ES2255068T3 - Peptidos especificios para hcv, preparaciones relacionadas y su uso. - Google Patents
Peptidos especificios para hcv, preparaciones relacionadas y su uso.Info
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Abstract
LA INVENCION TRATA DE POLIPEPTIDOS PARA LA DETERMINACION INMUNOQUIMICA DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS DEL HCV Y ANTIGENOS DEL HCV AS`COMO LOS COMPUESTOS APROPIADOS PARA ESTE PROCEDIMIENTO Y SU UTILIZACION. LA INVENCION TRATA ADEMAS DE UN PROCEDIMIENTO INMUNOQUIMICO PARA LA DETECCION SIMULTANEA Y/O DETERMINACION SIMULTANEA DE VARIOS ANTICUERPOS DIFERENTES Y ESPECIFICOS PARA DIFERENTES PATOGENOS EN UN UNICO TEST.
Description
Péptidos específicos para HCV, preparaciones
relacionadas y su uso.
La invención se refiere a polipéptidos para la
determinación inmunoquímica de anticuerpos específicos para VHC y
antígenos de VHC, así como a medios adecuados para estos
procedimientos y a su uso.
La invención también se refiere a un
procedimiento inmunoquímico para la simultáneo comprobación y/o para
la simultánea determinación de varias especificidades distintas de
anticuerpos respecto de en cada caso diferentes agentes patógenos en
una sola prueba.
La hepatitis no A/no B (NANBH) se considera una
enfermedad transmisible, o bien, un grupo de cuadros clínicos como
asociada a un virus y puede diferenciarse de otros cuadros clínicos
inducidos por virus, que son generados por diferentes virus de
hepatitis, como el virus de hepatitis A (VHA), el virus de hepatitis
B (VHB), el virus de hepatitis D (VHD) y de hepatitis E (VHE).
Finalmente pueden diagnosticarse hepatitis que son generadas por el
virus citomegalia (VCM) o el virus Epstein Barr (VEB).
Sobre la base de relevamientos epidemiológicos
pueden definirse según la vía de transmisión al menos dos hepatitis
no A/no B (NANBH): el virus de hepatitis epidémico (NANBV
transmitidos entéricamente) que es transmitido a través del agua y
los alimentos, así como el virus de hepatitis
post-transfusional (blood transmitted NANBV) que es
transmitido a través de la sangre, pinchazos de aguja etc. Además de
estas vías de infección, también se conocen transmisiones que no
presentan una relación evidente con los dos tipos mencionados, al
ser NANBV que se presentan esporádicamente ("community acquired
NANBV"). Aunque no se conoce el número exacto de agentes o virus
que producen una NANBH, recientemente se identificó el así llamado
virus de hepatitis C (VHC) como el agente patógeno primario (WO
89/04 669).
Un diagnóstico clínico hasta hace poco tiempo se
basaba principalmente en la determinación serológica de antígenos
y/o anticuerpos con acción contraria, donde las pruebas son
específicas para parámetros del grupo de los agentes patógenos de
hepatitis VHA, VHB, VHD, VHE, VMC o VBE. En este procedimiento
denominado de exclusión sólo se diagnosticó una NANBH, cuando todas
las determinaciones que se indicaron previamente fueron
negativas.
Además también se utilizaron los así llamados
marcadores sustitutos, como p. ej. GPT
(glutamato-piruvato-transaminasa,
también denominada ALT - alanina aminotransferasa) o anti HBc
(anticuerpos específicos de hepatitis B). Pero estos elementos
auxiliares no son ni tan sensibles, ni tampoco específicos para
poder considerarse confiables. Al analizar los donantes de sangre,
puede por lo tanto sólo evitarse una pequeña parte de las hepatitis
post-transfusionales que se produce en
aproximadamente un 10% de los pacientes transfundidos. La urgencia
de introducir una prueba específica es aún subrayada, por afirmar
que NANBV es el causante de alrededor del 90% de las hepatitis
post-transfusionales. La dificultad principal de
esta enfermedad radica en el hecho que entre un 25% y 55% de los
infectados sufren daños hepáticos crónicos.
Con el descubrimiento del VHC se creó la base
para una comprobación específica de VHC o de anticuerpos específicos
para VHC. El aislamiento y la caracterización del VHC, o bien de las
correspondientes replicaciones de ADNc de partes del genoma de VHC,
constituye un objeto de la WO 89/04 669, donde se clasifica el VHC
en la familia de los virus símil flavi. Allí también se describe el
uso del antígeno VHC para la comprobación de anticuerpos específicos
para VHC, así como la producción de anticuerpos para la
determinación diagnóstica de antígeno en la sangre del paciente.
