ES2662611T3 - Variantes solubles e inmunorreactivas del antígeno p24 de la cápside de HTLV - Google Patents

Variantes solubles e inmunorreactivas del antígeno p24 de la cápside de HTLV Download PDF

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Abstract

Un antígeno p24 de HTLV soluble que consiste en el dominio C-terminal de p24 de HTLV que tiene SEQ ID NO. 3 o SEQ ID NO. 7, en el que dicho antígeno p24 de HTLV carece del dominio N-terminal como se especifica en SEQ ID NO. 2 y en SEQ ID NO. 6 y en el que dicho antígeno p24 de HTLV soluble se fusiona a una chaperona oligomérica.

Description

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la poliproteína env) de acuerdo con la identificación de entrada SwissProt P14075. El precursor de la poliproteína completo comprende: proteína de superficie (=glucoproteína 46, gp46) y proteína transmembranaria (=glucoproteína 21, gp21) del virus I de la leucemia de linfocitos T humanos (aislado de HS-35 subtipo A del Caribe). Obsérvese que tres residuos están marcados con X (subrayada) lo que significa que el residuo de cisteína de la secuencia natural se puede reemplazar por una alanina o serina (X = C, A o S).
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La gp21 de HTLV también se puede aplicar ventajosamente como un polipéptido de fusión de chaperona potenciado 10 en solubilidad como se muestra, por ejemplo, en SEQ ID NO. 26 y 27
SEQ ID NO. 26: EcSlyD-gp21(339-446)/HTLV-I
imagen7
SEQ ID NO. 27: EcSlpA-gp21(339-446)/HTLV-I
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20 Leyenda de las figuras:
La fig. 1 muestra el espectro de CD UV cercano de Skp-p24/CTD (267-350), SEQ ID NO. 22.
La fig. 2 muestra la curva de fusión de Skp-p24/CTD (SEQ ID NO. 22). El desplegamiento y el replegamiento inducidos 25 térmicamente se controlan mediante espectroscopia de CD UV cercano a 277 nm.
La fig. 3 muestra el espectro de CD UV cercano de FkpA-p24/CTD (267-350), SEQ ID NO. 21.
La fig. 4 muestra que la señal de CD UV cercano de la molécula de FkpA-p24/CTD natural se restaura completamente 30 después de un ciclo de desplegamiento/replegamiento inducido térmicamente.
Descripción detallada de la invención
p24 de HTLV es un antígeno crítico para la detección de anticuerpos anti-HTLV. La proteína de la cápside p24 se
35 conoce en la técnica desde hace mucho tiempo y se ha usado en inmunoensayos para la detección de anticuerpos anti-HTLV (Manns et al., Blood (1991) 77: 896-905. Los inmunoensayos para la detección de moléculas tanto de IgG como de IgM requieren un conjunto de antígenos que se reconocen y se unen no solo mediante moléculas de IgG sino también mediante moléculas de IgM. Las moléculas de IgM típicamente se producen en la fase temprana de la seroconversión tras la infección con HTLV. La unión de las moléculas de IgM polivalente es esencialmente
40 dependiente de una alta densidad de epítopo de antígeno. Por tanto, es imperativo que los antígenos diseñados para la detección específica de moléculas de IgM posean y exhiban dicha alta densidad de epítopo.
Una forma convencional de generar módulos de detección de IgM con alta densidad de epítopo sería polimerizar antígenos monoméricos por medio de reticulación química. Existe una gran cantidad de reticuladores 45 homobifuncionales y heterobifuncionales que se pueden usar con gran ventaja y que se conocen bien en la técnica. No obstante, existen algunos inconvenientes graves en la polimerización de antígenos químicamente inducida para su uso como especificadores en ensayos serológicos. Por ejemplo, la inserción de restos reticuladores en antígenos puede comprometer la antigenicidad al interferir con la conformación de tipo natural o al enmascarar epítopos críticos. Además, la introducción de contactos terciarios no naturales puede interferir con la reversibilidad del
50 plegamiento/desplegamiento de proteínas, y puede ser, adicionalmente, la fuente de problemas de interferencia que se deben superar mediante estrategias antiinterferentes en la mezcla de inmunoensayo.
