JPH11508036A - 抗−ｈｉｖ−１または抗−ｈｉｖ−２抗体を検出するための改良されたハプテン−ペプチド結合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 試験サンプル中に存在するかもしれない抗ＨＩＶ−１または抗ＨＩＶ−２抗体の存在を検出するための改良された免疫測定法が提供される。部位特異的ハプテン化ペプチド結合物を含む組成物および試験キットも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 抗−ＨＩＶ−１または抗−ＨＩＶ−２抗体を検出するための 改良されたハプテン−ペプチド結合物 発明の背景 本発明は、ハプテン−ペプチド結合物、および特に、ハプテン−ペプチド結合 物を用いるＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を検出するための改良された免疫測定法 に関する。 試験サンプル中の分析物を検出するために用いられる信号発生化合物より発生 される信号を増加または増幅させ、アッセイの感度を向上させるために、ハプテ ンが種々の免疫測定法において用いられる。「ハプテン」という用語は、抗体に 結合することができるが、輸送タンパク質に結合しなければ抗体形成を誘起する ことのできない部分的抗原または非タンパク結合成分を意味する。ハプテンの例 は、ビオチンまたは抗ビオチンおよびアビジンまたはビオチンなどの分子を含む 。 例えば、ビオチン化ペプチドは、溶液中において選択されたモル量のビオチン 化試薬を用いて抗原またはペプチドをビオチン化し、粗プローブから遊離ビオチ ンを透析により除去することにより調製されてきた。しかしながら、このビオチ ン化の方 法には多くの問題がある。この方法により製造されるビオチン化ペプチドは、典 型的に、種々の異なる数のビオチン部分で標識化されたペプチドの混合物である 。さらに、ビオチン化はペプチド上でランダムに起るため、溶液中の一部のペプ チド分子がいかなる位置でもビオチン化されない場合もあり得る。すなわち、溶 液ビオチン化方法で製造したペプチドの作用は、調製毎に異なる傾向がある。さ らに、ビオチン化ペプチドが免疫測定法で用いられる抗原である場合、溶液ビオ チン化方法は、通常、抗原エピトープ中のアミノ酸残基をビオチン化し、それに より抗原と抗体との間の結合を妨害する。さらに、ビオチンはペプチド分子にラ ンダムに結合するので、ペプチドでビオチン化が起こる場所を制御することがで きず、ビオチン化ペプチドの調製においてペプチド上に存在するビオチンの量は 不明でありかつ制御することができない。 従って、ハプテン、好ましくはビオチンが、ペプチド分子上の既知の予め決め られた特定の位置において結合している改良されたハプテン−ペプチド結合物が 要求されている。発明の概要 本発明は、試験サンプル中に存在するかもしれないＨＩＶ− １およびＨＩＶ−２に対する抗体を検出するための改良された免疫測定法を提供 する。ここに教示されるように改良されたＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のための 免疫測定法は、通常、試験サンプルを、固相に結合してそれにより第１の混合物 を形成する目的の抗体分析物に特異的な結合対成分を含む抗体分析物に対する捕 捉試薬に接触させることを含む。この第１の混合物を、捕捉試薬／分析物複合体 を形成するのに充分な条件下に所定時間培養する。次に、これらの複合体を、複 合体の分析物成分に特異的なペプチドに結合しているハプテンを含むハプテン− ペプチド結合物に接触させて第２の混合物を形成する。この第２の混合物を培養 して捕捉試薬／分析物／ハプテン−ペプチド結合物複合体を形成する。次に、捕 捉試薬／分析物／ハプテン−ペプチド結合物複合体に対して、好ましくは洗浄工 程を施して、捕捉試薬／分析物／ハプテン−ペプチド結合物複合体から複合化さ れていないハプテン−ペプチド結合物を分離する。次に、測定可能な信号を発生 することのできる信号発生化合物で標識したハプテンに特異的な結合対の成分を 含む指示薬を、捕捉試薬／分析物／ハプテン−ペプチド結合物複合体に接触させ て第３の混合物を形成する。この第３の混合物を、捕捉試薬／分析 物／ハプテン−ペプチド結合物／指示薬複合体を形成するのに充分な条件下に所 定時間培養する。分析物が存在する場合、分析物の存在は、信号発生化合物より 発生される測定可能な信号を検出することにより決められる。アッセイの改良は 、少なくとも一つ、好ましくは二つのＮ−末端ハプテンで標識された配列番号１ −５で示されるアミノアシル残基配列を含むハプテン−ペプチド結合物に、捕捉 試薬／分析物複合体を接触させることを含む。 試験サンプル中に存在するかもしれない抗ＨＩＶ−１または抗ＨＩＶ−２抗体 を検出するのに有用な組成物も提供される。この組成物は、配列番号１−５で示 される任意の配列から選択される実質的に純粋なＮ−末端ハプテン化ペプチドを 含む。さらに、本発明は、少なくとも一つのハプテン−ペプチド結合物試薬を含 む試験キットを提供する。ハプテン−ペプチド結合物試薬は、通常、適当な緩衝 液中に溶解または懸濁されている配列番号１−５で示される任意の配列から選択 される実質的に純粋なＮ−末端ハプテン化ペプチドを含む。図面の簡単な説明 図１は、ビオチン化方法の模式的概略図である。 図２は、カメルーンサンプルのビオチン化ＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗原へのペプ チド濃度投与反応に対するＳ／Ｎ比のプロットを示す。 図３は、ＨＩＶサンプルの配列番号６へのペプチド濃度投与反応に対するカウ ント数の半対数プロットを示す。発明の詳細な説明 特記しない限り、以下の用語は以下の意味を有する： ここで用いられる「合成ペプチド」という用語は、当業者に良く知られている 方法により化学的に合成することのできる任意の長さのアミノ酸の重合体を意味 する。 合成ペプチドすなわち「抗原」は、ペプチド内に含まれる特定エピトープの抗 体認識性故に抗体に結合するとき、抗体に対して「免疫学的に反応性」である。 免疫学的反応性は、抗体結合により、特に抗体結合の速度論により、および／ま たは、抗体に対するエピトープを含む既知のペプチドを競合薬として用いる結合 における競合により決定することができる。ペプチドが抗体に対して免疫学的に 反応性であるかどうか決める方法は、当該分野において知られている。 ここで用いられる「個体」という用語は脊椎動物、特に、哺 乳類の動物を示し、限定されないが、家畜、スポーツ用動物（sports animals） 、霊長類および人を含み、特にこの用語は霊長類／サルおよび人を意味する。 「体成分を含む分析物」または「試験サンプル」という用語は、目的とする抗 体分析物の源である個体の体の成分を意味する。これらの成分は、当分野で良く 知られている。