインを示す（アミノ酸位置のナンバリングについてはＳＥＱＩＤＮＯ．５も参照されたい）。１つの位置をＸ（下線付き）とマークしたことに注目されたい；これは、天然配列のシステイン残基がアラニンまたはセリンで置き換えられていてもよいことを意味する（Ｘ＝Ｃ、ＡまたはＳ）。

SEQ ID NO. 7 : p24 CTD (267-350)/HTLV-II, ８４アミノ酸残基
ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４のアミノ酸２６７−３５０からのＣ末端ドメインを示す（アミノ酸位置のナンバリングについてはＳＥＱＩＤＮＯ．５も参照されたい）。３つの位置をＸ（下線付き）とマークしたことに注目されたい；これは、天然配列のシステイン残基がアラニンまたはセリンで置き換えられていてもよいことを意味する（Ｘ＝Ｃ、ＡまたはＳ）。

SEQ ID NO. 8 : p24(152-350)/HTLV-II, １９９アミノ酸残基
長さおよび位置に関してＳＥＱＩＤＮＯ．５と同様なＨＴＬＶ−Ｉｐ２４の配列を示す。４つのアミノ酸位置はＸ（下線付き）を示す；これは、これらの位置において天然のシステイン（前駆体ポリペプチド配列に従ってナンバリングした位置ｎｏ．１９９、２８１、３１７および３３８）がアラニンまたはセリンで置き換えられていてもよいことを意味する（Ｘ＝Ｃ、ＡまたはＳ）。

下記のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ．９〜１６および１８〜２４）は、実施例のセクションで用いるＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４（完全または部分）配列の融合配列を示す。タンパク質表記中のＥｃＳｌｙＤ、ＥｃＦｋｐＡおよびＥｃＳｋｐについての２文字Ｅｃは、そのタンパク質配列が大腸菌(Escherichia coli)に由来することを示す。各タンパク質はそれのＣ末端にヘキサヒスチジンタグを保有し、それはタンパク質の精製およびリフォールディングを容易にするために用いられる。

SEQ ID NO. 17 : 融合ポリペプチド間のグリシンリッチリンカー（実施例１を参照）

SEP ID NP. 25 : gp21/HTLV-I (339-446)// P14075, １０８アミノ酸残基
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリーＩＤＰ１４０７５によるエンベロープ糖タンパク質ｇｐ２１アミノ酸残基ｎｏ．３３９−４４６を示す（エンベロープポリタンパク質前駆体に由来する）。完全ポリタンパク質前駆体は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ（単離株ＣａｒｉｂｂｅａｎＨＳ−３５サブタイプＡ）の表面タンパク質（＝糖タンパク質４６、ｇｐ４６）および膜貫通タンパク質（＝糖タンパク質２１、ｇｐ２１）を含む。３つの残基をＸ（下線付き）とマークしたことに注目されたい；これは、天然配列のシステイン残基がアラニンまたはセリンで置き換えられていてもよいことを意味する（Ｘ＝Ｃ、ＡまたはＳ）。

ＨＴＬＶｇｐ２１も、たとえばＳＥＱＩＤＮＯ．２６および２７に示すように溶解性を高めたシャペロン融合ポリペプチドとして有利に適用できる。

図１は、Ｓｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤ（２６７−３５０）、ＳＥＱＩＤＮＯ．２２の近ＵＶＣＤスペクトルを示す。図２は、Ｓｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２２）の融解曲線を示す。熱誘導したアンフォールディングおよびリフォールディングを近ＵＶＣＤ分光法により２７７ｎｍでモニターしている。図３は、ＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤ（２６７−３５０），ＳＥＱＩＤＮＯ．２１の近ＵＶＣＤスペクトルを示す。図４は、熱誘導アンフォールディング／リフォールディングサイクルの後に天然ＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤ分子の近ＵＶＣＤ信号が完全に復活することを示す。

ＨＴＬＶｐ２４は抗ＨＴＬＶ抗体の検出のための重要な抗原である。ｐ２４キャプシドタンパク質は当技術分野で以前から知られており、抗ＨＴＬＶ抗体を検出するためのイムノアッセイに用いられてきた(Manns et al., Blood (1991) 77: 896-905)。ＩｇＧとＩｇＭの両分子の検出のためのイムノアッセイは、ＩｇＧ分子だけでなくＩｇＭ分子によっても認識および結合される一組の抗原を必要とする。ＩｇＭ分子は一般に、ＨＴＬＶに感染した際にセロコンバージョンの初期に出現する。多価ＩｇＭ分子の結合は高い抗原エピトープ密度に決定的に依存する。よって、ＩｇＭ分子の特異的検出のために設計された抗原はそのような高エピトープ密度を保有および提示することが必須である。

高エピトープ密度のＩｇＭ検出モジュールを作製するための一般的方法は、モノマー型抗原を化学架橋により重合させることであろう。きわめて有利に使用でき、当技術分野で周知であるホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋剤は、多数ある。それでもなお、血清学的アッセイにおいて指示子として使用するための抗原の化学誘導による重合には幾つかの重大な欠点がある。たとえば、抗原への架橋剤部分の挿入は、天然様コンホメーションに干渉することにより、または重要なエピトープをマスキングすることにより、抗原性を撹乱する可能性がある。さらに、非天然三次接点の導入はタンパク質フォールディング／アンフォールディングの可逆性に干渉する可能性があり、それはさらに、イムノアッセイ混合物において抗干渉戦略により克服しなければならない干渉問題の根源になる可能性がある。

ＩｇＭ検出モジュール作成のより最近の手法は、目的抗原をオリゴマー型シャペロンに融合させ、それによって高エピトープ密度を抗原へ伝達するものである。この技術の利点は、それの高い再現性およびオリゴマー型シャペロン融合パートナーの三重の機能にある：第１に、シャペロンは宿主細胞における融合ポリペプチドの発現率を高め、第２に、シャペロンはターゲット抗原のリフォールディングプロセスを促進し、それの全体的溶解性を高め、第３に、それは再現性をもってターゲット抗原を規則的なオリゴマー型構造に組み立てる。

欧州特許出願公開番号EP1982993 A2には、ヒトサイトメガロウイルスなどの病原体による真の一次感染をオリゴマー型シャペロンに融合する抗原の使用によって早期検出するための方法およびツールが開示されている。しかし、この公報はＨＴＬＶ感染の検出に関しては言及していない。

全長バージョンのＨＴＬＶｐ２４を用いた本発明者らの最初の試みにより、このタンパク質はシャペロンとしてのＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤまたはＥｃＦｋｐＡに融合した場合に高い溶解性を示すことが明らかになった。しかし、ｐ２４をトリマー型Ｓｋｐシャペロンと融合させた場合には、それの溶解性に限界があった。すべての化合物の溶解性が不均一イムノアッセイ適用に重要な特色であることは自明である。イムノアッセイにおけるタンパク質成分の凝集プロセスは、通常は信号の喪失（エピトープの喪失による）および特異性の喪失（固相への標識抗原凝集物の非特異的結合による）の両方を生じる。本発明者らは、ＨＴＬＶ由来の全長ｐ２４が −オリゴマー型シャペロンＥｃＳｋｐに融合させた場合− 周囲温度で生理的緩衝液中において凝集する傾向を示すのを観察した。よって、感受性の高いＩｇＭイムノアッセイに全長ｐ２４バリアントを単純にそのまま適用するのはともかく除外された。

全長バージョンのｐ２４に注目する代わりに、本発明者らは今回、トランケート型であるがなお立体的にフォールディングしているｐ２４のフラグメントを設計することを試みた。言い換えると、本発明者らは抗原開発の基礎として全長ｐ２４タンパク質の代わりにタンパク質ドメインの使用を試みた。タンパク質ドメインはタンパク質構造内で自発的にフォールディングするものである；すなわち、タンパク質ドメインはそれのフォールディングに際して他の部分または領域に依存しない。現在までに、約４０アミノ酸残基（ＷＷドメイン）から３００アミノ酸残基以上までのサイズに及ぶ多数の天然タンパク質ドメイが解明されている。きわめて小さいけれどもなお安定であるタンパク質ドメインをスクラッチ(scratch)から設計できることも証明された：２３〜２８アミノ酸配列のフラグメント長さをもつ人工ポリペプチド配列が協調してフォールディングし、かつタンパク質ドメインの特徴的な特色をもつことが示された(Struthers, M. D. et al., Design of a monomeric 23-residue polypeptide with defined tertiary structure, Science (1996) 271 (5247) 342-345; Dahiyat, B. I. & Mayo, S.L., De novo protein design: fully automated sequence selection, Science (1997) 278 (5335) 82-87; Dahiyat, B.I. et al., De novo protein design: towards fully automated protein design, J. Mol. Biol. (1997) 273 (4) 789-796)。理論的考察および実験的証拠から、タンパク質ドメインに要求される最小長さは約２５アミノ酸残基であると推定される (Porter L. L. & Rose, G. D., A thermodynamic definition of protein domains, PNAS (2012) 109 (24), 9420-9425)。

