JP2003192697A - Ｈｃｖ−特異的ペプチドおよびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ＨＣＶ−特異的抗体およびＨＣＶ抗原の免疫
化学的測定のためのポリペプチド、およびこの方法に適
した剤およびその使用法を提供する。さらに、それぞれ
個別テストにおいて異なる病原体に対する複数の異なる
抗体特異性を同時検出および／または同時測定するため
の免疫化学的方法を提供する。 【解決手段】ＨＣＶに対する抗体と特異的に反応し、そ
してそのアミノ酸配列が少なくともアミノ末端ＨＣＶコ
ア領域の一部を含むペプチド。
化学的測定のためのポリペプチド、およびこの方法に適
した剤およびその使用法を提供する。さらに、それぞれ
個別テストにおいて異なる病原体に対する複数の異なる
抗体特異性を同時検出および／または同時測定するため
の免疫化学的方法を提供する。 【解決手段】ＨＣＶに対する抗体と特異的に反応し、そ
してそのアミノ酸配列が少なくともアミノ末端ＨＣＶコ
ア領域の一部を含むペプチド。
Description
【０００１】本発明はＨＣＶ特異的抗体およびＨＣＶ抗
原の免疫化学的測定のためのポリペプチドおよびこの方
法に適した剤およびその使用に関する。
原の免疫化学的測定のためのポリペプチドおよびこの方
法に適した剤およびその使用に関する。
【０００２】さらに、本発明はそれぞれについて単一の
テストにより、それぞれ異なる病原体に対する複数の異
なる抗体特異性を同時に検出するおよび／または同時に
測定するための免疫化学的方法に関する。
テストにより、それぞれ異なる病原体に対する複数の異
なる抗体特異性を同時に検出するおよび／または同時に
測定するための免疫化学的方法に関する。
【０００３】非Ａ／非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、伝搬性
疾病または臨床像群として、ウイルス関連であり、また
様々な肝炎ウイルス例えば肝炎Ａウイルス（ＨＡＶ）、
肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）、肝炎Ｄウイルス（ＨＤＶ）
および肝炎Ｅ（ＨＥＶ）などによる他のウイルス誘導臨
床像からは区別できるものとされている。最後に、サイ
トメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエプスタインバーウ
イルス（ＥＢＶ）による肝炎を診断することもできる。
疾病または臨床像群として、ウイルス関連であり、また
様々な肝炎ウイルス例えば肝炎Ａウイルス（ＨＡＶ）、
肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）、肝炎Ｄウイルス（ＨＤＶ）
および肝炎Ｅ（ＨＥＶ）などによる他のウイルス誘導臨
床像からは区別できるものとされている。最後に、サイ
トメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエプスタインバーウ
イルス（ＥＢＶ）による肝炎を診断することもできる。
【０００４】疫学的研究に基づいて、伝搬経路に従い少
くとも２タイプの非Ａ／非Ｂ肝炎を定義することができ
る：水および食物により伝搬される流行性肝炎ウイルス
（経腸的に伝搬されるＮＡＮＢＶ）、および血液、針刺
しまたは同様の経路により伝搬される輸出後肝炎ウイル
ス（血液により伝搬されるＮＡＮＢＶ）。これらの感染
経路のほかに、特発的に発生するＮＡＮＢＶ（“市中感
染ＮＡＮＢＶ(community acquired ＮＡＮＢＶ)”）と
して、前述の２タイプとは明白な関連がない伝搬の存在
も知られている。ＮＡＮＢＨの原因となる作用体または
ウイルスの正確な数は分っていないが最近、いわゆる肝
炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）がこの病気の一原因病原体とし
て確認された（WO 89/04 669）。
くとも２タイプの非Ａ／非Ｂ肝炎を定義することができ
る：水および食物により伝搬される流行性肝炎ウイルス
（経腸的に伝搬されるＮＡＮＢＶ）、および血液、針刺
しまたは同様の経路により伝搬される輸出後肝炎ウイル
ス（血液により伝搬されるＮＡＮＢＶ）。これらの感染
経路のほかに、特発的に発生するＮＡＮＢＶ（“市中感
染ＮＡＮＢＶ(community acquired ＮＡＮＢＶ)”）と
して、前述の２タイプとは明白な関連がない伝搬の存在
も知られている。ＮＡＮＢＨの原因となる作用体または
ウイルスの正確な数は分っていないが最近、いわゆる肝
炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）がこの病気の一原因病原体とし
て確認された（WO 89/04 669）。
【０００５】最近に至るまで、臨床診断は主として、抗
原の血清学的測定および／またはそれらに対する抗体に
基づいていており、それらテストはＨＡＶ、ＨＢＶ、Ｈ
ＤＶ、ＨＥＶ、ＣＭＶまたはＥＢＶという肝炎病原体群
からのパラメータに対して特異的である。このいわゆる
排除法においてはＮＡＮＢＨはすべての前記測定が陰性
のときだけ診断された。
原の血清学的測定および／またはそれらに対する抗体に
基づいていており、それらテストはＨＡＶ、ＨＢＶ、Ｈ
ＤＶ、ＨＥＶ、ＣＭＶまたはＥＢＶという肝炎病原体群
からのパラメータに対して特異的である。このいわゆる
排除法においてはＮＡＮＢＨはすべての前記測定が陰性
のときだけ診断された。
【０００６】このほか、いわゆる代用マーカー例えばＧ
ＰＴ（グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、Ａ
ＬＴすなわちアラニンアミノ基転移酵素とも呼ばれる）
または抗ＨＢｃ（肝炎Ｂコア特異的抗体）も用いられて
いる。しかしながら、これらの助剤は信頼性ありとする
ほど感度、特異性いずれも十分でない。従って、輸血患
者の約１０％に発生する輸血後肝炎症例のほんのわずか
な一部を供血者検査によって回避することはできる。特
異的テスト導入が緊要のことであることはＮＡＮＢＶが
輸血後肝炎症例の約９０％にあたるとされていることか
ら強調される。この疾病にともなう主たる問題は、２５
〜５５％の感染者が慢性肝傷害にかかるということであ
る。
ＰＴ（グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、Ａ
ＬＴすなわちアラニンアミノ基転移酵素とも呼ばれる）
または抗ＨＢｃ（肝炎Ｂコア特異的抗体）も用いられて
いる。しかしながら、これらの助剤は信頼性ありとする
ほど感度、特異性いずれも十分でない。従って、輸血患
者の約１０％に発生する輸血後肝炎症例のほんのわずか
な一部を供血者検査によって回避することはできる。特
異的テスト導入が緊要のことであることはＮＡＮＢＶが
輸血後肝炎症例の約９０％にあたるとされていることか
ら強調される。この疾病にともなう主たる問題は、２５
〜５５％の感染者が慢性肝傷害にかかるということであ
る。
【０００７】ＨＣＶの発見により、ＨＣＶまたはＨＣＶ
特異的抗体の特異的検出の基礎が提供された。ＨＣＶお
よび、ＨＣＶゲノム部分の相当するｃＤＮＡ複製物の単
離および確認はWO 89/04 669の主題となっており、そこ
ではＨＣＶはフラビ（flavi）様ウイルスのファミリー
に属するとされている。さらにそこには、ＨＣＶ抗原を
ＨＣＶ−特異的抗体検出に用いること、および患者血中
抗原の診断測定のために抗体を産生させる（raise）す
ることも記載されている。
特異的抗体の特異的検出の基礎が提供された。ＨＣＶお
よび、ＨＣＶゲノム部分の相当するｃＤＮＡ複製物の単
離および確認はWO 89/04 669の主題となっており、そこ
ではＨＣＶはフラビ（flavi）様ウイルスのファミリー
に属するとされている。さらにそこには、ＨＣＶ抗原を
ＨＣＶ−特異的抗体検出に用いること、および患者血中
抗原の診断測定のために抗体を産生させる（raise）す
ることも記載されている。
【０００８】しかしながら、遺伝子工学タンパク質、特
に転写解読枠（open reading frame，ＯＲＦ）からのい
わゆる非構造タンパク質（ＮＳＰ）が用いられるが、そ
れらは免疫化学的検出方法における反応剤として使用さ
れる。
に転写解読枠（open reading frame，ＯＲＦ）からのい
わゆる非構造タンパク質（ＮＳＰ）が用いられるが、そ
れらは免疫化学的検出方法における反応剤として使用さ
れる。
【０００９】免疫化学的検出とは、本発明における意味
あいにおいては、均一（溶液中）または不均一（固相使
用）イン・ビトロ法として、体液、例えば血清、血漿、
唾液、脳脊髄液または尿中の免疫グロブリンクラスＡ、
Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ
またはＩｇＭ）の抗原および／または抗体の測定を可能
にするあらゆる方法を包含する。イムノアッセイとも呼
ばれるこれらの方法の例は、酵素イムノアッセイ（ＥＬ
ＩＳＡまたはＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）、イムノフルオレセンスアッセイ（ＩＦＡ）、ラジ
オイムノプレシピテーション（ＲＩＰＡ）、寒天ゲル拡
散などである。
あいにおいては、均一（溶液中）または不均一（固相使
用）イン・ビトロ法として、体液、例えば血清、血漿、
唾液、脳脊髄液または尿中の免疫グロブリンクラスＡ、
Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ
またはＩｇＭ）の抗原および／または抗体の測定を可能
にするあらゆる方法を包含する。イムノアッセイとも呼
ばれるこれらの方法の例は、酵素イムノアッセイ（ＥＬ
ＩＳＡまたはＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）、イムノフルオレセンスアッセイ（ＩＦＡ）、ラジ
オイムノプレシピテーション（ＲＩＰＡ）、寒天ゲル拡
散などである。
【００１０】例えば、WO 89/04 669は、ＨＩＶ特異的抗
体(抗−ＨＣＶ)の検出のために、ＥＬＩＳＡ法にそこに
記載されている抗原Ｃ−１００−３を用いている。ＮＳ
Ｐ３／４領域からの構築物（コンストラクト）Ｃ−１０
０−３（これは酵母細胞中で遺伝子工学により発現され
る）は３６３アミノ酸より成り、その配列は図１に示さ
れているが、図中のナンバリングシステムは前記特許の
それに対応している。
体(抗−ＨＣＶ)の検出のために、ＥＬＩＳＡ法にそこに
記載されている抗原Ｃ−１００−３を用いている。ＮＳ
Ｐ３／４領域からの構築物（コンストラクト）Ｃ−１０
０−３（これは酵母細胞中で遺伝子工学により発現され
る）は３６３アミノ酸より成り、その配列は図１に示さ
れているが、図中のナンバリングシステムは前記特許の
それに対応している。
【００１１】しかしながら、ヒト起源の検体中の抗−Ｈ
ＣＶを測定するためのＥＬＩＳＡ法で達成し得る最高感
度は、慢性ＮＡＮＢ患者の場合で約８０％そして急性Ｎ
ＡＮＢ患者の場合で約３０％と推定される。患者（ヒ
ト）からの血液についてのこれらの知見はＮＡＮＢＶ感
染チンパンジーについての対応する研究によって支持さ
れている。
ＣＶを測定するためのＥＬＩＳＡ法で達成し得る最高感
度は、慢性ＮＡＮＢ患者の場合で約８０％そして急性Ｎ
ＡＮＢ患者の場合で約３０％と推定される。患者（ヒ
ト）からの血液についてのこれらの知見はＮＡＮＢＶ感
染チンパンジーについての対応する研究によって支持さ
れている。
【００１２】それらの研究において、Ｃ−１００−３構
築物に基づく抗−ＨＣＶの陽性検出は、ＡＬＴ増加が生
じてから約６〜１８週間までは成功せず、そしてその後
にＮＡＮＢＶ接種してから３〜１０週間後に病気の徴候
として認めることができる。すなわち、チンパンジーが
感染してから９〜２６週間が、Ｃ−１００−３構築物を
用いた従来のイムノアッセイによりＨＣＶ特異的抗体を
検出できるまでの総時間であることがわかる。
築物に基づく抗−ＨＣＶの陽性検出は、ＡＬＴ増加が生
じてから約６〜１８週間までは成功せず、そしてその後
にＮＡＮＢＶ接種してから３〜１０週間後に病気の徴候
として認めることができる。すなわち、チンパンジーが
感染してから９〜２６週間が、Ｃ−１００−３構築物を
用いた従来のイムノアッセイによりＨＣＶ特異的抗体を
検出できるまでの総時間であることがわかる。
【００１３】WO 90/11 089に更に、抗−ＨＣＶ検出に使
用できるＨＣＶアミノ酸配列を記載している。しかしな
がら、特定のタンパクセクションの診断上の関連につい
ては全く記述がなく、また免疫優性(immunodominant)エ
ピトープの例も存在しない。
用できるＨＣＶアミノ酸配列を記載している。しかしな
がら、特定のタンパクセクションの診断上の関連につい
ては全く記述がなく、また免疫優性(immunodominant)エ
ピトープの例も存在しない。
【００１４】文献に開示された方法で抗−ＨＣＶを検出
する上での基本的問題は誤って陽性および誤って陰性に
反応する検体がなおも存在することである。誤って陽性
となる検体は健常供血者群の４０％にも到ることがある
(WEINER A., et al. Lancet1990, Vol. 336, p. 69
5）。従って、特異的かつ鋭敏なＨＣＶテストがないと
いうことは、誤って反応するわずかとはいえない割合の
検体が献血センターにおいて間違って捨てられているこ
と、そして同時に実際には抗−ＨＣＶ−陽性である患者
がなおも信頼性をもって確認されないということを意味
している。
する上での基本的問題は誤って陽性および誤って陰性に
反応する検体がなおも存在することである。誤って陽性
となる検体は健常供血者群の４０％にも到ることがある
(WEINER A., et al. Lancet1990, Vol. 336, p. 69
5）。従って、特異的かつ鋭敏なＨＣＶテストがないと
いうことは、誤って反応するわずかとはいえない割合の
検体が献血センターにおいて間違って捨てられているこ
と、そして同時に実際には抗−ＨＣＶ−陽性である患者
がなおも信頼性をもって確認されないということを意味
している。
【００１５】これらの欠点を除くために、他のグループ
はＣ−１００−３のＯＲＦ領域(WO89/04 669より。図
１）の特定配列を選びそしてそれらをイムノアッセイに
用いている（ペプチドＳＰ ４２、１１７、６７および
６５。図２）。ＮＡＮＢ感染チンパンジーの研究の際に
は、診断上の価値を向上させることはできなかった。逆
にそこでなされた所見からは、記載ペプチドはいずれも
信頼性あるＩｇＧまたはＩｇＭ測定の基礎として役立て
るには不適切であるという結論となる。何故ならば感度
が不十分であり、また抗体検出までに少くとも７〜１７
週間という診断ギャップは従来の検出方法と比較しても
時間短縮が無いことを意味しているからである。さらに
また、特にＳＰ ４２は２０〜４０週間にわたる診断ギ
ャップがあり診断テストに適していないことが分った
（SAFFORD J., et al. Int. Symp.on Viral Hepatitis
and Liver Disease 1990 Houston, USA)。
はＣ−１００−３のＯＲＦ領域(WO89/04 669より。図
１）の特定配列を選びそしてそれらをイムノアッセイに
用いている（ペプチドＳＰ ４２、１１７、６７および
６５。図２）。ＮＡＮＢ感染チンパンジーの研究の際に
は、診断上の価値を向上させることはできなかった。逆
にそこでなされた所見からは、記載ペプチドはいずれも
信頼性あるＩｇＧまたはＩｇＭ測定の基礎として役立て
るには不適切であるという結論となる。何故ならば感度
が不十分であり、また抗体検出までに少くとも７〜１７
週間という診断ギャップは従来の検出方法と比較しても
時間短縮が無いことを意味しているからである。さらに
また、特にＳＰ ４２は２０〜４０週間にわたる診断ギ
ャップがあり診断テストに適していないことが分った
（SAFFORD J., et al. Int. Symp.on Viral Hepatitis
and Liver Disease 1990 Houston, USA)。
【００１６】しかしながら、ＳＰ ６７と称されるポリ
ペプチドは、このペプチドについてはわずか抗ＨＣＶ−
陽性検体の８６％の確認しか可能でなかったが免疫優性
であるとされている。（DAWSON, G.J., et al. Int. Co
ngress of Virology 1990, Berlin, FRG)。
ペプチドは、このペプチドについてはわずか抗ＨＣＶ−
陽性検体の８６％の確認しか可能でなかったが免疫優性
であるとされている。（DAWSON, G.J., et al. Int. Co
ngress of Virology 1990, Berlin, FRG)。
【００１７】合成的に製造されたコアペプチドを用いて
改良できたとされている（OKAMOTOH., et al. Japan.
J. Exp. Med. 1990, Vol 60, No. 4, p. 223〜233）。
これはＨＯＰＰおよびＷＯＯＤ（Proc. Nat. Acad. Sc
i. 1981, Vol. 78, p. 3824〜3828）により特定された
物理化学的予想基準を用いてコアアミノ酸配列１〜１２
０の全部で３つの潜在的抗体結合部位からある配列を選
択することより成る(OKAMOTO, H. et al., Japan. J. E
xp. Med. 1990, Vol. 60, No. 3, p. 167〜177）。この
ペプチドは図３に示されているがNo.３９からNo.７４ま
での番号の３６アミノ酸より成っている。
改良できたとされている（OKAMOTOH., et al. Japan.