これらの試験サンプルは、ここに記載の本発明の方法により試験 することができる生物学的サンプルを含み、人および動物の体の流体、例えば、 全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液、腹水、および呼吸、腸および尿生 殖器管の種々の外分泌物、涙、唾液、乳、白血球、骨髄等；細胞培養上清のよう な生物学的流体；固定組織標本；および固定細胞標本または他の体成分を含む。 ここに記載の改良されたハプテン−ペプチド結合物（conjugate）は、抗ＨＩ Ｖ−１または抗ＨＩＶ−２抗体の存在を検出または認識するためにここに記載の 独自の改良されたアッセイを開発するために使用することができる。ハプテン− ペプチド結合物は、ハプテンおよび、例えば天然のウイルス抗原および／または 組み換えタンパクを含む他のハプテン結合物と組み合わせて用いることもできる 。 ここで用いられる「分析物」は、試験サンプル中に存在し得る検出すべき物質 である。分析物は、天然の特異的結合成分（例えば、抗体）が存在するか、また は特異的結合成分を調製することができる任意の物質であり得る。すなわち、分 析物は、アッセイにおいて一つ以上の特異的結合成分に結合することのできる物 質である。「分析物」はまた、任意の抗原性物質、ハプテン、抗体、およびそれ らの組み合わせを含む。特異的結合対の成分として、分析物は、ビタミンＢ１２ 測定のための特異的結合対の成分としての固有因子タンパクの使用、葉酸測定の ための葉酸エステル結合タンパクの使用、または炭水化物測定のための特異的結 合対の成分としてのレクチンの使用のような天然の特異的結合パートナー（対） により検出することができる。分析物は、タンパク、ペプチド、アミノ酸および ヌクレオチド標的等も含むことができる。 本発明は、特異的結合成分を利用するアッセイを提供する。ここで用いられる 「特異的結合成分」は、特異的結合対の成分である。すなわち、第１の分子が化 学的または物理的手段により第２の分子に結合している二つの異なる分子である 。従って、通常の免疫測定法の抗原および抗体特異的結合対に加えて、他 の特異的結合対は、ビオチンおよびアビジン、炭水化物およびレクチン、相補ヌ クレオチド配列、エフェクターおよびレセプター分子、共因子および酵素、酵素 阻害剤および酵素、等を含むことができる。さらに、特異的結合対は、最初の特 異的結合成分に類似する成分、例えば、分析物類似体を含み得る。特異的結合対 成分は、タンパク、ペプチド、アミノ酸およびヌクレオチド標的等を含むことが できる。さらに、特異的結合対は、最初の特異的結合成分に類似する成分、例え ば、分析物類似体を含み得る。免疫反応性特異的結合成分は、抗原、抗原フラグ メント、抗体および抗体フラグメント（モノクローナルとポリクローナルの両方 ）、およびそれらの複合体を含み、組み換えＤＮＡ分子により形成されたものを 含む。ここで用いられる「ハプテン」という用語は、抗体に結合することができる が、輸送タンパクに結合しなければ抗体形成を誘発することのできない部分的抗 原または非タンパク結合成分を意味する。 ここで用いられる「捕捉試薬」という用語は、サンドイッチアッセイにおける ような分析物、競合アッセイにおけるような指示薬または分析物、または間接ア ッセイにおけるようなそれ自体が分析物に特異的な補助特異的結合成分のいずれ かに特異 的な非標識特異的結合成分を意味する。捕捉試薬は、アッセイの実行前またはア ッセイの実行中に固相材料に直接または間接的に結合することができ、それによ り試験サンプルから不動化複合体の分離を可能にする。 「固相」は特に限定されず、不当な実験をすることなく当業者が選択すること ができる種々の材料であってよい。「固相」という用語は、広義に用いられ、不 溶性またはその後の反応により不溶性にすることのできる任意の材料を意味する 。すなわち、多孔性または非多孔性材料、ラテックスまたはポリスチレン粒子、 磁性または非磁性微粒子、ビーズ、膜、プラスチック管、微小ウエルの壁および 着色羊赤血球は、全て適当な例である。固相の寸法、次元および形状は、通常、 ここに開示されている方法の実施例において重要でない。 固相上の抗原を不動化する適当な方法は、イオン性、疎水性、共有相互反応等 を含み、有用な固相の適用に関して種々の方法を使用することができる。捕捉試 薬は、固相上に受動的にまたは能動的に結合しうる。ここで用いられる受動被膜 は、捕捉試薬と固相との間の非共有結合（ｂｏｎｄｉｎｇまたはａｔｔａｃｈｍ ｅｎｔ）を意味する。活性被膜は、捕捉試薬と固体支持 体との間に共有結合を形成することを意味する。通常、そのような共有結合は、 抗原のカルボキシまたはアミノ末端により、または固相の表面上の適当な官能基 へのタンパク結合中の遊離カルボキシまたはアミノ基により形成される。そのよ うな官能基を有する固相は誘導体と呼ばれる。活性被膜は、抗原と固体支持体と の間に共有結合を形成するためにリンカー化合物を用いることも含む。リンキン グ剤は、捕捉試薬、通常は抗原を添加する前に固相の一部として組み込む、また は固相上に誘導体形成することができる。ヘテロ二官能化合物、例えば、スルホ −ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ サン−１−カルボキシレート）またはスルホ−ＳＩＡＢ（スルホスクシンイミジ ル（４−インドアセチル）アミノベンゾエートまたはホモ二官能化合物、例えば 、スルホ−ＤＳＴ（ジスルホスクシンイミジルタルタレート）またはスルホ−Ｅ ＧＳ（エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジル−スクシネート］）の 使用により、より特異的／部位指向性共有結合を起こすことができる。リンカー 化合物の添加により、固相に結合しているときに抗体に抗原をより自由に相互作 用させるスペーサーアームも含まれる。リンカー基の化学は当 業者の間で公知である。 適当な「指示薬」は、特異的結合成分に結合（付着）している外部手段により 検出することのできる測定可能な信号を発生することのできる信号発生化合物（ 標識）を含む。考慮される種々の「信号発生化合物」（標識）は、色素源、酵素 のような触媒、フルオレセンおよびローダミンのような蛍光化合物、ルミノール 、ジオキセタンアクリジニウム化合物およびフェナンスリジニウム化合物のよう な化学蛍光化合物、放射活性元素および直接視覚標識を含む。酵素の例は、アル カリホスファターゼ、西洋ダイコンペルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ 等を含む。特定の標識の選択は、重要でないが、信号をそのものによりまたは一 つ以上の追加物質と組み合わせて発生することができる。 試験サンプル中に存在し得る分析物は、ここに開示のハプテン−ペプチド結合 物の使用によりアッセイにおいて検出することができる。