Aunque se utilizan proteínas obtenidas por ingeniería genética, en
especial las así llamadas proteínas no estructurales (NSP) de la
región del marco de lectura abierto "open reading frame
region" (ORF) que se utilizan como compañeros de reacción en
procedimientos de prueba inmunoquímicos.
Se entiende por procedimiento inmunoquímico en el
sentido de esta invención, todos los procedimientos que como métodos
en vitro homogéneos (en solución) o heterogéneos (con fase
sólida) permiten la determinación de antígenos y/o anticuerpos de
las clases de inmunoglobulina A, D, E, G o M (IgA, IgD), IgE, IgG o
IgM) en fluidos corporales como suero, plasma, saliva, líquido
cefalorraquídeo u orina. Son ejemplos para estos procedimientos
también denominados inmunoensayos, los inmunoensayos enzimáticos
(ELISA o EIA), radioinmunoensayos (RIA), ensayos de
inmunofluorescencia (IFA), radioinmuno-precipitación
(RIPA), difusión en gel agar etc.
En el documento WO 89/04 669, por ejemplo, se
utilizó como comprobación de anticuerpos específicos para VHC (anti
VHC) el allí enunciado antígeno
C-100-3 en la ejecución ELISA. La
construcción C100-3 del área NSP 3/4 expresada por
ingeniería genética en células de levadura, abarca 363 secuencias de
aminoácidos, cuya secuencia se representa en la Figura 1, donde el
sistema de numeración corresponde al de la patente indicada
previamente.
La máxima sensibilidad que puede lograrse con el
procedimiento ELISA para determinar anti VHC en muestras de origen
humano, se considera en pacientes NANB crónicos en alrededor de un
80% y en pacientes NANB agudos en alrededor de un 30%. Estos
resultados en sangre de pacientes humana son corroborados por
correspondientes estudios en chimpancés que fueron infectados con
NANBV.
Allí recién se logra una comprobación positiva de
anti VHC sobre la base de una construcción
C-100-3 después de aproximadamente
6-18 semanas después de realizado un aumento de ALT,
lo que a su vez puede detectarse como síntoma de enfermedad
3-10 semanas después de la inoculación del NANBV. De
ese modo resultan 9-26 semanas después de la
infección de un chimpancé como período total, hasta que con el
inmunoensayo puede comprobarse anticuerpos específicos para VHC con
la construcción C-100-3 según el
estado de la técnica.
En el documento WO 90/11 089 se describen otras
secuencias de aminoácidos del VHC que pueden utilizarse para la
comprobación de anti VHC. Pero no se indican datos respecto de la
relevancia diagnóstica de determinados segmentos de proteínas, ni
tampoco se encuentran ejemplos de epitopos inmunodominantes.
Un problema fundamental para la comprobación de
anti VHC mediante los procedimientos conocidos en la literatura, son
las muestras aún subsistentes que reaccionan de modo
falso-positivo y falso-negativo.
Pero las muestras falso-positivo pueden ser de hasta
un 40% en el grupo de donantes de sangre sanos (WEINER A., et
al. Lancet 1990, Vol. 336, pág. 695). Debido a la carencia de
una prueba específica y sensible al VHC, por lo tanto se desecha
erróneamente una significativa proporción de muestras
falso-reactivas en el sistema de donaciones de
sangre y a su vez aún no pueden detectarse de modo confiable a los
pacientes que realmente son positivos para anti VHC.
A fin de eliminar estas desventajas, otros grupos
de trabajo seleccionaron determinadas secuencias de la región ORF de
C-100-3 (del documento WO 89/04 669,
Fig. 1) y las utilizaron en un inmunoensayo (péptidos sp42, 117, 67
y 65, Fig. 2). Al estudiar los chimpancés infectados con NANB no
pudo lograrse mejorar los valores de diagnóstico. Más aún, de las
observaciones allí realizadas se concluyó que ninguno de los
péptidos descritos es adecuado para usarse como base de una
determinación IgG o IgM confiable, dado que la sensibilidad no es
suficiente y la brecha de diagnóstico de al menos 7 a 17 semanas
hasta poder realizar la comprobación del anticuerpo no significa una
abreviación respecto de los métodos de comprobación usuales. Además
se encontró que especialmente el sp42 con una brecha de diagnóstico
de 20 a 40 semanas es inapropiado para una prueba de diagnóstico
(SAFFORD J. et al. Int. Symp. On viral Hepatitis and Liver
Disease 1990 Houston, EE.UU.).