J. Exp. Med. 1990, Vol 60, No. 4, p. 223〜233）。
これはＨＯＰＰおよびＷＯＯＤ（Proc. Nat. Acad. Sc
i. 1981, Vol. 78, p. 3824〜3828）により特定された
物理化学的予想基準を用いてコアアミノ酸配列１〜１２
０の全部で３つの潜在的抗体結合部位からある配列を選
択することより成る(OKAMOTO, H. et al., Japan. J. E
xp. Med. 1990, Vol. 60, No. 3, p. 167〜177）。この
ペプチドは図３に示されているがNo.３９からNo.７４ま
での番号の３６アミノ酸より成っている。
【００１８】抗−Ｃ−１００テストとは対照的に、この
コアペプチドに基づくＥＬＩＳＡを用いて一部の抗−Ｈ
ＣＶ−陽性血清中のＨＣＶ抗体を検出することができ
た。この知見は、ＨＣＶ ＲＮＡ検出にポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）を用いた比較研究によって確認され
た。
コアペプチドに基づくＥＬＩＳＡを用いて一部の抗−Ｈ
ＣＶ−陽性血清中のＨＣＶ抗体を検出することができ
た。この知見は、ＨＣＶ ＲＮＡ検出にポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）を用いた比較研究によって確認され
た。
【００１９】６０６名の供血者に対する検査で認められ
た２６の抗−コアＨＣＶ−陽性検体（４.３％）から、
まさにわずか１０例（１.６５％）しかＰＣＲによって
は確認し得ないことが明白となっている。逆に１６名の
供血者（２.１５％）はこのペプチドに対し誤って陽性
に反応した。すなわち、前記コアペプチドは場合によっ
ては抗−Ｃ−１００テストよりも抗−ＨＣＶ検出法に適
しているとされているが、従来のコアペプチドは一般に
相当な干渉されやすさを伴う。
た２６の抗−コアＨＣＶ−陽性検体（４.３％）から、
まさにわずか１０例（１.６５％）しかＰＣＲによって
は確認し得ないことが明白となっている。逆に１６名の
供血者（２.１５％）はこのペプチドに対し誤って陽性
に反応した。すなわち、前記コアペプチドは場合によっ
ては抗−Ｃ−１００テストよりも抗−ＨＣＶ検出法に適
しているとされているが、従来のコアペプチドは一般に
相当な干渉されやすさを伴う。
【００２０】従って、本発明はＨＩＶ感染症をなるべく
早くかつ高い特異性をもって検出できるテストを開発す
るという目的に基づいたものである。
早くかつ高い特異性をもって検出できるテストを開発す
るという目的に基づいたものである。
【００２１】今般、驚くべきことに、Ｃ−１００−３の
ＯＲＦ領域および／またはＨＣＶコア領域のアミノ末端
領域の区域からのある種のポリペプチドがＨＣＶ−特異
的抗体の検出に特に適していること、そして従来のペプ
チドに比べて感度が顕著に増大すると共に望ましくない
誤った陽性反応による干渉の受けやすさが著しく低下す
ることを見出した。
ＯＲＦ領域および／またはＨＣＶコア領域のアミノ末端
領域の区域からのある種のポリペプチドがＨＣＶ−特異
的抗体の検出に特に適していること、そして従来のペプ
チドに比べて感度が顕著に増大すると共に望ましくない
誤った陽性反応による干渉の受けやすさが著しく低下す
ることを見出した。
【００２２】さらにまた、本発明によるペプチドを用い
た免疫化学的検出方法においては、高い抗原濃度、従っ
て高いエピトープ密度、が達成されることを見出した。
これは特に、干渉する異物が存在しないために、高度に
濃縮された患者検体の検査が可能な場合に可能である。
た免疫化学的検出方法においては、高い抗原濃度、従っ
て高いエピトープ密度、が達成されることを見出した。
これは特に、干渉する異物が存在しないために、高度に
濃縮された患者検体の検査が可能な場合に可能である。
【００２３】さらに、本発明によるペプチドが初期およ
び後期ＨＣＶ抗体の免疫優性エピトープを有し、従って
縦断的検査（longitudinal investigation）の特に有利
に用いることができるということも全く驚くべきことで
あった。
び後期ＨＣＶ抗体の免疫優性エピトープを有し、従って
縦断的検査（longitudinal investigation）の特に有利
に用いることができるということも全く驚くべきことで
あった。
【００２４】従って、本発明はＨＣＶ感染に対する抗体
と特異的に反応するペプチドまたはペプチド混合物、Ｃ
−１００−３のＯＲＦ領域および／またはアミノ−末端
ＨＣＶコア領域の一部を含むそれらのアミノ酸配列に関
する。
と特異的に反応するペプチドまたはペプチド混合物、Ｃ
−１００−３のＯＲＦ領域および／またはアミノ−末端
ＨＣＶコア領域の一部を含むそれらのアミノ酸配列に関
する。
【００２５】ペプチドおよびポリペプチドという用語
は、本発明の範囲において、約８０ＡＡ以上のペプチド
に等しいものとして用いられる。
は、本発明の範囲において、約８０ＡＡ以上のペプチド
に等しいものとして用いられる。
【００２６】本発明によるペプチドは好ましくは、Ｃ−
１００−３として記されるＨＣＶゲノムセクションのＡ
Ａ １２１〜ＡＡ １７５（式Ｉ）およびＡＡ ３３７〜
ＡＡ３６３（式II）のアミノ酸配列より成り、以下の配
列を有している：
１００−３として記されるＨＣＶゲノムセクションのＡ
Ａ １２１〜ＡＡ １７５（式Ｉ）およびＡＡ ３３７〜
ＡＡ３６３（式II）のアミノ酸配列より成り、以下の配
列を有している：
【００２７】
【化３】
【００２８】好ましいペプチドは次のとおりである：
【化４】
【００２９】
【化５】
【００３０】特に式Ｉのカルボキシル−およびアミノ−
末端領域からの配列は、ＨＣＶ感染の後期抗体検出に有
益であることがわかった（例えばペプチド４０８１、４
０５６、４０５５および次の４０６０）：
末端領域からの配列は、ＨＣＶ感染の後期抗体検出に有
益であることがわかった（例えばペプチド４０８１、４
０５６、４０５５および次の４０６０）：
【００３１】
【化６】
驚くべきことに、式IIのアミノ酸またはその一部を含
む、Ｃ−１００−３のＯＲＦ領域のカルボキシル−末端
領域（例えば４０９１）は、後期抗体の検出に特に適し
ていることが分った。
む、Ｃ−１００−３のＯＲＦ領域のカルボキシル−末端
領域（例えば４０９１）は、後期抗体の検出に特に適し
ていることが分った。
【００３２】さらにまた、式Ｉの中央領域は抗−ＨＣＶ
の初期確認に関係している。この関連で好ましいのは前
記ポリペプチド４０７１および４０７２、およびペプチ
ド４０５４、４０５３および４０５２である。
の初期確認に関係している。この関連で好ましいのは前
記ポリペプチド４０７１および４０７２、およびペプチ
ド４０５４、４０５３および４０５２である。
【００３３】さらにまた、三つのエピトープが式Ｉのペ
プチドにおいてつきとめられたが、そのうちの一つ
（Ｓ）は後期抗体を認識し、そして他方（Ｆ１およびＦ
２）は初期抗体を認識する。好ましいペプチドの例は以
下のアミノ酸配列のうちの一つを有している： ＡＡa1−ＤＲＥＶＬＹＲ−ＢＡb1 （Ｓ） ＡＡa2−ＱＨＬＰＹＩＥ−ＢＡb2 （Ｆ１） ＡＡa3−ＫＱＫＡＬＧＬ−ＢＡb3 （Ｆ２） 式中ＡＡおよびＢＡは任意の所望のアミノ酸であり、ま
たａ１〜ａ３およびｂ１〜ｂ３は、各々相互にの独立的
に、０より大きい、または０に等しい整数である。
プチドにおいてつきとめられたが、そのうちの一つ
（Ｓ）は後期抗体を認識し、そして他方（Ｆ１およびＦ
２）は初期抗体を認識する。好ましいペプチドの例は以
下のアミノ酸配列のうちの一つを有している： ＡＡa1−ＤＲＥＶＬＹＲ−ＢＡb1 （Ｓ） ＡＡa2−ＱＨＬＰＹＩＥ−ＢＡb2 （Ｆ１） ＡＡa3−ＫＱＫＡＬＧＬ−ＢＡb3 （Ｆ２） 式中ＡＡおよびＢＡは任意の所望のアミノ酸であり、ま
たａ１〜ａ３およびｂ１〜ｂ３は、各々相互にの独立的
に、０より大きい、または０に等しい整数である。
【００３４】アミノ−末端配列を式Ｉのカルボキシル−
末端アミノ酸配列および式IIの配列と共に選ぶのが有利
である。約１３０〜１６０の式Ｉの中央アミノ酸配列は
それらとは別個に用いることができる。
末端アミノ酸配列および式IIの配列と共に選ぶのが有利
である。約１３０〜１６０の式Ｉの中央アミノ酸配列は
それらとは別個に用いることができる。
【００３５】さらに、本発明によるペプチドは、アミノ
−末端ＨＣＶコア領域の一部、好ましくはコアとして記
されるＨＣＶゲノムセクションのＡＡ １〜ＡＡ ３５の
アミノ酸配列より成り、次の配列を有する： MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVY III
−末端ＨＣＶコア領域の一部、好ましくはコアとして記
されるＨＣＶゲノムセクションのＡＡ １〜ＡＡ ３５の
アミノ酸配列より成り、次の配列を有する： MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVY III
【００３６】
【化７】
【００３７】ペプチドＳＰ １０およびＳＰ ２３が特に
好ましい。
好ましい。
【００３８】コア領域の本発明ペプチドを用いれば、感
染の急性期からの初期抗体と後期抗体との両者を確認す
ることができるが、これによってこれらペプチドに基づ
く検出感度は従来技術に比べ相当向上する。もう一つの
利点はペプチドの高特異性であり、これによって一般
に、誤った陽性反応を示す検体数は少くなる。
染の急性期からの初期抗体と後期抗体との両者を確認す
ることができるが、これによってこれらペプチドに基づ
く検出感度は従来技術に比べ相当向上する。もう一つの
利点はペプチドの高特異性であり、これによって一般
に、誤った陽性反応を示す検体数は少くなる。
【００３９】一般的に、初期および後期ＨＣＶ抗体に特
異的なペプチド、連結ペプチドまたはペプチド混合物を
用いるのが有利である。何故ならば、両タイプの結合部
位があるので感染初期からの検体と感染後期からの検体
との両者を確認できるからである。さらにまた、ＨＣＶ
−特異的ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ抗体による血清転
化を信頼性よく確認でき、また一般に陽性および陰性検
体を、極めて高い正確さをもって弁別することができ
る。さらに、一般的に、遺伝子工学によるタンパク質調
製に必要な発現系、あるいはウイルス増殖のためには不
可避である他の宿主細胞汚染による干渉もない。さらに
一般に、ヒト起源の血清、クエン酸加、ヘパリン加また
はＥＤＴＡ血漿中のＨＣＶ−特異的抗体の信頼し得る測
定が保証され、また検体を約５６℃で約６０分間不活性
化すれば一般に誤った陽性結果を与えることはない。最
後に、本発明によるこれらペプチドを用いて調製された
特異的抗体を用いれば、細胞不含患者血中の対応抗原の
免疫化学的測定によって診断ギャップをさらにうめるこ
とができる。
異的なペプチド、連結ペプチドまたはペプチド混合物を
用いるのが有利である。何故ならば、両タイプの結合部
位があるので感染初期からの検体と感染後期からの検体
との両者を確認できるからである。さらにまた、ＨＣＶ
−特異的ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ抗体による血清転
化を信頼性よく確認でき、また一般に陽性および陰性検
体を、極めて高い正確さをもって弁別することができ
る。さらに、一般的に、遺伝子工学によるタンパク質調
製に必要な発現系、あるいはウイルス増殖のためには不
可避である他の宿主細胞汚染による干渉もない。さらに
一般に、ヒト起源の血清、クエン酸加、ヘパリン加また
はＥＤＴＡ血漿中のＨＣＶ−特異的抗体の信頼し得る測
定が保証され、また検体を約５６℃で約６０分間不活性
化すれば一般に誤った陽性結果を与えることはない。最
後に、本発明によるこれらペプチドを用いて調製された
特異的抗体を用いれば、細胞不含患者血中の対応抗原の
免疫化学的測定によって診断ギャップをさらにうめるこ
とができる。
【００４０】本発明の主題によれば、好ましくは、回復
期のまた慢性感染患者からのＨＣＶ−特異的抗体および
／または感染急性期からのＨＣＶ抗体を確認する一連の
新規ペプチドが記載され、また無差別ではあるが極めて
鋭敏にかつ干渉をほとんど受けることなく抗−ＨＣＶ抗
体を検出するためのスクリーニングテストの基礎として
適当なポリペプチドおよびポリペプチド混合物が記載さ
れている。
期のまた慢性感染患者からのＨＣＶ−特異的抗体および
／または感染急性期からのＨＣＶ抗体を確認する一連の
新規ペプチドが記載され、また無差別ではあるが極めて
鋭敏にかつ干渉をほとんど受けることなく抗−ＨＣＶ抗
体を検出するためのスクリーニングテストの基礎として
適当なポリペプチドおよびポリペプチド混合物が記載さ
れている。
【００４１】さらに、本発明は、Ｃ−１００−３のＯＲ
Ｆ領域またはコア領域の前述のペプチドの少くとも一つ
に対してバイオスペシフィック（biospecific）アフィ
ニティを有する抗体に関する。
Ｆ領域またはコア領域の前述のペプチドの少くとも一つ
に対してバイオスペシフィック（biospecific）アフィ
ニティを有する抗体に関する。
【００４２】細胞不含患者血中の対応抗原を本発明によ
る抗体で免疫化学的に測定することにより内生抗体が出
現する前であってもＨＣＶの存在を確認することができ
る。
る抗体で免疫化学的に測定することにより内生抗体が出
現する前であってもＨＣＶの存在を確認することができ
る。
【００４３】さらに本発明は、本発明によるペプチドを
抗原として用いたＨＣＶ抗体を検出および／または測定
するための免疫化学的方法に関する。
抗原として用いたＨＣＶ抗体を検出および／または測定
するための免疫化学的方法に関する。
【００４４】さらに本発明は、各場合について、初期抗
体に対して特異的に反応する一以上のペプチドと後期抗
体に対して特異的に反応する一以上のペプチドとを別々
の混合物として検体と反応させることより成る、感染初
期と後期の鑑別診断方法に関する。
体に対して特異的に反応する一以上のペプチドと後期抗
体に対して特異的に反応する一以上のペプチドとを別々
の混合物として検体と反応させることより成る、感染初
期と後期の鑑別診断方法に関する。
【００４５】さらに本発明は、前記ペプチドを哺乳動
物、特にヒト、において産生させるのに用いることに関
する。
物、特にヒト、において産生させるのに用いることに関
する。
【００４６】さらに本発明は、前述の抗体を診断および
治療目的に用いることに関する。
治療目的に用いることに関する。
【００４７】従って本発明は、本発明の抗体またはペプ
チドの少くとも一つを単独でまたは他のペプチドまたは
抗体と共に含む剤に関する。
チドの少くとも一つを単独でまたは他のペプチドまたは
抗体と共に含む剤に関する。
【００４８】前記免疫反応性ペプチドは合成または遺伝
子工学により、好ましくは当業者に知られた方法による
合成により製造できる。ペプチドの化学合成は例えばＢ
ＡＲＡＮＩ，Ｇ．およびＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤ，Ｒ．
Ｂ．が“The Peptides, Analysis, Synthesis and Biol
ogy", Vol. 2, Academic Press 1980, ed. Erhard Gros
s, Johannes Meyenhoferに記載しているとおり、特にポ
リペプチドとして、またはオーバーラップまたは非オー
バーラップアミノ酸配列を有するいくつかの小ペプチド
の混合物として行うことができる。
子工学により、好ましくは当業者に知られた方法による
合成により製造できる。ペプチドの化学合成は例えばＢ
ＡＲＡＮＩ，Ｇ．およびＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤ，Ｒ．
Ｂ．が“The Peptides, Analysis, Synthesis and Biol
ogy", Vol. 2, Academic Press 1980, ed. Erhard Gros
s, Johannes Meyenhoferに記載しているとおり、特にポ
リペプチドとして、またはオーバーラップまたは非オー
バーラップアミノ酸配列を有するいくつかの小ペプチド
の混合物として行うことができる。
【００４９】遺伝子工学により製造されたポリペプチド
はその融合部分が後で除去されてしまう融合タンパク質
を含む。さらに、適切な場合には例えばグリコシル化、
アセチル化またはホスホリル化により修飾されたポリペ
プチドが包含される。
はその融合部分が後で除去されてしまう融合タンパク質
を含む。さらに、適切な場合には例えばグリコシル化、
アセチル化またはホスホリル化により修飾されたポリペ
プチドが包含される。
【００５０】これらのアミノ酸配列はポリペプチドとし
ておよびオーバーラップまたは非オーバーラップアミノ
酸配列を有するいくつかの小ペプチドの混合物として合
成することができる。
ておよびオーバーラップまたは非オーバーラップアミノ
酸配列を有するいくつかの小ペプチドの混合物として合
成することができる。
【００５１】さらにまた、個々のペプチドの混合物の方
が、前記構造の単一ペプチドよりも、免疫化学的抗−Ｈ
ＣＶ検出にとって良い診断特性を有することがあること
も見出した。Ｃ−１００−３のＯＲＦ領域およびコア領
域のペプチドの混合物を用いるのが特に有利である。
が、前記構造の単一ペプチドよりも、免疫化学的抗−Ｈ
ＣＶ検出にとって良い診断特性を有することがあること
も見出した。Ｃ−１００−３のＯＲＦ領域およびコア領
域のペプチドの混合物を用いるのが特に有利である。
【００５２】従って本発明は、さらに、本発明ペプチド
の一以上を含むペプチドの混合物に関する。
の一以上を含むペプチドの混合物に関する。
【００５３】別の態様においては、二以上の前記ペプチ
ド、好ましくは２〜１０、特に２〜４個のペプチドをブ
リッジを用いまたは用いずに連結する。それらペプチド
の長さは好ましくは６〜１５個のアミノ酸である。二以
上のペプチドのポリマー体を当業者に知られた方法によ
り製造しそして担体例えばタンパク質またはラテックス
粒子に結合することさえもできる。すなわち、担体また
はブリッジとして特に適しているのは例えばヒト血清ア
ルブミンおよび／またはポリリジンである。それらペプ
チドを１〜４０、好ましくは１〜２０、特に１〜１０個
のアミノ酸で延長することにより修飾することも同じく
可能である。付加的領域および構造は、ペプチド全体の
物理化学的挙動に対し有益な効果をもつことがあるが、
ペプチドまたはその部分の免疫反応性は維持されるべき
である。
ド、好ましくは２〜１０、特に２〜４個のペプチドをブ
リッジを用いまたは用いずに連結する。それらペプチド
の長さは好ましくは６〜１５個のアミノ酸である。二以
上のペプチドのポリマー体を当業者に知られた方法によ
り製造しそして担体例えばタンパク質またはラテックス
粒子に結合することさえもできる。すなわち、担体また
はブリッジとして特に適しているのは例えばヒト血清ア
ルブミンおよび／またはポリリジンである。それらペプ
チドを１〜４０、好ましくは１〜２０、特に１〜１０個
のアミノ酸で延長することにより修飾することも同じく
可能である。付加的領域および構造は、ペプチド全体の
物理化学的挙動に対し有益な効果をもつことがあるが、
ペプチドまたはその部分の免疫反応性は維持されるべき
である。
【００５４】従って本発明はさらにブリッジを用いてま
たは用いないで相互に連結され、あるいは担体に結合さ
れ得るペプチドに関する。
たは用いないで相互に連結され、あるいは担体に結合さ
れ得るペプチドに関する。
【００５５】このタイプの修飾は、一般的に、固相への
受動吸着または共有結合特性を有益に変え、カプリング
方法に有利な効果を有し、あるいは該ペプチドに対する
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生させる
場合に抗原としてより強力に働く。
受動吸着または共有結合特性を有益に変え、カプリング
方法に有利な効果を有し、あるいは該ペプチドに対する
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生させる
場合に抗原としてより強力に働く。
【００５６】すなわち例えば本発明はさらに次式
ＡＡn−ＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲＲＰＱＤＶＫ−ＢＡm
（式中ＡＡおよびＢＡは任意の所望のアミノ酸であり、
そしてｎおよびｍは各々相互に独立的に０〜約６０、特
に１〜４０の整数である）で示されるペプチドに関す
る。
そしてｎおよびｍは各々相互に独立的に０〜約６０、特
に１〜４０の整数である）で示されるペプチドに関す
る。
【００５７】しばしば、様々な方法で、例えばペプチド
を相互にまたは担体に連結させるために一以上のアミノ
酸、好ましくはシステインをアミノ−末端またはカルボ
キシル−末端に結合することにより、チオグリコール酸
アミド化により、例えばアンモニウムまたはメチルアミ
ンなどでカルボキシル−末端アミド化することにより、
ペプチドを誘導体化するのが有利である。このタイプの
修飾はポリペプチド上の正味荷電を変えそしてペプチド
の物理化学的特性を改善しあるいは固体担体、担体タン
パク質または別のペプチドへのペプチドの共有結合を容
易にすることがある。さらに当業者は、本発明ペプチド
がそれら自体の間であるいはそれら自体を用いて遺伝子
工学または合成により複数の免疫関連エピトープが一つ
のペプチド上に局在するように調製され得ることも知っ
ている。
を相互にまたは担体に連結させるために一以上のアミノ
酸、好ましくはシステインをアミノ−末端またはカルボ
キシル−末端に結合することにより、チオグリコール酸
アミド化により、例えばアンモニウムまたはメチルアミ
ンなどでカルボキシル−末端アミド化することにより、
ペプチドを誘導体化するのが有利である。このタイプの
修飾はポリペプチド上の正味荷電を変えそしてペプチド
の物理化学的特性を改善しあるいは固体担体、担体タン
パク質または別のペプチドへのペプチドの共有結合を容
易にすることがある。さらに当業者は、本発明ペプチド
がそれら自体の間であるいはそれら自体を用いて遺伝子
工学または合成により複数の免疫関連エピトープが一つ
のペプチド上に局在するように調製され得ることも知っ
ている。
【００５８】すなわち、本発明はさらに一以上のアミノ
酸の置換、付加または欠失により修飾された本発明によ
るアミノ酸配列を有するペプチドに関する。
酸の置換、付加または欠失により修飾された本発明によ
るアミノ酸配列を有するペプチドに関する。
【００５９】一般に、このタイプの修飾はペプチドの免
疫反応性を直接変化させることはないが、ペプチドの免
疫学的性質を向上させることは完全に可能である。すな
わち、例えば、メチオニンは自然酸化しやすいが、これ
はノルロイシン置換によりポリペプチドの抗原特性を本
質的に変えることなく防ぐことができる。
疫反応性を直接変化させることはないが、ペプチドの免
疫学的性質を向上させることは完全に可能である。すな
わち、例えば、メチオニンは自然酸化しやすいが、これ
はノルロイシン置換によりポリペプチドの抗原特性を本
質的に変えることなく防ぐことができる。
【００６０】当業者は、所与のアミノ酸配列を様々な利
点を伴い得る広範にわたる様々な改変例えば欠失、挿入
または置換に付すことができることを知っている。この
タイプの修飾は例えばＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅ
ｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ；Ａｌ
ａ、Ｓｅｒ；Ａｌａ、Ｔｈｒ；Ａｌａ、Ｖａｌ；Ａｌ
ａ、Ｐｒｏ；Ａｌａ、Ｇｌｕ；Ｌｅｕ、Ｇｌｎ；Ｇｌ
ｙ、Ｐｈｅ；Ｉｌｅ、ＳｅｒおよびＩｌｅ、Ｍｅｔなど
の組合せに関する。
点を伴い得る広範にわたる様々な改変例えば欠失、挿入
または置換に付すことができることを知っている。この
タイプの修飾は例えばＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅ
ｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ；Ａｌ