また、アッセイの試薬 の一つとして、同定することができ、ウイルスまたは微生物のような分析物の異 なるエピトープに特異的に結合することのできる異なる合成ペプチドを、アッセ イフォーマットにおいて用いることができる。本発明の ハプテン化ペプチドを、当分野において良く知られている結合、リンクまたは信 号増幅の目的で用いることができる。 本発明によれば、抗ＨＩＶ−１および抗ＨＩＶ−２抗体分析物の存在を検出す るように設計されたアッセイの改良が提供される。ここに教示のように改良され たアッセイは以下のように行われる。試験サンプルを、固相に結合された目的の 抗体分析物に特異的な結合対成分を含む分析物の捕捉試薬と接触し、それにより 第１の混合物を形成する。分析物は抗体であるので、捕捉試薬は、組み換え抗原 、合成ペプチドまたは分析物に特異的に結合する溶解物であり得る。第１の混合 物を、捕捉試薬／分析物複合体を形成するのに充分な条件下に所定時間培養する 。次に、こうして形成された複合体を、ハプテン−ペプチド結合物に接触して第 ２の混合物を形成する。この第２の混合物を、捕捉試薬／分析物／ハプテン−ペ プチド共役複合体を形成するのに充分な条件下に所定時間培養する。次に、好ま しくは洗浄工程が行われる。次に、測定可能な信号を発生することのできる信号 発生化合物で標識化したハプテンに特異的な結合対の成分を含む指示薬を、捕捉 試薬／分析物／ハプテン−ペプチド結合物複合体に接触させて第３の混合物を形 成する。この第３の 混合物を、捕捉試薬／分析物／ハプテン−ペプチド結合物／指示薬複合体を形成 するのに充分な条件下に所定時間培養する。分析物が存在する場合、分析物の存 在は、信号発生化合物により発生される信号を検出することにより決められる。 既知の濃度の分析物および陰性キャリブレーターを含む陽性キャリブレーターを アッセイし、これらのキャリブレーターを用いて得られた測定信号の結果を既知 の濃度に対してプロットし、プロットの試験サンプルの結果を読み取ることによ っても、存在する分析物の量を定量することができる。 ここに提供される改良は、捕捉試薬／分析物複合体を、Ｎ末端αおよび／また はε位置においてハプテン化された配列番号１−５と表わされるペプチドの少な くとも一つと接触させることを含む。好ましくは、ハプテンはビオチンである。 抗ＨＩＶ−１または抗ＨＩＶ−２抗体の検出に有用な組成物もここに提供される 。組成物は、通常、配列番号１−５で表わされるようなＮ−末端ハプテン化ペプ チドの少なくとも一つの実質的に純粋な溶液を含む。ここで用いられるように、 ここで用いられる「実質的に純粋な溶液」とは、溶液中の非Ｎ末端位置がハプテ ン化されたペプチドの濃度が、アッセイの結果に影響を与える 量で抗体分析物を結合しないことを意味すると解される。当業者にとっては、こ こに提供されるハプテン−ペプチド結合物を懸濁または溶解するための適当な緩 衝液が自明であろう。 バイアルまたはビンのような一以上の容器を有する試験キットの一部として実 質的に純粋な溶液ハプテン−ペプチド結合物が提供され得る。各容器またはバイ アルは、希釈剤、信号発生化合物を含む指示薬、ここに教示のハプテン−ペプチ ド結合物を含むアッセイ試薬等のような試薬を別途含む。ハプテン−ペプチド結 合物は、少なくとも一つのＮ−末端ハプテンで標識した配列番号１−５の実質的 に純粋なものである。そのような試験キットは、目的の分析物の存在を検出／確 認するのに内容物を用いることができることを示す指示も含む。 ここに教示のようにハプテン化されたペプチドは、ＨＩＶ−１ｇｐ４１ ＩＤ ＲおよびＨＩＶ−２ｇｐ−３６ ＩＤＲのようなＨＩＶ抗原の免疫優生領域（Ｉ ＤＲ）から誘導される。これらのＨＩＶペプチドは、以下のものを含む： 配列番号１：Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉ ｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃ ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ； ＨＩＶ−１ｇｐ４１サブタイプＢの免疫優生領域（ＩＤＲ）から誘導された１９ 量体。 配列番号２：Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌ ｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇ ｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ；Ｈ ＩＶ−２ｇｐ３６から誘導された２５量体。 配列番号３：Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔ ｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉ ｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃ ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ；ＨＩＶ−１ｇｐ４１から誘導された２８量体。 配列番号４：Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓ ｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉ ｌｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ；ＨＩＶ−１ｇｐ４１，Ｔｙｐｅ０のＩＤＲから 誘導された２０量体。 配列番号５：Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉ ｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ− Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ；１１位のシステイ ンと１７位のシステインとの間にジスルフィド橋を有する１９量体。１２位にお いてＳｅｒからＬｙｓに、および１８位においてＴｈｒからＴｙｒに変化したＨ ＩＶ−１ｇｐ４１，サブタイプＢのＩＤＲからこのペプチドは誘導される。 これらのペプチド（抗原）のビオチン化形態は、以下のものを含む。 配列番号６：Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉ ｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃ ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ；ＸａａがＮ−ε−（ビオチンアミドカプロイル）リシン であるもの。 