El polipéptido denominado como sp67, empero, debe
ser inmunodominante, aunque con este péptido solamente fue posible
registrar un 86% de las muestras anti VHC positivas (DAWSON, G.J.,
et al. Int. Congress of Virology 1990, Berlín, FRG).
Dicen haber logrado una mejoría con el
péptido-núcleo obtenido sintéticamente (OKAMOTO H.,
et al. Japan. J. Exp. Med. 1990, vol. 60, Nº4, pág.
223-233). Allí se eligió una secuencia de los tres
sitios potenciales de unión de anticuerpos disponibles en total, de
la secuencia de aminoácidos de núcleo 1-120 (OKAMOTO
H., et al. Japan. J. Exp. Med. 1990, vol. 60, Nº3, pág.
167-177) utilizando criterios de de predeterminación
fisicoquímicos según HOPP y WOOD (Proc. Nat. Acad. Sci. 1981, Vol.
78, pág. 3824-3828). Este péptido representado en la
Fig. 3 abarca 36 aminoácidos de la numeración Nº 39 al Nº 74.
En contraposición a la prueba anti
C-100 pudo comprobarse mediante un ELISA basado en
este péptido de núcleo, la existencia de anticuerpos VHC en algunos
sueros positivos para anti VHC. Este resultado se confirmó mediante
un estudio comparativo utilizando la reacción de la cadena de
polimerasa (PCR) para la comprobación de
ARN-VHC.
Aunque justamente se reconoce a partir de 26
muestras positivas para VHC anti núcleo (4,3%) determinadas en un
estudio de 606 donantes de sangre, que sólo pudieron comprobarse 10
(1,65%) de casos mediante PCR. A la inversa, 16 donantes (2,65%)
mostraron una reacción falso-positiva con este
péptido. Por lo tanto dicen que el péptido de núcleo indicado puede
ser más apropiado en algunos casos para un procedimiento de
comprobación de anti VHC que la prueba anti C-100,
pero en general el péptido de núcleo del estado de la técnica
presenta una notoria tendencia a inconvenientes.
La presente invención por lo tanto se basó en el
objetivo de desarrollar una prueba, con la cual se puede comprobar
infecciones de VHC lo antes posible y con elevada especificidad.
Sorprendentemente se encontró que determinados
polipéptidos del área de la región ORF de
C-100-3 y/o del área
amino-terminal de la región de núcleo de VHC son
especialmente adecuados para la comprobación de anticuerpos
específicos de VHC y puede lograrse un notorio aumento de la
sensibilidad respecto de péptidos del estado de la técnica y
simultáneamente una tendencia a presentar inconvenientes causados
por reacciones falso-positivas significativamente
disminuida.
Se encontró además que con los péptidos de la
invención se logra una elevada concentración de antígenos y con ello
una elevada densidad de epitopos en un procedimiento de comprobación
inmunoquímico. Ello es posible especialmente cuando debido a la
ausencia de combinaciones interfirientes se posibilita el análisis
de muestras de pacientes altamente concentradas.
También resultó totalmente sorprendente que los
péptidos de la invención portan epitopos inmunodominantes para
anticuerpos de VHC tempranos o tardíos y pueden así utilizarse de
modo especialmente ventajoso para los estudios en serie.
Un objeto de la invención es por lo tanto las
mezclas de péptidos que reaccionan específicamente con anticuerpos
contra una infección de VHC, siendo que sus secuencias de
aminoácidos contienen partes de la región ORF de
C-100-3 y/o de la región de núcleo
de VHC amino-terminal.
Los conceptos péptidos y polipéptidos se utilizan
en el sentido de la invención todos en el mismo sentido para
péptidos con hasta alrededor de 80 AA.
Los péptidos utilizados para la preparación de
mezclas de péptidos de la invención incluyen preferentemente
secuencias de aminoácidos de AA 121 a AA 175 (Fórmula I), así como
de AA 337 a AA 363 (Fórmula II) de la sección de genoma de VHC
denominado como C-100-3 con las
siguientes secuencias:
Son polipéptidos de preferencia:
\vskip1.000000\baselineskip
Para la comprobación de anticuerpos tardíos de
una infección de VHC resultaron especialmente adecuadas las
secuencias del área terminal carboxi y amino, como por ejemplo, los
péptidos 4081, 4056, 4055 así como el 4060 indicado a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Sorprendentemente también resultó especialmente
adecuada para la comprobación de anticuerpos tardíos el área
terminal carboxi de la región ORF de
C-100-3 que contiene los aminoácidos
de la Fórmula 11 o partes de los mismos, por ejemplo 4091.