Journal of Molecular Biology (1999) Aug. 13; 291(2):491-505に、Khorasanizadehらはキャプシドタンパク質ｐ２４のＮＭＲ構造を提示し、このタンパク質のドメイントポロジーを解明している。この報文によれば、ＨＴＬＶ−Ｉ由来のｐ２４はほぼらせん形であり、２つの十分に分離したドメインからなる；すなわち、ｐ２４は２つの明確な自発的フォールディングユニットを含む。Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）にらせん１〜７があり、これに対しＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）はらせん８〜１２を含む。本発明者らはこれら２つのドメインを個々に大腸菌において発現させることが可能かどうか、また、可溶性かつ抗原性形態のオリゴマー型シャペロンポリペプチド融合体を得ることができるかどうかと思案した。

Khorasanizadehらは、ｐ２４の抗原特性（たとえば、Ｂ細胞エピトープ）およびＮＭＲ解明されたＨＴＬＶキャプシドタンパク質の何らかの診断適用に関しては言及していない。ｐ２４キャプシド抗原の単なる三次元解像構造から、それの抗原性が主にＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）にあるのかまたはＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）にあるのか、あるいはそれのＢ細胞エピトープがその分子全体に均一に分布しているかどうかは予測不可能であった。

意外にも本発明者らは、シャペロンモジュール、たとえばＳｌｙＤ、ＦｋｐＡおよびＳｋｐと融合する単離ＨＴＬＶｐ２４ドメインＮＴＤおよびＣＴＤを発現させることができた。実施例のセクションに見ることができるように、これらの構築体はすべて均一になるまで精製でき、それらは十分に溶解性であり、本発明者らはそれらの抗原性について抗ＨＴＬＶ陽性ヒト血清を用いて自動イムノアッセイ分析計でそれらを査定することができた。これらの結果はきわめて明快であった：抗原性は両ドメインについてかなり高く、Ｃドメイン（ＣＴＤ）の方がさらにわずかに高かった。印象深いことに、ＮＴＤは、ＣＴＤと比較した場合に有意に高いブランクの関係で不確定と同定される可能性があった。ＣＴＤは陽性血清について高い信号を発生し、陰性血清についてはきわめて低い信号を発生したという点で、卓越した信号動態を示した。ＣＴＤはｐ２４キャプシドアセンブリーに必要な天然の二量体化モチーフをもつと推定されるので、これは意外である。それの自然オリゴマー化挙動により、本発明者らはＣＴＤがＮＴＤの凝集傾向より有意に高い凝集傾向を示すであろうと推論していた。

ｐ２４ＣＴＤおよびＮＴＤをウサギ抗ＨＴＬＶセロコンバージョン血清（ヒトＨＴＬＶセロコンバージョンパネルは市販されていないので、本発明者らは人工ウサギモデルに戻らざるを得なかった）で査定した際、シャペロン誘導したオリゴマー型ｐ２４バリアントをＤＡＧＳアッセイの両側に用いるとイムノアッセイの感度が著しく増大することを見出した。セロコンバージョン試料はモノマー型ｐ２４バリアントを用いるよりオリゴマー型ｐ２４バリアントを用いてはるかに良好に認識される。

簡単に述べると、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩ由来のｐ２４のＣ−ドメインは、高い抗原性および高い溶解性をもつｐ２４フラグメントと同定された。シャペロン、たとえばＳｌｙＤ、ＦｋｐＡまたはＳｋｐに融合させた場合、ｐ２４ＣＴＤは可溶性で安定な状態を維持し、ＨＴＬＶに感染した際に一般にセロコンバージョンの初期に出現するＩｇＭ分子の検出に好適である。したがって、特にｐ２４ＣＴＤのオリゴマー型ＦｋｐＡおよびＳｋｐ融合バリアントはＨＴＬＶ−イムノアッセイの感度を増大させるために使用できる。

本発明者らは、全長ｐ２４分子より可溶性であり、凝集傾向が有意に少ない、ＨＴＬＶ由来のキャプシドタンパク質ｐ２４のバリアントを開発した。溶解性および安定性は抗原性を犠牲にして改善される −それにもかかわらず、新たに開発されたｐ２４バリアントはＨＴＬＶイムノアッセイにおける抗原としての有望性を保持する；それらは大腸菌において多量に過剰発現し、容易に精製され、固定化金属キレートクロマトグラフィー(immobilized metal chelate chromatography)（ＩＭＡＣ）によって容易にリフォールディングし、満足できる安定性を示し、信頼性をもってヒト血清中の抗ＨＴＬＶ抗体を検出するのに使用できるからである（おそらく、ｇｐ２１の外部ドメイン(ectodomain)、ＨＴＬＶ由来の他の免疫優性(immunodominant)タンパク質との組合わせで）。たとえば、ＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤおよびＳｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤ融合タンパク質が、ＩｇＭ分子を検出するのに十分なエピトープ密度をもつ天然オリゴマーを形成することが最も重要である。本発明者らは総免疫グロブリン検出（すなわち、ＩｇＧおよびＩｇＭの検出）のためのイムノアッセイの開発を目標としたので、オリゴマー種のＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤおよびＳｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤをＤＡＧＳフォーマットの両側における指示子として有利に使用できる（たとえば、ＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤ−ビオチンおよびＳｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤ−ルテニウム）。予備データは、オリゴマー型ｐ２４バリアントの使用は競合体アッセイによって対応できない卓越したセロコンバージョン感度を保証することを示唆する。

したがって本発明は、それぞれ全長ＨＴＬＶｐ２４ポリペプチドのＮ末端ドメインを含みかつＣ末端ドメインを欠如するか、またはＣ末端ドメインを含みかつＮ末端ドメインを欠如する、可溶性ＨＴＬＶｐ２４抗原に関する。本発明によれば、ｐ２４抗原をシャペロンに融合させることができる。診断適用における、たとえば単離した生体試料においてＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体を検出するためのイムノアッセイにおける、これらのＨＴＬＶｐ２４抗原の使用も包含される。用語“ＨＴＬＶ”は、“ヒトＴリンパ球向性ウイルス”を意味する。ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩと具体的に指示しない限り、用語ＨＴＬＶは両方のウイルスタイプを表わす。

本発明によれば、抗原は完全ＨＴＬＶｐ２４抗原の特定のドメイン、たとえばＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）またはＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）のみを含む。好ましくは、抗原はＨＴＬＶ−Ｉｐ２４のＳＥＱＩＤＮＯ．２のＮ末端ドメインまたはＳＥＱＩＤＮＯ．３のＣ末端ドメインを含む。ＨＴＬＶ−ＩＩ抗原について、融合抗原は好ましくはＳＥＱＩＤＮＯ．６のＮ末端ドメインまたはＳＥＱＩＤＮＯ．７のＣ末端ドメインを含む。さらなる好ましい方式において、Ｎ末端ドメインが抗原の一部であればＣ末端ドメインは欠損しており、逆もまた同様である。

特に、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２（ｐ２４ＮＴＤＨＴＬＶ−Ｉ）またはＳＥＱＩＤＮＯ．６（ｐ２４ＮＴＤＨＴＬＶ−ＩＩ）に特定したＨＴＬＶｐ２４のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を含む可溶性ＨＴＬＶｐ２４抗原に関するものであり、その際、ＨＴＬＶｐ２４抗原はＳＥＱＩＤＮＯ．３（ｐ２４ＣＴＤＨＴＬＶ−Ｉ）およびＳＥＱＩＤＮＯ．７（ｐ２４ＣＴＤＨＴＬＶ−ＩＩ）に特定したＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）を欠如する。

さらに、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３（ｐ２４ＣＴＤＨＴＬＶ−Ｉ）またはＳＥＱＩＤＮＯ．７（ｐ２４ＣＤＴＨＴＬＶ−ＩＩ）に特定したＨＴＬＶｐ２４のＣ末端ドメインを含む可溶性ＨＴＬＶｐ２４抗原に関するものであり、その際、ＨＴＬＶｐ２４抗原はＳＥＱＩＤＮＯ．２（ｐ２４ＮＴＤＨＴＬＶ−Ｉ）およびＳＥＱＩＤＮＯ．６（ｐ２４ＮＴＤＨＴＬＶ−ＩＩ）に特定したＮ末端ドメインを欠如する。