配列番号７：Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉ ｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃ ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ；ＸａａがＮ−α−（ビオチンアミドカプロイル）リシン であるもの。 配列番号８：Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ− Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ− Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ− Ｐｒｏ−Ｔｒｐ；ＸａａがＮ−ε−（ビオチンアミドカプロイル）リシンである もの。 配列番号９：Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇ ｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａ ｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔ ｒｐ；ＸａａがＮ−ε−（ビオチンアミドカプロイル）リシンであるもの。 配列番号１０：Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ− Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ− Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ− Ｔｈｒ−Ｔｈｒ；ＸａａがＮ−α−（ビオチンアミドカプロイル）アルギニンで あるもの。 配列番号１１：Ｘａａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ− Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ− Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ− Ｔｈｒ；ＸａａがＮ−α−（ビオチンアミドカプロイル）リシンであるもの。 配列番号１２：Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ− Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ− Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ；ＸａａがＮ−α−（ビオチンアミドカプロイル）リシ ンであるもの。 配列番号１３：Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ− Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ− Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ；ＸａａがＮ−ε−（ビオチンアミドカプロイル）リシ ンであるもの。 配列番号１４：Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ− Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ− Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ；ＸａａがＮ−ε−（ビオチンアミドカプロイル）−α −（ビオチンアミドカプロイル）リシンであるもの。 改良したアッセイにより用いられるペプチド結合物は、固相ペプチド合成（Ｓ ＰＰＳ）を用いて合成することができる。こ の方法を用いて、例えばビオチンを、ペプチド中の選択されたまたは予め決めら れた位置（アミノ酸）に制御可能にかつ容易に組み込むことができる。ＳＰＰＳ は、酸不安定保護基と塩基不安定保護基との間の化学的相違を利用して位置特異 的にハプテンをアミノ酸残基に組み込むことができる。ここに開示のビオチン化 方法は、抗体に対する特異的結合領域（エピトープ）を含むペプチドまたはタン パク抗原を標識化する（ｔａｇ）際に特に有用である。そのようなペプチドのた めに、抗原−抗体相互反応を干渉しないようにエピトープ領域の外側の位置にビ オチンを組み込むことが重要である。 標準的ＳＰＰＳ手順において、樹脂のような固体支持体の上でペプチドが合成 される。ＳＰＰＳを支持するための適当な樹脂は、当該分野において良く知られ ており、限定されないが、ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂およびクロロ メチル化ポリスチレン樹脂を含む。ペプチド合成は、所望のカルボキシル末端（ Ｃ−末端）アミノ酸の樹脂への結合により開始する。ペプチドは、樹脂に付着し たＣ−末端残基へのアミノ酸残基の連続的付加により合成される。付加されたア ミノ酸状α−ペプチドは、樹脂支持残基に結合する。更なる樹脂を添加するため の他の手段が、当該分野において良く知られており、メリフィールド（Ｍｅｒｒ ｉｆｉｅｌｄ）ｔＢｏｃ ＳＰＰＳ手順が挙げられる。好ましい態様において、 塩基不安定性−Ｎ−α−Ｆｍｏｃアミノ酸残基のサイクルを繰り返しペプチドが 形成される。すなわち、Ｃ−末端残基および添加された全ての、しかしＮ−末端 残基は含まない残基は、それらのα−アミノ基に塩基不安定性保護基を有する。 添加された残基の全ての反応性基が、樹脂結合鎖中に既に存在する残基と添加 された残基との間に望ましくない結合（conjugations）ができるのを防止するた めに、適当な保護基により保護される。塩基不安定性基および酸不安定性基を含 むアミノ酸の反応性基のための適当な保護基は、当該分野において良く知られて いる（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、グリーネ（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）およびウツ（ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）、ジョンワーリーアンドサンズ社、１９９１年、を参照 ）。例えば、システインの反応性イオウ（Ｓ）、アスパラギンのβアミノ基、グ ルタミンのγ−アミノ基、およびヒスチジンのイミダゾール窒素（Ｎ）を、当該 分野においてト リチル（Ｔｒｔ：ｔｒｉｔｙｌ）として知られているトリフェニルメチルで保護 することができる。セリンまたはトレオニンの反応性酸素（Ｏ）、チロシンの反 応性Ｏ、アスパラギン酸のβ−カルボキシル基、およびグルタミン酸のγ−カル ボキシル基を、ｔ−ブチルエステル（ｔＢｕ）で保護することができる。 適当な保護剤を選択するための方法は、当該分野において知られており、ペプ チド鎖およびペプチドを含むアミノ酸を形成するために用いられる方法に依存す る。