Una técnica más reciente para generar módulos de detección de IgM es fusionar el antígeno de interés a una chaperona oligomérica, transmitiendo de ese modo una alta densidad de epítopo al antígeno. La ventaja de esta 55 tecnología radica en su alta reproducibilidad y en la función triple de la pareja de fusión de chaperona oligomérica: en primer lugar, la chaperona potencia la tasa de expresión del polipéptido de fusión en la célula huésped, en segundo lugar, la chaperona facilita el proceso de replegamiento del antígeno diana y potencia su solubilidad global y, en tercer
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dichos antígenos p24 de HTLV en la muestra de líquido corporal inmunorreaccionen con dichos antígenos p24 de HTLV para formar un producto de inmunorreacción. La siguiente etapa es una etapa de separación en la que la fase líquida se separa de la fase sólida. Finalmente, se detecta la presencia de cualquiera de dichos productos de inmunorreacción en la fase sólida o líquida o en ambas.
En dicho inmunoensayo DAGS, las estructuras básicas del "antígeno de fase sólida" y el "antígeno de detección" son esencialmente las mismas. También es posible usar, en un ensayo de puente de doble antígeno, antígenos p24 de HTLV similares pero diferentes, que son inmunológicamente de reacción cruzada. El requisito esencial para realizar dichos ensayos es que el epítopo relevante o los epítopos relevantes estén presentes en ambos antígenos. De acuerdo con la invención, es posible usar diferentes restos de fusión para cada antígeno p24 de HTLV (por ejemplo, SlyD fusionado a p24 de HTLV en el lado de la fase sólida y p24 de FkpA fusionado a p24 de HTLV en el lado de detección) ya que dichas variaciones alivian significativamente el problema de unión no específica y, por tanto, mitigan el riesgo de resultados positivos falsos.
Preferentemente, en dicho inmunoensayo DAGS se aplica un formato asimétrico, que combina un p24 de HTLV fusionado a FkpA y un antígeno p24 de HTLV fusionado a Skp. Más preferentemente, el p24 de HTLV fusionado a FkpA se usa en el lado de la fase sólida y el p24 de HTLV fusionado a Skp se aplica en el lado de detección, pero también es posible tener una disposición inversa, es decir, un antígeno p24 de HTLV fusionado a Skp en el lado de la fase sólida y p24 de HTLV fusionado a FkpA en el lado de detección. Más preferentemente, la proteína de fusión FkpA con p24 de HTLV transporta un resto de biotina para la unión a una fase sólida que se ha recubierto con estreptavidina
o avidina y la proteína de fusión Skp con p24 de HTLV transporta un marcador electroquimioluminiscente tal como complejos de rutenio. En caso de una disposición inversa, la proteína de fusión de Skp con p24 transporta una biotina y la de FkpA con p24 transporta dicho marcador.
Un modo de realización adicional de la presente invención es, por lo tanto, un inmunoensayo de acuerdo con el concepto de puente de doble antígeno en el que se usan un primer antígeno p24 de HTLV de acuerdo con la presente invención, y un segundo antígeno p24 de HTLV de acuerdo con la presente invención.
La presente invención se refiere además al uso de al menos un antígeno de HTLV de la invención en una prueba de diagnóstico para la detección de anticuerpos anti-HTLV.
Un tema central adicional de la invención es un kit de reactivos para la detección de anticuerpos contra HTLV que contiene, además de los aditivos de prueba habituales para inmunoensayos, al menos un antígeno de los antígenos p24 de HTLV de acuerdo con la invención, adecuado para unirse específicamente a los anticuerpos de HTLV que se van a determinar y que posiblemente transporta un marcador, así como otros aditivos habituales si es necesario.
Un kit de reactivos puede contener un antígeno p24 de HTLV de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO. 9 a 16 y 18 a 24.