用語ＨＴＬＶｐ２４抗原にはバリアントも含まれる。ＨＴＬＶｐ２４バリアントは、開示したアミノ酸配列の保存的置換または相同置換（たとえば、アラニンまたはセリンによるシステインの置換）により当業者が容易に作製できる。これに関して用語“バリアント”は、実質的にそのタンパク質に類似するタンパク質またはタンパク質フラグメント（すなわち、ポリペプチドまたはペプチド）に関するものでもある。たとえば、Ｃ末端またはＮ末端の１〜１０個のアミノ酸のトランケーションのような修飾は、特許請求の範囲のＨＴＬＶｐ２４抗原の範囲内である。特に、バリアントは、最も広く存在するタンパク質イソ型のアミノ酸配列と比較してアミノ酸の交換、欠失または挿入を示すイソ型であってもよい。１態様において、そのような実質的に類似のタンパク質は、最も広く存在するタンパク質イソ型に対して少なくとも８０％、他の態様において少なくとも８５％または少なくとも９０％、さらに他の態様において少なくとも９５％の配列類似性をもつ。用語“バリアント”は、翻訳後修飾されたタンパク質、たとえばグリコシル化またはリン酸化されタンパク質に関するものでもある。本発明によれば、バリアントは、in vitro 診断イムノアッセイにおいて免疫反応性が維持されている限り、すなわち単離した試料中に存在する抗ＨＴＬＶｐ２４抗体をそのバリアントがなお結合および検出できる限り、ＨＴＬＶｐ２４抗原バリアントと分類される。“バリアント”は、たとえばタンパク質または抗原への標識またはキャリヤー部分の共有結合または非共有結合により修飾されたタンパク質または抗原でもある。可能な標識は、放射性、蛍光性、化学発光性、電気化学発光性のもの、酵素、または他のもの、たとえばジゴキシゲニンもしくはビオチンである。これらの標識は当業者に知られている。

本発明のＨＴＬＶｐ２４抗原は可溶性、安定かつ免疫反応性であり、すなわちそれらは免疫学的アッセイに使用するための抗原として適切である。これは、本発明による抗原が生理的緩衝液条件下で、たとえば界面活性剤を添加していない周囲温度のリン酸緩衝系中で、可溶性であることを意味する。これらの抗原は、単離した試料、たとえばヒト血清中に存在する、ＨＴＬＶｐ２４に対して特異的な抗体、たとえば抗ｐ２４抗体に結合し、あるいはそれらにより認識および結合されることもできる。

本発明によるＨＴＬＶｐ２４抗原をシャペロンに融合させることができる。本発明において用いる用語“融合タンパク質”、“融合ポリペプチド”または“融合抗原”は、ＨＴＬＶｐ２４ポリペプチドに対応する少なくとも１つのタンパク質部分、および融合パートナーの役割を果たすシャペロンに由来する少なくとも１つのタンパク質部分を含む、タンパク質を表わす。

古典的なフォールディングヘルパーとして知られるシャペロンは、他のタンパク質のフォールディングおよび構造統合性を支援するタンパク質である。フォールディングヘルパーの例はWO 03/000877に詳細に記載されている。本発明によれば、ペプチジルプロリルイソメラーゼクラスのシャペロン、たとえばＦＫＢＰファミリーのシャペロンをＨＴＬＶｐ２４抗原バリアントへの融合のために使用できる。融合パートナーとして適したＦＫＢＰシャペロンの例は、ＦｋｐＡ、ＳｌｙＤおよびＳｌｐＡである。ＨＴＬＶｐ２４に対する融合パートナーとして適したさらなるシャペロンは、ＦＫＢＰファミリーに属さないＳｋｐ、すなわち大腸菌のペリプラスムに由来するトリマー型シャペロンである。必ずしもシャペロンの完全配列を用いる必要はない。シャペロンの必要な能力および機能をなお保有する機能性フラグメント（いわゆる結合能をもつ(binding-competent)モジュール）も使用できる(参照：WO 98/13496)。

本発明のさらなる態様によれば、ＦＫＢＰシャペロン、たとえば大腸菌ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡまたはＦｋｐＡの少なくとも１つまたは少なくとも２つのモジュールを、ＨＴＬＶｐ２４抗原の発現のための融合部分として用いる。シャペロンＳｋｐも融合パートナーとして使用できる。２つのＦＫＢＰシャペロンドメインの融合により、得られる融合ポリペプチドの溶解性が改善される。融合部分をＨＴＬＶｐ２４抗原のＮ末端もしくはＣ末端または両末端（サンドイッチ様）に配置することができる。

好ましくは、本発明によるＨＴＬＶｐ２４抗原をオリゴマー型シャペロンに融合させる。オリゴマー型シャペロンは、天然形態のダイマー、トリマーまたはさらに高次のマルチマーであるシャペロンであり、したがって複数のモノマーサブユニットが特異的な非共有結合性相互作用により組み立てられている。好ましいオリゴマー型シャペロンはＦｋｐＡおよびＳｋｐである。

特に好ましいものは、ＳＥＱＩＤＮＯ．９〜１６および１８〜２４からなる群から選択される、シャペロンに融合した可溶性ＨＴＬＶｐ２４抗原である。
本発明によるＨＴＬＶｐ２４抗原は、組換えＤＮＡ技術により作製および産生できる。したがって本発明の他の観点は、前記にさらに定義したＨＴＬＶｐ２４抗原およびそのバリアントをコードする組換えＤＮＡ分子である。

用語“組換えＤＮＡ分子”は、他の状態では分離している２つのＤＮＡ配列セグメントの組合わせにより作製される分子であって、単離したポリヌクレオチドセグメントを遺伝子工学技術または化学合成によって人為的に操作することにより得られるものを表わす。それを行なうために、目的とする機能をもつポリヌクレオチドセグメントを互いに連結して、目的とする組合わせの機能を生じさせることができる。タンパク質を原核宿主細胞またはより下等もしくは高等な宿主細胞において発現させるための組換えＤＮＡ技術は当技術分野で周知である。それらは、たとえばSambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual)により記載されている。

本発明による組換えＤＮＡ分子は、１０〜１００アミノ酸残基のリンカーペプチドをコードする配列を、ＨＴＬＶｐ２４抗原と融合部分の間に、また数個の融合部分の間にも、含むこともできる。そのようなリンカー配列は、たとえばタンパク質分解開裂部位をもつことができる。

本発明のさらなる観点は、利用可能な状態で連結した本発明による組換えＤＮＡ分子、すなわちＨＴＬＶｐ２４抗原をコードする組換えＤＮＡ分子、および場合によりペプチジルプロリルイソメラーゼシャペロン、たとえばＦＫＢＰ−シャペロンを含む、発現ベクターであり、その際、ＦＫＢＰ−シャペロンはＦｋｐＡ、ＳｌｙＤおよびＳｌｐＡから選択される。別態様において、組換えＤＮＡ分子はＨＴＬＶｐ２４抗原およびＳｋｐを含む融合タンパク質をコードする。本発明による組換えＤＮＡを含む発現ベクターは、無細胞翻訳系においてＨＴＬＶｐ２４抗原を発現させるのに使用でき、あるいはＨＴＬＶｐ２４抗原の発現のために宿主細胞を当技術分野で周知の方法に従って形質転換するのに使用できる。したがって本発明の他の観点は、本発明による発現ベクターで形質転換した宿主細胞に関する。本発明の１態様において、組換えＨＴＬＶｐ２４抗原は大腸菌細胞において産生される。

さらに他の観点は、本発明による可溶性、安定かつ免疫反応性のＨＴＬＶｐ２４抗原を製造するための方法である。そのｐ２４抗原は、ＨＴＬＶｐ２４抗原およびシャペロンを含む融合タンパク質として製造できる。好ましくは、シャペロン、たとえばＳｋｐ、またはペプチジルプロリルイソメラーゼクラスのシャペロン、たとえばＦＫＢＰシャペロンを用いる。本発明のさらなる態様において、そのＦＫＢＰシャペロンはＳｌｙＤ、ＦｋｐＡおよびＳｌｐＡからなる群から選択される。

この方法は下記の工程を含む：
ａ）ＨＴＬＶｐ２４抗原をコードする遺伝子を含む前記の発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養する；
ｂ）そのＨＴＬＶｐ２４抗原をコードする遺伝子を発現させる；
ｃ）そのＨＴＬＶｐ２４抗原を精製する。
場合により、追加工程ｄ）として、当技術分野で既知のリフォールディング法によりＨＴＬＶｐ２４抗原を可溶性および免疫反応性のコンホメーションにするために、機能性可溶化を実施する必要がある。

本発明のさらに他の観点は、単離したヒト試料中の抗ＨＴＬＶ抗体を検出するための方法に関するものであり、その際、本発明によるＨＴＬＶｐ２４抗原を抗体に対する結合パートナーとして用いる。よって本発明は、単離した試料においてＨＴＬＶに対して特異的な抗体を検出するための方法を含み、その方法は下記を含む：
ａ）体液試料を本発明によるＨＴＬＶｐ２４抗原と混合することにより免疫反応混合物を調製する；
ｂ）体液試料中に存在する、そのＨＴＬＶ抗原またはＨＴＬＶ抗原組成物に対する抗体が、そのＨＴＬＶ抗原と免疫反応して免疫反応生成物を形成できるのに十分な期間、その免疫反応混合物を保持する；そして
ｃ）そのいずれかの免疫反応生成物の存在および／または濃度を検出する。