ａ、Ｓｅｒ；Ａｌａ、Ｔｈｒ；Ａｌａ、Ｖａｌ；Ａｌ
ａ、Ｐｒｏ；Ａｌａ、Ｇｌｕ；Ｌｅｕ、Ｇｌｎ；Ｇｌ
ｙ、Ｐｈｅ；Ｉｌｅ、ＳｅｒおよびＩｌｅ、Ｍｅｔなど
の組合せに関する。
【００６１】同じく、ポリペプチドの吸着特性を約２〜
２０個の疎水性アミノ酸より成る疎水性配列、例えばＰ
ｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅなどの付加の形で向
上させることも有利なことがある。
２０個の疎水性アミノ酸より成る疎水性配列、例えばＰ
ｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅなどの付加の形で向
上させることも有利なことがある。
【００６２】さらに本発明は、本発明ペプチドの少なく
とも一つをコードするＤＮＡ配列に関する。
とも一つをコードするＤＮＡ配列に関する。
【００６３】さらに本発明は、その特異的部分において
本発明によるＤＮＡ配列の少なくとも一つと相補的であ
る少なくとも一つの核酸プローブが用いられるハイブリ
ダイゼーション反応を特異的段階として用いるＨＣＶの
検出および／または測定のための分析方法に関する。免
疫化学的検出は一般に均一（溶液中）または不均一（固
相使用）方法として抗原および／または抗体の測定を可
能にする方法を含む。イムノアッセイとも称されるこれ
らの例は酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡまたはＥＩ
Ａ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノフルオ
レセンスアッセイ（ＩＦＡ）、ラジオイムノプレシピテ
ーションアッセイ（ＲＩＰＡ）または寒天ゲル拡散アッ
セイなどである。
本発明によるＤＮＡ配列の少なくとも一つと相補的であ
る少なくとも一つの核酸プローブが用いられるハイブリ
ダイゼーション反応を特異的段階として用いるＨＣＶの
検出および／または測定のための分析方法に関する。免
疫化学的検出は一般に均一（溶液中）または不均一（固
相使用）方法として抗原および／または抗体の測定を可
能にする方法を含む。イムノアッセイとも称されるこれ
らの例は酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡまたはＥＩ
Ａ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノフルオ
レセンスアッセイ（ＩＦＡ）、ラジオイムノプレシピテ
ーションアッセイ（ＲＩＰＡ）または寒天ゲル拡散アッ
セイなどである。
【００６４】これら数多くの極めて多様な方法は、特定
の態様ごとに、検出に用いたマーカーまたは測定原理
（例えば光度測定、放射性測定、視認、または凝集、散
乱光またはプレシピテーション挙動）、および固相につ
いて相違している。当業者は結合および遊離検体抗体ま
たは抗原の分離は広く用いられてはいるが例えばいわゆ
る均一アッセイでは絶対必要というわけではないことを
知っている。不均一イムノアッセイ、特に不均一ＥＬＩ
ＳＡ法が好ましい。
の態様ごとに、検出に用いたマーカーまたは測定原理
（例えば光度測定、放射性測定、視認、または凝集、散
乱光またはプレシピテーション挙動）、および固相につ
いて相違している。当業者は結合および遊離検体抗体ま
たは抗原の分離は広く用いられてはいるが例えばいわゆ
る均一アッセイでは絶対必要というわけではないことを
知っている。不均一イムノアッセイ、特に不均一ＥＬＩ
ＳＡ法が好ましい。
【００６５】同じく当業者は、“確認テスト(confirmat
ory test)”という用語が、ドット(dot)法と称されるテ
ストが名前により抗原の固定の仕方を説明しているにす
ぎないのと同様、イムノアッセイの使用を説明している
にすぎないことを知っている。
ory test)”という用語が、ドット(dot)法と称されるテ
ストが名前により抗原の固定の仕方を説明しているにす
ぎないのと同様、イムノアッセイの使用を説明している
にすぎないことを知っている。
【００６６】抗体検出においては、検体を記載のペプチ
ド配列とある時点で接触させて特定の方法の特定の段階
で抗原−抗体複合体を形成しあるいは競合および阻合テ
ストにあっては適当な標識試薬の添加によりその形成を
防ぐことが免疫化学的検出方法の前提要件である。
ド配列とある時点で接触させて特定の方法の特定の段階
で抗原−抗体複合体を形成しあるいは競合および阻合テ
ストにあっては適当な標識試薬の添加によりその形成を
防ぐことが免疫化学的検出方法の前提要件である。
【００６７】直接法では、抗体を固相に結合したペプチ
ドと、あるいは標識されたペプチドと、あるいは両者と
接触させることができ、基本となる方法が、１−、２−
または多−段階法として、同一のまたは異なるペプチド
（またはペプチド混合物）を固相上におよび検出用液状
試薬としておよび特異的ないわゆる捕獲抗体（例えば抗
ＩｇＭ）またはアフィニティー試薬（例えばプロテイン
Ａ）との組合せで用いた免疫測定テストデザイン（二重
抗原サンドイッチ）または第二抗体テストの原理に基づ
くかどうかは重要でない。
ドと、あるいは標識されたペプチドと、あるいは両者と
接触させることができ、基本となる方法が、１−、２−
または多−段階法として、同一のまたは異なるペプチド
（またはペプチド混合物）を固相上におよび検出用液状
試薬としておよび特異的ないわゆる捕獲抗体（例えば抗
ＩｇＭ）またはアフィニティー試薬（例えばプロテイン
Ａ）との組合せで用いた免疫測定テストデザイン（二重
抗原サンドイッチ）または第二抗体テストの原理に基づ
くかどうかは重要でない。
【００６８】ペプチドは固相に対して、共有結合的に、
吸着により、または特異的抗体または同様のアフィニテ
ィー法を用いて、例えばビオチン／アビジン複合体を介
して、しかし好ましくは吸着により結合させることがで
きる。
吸着により、または特異的抗体または同様のアフィニテ
ィー法を用いて、例えばビオチン／アビジン複合体を介
して、しかし好ましくは吸着により結合させることがで
きる。
【００６９】固相用担体材料として適しているのはプラ
スチック例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリア
ミドおよびその他の合成ポリマー、天然ポリマー例えば
セルロースおよび誘導体化された天然ポリマー例えばセ
ルロースアセテートおよびニトロセルロース、およびガ
ラス（特にガラス繊維など）などである。ポリスチレン
が担体材料として適している。
スチック例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリア
ミドおよびその他の合成ポリマー、天然ポリマー例えば
セルロースおよび誘導体化された天然ポリマー例えばセ
ルロースアセテートおよびニトロセルロース、およびガ
ラス（特にガラス繊維など）などである。ポリスチレン
が担体材料として適している。
【００７０】担体はビーズ、ロッド、チューブおよびマ
イクロタイター(microtiter)プレートの形態、あるいは
懸濁液例えばラテックス粒子の形態とすることができ
る。シート様構造物、例えば紙片、小プレートおよび膜
も同じく適している。担体表面は水性溶液に対して透過
性があるもの、ないものいずれであってもよい。
イクロタイター(microtiter)プレートの形態、あるいは
懸濁液例えばラテックス粒子の形態とすることができ
る。シート様構造物、例えば紙片、小プレートおよび膜
も同じく適している。担体表面は水性溶液に対して透過
性があるもの、ないものいずれであってもよい。
【００７１】好ましい担体はビーズ、チューブ、ウエ
ル、微粒子、紙片および膜である。特に好ましい担体は
マイクロタイタープレート、ラテックス粒子、ポリスチ
レンビーズまたは磁力に従いやすい粒子である。
ル、微粒子、紙片および膜である。特に好ましい担体は
マイクロタイタープレート、ラテックス粒子、ポリスチ
レンビーズまたは磁力に従いやすい粒子である。
【００７２】担体をコーティングするためのペプチド濃
度は一般に約０.０１〜２０μｇ／ml、好ましくは０.０
１〜１０μｇ／ml、特に好ましくは２〜１０μｇ／mlで
ある。その高純度および強度の抗原性により、例えば
０.０１〜２.０μｇ／ml、好ましくは０.１〜０.５μｇ
／mlという少量の使用を可能にする合成により製造され
たポリペプチドを用いるのが特に有利である。担体の結
合能は、特にポリスチレンを用いる場合、一般的に飽和
してしまうことはないので通常、複数の異なるポリペプ
チド、殊に２〜５種、特に３〜４種の異なるポリペプチ
ドでコートすることができるが、このことは特に有利で
ある。
度は一般に約０.０１〜２０μｇ／ml、好ましくは０.０
１〜１０μｇ／ml、特に好ましくは２〜１０μｇ／mlで
ある。その高純度および強度の抗原性により、例えば
０.０１〜２.０μｇ／ml、好ましくは０.１〜０.５μｇ
／mlという少量の使用を可能にする合成により製造され
たポリペプチドを用いるのが特に有利である。担体の結
合能は、特にポリスチレンを用いる場合、一般的に飽和
してしまうことはないので通常、複数の異なるポリペプ
チド、殊に２〜５種、特に３〜４種の異なるポリペプチ
ドでコートすることができるが、このことは特に有利で
ある。
【００７３】ペプチドを検出のための標識誘導体として
用いる場合には、適切なカップリング法は当業者に知ら
れたすべてのものである。さらにまた、多段階法例え
ば、抗体が標識を有している予め形成されたペプチド−
抗体複合体、高アフィニティー系例えばビオチン／アビ
ジン（これらの反応剤の一方の標識）などをアレンジす
ることもできる。
用いる場合には、適切なカップリング法は当業者に知ら
れたすべてのものである。さらにまた、多段階法例え
ば、抗体が標識を有している予め形成されたペプチド−
抗体複合体、高アフィニティー系例えばビオチン／アビ
ジン（これらの反応剤の一方の標識）などをアレンジす
ることもできる。
【００７４】使用できるマーカー例は放射性同位元素、
蛍光または化学発光色素である。さらに、例えば発色
原、発光原または蛍光原基質系により、または第１酵素
により活性化される第２酵素を用いたその後の増幅系に
より検出される酵素をマーカーとして用いることもでき
る。
蛍光または化学発光色素である。さらに、例えば発色
原、発光原または蛍光原基質系により、または第１酵素
により活性化される第２酵素を用いたその後の増幅系に
より検出される酵素をマーカーとして用いることもでき
る。
【００７５】マーカーとして好ましく用いられるのは酵
素、特にアルカリ性ホスファターゼおよび／または西洋
ワサビペルオキシダーゼまたは化学発光原例えばアクリ
ジニウムエステルである。
素、特にアルカリ性ホスファターゼおよび／または西洋
ワサビペルオキシダーゼまたは化学発光原例えばアクリ
ジニウムエステルである。
【００７６】標識は、前記マーカーについて従来技術に
記載されている方法により行われる。
記載されている方法により行われる。
【００７７】抗体をペルオキシダーゼで標識する場合は
NAKANE et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22, 1
084〜1090の過沃素酸塩法を用いることができ、または
パートナーをヘテロ二官能性試薬により連結するISHIKA
WA et al. 1983, J. Immunoassey 4, 209〜327の方法を
用いることができる。
NAKANE et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22, 1
084〜1090の過沃素酸塩法を用いることができ、または
パートナーをヘテロ二官能性試薬により連結するISHIKA
WA et al. 1983, J. Immunoassey 4, 209〜327の方法を
用いることができる。
【００７８】これらの方法のほかに、ペプチドを、ペプ
チド−特異的抗体により誘発された物理化学的変化例え
ば沈殿、凝集または光散乱などを自動的にまたは視覚的
に測定するために、適当な表面例えばラテックスまたは
赤血球の感作に用いることもできる。さらにペプチドを
誘導体化することなく前述の方法と同様これら測定原理
の阻害に用いることができることも知られている。
チド−特異的抗体により誘発された物理化学的変化例え
ば沈殿、凝集または光散乱などを自動的にまたは視覚的
に測定するために、適当な表面例えばラテックスまたは
赤血球の感作に用いることもできる。さらにペプチドを
誘導体化することなく前述の方法と同様これら測定原理
の阻害に用いることができることも知られている。
【００７９】本発明によるペプチドまたはそれらの誘導
体を用いて調製されたポリクローナルまたはモノクロー
ナル抗体を用いる免疫診断法を抗原検出に用いることが
できる。この検出法に適した態様は当業者に知られてい
て、特定の段階で抗体−抗原複合体を形成するか、また
は競合法において標識抗原の添加により複合体形成を阻
害することより成る。
体を用いて調製されたポリクローナルまたはモノクロー
ナル抗体を用いる免疫診断法を抗原検出に用いることが
できる。この検出法に適した態様は当業者に知られてい
て、特定の段階で抗体−抗原複合体を形成するか、また
は競合法において標識抗原の添加により複合体形成を阻
害することより成る。
【００８０】抗原テストを確立するための固相、マーカ
ーまたは測定プリンシプルとして適しているのは相当す
る抗体測定について記載されているすべての可能性であ
るが、競合原理および二重抗体サンドイッチ法が免疫化
学的方法として特に好ましい。この脈絡においては、方
法が１−、２−または３−段階法として設計されるかど
うかは重要でない。すなわち多段階法は、未標識検出抗
体であってそれらに対する適切に標識された別の抗体を
用いて測定されるものを使用して行うことができる。例
えば血清アルブミンまたはスカシガイヘモシアニンにカ
ップリングさせることによって可能であるが（B. S. Sc
haffhausen, Hybridoma Technologie, the Biosciences
and Medicine, ed. T. A. Springer, Plenum Press N
Y, London, 1985)、ペプチドをそれらの免疫原性が改善
されるように修飾しておくことは抗体の産生(raising)
に有利である。
ーまたは測定プリンシプルとして適しているのは相当す
る抗体測定について記載されているすべての可能性であ
るが、競合原理および二重抗体サンドイッチ法が免疫化
学的方法として特に好ましい。この脈絡においては、方
法が１−、２−または３−段階法として設計されるかど
うかは重要でない。すなわち多段階法は、未標識検出抗
体であってそれらに対する適切に標識された別の抗体を
用いて測定されるものを使用して行うことができる。例
えば血清アルブミンまたはスカシガイヘモシアニンにカ
ップリングさせることによって可能であるが（B. S. Sc
haffhausen, Hybridoma Technologie, the Biosciences
and Medicine, ed. T. A. Springer, Plenum Press N
Y, London, 1985)、ペプチドをそれらの免疫原性が改善
されるように修飾しておくことは抗体の産生(raising)
に有利である。
【００８１】最後に、本発明はさらに固相および乾燥状
態で一部あるいは全部の必要試薬を含む免疫診断要素を
用いる場合にも適用でき、そしてこの場合にも本発明の
新規ペプチドは固相側または検出試薬中またはその両方
に含まれそして抗体測定、抗原検出またはその他の被分
析物質(analyte)との組合せが行われる。
態で一部あるいは全部の必要試薬を含む免疫診断要素を
用いる場合にも適用でき、そしてこの場合にも本発明の
新規ペプチドは固相側または検出試薬中またはその両方
に含まれそして抗体測定、抗原検出またはその他の被分
析物質(analyte)との組合せが行われる。
【００８２】本発明の新規ペプチドの予想外の利点の一
つは、それらによってＨＣＶ抗体の信頼性ある測定が可
能となる点である。さらにこれらのペプチドを用いれば
急性感染期からの初期抗体も確認されるが、これにより
これらペプチドに基づく検出感度が従来技術に比べ相当
に向上し、さらにはこれら抗体タイプ（初期または後期
抗体）に対する適宜の結合部位を有するペプチドを二つ
の異なるテスト方法に相互に別々に用いれば一方におけ
る急性期と他方における慢性または回復期との間の鑑別
が可能となる。最後に、本発明によって得られるもう一
つの利点は本発明のペプチドの特異性が高い点であり、
これによって誤って陽性反応を示す検体数は最小に抑え
られることになる。
つは、それらによってＨＣＶ抗体の信頼性ある測定が可
能となる点である。さらにこれらのペプチドを用いれば
急性感染期からの初期抗体も確認されるが、これにより
これらペプチドに基づく検出感度が従来技術に比べ相当
に向上し、さらにはこれら抗体タイプ（初期または後期
抗体）に対する適宜の結合部位を有するペプチドを二つ
の異なるテスト方法に相互に別々に用いれば一方におけ
る急性期と他方における慢性または回復期との間の鑑別
が可能となる。最後に、本発明によって得られるもう一
つの利点は本発明のペプチドの特異性が高い点であり、
これによって誤って陽性反応を示す検体数は最小に抑え
られることになる。
【００８３】一方においては献血センターにおけるウイ
ルス安全対策上、そして他方においてはコスト上の理由
から、いわゆる組合せテストが開発されそして１９８９
年来利用可能となっているが、これにより抗−ＨＩＶ
１および／または抗−ＨＩＶ２の同時非鑑別検出ができ
る(K. Koerner et al., Lab. Med. 14, 159〜161, 199
0)この開発が可能となったのは、それら二つのＨＩＶサ
ブタイプが相互に大きな類似性を示しさらにそれらが同
じウイルスクラスに属するためである。すなわち、かか
る抗−ＨＩＶ 1/2組合せテストにおける抗−ＨＩＶ １
測定も抗−ＨＩＶ １とＨＩＶ ２抗原との交叉反応に基
づいている(M. Busch et al., Transfusion 30/2, 184
〜187, 1990)が、同じくやはり逆に抗−ＨＩＶ ２検出
は抗−ＨＩＶ ２およびＨＩＶ １抗原の間で生じる反応
によって高められる。これに基づいて、二つの抗体特異
性を有する組合せ検出の確立は、関連のあるまたは構造
類似の抗原を用いる場合には相対的に簡単であることが
わかる。非Ａ非Ｂ肝炎の病原体、いわゆる肝炎Ｃウイル
ス（ＨＣＶ）の検出は本発明による抗−ＨＣＶ測定の確
立のための必要条件であった。それに伴ってスクリーニ
ングテストの性能面では改良されるが、最新の抗−ＨＣ
Ｖテストについても、一方において抗−ＨＩＶ組合せテ
ストおよび他方において抗−ＨＣＶ個別テストによる個
々の供血者の検査には相当な努力と相当な付加的コスト
が伴うという問題が生じる。
ルス安全対策上、そして他方においてはコスト上の理由
から、いわゆる組合せテストが開発されそして１９８９
年来利用可能となっているが、これにより抗−ＨＩＶ
１および／または抗−ＨＩＶ２の同時非鑑別検出ができ
る(K. Koerner et al., Lab. Med. 14, 159〜161, 199
0)この開発が可能となったのは、それら二つのＨＩＶサ
ブタイプが相互に大きな類似性を示しさらにそれらが同
じウイルスクラスに属するためである。すなわち、かか
る抗−ＨＩＶ 1/2組合せテストにおける抗−ＨＩＶ １
測定も抗−ＨＩＶ １とＨＩＶ ２抗原との交叉反応に基
づいている(M. Busch et al., Transfusion 30/2, 184
〜187, 1990)が、同じくやはり逆に抗−ＨＩＶ ２検出
は抗−ＨＩＶ ２およびＨＩＶ １抗原の間で生じる反応
によって高められる。これに基づいて、二つの抗体特異
性を有する組合せ検出の確立は、関連のあるまたは構造
類似の抗原を用いる場合には相対的に簡単であることが
わかる。非Ａ非Ｂ肝炎の病原体、いわゆる肝炎Ｃウイル
ス（ＨＣＶ）の検出は本発明による抗−ＨＣＶ測定の確
立のための必要条件であった。それに伴ってスクリーニ
ングテストの性能面では改良されるが、最新の抗−ＨＣ
Ｖテストについても、一方において抗−ＨＩＶ組合せテ
ストおよび他方において抗−ＨＣＶ個別テストによる個
々の供血者の検査には相当な努力と相当な付加的コスト
が伴うという問題が生じる。
【００８４】抗−ＨＣＶ測定についての今日までのすべ
ての商業ベースの態様および大部分の抗−ＨＩＶ組合せ
テストは遺伝子工学によるＨＣＶまたはＨＩＶポリペプ
チドに基づいている。しかしながら、やはり今日にいた
るも、ＨＣＶ（フラボウイルス）およびＨＩＶ（レトロ
ウイルス）の場合のように異なるウイルスクラス関係が
存在することから、類似抗原を使用できないときは複数
の異なる抗原を含む唯一のテスト混合物中の複数の異な
る抗体特異性を一回の免疫化学的検出で同時に測定する
ことには成功を収めていない。本発明の意味において、
異なる抗体特異性とは、相互の交叉反応性が極めて低い
か全くない抗体を意味する。複数のウイルス抗原に対す
る全部で三つの抗体特異性を検出するためのこのタイプ
のテストは、感度の点でもまた相互に干渉しあう相互作
用の結果干渉の受けやすさ（特異性）の点でも、特定の
個別のテストの対応特性よりも劣る傾向にあるとされて
いた。
ての商業ベースの態様および大部分の抗−ＨＩＶ組合せ
テストは遺伝子工学によるＨＣＶまたはＨＩＶポリペプ
チドに基づいている。しかしながら、やはり今日にいた
るも、ＨＣＶ（フラボウイルス）およびＨＩＶ（レトロ
ウイルス）の場合のように異なるウイルスクラス関係が
存在することから、類似抗原を使用できないときは複数
の異なる抗原を含む唯一のテスト混合物中の複数の異な
る抗体特異性を一回の免疫化学的検出で同時に測定する
ことには成功を収めていない。本発明の意味において、
異なる抗体特異性とは、相互の交叉反応性が極めて低い
か全くない抗体を意味する。複数のウイルス抗原に対す
る全部で三つの抗体特異性を検出するためのこのタイプ
のテストは、感度の点でもまた相互に干渉しあう相互作
用の結果干渉の受けやすさ（特異性）の点でも、特定の
個別のテストの対応特性よりも劣る傾向にあるとされて
いた。
【００８５】今般驚くべきことに、それぞれ異なる病原
体の異なるエピトープを担体に固定すればそれぞれ異な
る病原体に対する複数の異なる抗体または異なる抗体特
異性を単一テストで免疫化学的に検出できることも見出
された。
体の異なるエピトープを担体に固定すればそれぞれ異な
る病原体に対する複数の異なる抗体または異なる抗体特
異性を単一テストで免疫化学的に検出できることも見出
された。
【００８６】さらにまた、本発明方法により認められる
感度は少なくとも個別テストの感度には相当する。すな
わち、例えば、本発明方法の場合に抗−ＨＩＶ 1/2およ
び抗−ＨＣＶについて測定される感度特徴は少なくとも
個別テストのそれらに相当する。
感度は少なくとも個別テストの感度には相当する。すな
わち、例えば、本発明方法の場合に抗−ＨＩＶ 1/2およ
び抗−ＨＣＶについて測定される感度特徴は少なくとも
個別テストのそれらに相当する。
【００８７】従って、望ましくない誤った陽性反応によ
る干渉の受けやすさが本発明方法により低下するという
ことも全く驚くべきことであった。すなわち、例えば本
発明による抗−ＨＩＶ／抗−ＨＣＶの特異性をテストし
たところ、得られた特異性は二つの個別テストの全体に
よって与えられるものよりも高かった。その結果、間違
って捨てられる供血数は全体として減少させることがで
きる。
る干渉の受けやすさが本発明方法により低下するという
ことも全く驚くべきことであった。すなわち、例えば本
発明による抗−ＨＩＶ／抗−ＨＣＶの特異性をテストし
たところ、得られた特異性は二つの個別テストの全体に
よって与えられるものよりも高かった。その結果、間違
って捨てられる供血数は全体として減少させることがで
きる。
【００８８】従って本発明はさらに、特定の病原体の一
以上のエピトープを担体に固定しそして該病原体の検出
および／または測定を単一のテストで行うことより成