複数の塩基不安定性α−保護アミノ酸残基を用いてペプチド鎖を形成する場 合、他の（非α−アミノ）基のための適当な保護基は、アミノ酸残基を付加する ために用いられる塩基性条件下に安定でなくてはならない。このことは、ビオチ ン化方法が保護基間の安定性および化学的反応性の相違を利用する場合、ここに 開示の方法に特に当てはまる。 Ｎ−末端アミノ酸残基を除くさらなるアミノ酸残基が、前記手順を用いて、ビ オチン化されるペプチドの望ましい配列に依存して予め決められた順番で樹脂結 合ペプチドに付加される。ビオチン化可能なＮ−末端アミノ酸残基が、樹脂結合 ペプチド鎖に付加される。ここで用いられる「ビオチン化可能」という 用語は、ビオチン化され得ることを意味する。ビオチン化され得るアミノ残基は 、当該分野において良く知られており、好ましいアミノ酸残基はリシンである。 Ｎ−末端アミノ酸は、典型的に、ビオチン化の所望の位置が塩基不安定性保護 基で保護され、その残基上の全ての他の反応性基が酸不安定性保護基で保護され るような方法で保護される。すなわち、Ｎ−末端残基が、前記多段塩基不安定性 循環手順を用いて樹脂結合ペプチド鎖に付加されるとき、ビオチン化部位は保護 されず、他の全ての基は、以下のビオチン化工程を有する反応から保護される。 塩基不安定性保護基は、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のよ うなカルバメート、および酸不安定性保護基は、トリチル（Ｔｒｔ）およびｔ− ブトキシカルボニル（ｔＢｏｃ）を含んでよい。用いられる保護基は、本発明を 制限することを意図していないと解される。 前述のペプチド形成工程の終わりに、予め決められたアミノ酸残基配列および ビオチン化可能なＮ−末端残基を有するペプチドが樹脂に結合された状態で存在 し、その配列中の個々のアミノ酸残基の全ての反応性基が酸不安定性保護基で保 護される。ビオチン化すべきＮ−末端アミノ酸残基の反応性基は保護され ない。樹脂に結合した保護ペプチドは、そのペプチドをビオチン化溶液にさらす ことによりビオチン化される。ペプチドのビオチン化に好適なビオチン化溶液は 、当該分野において知られており、好ましい態様において、その溶液はビオチン のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはビオチンアミドカプロエートを 含む。そのようなエステルは、ミズーリ州セントルイス在シグマケミカル社の製 品のような種々の市販の原料から得ることができる。好ましい態様において、式 ：ビオチン−（ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ）_n−ＯＮＨＳ（ ここで、ｎは０〜５、好ましくは１〜２）を有するビオチンアミドカプロエート のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いる。ビオチン化反応は、当該分 野で知られているように適当な溶媒中で実施される。好ましい溶媒は、Ｎ−メチ ルピロリドン（ＮＭＰ）である。 ペプチドのビオチン化に続いて、当該分野において知られている標準的手順を 用いて樹脂からペプチドが切断される。好ましい態様において、切断は、トリク ロロ酢酸（ＴＦＡ）を含む切断溶液を用いてペプチドを処理することにより達成 される。切断溶液は、さらに１，２−エタンジオール（ＥＤＴ）、アニ ソールおよびジメチルスルフィドを含む。ペプチドは、ペプチド中のアルギニン 残基の数により切断溶液中に約１〜約５時間さらされる。次に、好ましくはペプ チドの酸化およびビオチン化ペプチドの精製後に、切断されたビオチン化ペプチ ドは回収される。切断ペプチドの酸化は、典型的には、ペプチドのアルカリ溶液 に空気を通すことにより、またはペプチドを、Ｋ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆（フェリシアン 化カリウム）のような酸化剤にさらすことにより達成される。酸化に続いて、ペ プチド溶液を標準的技術を用いて酸化し、精製する。好ましい精製手段は、高速 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。ビオチン化ＨＩＶ抗原を製造する ための本発明のビオチン化方法の模式的ダイアグラムを図１に示す。本発明のビ オチン化方法を用いる多くのペプチドのビオチン化を、以下の実施例に詳細に記 載する。 以下の実施例は本発明の態様の説明であって、請求の範囲および明細書を限定 することを意図していない。 実施例 実施例１．配列番号６の固相合成 ペプチド（配列番号６）の合成を、ｐ−ヒドロキシメチルフェノキシメチル（Ｈ ＭＰ）樹脂０．２５ｍｍｏｌおよびＦｍｏｃ アミノ酸１．００ｍｍｏｌを用い、標準的スケールのＦｍｏｃ化学を使用して自 動固相ペプチド合成機により行った。ランエディターを修正し、１０個のアミノ 酸の結合毎に二重結合を導入した。二つのシステイン残基の間に位置する付加さ れたリシン残基はＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｌ−リシンであり、Ｎ− 末端におけるリシン残基はＮ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−ε−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシンであ った。Ｎ−末端リシンのε−アミンは、ペプチドを樹脂上に付着させたまま、ビ オチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて誘導 した。このとき、末端アミンを除いて脱保護は行わなかった。 特に、樹脂上の完成ペプチド約１６０ｇ（０．０５ｍｍｏｌ）を、Ｎ−メチル ピロリドン（ＮＭＰ）溶媒系約５ｍｌ中で混合した。ビオチンアミドカプロエー トＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル約４５ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を添加 し、溶液を約６時間混合した。次に、樹脂上のペプチドを、塩化メチレン約２ｍ ｌを用いてフィルター洗浄し、減圧下に乾燥した。ペプチドを切断溶液（cleavi ng solution）約１０ｍｌで約１２０分間切断し、濾過した。切断溶液は、１， ２−エタンジチオール（ＥＤＴ）：アニソール：ジメチルスルフィドの１：３： ３ 混合物５％とトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）９５％との混合物であった。ペプチド を樹脂から濾過し、冷たいエーテルで沈殿させた。沈殿したペプチドを濾過し、 エーテルで洗った。粗ペプチドをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）−水に溶解し 、ｐＨを炭酸ナトリウムで約９．