さらなる観点において、その方法はＩｇＧおよびＩｇＭサブクラスのＨＴＬＶ抗体を検出するのに適切である。
抗体の検出のためのイムノアッセイは当技術分野で周知であり、したがってそのようなアッセイを実施するための方法ならびに実際の適用および操作も周知である。本発明によるＨＴＬＶｐ２４抗原を用いて、使用する標識と無関係に、また検出様式（たとえば、放射性同位体アッセイ、エンザイムイムノアッセイ、電気化学発光アッセイなど）またはアッセイ原理（たとえば、試験片アッセイ、サンドイッチアッセイ、間接試験概念、または均一アッセイなど）と無関係に、抗ＨＴＬＶ抗体を検出するためのアッセイを改善することができる。当業者に知られているすべての生物学的液体を、抗ＨＴＬＶ抗体の検出のための単離した試料として使用できる。通常用いられる試料は、体液、たとえば全血、血清、血漿、尿または唾液である。

本発明のさらなる態様は、単離した試料中の抗ＨＴＬＶ抗体を検出するための、いわゆる二重抗原サンドイッチ(double antigen sandwitch)（ＤＡＧＳ）概念に従って実施されるイムノアッセイである。２つの抗原が被験抗体により架橋されるので、時にはこのアッセイ概念は二重抗原架橋概念とも呼ばれる。そのようなアッセイには、抗体がそれの２（ＩｇＧ、ＩｇＥ）、４（ＩｇＡ）または１０（ＩｇＭ）のパラトープで特定の抗原の少なくとも２つの異なる分子を結合する能力が要求され、利用される。

より詳細には、抗ＨＴＬＶ抗体検出を二重抗原架橋フォーマットに従って判定するためのイムノアッセイは、抗ＨＴＬＶ抗体を含有する試料を、２つの異なるＨＴＬＶｐ２４抗原、すなわち第１の（“固相”）ＨＴＬＶｐ２４抗原および第２のＨＴＬＶｐ２４（“検出”）抗原と共にインキュベートすることにより実施され、その際、それらの抗原はそれぞれ抗ＨＴＬＶ抗体に特異的に結合する。第１抗原は直接または間接的に固相に結合することができ、通常は生体親和性(bioaffine)結合対、たとえばビオチンとアビジンの一部であるエフェクター基を保有する。たとえば、第１抗原がビオチンにコンジュゲートしているならば、固相をアビジンまたはストレプトアビジンのどちらかでコートする。第２抗原は標識を保有する。こうして、第１抗原、試料抗体および第２抗原を含む免疫反応混合物が調製される。第１抗原が結合できる固相は、試料を抗原に添加する前または免疫反応混合物を調製した後に添加される。体液試料においてそれらのＨＴＬＶｐ２４抗原に対する抗ＨＴＬＶ抗体がそれらのＨＴＬＶｐ２４抗原と免疫反応して免疫反応生成物を形成できるのに十分な期間、その免疫反応混合物を保持する。次の工程は液相を固相から分離する分離工程である。最後に、固相もしくは液相または両方におけるそのいずれかの免疫反応生成物の存在を検出する。

そのＤＡＧＳイムノアッセイにおいて、“固相抗原”と“検出抗原”の基本構造は本質的に同じである。二重抗原架橋アッセイにおいては、類似するけれども異なるＨＴＬＶｐ２４抗原を用いることもでき、それらは免疫交差反応性である。そのようなアッセイを実施するための本質的要件は、関連エピトープまたは関連エピトープ類が両方の抗原に存在することである。本発明によれば、各ＨＴＬＶｐ２４抗原について異なる融合部分を使用できる（たとえば、固相側のＨＴＬＶｐ２４に融合したＳｌｙＤ、および検出側のＨＴＬＶｐ２４に融合したＦｋｐＡ）；そのようなバリエーションは非特異的結合の問題を著しく軽減し、したがって偽陽性結果のリスクを緩和するからである。

好ましくは、そのＤＡＧＳイムノアッセイに非対称フォーマットを適用し、ＦｋｐＡに融合したＨＴＬＶｐ２４とＳｋｐに融合したＨＴＬＶｐ２４抗原を組み合わせる。より好ましくは、ＦｋｐＡに融合したＨＴＬＶｐ２４を固相側に用い、かつＳｋｐに融合したＨＴＬＶｐ２４を検出側に適用するが、逆の配置をもつこともでき、すなわちＳｋｐに融合したＨＴＬＶｐ２４抗原を固相側に、かつＦｋｐＡに融合したＨＴＬＶｐ２４を検出側に用いることもできる。最も好ましくは、ＨＴＬＶｐ２４ＦｋｐＡ融合タンパク質はストレプトアビジンまたはアビジンでコートした固相への付着のためのビオチン部分を保有し、ＨＴＬＶｐ２４Ｓｋｐ融合タンパク質は電気化学発光標識、たとえばルテニウム錯体を保有する。逆の配置の場合、ｐ２４Ｓｋｐ融合タンパク質がビオチンを保有し、ｐ２４ＦｋｐＡがその標識を保有する。

したがって本発明のさらなる態様は、本発明による第１のＨＴＬＶｐ２４抗原および本発明による第２のＨＴＬＶｐ２４抗原を用いる二重抗原架橋概念に従ったイムノアッセイである。

本発明はさらに、抗ＨＴＬＶ抗体を検出するための診断検査における少なくとも１つのＨＴＬＶｐ２４抗原の使用に関する。
本発明のさらに他の対象は、イムノアッセイのための通常の検査添加剤に加えて、決定すべきＨＴＬＶ抗体に特異的に結合するのに適した本発明によるＨＴＬＶｐ２４抗原の少なくとも１つの抗原であっておそらく標識を保有するもの、および必要であれば他の通常の添加剤を含む、ＨＴＬＶに対する抗体の検出のための試薬キットである。

特に、試薬キットはＳＥＱＩＤＮＯ．９〜ｌ６およびｌ８〜２４のいずれかによるＨＴＬＶｐ２４抗原を含む。
さらに、前記に定めた試薬キットは、対照および標準溶液、ならびに平均的な当業者が用いる一般的な添加剤、緩衝剤、塩類、界面活性剤などを含む１以上の溶液中の試薬を、使用のための指示と一緒に含む。

他の態様は、本発明による可溶性ＨＴＬＶｐ２４抗原、およびＨＴＬＶエンベロープ抗原、好ましくはＳＥＱＩＤＮＯ．２５を含むｇｐ２１を含有する、ＨＴＬＶ抗原組成物である。用語“組成物”は、個別に発現したポリペプチドが混合物中に個々の別個の分子として存在するものを表わす。組成物という用語は、ｐ２４およびｇｐ２１のフラグメントを単一のポリペプチド鎖上に保有するタンパク質を除外する。

ＨＴＬＶｐ２４のＣ末端ドメインを含む組成物が好ましく、ＳＥＱＩＤＮＯ．３によるＨＴＬＶ−Ｉｐ２４抗原（ＳＥＱＩＤＮＯ．２を欠如する）および／またはＳＥＱＩＤＮＯ．７によるＨＴＬＶ−ＩＩｐ２４抗原（ＳＥＱＩＤＮＯ．６を欠如する）ならびにＨＴＬＶｇｐ２１を含む組成物が特に好ましい。たとえば、その組成物には、ＳＥＱＩＤＮＯ．２５、２６または２７のいずれかを含むＨＴＬＶｇｐ２１配列が存在できる。ＤＡＧＳフォーマットによるイムノアッセイに適用するために、組成物は２形態、すなわち抗原が固相に付着できるようにする形態（たとえば、ストレプトアビジンでコートした表面に結合できるビオチニル化抗原）および試料中に存在するＨＴＬＶ抗体と適用したＨＴＬＶ抗原との免疫複合体の検出を可能にする標識化形態の各ＨＴＬＶ抗原を含む。