る、それぞれ異なる病原体に対する複数の異なる抗体特
異性を検出および／または測定するための免疫化学的方
法にも関する。
以上のエピトープを担体に固定しそして該病原体の検出
および／または測定を単一のテストで行うことより成
る、それぞれ異なる病原体に対する複数の異なる抗体特
異性を検出および／または測定するための免疫化学的方
法にも関する。
【００８９】ある種の課題、例えば縦断的検査のために
は、異なる病原体の非鑑別同時測定を行うのが望ましい
ことがある。これは、様々な抗体間の区別をすることな
くイエスの応答またはノーの応答（すべての抗体特異性
について陰性）だけが得られることを意味する。
は、異なる病原体の非鑑別同時測定を行うのが望ましい
ことがある。これは、様々な抗体間の区別をすることな
くイエスの応答またはノーの応答（すべての抗体特異性
について陰性）だけが得られることを意味する。
【００９０】さらに、適切な場合には同時抗体検出の鑑
別測定も望ましい。これは、本発明の範囲内において、
例えば免疫測定テストにあっては、異なるウイルス特異
的標識を有する抗原、例えばペルオキシダーゼを有する
ＨＩＶ １抗原、アルカリ性ホスファターゼを有するＨ
ＩＶ ２抗原およびβ−ガラクトシダーゼを有するＨＣ
Ｖ抗原を用いることにより、直接可能である。次に、同
時結合した抗体特異性を順次または同時に測定すること
は、異なる酵素基質を用いることにより可能である。
別測定も望ましい。これは、本発明の範囲内において、
例えば免疫測定テストにあっては、異なるウイルス特異
的標識を有する抗原、例えばペルオキシダーゼを有する
ＨＩＶ １抗原、アルカリ性ホスファターゼを有するＨ
ＩＶ ２抗原およびβ−ガラクトシダーゼを有するＨＣ
Ｖ抗原を用いることにより、直接可能である。次に、同
時結合した抗体特異性を順次または同時に測定すること
は、異なる酵素基質を用いることにより可能である。
【００９１】別の形の鑑別法は、一つの抗体特異性を対
応抗原を特異的に検体に添加することにより阻害するこ
とである。
応抗原を特異的に検体に添加することにより阻害するこ
とである。
【００９２】すなわち本発明はさらに、検出および／ま
たは測定が鑑別的または非鑑別的に、好ましくは非鑑別
的に、行われる、異なる抗体特異性を同時検出および／
または同時測定するための免疫化学的方法に関する。
たは測定が鑑別的または非鑑別的に、好ましくは非鑑別
的に、行われる、異なる抗体特異性を同時検出および／
または同時測定するための免疫化学的方法に関する。
【００９３】本発明による異なる病原体は、異なる特異
性を有する抗体および一般に極めて低いまたはゼロの交
叉反応性の対象となっている病原体を意味する。これら
の例は、ＨＩＶ １＋２、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ Ｉ＋II、Ｈ
ＢＶまたはトレポネーマ・パリダム(Treponema pallidu
m)、好ましくはＨＩＶおよびＨＣＶである。
性を有する抗体および一般に極めて低いまたはゼロの交
叉反応性の対象となっている病原体を意味する。これら
の例は、ＨＩＶ １＋２、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ Ｉ＋II、Ｈ
ＢＶまたはトレポネーマ・パリダム(Treponema pallidu
m)、好ましくはＨＩＶおよびＨＣＶである。
【００９４】対応抗体に対する高密度または高濃度の結
合部位（エピトープ）を有する前記病原体の、特にＨＩ
Ｖ １、ＨＩＶ ２およびＨＣＶの、抗原を担体に固定す
るのが特に有利である。このようにすれば、例えば、血
清転化を確認でき、一般に高い正確さをもって陽性およ
び陰性検体を弁別でき、遺伝子工学によるタンパク質調
製に必要な発現系による干渉は一般に起こり得ず、ウイ
ルス増殖上不可避である他の宿主細胞汚染は一般には存
在せず、ヒト起源の血清、クエン酸加、ヘパリン加およ
びＥＤＴＡ血漿における異なる特異性を有するＨＩＶ−
およびＨＣＶ−特異的抗体の一般に信頼し得る測定が保
証され、また５６℃で６０分間検体を不活性化させれば
誤った陽性結果を生じることはない。
合部位（エピトープ）を有する前記病原体の、特にＨＩ
Ｖ １、ＨＩＶ ２およびＨＣＶの、抗原を担体に固定す
るのが特に有利である。このようにすれば、例えば、血
清転化を確認でき、一般に高い正確さをもって陽性およ
び陰性検体を弁別でき、遺伝子工学によるタンパク質調
製に必要な発現系による干渉は一般に起こり得ず、ウイ
ルス増殖上不可避である他の宿主細胞汚染は一般には存
在せず、ヒト起源の血清、クエン酸加、ヘパリン加およ
びＥＤＴＡ血漿における異なる特異性を有するＨＩＶ−
およびＨＣＶ−特異的抗体の一般に信頼し得る測定が保
証され、また５６℃で６０分間検体を不活性化させれば
誤った陽性結果を生じることはない。
【００９５】好ましいものとして用いられるのは（特に
ＨＩＶ １および／またはＨＩＶ ２およびＨＣＶの）ポ
リペプチド（それらは高感度抗ＨＩＶ／抗−ＨＣＶ検出
に適している）、そしてさらに、組合せ抗体検出のスク
リーニングテストの基礎として適したポリペプチド混合
物より成る単一エピトープおよび／またはそれらの組合
せである。
ＨＩＶ １および／またはＨＩＶ ２およびＨＣＶの）ポ
リペプチド（それらは高感度抗ＨＩＶ／抗−ＨＣＶ検出
に適している）、そしてさらに、組合せ抗体検出のスク
リーニングテストの基礎として適したポリペプチド混合
物より成る単一エピトープおよび／またはそれらの組合
せである。
【００９６】すなわち、本発明はＨＩＶ １および／ま
たはＨＩＶ ２およびＨＣＶのポリペプチド混合物にも
関する。
たはＨＩＶ ２およびＨＣＶのポリペプチド混合物にも
関する。
【００９７】以下のポリペプチドが特に好ましい：
１．HIV 1 (Ratner et al., Nature 1985, 313, 277〜284のナンバリングシス
テム)：
IV トランスメンブレンタンパク質(gp 41)：AA 580−AA 630
V エンベロープタンパク質 （gp 120)：AA 490−AA 540
VI コアタンパク質 （p 24)：AA 240−AA 390
２．HIV 2 (Gyader et al., Nature 1987, 326, 662〜669のナンバリングシス
テム)：
VII トランスメンブレンタンパク質(gp 36)：AA 570−AA 620
VIII エンベロープタンパク質 (gp 110)：AA 480−AA 530
IX コアタンパク質 (p 26)：AA 230−AA 380
３．HCV(WO 89/04669およびWO 90/11089のナンバリングシステム)：
X 非構造タンパク質４(NSP 4)：AA 121−AA 175
XI 非構造タンパク質３(NSP 3)：AA 1−AA 265
XII 構造タンパク質 (コア)：AA 1−AA 80
【００９８】（特に非鑑別抗−ＨＩＶ／抗−ＨＣＶスク
リーニングテストにとって）特に好ましいのは前記ポリ
ペプチドの混合物であり、その一部を例示として記す
が、考えられる可能性をそれらに限定するものではな
い： XIII ｇｐ ４１ ＨＩＶ １ ｇｐ ３６ ＨＩＶ ２ ＮＳＰ ３ ＨＣＶ XIV ｇｐ ４１ ＨＩＶ １ ｇｐ ３６ ＨＩＶ ２ ＮＳＰ ４ ＨＣＶ コア ＨＣＶ XV ｇｐ ４１ ＨＩＶ １ ｇｐ ３６ ＨＩＶ ２ ＮＳＰ ３ ＨＣＶ ＮＳＰ ４ ＨＣＶ コア ＨＣＶ XVI ｇｐ ４１ ＨＩＶ １ ｐ ２４ ＨＩＶ １ ｇｐ ３６ ＨＩＶ ２ ＮＳＰ ３ ＨＣＶ コア ＨＣＶ または XVII ｇｐ ４１ ＨＩＶ １ ｐ ２４ ＨＩＶ １ ｇｐ ３６ ＨＩＶ ２ ｐ ２４ ＨＩＶ ２ ＮＳＰ ３ ＨＣＶ ＮＳＰ ４ ＨＣＶ コア
リーニングテストにとって）特に好ましいのは前記ポリ
ペプチドの混合物であり、その一部を例示として記す
が、考えられる可能性をそれらに限定するものではな
い： XIII ｇｐ ４１ ＨＩＶ １ ｇｐ ３６ ＨＩＶ ２ ＮＳＰ ３ ＨＣＶ XIV ｇｐ ４１ ＨＩＶ １ ｇｐ ３６ ＨＩＶ ２ ＮＳＰ ４ ＨＣＶ コア ＨＣＶ XV ｇｐ ４１ ＨＩＶ １ ｇｐ ３６ ＨＩＶ ２ ＮＳＰ ３ ＨＣＶ ＮＳＰ ４ ＨＣＶ コア ＨＣＶ XVI ｇｐ ４１ ＨＩＶ １ ｐ ２４ ＨＩＶ １ ｇｐ ３６ ＨＩＶ ２ ＮＳＰ ３ ＨＣＶ コア ＨＣＶ または XVII ｇｐ ４１ ＨＩＶ １ ｐ ２４ ＨＩＶ １ ｇｐ ３６ ＨＩＶ ２ ｐ ２４ ＨＩＶ ２ ＮＳＰ ３ ＨＣＶ ＮＳＰ ４ ＨＣＶ コア
【００９９】一般に前記ペプチド混合物を用いれば診断
用途に対するよりよい免疫学的性質が得られる。
用途に対するよりよい免疫学的性質が得られる。
【０１００】ＨＩＶ １、ＨＩＶ ２およびＨＣＶの以下
のペプチドは特に適していることが判明した：
のペプチドは特に適していることが判明した：
【化８】
【０１０１】同様に、ＨＩＶ １、ＨＩＶ ２またはＨＣ
Ｖの異なるタンパク質領域からのさらなるペプチドも、
これらのポリペプチドに免疫関連がある限り、一体化す
ることができる。逆に、例えばＨＩＶ １およびＨＣＶ
ペプチドの混合物を用いて抗−ＨＩＶ １／抗−ＨＣＶ
だけを同時測定するが例えば抗−ＨＢＶ／抗−ＨＩＶ１
／抗−ＨＣＶは測定しないために、対応ペプチドを省く
ことにより非鑑別検出において特定の抗体を排除するこ
とも、例えば疫学的課題の上からは、有利なこともあ
る。さらに、ＨＣＶとは同一でないペプチド、例えばま
さにＨＩＶを、ＨＣＶペプチドについて前述した方法を
同様にして誘導体化と修飾することもできる。
Ｖの異なるタンパク質領域からのさらなるペプチドも、
これらのポリペプチドに免疫関連がある限り、一体化す
ることができる。逆に、例えばＨＩＶ １およびＨＣＶ
ペプチドの混合物を用いて抗−ＨＩＶ １／抗−ＨＣＶ
だけを同時測定するが例えば抗−ＨＢＶ／抗−ＨＩＶ１
／抗−ＨＣＶは測定しないために、対応ペプチドを省く
ことにより非鑑別検出において特定の抗体を排除するこ
とも、例えば疫学的課題の上からは、有利なこともあ
る。さらに、ＨＣＶとは同一でないペプチド、例えばま
さにＨＩＶを、ＨＣＶペプチドについて前述した方法を
同様にして誘導体化と修飾することもできる。
【０１０２】本発明方法の大きな利点の一つは、異なる
病原体に対する複数の抗体を単一のテストで検出がで
き、しかもなお個別テストで達成し得るのと同じ高さの
特異性または感度が達成される点である。
病原体に対する複数の抗体を単一のテストで検出がで
き、しかもなお個別テストで達成し得るのと同じ高さの
特異性または感度が達成される点である。
【０１０３】下記の実施例は本発明の諸態様を記載した
ものであるが、本発明をそれらに限定するものではな
い。
ものであるが、本発明をそれらに限定するものではな
い。
【０１０４】実施例１
ペプチド溶液の調製、およびこれらペプチドまたはペプ
チド混合物によるマイクロタイタープレートのコーティ
ング １〜１０mg／mlのペプチドを含む蒸留水中の５０％酢酸
中の本発明ペプチド貯蔵溶液から０.１０Ｍ重炭酸ナト
リウム（pH９.６）中の連続２倍希釈液を調製した、す
なわちペプチド濃度が５０、２０、１２.５、６.２５、
３.１２、１.５６、０.７８、０.３９、０.２、０.１、
０.０５および０.０１μg／mlである一連の希釈液を得
た。個別ペプチドの混合物についても手順は同様とし、
０.１Ｍ重炭酸ナトリウムに希釈することにより、前述
の通りの全体的最終濃度ではあるがいくつかのペプチド
の混合物の場合にあってはそれらを等濃度で（１：１混
合物の場合）または相互に対し様々な割合で含むものを
得るために、前記貯蔵溶液を付加的に例えば１０：１ま
たは１：４というように様々な割合で混合した。
チド混合物によるマイクロタイタープレートのコーティ
ング １〜１０mg／mlのペプチドを含む蒸留水中の５０％酢酸
中の本発明ペプチド貯蔵溶液から０.１０Ｍ重炭酸ナト
リウム（pH９.６）中の連続２倍希釈液を調製した、す
なわちペプチド濃度が５０、２０、１２.５、６.２５、
３.１２、１.５６、０.７８、０.３９、０.２、０.１、
０.０５および０.０１μg／mlである一連の希釈液を得
た。個別ペプチドの混合物についても手順は同様とし、
０.１Ｍ重炭酸ナトリウムに希釈することにより、前述
の通りの全体的最終濃度ではあるがいくつかのペプチド
の混合物の場合にあってはそれらを等濃度で（１：１混
合物の場合）または相互に対し様々な割合で含むものを
得るために、前記貯蔵溶液を付加的に例えば１０：１ま
たは１：４というように様々な割合で混合した。
【０１０５】それぞれについて、１００μlの希釈液を
マイクロタイタープレート、タイプＢ（Nunc．Roskild
e、デンマーク、により供給されたもの）の１６ウエル
に入れた。希釈液を入れたテストプレートを２０℃で１
８時間放置し、次いでウエル内の溶液を吸引により除去
し、そしてそれらウエルをリン酸緩衝生理学的食塩水
（ＰＢＳ、pH７.４）中の１０ｇ／リットル牛血清アル
ブミンの溶液３００μｌを用いて充填および吸引除去に
より３〜４回洗浄し、そしてそれらテストプレートを次
いでシリカゲル上、２０℃で乾燥した。
マイクロタイタープレート、タイプＢ（Nunc．Roskild
e、デンマーク、により供給されたもの）の１６ウエル
に入れた。希釈液を入れたテストプレートを２０℃で１
８時間放置し、次いでウエル内の溶液を吸引により除去
し、そしてそれらウエルをリン酸緩衝生理学的食塩水
（ＰＢＳ、pH７.４）中の１０ｇ／リットル牛血清アル
ブミンの溶液３００μｌを用いて充填および吸引除去に
より３〜４回洗浄し、そしてそれらテストプレートを次
いでシリカゲル上、２０℃で乾燥した。
【０１０６】実施例２
ＩｇＧクラスのヒト免疫グロブリン（ｈ−ＩｇＧ）に対
するペルオキシダーゼ標識抗体、および検出用ＴＭＢ基
質の調製 KOEHLERおよびMILSTEINのモノクローナル抗体調製法（N
ature 256, 495, 1975）によりｈ−ＩｇＧに対する抗
体を調製し、同じ抗原特異性を有する異なるモノクロー
ナル抗体をSTAEHLI et al. (J. of Immunological Meth
ods 32、 297〜304、 1980）により記載された方法によ
り確認した。ゲルクロマトグラフィーおよびリン酸緩衝
食塩水（ＰＢＳ、pH７.４）に対する透析による精製
後、モノクローナル抗体画分含有プール（タンパク質４
mg／ml）を次いでTANAMORI et al.(J. Immunol. Meth.
62、 123〜131、 1983）により記載されている方法により
Ｎ−ガンマ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド
（ＧＭＢＳ）（Behring Diagnostics社より入手）と反
応させた。
するペルオキシダーゼ標識抗体、および検出用ＴＭＢ基
質の調製 KOEHLERおよびMILSTEINのモノクローナル抗体調製法（N
ature 256, 495, 1975）によりｈ−ＩｇＧに対する抗
体を調製し、同じ抗原特異性を有する異なるモノクロー
ナル抗体をSTAEHLI et al. (J. of Immunological Meth
ods 32、 297〜304、 1980）により記載された方法によ
り確認した。ゲルクロマトグラフィーおよびリン酸緩衝
食塩水（ＰＢＳ、pH７.４）に対する透析による精製
後、モノクローナル抗体画分含有プール（タンパク質４
mg／ml）を次いでTANAMORI et al.(J. Immunol. Meth.
62、 123〜131、 1983）により記載されている方法により
Ｎ−ガンマ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド
（ＧＭＢＳ）（Behring Diagnostics社より入手）と反
応させた。
【０１０７】塩酸２−イミノチオラン（Sigma社により
供給された。カタログ番号Ｉ ６２５６）をKING et al.
(Biochem. 17、 1499〜1506、 1978）により記載された
方法により、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）(B
oehringer Mannheim社より入手。カタログ番号４１３４
７０）と反応させた。ＩｇＧ−ＰＯＤ接合体はＧＭＢＳ
−ＩｇＧ接合体とイミノチオラン−ＰＯＤ接合体からTA
NAMORI et al. (supra)により記載された方法により調
製した。
供給された。カタログ番号Ｉ ６２５６）をKING et al.
(Biochem. 17、 1499〜1506、 1978）により記載された
方法により、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）(B
oehringer Mannheim社より入手。カタログ番号４１３４
７０）と反応させた。ＩｇＧ−ＰＯＤ接合体はＧＭＢＳ
−ＩｇＧ接合体とイミノチオラン−ＰＯＤ接合体からTA
NAMORI et al. (supra)により記載された方法により調
製した。
【０１０８】得られたＩｇＧ−ＰＯＤ接合体溶液のタン
パク質含量は３６０μg／mlであった。ＰＯＤ対ＩｇＧ
比は２.８として測定された。その溶液を次に、５０ml
／リットル牛胎児血清（ＦＣＳ）、５ｇ／リットルポリ
オキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（RT
ween２０）のＰＢＳ溶液を用いて５００ng／ml ＩｇＧ
−ＰＯＤまで希釈しそして抗−ＩｇＧ／ＰＯＤ接合体と
呼んだ。ＥＬＩＳＡに用いるために、次に０.５％ RTwe
en２０を含有するｔｒｉｓ緩衝液（pH７.４）への希釈
を（１：１００〜１：２０,０００希釈範囲で）様々に
行って、０.１Ｍ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチ
ル）−１,３−プロパンジオール（ｔｒｉｓ）、０.１Ｍ
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および０.１％ RTween（pH
８.４）を含む接合体緩衝液中で均一に１：２６最終希
釈液を調製した。従来技術に従って調製されたウサギポ
リクローナル抗体は使用の為に同じく１＋２５の希釈液
が得られるように調節した。
パク質含量は３６０μg／mlであった。ＰＯＤ対ＩｇＧ
比は２.８として測定された。その溶液を次に、５０ml
／リットル牛胎児血清（ＦＣＳ）、５ｇ／リットルポリ
オキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（RT
ween２０）のＰＢＳ溶液を用いて５００ng／ml ＩｇＧ
−ＰＯＤまで希釈しそして抗−ＩｇＧ／ＰＯＤ接合体と
呼んだ。ＥＬＩＳＡに用いるために、次に０.５％ RTwe
en２０を含有するｔｒｉｓ緩衝液（pH７.４）への希釈
を（１：１００〜１：２０,０００希釈範囲で）様々に
行って、０.１Ｍ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチ
ル）−１,３−プロパンジオール（ｔｒｉｓ）、０.１Ｍ
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および０.１％ RTween（pH
８.４）を含む接合体緩衝液中で均一に１：２６最終希
釈液を調製した。従来技術に従って調製されたウサギポ
リクローナル抗体は使用の為に同じく１＋２５の希釈液
が得られるように調節した。
【０１０９】抗−ＩｇＧ／ＰＯＤ接合体の検出には、二
つの貯蔵溶液から調製された過酸化水素およびテトラメ
チルベンチジン（ＴＭＢ）を含む基質調製物または基質
系を用いた。
つの貯蔵溶液から調製された過酸化水素およびテトラメ
チルベンチジン（ＴＭＢ）を含む基質調製物または基質
系を用いた。
【０１１０】貯蔵溶液１：二塩酸ＴＭＢを撹拌しなが
ら、５ｇ／リットル、すなわち１６mmol／リットル濃度
で二重蒸留水に溶解しそして５規定塩酸でpH１.５に調
節した。ペニシリンＧをこの溶液に撹拌しながら２００
mg／リットル、すなわち０.５６mmol／リットルの最終
濃度として添加した。
ら、５ｇ／リットル、すなわち１６mmol／リットル濃度
で二重蒸留水に溶解しそして５規定塩酸でpH１.５に調
節した。ペニシリンＧをこの溶液に撹拌しながら２００
mg／リットル、すなわち０.５６mmol／リットルの最終
濃度として添加した。
【０１１１】貯蔵溶液２：１.４mlの氷酢酸、１.５mlの
１規定ＮａＯＨおよび、２５０mgすなわち３mmolのＨ2
Ｏ2（尿素／過酸化水素アダクトとして）を９００mlの
二重蒸留水に添加した。溶解完了後、その混合物を二重
蒸留水で１リットルとした。
１規定ＮａＯＨおよび、２５０mgすなわち３mmolのＨ2
Ｏ2（尿素／過酸化水素アダクトとして）を９００mlの
二重蒸留水に添加した。溶解完了後、その混合物を二重
蒸留水で１リットルとした。
【０１１２】ＴＭＢ基質調製物：１容量部の貯蔵溶液１
と１０容量部の貯蔵溶液２とを混合した。
と１０容量部の貯蔵溶液２とを混合した。
【０１１３】実施例３
従来技術
例として用いたのは市販のＥＬＩＳＡテストキット（Ｈ
Ｐ １）であるが、このキットではＷＯ ８９／０４６６
９に記載されそして遺伝子工学により酵母で調製される
Ｃ−１００−３構築物が抗原として用いられている。ヒ
トの血清および血漿を検査するための手順は製造元の包
装への差し込みに示されたものとした。例えば検体希釈
は１：１１とし、血清のインキュベーションは１時間行
い、抗ヒトＩｇＧ／ＰＯＤ接合体のインキュベーション
は１時間行い、そしてＯ−フェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ）を基質とする酵素基質系を用い、４９２nmで光度測
定を行い、そして限界を設定した（０.４０Ｅの閾値を
陰性コントロールの平均値に加える）。
Ｐ １）であるが、このキットではＷＯ ８９／０４６６
９に記載されそして遺伝子工学により酵母で調製される
Ｃ−１００−３構築物が抗原として用いられている。ヒ
トの血清および血漿を検査するための手順は製造元の包
装への差し込みに示されたものとした。例えば検体希釈
は１：１１とし、血清のインキュベーションは１時間行
い、抗ヒトＩｇＧ／ＰＯＤ接合体のインキュベーション
は１時間行い、そしてＯ−フェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ）を基質とする酵素基質系を用い、４９２nmで光度測
定を行い、そして限界を設定した（０.４０Ｅの閾値を
陰性コントロールの平均値に加える）。
【０１１４】Ｃ−１００構築物のほかにコア領域および
ＮＳＰ３領域（Ｃ３３Ｃ）からの付加的エピトープを含
むもう一つの市販のＥＬＩＳＡ（ＨＰ ２）に対して全
く同様の手順を用いた。すなわち、ヒトの検体の検査に
オリジナルテストキットを前述の如く製造元により説明
された手順に関するすべての説明を順守して用いた。
ＮＳＰ３領域（Ｃ３３Ｃ）からの付加的エピトープを含
むもう一つの市販のＥＬＩＳＡ（ＨＰ ２）に対して全
く同様の手順を用いた。すなわち、ヒトの検体の検査に
オリジナルテストキットを前述の如く製造元により説明
された手順に関するすべての説明を順守して用いた。
【０１１５】これに対し、前記二種類の市販品を用いて
チンパンジーの血清または血漿中のＨＣＶ−特異的抗体
を測定するための手順ではヒトＩｇＧに対するウサギで
調製されたポリクローナル抗体を検出に用いた。このた
めに、ウサギ抗血清のＩｇＧ画分を実施例２に記載のと
おり精製し、透析しそしてペルオキシターゼ（ＰＯＤ）
で標識した。予備テストで確認されたヒトＩｇＧに対す
る抗体の交叉反応をチンパンジーＩｇＧに信頼性よく適
応させる（fashion over）ために、その最終濃度をモノ
クローナル抗−ＩｇＧ／ＰＯＤ接合体濃度の４倍に調節
した。
チンパンジーの血清または血漿中のＨＣＶ−特異的抗体
を測定するための手順ではヒトＩｇＧに対するウサギで
調製されたポリクローナル抗体を検出に用いた。このた
めに、ウサギ抗血清のＩｇＧ画分を実施例２に記載のと
おり精製し、透析しそしてペルオキシターゼ（ＰＯＤ）
で標識した。予備テストで確認されたヒトＩｇＧに対す