０に調節し、空気の定常流をＤＭＦ溶液を通過 させた（すなわち、ペプチドを酸化させた）。 酸化に続いて、溶液をＴＦＡで酸化し、ビオチン化ペプチドを高速液体クロマ トグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製した。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ Ａ）を含むアセトニトリル−水（２０％〜１００％グラジェント）溶媒系を用い て、Ｃ１８−逆相ＨＰＬＣカラム（２５．４ｍｍ×２５ｃｍ、３００Ａ）におい てピーク成分を分離した。流量は１２ｍｌ／分であった。検出に、２３０ｎｍと ２６０ｎｍの波長の紫外線（ＵＶ）を用いた。単離された物質（１１ｍｇ）を質 量スペクトル（ＭＳ）により分析し、正確な生成物のＭＳ２４０４に分子イオン を示した。ビオチン化ペプチドについて、エルマンズ（Ｅｌｌｍａｎｓ）試薬（ ミズーリ州セントルイス在シグマケミカル社製）を用いて遊離チオール含量を分 析した。精製ペプチド中には僅か７％の遊離チオールしか存在していなかった。 実施例２．配列番号７の固相合成 ビオチン化ペプチド（配列番号７）を、いずれのリシン残基（システイン残基 とＮ−末端リシンとの間に位置するリシン）も樹脂結合鎖にＮ−ε−ｔＢｏｃ− Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓとして付加した以外は実施例１と同様にして調製した 。ビオチンアミドカプロン酸をＮ−末端リシンのαアミノ基に結合した。 実施例３．配列番号８の固相合成 ビオチン化ペプチド（配列番号８）を、実施例１に記載のように調製した。 実施例４．配列番号９の固相合成 ビオチン化ペプチド（配列番号９）を、実施例１に記載のように調製した。 実施例５．配列番号１０の固相合成 ビオチン化ペプチド（配列番号１０）を、いずれのリシン残基もＮ−α−ｔＢ ｏｃ−Ｎ−ε−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓとして組み込んだ以外は実施例１と同様にして 調製した。Ｎ−末端Ａｒｇ残基をＮ−ε−Ｆｍｏｃ−Ｎ−α−（２，２，５，７ ，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）−Ｌ−アルギニンとして付加し た。ビオチンをＮ−末端Ａｒｇのα−アミノ基に結合 させた。配列番号１０を、ＨＰＬＣから精製して質量スペクトル分子量３４０５ とした。 実施例６．配列番号１１の固相合成 ビオチン化ペプチド（配列番号１１）を、いずれのＬｙｓ残基もＮ−ε−ｔＢ ｏｃ−Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓとして組み込んだ以外は実施例１と同様にして 調製した。ビオチン−アミドカプロン酸をＮ−末端リシンのα−アミノ基に結合 させた。 実施例７．ＨＩＶ−１抗体の化学蛍光免疫測定法 ビオチン化ペプチド（配列番号６）を実施例１と同様にして調製した。ビオチ ン化ペプチド（配列番号１）の溶液を、配列番号１（英国チェシャー在ケンブリ ッジリサーチバイオケミカルズ社により合成された製品）約１ｍｇを重炭酸ナト リウム溶液（２０ｍＭ、ｐＨ８．０）約１ｍｌに溶解することにより調製した。 ペプチド溶液を、磁器撹拌機により室温で、ビオチン−アミドカプロイル−アミ ドカプロン酸のＮ−ヒドロキシルスクシンイミドエステル（１．２３ｍｇ、１９ 量体に対して４．５モル当量）と一晩混合した。 ビオチン化ペプチドをさらに処理して１０００以下の低分子量成分を取り除く ように透析により過剰のビオチンを除去し得 るが、我々は、洗浄工程を有する免疫測定法系において遊離ビオチンよりも巨大 分子結合ビオチンにより高い結合親和性を有するモノクローナル抗ビオチン抗体 を使用すると遊離ビオチンを除去することなくビオチン化ペプチドを使用し得る ことを知見した。 アッセイは、独立型半自動装置（カリル（Ｋｈａｌｉｌ）らのＣｌｉｎ．Ｃｈ ｅｍ 、３７巻、１５４０〜１５４７頁、１９９１年）（イリノイ州６００６４、 アボットパーク、アボットラボラトリー社から得られるＡｂｂｏｔｔ ＰＲＩＳ Ｍ^TM装置）において行った。装置の高処理量を、先行文献に記載の工程当たり７ ２秒サイクルから工程当たり４０秒サイクルに変化させた。 ＨＩＶ抗体アッセイを以下のように行った。最初に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ −２に対するｒＤＮＡ抗原で被覆した微粒子のブレンド５０μｌを、培養ウエル 中で混合物を形成するように試験サンプル１００μｌと１８分間培養した。ブレ ンド中の各種微粒子を、インディジアナ州インディアナポリス在Ｓｅｒａｄｙｎ 社から得られるポリスチレンラテックス微粒上での受動吸着によりｒＤＮＡで別 々に被覆した。被覆後、ブレンドし た粒子に、５５℃〜６０℃の熱をかけた。次に、全サンプル／微粒子混合物を、 転移緩衝液（ｐＨ７．２、１０ｍＭ燐酸塩、０．９％ＮａＣｌ、０．１２％脱脂 ドライミルクおよび０．１％ＮａＮ₃）６００μｌと共に培養ウエルから検出ウ エルに移した。次に、ビオチン化ペプチド（配列番号６）またはビオチン化ペプ チド（配列番号１）（それぞれ、実施例１および７に記載のように調製）を、約 ３．３μ／ｍｌ、ｐＨ８．３、０．１Ｍホウ酸塩、６％仔ウシ血清、１％Ｅ．ｃ ｏｌｉ溶解物、２％コリン酸、０．０５％ＣＫＳ（ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキ シ−マンノ−オクトウロソネート シチジリルトランスフェラーゼまたはＣＭＰ −ＫＤＯシンセターゼ）、および０．１％ＮａＮ₃の濃度で溶解した。ビオチン 化ペプチド溶液約５０μｌを、ピペットで検出ウエルに移した後、反応混合物を 約１０．６分間培養した。次に、各サンプルのウエルを、プローブ洗浄緩衝液（ ｐＨ９．０、０．１Ｍホウ酸塩、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２５％ラウリル 硫酸リチウム、および０．１％ＮａＮ₃）約１００μｌで４回洗った。次に、指 示薬結合物（モノクローナル抗ビオチンのＮ−メチルアクリジニウム結合物（ｐ Ｈ６．３燐酸塩緩衝塩水［ＰＢＳ］、４％仔ウシ血清アルブミン ミルク、および０．１％ＮａＮ₃中において１２０ｎｇ／ｍｌ））約５０μｌを 各反応ウエルに添加した。次に、反応混合物を、約１０．６分間培養した。この 培養に続いて、各ウエルを２５ｍＭの２［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸） （ＭＥＳ）、 Ｈ５．７のコンジュゲート緩衝液で洗った。次に、サンプルを、化学的トリガリ ングおよび光子検出のための場所に移動させると共に約５分間培養した。反応ウ エル中の反応混合物を、過酸化尿素（０．