Además, los kits de reactivos definidos anteriormente contienen controles y soluciones patrón, así como reactivos en una o más soluciones con los aditivos, tampones, sales, detergentes, etc., comunes que se usan por el experto en la técnica junto con las instrucciones de uso.
Otro modo de realización es una composición de antígenos de HTLV que comprende un antígeno p24 de HTLV soluble de acuerdo con la presente invención y un antígeno env de HTLV, preferentemente gp21 que comprende SEQ ID NO.
25. El término "composición" se refiere a polipéptidos expresados por separado que están presentes como moléculas distintas individuales en una mezcla. El término composición excluye una proteína que lleva fragmentos de p24 y gp21 en una única cadena polipeptídica.
Se divulga una composición que comprende los dominios C-terminales de p24 de HTLV, particularmente una composición que comprende un antígeno p24 de HTLV-I de acuerdo con SEQ ID NO. 3 (que carece de SEQ ID NO. 2) y/o un antígeno p24 de HTLV-II de acuerdo con SEQ ID NO. 7 (que carece de SEQ ID NO. 6) y gp21 de HTLV.
Por ejemplo, en dicha composición, puede estar presente una secuencia de gp21 de HTLV que comprende cualquiera de SEQ ID NO. 25, 26 o 27. Para la aplicación en un inmunoensayo de acuerdo con el formato DAGS, la composición comprende cada antígeno de HTLV en dos formas, es decir, en una forma que permite que el antígeno se una a una fase sólida (por ejemplo, un antígeno biotinilado que se puede unir a una superficie recubierta con estreptavidina) y en una forma marcada que permite la detección del inmunocomplejo entre los anticuerpos de HTLV presentes en la muestra y los antígenos de HTLV aplicados.
La invención también se refiere al uso de un antígeno p24 de HTLV de acuerdo con la invención en una prueba de diagnóstico in vitro para la detección de anticuerpos anti-HTLV.
En la medida en que los siguientes ejemplos forman parte del tema principal que se encuentra dentro del alcance de las reivindicaciones, se deben ver como ilustrativos de la invención. En cualquier otra circunstancia, estos se deben ver como proporcionados solamente con propósitos de referencia.
12
imagen13
sobre una columna de Ni-NTA equilibrada con el tampón de lisis que incluía TCEP 5,0 mM. La etapa de lavado posterior se adaptó para la proteína diana respectiva y varió desde 5 a 15 mM de imidazol (en fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0, GdmCl 7,0 M, TCEP 5,0 mM). Se aplicaron al menos 15-15 volúmenes del tampón de lavado. Entonces, se reemplazó la solución de GdmCl por fosfato de potasio 50 mM pH 8,0, KCl 100 mM, imidazol 10 mM, TCEP 5,0 mM 5 para inducir el replegamiento conformacional de la proteína unida a la matriz. Para evitar la reactivación de proteasas que se copurifican, se incluyó un cóctel inhibidor de proteasa (Complete® sin EDTA, Roche) en el tampón de replegamiento. Se aplicaron un total de 15-20 volúmenes de columna de tampón de replegamiento en una reacción durante la noche. Entonces, tanto el TCEP como el cóctel inhibidor Complete® sin EDTA se eliminaron lavando con 35 volúmenes de columna de fosfato de potasio 50 mM, pH 8,0, KCl 100 mM, imidazol 10 mM. Posteriormente, la 10 concentración de imidazol, aún en fosfato de potasio 50 mM, pH 8,0, KCl 100 mM, se elevó a 20-80 mM (dependiendo de la respectiva proteína diana) para eliminar los contaminantes proteínicos unidos de manera inespecífica. Entonces, se eluyó la proteína natural mediante imidazol 500 mM en el mismo tampón. Las fracciones que contenían proteína se evaluaron en cuanto a su pureza mediante Tricina-SDS-PAGE y se agruparon. Finalmente, se sometieron las proteínas a cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex HiLoad, Amersham Pharmacia) y se agruparon las
15 fracciones que contenían proteína y se concentraron a 10-20 mg/ml en una célula Amicon (YM10).