る抗体の交叉反応をチンパンジーＩｇＧに信頼性よく適
応させる（fashion over）ために、その最終濃度をモノ
クローナル抗−ＩｇＧ／ＰＯＤ接合体濃度の４倍に調節
した。
【０１１６】すべてのチンパンジーの初期値が高い値を
示したので表１４〜１６に記載の如く限界設定を改める
必要があった（表１４〜１６参照）。
示したので表１４〜１６に記載の如く限界設定を改める
必要があった（表１４〜１６参照）。
【０１１７】ＨＩＶ １およびＨＩＶ ２抗体の非鑑別測
定のための比較用抗−ＨＩＶ １＋２組合せテストは、
合成的に調製されたＨＩＶ １およびＨＩＶ ２のペプチ
ドに基づく市販品（ＨＰ ３）である。このテストの手
順も製造元の包装への差し込みのそれとしたところ、例
えば検体希釈は１：２とし、血清のインキュベーション
は３０分間とし、接合体（抗−ヒトＩｇＧ／ＰＯＤ）の
インキュベーションは３０分間とし、そしてテトラメチ
ルベンチジン（ＴＭＢ）を基質とする酵素基質系を用
い、４５０nmで光度測定を行い、そして限界を設定した
（０.２５０の閾値を陰性コントロールの平均値に加え
た）。
定のための比較用抗−ＨＩＶ １＋２組合せテストは、
合成的に調製されたＨＩＶ １およびＨＩＶ ２のペプチ
ドに基づく市販品（ＨＰ ３）である。このテストの手
順も製造元の包装への差し込みのそれとしたところ、例
えば検体希釈は１：２とし、血清のインキュベーション
は３０分間とし、接合体（抗−ヒトＩｇＧ／ＰＯＤ）の
インキュベーションは３０分間とし、そしてテトラメチ
ルベンチジン（ＴＭＢ）を基質とする酵素基質系を用
い、４５０nmで光度測定を行い、そして限界を設定した
（０.２５０の閾値を陰性コントロールの平均値に加え
た）。
【０１１８】実施例４
本発明によるペプチドを用いたＥＬＩＳＡによるＨＣＶ
に対する免疫グロブリンクラスＧのヒト抗体の測定 ペプチドまたはペプチド混合物を用いて前述の如くコー
ティングされたマイクロタイタープレートのウエル中、
０.３Ｍ ｔｒｉｓ、０.３Ｍ ＮａＣｌ、２０％ボビセリ
ンおよび０.１％ RTween２０を含む検体緩衝液５０μｌ
に５０μｌの血清または血漿を添加した。３７℃で３０
分間インキュベーション後、ウエル内容物を吸引除去
し、そしてそれらウエルをＰＢＳ中に１ｇ／リットル R
Tween２０を含有する洗浄用緩衝液で５回洗浄した。次
に最終希釈液中の接合体１００μｌを、好ましくはｔｒ
ｉｓ、０.５％Tween２０中の１：３０００の予備的希釈
液、および接合体緩衝液中の１：２６の最終希釈液を用
いて、ウエルに添加した。３７℃で３０分間インキュベ
ーション後、ウエル内容物を吸引除去しそして再び５回
洗浄した。次に１００μｌのＴＭＢ基質調製物を各ウエ
ルに加え、２０〜２２℃で３０分間インキュベートし、
そしてインキュベーションを１００μｌの１規定硫酸の
添加により止めた。着色溶液の吸光度をＰＢＳブランク
を基準として用いて４５０nmの波長で測定した
（Ｅ450）。
に対する免疫グロブリンクラスＧのヒト抗体の測定 ペプチドまたはペプチド混合物を用いて前述の如くコー
ティングされたマイクロタイタープレートのウエル中、
０.３Ｍ ｔｒｉｓ、０.３Ｍ ＮａＣｌ、２０％ボビセリ
ンおよび０.１％ RTween２０を含む検体緩衝液５０μｌ
に５０μｌの血清または血漿を添加した。３７℃で３０
分間インキュベーション後、ウエル内容物を吸引除去
し、そしてそれらウエルをＰＢＳ中に１ｇ／リットル R
Tween２０を含有する洗浄用緩衝液で５回洗浄した。次
に最終希釈液中の接合体１００μｌを、好ましくはｔｒ
ｉｓ、０.５％Tween２０中の１：３０００の予備的希釈
液、および接合体緩衝液中の１：２６の最終希釈液を用
いて、ウエルに添加した。３７℃で３０分間インキュベ
ーション後、ウエル内容物を吸引除去しそして再び５回
洗浄した。次に１００μｌのＴＭＢ基質調製物を各ウエ
ルに加え、２０〜２２℃で３０分間インキュベートし、
そしてインキュベーションを１００μｌの１規定硫酸の
添加により止めた。着色溶液の吸光度をＰＢＳブランク
を基準として用いて４５０nmの波長で測定した
（Ｅ450）。
【０１１９】０.１０より高いＥ450を生じた検体は抗−
ＨＣＶ陽性として分類し、Ｅ450が０.０５〜０.１０の
範囲であった検体は抗−ＨＣＶ境界（マージナル）とし
て分類し、そして０.０５より低いＥ450を生じた検体は
抗−ＨＣＶ陰性として分類した。
ＨＣＶ陽性として分類し、Ｅ450が０.０５〜０.１０の
範囲であった検体は抗−ＨＣＶ境界（マージナル）とし
て分類し、そして０.０５より低いＥ450を生じた検体は
抗−ＨＣＶ陰性として分類した。
【０１２０】表１は本発明ペプチド４０８３、および式
Ｉで示されるより小さな配列の混合物を用いたヒトの検
体についての実施例１、２および４に記載された測定か
ら得られた結果をまとめたものである。表２のデータも
同様にして本発明ペプチドＳＰ １０を用いて得られた
ものであり、両方のＥＬＩＳＡの結果をＨＰ １（実施
例３）のそれと比較してある。
Ｉで示されるより小さな配列の混合物を用いたヒトの検
体についての実施例１、２および４に記載された測定か
ら得られた結果をまとめたものである。表２のデータも
同様にして本発明ペプチドＳＰ １０を用いて得られた
ものであり、両方のＥＬＩＳＡの結果をＨＰ １（実施
例３）のそれと比較してある。
【０１２１】表１
ペプチド４０８３を含むＥＬＩＳＡ、および固相上のよ
り小さなペプチドの混合物を用いてヒトの検体の抗−Ｈ
ＣＶを測定した結果
り小さなペプチドの混合物を用いてヒトの検体の抗−Ｈ
ＣＶを測定した結果
【０１２２】
【表１】
【０１２３】１） ｎ＝９７検体は０.１０Ｅの限界に
おいて＞２５の割合となる≫２.５Ｅの吸光度を示し
た。
おいて＞２５の割合となる≫２.５Ｅの吸光度を示し
た。
【０１２４】２） ｎ＝９４検体は＞２.５Ｅの吸光度
を示した。それぞれわずか４および７検体の反応は比較
的弱かったが、Ｅ450値は０.８〜２.５（０.１０Ｅの限
界）であり依然としてどちらかというと強い反応であっ
た。
を示した。それぞれわずか４および７検体の反応は比較
的弱かったが、Ｅ450値は０.８〜２.５（０.１０Ｅの限
界）であり依然としてどちらかというと強い反応であっ
た。
【０１２５】表２
固相上に新規ペプチドＳＰ １０を含むＥＬＩＳＡを用
いてヒトの検体の抗−ＨＣＶを測定した結果
いてヒトの検体の抗−ＨＣＶを測定した結果
【０１２６】
【表２】
【０１２７】１） ｎ＝１４２検体は０.１Ｅの限界に
おいて≫２５の割合となる＞２.５Ｅの吸光度を示し
た；唯一の検体は１.２Ｅという値で比較的弱く反応し
たがそれでも市販ＥＬＩＳＡ（ＨＰ １）よりも相当に
強い反応であった。
おいて≫２５の割合となる＞２.５Ｅの吸光度を示し
た；唯一の検体は１.２Ｅという値で比較的弱く反応し
たがそれでも市販ＥＬＩＳＡ（ＨＰ １）よりも相当に
強い反応であった。
【０１２８】市販テスト（ＨＰ １）で抗−ＨＣＶ陽性
として分類されたすべての供試ヒト検体は同じく本発明
ペプチドに基づくすべてのＥＬＩＳＡにより陽性である
ことが認められた。市販テスト（ＨＰ １）の結果と極
めてよく一致するほか、ペプチドＥＬＩＳＡにおける極
めて強度の信号形成も注目すべきである。同時に、健常
供血者の縦断的検査結果からテストの干渉の受けやすさ
が極めて低いことが明らかとなっている。すなわち、血
清および血漿の健常供血者をテストしたところ、本発明
ペプチドに対する非特異的結合は極微にすぎなかった、
換言すれば誤った陽性結果はほんのわずかにすぎなかっ
た。
として分類されたすべての供試ヒト検体は同じく本発明
ペプチドに基づくすべてのＥＬＩＳＡにより陽性である
ことが認められた。市販テスト（ＨＰ １）の結果と極
めてよく一致するほか、ペプチドＥＬＩＳＡにおける極
めて強度の信号形成も注目すべきである。同時に、健常
供血者の縦断的検査結果からテストの干渉の受けやすさ
が極めて低いことが明らかとなっている。すなわち、血
清および血漿の健常供血者をテストしたところ、本発明
ペプチドに対する非特異的結合は極微にすぎなかった、
換言すれば誤った陽性結果はほんのわずかにすぎなかっ
た。
【０１２９】表３は、実施例１、２および４による式
（Ｉ）で示されるより小さな（１５アミノ酸）の使用に
基づくＥＬＩＳＡを用いてヒトの検体をテストした際に
得られたさらなる結果を示す。それらペプチドがＨＣＶ
抗体のエピトープ規定に適していること、そしていくつ
かのペプチドの混合物（好ましくは３〜６種のペプチド
を含有）としても抗−ＨＣＶ測定に適していることは明
らかである。
（Ｉ）で示されるより小さな（１５アミノ酸）の使用に
基づくＥＬＩＳＡを用いてヒトの検体をテストした際に
得られたさらなる結果を示す。それらペプチドがＨＣＶ
抗体のエピトープ規定に適していること、そしていくつ
かのペプチドの混合物（好ましくは３〜６種のペプチド
を含有）としても抗−ＨＣＶ測定に適していることは明
らかである。
【０１３０】表３
実施例１による、マイクロタイタープレート表面上にお
ける１５アミノ酸より成るより小さなペプチドとヒト抗
−ＨＣＶ陽性検体とのＥＬＩＳＡでの反応性；結果は４
５０nmにおける吸光度（Ｅ450）として報告する（−＝
０.１０Ｅより低い陰性値）
ける１５アミノ酸より成るより小さなペプチドとヒト抗
−ＨＣＶ陽性検体とのＥＬＩＳＡでの反応性；結果は４
５０nmにおける吸光度（Ｅ450）として報告する（−＝
０.１０Ｅより低い陰性値）
【０１３１】
【表３】
【０１３２】本発明ペプチドの混合物を用いて得られた
反応性が示されている。このペプチドＥＬＩＳＡにより
極めて強力な信号が形成されることから陽性および陰性
結果が信頼性をもって弁別されることは明らかである。
本発明による以下のペプチドまたはペプチド混合物を用
いても同様の結果が得られた。
反応性が示されている。このペプチドＥＬＩＳＡにより
極めて強力な信号が形成されることから陽性および陰性
結果が信頼性をもって弁別されることは明らかである。
本発明による以下のペプチドまたはペプチド混合物を用
いても同様の結果が得られた。
【０１３３】４０７４／４０８１（各２μｇ／ml）
４０７４／４０８２（０.５および０.１２５μｇ／ml）
４０６０／４０７１／４０８１（各２μｇ／ml）、約１
５ＡＡより成るより小さなペプチドの混合物が十分適し
ていることがわかった： ４０５６／４０５５および４０５２（各０.５μｇ／m
l）。
５ＡＡより成るより小さなペプチドの混合物が十分適し
ていることがわかった： ４０５６／４０５５および４０５２（各０.５μｇ／m
l）。
【０１３４】本発明ペプチドのすべてについてテストし
た結果いずれの場合にも、検体反応性の地理的起源への
依存性は認められなかった。
た結果いずれの場合にも、検体反応性の地理的起源への
依存性は認められなかった。
【０１３５】実施例５
ＥＬＩＳＡ測定の至適化
様々に変えたＥＬＩＳＡ測定の可変パラメータは主に、
コーティングに用いたペプチド濃度、またはペプチド混
合物の場合にあってはそれらの全濃度および相互比であ
り、接合体濃度は１：３０００および１：２６希釈比で
一定とした。さらにコーティング濃度は一定として接合
体の予備的希釈率を変えた。いずれの可変変数も供血者
の血清および血漿のテストによる特異性について、およ
び陽性群における抗−ＨＣＶ測定による感度について確
認した。さらにまた限界感度を抗−ＨＣＶ−陽性検体の
連続希釈（抗−ＨＣＶ−陰性血清中で１：２、１：４な
ど）による分析感度の形で測定しそして文献記載ペプチ
ドを用いて得られた結果に対すると全く同様にして市販
テストのデータと比較した。ヒトの検体について得られ
た結果を表４、５に例としてまとめる。
コーティングに用いたペプチド濃度、またはペプチド混
合物の場合にあってはそれらの全濃度および相互比であ
り、接合体濃度は１：３０００および１：２６希釈比で
一定とした。さらにコーティング濃度は一定として接合
体の予備的希釈率を変えた。いずれの可変変数も供血者
の血清および血漿のテストによる特異性について、およ
び陽性群における抗−ＨＣＶ測定による感度について確
認した。さらにまた限界感度を抗−ＨＣＶ−陽性検体の
連続希釈（抗−ＨＣＶ−陰性血清中で１：２、１：４な
ど）による分析感度の形で測定しそして文献記載ペプチ
ドを用いて得られた結果に対すると全く同様にして市販
テストのデータと比較した。ヒトの検体について得られ
た結果を表４、５に例としてまとめる。
【０１３６】表４、５
ペプチドＥＬＩＳＡ（４０８３）および市販テストによ
る抗−ＨＣＶ陽性血清および血漿の力価測定比較。比は
特定信号を限界値で割った商として報告されており、ま
た１よりも大きな値は陽性結果を示し、そして１より小
さな値は陰性結果を示す。
る抗−ＨＣＶ陽性血清および血漿の力価測定比較。比は
特定信号を限界値で割った商として報告されており、ま
た１よりも大きな値は陽性結果を示し、そして１より小
さな値は陰性結果を示す。
【０１３７】
【表４】
【０１３８】
【表５】
【０１３９】表４、５の結果から、血清力価測定の限界
感度によって測定される本発明ペプチドに基づくＥＬＩ
ＳＡの感度が比較のために同じ血清希釈比を用いてテス
トされた市販テストと少なくとも同程度に良いことは明
らかである。実際、多くの場合において、市販テスト
（ＨＰ １）においてすでに何回も陰性反応を与えてい
た希釈検体はこのペプチドＥＬＩＳＡによればなおも有
意に陽性であると測定された。従って全体としては、本
発明ペプチドを用いることによりＨＣＶ抗体の検出限界
が向上するという結果が得られた。同じく新規ペプチド
のその他のペプチド濃度、ペプチド配列または混合物を
用いても同様の結果が得られた；例えば ４０８３（０.２５μｇ／ml） ４０７４／４０８１（各０.２５μｇ／ml） ４０７４／４０８２（各０.５μｇ／ml） ４０７４／４０８２（０.５および０.１２５μｇ／ml） ４０６０／４０８２（各２μｇ／ml）
感度によって測定される本発明ペプチドに基づくＥＬＩ
ＳＡの感度が比較のために同じ血清希釈比を用いてテス
トされた市販テストと少なくとも同程度に良いことは明
らかである。実際、多くの場合において、市販テスト
（ＨＰ １）においてすでに何回も陰性反応を与えてい
た希釈検体はこのペプチドＥＬＩＳＡによればなおも有
意に陽性であると測定された。従って全体としては、本
発明ペプチドを用いることによりＨＣＶ抗体の検出限界
が向上するという結果が得られた。同じく新規ペプチド
のその他のペプチド濃度、ペプチド配列または混合物を
用いても同様の結果が得られた；例えば ４０８３（０.２５μｇ／ml） ４０７４／４０８１（各０.２５μｇ／ml） ４０７４／４０８２（各０.５μｇ／ml） ４０７４／４０８２（０.５および０.１２５μｇ／ml） ４０６０／４０８２（各２μｇ／ml）
【０１４０】限界感度の測定のほか、至適系の場合に
は、非−ＨＣＶ−特異的抗体およびその他の潜在的干渉
要因によって特異性についても検討した。その結果、本
発明ペプチドを用いた抗−ＨＣＶ測定はＨＣＶに対して
特異的であり、かついずれの既知の干渉、例えば他の抗
体との交叉反応、熱失活による干渉などを受けないこと
が明らかとなった。さらにこのことは相対応して、感度
を上げるべく均一に高血清濃度（検体緩衝液中１：２希
釈比）を用いた記載の他の新規ペプチドまたはペプチド
混合物についてもあてはまるが、それが可能であったの
はペプチドの純度および固相上の高い抗原密度によるも
のである。
は、非−ＨＣＶ−特異的抗体およびその他の潜在的干渉
要因によって特異性についても検討した。その結果、本
発明ペプチドを用いた抗−ＨＣＶ測定はＨＣＶに対して
特異的であり、かついずれの既知の干渉、例えば他の抗
体との交叉反応、熱失活による干渉などを受けないこと
が明らかとなった。さらにこのことは相対応して、感度
を上げるべく均一に高血清濃度（検体緩衝液中１：２希
釈比）を用いた記載の他の新規ペプチドまたはペプチド
混合物についてもあてはまるが、それが可能であったの
はペプチドの純度および固相上の高い抗原密度によるも
のである。
【０１４１】本発明のもう一つのコアペプチドであるＳ
Ｐ １０とＨＰ １の比較を表６、７にまとめるが、これ
からも本発明ペプチドが従来技術に比べ、この場合は限
界感度の向上すなわち分析感度の増大、を含む利点を有
していることは明らかである。表６、７中の四つの力価
測定は公表されているペプチドよりも２〜４倍も高い感
度で測定され、また市販テスト（ＨＰ １）と比較した
場合の倍率は８〜３２にものぼった。
Ｐ １０とＨＰ １の比較を表６、７にまとめるが、これ
からも本発明ペプチドが従来技術に比べ、この場合は限
界感度の向上すなわち分析感度の増大、を含む利点を有
していることは明らかである。表６、７中の四つの力価
測定は公表されているペプチドよりも２〜４倍も高い感
度で測定され、また市販テスト（ＨＰ １）と比較した
場合の倍率は８〜３２にものぼった。
【０１４２】表６、７
コアペプチド（ＳＰ １０，２μｇ／ml）に基づくＥＬ
ＩＳＡの分析感度の従来技術との比較。このために、陰
性ヒト血清中の抗−ＨＣＶ−陽性ヒト血清の連続希釈液
を調製し、そして本発明ペプチド（ＳＰ １０）に基づ
くＥＬＩＳＡによるテスト結果を市販ＨＣＶ ＥＬＩＳ
Ａ（ＨＰ１）および文献（OKAMOTO et al）の図２によ
り免疫関連ありと記載されているペプチドと比較した。
すべてのデータは吸光度（Ｅ450nm）を表わし、反応性
ありとされる結果には下線を施してある。
ＩＳＡの分析感度の従来技術との比較。このために、陰
性ヒト血清中の抗−ＨＣＶ−陽性ヒト血清の連続希釈液
を調製し、そして本発明ペプチド（ＳＰ １０）に基づ
くＥＬＩＳＡによるテスト結果を市販ＨＣＶ ＥＬＩＳ
Ａ（ＨＰ１）および文献（OKAMOTO et al）の図２によ
り免疫関連ありと記載されているペプチドと比較した。
すべてのデータは吸光度（Ｅ450nm）を表わし、反応性
ありとされる結果には下線を施してある。
【０１４３】
【表６】
【０１４４】
【表７】
【０１４５】本発明によるもう一つのコアペプチド（Ｓ
Ｐ ２３）の評価も同様の結果を与えた。表８に示され
た比較結果から、感度に関しＳＰ ２３がＳＰ １０と等
価であること、および両方ペプチドが文献記載のペプチ
ドよりも優れていることは明らかである。
Ｐ ２３）の評価も同様の結果を与えた。表８に示され
た比較結果から、感度に関しＳＰ ２３がＳＰ １０と等
価であること、および両方ペプチドが文献記載のペプチ
ドよりも優れていることは明らかである。
【０１４６】文献類似のペプチドＳＰ １２（ＡＡ ４７
−７５）は OKAMOTO et al.により記載されたペプチド
とは厳密には対応しないが、中間配列（ＳＰ １１、Ａ
２４−５３，表８）についての結果から、次の配列領域
（ＡＡ ３９−４７）には免疫関連エピトープは存在し
ないことは明らかであり、そしてＳＰ １１の極めて弱
い反応性（なおも検出可能ではある）はそこに含まれる
カルボキシ末端領域（図３に示されたオーバーラップ領
域ＡＡ ２４−３０）によるものとすることができる。
−７５）は OKAMOTO et al.により記載されたペプチド
とは厳密には対応しないが、中間配列（ＳＰ １１、Ａ
２４−５３，表８）についての結果から、次の配列領域
（ＡＡ ３９−４７）には免疫関連エピトープは存在し
ないことは明らかであり、そしてＳＰ １１の極めて弱
い反応性（なおも検出可能ではある）はそこに含まれる
カルボキシ末端領域（図３に示されたオーバーラップ領
域ＡＡ ２４−３０）によるものとすることができる。
【０１４７】表８
本発明による２種類のペプチドおよび公表された配列
（ＡＡ ３９−７５，OKAMOTO et al.）と新規構造物の
間に位置するアミノ酸配列（ＳＰ １１，ＡＡ ２４−５
３，図３も参照されたし）のＥＬＩＳＡにおける免疫反
応性の比較。すべてのデータは吸光度（Ｅ450nm）を表
わす。
（ＡＡ ３９−７５，OKAMOTO et al.）と新規構造物の
間に位置するアミノ酸配列（ＳＰ １１，ＡＡ ２４−５
３，図３も参照されたし）のＥＬＩＳＡにおける免疫反
応性の比較。すべてのデータは吸光度（Ｅ450nm）を表
わす。
【０１４８】
【表８】
【０１４９】感度に関するこの驚くべき利点は未希釈検
体のテストの際に特に明らかとなる。すなわち、表９に
示された１１抗−ＨＣＶ−陽性検体のうち１１すべての
検体が本発明ペプチドと反応することがわかった。これ
に対し文献記載のペプチドの場合にはわずか６検体しか
陽性とならず、また市販テスト（ＨＰ １）で陽性反応
示した例は全くなかった。両ペプチドと陽性反応する検
体に関し、本発明ペプチドの方が同じテスト条件下にお
いて有意により強く反応することが顕著であるが、この
ことは、特に陽性／陰性弁別に対し相当な利点を与え
る。
体のテストの際に特に明らかとなる。すなわち、表９に
示された１１抗−ＨＣＶ−陽性検体のうち１１すべての
検体が本発明ペプチドと反応することがわかった。これ
に対し文献記載のペプチドの場合にはわずか６検体しか
陽性とならず、また市販テスト（ＨＰ １）で陽性反応
示した例は全くなかった。両ペプチドと陽性反応する検
体に関し、本発明ペプチドの方が同じテスト条件下にお
いて有意により強く反応することが顕著であるが、この
ことは、特に陽性／陰性弁別に対し相当な利点を与え
る。
【０１５０】表９
ペプチドＥＬＩＳＡ（ＳＰ １０ ２μｇ／ml）の感度と
従来技術との比較。このために、選ばれた１１個の自然
の（native）ヒト抗−ＨＣＶ−陽性検体を本発明ペプチ
ドに基づくＥＬＩＳＡでテストし、市販テスト（ＨＰ
１）と、および文献（OKAMOTO et al.）において図３に
より免疫関連ありとして記載されているペプチドと比較
した。すべてのデータは吸光度（Ｅ450nm）を表わす。
抗−ＨＣＶ−陽性検体ＨＣ ９０−４９５もコントロー
ルとしてテストした。
従来技術との比較。このために、選ばれた１１個の自然
の（native）ヒト抗−ＨＣＶ−陽性検体を本発明ペプチ
ドに基づくＥＬＩＳＡでテストし、市販テスト（ＨＰ
１）と、および文献（OKAMOTO et al.）において図３に
より免疫関連ありとして記載されているペプチドと比較
した。すべてのデータは吸光度（Ｅ450nm）を表わす。
抗−ＨＣＶ−陽性検体ＨＣ ９０−４９５もコントロー
ルとしてテストした。
【０１５１】
【表９】
【０１５２】コアペプチドを用いた力価測定（表６、
７）および予め選ばれた自然血清から導かれたこれらの
結果（表９）は市販血清パネル（ロット番号ＰＨＶ １
０１およびロット番号ＰＨＶ ２０１，Boston Biomedic
a, 米国）に対するテスト結果により確認された。
７）および予め選ばれた自然血清から導かれたこれらの
結果（表９）は市販血清パネル（ロット番号ＰＨＶ １
０１およびロット番号ＰＨＶ ２０１，Boston Biomedic
a, 米国）に対するテスト結果により確認された。
【０１５３】特に、いわゆる低力価抗−ＨＣＶパネルの
結果は表１０、１１にまとめ、そして混合力価抗−ＨＣ
Ｖパネルの結果は表１２、１３にまとめる。本発明によ
るコアペプチドを用いて得られたデータ結果を従来技術
としての市販テストを用いて得られたデータと比較す
る。
結果は表１０、１１にまとめ、そして混合力価抗−ＨＣ
Ｖパネルの結果は表１２、１３にまとめる。本発明によ
るコアペプチドを用いて得られたデータ結果を従来技術
としての市販テストを用いて得られたデータと比較す
る。
【０１５４】表１０、１１
表１０、１１は１５個の低力価で十分確認された抗−Ｈ
ＣＶ−陽性検体より成るパネルＰＨＶ １０１の自然抗
−ＨＣＶ−陽性検体について、ペプチドＥＬＩＳＡ（Ｓ
Ｐ １０，２μｇ／ml）の感度を従来技術と比較したも
のである（材料および比較テスト結果は Boston Biomed
ica（米国）により上市されたもの）。すべてのＥＬＩ
ＳＡデータは比の値、すなわち検体吸光度のカットオフ
に対する比のである。＜１.０の値は陰性とし、また＞
１.０は陽性とする。
ＣＶ−陽性検体より成るパネルＰＨＶ １０１の自然抗
−ＨＣＶ−陽性検体について、ペプチドＥＬＩＳＡ（Ｓ
Ｐ １０，２μｇ／ml）の感度を従来技術と比較したも
のである（材料および比較テスト結果は Boston Biomed
ica（米国）により上市されたもの）。すべてのＥＬＩ
ＳＡデータは比の値、すなわち検体吸光度のカットオフ