本発明はまた、抗ＨＴＬＶ抗体の in vitro 診断検査における本発明によるＨＴＬＶｐ２４抗原の使用に関する。

本発明を実施例によってさらに説明する。
実施例１
ｐ２４キャプシド融合ポリペプチドのクローニングおよび精製
発現カセットのクローニング
Nｏｖａｇｅｎ（米国ワイオミング州マディソン）のｐＥＴ２４ａ発現プラスミドをベースにして、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩに由来するｐ２４融合タンパク質をコードする発現カセットを本質的に記載に従って得た(Scholz, C. et al., J. Mol. Biol. (2005) 345, 1229-1241)。ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩに由来するｐ２４抗原の配列をＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（それぞれ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＩＤＰ１０２７４およびＰ０３３５３）から検索した。Ｎ末端にグリシンリッチリンカー領域がインフレーム融合したＨＴＬＶ−Ｉ（成熟キャプシドタンパク質のＮ末端プロリンリッチ１５アミノ酸を欠如する）由来のｐ２４キャプシド抗原アミノ酸１４６−３４４（ナンバリングはＧａｇ−Ｐｒｏポリタンパク質前駆体を参照する）をコードする合成遺伝子を、Ｍｅｄｉｇｅｎｏｍｉｘ（ドイツ、マーチンスリード）から購入した。望ましくない副反応、たとえば酸化または分子間ジスルフィド架橋を阻止するために、ｐ２４の位置１９３、３１１および３３２のシステイン残基をアラニン残基に交換した。ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位が、ｐ２４−コーディング領域のそれぞれ５’および３’末端にあった。２つのＥｃＳｌｙＤユニット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ寄託ｎｏ．Ｐ０Ａ９Ｋ９の残基１−１６５）がグリシンリッチリンカー領域に連結したものをコードする、Ｃ末端にさらなるリンカー領域の部分を含むさらなる合成遺伝子を、同様にＭｅｄｉｇｅｎｏｍｉｘから購入した。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位がこのカセットのそれぞれ５’および３’末端にあった。これらの遺伝子および制限部位は、シャペロン部分ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤとｐ２４抗原部分の簡単なライゲーションによるインフレーム融合が可能になるように設計された。意図しない組換えプロセスを避けるために、かつ大腸菌宿主における発現カセットの遺伝子安定性を高めるために、ＥｃＳｌｙＤユニットをコードするヌクレオチド配列を変性させ、エクステンションしたリンカー領域をコードするヌクレオチド配列を同様に変性させた；すなわち、同一アミノ酸配列をコードする異なるコドン組合わせを用いた。

ｐＥＴ２４ａベクターをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４（１４６−３４４）にインフレーム融合した縦列ＳｌｙＤを含むカセットを挿入した。パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)ＳｌｙＤ（１−１５６，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＩＤＱ９ＣＫＰ２）、大腸菌Ｓｋｐ（２１−１６１，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＩＤＰ０ＡＥＵ７）または大腸菌ＦｋｐＡ（２６−２７０，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＩＤＰ４５５２３）を含む発現カセットをそれに応じて構築し、ＨＴＬＶ−ＩＩ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＩＤＰ０３３５３）由来のｐ２４およびｐ２４フラグメントを含む発現カセットも構築した。ＨＴＬＶ−Ｉ由来のｐ２４と同様に、望ましくない副反応、たとえば酸化または分子間ジスルフィド架橋を阻止するために、ＨＴＬＶ−ＩＩ由来のｐ２４の位置１９９、２８１、３１７および３３８（この場合もナンバリングは前駆体Ｇａｇ−Ｐｒｏポリタンパク質を参照する）にある真のシステイン残基をアラニン残基に交換した。Ｎｉ−ＮＴＡ−支援による精製およびリフォールディングを容易にするために、すべての組換え融合ポリペプチドバリアントがＣ末端ヘキサヒスチジンタグを含んでいた。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国カリフォルニア州ラホーヤ）および標準ＰＣＲ法を用いて点変異、欠失、挿入およびエクステンションバリアントまたは制限部位をそれぞれの発現カセットに作製した。

下記の図は、それのＮ末端にインフレーム融合した２つのＳｌｙＤシャペロンユニットを保有するＮ末端トランケート型ＨＴＬＶ−Ｉｐ２４抗原１４６−３４４のスキームを示す。大腸菌起源のＳｌｙＤ融合パートナーを表わすために、描かれた融合ポリペプチドはＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ｐ２４（１４６−３４４）と命名された。

得られたプラスミドの挿入配列を配列決定し、目的とする融合タンパク質をコードすることが認められた。ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩに由来するｐ２４融合ポリペプチドの完全アミノ酸配列をＳＥＱＩＤＮＯ．９〜１６および１８〜２４に示す。リンカーＬのアミ酸配列をＳＥＱＩＤＮＯ．１７に示す。

ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩに由来するｐ２４およびｐ２４バリアントを含む融合タンパク質の精製
すべてのｐ２４融合タンパク質バリアントを実質的に同一のプロトコルを用いて精製した。特定のｐＥＴ２４ａ発現プラスミドを宿した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、３７℃でＬＢ培地＋カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）中において１．５のＯＤ_６００になるまで増殖させ、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを添加することにより細胞質ゾル過剰発現を誘導した。誘導の３時間後、細胞を遠心分離（５０００ｇで２０分間）により収穫し、凍結し、−２０℃で保存した。細胞溶解のために、冷却した５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０、７．０ＭＧｄｍＣｌ、５ｍＭイミダゾールに凍結ペレットを再懸濁し、懸濁液を氷上で２時間撹拌して細胞溶解を完了させた。遠心分離および濾過（０．４５μｍ／０．２μｍ）の後、粗製の細胞溶解物を５．０ｍＭのＴＣＥＰを含有する細胞溶解緩衝液でＮｉ−ＮＴＡカラムに適用した。その後の洗浄工程は各ターゲットタンパク質に合わせて調整され、５ｍＭから１５ｍＭに及ぶイミダゾール（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０、７．０ＭＧｄｍＣｌ、５．０ｍＭＴＣＥＰ中）であった。少なくとも１０〜１５体積の洗浄緩衝液を適用した。次いで、ＧｄｍＣｌ溶液を５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５．０ｍＭＴＣＥＰにより交換して、マトリックス結合したタンパク質のコンホメーショナルリフォールディングを誘導した。同時精製されるプロテアーゼの再活性化を避けるために、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡフリー，Ｒｏｃｈｅ）をリフォールディング緩衝液に含有させた。合計１５〜２０カラム体積のリフォールディング緩衝液を一夜の反応で適用した。次いで、ＴＣＥＰとＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡフリーインヒビターカクテルの両方を、３〜５カラム体積の５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭイミダゾールで洗浄することにより除去した。その後、非特異的に結合したタンパク質混在物を除去するために、イミダゾール濃度 −まだ５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭＫＣｌ中にある− を２０〜８０ｍＭ（各ターゲットタンパク質に応じて）に高めた。天然タンパク質を次いで同じ緩衝液中の５００ｍＭイミダゾールで溶離した。タンパク質含有画分を純度についてトリシン(Tricine)−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより査定し、プールした。最後に、タンパク質にサイズ排除クロマトグラフィー（ＳｕｐｅｒｄｅｘＨｉＬｏａｄ，ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）を施し、タンパク質含有画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎセル（ＹＭ１０）で１０〜２０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。

精製とリフォールディングの組合わせプロトコルの後、各ターゲットタンパク質に応じてほぼ１０〜３０ｍｇの収量のタンパク質を１ｇの大腸菌湿潤細胞から得ることができた。

実施例２
分光測定
ＵｖｉｋｏｎＸＬダブルビーム分光光度計でタンパク質濃度測定を実施した。Pace (1995), Protein Sci. 4, 2411-2423が記載した方法を用いてモル吸光係数（ε_２８０）を決定した。個別の融合ポリペプチドに用いたモル吸光係数（ε_Ｍ２８０）を表１に明示する。

表１：この試験で作製および使用したｐ２４融合ポリペプチドバリアントのタンパク質パラメーター。すべてのパラメーターが各タンパク質モノマーを表わす

これらの融合ポリペプチドバリアントのアミノ酸配列をＳＥＱＩＤＮＯ．９〜１６および１８〜２４に示す。
実施例３
融合タンパク質へのビオチン部分およびルテニウム部分のカップリング
融合ポリペプチドのリジン ε−アミノ基を、タンパク質濃度１０〜３０ｍｇ／ｍｌでＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド活性化ビオチンおよびルテニウム標識分子によりそれぞれ修飾した。標識／タンパク質比をそれぞれの融合タンパク質に応じて２：１から５：１（ｍｏｌ：ｍｏｌ）まで変更した。反応緩衝液は１５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭＫＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡであった。反応を室温で１５分間実施し、緩衝化Ｌ−リジンを１０ｍＭの最終濃度になるまで添加することにより停止した。標識の加水分解による不活性化を避けるために、それぞれの原液を乾燥ＤＭＳＯ（ｓｅｃｃｏｓｏｌｖ品質，Ｍｅｒｃｋ，ドイツ）中に調製した。反応緩衝液中２５％までのＤＭＳＯ濃度が、試験したすべての融合タンパク質によって良好に耐容された。カップリング反応の後、粗製タンパク質コンジュゲートをゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨｉＬｏａｄ）に通すことにより、未反応の遊離標識を除去した。