Después del protocolo acoplado de purificación y replegamiento, se pudo obtener rendimientos de proteína de aproximadamente 10-30 mg a partir de 1 g de células húmedas de E. coli, dependiendo de la respectiva proteína diana.
20
Ejemplo 2
Mediciones espectroscópicas
25 Las mediciones de concentración de proteína se realizaron con un espectrofotómetro Uvikon XL de doble haz. Los coeficientes de extinción molar (ε280) se determinaron usando el procedimiento descrito por Pace (1995), Protein Sci. 4, 2411-2423. Los coeficientes de extinción molar (εM280) usados para los distintos polipéptidos de fusión se especifican en la tabla 1.
30 Tabla 1: Parámetros de proteína de las variantes del polipéptido de fusión p24 generadas y usadas en el presente estudio. Todos los parámetros se refieren a los respectivos monómeros de proteína.
Proteína de fusión
Longitud de la proteína diana (residuos aa) Peso molecular del polipéptido de fusión (Da) pI εM280 M-1cm-1 Abs 0,1 % (= 1 mg/ml)
variantes de p24 HTLV-I
EcSlyD-EcSlyD-p24 EcFkpA-p24 EcSkp-p24 EcSlyD-EcSlyD-p24/CTD EcFkpA-p24/CTD EcSkp-p24/CTD EcSlyD-EcSlyD-p24/NTD EcFkpA-p24/NTD EcSkp-p24/NTD
146-344 146-344 146-344 258-344 258-344 258-344 146-260 146-260 146-260 61 762 50 840 40 306 49 311 38 389 27 855 52 486 41 565 31 031 5,0 6,8 9,1 4,9 7,1 9,3 4,8 6,5 9,0 35 870 39 880 25 440 25 900 29 910 15 470 21 890 25 900 11 460 0,581 0,784 0,631 0,525 0,779 0,555 0,417 0,623 0,369
variantes de p24 HTLV-II
EcSlyD-EcSlyD-p24 EcFkpA-p24 EcSkp-p24 EcFkpA-p24/CTD EcSkp-p24/CTD EcFkpA-p24/NTD EcSkp-p24/CTD
152-350 152-350 152-350 267-350 267-350 152-266 152-266 61 868 50 946 40 412 38 120 27 586 41 739 31 205 5,0 7,2 9,2 7,1 9,3 6,7 9,2 35 870 39 880 25 440 29 910 15 470 25 900 11 460 0,580 0,783 0,630 0,785 0,561 0,621 0,367
14
imagen14
imagen15
Recuentos en el analizador Elecsys (cobas e 411)
Suero sin anti-HTLV 0701.1201.01 599 0701.1202.01 611 0701.1203.01 592 Paneles de seroconversión (día de extracción de sangre)
976 1116 1148 667 724 717 2846 4331 4860 1677 1981 1933
K5645 (día 0) 725 K5645 (día 10) 612 K5645 (día 14) 642 K5645 (día 18) 1558 K5646 (día 0) 592 K5646 (día 11) 636 K5646 (día 15) 1425 K5646 (día 19) 14 080
1037 1196 8232 50 118 1045 1396 13 090 106 376 790 758 729 906 728 770 740 4342 2330 2549 2690 3071 2359 2779 3084 6321 1608 1613 2910 15 191 1580 1665 1715 8832
K5646 (día 23) 109 285 K5647 (día 0) 814 K5647 (día 12) 2620 K5647 (día 16) 159 796 K5647 (día 20) 187 997 K5648 (día 0) 572 K5648 (día 10) 803 K5648 (día 14) 2575 K5648 (día 18) 10 107 K5648 (día 22) 58 656
160 403 917 95 130 61 639 63 193 848 1003 122 993 181 988 352 195 33 361 799 1100 19 774 62 381 737 871 972 4401 7844 15 881 2295 19 920 88 453 99 227 2113 2562 4324 21 689 16 692 76 212 1445 3606 339 050 623 586 1467 1512 2733 10 892 48 125
Ejemplo 5
Combinaciones de proteínas transportadoras de chaperonas oligoméricas en un formato de tipo sándwich de 5 doble antígeno asimétrico
Se realizó el inmunoensayo esencialmente como se describe en el ejemplo 4. Se pueden usar ventajosamente chaperonas oligoméricas tales como FkpA y Skp como parejas de fusión para lograr una oligomerización funcional de sus respectivos antígenos clientes. La fusión de FkpA o Skp a proteínas diana (es decir, sus antígenos clientes o 10 huéspedes) puede producir polipéptidos de fusión oligoméricos bien definidos que son adecuados para la detección de moléculas de IgM en inmunoensayos. En este caso, los autores de la presente invención abordaron la cuestión de si existe una combinación particularmente preferente de los polipéptidos de fusión Skp-X y FkpA-X cuando se usan en un formato DAGS (de tipo sándwich de doble antígeno). (Nota: "X" se refiere en general a cualquier proteína o antígeno diana). En otras palabras, los autores de la presente invención abordaron la cuestión de si es aconsejable