に対する比のである。＜１.０の値は陰性とし、また＞
１.０は陽性とする。
【０１５５】
【表１０】
【０１５６】
【表１１】
【０１５７】表１０、１１より、一つの例外（ＰＨＶ
０１−０３）はあるが、すべての抗−ＨＣＶ−陽性検体
が新規ペプチドに対し正しい陽性反応を与えることは明
らかである。市販テストとの比較により、検体信号：カ
ットオフ比により表わされる信号強度は比較のためにテ
ストされるアッセイよりも本発明ペプチドを用いた場合
の方が著しく強いことが顕著であるが、このことは新規
ペプチドＥＬＩＳＡの信頼性が著しく向上したことを示
している。
０１−０３）はあるが、すべての抗−ＨＣＶ−陽性検体
が新規ペプチドに対し正しい陽性反応を与えることは明
らかである。市販テストとの比較により、検体信号：カ
ットオフ比により表わされる信号強度は比較のためにテ
ストされるアッセイよりも本発明ペプチドを用いた場合
の方が著しく強いことが顕著であるが、このことは新規
ペプチドＥＬＩＳＡの信頼性が著しく向上したことを示
している。
【０１５８】これらのデータ（＞２５の比、これは＞
２.５の吸光度に相当する）によれば、従来技術の定義
により検体は低力価にすぎず、驚くべきことに新規ペプ
チドとは強い反応性を示すことがわかる。
２.５の吸光度に相当する）によれば、従来技術の定義
により検体は低力価にすぎず、驚くべきことに新規ペプ
チドとは強い反応性を示すことがわかる。
【０１５９】前記の一つの例外（検体０３）は本検体中
にはコア特異的抗体が存在しないことを実証する確認テ
ストにおける比較結果のデータによって説明される（Ｃ
２２ｃは遺伝子工学により大腸菌において調製されるコ
アタンパク質である）。このテストによれば、検体０３
は実際陰性として分類されるべきである。
にはコア特異的抗体が存在しないことを実証する確認テ
ストにおける比較結果のデータによって説明される（Ｃ
２２ｃは遺伝子工学により大腸菌において調製されるコ
アタンパク質である）。このテストによれば、検体０３
は実際陰性として分類されるべきである。
【０１６０】表１２、１３にまとめられた第２パネルに
ついてのテストからも同様の所見が得られた：全部で２
２抗−ＨＣＶ−陽性検体のうちの１９検体は、驚くべき
ことに、吸光度が２.５よりも大きく（＞２５の比に相
当する）極めて強い陽性であることがわかる。パネルに
含まれる３つの抗−ＨＣＶ−陰性血清は正しく陰性（＜
１.０の比）として分類される。最後に、検体Ｎｏ.ＰＨ
Ｖ ２０１−０８、−１０および−２０も問題の範囲内
で正しいことがわかる。何故ならば、これら検体は確認
テストによりコア特異的抗体を全く（−０８および−１
０）またはほとんど（−２０）を示さないからである。
ついてのテストからも同様の所見が得られた：全部で２
２抗−ＨＣＶ−陽性検体のうちの１９検体は、驚くべき
ことに、吸光度が２.５よりも大きく（＞２５の比に相
当する）極めて強い陽性であることがわかる。パネルに
含まれる３つの抗−ＨＣＶ−陰性血清は正しく陰性（＜
１.０の比）として分類される。最後に、検体Ｎｏ.ＰＨ
Ｖ ２０１−０８、−１０および−２０も問題の範囲内
で正しいことがわかる。何故ならば、これら検体は確認
テストによりコア特異的抗体を全く（−０８および−１
０）またはほとんど（−２０）を示さないからである。
【０１６１】表１２、１３は、様々な抗−ＨＣＶ力価を
有する十分確認された抗−ＨＣＶ−陽性検体より成るパ
ネルＰＨＶ ２０１の自然抗−ＨＣＶ−陽性検体につい
てペプチドＥＬＩＳＡ（ＳＰ １０，２μｇ／ml）の感
度を従来技術と比較したものである。（材料および比較
テスト結果は Boston Biomedica により上市されたもの
である）。すべてのＥＬＩＳＡデータは検体吸光度をカ
ットオフ値で割った商である比として与えられる。＜
１.０の値は陰性結果を表わし、そして＞１.０の値は陽
性結果を表わす。
有する十分確認された抗−ＨＣＶ−陽性検体より成るパ
ネルＰＨＶ ２０１の自然抗−ＨＣＶ−陽性検体につい
てペプチドＥＬＩＳＡ（ＳＰ １０，２μｇ／ml）の感
度を従来技術と比較したものである。（材料および比較
テスト結果は Boston Biomedica により上市されたもの
である）。すべてのＥＬＩＳＡデータは検体吸光度をカ
ットオフ値で割った商である比として与えられる。＜
１.０の値は陰性結果を表わし、そして＞１.０の値は陽
性結果を表わす。
【０１６２】
【表１２】
【０１６３】
【表１３】
【０１６４】実施例６
本発明ペプチドを用いたＥＬＩＳＡによるチンパンジー
血清中の抗−ＨＣＶの測定 マイクロタイタープレートのウエルに吸着させた様々な
ペプチドおよびペプチド混合物を様々な感染量のＮＡＮ
ＢＶに感染したチンパンジーからの血清を用いて試験し
た。接種後２週間ごとに採取した一連の検体を市販テス
トを用いてＧＯＴだけでなくＧＰＴについても測定し、
またすべての検体を並行的にかつ本発明ペプチドを用い
たＥＬＩＳＡにより測定した。実施例３の市販テスト
（ＨＰ １）と同様に、ペプチドＥＬＩＳＡにはＰＯＤ
で標識されたポリクローナルウサギ抗体を４倍濃縮して
検出に用い、また酵素基質ＴＭＢを用いて４５０nmで光
度測定を行った。テスト手順は前述のヒト抗−ＨＣＶ測
定に対応するものとし、０.１Ｅを固定限界としまた表
１４、１５、１６の結果は特定の吸光度のこのカットオ
フ値に対する割合（比）として示したものである。
血清中の抗−ＨＣＶの測定 マイクロタイタープレートのウエルに吸着させた様々な
ペプチドおよびペプチド混合物を様々な感染量のＮＡＮ
ＢＶに感染したチンパンジーからの血清を用いて試験し
た。接種後２週間ごとに採取した一連の検体を市販テス
トを用いてＧＯＴだけでなくＧＰＴについても測定し、
またすべての検体を並行的にかつ本発明ペプチドを用い
たＥＬＩＳＡにより測定した。実施例３の市販テスト
（ＨＰ １）と同様に、ペプチドＥＬＩＳＡにはＰＯＤ
で標識されたポリクローナルウサギ抗体を４倍濃縮して
検出に用い、また酵素基質ＴＭＢを用いて４５０nmで光
度測定を行った。テスト手順は前述のヒト抗−ＨＣＶ測
定に対応するものとし、０.１Ｅを固定限界としまた表
１４、１５、１６の結果は特定の吸光度のこのカットオ
フ値に対する割合（比）として示したものである。
【０１６５】表１４、１５、１６
市販テスト（ＨＰ １）およびＮＳＰ ４領域からの本発
明ペプチドまたはペプチド混合物を用いたＥＬＩＳＡに
よるチンパンジー検体の抗−ＨＣＶ測定。最初の３回値
のデータは限界の設定に用いる吸光度であり、以後はそ
れをもとに特定信号と限界の比を求めた。
明ペプチドまたはペプチド混合物を用いたＥＬＩＳＡに
よるチンパンジー検体の抗−ＨＣＶ測定。最初の３回値
のデータは限界の設定に用いる吸光度であり、以後はそ
れをもとに特定信号と限界の比を求めた。
【０１６６】
【表１４】
【０１６７】
【表１５】
【０１６８】
【表１６】
【０１６９】表１４、１５、１６に示された結果は、特
にＡＬＴ経過（course）および市販テスト（ＨＰ １）
からの相当する結果との比較において、本発明ペプチド
の利点を際立たせている。
にＡＬＴ経過（course）および市販テスト（ＨＰ １）
からの相当する結果との比較において、本発明ペプチド
の利点を際立たせている。
【０１７０】すなわち、例えば、動物Ｎｏ.１２３は肝
生検標本の電顕検査ではＮＡＮＢＨが検出されたのに市
販テスト（ＨＰ １）では全く抗体−陽性とされていな
い。これに対し、４０８３に基づくＥＬＩＳＡを用いれ
ば信頼性あるＨＣＶ抗体検出がＡＬＴ増加とほぼ同時に
可能である。
生検標本の電顕検査ではＮＡＮＢＨが検出されたのに市
販テスト（ＨＰ １）では全く抗体−陽性とされていな
い。これに対し、４０８３に基づくＥＬＩＳＡを用いれ
ば信頼性あるＨＣＶ抗体検出がＡＬＴ増加とほぼ同時に
可能である。
【０１７１】特に、動物Ｎｏ.０４８においては前述の
すべてのペプチドまたはペプチド混合物を用いることに
より陽性／陰性が鋭敏に弁別されるという意味におい
て、極めて信頼性ある抗−ＨＣＶ検出がＡＬＴ増大とほ
ぼ同時にまた市販テスト（ＨＰ１）の平均１８週間前に
行われることから、ペプチドＥＬＩＳＡ結果がＡＬＴレ
ベル増大と時間的に一致することは明らかである。ペプ
チド間を比較すると、４０６０と４０８１（アミノ−お
よびカルボキシル−末端配列）および中央構造を構成す
る４０９０の比較から明らかなように、中央アミノ酸配
列が式Ｉの完全ペプチド（４０８３）による初期ＨＣＶ
抗体認識に相当寄与していることが特に明白である。
すべてのペプチドまたはペプチド混合物を用いることに
より陽性／陰性が鋭敏に弁別されるという意味におい
て、極めて信頼性ある抗−ＨＣＶ検出がＡＬＴ増大とほ
ぼ同時にまた市販テスト（ＨＰ１）の平均１８週間前に
行われることから、ペプチドＥＬＩＳＡ結果がＡＬＴレ
ベル増大と時間的に一致することは明らかである。ペプ
チド間を比較すると、４０６０と４０８１（アミノ−お
よびカルボキシル−末端配列）および中央構造を構成す
る４０９０の比較から明らかなように、中央アミノ酸配
列が式Ｉの完全ペプチド（４０８３）による初期ＨＣＶ
抗体認識に相当寄与していることが特に明白である。
【０１７２】ＡＬＴとほぼ同時の同様のＨＣＶ抗体の初
期確認結果は動物Ｎｏ.１４７の実験によっても得ら
れ、その場合にはＡＬＴ増大とほぼ同時に、この場合に
も市販テスト（ＨＰ １）を用いた場合よりも約１６〜
１８週間早く信頼性ある抗体検出が可能である。
期確認結果は動物Ｎｏ.１４７の実験によっても得ら
れ、その場合にはＡＬＴ増大とほぼ同時に、この場合に
も市販テスト（ＨＰ １）を用いた場合よりも約１６〜
１８週間早く信頼性ある抗体検出が可能である。
【０１７３】表１７および表１８
ＨＣＶ感染した２匹のチンパンジーからの血清検体中の
抗−ＨＣＶ測定。市販テスト（ＨＰ １）による結果を
合成的に製造された本発明によるコアペプチド（ＳＰ
１０，２μｇ／ml）と対比して示す。それら結果は特定
信号と限界の比として示す。
抗−ＨＣＶ測定。市販テスト（ＨＰ １）による結果を
合成的に製造された本発明によるコアペプチド（ＳＰ
１０，２μｇ／ml）と対比して示す。それら結果は特定
信号と限界の比として示す。
【０１７４】
【表１７】
【０１７５】
【表１８】
【０１７６】新規コアペプチドについて表１７および１
８に示された結果は、特にＡＬＴ経過および市販ＥＬＩ
ＳＡ（ＨＰ １）の対応結果と比較することにより、本
発明ペプチドの利点を強調している。
８に示された結果は、特にＡＬＴ経過および市販ＥＬＩ
ＳＡ（ＨＰ １）の対応結果と比較することにより、本
発明ペプチドの利点を強調している。
【０１７７】特に、動物Ｎｏ.０４８においては陽性／
陰性が鋭敏に弁別されるという意味において極めて信頼
性ある抗−ＨＣＶ検出がＡＬＴ増大とほぼ同時にまた市
販テスト（ＨＰ １）の平均２０週間前に行われること
から、コアペプチドＥＬＩＳＡ結果がＡＬＴ増大と時間
的に一致することは明らかである。
陰性が鋭敏に弁別されるという意味において極めて信頼
性ある抗−ＨＣＶ検出がＡＬＴ増大とほぼ同時にまた市
販テスト（ＨＰ １）の平均２０週間前に行われること
から、コアペプチドＥＬＩＳＡ結果がＡＬＴ増大と時間
的に一致することは明らかである。
【０１７８】ＡＬＴとほぼ同時の同様のＨＣＶ抗体初期
確認結果は動物Ｎｏ.１４７の試験によっても得られ、
その場合、市販テスト（ＨＰ １）よりも約４週間早く
信頼性あるＨＣＶ抗体検出が可能である。
確認結果は動物Ｎｏ.１４７の試験によっても得られ、
その場合、市販テスト（ＨＰ １）よりも約４週間早く
信頼性あるＨＣＶ抗体検出が可能である。
【０１７９】全体として、本発明によるペプチドおよび
免疫化学的検出方法へのそれらの使用は、遺伝子工学に
より製造されたタンパク質および従来技術の他の合成ペ
プチドに基づくこれまでに記載されたすべての方法より
も相当に高感度であることがわかる。感染後期における
感度向上の故に、新規ペプチドは付加的に、初期ＨＣＶ
抗体を信頼性をもって測定することができる、従って現
存している診断ギャップが著しく低下するという相当な
利点を提供する。さらにまた、本発明によるペプチドは
非特異的結合に対して感度が相当に低いが、これは動物
の検体および人間起源の検体のいずれについても、市販
テスト（ＨＰ １）に比べバックグラウンドが激減する
（市販テスト（ＨＰ １）の場合最大０.４Ｅ492である
のに対し最大０.１０Ｅ450）ことによって少なからず表
わされ、従って相当鋭敏な陰性／陽性弁別が可能とな
る。最後に、記述すべき有利な点は、全体的測定時間が
短縮されることおよび検体量が５０μｌで比較的正確に
ペピットでとることができるので、正確度が増すことで
ある。
免疫化学的検出方法へのそれらの使用は、遺伝子工学に
より製造されたタンパク質および従来技術の他の合成ペ
プチドに基づくこれまでに記載されたすべての方法より
も相当に高感度であることがわかる。感染後期における
感度向上の故に、新規ペプチドは付加的に、初期ＨＣＶ
抗体を信頼性をもって測定することができる、従って現
存している診断ギャップが著しく低下するという相当な
利点を提供する。さらにまた、本発明によるペプチドは
非特異的結合に対して感度が相当に低いが、これは動物
の検体および人間起源の検体のいずれについても、市販
テスト（ＨＰ １）に比べバックグラウンドが激減する
（市販テスト（ＨＰ １）の場合最大０.４Ｅ492である
のに対し最大０.１０Ｅ450）ことによって少なからず表
わされ、従って相当鋭敏な陰性／陽性弁別が可能とな
る。最後に、記述すべき有利な点は、全体的測定時間が
短縮されることおよび検体量が５０μｌで比較的正確に
ペピットでとることができるので、正確度が増すことで
ある。
【０１８０】実施例７
ＮＳＰ ４ペプチド４０８３およびコアペプチドＳＰ １
０の混合物を調製するためのペプチド溶液の調製、およ
びこのペプチド混合物によるマイクロタイタープレート
のコーティング 各々６mg／mlのペプチドを含む蒸留水中の５０％酢酸中
のペプチドＳＰ １０および４０８３の貯蔵溶液から０.
１０Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９.６）中の連続２倍希
釈液を調製した。すなわち、ペプチド濃度が５０、２
５、１２.５、６.２５、３.１２、１.５６、０.７８、
０.３９、０.２、０.１、０.０５および０.０１μｇ／m
lである一連の希釈液を得た。個別ペプチドの混合物に
ついても手順は同様とし、０.１Ｍ重炭酸ナトリウムに
希釈することにより、前述の通りの全体的最終濃度であ
るがいくつかのペプチドの混合物の場合にあってはそれ
を等濃度で（１：１混合物の場合）または相互に対し様
々な割合で含むものを得るために、前記貯蔵液を付加的
に例えば１０：１または１：４というように様々な割合
で混合した。
０の混合物を調製するためのペプチド溶液の調製、およ
びこのペプチド混合物によるマイクロタイタープレート
のコーティング 各々６mg／mlのペプチドを含む蒸留水中の５０％酢酸中
のペプチドＳＰ １０および４０８３の貯蔵溶液から０.
１０Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９.６）中の連続２倍希
釈液を調製した。すなわち、ペプチド濃度が５０、２
５、１２.５、６.２５、３.１２、１.５６、０.７８、
０.３９、０.２、０.１、０.０５および０.０１μｇ／m
lである一連の希釈液を得た。個別ペプチドの混合物に
ついても手順は同様とし、０.１Ｍ重炭酸ナトリウムに
希釈することにより、前述の通りの全体的最終濃度であ
るがいくつかのペプチドの混合物の場合にあってはそれ
を等濃度で（１：１混合物の場合）または相互に対し様
々な割合で含むものを得るために、前記貯蔵液を付加的
に例えば１０：１または１：４というように様々な割合
で混合した。
【０１８１】それぞれについて、１００μｌの希釈液を
マイクロタイタープレート、タイプＢ（Nunc, Roskild
e，デンマークにより供給されたもの）の１６ウエルに
入れた。希釈液を入れたテストプレートを２０℃で１８
時間放置し、次いでウエル内の溶液を吸引により除去
し、そしてそれらウエルをリン酸緩衝生理学的食塩水
（ＰＢＳ，ｐＨ７.４）中の１０ｇ／リットル牛血清ア
ルブミンの溶液３００μｌを用いて充填および吸引除去
により３〜４回洗浄し、そしてそれらテストプレートを
次いでシリカゲル上、２０℃で乾燥した。
マイクロタイタープレート、タイプＢ（Nunc, Roskild
e，デンマークにより供給されたもの）の１６ウエルに
入れた。希釈液を入れたテストプレートを２０℃で１８
時間放置し、次いでウエル内の溶液を吸引により除去
し、そしてそれらウエルをリン酸緩衝生理学的食塩水
（ＰＢＳ，ｐＨ７.４）中の１０ｇ／リットル牛血清ア
ルブミンの溶液３００μｌを用いて充填および吸引除去
により３〜４回洗浄し、そしてそれらテストプレートを
次いでシリカゲル上、２０℃で乾燥した。
【０１８２】１μｇ／mlの４０８３および１μｇ／mlの
ＳＰ １０濃度がペプチド混合物のコーティングに適し
ていることがわかったが、これは表１９〜２１にまとめ
られそして実施例４および５に記載の如く行って得られ
た結果の基礎をなすものである。従来技術とのこれまで
の比較とは対照的に、これからの比較はすべて実施例３
に記載の如き市販の第２世代の抗−ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ
（ＨＰ ２）に関連したものとなる。
ＳＰ １０濃度がペプチド混合物のコーティングに適し
ていることがわかったが、これは表１９〜２１にまとめ
られそして実施例４および５に記載の如く行って得られ
た結果の基礎をなすものである。従来技術とのこれまで
の比較とは対照的に、これからの比較はすべて実施例３
に記載の如き市販の第２世代の抗−ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ
（ＨＰ ２）に関連したものとなる。
【０１８３】表１９および２０：本発明によるＥＬＩＳ
Ａおよび市販のＨＰ ２に基づくデータは、いわゆる終
点力価（end point titer）であり、これをもって抗−
ＨＣＶ−陰性血清中の血清の最高予備希釈率（所与のテ
ストにおいて再現性よく陽性であることが認められたも
の）が規定される。
Ａおよび市販のＨＰ ２に基づくデータは、いわゆる終
点力価（end point titer）であり、これをもって抗−
ＨＣＶ−陰性血清中の血清の最高予備希釈率（所与のテ
ストにおいて再現性よく陽性であることが認められたも
の）が規定される。
【０１８４】
【表１９】
【０１８５】
【表２０】
【０１８６】表２１
血清および血漿を同時に得た９３０名の健常供血者に対
するテスト結果
するテスト結果
【表２１】
【０１８７】実施例８
式XVIII、XIX、XXおよびXXIIで示されるペプチドを用い
て式XIVによる混合物を調製するためのペプチド溶液の
調製、およびこれらペプチド混合物によるマイクロタイ
タープレートのコーティング ポリペプチドＳＰＨ ９（式XVIII）、ＳＰＨ ２０（式X
IX）、４０８３（式XX）およびＳＰ １０（式XXII）を
５０％酢酸（v/v）に６mg／ml濃度となるように溶解し
た。
て式XIVによる混合物を調製するためのペプチド溶液の
調製、およびこれらペプチド混合物によるマイクロタイ
タープレートのコーティング ポリペプチドＳＰＨ ９（式XVIII）、ＳＰＨ ２０（式X
IX）、４０８３（式XX）およびＳＰ １０（式XXII）を
５０％酢酸（v/v）に６mg／ml濃度となるように溶解し
た。
【０１８８】これら４種類の貯蔵溶液を実施例４に記載
の如く様々な容量基準比で混合しそしてポリペプチド総
濃度が０.２〜８μｇ／mlとなるように０.１０Ｍ重炭酸
ナトリウム（ｐＨ９.６）に希釈した。
の如く様々な容量基準比で混合しそしてポリペプチド総
濃度が０.２〜８μｇ／mlとなるように０.１０Ｍ重炭酸
ナトリウム（ｐＨ９.６）に希釈した。
【０１８９】それぞれについて、１００μｌの各希釈溶
液をマイクロタイター、タイプＢ（Nunc, Roskilde, デ
ンマークにより供給されたもの）の１６ウエルに入れ
た。充填されたテストプレートを２０℃で１８時間イン
キュベートした。次にそれら溶液を吸引により除去し、
そしてそれらウエルをリン酸緩衝生理学的食塩水（ＰＢ
Ｓ，ｐＨ７.４）中の１０ｇ／リットル牛血清アルブミ
ンの溶液３００μｌを用いて３〜４回洗浄しそしてそれ
らテストプレートを次いでシリカゲル上、２０℃で乾燥
した。
液をマイクロタイター、タイプＢ（Nunc, Roskilde, デ
ンマークにより供給されたもの）の１６ウエルに入れ
た。充填されたテストプレートを２０℃で１８時間イン
キュベートした。次にそれら溶液を吸引により除去し、
そしてそれらウエルをリン酸緩衝生理学的食塩水（ＰＢ
Ｓ，ｐＨ７.４）中の１０ｇ／リットル牛血清アルブミ
ンの溶液３００μｌを用いて３〜４回洗浄しそしてそれ
らテストプレートを次いでシリカゲル上、２０℃で乾燥
した。
【０１９０】実施例９
コーティング混合物のためのＨＩＶ １、ＨＩＶ ２およ
びＨＶＣペプチド濃度の至適化、およびＥＬＩＳＡ測定
および評価基準の至適化 実施例８に記載の４種類の貯蔵溶液について１：１：
１：１比（ｖ／ｖ）から開始してコーティング溶液中の
ＨＩＶ １、ＨＩＶ ２およびＨＶＣの各ペプチド最終濃
度（単位：μｇ／ml）となるように、各場合の他の３ペ
プチドを一定に保ちつつ４種類すべての可変含量を相互
に独立的に変化させた。すなわち などから ０.０５ ０.０５ ０.０５ ０.０５ まで。
びＨＶＣペプチド濃度の至適化、およびＥＬＩＳＡ測定
および評価基準の至適化 実施例８に記載の４種類の貯蔵溶液について１：１：
１：１比（ｖ／ｖ）から開始してコーティング溶液中の
ＨＩＶ １、ＨＩＶ ２およびＨＶＣの各ペプチド最終濃
度（単位：μｇ／ml）となるように、各場合の他の３ペ
プチドを一定に保ちつつ４種類すべての可変含量を相互
に独立的に変化させた。すなわち などから ０.０５ ０.０５ ０.０５ ０.０５ まで。
【０１９１】これら混合物を実施例８に記載の如くマイ
クロタイタープレートに固定しそして実施例４および５
に記載の如くＥＬＩＳＡで評価し、同じくペルオキシダ
ーゼ標識抗体濃度もヒト免疫グロブリンＧに対して至適
化した。
クロタイタープレートに固定しそして実施例４および５
に記載の如くＥＬＩＳＡで評価し、同じくペルオキシダ
ーゼ標識抗体濃度もヒト免疫グロブリンＧに対して至適
化した。
【０１９２】対応する陽性ヒト血清の陰性ヒト血清中の
連続希釈液により調製された低力価抗−ＨＩＶ １、抗
−ＨＩＶ ２および抗−ＨＣＶ検体より成る検体を用い
て至適化の評価を行った。さらに同じく、バックグラン
ド反応（すなわち所与の被覆されたマイクロタイタープ
レートへの非特異的結合）を規定できるようにいくつか
の抗−ＨＩＶおよび抗−ＨＣＶ−陰性検体についてもテ
ストした。
連続希釈液により調製された低力価抗−ＨＩＶ １、抗
−ＨＩＶ ２および抗−ＨＣＶ検体より成る検体を用い
て至適化の評価を行った。さらに同じく、バックグラン
ド反応（すなわち所与の被覆されたマイクロタイタープ
レートへの非特異的結合）を規定できるようにいくつか
の抗−ＨＩＶおよび抗−ＨＣＶ−陰性検体についてもテ
ストした。
【０１９３】選択基準として設定したのは、力価測定の
為の一連のヒト抗−ＨＩＶ−および抗−ＨＣＶ−陽性検
体の測定における最大の特異性を有する信号、すなわち
高い限界感度、と同時に、抗−ＨＩＶ−および抗−ＨＣ
Ｖ−陰性検体に対するテストにおける低いバックグラン
ドである。
為の一連のヒト抗−ＨＩＶ−および抗−ＨＣＶ−陽性検
体の測定における最大の特異性を有する信号、すなわち
高い限界感度、と同時に、抗−ＨＩＶ−および抗−ＨＣ
Ｖ−陰性検体に対するテストにおける低いバックグラン
ドである。
【０１９４】通常好ましいコーティング混合物をこれら
基準に基づいて見出し、それより次の混合物を選んだ：
基準に基づいて見出し、それより次の混合物を選んだ：
【０１９５】１：３０００という実施例２の接合体濃度
（および１：２６という均一な付加的最終希釈率）が好
ましいことがわかり、そしてテストは実施例４における
と同様に行った。これまでの限界設定とは対照的に、こ