実施例４
ＨＴＬＶイムノアッセイにおける種々のｐ２４キャプシド抗原バリアントの免疫反応性（すなわち、抗原性）
ＨＴＬＶｐ２４キャプシド抗原のポリペプチド融合バリアントの免疫反応性（抗原性）を、自動Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０およびｃｏｂａｓｅ４１１分析計（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ）で査定した。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）はＲｏｃｈｅグループの登録商標である。測定は二重抗原サンドイッチフォーマットで実施された。

Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０およびｃｏｂａｓｅ４１１における信号検出は電気化学発光に基づく。ビオチン−コンジュゲート（すなわち、捕捉抗原）はストレプトアビジンコートした磁性ビーズの表面に固定化され、一方、検出抗原は錯化したルテニウムカチオン（２＋と３＋の酸化還元状態間でスイッチング）を信号発生部分として保有する。特異的免疫グロブリン被験体の存在下で、色素原ルテニウム錯体は固相に架橋し、白金電極で励起された後に６２０ｎｍで光を発する。信号出力は相対光単位による。

組換えｐ２４キャプシド抗原融合ポリペプチドを二重抗原サンドイッチ（ＤＡＧＳ）イムノアッセイフォーマットで査定した。このために、組換えＨＴＬＶ−Ｉキャプシド抗原ｐ２４をそれぞれビオチンおよびルテニウムのコンジュゲートとして用いて、ヒト血清中の抗ｐ２４抗体を検出した。

ｐ２４はＨＴＬＶの免疫優性抗原のひとつであり、ｐ２４の可溶性バリアント −本出願において開示するもの− はＨＴＬＶ感染の検出のための貴重なツールである。すべての測定において、シャペロン融合ユニットを介した免疫交差反応を避けるために、化学的に重合させた非標識ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ、ＥｃＦｋｐＡおよびＥｃＳｋｐを、反応緩衝液中に抗干渉物質として大過剰（約１０μｇ／ｍｌ）に供給した。

特に、ＨＴＬＶ−Ｉ由来の３つのｐ２４バリアント、すなわち全長ｐ２４（１４６−３４４，ナンバリングはＧａｇ−Ｐｒｏポリタンパク質前駆体を参照する，ＳＥＱＩＤＮＯ．１よび５を参照）、ｐ２４Ｎ末端ドメイン（ｐ２４／ＮＴＤ，１４６−２６０）、およびｐ２４Ｃ末端ドメイン（ｐ２４／ＣＴＤ，２６１−３４４）をこの試験で調べた。抗ｐ２４ＩｇＧ分子を検出するために、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ｐ２４−ビオチンおよびＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ｐ２４−ルテニウムを、それぞれＲｌ（試薬緩衝液１）およびＲ２（試薬緩衝液２）中において用いた。抗ｐ２４ＩｇＭおよびＩｇＧの両分子を検出するために、ＥｃＦｋｐＡ−ｐ２４−ビオチンおよびＥｃＳｋｐ−ｐ２４−ルテニウムを、それぞれＲｌ（試薬緩衝液１）およびＲ２（試薬緩衝液２）中において用いた。ＲｌおよびＲ２中の抗原コンジュゲートの濃度は、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌであった。Ｎ末端トランケート型成熟ｐ２４（１４６−３４４）を、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ融合ポリペプチドとしてビオチン側に用い、ＥｃＦｋｐＡ融合ポリペプチドをルテニウム側に用いた。

残念ながら、ヒトＨＴＬＶセロコンバージョンパネル −改良された in vitro 診断アッセイの開発に不可欠なツールである− は市販されていない。ＨＴＬＶ感染のごく初期における種々のｐ２４バリアントの抗原特性を査定するために、本発明者らはセロコンバージョンモデルとして用いるウサギ血清に戻らざるを得なかった。この目的で、ニュージーランドシロウサギを、精製および不活性化したＨＴＬＶ−Ｉおよび−ＩＩウイルス溶解物（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘから購入，米国ニューヨーク）および完全フロイントアジュバントで免疫化して、免疫応答を誘導した（２回の免疫化，１週間隔）。ヒトにおける真のＨＴＬＶ感染に際しての体液性免疫応答のパターンはウイルス溶解物接種により誘発したウサギの免疫応答とはわずかに異なる可能性があることを本発明者らは承知している。それでもなお、人為的に誘導したウサギのセロコンバージョンは、我々が入手できた最良の模倣である。

第１実験において、バックグラウンド信号の見解を得るために、モノマー型ｐ２４ＣＴＤ（ｐ２４，２６１−３４４）を抗ＨＴＬＶ−陰性ヒト血清について前記のＤＡＧＳイムノアッセイ設定で査定した。不可避のシステム固有信号は約５００カウントである。低いバックグラウンド信号は、各ルテニウムコンジュゲートの高い溶解性および全般的に良好な物理化学的特性の指標となる。表２から、モノマー型ｐ２４ＣＴＤの物理化学的特性が卓越していると推測できる（縦列１）。これはオリゴマー型ｐ２４ＣＴＤについても当てはまる（縦列２）：ＦｋｐＡ−ｐ２４（２６１−３４４）−ビオチンおよびＳｋｐ−ｐ２４（２６１−３４４）−ルテニウムは、ＤＡＧＳフォーマットにおける抗原対として用いた場合、陰性ヒト血清について約１１００カウントの信号バックグラウンドを生じ、これは明らかに良好な溶解性を指摘する。しかし、モノマー型とオリゴマー型のｐ２４ＣＴＤはそれらが抗ＨＴＬＶ抗体（そして明らかにＩｇＭ分子）を検出する能力において著しく異なることは、表２に示すセロコンバージョンパネルにおいて一見して明らかになる。セロコンバージョンＫ５６４５を注意深く観察すると、モノマー型ｐ２４ＣＴＤは１８日目にかろうじて陽性（１５５８カウント）として検出され、これに対しオリゴマー型ｐ２４ＣＴＤは１４日目に既に明らかに陽性（８２３２カウント）として現われ、１８日目には５０１１８カウントの高い信号になる。同じ状況がセロコンバージョンパネルＫ５６４６、Ｋ５６４７およびＫ５６４８でみられる：オリゴマー型ｐ２４ＣＴＤバリアントはより高い信号をより早期に発生し、よってセロコンバージョンにおける抗ｐ２４抗体の早期検出において卓越した感度を保証する。原則として、その状況は、アミノ酸残基１４６−２６０（ナンバリングはＧａｇ−Ｐｒｏポリタンパク質前駆体を参照する）を含むｐ２４のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）について類似する。ＣＴＤと同様に、オリゴマー型ｐ２４ＮＴＤの方がセロコンバージョンの早期に出現する抗体（すなわち、Ｍ型の免疫グロブリン）の検出に好適であり、それは特にセロコンバージョンパネルＫ５６４７およびＫ５６４８（表２，縦列３および４）で例示される。しかし、オリゴマー型ＮＴＤｐ２４のバックグラウンド信号はＣＴＤｐ２４と比較した場合、有意に高い。さらに、ｐ２４のＣ末端ドメインの抗原性はＮ末端ドメインの抗原性をはるかに超えると思われる。結論として、ｐ２４のオリゴマー型Ｃ末端ドメインは卓越した物理化学的特性および優れた抗原性をもち、それによりＨＴＬＶ血清学のための魅力的な候補となる。早期ＩｇＭ検出における感度の点で、それは明らかに全長ｐ２４（１４６−３４４，ポリタンパク質前駆体のナンバリング）より優れている。全長ｐ２４（１４６−３４４）のＳｋｐ融合ポリペプチドは著しい凝集傾向があるので利用できなかったため、ｐ２４全長バージョンのＳｌｙＤ−ＳｌｙＤおよびＦｋｐＡ融合ポリペプチドに制限された。モノマー型ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ｐ２４（１４６−３４４）をＤＡＧＳフォーマットのビオチン側に用い、オリゴマー型ＦｋｐＡ−ｐ２４（１４６−３４４）をルテニウム側に用いた場合、結果はきわめて明快である：全長ｐ２４はセロコンバージョンパネルの後期には卓越した信号を生じるが、それは早期検出は全くできない（表２，縦列５）。オリゴマー型のＣＴＤｐ２４およびＮＴＤｐ２４は両方ともモノマー型全長バリアントより優れており、高感度の早期検出は主に使用するｐ２４フラグメントのエピトープ密度に依存するという良い証拠を提示する。卓越したセロコンバージョン感度を得るために完全ｐ２４配列全体を提供する必要はないと思われる。むしろ、ＨＴＬＶ感染の初期における高感度で信頼性のあるＩｇＭ分子検出を保証するためにはｐ２４のＮおよびＣ−ドメインにあるエピトープで十分である −ただし、これらのエピトープがオリゴマー型で提示されていれば。ＨＴＬＶ−Ｉ由来のｐ２４のＣ末端ドメインは、それの優れた溶解性（低いバックグラウンド信号に反映される）およびそれの卓越した抗原性のおかげで、ＨＴＬＶイムノアッセイの貴重な成分としての将来性をもつ。これはほとんど予想外であった：ｐ２４キャプシド抗原のＣ−ドメインはおそらくｐ２４オリゴマー化に関与する(Khorasanizadeh et al., J. Mol. Biol. (1999) 291, 491-505)ので、単離したＣ−ドメインは凝集しやすい可能性があり、少なくともＮ−ドメインより取扱いが難しいはずであると本発明者らは推論していた。さらに、本発明者らの予想は、成熟キャプシド粒子内にほとんど隠れているｐ２４Ｃ−ドメインは良好にアクセスできるＮ−ドメインより少ない免疫優性エピトープを宿しているというものであった。意外なことに、その逆が真実である。実際には、溶解性および抗原性に関してＣ末端ドメインより劣ると思われるけれども、ｐ２４のＮ−ドメインもＨＴＬＶ−イムノアッセイの抗原として好適である。表２はＨＴＬＶ−Ｉ由来のｐ２４バリアントについての結果を示す。ＨＴＬＶ−ＩＩ由来の対応するｐ２４バリアントについても実質的に同一の結果が見出された。ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩに由来するｐ２４のアミノ酸配列は８４％の同一性および９３％の相同性をもつので、これは本発明者らの予想と一致する。ＨＴＬＶ−ＩＩ由来のｐ２４に対応する配列は、１５２−２６６（Ｎ−ドメイン，ＮＴＤ），２６７−３５０（Ｃ−ドメイン，ＣＴＤ）および１５２−３５０（成熟全長ｐ２４）であった；ＳＥＱＩＤＮＯ．５〜８も参照。