15 usar polipéptidos de fusión FkpA-X en el lado de biotina (captura) en lugar de en el lado de rutenio (señalización). Por el contrario, los autores de la presente invención se preguntaron si es aconsejable usar los polipéptidos de fusión Skp-X en el lado de rutenio (señalización) en lugar de en el lado de biotina (captura).
En un primer experimento, se prepararon conjugados de biotina y rutenio de EcSkp y EcFkpA recombinantes
20 purificados como se describe en el ejemplo 3. Es decir, las chaperonas purificadas (es decir, las chaperonas desnudas sin ninguna secuencia diana fusionada) se biotinilaron por medio de un marcador de biotina activado por N-hidroxisuccinimida. Asimismo, se produjeron chaperonas rutiniladas (es decir, las chaperonas desnudas sin ninguna secuencia diana fusionada) por medio de un marcador de rutenio activado por N-hidroxi-succinimida.
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Ejemplo 6
Desplegamiento inducido térmicamente detectado por CD de Skp-p24/CTD (267-350) y FkpA-p24/CTD (267350)
Los espectros de CD UV cercano se registraron con un espectropolarímetro Jasco-720 con un soporte de cubeta termorregulado y se convirtieron en elipticidad de residuo media. El tampón era fosfato de potasio 150 mM, pH 8,0, KCl 100 mM, EDTA 0,5 mM. La longitud de trayectoria era de 0,2 cm, la concentración de proteína era de 218 µM (que se refiere al monómero Skp-p24) o de 147,5 µM (que se refiere al monómero FkpA-p24). El intervalo de medición era de 250-330 nm, el ancho de banda era de 1,0 nm, la velocidad de exploración era de 20 nm/min a una resolución de 0,5 nm y la respuesta era de 1 s. Para mejorar la proporción de señal a ruido, se midieron los espectros nueve veces y se promediaron.
La espectroscopia de dicroísmo circular (CD) es el procedimiento de elección para evaluar tanto la estructura secundaria como la terciaria de las proteínas. La elipticidad en la región aromática (250-330 nm) informa sobre contactos terciarios dentro de una proteína (es decir, la estructura globular de una proteína plegada de forma normal) y se considera como la región de característica de un pliegue (conformación) de tipo natural.
Los espectros de CD UV cercano de Skp-p24/CTD(267-350) y FkpA-p24/CTD(267-350), SEQ ID NO. 22 y 21, respectivamente, se controlaron para abordar la cuestión de si las proteínas de fusión adoptan una conformación ordenada después del procedimiento de replegamiento acoplado a la matriz que es la etapa crítica en el procedimiento de purificación. La respuesta es bastante clara: las señales de CD UV cercano tanto de Skp-p24/CTD (véase la figura 1) como de FkpA-p24/CTD (véase la figura 3) informan inequívocamente de una estructura terciaria ordenada del respectivo polipéptido de fusión. Obviamente, los residuos aromáticos de Skp-p24/CTD y FkpA-p24/CTD están incrustados en el núcleo de proteína lipófila y experimentan, por tanto, entornos asimétricos que indican fuertemente una conformación de tipo natural del componente de la proteína transportadora y diana dentro de la respectiva construcción de fusión. El espectro de CD UV cercano de Skp-p24/CTD exhibe una señal negativa con máximos a 282 y 277 nm (figura 1). El espectro de CD UV cercano de FkpA-p24/CTD exhibe una señal positiva con un máximo a 280 nm (figura 3).