れらの条件下では、陰性コントロール平均値と０.２５
０ Ｏ.Ｄ.の和よりも大きい４５０nmにおける吸光度を
有する検体を抗−ＨＩＶ−および／または抗−ＨＣＶ−
陽性として分類した（新しい限界設定）。
（および１：２６という均一な付加的最終希釈率）が好
ましいことがわかり、そしてテストは実施例４における
と同様に行った。これまでの限界設定とは対照的に、こ
れらの条件下では、陰性コントロール平均値と０.２５
０ Ｏ.Ｄ.の和よりも大きい４５０nmにおける吸光度を
有する検体を抗−ＨＩＶ−および／または抗−ＨＣＶ−
陽性として分類した（新しい限界設定）。
【０１９６】これらの設定を以下の実施例１０〜１５に
対し均一かつ不変に適用した。
対し均一かつ不変に適用した。
【０１９７】実施例１０
ＥＬＩＳＡによるＨＩＶ １、ＨＩＶ ２およびＨＣＶに
対する免疫グロブリンＧクラスのヒト抗体の測定
対する免疫グロブリンＧクラスのヒト抗体の測定
【０１９８】式XIVのペプチド混合物を用いて実施例９
の至適化条件下で表２２〜２４に示された検体を実施例
４に記載の如くテストした。抗−ＨＩＶ １または２に
ついては、本発明方法の反応性を抗−ＨＩＶ １／２組
合せテスト（EnzygnostR 抗−ＨＩＶ １／２。Behringw
erke ＡＧ社により供給されたもの。ＨＰ ３）。Du Pon
t社により供給された市販のウエスターンブロット（抗
−ＨＩＶ １および抗−ＨＩＶ ２）をコントロールに用
いた。２種類の異なるＥＬＩＳＡ方法（ＨＰ１およびＨ
Ｐ ２）を用いてＨＣＶを検出した。
の至適化条件下で表２２〜２４に示された検体を実施例
４に記載の如くテストした。抗−ＨＩＶ １または２に
ついては、本発明方法の反応性を抗−ＨＩＶ １／２組
合せテスト（EnzygnostR 抗−ＨＩＶ １／２。Behringw
erke ＡＧ社により供給されたもの。ＨＰ ３）。Du Pon
t社により供給された市販のウエスターンブロット（抗
−ＨＩＶ １および抗−ＨＩＶ ２）をコントロールに用
いた。２種類の異なるＥＬＩＳＡ方法（ＨＰ１およびＨ
Ｐ ２）を用いてＨＣＶを検出した。
【０１９９】表２２〜２４のデータから明らかなよう
に、本発明方法を用いれば、ヒト起源の検体中の抗−Ｈ
ＩＶ １および抗−ＨＩＶ ２および抗−ＨＣＶが安全に
かつ信頼性をもって検出される。
に、本発明方法を用いれば、ヒト起源の検体中の抗−Ｈ
ＩＶ １および抗−ＨＩＶ ２および抗−ＨＣＶが安全に
かつ信頼性をもって検出される。
【０２００】表２２
抗−ＨＩＶ １／２組合せテスト（EnzygnostR 抗−ＨＩ
Ｖ １／２，ＨＰ ３）と比較された本発明方法による抗
−ＨＩＶ １の測定 強反応性とは光度測定評価において吸光度が＞２.５で
あることを意味する；すべての抗−ＨＩＶ １−陽性検
体はＨＣＶ−陰性である。
Ｖ １／２，ＨＰ ３）と比較された本発明方法による抗
−ＨＩＶ １の測定 強反応性とは光度測定評価において吸光度が＞２.５で
あることを意味する；すべての抗−ＨＩＶ １−陽性検
体はＨＣＶ−陰性である。
【０２０１】
【表２２】
【０２０２】表２３
抗−ＨＩＶ １／２組合せテスト（EnzygnostR 抗−ＨＩ
Ｖ １／２，ＨＰ ３）と比較された本発明方法による抗
−ＨＩＶ ２の測定 強反応性とは光度測定評価において吸光度が＞２.５で
あることを意味する；すべての２８抗−ＨＩＶ ２−陽
性検体はＨＣＶ陰性である。
Ｖ １／２，ＨＰ ３）と比較された本発明方法による抗
−ＨＩＶ ２の測定 強反応性とは光度測定評価において吸光度が＞２.５で
あることを意味する；すべての２８抗−ＨＩＶ ２−陽
性検体はＨＣＶ陰性である。
【０２０３】
【表２３】
【０２０４】表２４
本発明によるＥＬＩＳＡ法による抗−ＨＣＶの検出
吸光度が＞２.５００に達した検体を強反応性とした。
穏やかな強さの反応性を示す検体についてはいわゆる比
を記すが、これは所与のＥＬＩＳＡのカットオフ値で検
体吸光度を割った商を意味する。１.０より低い値は合
意により（by agreement）陰性とする。１.０より高い
値は陽性とされ、また得られる比が大きいほど反応性は
強くなる；すべての抗−ＨＣＶ−陽性検体はＨＩＶ−陰
性である。
穏やかな強さの反応性を示す検体についてはいわゆる比
を記すが、これは所与のＥＬＩＳＡのカットオフ値で検
体吸光度を割った商を意味する。１.０より低い値は合
意により（by agreement）陰性とする。１.０より高い
値は陽性とされ、また得られる比が大きいほど反応性は
強くなる；すべての抗−ＨＣＶ−陽性検体はＨＩＶ−陰
性である。
【０２０５】
【表２４】
【０２０６】実施例１１
従来技術と比較された抗−ＨＩＶおよび抗−ＨＣＶに対
する本発明によるＥＬＩＳＡの分析感度の測定 本発明によるＥＬＩＳＡの分析感度の評価モデルとし
て、陽性検体の力価測定を用意しそして実施例９に記載
のＥＬＩＳＡでテストした。全体として、抗−ＨＩＶ−
および抗−ＨＣＶ−陰性血清中で抗−ＨＩＶ １および
抗−ＨＩＶ ２−陽性ヒト血清の各々について３つの希
釈液を調製し、そして限界感度は、新しい限界値（陰性
コントロール平均値と０.２５０閾値の和）を用いて、
特定のテスト系における依然として反応性を示す最後の
予備希釈液として規定した。
する本発明によるＥＬＩＳＡの分析感度の測定 本発明によるＥＬＩＳＡの分析感度の評価モデルとし
て、陽性検体の力価測定を用意しそして実施例９に記載
のＥＬＩＳＡでテストした。全体として、抗−ＨＩＶ−
および抗−ＨＣＶ−陰性血清中で抗−ＨＩＶ １および
抗−ＨＩＶ ２−陽性ヒト血清の各々について３つの希
釈液を調製し、そして限界感度は、新しい限界値（陰性
コントロール平均値と０.２５０閾値の和）を用いて、
特定のテスト系における依然として反応性を示す最後の
予備希釈液として規定した。
【０２０７】これら限界感度テストの結果を表２５（抗
−ＨＩＶ １）、表２６（抗−ＨＩＶ ２）および表２７
（抗−ＨＣＶ）に吸光度としてまとめる。
−ＨＩＶ １）、表２６（抗−ＨＩＶ ２）および表２７
（抗−ＨＣＶ）に吸光度としてまとめる。
【０２０８】表２５
抗−ＨＩＶ 1/2組合せテスト（EnzygnostR 抗−ＨＩＶ
1/2）と比較された抗−ＨＩＶ １に対する本発明による
ＥＬＩＳＡの限界感度の測定 ３種類の抗−ＨＩＶ １−陽性検体をヒト抗−ＨＩＶ １
−および抗−ＨＣＶ−陰性血清を用いて予備的な連続２
倍希釈液を行い、そしてこれら希釈液を実施例３と同様
にして、あるいは比較テストの製造元の包装体差し込み
に従ってテストした。すべてのデータは吸光度
（Ｅ450）である。すべての抗−ＨＩＶ−陽性検体はＨ
Ｐ ２において陰性反応を示した。
1/2）と比較された抗−ＨＩＶ １に対する本発明による
ＥＬＩＳＡの限界感度の測定 ３種類の抗−ＨＩＶ １−陽性検体をヒト抗−ＨＩＶ １
−および抗−ＨＣＶ−陰性血清を用いて予備的な連続２
倍希釈液を行い、そしてこれら希釈液を実施例３と同様
にして、あるいは比較テストの製造元の包装体差し込み
に従ってテストした。すべてのデータは吸光度
（Ｅ450）である。すべての抗−ＨＩＶ−陽性検体はＨ
Ｐ ２において陰性反応を示した。
【０２０９】
【表２５】
【０２１０】表２６
抗−ＨＩＶ 1/2組合せテスト（EnzygnostR 抗−ＨＩＶ
1/2）で比較された抗−ＨＩＶ ２に対する本発明による
ＥＬＩＳＡの限界感度の測定 ３種類の抗−ＨＩＶ ２−陽性検体をヒト抗−ＨＩＶ １
−および抗−ＨＣＶ−陰性血清を用いて予備的な連続２
倍希釈液を行い、そしてこれら希釈液を実施例３と同様
にして、あるいは比較テストの製造元の包装体差し込み
に従ってテストした。すべてのデータは吸光度
（Ｅ450）である。すべての抗−ＨＩＶ−陽性検体はＨ
Ｐ ２において陰性反応を示した。
1/2）で比較された抗−ＨＩＶ ２に対する本発明による
ＥＬＩＳＡの限界感度の測定 ３種類の抗−ＨＩＶ ２−陽性検体をヒト抗−ＨＩＶ １
−および抗−ＨＣＶ−陰性血清を用いて予備的な連続２
倍希釈液を行い、そしてこれら希釈液を実施例３と同様
にして、あるいは比較テストの製造元の包装体差し込み
に従ってテストした。すべてのデータは吸光度
（Ｅ450）である。すべての抗−ＨＩＶ−陽性検体はＨ
Ｐ ２において陰性反応を示した。
【０２１１】
【表２６】
【０２１２】表２７
抗−ＨＣＶに対する本発明によるＥＬＩＳＡの限界感度
の測定 ヒト抗−ＨＩＶ−および抗−ＨＣＶ−陰性血清を用いて
４種類の確認された抗−ＨＣＶ−陽性検体を予備的に連
続２倍希釈し、そしてこれら希釈液を実施例３と同様に
してテストした。すべてのデータは吸光度（Ｅ450nm）
である。
の測定 ヒト抗−ＨＩＶ−および抗−ＨＣＶ−陰性血清を用いて
４種類の確認された抗−ＨＣＶ−陽性検体を予備的に連
続２倍希釈し、そしてこれら希釈液を実施例３と同様に
してテストした。すべてのデータは吸光度（Ｅ450nm）
である。
【０２１３】
【表２７】
【０２１４】抗−ＨＣＶに対しても手順は同様とし、４
種類の抗−ＨＣＶ−陽性検体の連続希釈液を表２７に記
載の如く調製し、抗−ＨＩＶと同様にテストおよび評価
し、そして第２世代の市販抗−ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ（Ｈ
Ｐ ２）を用いた結果と比較した。
種類の抗−ＨＣＶ−陽性検体の連続希釈液を表２７に記
載の如く調製し、抗−ＨＩＶと同様にテストおよび評価
し、そして第２世代の市販抗−ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ（Ｈ
Ｐ ２）を用いた結果と比較した。
【０２１５】さらに、各供血の反応性の特異性について
も、抗−ＨＣＶテストでは未希釈の抗−ＨＩＶ １−お
よび抗−ＨＩＶ ２−陽性検体を、そして逆に抗−ＨＩ
Ｖ 1/2組合せテスト（EnzygnostR 抗−ＨＩＶ 1/2）で
は抗−ＨＣＶ−陽性検体を検査することにより個別テス
トとしてテストした。
も、抗−ＨＣＶテストでは未希釈の抗−ＨＩＶ １−お
よび抗−ＨＩＶ ２−陽性検体を、そして逆に抗−ＨＩ
Ｖ 1/2組合せテスト（EnzygnostR 抗−ＨＩＶ 1/2）で
は抗−ＨＣＶ−陽性検体を検査することにより個別テス
トとしてテストした。
【０２１６】表２５〜２７にまとめた結果から、抗−Ｈ
ＩＶ １および抗−ＨＩＶ ２のいずれについても本発明
によるＥＬＩＳＡの限界感度が抗−ＨＩＶ 1/2組合せテ
ストの限界感度に相当することが明らかである。さらに
本発明によるＥＬＩＳＡのＨＣＶ限界感度も市販の抗−
ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ（ＨＰ ２）の限界感度に相当した。
しかしながら、従来技術に従ってこれら３種類の抗体特
異性を検出しようとすれば全部で少なくとも２種類のテ
スト（抗−ＨＩＶ 1/2組合せテストと少なくとも一つの
抗−ＨＣＶテスト）が必要であるのに対し、本発明方法
によればたった一つのテスト混合物を用いるだけで全く
同じ信頼性をもってまた同等の感度をもってこの検出が
可能となる。
ＩＶ １および抗−ＨＩＶ ２のいずれについても本発明
によるＥＬＩＳＡの限界感度が抗−ＨＩＶ 1/2組合せテ
ストの限界感度に相当することが明らかである。さらに
本発明によるＥＬＩＳＡのＨＣＶ限界感度も市販の抗−
ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ（ＨＰ ２）の限界感度に相当した。
しかしながら、従来技術に従ってこれら３種類の抗体特
異性を検出しようとすれば全部で少なくとも２種類のテ
スト（抗−ＨＩＶ 1/2組合せテストと少なくとも一つの
抗−ＨＣＶテスト）が必要であるのに対し、本発明方法
によればたった一つのテスト混合物を用いるだけで全く
同じ信頼性をもってまた同等の感度をもってこの検出が
可能となる。
【０２１７】さらに表２５〜２７のデータから、この新
しいＥＬＩＳＡにおける抗−ＨＩＶ−および抗−ＨＣＶ
−陽性検体の強反応性が特に有利であることが明らかで
ある。何故ならば抗−ＨＩＶ検体は特異的抗−ＨＣＶテ
ストで陰性に反応し、また抗−ＨＣＶ−陽性検体は特異
的抗−ＨＩＶテストで陰性に反応したからである。
しいＥＬＩＳＡにおける抗−ＨＩＶ−および抗−ＨＣＶ
−陽性検体の強反応性が特に有利であることが明らかで
ある。何故ならば抗−ＨＩＶ検体は特異的抗−ＨＣＶテ
ストで陰性に反応し、また抗−ＨＣＶ−陽性検体は特異
的抗−ＨＩＶテストで陰性に反応したからである。
【０２１８】実施例１２
本発明ＥＬＩＳＡによる感染初期からの抗−ＨＩＶ １
−陽性検体（血清転化）の測定 合計３名の患者からＨＩＶ １感染の極く初期の間の規
定の時点でくり返し採取された連続血液検体についてテ
ストを行った。これらの血清パネルは市販されている
（Boston Biomedica Inc., 米国）。本発明ＥＬＩＳＡ
により得られた結果と抗−ＨＩＶ 1/2組合せテストとの
比較を表２８に示した。
−陽性検体（血清転化）の測定 合計３名の患者からＨＩＶ １感染の極く初期の間の規
定の時点でくり返し採取された連続血液検体についてテ
ストを行った。これらの血清パネルは市販されている
（Boston Biomedica Inc., 米国）。本発明ＥＬＩＳＡ
により得られた結果と抗−ＨＩＶ 1/2組合せテストとの
比較を表２８に示した。
【０２１９】表２８
すべてのデータは吸光度（Ｅ450nm）であり、そして特
定の限界値を超える値を陽性とすることができる。
定の限界値を超える値を陽性とすることができる。
【０２２０】
【表２８】
【０２２１】表２８の結果から明らかなように、本発明
によるＥＬＩＳＡは低力価抗−ＨＩＶ １−陽性検体を
抗−ＨＩＶ 1/2組合せテスト（EnzygnostR 抗−ＨＩＶ
1/2）と全く同じ信頼性をもって検出する。同様に表２
８のデータと比較することにより、本発明の新規ペプチ
ドＥＬＩＳＡによりＨＩＶ １−特異的抗体の最初の検
出が可能となる最も早い時点も、従来技術としての特異
的個別抗−ＨＩＶ １テストと少なくとも同じ早さとす
ることができることが明らかである。
によるＥＬＩＳＡは低力価抗−ＨＩＶ １−陽性検体を
抗−ＨＩＶ 1/2組合せテスト（EnzygnostR 抗−ＨＩＶ
1/2）と全く同じ信頼性をもって検出する。同様に表２
８のデータと比較することにより、本発明の新規ペプチ
ドＥＬＩＳＡによりＨＩＶ １−特異的抗体の最初の検
出が可能となる最も早い時点も、従来技術としての特異
的個別抗−ＨＩＶ １テストと少なくとも同じ早さとす
ることができることが明らかである。
【０２２２】実施例１３
本発明ＥＬＩＳＡによる低力価抗−ＨＩＶ １−陽性検
体の測定 表２９は本発明の新規ＨＩＶ／ＨＣＶペプチドＥＬＩＳ
Ａを用いた市販の抗−ＨＩＶ低力価パネルについてのテ
ストで得られた結果を抗−ＨＩＶ 1/2組合せテスト（En
zygnostR 抗−ＨＩＶ 1/2）と比較したものをまとめて
示したものである。
体の測定 表２９は本発明の新規ＨＩＶ／ＨＣＶペプチドＥＬＩＳ
Ａを用いた市販の抗−ＨＩＶ低力価パネルについてのテ
ストで得られた結果を抗−ＨＩＶ 1/2組合せテスト（En
zygnostR 抗−ＨＩＶ 1/2）と比較したものをまとめて
示したものである。
【０２２３】Boston Biomedica, Inc. 社（米国）によ
り供給された検体パネルは、抗−ＨＩＶ １測定法によ
り低力価抗−ＨＩＶ １−陽性として分類された合計１
５の検体より成る。
り供給された検体パネルは、抗−ＨＩＶ １測定法によ
り低力価抗−ＨＩＶ １−陽性として分類された合計１
５の検体より成る。
【０２２４】表２９
Boston Biomedica Inc. 社（米国）により供給された低
力価抗−ＨＩＶ １パネルについてのテスト結果 すべてのデータは４５０nmの波長における吸光度であ
る。記載の限界値を超える値が陽性である。
力価抗−ＨＩＶ １パネルについてのテスト結果 すべてのデータは４５０nmの波長における吸光度であ
る。記載の限界値を超える値が陽性である。
【０２２５】
【表２９】
【０２２６】表２９の結果から、抗−ＨＩＶ 1/2組合せ
テスト（EnzygnostR 抗−ＨＩＶ 1/2）に比べ、本発明
によるＨＩＶ／ＨＣＶペプチドＥＬＩＳＡを用いるとき
はすべての検体が比較的強い反応性を示すことが明らか
である。
テスト（EnzygnostR 抗−ＨＩＶ 1/2）に比べ、本発明
によるＨＩＶ／ＨＣＶペプチドＥＬＩＳＡを用いるとき
はすべての検体が比較的強い反応性を示すことが明らか
である。
【０２２７】実際、パネルの４つの検体は本発明の新規
ペプチドＥＬＩＳＡによれば抗−ＨＩＶ 1/2組合せテス
ト（EnzygnostR 抗−ＨＩＶ 1/2）よりも強い反応性を
示すが、このことは興味深いことである（Ｎｏ. １、
２、１２および１５）。これらの検体についての付加的
テストからＨＣＶ検体の同時存在が明らかとなったがこ
のことからも本発明方法による抗−ＨＩＶ １／−ＨＩ
Ｖ ２および−ＨＣＶの非鑑別検出の信頼性が確認され
る。
ペプチドＥＬＩＳＡによれば抗−ＨＩＶ 1/2組合せテス
ト（EnzygnostR 抗−ＨＩＶ 1/2）よりも強い反応性を
示すが、このことは興味深いことである（Ｎｏ. １、
２、１２および１５）。これらの検体についての付加的
テストからＨＣＶ検体の同時存在が明らかとなったがこ
のことからも本発明方法による抗−ＨＩＶ １／−ＨＩ
Ｖ ２および−ＨＣＶの非鑑別検出の信頼性が確認され
る。
【０２２８】実施例１４
本発明ＥＬＩＳＡによる低力価抗−ＨＣＶ−陽性検体の
測定 表３０に含まれる結果は、本発明の新規ＨＩＶ １／Ｈ
ＩＶ ２およびＨＣＶペプチドＥＬＩＳＡ、およびBosto
n Biomedica Inc. 社（米国）により供給された低力価
抗−ＨＣＶパネルを用いて得られたものである。さらに
この表３０は最新式の抗−ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ（ＨＰ
２）を用いて同一パネルについて得られたデータであ
る。
測定 表３０に含まれる結果は、本発明の新規ＨＩＶ １／Ｈ
ＩＶ ２およびＨＣＶペプチドＥＬＩＳＡ、およびBosto
n Biomedica Inc. 社（米国）により供給された低力価
抗−ＨＣＶパネルを用いて得られたものである。さらに
この表３０は最新式の抗−ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ（ＨＰ
２）を用いて同一パネルについて得られたデータであ
る。
【０２２９】本発明によるおよび市販のＥＬＩＳＡにつ
いてのデータはいわゆる終点力価でありこれをもって、
所与のテストにおいて再現性よく陽性であると認められ
た最高の予備的希釈率が規定される。
いてのデータはいわゆる終点力価でありこれをもって、
所与のテストにおいて再現性よく陽性であると認められ
た最高の予備的希釈率が規定される。
【０２３０】
【表３０】
【０２３１】表３０の結果から、１４個すべての陽性検
体が本発明ＥＬＩＳＡにより信頼性をもってかつ明白に
陽性とされたことが明らかである。これに関し、信号強
度が極めて高いことに注目すべきであるが、これは高い
反応性によるものとすることができる。
体が本発明ＥＬＩＳＡにより信頼性をもってかつ明白に
陽性とされたことが明らかである。これに関し、信号強
度が極めて高いことに注目すべきであるが、これは高い
反応性によるものとすることができる。
【０２３２】この高い特異性は表３０に示された限界感
度にも反映されている。これらの検出限界は、自然ヒト
検体を抗−ＨＣＶ−陰性血清中で予備的に連続２倍希釈
し次いで実施例４と同様にテストすることにより規定さ
れたが、その場合、依然として反応性が認められる最後
の予備的希釈段階がいわゆる最終力価となる。
度にも反映されている。これらの検出限界は、自然ヒト
検体を抗−ＨＣＶ−陰性血清中で予備的に連続２倍希釈
し次いで実施例４と同様にテストすることにより規定さ
れたが、その場合、依然として反応性が認められる最後
の予備的希釈段階がいわゆる最終力価となる。
【０２３３】これに基づいて、表３０のデータから、本
発明による新規ＨＩＶ １／ＨＩＶ２／ＨＣＶペプチド
ＥＬＩＳＡが、事実、ＰＶＣ １０１パネルにおいて抗
−ＨＣＶに対して従来技術よりも良い検出限界を有して
いることが明らかである。
発明による新規ＨＩＶ １／ＨＩＶ２／ＨＣＶペプチド
ＥＬＩＳＡが、事実、ＰＶＣ １０１パネルにおいて抗
−ＨＣＶに対して従来技術よりも良い検出限界を有して
いることが明らかである。
【０２３４】実施例１５
一群の健常供血者における新規ペプチドの非特異的反応
率の測定 ＥＬＩＳＡにおける誤った陽性結果につながる非特異的
反応頻度を測定するために全部でｎ＝５１２の健常供血
者を用いた。さらに当該方法への凝固系の可能性として
の干渉をも検査できるように、これらの供血者から血清
と血漿を同時に採取した。
率の測定 ＥＬＩＳＡにおける誤った陽性結果につながる非特異的
反応頻度を測定するために全部でｎ＝５１２の健常供血
者を用いた。さらに当該方法への凝固系の可能性として
の干渉をも検査できるように、これらの供血者から血清
と血漿を同時に採取した。
【０２３５】これら３種類のテスト（本発明によるＥＬ
ＩＳＡ、抗−ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ ＨＰ ２および抗−Ｈ
ＣＶ 1/2 ＨＰ ３）（いわゆる初回テスト）のうちの一
つで反応性のあった検体に同じテスト（いわゆる再テス
ト）をくり返し、そしてその反応性に再現性がある場合
には、比較のための方法としての抗−ＨＩＶ １ウエス
ターンブロットおよび抗−ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ ＣＨＰ
１）で検査した。
ＩＳＡ、抗−ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ ＨＰ ２および抗−Ｈ
ＣＶ 1/2 ＨＰ ３）（いわゆる初回テスト）のうちの一
つで反応性のあった検体に同じテスト（いわゆる再テス
ト）をくり返し、そしてその反応性に再現性がある場合
には、比較のための方法としての抗−ＨＩＶ １ウエス
ターンブロットおよび抗−ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ ＣＨＰ
１）で検査した。
【０２３６】この確認法によっては、このスクリーニン
グにおいて前記３種類のＥＬＩＳＡのうちの一つで反応
性を示した反応性検体のいずれも抗−ＨＩＶ １−また
は抗−ＨＣＶ−陽性であると確認することはできなかっ
た。すなわち、スクリーニングで拒絶されたすべての検
体は特定の方法において終始誤った陽性として分類され
た。
グにおいて前記３種類のＥＬＩＳＡのうちの一つで反応
性を示した反応性検体のいずれも抗−ＨＩＶ １−また
は抗−ＨＣＶ−陽性であると確認することはできなかっ
た。すなわち、スクリーニングで拒絶されたすべての検
体は特定の方法において終始誤った陽性として分類され
た。
【０２３７】表３１：５１２個の血清および５１２個の
いわゆる対合である血漿を同時採取したｎ＝５１２名の
健常供血者のスクリーニング。初回テスト後の結果を示
す；再テストの結果については表３２を参照されたい。
いわゆる対合である血漿を同時採取したｎ＝５１２名の
健常供血者のスクリーニング。初回テスト後の結果を示
す；再テストの結果については表３２を参照されたい。
【０２３８】
【表３１】
【０２３９】
【表３２】
【０２４０】最初の一連のテストの結果（初回時結果）
は表３１にまとめられている。３個の血清（および２個
の対合血漿）が本発明方法において反応性を示したのに
対し、抗−ＨＩＶ 1/2 ＥＬＩＳＡでは１個の血清（お
よび１個の相当する血漿）が反応性を示し、また抗−Ｈ
ＣＶ ＥＬＩＳＡでは５個の血清（および４つの相当す
る血漿）が反応性を示した。特定のＥＬＩＳＡで反応性
を示した供血者は同一でなかった。
は表３１にまとめられている。３個の血清（および２個
の対合血漿）が本発明方法において反応性を示したのに
対し、抗−ＨＩＶ 1/2 ＥＬＩＳＡでは１個の血清（お
よび１個の相当する血漿）が反応性を示し、また抗−Ｈ
ＣＶ ＥＬＩＳＡでは５個の血清（および４つの相当す
る血漿）が反応性を示した。特定のＥＬＩＳＡで反応性