También se encontró que el área media de la
Fórmula I es relevante para la captación temprana de anti VHC. De
preferencia son aquí los ya mencionados polipéptidos 4071 y 4072 así
como los péptidos 4054, 4053 y 4052.
En el péptido según Fórmula 1 se localizaron
además 3 epitopos, de los cuales uno reconoce anticuerpos (S) y los
otros anticuerpos tempranos (F1 y F2).
A modo de ejemplo se prefieren péptidos con una
de las siguientes secuencias de aminoácidos:
(S)AA_{a1}-DREVLYR-BS_{b1}
(F1)AA_{a2}-QHLFYIE-BS_{b2}
(F2)AA_{a3}-KQKALGL-BS_{b3}
donde AA y BS significan un
aminoácido cualquiera y donde a1-a3 y
b1-b3 son en cada caso independientemente entre sí,
números enteros iguales o mayores a
cero.
Es ventajoso seleccionar las secuencias con
terminal amino junto con las secuencias de aminoácidos con terminal
carboxi de la Fórmula 1 y las secuencias de la Fórmula II. La
secuencia central de aminoácidos de la Fórmula 1 de alrededor de 130
a 160 puede utilizarse en forma separada.
Además los péptidos utilizados para la
preparación de mezclas de péptidos según la invención, incluyen
partes de la región de núcleo de VHC terminal amino, de preferencia
cualquier secuencia de aminoácidos de AA 1 a AA 35 de la sección de
genoma de VHC descrito como núcleo con la siguiente secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3.5cmMSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVY
\hskip3cm(III)
\newpage
Los péptidos preferidos son:
De especial preferencia son los péptidos SP 10 y
SP 23.
Con ayuda de los péptidos de la región de núcleo
pueden registrarse tanto anticuerpos tempranos de fases agudas de
infección, como también anticuerpos tardíos, que mejora
esencialmente la sensibilidad de la comprobación basada en estos
péptidos respecto del estado de la técnica. Otra ventaja es la
elevada especificidad de los péptidos, lo que en general produce una
mínima cantidad de muestras que reacción en forma
falso-positiva.
En general es ventajoso utilizar péptidos,
péptidos enlazados o mezclas de péptidos que son específicos para
anticuerpos de VHC tempranos y tardíos, da con ambos tipos de sitios
de unión pueden registrarse muestras de fases tempranas de
infección, como también las de fases tardías de infección. Asimismo
pueden registrarse con seguridad las conversiones séricas causadas
por anticuerpos IgG y/o IgM específicos para VHC, siendo posible
discriminar con una exactitud extraordinariamente alta las muestras
positivas y negativas. Además en general no existen interferencias a
través de un sistema de expresión necesario para una representación
de proteínas por tecnología genética u otras contaminaciones de
células huésped inevitables en el cultivo de virus. Además, en los
sueros y plasmas de citrato, heparina y EDTA de origen humano está
asegurada en general una determinación segura de anticuerpo
específicos para VHC y una inactivación de las muestras durante
aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 56ºC en general no
produce resultados falso-positivos. Finalmente, a
través de estos péptidos de la invención pueden prepararse
anticuerpos específicos mediante los cuales a través de la
determinación inmunoquímica de los correspondientes antígenos en la
sangre de pacientes libre de células, puede cerrarse aún más la
brecha de diagnóstico.
Aquí se describe una serie de péptidos que
preferentemente registran anticuerpos específicos para VHC de
pacientes reconvalecientes o con infección crónica y/o anticuerpos
de VHC de fases de infección agudas, y se describen polipéptidos así
como mezclas de péptidos de la invención que son adecuadas como base
de ensayos de monitoreo para la comprobación sin diferenciación,
pero altamente sensible y con poca tendencia a interferencias, de
anti anticuerpos de VHC.
También se describen anticuerpos que tienen una
afinidad bioespecífica con al menos uno de los péptidos que se
describieron previamente de la región ORF de
C-100-3 o de la región de
núcleo.
A través de la determinación inmunoquímica de los
correspondientes antígenos con los anticuerpos descritos en la
sangre de pacientes libre de células, ya puede determinarse la
existencia de VHC antes de que se produzcan anticuerpos propios del
organismo.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
inmunoquímico para la comprobación y/o la determinación de
anticuerpos VHC con las mezclas de péptidos de la invención como
antígeno.