Para abordar la cuestión de si el desplegamiento inducido térmicamente de Skp-p24/CTD y FkpA-p24/CTD es reversible, se controlaron las curvas de fusión en la región de UV cercano en longitudes de onda de detección de 277 y 280 nm, respectivamente. El intervalo de temperatura era de 20-75 °C, el ancho de banda era de 2,0 nm, la pendiente de la temperatura era de 1 °C/min y la respuesta era de 2 s.
El desplegamiento inducido térmicamente se controló a 277 y 280 nm, correspondiente a las amplitudes de señal máxima para Skp-p24/CTD y FkpA-p24/CTD, respectivamente. Tras el calentamiento, los contactos no covalentes que estabilizan la conformación natural de las moléculas del polipéptido de fusión se sueltan y finalmente se descomponen. Para Skp-p24/CTD, este desplegamiento inducido térmicamente (que se controló a 277 nm) se refleja en un aumento en la señal de CD como se muestra en la figura 2. El Skp-p24/CTD obviamente retiene su pliegue de tipo natural y su estructura trimérica hasta 55 °C. El inicio del desplegamiento es entre 55 °C y 60 °C. A 70 °C, la molécula está completamente desplegada, a juzgar por la curva de fusión en la figura 2. De modo impresionante, la señal de CD se restaura cuando la solución de proteína se enfría hasta 20 °C (figuras 1, 2). No obstante, la histéresis de la curva de replegamiento es pronunciada y probablemente indica diferentes vías de desplegamiento y replegamiento. Es asombroso que el desplegamiento inducido térmicamente de una proteína de fusión trimérica compleja tal como Skp-p24/CTD sea, al menos parcialmente, un proceso reversible. Se hubiera esperado que Skp-p24/CTD, después del desplegamiento inducido térmicamente y la disociación en subunidades monoméricas, se agregara muy rápida y cuantitativamente a una temperatura elevada tal como 75 °C. Sin embargo, se encontró que Skp-p24/CTD es obviamente capaz de volver a adoptar su conformación de tipo natural cuando la solución de proteína se enfría hasta 20 °C. De hecho, los espectros de CDV UV cercano controlados antes y después del desplegamiento inducido térmicamente prácticamente se superponen (véase la figura 1). En conclusión, Skp-p24/CTD posee sólidas propiedades de plegamiento que son destacadas para una molécula con este grado de complejidad y que son altamente deseadas para un antígeno que se usa en un inmunoensayo. Se encontraron resultados muy similares para FkpA-p24/CTD: al igual que Skp-p24/CTD, FkpA-p24/CTD exhibe una marcada señal de CD en la región UV cercano (250-330 nm, señal máxima a 280 nm), indicando una conformación bien ordenada después del proceso de replegamiento acoplado a la matriz (figura 3). La señal de CD de FkpA-p24/CTD disminuye fuertemente cuando la molécula se despliega y pierde su estructura terciaria (figura 4). Por medio de transiciones térmicas se observó que FkpA-p24/CTD retiene, de hecho, su conformación de tipo natural a temperaturas de hasta 55 °C. El inicio del desplegamiento, que se controla mediante espectroscopia de CD UV cercano a 280 nm, es de alrededor de 60 °C, y a 70 °C, FkpA-p24/CTD está completamente desplegada. Es notable que la señal de CD de la molécula FkpA-p24/CTD natural se restaura completamente después de un ciclo de desplegamiento/replegamiento térmico (figura 4). Como se ilustra en la figura 3, los espectros de CD de FkpA-p24/CTD antes y después del ciclo de desplegamiento/replegamiento se superponen casi perfectamente.
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