１５Ｎ ＮａＯＨ中０．２％）約５０ μｌでトリガーし、光子の数を光電子増倍機で積算した。この研究の結果を表１ に示す。 表１のデータは、配列番号６の使用により、溶液ビオチン化ペプチド（配列番 号１）を用いる結果と比較して、信号／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が大きく増加するこ とを示している。 実施例８．投与反応 Ａ．ｇｐ４１ペプチド単独プローブアッセイにおけるビオチン化ＨＩＶ−１ｇｐ ４１ ＩＤＲペプチドに対するサブタイプＯＨＩＶ−１試験サンプルの反応 アッセイの工程３で、（ｉ）０、４、１０、２０、４０、１００、２００およ び５００ｎｇ／ｍｌの濃度での配列番号６（ε−Ｎ−末端ビオチン化ＨＩＶ−１ Ｂ型配列）、（ｉｉ）４、２０、１００および５００ｎｇ／ｍｌの濃度での配 列番号 ７（α−Ｎ−末端ビオチン化ＨＩＶ−１ Ｂ型配列）、および（ｉｉｉ）４、２ ０、１００および５００ｎｇ／ｍｌの濃度での配列番号１１（α−Ｎ−末端ビオ チン化ＨＩＶ−１ Ｏ型配列）の一連の希釈物を使用した以外は実施例７の手順 に従って化学蛍光免疫測定法を行った。ランで用いた対照およびサンプルは、陰 性キャリブレーター、ｇｐ４１ ＩＤＲパネル（モノクローナルＩＡＭ４１−４ Ｄ４；ブチャヒャー（Ａ．Ｂｕｃｈａｃｈｅｒ）らの、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕ ｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ 、第１０巻：３５９〜３６９頁、［１９９４年］ ）およびＨＩＶ−１サブタイプ−Ｏパネル（Ｃａｍｅｒｏｏｎ−Ｍ）である。こ の実験の結果を、図２に示す。図２に示すように、データは本発明のビオチン化 ペプチドを用いる免疫測定法の感度を示している。Ｂ．ＨＩＶ−１／２組み合わせ全アッセイにおける配列番号６に対する抗ＨＩＶ −１サンプルの投与反応 工程３のプローブとして、（ａ）ＨＩＶ−１ｇｐ４１、ＨＩＶ−１ｐ２４およ びＨＩＶ−２の３つのビオチン化Ａｒｇ（それぞれ２．８、０．６および０．２ μｇ／ｍｌ）および（ｂ）ＨＩＶ−２ＩＤＲのビオチン化１９量体（０．０５μ ｇ／ｍｌ） からなる塩基プローブから得られる一連の８つの異なるプローブを用い、次にビ オチン化ＨＩＶ−１ｇｐ４１ ＩＤＲ １９量体でスパイクして０、４、１０、 ２０、４０、１００、２００および５００ｎｇ／ｍｌの濃度にする以外は実施例 ７に記載のアッセイプロトコールに従った。ランで用いた対照およびサンプルは 、陰性キャリブレーター、陽性キャリブレーター、ｇｐ４１ ＩＤＲパネル（Ｍ Ａｂ ４Ｄ４、前記）およびＨＩＶ−１サブタイプ−Ｏパネル（Ｃａｍｅｒｏｏ ｎ−Ｍ）である。試験サンプルの配列番号６に対する投与反応曲線を、ペプチド の添加量に対するカウント数を半対数でプロットした図３に示す。図３のデータ は、本発明のビオチン化ペプチドを用いる免疫測定法の感度を示している。 実施例９．配列番号１２の固相合成 充分に保護した配列番号５のペプチドを、実質的に実施例１に記載した段階的 固相合成によりヒドロキシメチルフェニル（ＨＭＰ）樹脂上に集めた。以下の保 護アミノ酸を合成において用いた。 Ｆｍｏｃ−（ｔＢｕ）−Ａｓｐ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−（ｔＢｏｃ）−Ｌｙｓ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ−ＯＨ Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ 全てのアミノ酸を、反応部位に対して４倍モル過剰で二重結合させた。 Ｎ−末端リシンのアルファアミノ位のビオチン化のために、最初に末端Ｆｍｏ ｃ保護基をＮＭＰ中の２０％ピペリジンと除去した。次に、ビオチンを、樹脂上 に維持されている完全保護ペプチドに１モル当量のビオチンアミドカプロイル− Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを添加することによりアルファアミノ末 端に結合させた。ペプチド−樹脂複合体をＮＭＰで洗い、結合を繰り返した。試 薬をＮＭＰ１０ｍｌ中、自動ペプチド合成機において２４時間攪拌しつつ結合を 行った。 次に、ペプチドを実施例１のように樹脂から切断し、残りの保護基は、９２． ５％トリフルオロ酢酸、５％エタンジチオー ル、２．５％水と共に保護ペプチドを室温で６時間攪拌することにより除去した 。次に、ペプチドを樹脂から濾過し、冷エーテルで沈殿させた。沈殿したペプチ ドを濾過し、エーテルで洗った。 粗ペプチドの純度を、Ｃ１８，４．６ｍｍ×２５ｃｍカラム上での逆相高速液 体クロマトグラフィーにより、０．１％ＴＦＡ水溶液を「溶媒Ａ」として０．１ ％ＴＦＡ／アセトニトリル溶液を「溶媒Ｂ」として用いて流量１ｍｌ／分として 分析した。このペプチド分析に用いた溶媒グラジェントは２０％溶媒Ｂで開始し た。ペプチドを溶離するために１％／分〜７０％溶媒Ｂの直線グラジェントを用 い、その後カラムの洗浄のために１００％溶媒Ｂを１０分間用いた。溶離液中の ペプチドの存在を、２３０ｎｍおよび２６０ｎｍにおいて同時にモニターした。 前記溶媒系を用い、Ｃ１８，４１．４ｍｍ×２５ｃｍカラム上を使用して、同 様の方法により分取逆相高速液体クロマトグラフィーを実施した。溶離し凍結乾 燥させることによりペプチドフラクションを収集し、次に質量スペクトルのデー タを集めた。 この１２位のリシンと１８位のチロシンとの間の分子内ジス ルフィド結合は、２０％ジメチルスルホキシド、８０％１００ 精製ペプチドを攪拌することにより形成した。分析用逆相高速液体クロマトグラ フィーを用いて、反応の程度をモニターした。酸化が完了（約２４時間）したと き、ペプチドを前述の分取逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。最 終生成物の質量スペクトルデータにより、分子量２５０４．９の正確な生成物で あることを確認した。 実施例１０．配列番号１３の固相合成 配列番号１３の合成を、実施例９に記載のものと実質的に同じ方法で進めた。 しかしながら、配列のＮ−末端位置におけるＮ−α−（ＦＭＯＣ）−Ｎ−ε−（ ｔＢｏｃ）−ＬｙｓをＮ−α−（ＦＭＯＣ）−Ｎ−ε−（ビオチン−アミドカプ ロイル）−Ｌｙｓで置換した。ビオチン化リシン誘導体を反応部位の１モル当量 で二重結合した。さらに、このペプチドのアルファアミノ末端はビオチン化しな かった。 残りの工程である、切断、逆相高速液体クロマトグラフィーによる粗生成物の 精製、酸化、およびＨＰＬＣにより再精製は同じとした。 実施例１１．配列番号１４の固相合成 配列番号１４の合成を、実施例９に記載のものと実質的に同じ方法で進めた。 しかしながら、配列のＮ−末端位置におけるＮ−α−（ＦＭＯＣ）−Ｎ−ε−（ ｔＢｏｃ）−ＬｙｓをＮ−α−（ＦＭＯＣ）−Ｎ−ε−（ＦＭＯＣ）−Ｌｙｓで 置換した。