También puede concretarse un procedimiento a los
fines de un diagnóstico diferencial entre la fase temprana o tardía
de la infección, donde en cada caso uno o varios péptidos que
reaccionan específicamente a anticuerpos tempranos y uno o varios
péptidos, que reaccionan específicamente a anticuerpos tardíos, se
hacen reaccionar con la muestra en preparados diferentes.
Además es un objeto de la invención el uso de
mezclas de péptidos según la invención para la producción de
anticuerpos en mamíferos, especialmente en seres humanos.
Otro objeto de la invención por lo tanto también
son medios que contienen mezclas de péptidos de la invención o
anticuerpos solos o junto con otros péptidos o anticuerpos.
Otro objeto son procedimientos para la
preparación de un medio para su uso como inmunógeno para la
preparación de anticuerpos en mamíferos, especialmente humanos.
Los mencionados péptidos inmunorreactivos pueden
prepararse por síntesis o ingeniería genética, preferentemente por
síntesis según procedimientos conocidos por el especialista. La
síntesis química de los péptidos puede prepararse por ejemplo según
BARANI G. y MERRIFIELD, R.B. en "The Peptides, Analysis, Synthesis
and Biology", Vol. 2, Academic Press 1980, Ed. Erhard Gross,
Johannes Meyenhofer, especialmente como un polipéptido o como mezcla
de varios péptidos pequeños con una secuencia de aminoácidos
superpuesta o no superpuesta.
También se incluyen en los polipéptidos
preparados por ingeniería genética, las proteínas de fusión, cuya
proporción de fusión fue escindida posteriormente. Asimismo se
incluyen los polipéptidos que en su caso fueron modificados por
ejemplo mediante glucosilación, acetilación o fosforilación.
Estas secuencias de aminoácidos pueden
sintetizarse tanto como un polipéptido, como también como mezcla de
varios péptidos menores con secuencia de aminoácidos superpuesta y
no superpuesta.
También se encontró que para una comprobación
inmunoquímica anti VHC, las mezclas de péptidos individuales pueden
tener mejores propiedades de diagnóstico, que péptidos individuales
de las estructuras mencionadas. Es especialmente ventajoso, cuando
se utilizan mezclas de péptidos de la región ORF de
C-100-3 y de la región de
núcleo.
Por lo tanto, es un objeto de la invención, las
mezclas de péptidos que contienen uno o varios de los péptidos que
se describieron.
En otra forma de realización se enlazan 2, o
bien, varios de los péptidos, de preferencia 2 a 10, especialmente 2
a 4 péptidos con o sin puente. La longitud de los péptidos asciende
de preferencia 6 a 15 aminoácidos. Incluso pueden prepararse formas
poliméricas de dos o más péptidos según los métodos conocidos por el
especialista, o bien pueden ser unidos a un portador, como por
ejemplo, una proteína o una partícula de látex. Así, por ejemplo son
especialmente adecuados como portadores o como puente, por ejemplo
albúmina sérica humana y/o polilisina. Los péptidos también pueden
modificarse mediante una prolongación con 1 a 40, de preferencia 1 a
20, especialmente 1 a 10 aminoácidos. Las áreas y estructuras
adicionales pueden influenciar positivamente el comportamiento
fisicoquímico del péptido completo, aunque debe mantenerse la
inmunorreactividad de los péptidos o de partes de los mismos.
Asimismo también se describen péptidos que están
unidos entre sí con o sin puente, o bien, también pueden estar
unidos a un portador.
Tales modificaciones en general modifican la
absorción pasiva o la propiedad de unión covalente a la fase sólida
en forma positiva, alteran ventajosamente el procedimiento de
acoplamiento o actúan más intensamente como antígeno durante la
producción de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos
contra los péptidos.
Por ejemplo, asimismo se describen los péptidos
de la siguiente Fórmula
AS_{n}-QRKTKRNTNRRPQDVK-BS_{m}
Donde AA y BA significan un aminoácido cualquiera
y n y m son independientemente entre sí cada uno números enteros de
0 a aprox. 60, especialmente de 1 a 40.