を示した供血者は同一でなかった。
【０２４１】これら９個の反応性血清についてテストを
くり返したところ表３２に示される像が得られ、２個の
血清（２個の対合血漿）は本発明によるペプチドＥＬＩ
ＳＡで再テスト反応性を示し、１個の血清（１個の対合
血漿）は抗−ＨＩＶ 1/2 ＥＬＩＳＡで反応性を示しそ
して４個の血清（４個の対合血漿）は抗−ＨＣＶ ＥＬ
ＩＳＡで反応性を示した。
くり返したところ表３２に示される像が得られ、２個の
血清（２個の対合血漿）は本発明によるペプチドＥＬＩ
ＳＡで再テスト反応性を示し、１個の血清（１個の対合
血漿）は抗−ＨＩＶ 1/2 ＥＬＩＳＡで反応性を示しそ
して４個の血清（４個の対合血漿）は抗−ＨＣＶ ＥＬ
ＩＳＡで反応性を示した。
【０２４２】これら検体のいずれについても抗−ＨＩＶ
−および抗−ＨＣＶ−陽性であるとして確認することが
できなかったことから、表３２に示した特異性データ
は、検査されたＥＬＩＳＡの各々および血清および血漿
について、（全５１２個の血清および５１２個の血漿の
うち）正しく陰性と認められた検体の率（％）を計算す
ることにより測定されたものである。
−および抗−ＨＣＶ−陽性であるとして確認することが
できなかったことから、表３２に示した特異性データ
は、検査されたＥＬＩＳＡの各々および血清および血漿
について、（全５１２個の血清および５１２個の血漿の
うち）正しく陰性と認められた検体の率（％）を計算す
ることにより測定されたものである。
【０２４３】表３２のデータに基づくと、各供血時に義
務付けられている従来の抗−ＨＩＶおよび抗−ＨＣＶテ
ストによるときは、全部で５名の供血者が排除されねば
ならなかったであろう。すなわち、１名の供血者は抗−
ＨＩＶ 1/2テストにおいてくり返し誤った陽性を示しそ
して４名の供血者は抗−ＨＣＶテストにおいてくり返し
誤った陽性を示した。これに対し本発明によるＥＬＩＳ
Ａによるときは、ひょっとして誤った反応を示す供血者
数は２名に過ぎない。
務付けられている従来の抗−ＨＩＶおよび抗−ＨＣＶテ
ストによるときは、全部で５名の供血者が排除されねば
ならなかったであろう。すなわち、１名の供血者は抗−
ＨＩＶ 1/2テストにおいてくり返し誤った陽性を示しそ
して４名の供血者は抗−ＨＣＶテストにおいてくり返し
誤った陽性を示した。これに対し本発明によるＥＬＩＳ
Ａによるときは、ひょっとして誤った反応を示す供血者
数は２名に過ぎない。
【０２４４】要約すると、抗−ＨＩＶ １、抗−ＨＩＶ
２および抗−ＨＣＶの同時非鑑別検出のための本発明の
新規ペプチドＥＬＩＳＡは、現在有効な感度基準からし
て、一方において抗−ＨＩＶ 1/2および他方において抗
−ＨＣＶの個別テストの各々至適の性能に少なくとも相
当するということができる。すなわちパネル、すなわち
抗−ＨＩＶ １および／または抗−ＨＩＶ ２および／ま
たは抗−ＨＣＶを含む自然検体からのデータは、低力価
抗−ＨＩＶ １または抗−ＨＩＶ ２または抗−ＨＣＶ検
体の限界感度および最先認識時点についてのテストと全
く同様に同等の効率を示している。従来技術によるとき
はこのようにして３種類の異なるテスト、あるいは抗−
ＨＩＶ 1/2組合せテストに徴すれば２種類の異なるテス
トを用いて初めてこれら３種類の抗体特異性が可能であ
るのに対して、本発明によるＥＬＩＳＡには効率は同じ
であるのに１種類のテストしか必要でないという利点が
ある。特に、抗−ＨＩＶ １、抗−ＨＩＶ ２および抗−
ＨＣＶのテストの実施が義務付けられている血液銀行に
とって、本発明の新規ペプチドＥＬＩＳＡは、抗−ＨＩ
Ｖ １、抗−ＨＩＶ ２および抗−ＨＣＶの測定におい
て、少なくとも同じ信頼性および安定性をもって、相当
な労力および費用の軽減となる。
２および抗−ＨＣＶの同時非鑑別検出のための本発明の
新規ペプチドＥＬＩＳＡは、現在有効な感度基準からし
て、一方において抗−ＨＩＶ 1/2および他方において抗
−ＨＣＶの個別テストの各々至適の性能に少なくとも相
当するということができる。すなわちパネル、すなわち
抗−ＨＩＶ １および／または抗−ＨＩＶ ２および／ま
たは抗−ＨＣＶを含む自然検体からのデータは、低力価
抗−ＨＩＶ １または抗−ＨＩＶ ２または抗−ＨＣＶ検
体の限界感度および最先認識時点についてのテストと全
く同様に同等の効率を示している。従来技術によるとき
はこのようにして３種類の異なるテスト、あるいは抗−
ＨＩＶ 1/2組合せテストに徴すれば２種類の異なるテス
トを用いて初めてこれら３種類の抗体特異性が可能であ
るのに対して、本発明によるＥＬＩＳＡには効率は同じ
であるのに１種類のテストしか必要でないという利点が
ある。特に、抗−ＨＩＶ １、抗−ＨＩＶ ２および抗−
ＨＣＶのテストの実施が義務付けられている血液銀行に
とって、本発明の新規ペプチドＥＬＩＳＡは、抗−ＨＩ
Ｖ １、抗−ＨＩＶ ２および抗−ＨＣＶの測定におい
て、少なくとも同じ信頼性および安定性をもって、相当
な労力および費用の軽減となる。
【０２４５】さらに、この新規テストの干渉の受けやす
さを測定したところ、全く驚くべきことに、特異性が極
めて良好である、すなわち誤った陽性結果数がほんのわ
ずかであるため、抗−ＨＩＶ 1/2テストとそれとは別に
抗−ＨＣＶテストを有する従来のスクリーニング手順に
比べ、より少ない再テストおよびより少ない確認テスト
で済み、また拒絶されねばならない供血も少なくて済む
ことがわかった。このことは本発明方法による方法が式
IV〜XIIおよびXIII〜XVIIで示されるＨＩＶおよびＨＣ
Ｖペプチドの他の群によっても提供される経済的および
化学的利点を有していることを意味している。
さを測定したところ、全く驚くべきことに、特異性が極
めて良好である、すなわち誤った陽性結果数がほんのわ
ずかであるため、抗−ＨＩＶ 1/2テストとそれとは別に
抗−ＨＣＶテストを有する従来のスクリーニング手順に
比べ、より少ない再テストおよびより少ない確認テスト
で済み、また拒絶されねばならない供血も少なくて済む
ことがわかった。このことは本発明方法による方法が式
IV〜XIIおよびXIII〜XVIIで示されるＨＩＶおよびＨＣ
Ｖペプチドの他の群によっても提供される経済的および
化学的利点を有していることを意味している。
【０２４６】本発明による方法は限界感度の最大至適化
が最も重要となっている他の課題にも極めて適してい
る。すなわち、他のテスト条件下で、あるいは例えば実
施例１０〜１４における計算により、幾分好ましさに欠
ける特異性データ（とはいえ依然として従来技術水準に
は相当する）でよしとするのであれば、従来技術よりも
著しく向上した感度特徴を本発明方法により得ることが
完全に可能であることを示すことができる。
が最も重要となっている他の課題にも極めて適してい
る。すなわち、他のテスト条件下で、あるいは例えば実
施例１０〜１４における計算により、幾分好ましさに欠
ける特異性データ（とはいえ依然として従来技術水準に
は相当する）でよしとするのであれば、従来技術よりも
著しく向上した感度特徴を本発明方法により得ることが
完全に可能であることを示すことができる。
【０２４７】例えば、限界値（実施例９）が０.１吸光
度まで低下したとすれば、抗−ＨＩＶ １、抗−ＨＩＶ
２および抗−ＨＣＶに対するすべての限界感度は相当に
（少なくとも２倍）改善されることになろう。健常供血
者のスクリーニングにおいて非特異的、すなわち誤った
陽性、反応を示す検体率として全部で５名の供血者（く
り返し反応性を示した）が得られる（実施例１５）。こ
れは２種類の個別テストの結果に完全に相当するが、抗
体検出感度は相当に向上した。
度まで低下したとすれば、抗−ＨＩＶ １、抗−ＨＩＶ
２および抗−ＨＣＶに対するすべての限界感度は相当に
（少なくとも２倍）改善されることになろう。健常供血
者のスクリーニングにおいて非特異的、すなわち誤った
陽性、反応を示す検体率として全部で５名の供血者（く
り返し反応性を示した）が得られる（実施例１５）。こ
れは２種類の個別テストの結果に完全に相当するが、抗
体検出感度は相当に向上した。
【０２４８】
【配列表】
配列番号：１
ＨＣＶアミノ酸配列
121 175
SGKPAIIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYIEQGMMLAEQFKQKALGLLQTASRQA
配列番号：２
ＨＣＶアミノ酸配列
121 160
SGKPAIIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYIEQGMMLAEQF
配列番号：３
ＨＣＶアミノ酸配列
128 160
PDREVLYREFDEMEECSQHLPYIEQGMMLAEQF
配列番号：４
ＨＣＶアミノ酸配列
136 160
EFDEMEECSQHLPYIEQGMMLAEQF
配列番号：５
ＨＣＶアミノ酸配列
144 160
SQHLPYIEQGMMLAEQF
配列番号：６
ＨＣＶアミノ酸配列
161 175
KQKALGLLQTASRQA
配列番号：７
ＨＣＶアミノ酸配列
144 175
SQHLPYIEQGMMLAEQFKQKALGLLQTASRQA
配列番号：８
ＨＣＶアミノ酸配列
135 164
REFDEMEECSQHLPYIEQGMMLAEQFKQKA
配列番号：９
ＨＣＶアミノ酸配列
121 135
SGKPAIIPDREVLYR
配列番号：10
ＨＣＶアミノ酸配列
129 143
DREVLYREFDEMEEC
配列番号：11
ＨＣＶアミノ酸配列
137 151
FDEMEECSQHLPYIE
配列番号：12
ＨＣＶアミノ酸配列
145 159
QHLPYIEQGMMLAEQ
配列番号：13
ＨＣＶアミノ酸配列
153 167
GMMLAEQFKQKALGL
配列番号：14
ＨＣＶアミノ酸配列
345 359
VQWMNRLIAFASRGN
配列番号：15
ＨＣＶアミノ酸配列
121 139
SGKPAIIPDREVLYREFDE
配列番号：16
ＨＣＶアミノ酸配列
HVGPGEAVQWMNRLIAFASRGNHVSP
配列番号：17
ＨＣＶアミノ酸配列
MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGQIVGGVY I
配列番号：18
ＨＣＶアミノ酸配列
1 30
MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGQI SP 10
配列番号：19
ＨＣＶアミノ酸配列
8 26
QRKTKRNTNRRPQDVKFPG SP 23
配列番号：20
ＨＣＶアミノ酸配列
10 26
KTKRNTNRRPQDVKFPG SP 30
配列番号：21
ＨＣＶアミノ酸配列
12 26
KRNTNRRPQDVKFPG SP 30 D
配列番号：22
ＨＣＶアミノ酸配列
14 26
NTNRRPQDVKFPG SP 30 C
配列番号：23
ＨＣＶアミノ酸配列
16 26
NRRPQDVKFPG SP 30 B
配列番号：24
ＨＣＶアミノ酸配列
18 26
RPQDVKFPG SP 30 A
配列番号：25
ＨＣＶアミノ酸配列
8 24
QRKTKRNTNRRPQDVKF SP 31
配列番号：26
ＨＣＶアミノ酸配列
8 22
QRKTKRNTNRRPQDV SP 32
配列番号：27
ＨＣＶアミノ酸配列
-DVEVLYR-
配列番号：28
ＨＣＶアミノ酸配列
-QHLPYIE-
配列番号：29
ＨＣＶアミノ酸配列
-KQKALGL-
配列番号：30
ＨＣＶアミノ酸配列
-QRKTKRNTNRRPQDVK-
配列番号：31
ＨＩＶアミノ酸配列
586 620
RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS
配列番号：32
ＨＩＶアミノ酸配列
578 613
RVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCHTTVPWVNDS
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｃ−１００−３のＯＲＦ領域のアミノ酸の一次
配列（ＷＯ／８９／０４６６９より）。
配列（ＷＯ／８９／０４６６９より）。
【図２】式Ｉおよび式IIの本発明による配列とＣ−１０
０−３のＯＲＦ領域からの既知ペプチドとの比較。
０−３のＯＲＦ領域からの既知ペプチドとの比較。
【図３】ＨＣＶコアタンパク質の本発明による配列と既
知ペプチドとの比較。
知ペプチドとの比較。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(31)優先権主張番号 Ｐ４１２１４３１．５
(32)優先日 平成３年６月28日(1991．6．28)
(33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ）
(72)発明者 ヴエルナー・シユテユーバー
ドイツ連邦共和国デー−3551ラーンター
ル．ツエルバーヴエーク２
(72)発明者 マンフレート・ゲルケン
ドイツ連邦共和国デー−3550マルブルク.
ヴアンコプフシユトラーセ12
(72)発明者 シユテフアン・ブルスト
ドイツ連邦共和国デー−3550マルブルク.
アム・ヴアル32
Ｆターム(参考） 4H045 AA11 AA20 AA30 BA16 BA17
BA18 CA02 DA86 EA50 FA10
Claims (15)
- 【請求項１】 ＨＣＶに対する抗体と特異的に反応し、
そしてそのアミノ酸配列が少くともアミノ末端ＨＣＶコ
ア領域の一部を含むペプチド。 - 【請求項２】 アミノ酸配列が少くとも式III： MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGQIVGGVY III で示される少くとも一つの配列を部分的または完全に含
む請求項１記載のペプチド。 - 【請求項３】 下記のアミノ酸配列のうちの少くとも一
つを含む請求項２記載のペプチド： 【化１】 - 【請求項４】 下記のアミノ酸配列のうちの少くとも一
つを含む請求項１記載のペプチド： 【化２】 - 【請求項５】 下記のアミノ酸配列のうちの少くとも一
つを含む請求項２記載のペプチド：ＡＡn−ＱＲＫＴＫ
ＲＮＴＮＲＲＰＱＤＶＫ−ＢＡm（式中ＡＡおよびＢＡ
は任意の所望のアミノ酸であり、そしてｎおよびｍは、
各々相互に独立的に、１〜４０の整数である。） - 【請求項６】 そのアミノ酸配列が一以上のアミノ酸の
置換、付加または欠失により修飾されている請求項１〜
５のいずれかに記載のペプチド。 - 【請求項７】 請求項１〜６のうちの少くとも一つに記
載のペプチドを含むペプチド混合物。 - 【請求項８】 ペプチド化学により合成された請求項１
〜７のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド混合
物。 - 【請求項９】 請求項１〜８のいずれかに記載のペプチ
ドまたはペプチド混合物を用いるＨＣＶ抗体の検出およ
び／または測定のための免疫化学的方法。 - 【請求項１０】 感染の初期および後期に特異的なペプ
チドの組合せが用いられ、そして特異性において該ペプ
チドの組合せに対応する複数の短鎖ペプチドおよび／ま
たは一以上のポリペプチドの混合物が用いられる請求項
９記載の方法。 - 【請求項１１】 感染の初期および後期を鑑別診断する
ために各場合について初期抗体に対して特異的に反応す
る一以上のペプチドと後期抗体に対して特異的に反応す
る一以上のペプチドを別々の混合物として検体と反応さ
せる請求項９記載の方法。 - 【請求項１２】 ペプチドのアミノ酸配列が一以上のア
ミノ酸の置換、付加または欠失により修飾されている請
求項９〜１１のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】 請求項１〜８のいずれかに記載のペプ
チドまたはペプチド混合物の一以上のエピトープが固定
されている一以上の担体を含む、ＨＣＶ抗体の検出およ
び／または測定のための免疫学的テストキット。 - 【請求項１４】 担体がポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ル、ポリアミドおよびその他の合成ポリマー、天然ポリ
マー例えばセルロースおよび誘導体化された天然ポリマ
ー例えばセルロースアセテートおよびニトロセルロー
ス、およびガラス、特にガラス繊維、より成る群より選
ばれる請求項１３に記載のテストキット。 - 【請求項１５】 担体がポリスチレンである請求項１４
記載のテストキット。
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4034982.9 | 1990-11-03 | ||
| DE4034982A DE4034982C2 (de) | 1990-11-03 | 1990-11-03 | Synthetische Polypeptide zur Bestimmung von HCV-Antikörpern und HCV-Antigenen, Mittel dazu und ihre Verwendung in diesen Nachweis-Verfahren |
| DE4112743.9 | 1991-04-19 | ||
| DE4112743A DE4112743C2 (de) | 1991-04-19 | 1991-04-19 | Synthetische Core-Peptide zur Bestimmung von HCV-Antikörpern und HCV-Antigenen, Mittel dazu und ihre Verwendung in diesen Nachweis-Verfahren |
| DE4120281.3 | 1991-06-19 | ||
| DE4120281A DE4120281C2 (de) | 1991-06-19 | 1991-06-19 | Immunchemisches Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis von mehreren verschiedenen Antikörperspezifitäten, Peptidmischungen und Test dazu |
| DE4121431A DE4121431A1 (de) | 1991-06-28 | 1991-06-28 | Synthetische core-peptide zur bestimmung von hcv-antikoerpern und hcv-antigenen, mittel dazu und ihre verwendung in diesen nachweis-verfahren |
| DE4121431.5 | 1991-06-28 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31517891A Division JP4097162B2 (ja) | 1990-11-03 | 1991-11-05 | Ｈｃｖ−特異的ペプチド、それらのための剤およびそれらの使用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003192697A true JP2003192697A (ja) | 2003-07-09 |
| JP4097191B2 JP4097191B2 (ja) | 2008-06-11 |
Family
ID=27435056
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31517891A Expired - Lifetime JP4097162B2 (ja) | 1990-11-03 | 1991-11-05 | Ｈｃｖ−特異的ペプチド、それらのための剤およびそれらの使用 |
| JP2002330252A Expired - Lifetime JP4097191B2 (ja) | 1990-11-03 | 2002-11-14 | Ｈｃｖ−特異的ペプチドおよびそれらの使用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31517891A Expired - Lifetime JP4097162B2 (ja) | 1990-11-03 | 1991-11-05 | Ｈｃｖ−特異的ペプチド、それらのための剤およびそれらの使用 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (2) | JP4097162B2 (ja) |
| AT (2) | ATE318309T1 (ja) |
| AU (1) | AU657497B2 (ja) |
| CA (1) | CA2054798C (ja) |
| DE (2) | DE59109271D1 (ja) |
| DK (2) | DK0770679T4 (ja) |
| ES (2) | ES2255068T5 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20140132410A (ko) * | 2012-03-09 | 2014-11-17 | 비오메리으 | 간섭 펩티드 및 미생물 검출 방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DE4209215A1 (de) * | 1991-07-04 | 1993-01-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Hcv peptidantigene und verfahren zur bestimmung von hcv |
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| WO1993011158A2 (en) * | 1991-12-06 | 1993-06-10 | Akzo Nobel N.V. | Non-a, non-b peptides |
| SG77551A1 (en) * | 1992-03-06 | 2005-04-28 | Innogenetics Nv | Process for the determination of peptides corresponding to immunologically important epitopes and their use in a process for determination of antibodies or biotinylated peptides corresponding to immunologically important epitopes, a process for preparing |
| US6709828B1 (en) | 1992-03-06 | 2004-03-23 | N.V. Innogenetics S.A. | Process for the determination of peptides corresponding to immunologically important epitopes and their use in a process for determination of antibodies or biotinylated peptides corresponding to immunologically important epitopes, a process for preparing them and compositions containing them |
| US6667387B1 (en) | 1996-09-30 | 2003-12-23 | N.V. Innogenetics S.A. | HCV core peptides |
| FR2690921B1 (fr) * | 1992-05-06 | 1995-06-30 | Bio Merieux | Polypeptides de synthese appartenant au virus de l'hepatite c (vhc) et utilisables notamment pour detecter ce dernier. |
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