さらに、Ｎ−末端リシンのαおよびε位におけるビオチン化は、前述 のように２モル当量のビオチンアミドカプロイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ドをペプチドに添加して同時に行った。さらに２モル当量のビオチン試薬を用い てこの結合を繰り返した。 残りの工程である、切断、逆相高性能液体クロマトグラフィーによる粗生成物 の精製、酸化、およびＨＰＬＣにより再精製は同じとした。実施例１２．部位特異性を利用するＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２抗体のためのＭ ＥＩＡおよび疑似溶液ビオチン化ペプチド結合物 実施例９〜１１で合成した部位特異性ビオチン化ペプチドを、溶液相ビオチン 化により得られたものの代表的なペプチドと比較した。１２、１４または１２と １４位のペプチドを標識する ためにビオチン化リシン残基を用いて標準的ＦＭＯＣ化学により配列番号１５、 配列番号１６および配列番号１７を合成した。 ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のための微粒子酵素免疫測定法を用いて、部位特 異的ビオチン化ペプチドを、溶液ビオチン化ペプチドの代表例と比較した。アボ ットラボラトリー社（イリノイ州アボットパーク在）から市販されている自動シ ステムで およびＨＩＶ−２組み換えタンパク（捕捉試薬）で被覆した微粒子と組み合わせ た。すなわち、試験サンプル中に存在する抗ＨＩＶ−１および抗ＨＩＶ−２抗体 が固相に結合する。次に、捕捉試薬／抗体複合体を接触させ、溶液ビオチン化ペ プチド結合物、または部位特異的ビオチン化ペプチド結合物で培養して捕捉試薬 ／抗体／ペプチド結合物複合体を形成する。複合体を検出するために、アルカリ ホスフェートに結合したウサギ抗ビオチン抗体を、捕捉試薬／抗体／ペプチド結 合物複合体と一緒に培養した。洗浄後、４−メチルウンベリフェリー−ホスフェ ートを添加した。蛍光性脱リン化基質の出現率は、ＨＩＶ抗体の検出と関係する 。捕捉試薬、アルカリホスフェート結合物、 および４−メチルウンベリフェリー−ホスフェート基質はアボットラボラトリー 社から市販されている。種々のアッセイのデータを表２に示す。表２に示すよう に、部位特異的ビオチン化ペプチド結合物（配列番号１２、配列番号１３、およ び配列番号１４）は、１８位にアミノ酸残基の違いを有する類似のペプチド（配 列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７）の溶液ビオチン化により得ら れるもの代表的ペプチド結合物と比ベて優れた結果を提供する。 前記データが示すように、開示され前述のように調製されたビオチン化ＨＩＶ ペプチドは、溶液ビオチン化手順を用いて調製されたビオチン化ペプチドを用い る場合と比較して、抗ＨＩＶ抗体の検出に優れた結果を与える。 本発明を、特定の態様を参照に詳細に説明したが、本発明の 精神および範囲から離れることなくそのような態様に種々の変更および修正を加 え得ることが当業者には明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チヤン，チー−デウ アメリカ合衆国、イリノイ・60048、グリ ーン・オークス、ケントン・レイン・2144 (72)発明者 マーチヤント，バーバラ・テイ アメリカ合衆国、イリノイ・60091、ウイ ルメツト、ヒル・レイン・3101 (72)発明者 スゼ，アイザツク・エス・ワイ アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガー ニー、クロスランド・ブールバード・6328 (72)発明者 ジヤフエ，キーブ アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53179、 トレボー、トウーハンドレツドセブンテイ フアースト・アベニユー・9761 (72)発明者 ブライドン，ドミニク・ピー アメリカ合衆国、イリノイ・60053、モー トン・グローブ、カプライナ・アベニユ ー・5717

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ｉ）試験サンプルを捕捉試薬に接触させて捕捉試薬／抗ＨＩＶ−１また は抗ＨＩＶ−２抗体複合体を形成する工程、 （ｉｉ）前記捕捉試薬／抗ＨＩＶ−１または抗ＨＩＶ−２抗体複合体をハプテ ン−ペプチド結合物に接触させて捕捉試薬／抗ＨＩＶ−１または抗ＨＩＶ−２抗 体／ハプテン−ペプチド結合物複合体を形成する工程、 （ｉｉｉ）前記捕捉試薬／抗ＨＩＶ−１または抗ＨＩＶ−２抗体／ハプテン− ペプチド結合物複合体を指示薬に接触させて前記捕捉試薬／抗ＨＩＶ−１または 抗ＨＩＶ−２抗体／ハプテン−ペプチド結合物／指示薬複合体を形成する工程、 および （ｉｖ）試験サンプル中における抗ＨＩＶ−１または抗ＨＩＶ−２抗体の存在 の指標として、前記指示薬より発生される信号を検出する工程 を含む試験サンプル中の抗ＨＩＶ−１または抗ＨＩＶ−２抗体の存在を検出する ように設計された免疫測定法であって、 前記捕捉試薬／抗ＨＩＶ−１または抗ＨＩＶ−２抗体複合体を配列番号１、配 列番号２、配列番号３、配列番号４および配 列番号５で示される配列からなる群より選択されるＮ−末端ハプテン化ペプチド を含む少なくとも一つのハプテン−ペプチド結合物に接触させることを特徴とす る免疫測定法。 ２．前記ハプテンがビオチンからなる請求項１に記載の改良された免疫測定法 。 ３．前記Ｎ−末端ハプテン化ペプチド配列がハプテンをαまたはε位に有する 請求項１に記載の改良された免疫測定法。 ４．前記Ｎ−末端ハプテン化ペプチド配列がハプテンをαおよびε位に有する 請求項１に記載の改良された免疫測定法。 ５．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５で示 されるペプチドからなる群より選択される実質的に純粋なＮ−末端ハプテン化ペ プチド配列を含んでなる、抗ＨＩＶ−１または抗ＨＩＶ−２抗体の検出に有用な 組成物。 ６．前記ハプテンがビオチンからなる請求項５に記載の組成物。 ７．前記Ｎ−末端ハプテン化ペプチド配列がハプテンをαおよびε位に有する 請求項５に記載の組成物。 ８．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５で示 されるペプチドからなる群より選択される実 質的に純粋なＮ−末端ハプテン化ペプチド配列を含む容器を含んでなる、試験サ ンプル中の抗ＨＩＶ−１または抗ＨＩＶ−２抗体の存在を決定するのに有用な試 験キット。 ９．前記ハプテンがビオチンからなる請求項８に記載のキット。 １０．前記Ｎ−末端ハプテン化ペプチド配列がハプテンをαおよびε位に有す る請求項８に記載のキット。