表２：ＨＴＬＶ感染初期におけるオリゴマー型ｐ２４バリアントの優れた免疫反応性（ウサギセロコンバージョンパネルにおける高い感度）

実施例５
非対称二重抗原サンドイッチフォーマットにおけるオリゴマー型シャペロンキャリヤータンパク質の組合わせ
イムノアッセイを、本質的に実施例４に記載したように実施した。オリゴマー型シャペロン、たとえばＦｋｐＡおよびＳｋｐは、それらの各クライアント抗原の機能的オリゴマー化を達成するための融合パートナーとして有利に使用できる。ターゲットタンパク質（すなわち、それらのクライアント抗原またはゲスト抗原）へのＦｋｐＡまたはＳｋｐの融合により、イムノアッセイにおいてＩｇＭ分子を検出するのに適切な明確に規定されたオリゴマー型融合ポリペプチドを得ることができる。ここでは、本発明者らは、ＤＡＧＳ（二重抗原サンドイッチ）フォーマットに用いる場合、Ｓｋｐ−ＸおよびＦｋｐＡ−Ｘ融合ポリペプチドの特定の好ましい組合わせがあるかどうかという疑問に対処した（注釈：“Ｘ”は一般にいずれかのターゲットタンパク質または抗原を表わす）。言い換えると、本発明者らはＦｋｐＡ−Ｘ融合ポリペプチドを（信号発生）ルテニウム側よりもむしろ（捕捉）ビオチン側に用いるのが得策であるかどうかという疑問に対処した。逆に、本発明者らはＳｋｐ−Ｘ融合ポリペプチドを（捕捉）ビオチン側よりもむしろ（信号発生）ルテニウム側に用いるのが得策であるかどうかという疑問をもっていた。

第１実験では、精製した組換えＥｃＳｋｐおよびＥｃＦｋｐＡのビオチンおよびルテニウムコンジュゲートを実施例３に記載したように作製した。すなわち、精製したシャペロン（すなわち、融合したターゲット配列をいずれも含まない裸のシャペロン）をＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド−活性化ビオチン標識によりビオチニル化した。同様に、ルテニウム化シャペロン（すなわち、融合したターゲット配列をいずれも含まない裸のシャペロン）をＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド−活性化ルテニウム標識により作製した。

次いで、ＥcＳｋｐをビオチン側とルテニウム側の両方に種々の濃度で用いて対称ＤＡＧＳを実施した。試料として、抗ＨＴＬＶ陰性ヒト血清のプールを用い、測定を二重に行なった。表３のデータから、全く同じオリゴマー型シャペロン（ここでは：ＥｃＳｋｐ）をＤＡＧＳフォーマットのビオチン側とルテニウム側の両方に用いた場合、きわめて低い濃度ですらバックグラウンド信号がかなり高いことが明らかである。バックグラウンド信号はコンジュゲート濃度に伴なって用量依存性様式で著しく増大する。よって、オリゴマー型融合パートナー、たとえば大腸菌由来のトリマー形シャペロンＳｋｐを用いる場合、対称ＤＡＧＳフォーマットは実行可能な選択肢とは思われない。類似の結果がダイマー型シャペロンＦｋｐＡについても見られた。

表３：ＤＡＧＳイムノアッセイの両側に全く同じオリゴマー型シャペロンを使用（対称ＤＡＧＳフォーマットにおけるオリゴマー型キャリヤータンパク質）

しかし、ＥｃＳｋｐおよびＥｃＦｋｐＡを非対称ＤＡＧＳフォーマットに組み合わせた場合、状況は全く異なった（下記の表４を参照）。捕捉側と信号発生側に異なるシャペロンを用いた場合、シャペロンの組合わせとは関係なくバックグラウンド信号が実質的に低減した。たとえば、対称（すなわち、Ｓｋｐ−Ｂｉ／Ｓｋｐ−Ｒｕ）ＤＡＧＳフォーマットにおけるバックグラウンド信号は、それぞれ２５０ｎｇ／ｍｌのコンジュゲート濃度で約２１，０００カウントであった。全く同じコンジュゲート濃度で、非対称ＤＡＧＳフォーマットにおけるバックグラウンド信号は、それぞれ２，７００カウント（Ｓｋｐ−Ｂｉ／ＦｋｐＡ−Ｒｕ）および８６０カウント（ＦｋｐＡ−Ｂｉ／Ｓｋｐ−Ｒｕ）に劇的に低減する。ＤＡＧＳイムノアッセイにおいて実際にＦｋｐＡとＳｋｐの好ましい組合わせがあることは一見して自明である：ＤＡＧＳイムノアッセイにおいて、ＦｋｐＡをビオチンコンジュゲートとして、またＳｋｐをルテニウムコンジュゲートとして用いるのが得策であり、ＦｋｐＡ−ＸおよびＳｋｐ−Ｘ融合ポリペプチドについて同じことが当てはまると結論するのが妥当である。

表４：ＤＡＧＳイムノアッセイの両側に異なるオリゴマー型シャペロンを使用（非対称ＤＡＧＳフォーマットにおけるオリゴマー型キャリヤータンパク質）

実施例６
ＣＤ検出したＳｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤ（２６７−３５０）およびＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤ（２６７−３５０）の熱誘導アンフォールディング
近ＵＶＣＤスペクトルをサーモスタット付きセルホルダーを備えたＪａｓｃｏ−７２０分光偏光計で記録し、平均残基楕円率(mean residue ellipticity)に換算した。緩衝液は１５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭＫＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡであった。光路長は０．２ｃｍ、タンパク質濃度は２１８μΜ（Ｓｋｐ−ｐ２４モノマーについて）または１４７．５μΜ（ＦｋｐＡ−ｐ２４モノマーについて）であった。測定範囲は２５０〜３３０ｎｍであり、バンド幅は１．０ｎｍであり、０．５ｎｍの解像度でスキャン速度は２０ｎｍ／分であり、応答は１秒であった。信号−対−ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回測定して平均した。

円偏光二色性分光分析（ＣＤ）は、タンパク質の二次構造と三次構造の両方を査定するために好まれる方法である。芳香族領域（２５０〜３３０ｎｍ）の楕円率はタンパク質（すなわち、球形構造の規則的にフォールディングしたタンパク質）内の三次接点をレポートし、天然様フォールド（コンホメーション）のフィンガープリント領域とみなされる。

精製プロセスの必須工程であるマトリックス−カップリングしたリフォールディング操作後に融合タンパク質が規則的コンホメーションをとるかどうかという疑問に対処するために、Ｓｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤ（２６７−３５０）およびＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤ（２６７−３５０）、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ．２２および２１の近ＵＶＣＤスペクトルをモニターした。答えはきわめて明快である：Ｓｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤ（図１を参照）およびＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤ（図３を参照）両方の近ＵＶＣＤ信号は、それぞれの融合ポリペプチドの規則的三次構造を明確にレポートしている。明らかに、Ｓｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤおよびＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤの芳香族残基は親油性タンパク質コアに埋め込まれており、よって非対称環境をもち、それはそれぞれの融合構築体内のキャリヤーおよびターゲットタンパク質成分の天然様コンホメーションを強く指摘する。Ｓｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤの近ＵＶＣＤスペクトルは、２８２および２７７ｎｍに最大をもつ陰性信号を示す（図１）。ＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤの近ＵＶＣＤスペクトルは、２８０ｎｍに最大をもつ陽性信号を示す（図３）。

Ｓｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤおよびＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤの熱誘導アンフォールディングが可逆的であるかどうかという疑問に対処するために、それぞれ２７７および２８０ｎｍの波長の近ＵＶ領域で融解曲線をモニターした。温度範囲は２０〜７５℃であり、バンド幅は２．０ｎｍであり、温度勾配は１℃／分であり、応答は２秒であった。

熱誘導アンフォールディングを２７７および２８０ｎｍでモニターした；これらは、それぞれＳｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤおよびＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤについての最大信号振幅に対応する。加熱すると、融合ポリペプチド分子の天然コンホメーションを安定化する非共有結合接点がルーズになり、最終的に破断する。Ｓｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤについて、この熱誘導アンフォールディング（２７７ｎｍでモニターしたもの）は、図２に示すようにＣＤ信号の増強に反映される。Ｓｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤは、５５℃まで明らかにそれの天然様フォールドおよびトリマー型構造を保持する。アンフォールディングの開始は５５℃〜６０℃である。図２の融解曲線により判定されるように、７０℃で分子は完全にアンフォールディングする。驚くべきことに、タンパク質溶液を２０℃まで冷却するとＣＤ信号が復活する（図１、２）。しかし、リフォールディング曲線のヒステリシスが顕著であり、これはおそらくアンフォールディングとリフォールディングの異なる経路を指摘する。Ｓｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤのような複雑なトリマー型融合タンパク質の熱誘導アンフォールディングが −少なくとも部分的には− 可逆的プロセスであることは驚くべきである。７５℃のような高い温度では、Ｓｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤは熱誘導アンフォールディングおよびモノマーサブユニットへの解離後にきわめて急速かつ定量的に凝集すると予想されたであろう。しかし本発明者らは、タンパク質溶液を２０℃に冷却するとＳｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤが明らかにそれの天然様コンホメーションを再びとることができるのを見出している。実際に、熱誘導アンフォールディングの前と後にモニターした近ＵＶＣＤスペクトルは実質的に重なる（図１を参照）。結論として、Ｓｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤは強靭なフォールディング特性をもち、それはこの複雑度をもつ分子としては傑出しており、イムノアッセイに用いる抗原にとってきわめて望ましいものである。ＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤについてもきわめて類似する結果が見られた：Ｓｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤと全く同様に、ＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤは近ＵＶ領域に顕著なＣＤ信号を示し（２５０〜３３０ｎｍ，最大信号は２８０ｎｍに）、これはマトリックス−カップリングしたリフォールディングプロセス後の十分に規則的なコンホメーションを指摘する（図３）。分子がアンフォールディングしてそれの三次構造を失うと、ＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤのＣＤ信号は著しく低減する（図４）。熱転移により、本発明者らはＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤが５５℃まで実際にそれの天然様コンホメーションを保持するのを観察した。アンフォールディングの開始 −２８０ｎｍにおける近ＵＶＣＤ分光分析によりモニターしたもの− は約６０℃であり、７０℃でＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤは完全にアンフォールディングする。熱的アンフォールディング／リフォールディングサイクル後に天然ＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤ分子のＣＤ信号が完全に復活するのは驚くべきことである（図４）。図３に示すように、アンフォールディング／リフォールディングサイクルの前と後のＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤのＣＤスペクトルはほぼ完全に重なる。

結論として、Ｓｋｐ−ｐ２４／ＣＴＤおよびＦｋｐＡ−ｐ２４／ＣＴＤはきわめて強靭なフォールディング特性をもち、それはこの複雑度をもつ分子としては傑出しており、イムノアッセイにおいて抗原成分、すなわち指示子として用いるためにきわめて望ましいものである。

Claims

ＳＥＱＩＤＮＯ．２またはＳＥＱＩＤＮＯ．６に特定されたＨＴＬＶｐ２４のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を含み、ＳＥＱＩＤＮＯ．３およびＳＥＱＩＤＮＯ．７に特定されたＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）を欠如する、可溶性ＨＴＬＶｐ２４抗原。
ＳＥＱＩＤＮＯ．３またはＳＥＱＩＤＮＯ．７に特定されたＨＴＬＶｐ２４のＣ末端ドメインを含み、ＳＥＱＩＤＮＯ．２およびＳＥＱＩＤＮＯ．６に特定されたＮ末端ドメインを欠如する、可溶性ＨＴＬＶｐ２４抗原。
可溶性ＨＴＬＶｐ２４抗原がシャペロンに融合する、請求項１または２に記載の可溶性ＨＴＬＶｐ２４抗原。
シャペロンがオリゴマー型シャペロンである、請求項３に記載の可溶性ＨＴＬＶｐ２４抗原。
オリゴマー型シャペロンがＳｋｐおよびＦｋｐＡからなる群から選択されるシャペロンである、請求項４に記載の可溶性ＨＴＬＶｐ２４抗原。
可溶性かつ免疫反応性のＨＴＬＶｐ２４抗原を製造する方法であって、以下の工程を含む前記方法：
−請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＴＬＶｐ２４抗原をコードする組換えＤＮＡ分子が利用可能な状態で連結したものを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養すること；
−前記ＨＴＬＶｐ２４抗原を発現させること；および、
−前記ＨＴＬＶｐ２４抗原を精製すること
。
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＴＬＶｐ２４抗原およびＳＥＱＩＤＮＯ．２５によるアミノ酸配列を含むＨＴＬＶｇｐ２１抗原を含むＨＴＬＶ抗原組成物であって、ｐ２４およびｇｐ２１抗原が別個のポリペプチドとして発現された、前記組成物。
単離した試料においてＨＴＬＶに対して特異的な抗体を検出するための方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＴＬＶｐ２４抗原または請求項７に記載のＨＴＬＶ抗原組成物をＨＴＬＶ抗体の捕捉試薬および／または結合パートナーとして使用する、前記方法。
単離した試料においてＨＴＬＶに対して特異的な抗体を検出するための方法であって、以下を含む前記方法：
ａ）体液試料を請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＴＬＶｐ２４抗原または請求項７に記載のＨＴＬＶ抗原組成物と混合することにより免疫反応混合物を調製すること；
ｂ）体液試料中に存在する、前記ＨＴＬＶ抗原またはＨＴＬＶ抗原組成物に対する抗体が、前記ＨＴＬＶ抗原またはＨＴＬＶ抗原組成物と免疫反応して免疫反応生成物を形成できるのに十分な期間、前記免疫反応混合物を保持すること；および、
ｃ）前記いずれかの免疫反応生成物の存在および／または濃度を検出すること
。
単離した試料においてＨＴＬＶに対して特異的な抗体を検出するための請求項９に記載の方法であって、ここで前記免疫反応が下記を含む非対称二重抗原サンドイッチフォーマットで実施される、前記方法：
ａ）直接または間接的に固相に結合でき、生体親和性結合対の一部であるエフェクター基を保有する第１のＨＴＬＶｐ２４抗原、および検出可能な標識を保有する第２のＨＴＬＶｐ２４抗原をその試料に添加すること、ここで前記第１および第２のＨＴＬＶｐ２４抗原は抗ＨＴＬＶ抗体に特異的に結合すること；
ｂ）第１抗原、試料抗体および第２抗原を含む免疫反応混合物を調製すること、ここで免疫反応混合物を調製する前、途中または後に、生体親和性結合対の対応するエフェクター基を保有する固相を添加すること；
ｃ）体液試料においてそれらのＨＴＬＶｐ２４抗原に対する抗ＨＴＬＶ抗体がそれらのＨＴＬＶｐ２４抗原と免疫反応して免疫反応生成物を形成できるのに十分な期間、その免疫反応混合物を保持すること；
ｄ）液相を固相から分離すること；
ｅ）固相もしくは液相または両方におけるそのいずれかの免疫反応生成物の存在を検出すること。
ＨＴＬＶに対して特異的な抗体を検出するための請求項１０に記載の方法であって、第１抗原はＦｋｐＡに融合したＨＴＬＶｐ２４抗原であってビオチン部分を保有し、かつ第２抗原はＳｋｐに融合したＨＴＬＶｐ２４抗原であって電気化学発光性ルテニウム錯体で標識されているか、または、
第１抗原はＳｋｐに融合したＨＴＬＶｐ２４抗原であってビオチン部分を保有し、かつ第２抗原はＦｋｐＡに融合したＨＴＬＶｐ２４抗原であって電気化学発光性ルテニウム錯体で標識されている、前記方法。
抗ＨＴＬＶ抗体の検出のための in vitro 診断検査における、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＴＬＶｐ２４抗原または請求項７に記載のＨＴＬＶ抗原組成物の使用。
少なくとも、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＴＬＶｐ２４抗原または請求項７に記載のＨＴＬＶ抗原組成物を含む、抗ＨＴＬＶ抗体の検出のための試薬キット。