Con frecuencia es ventajoso que los péptidos son
derivados de múltiples formas, como por ejemplo por acoplamiento con
terminal amino o terminal carboxi de uno o varios aminoácidos,
preferentemente cisteína, para lograr por ejemplo la unión de
péptidos entre sí o a un portador, la amidación del ácido
tioglicólico, la amidación del terminal carboxi, como por ejemplo,
con amonio o metilamina. Tales modificaciones pueden modificar la
carga neta del polipéptido y mejorar las propiedades fisicoquímicas
del péptido o la unión covalente del péptido a un portador fijo, a
proteínas portadoras o a otro péptido. También es de conocimiento
del especialista que los péptidos descritos también pueden
prepararse entre sí o consigo mismo por ingeniería genética o por
síntesis de modo tal, que existen varios epitopos inmunorrelevantes
en un péptido.
Además se describen péptidos para la preparación
de mezclas de péptidos de la invención con una secuencia de
aminoácidos modificada mediante el reemplazo de uno o varios
aminoácidos.
Por lo general, tales modificaciones no producen
modificaciones directas de la inmunorreactividad de un péptido,
aunque pueden de todos modos lograrse mejoradas propiedades
inmunológicas de los péptidos. De ese modo, por ejemplo, la
metionina tiende a la oxidación espontánea, lo que puede evitarse al
reemplazar con norleucina, sin que se modifiquen esencialmente las
propiedades antigénicas del polipéptido.
Es de conocimiento del especialista que las
secuencias dadas de aminoácidos pueden someterse a las más
diferentes modificaciones, como por ejemplo, supresiones,
inserciones o sustituciones, con lo que pueden lograrse diferentes
ventajas. Tales modificaciones se refieren, por ejemplo a
combinaciones como Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser,
Thr; Lys, Arg; Phe, Tyr; Ala, Ser; Ala, Thr; Ala, Val; Ala, Pro;
Ala, Glu; Leu, Gln; Gly, Phe; Ile, Ser e Ile, Met.
Asimismo puede ser ventajoso mejorar las
propiedades de absorción del polipéptido, al adicional una secuencia
hidrófoba que abarca aproximadamente 2 a 20 aminoácidos hidrófobos,
como por ejemplo, Phe Ala Phe Ala Phe.
En una comprobación inmunoquímica por lo general
se resumen procedimientos que como métodos homogéneos (en solución)
o heterogéneos (con fase sólida) permiten la determinación de
antígenos y/o anticuerpos. Son ejemplos para estos también llamados
inmunoensayos, los inmunoensayos enzimáticos (ELISA o EIA),
radioinmuno-ensayos (RIA), ensayos de
inmunofluorescencia (IFA), radioinmuno-precipitación
(RIPA), difusión en gel agar etc.
Estos múltiples métodos muy diferentes se
diferencian por formas de realización especiales, por los marcadores
o el principio de medición utilizados para la detección (p. ej.
fotométrica, radiométrica, visual, o bien, a través del
comportamiento de adición, de distribución lumínica o de
precipitación) y por las fases sólidas. Es de conocimiento del
especialista que una separación de de anticuerpos o antígenos de
muestras ligadas o libres está ampliamente difundida, pero no es
imprescindible, como por ejemplo, en los así llamados ensayos
homogéneos. De preferencia son los inmunoensayos heterogéneos,
especialmente los procedimientos ELISA heterogéneos.
También es de conocimiento del especialista que
el concepto "prueba de confirmación" sólo describe la
aplicación de un inmunoensayo, de modo similar al de las pruebas
denominadas procedimientos-dot, sólo describen de
qué modo se inmoviliza el antígeno.
En la comprobación del anticuerpo, un
procedimiento inmunoquímico de comprobación presupone durante el
desarrollo el contacto de la muestra con las secuencias de péptidos
descritas, a fin de conformar un complejo
anticuerpo-antígeno en un determinado del respectivo
procedimiento, o para evitar en pruebas de competición e inhibición,
la formación del mismo mediante el agregado de los apropiados
reactivos marcados.
En los procedimientos directos, los anticuerpos
pueden ser contactados con péptidos unidos en fase sólida o con
péptidos marcados o con ambos, careciendo de importancia, si el
procedimiento originaria como métodos de uno, de dos o de varios
pasos se basa en el principio de la segunda prueba de anticuerpos o
de la estructura inmunométrica de la prueba (sándwich
doble-antígeno), ya sea con péptidos iguales o
diferentes (o mezclas de péptidos) en la base sólida y como reactivo
líquido para la detección, así como junto con específicos
anticuerpos llamados de captura (p. ej. anti IgM) o reactivos de
afinidad (p. ej. proteína A).
La unión de los péptidos a la fase sólida puede
efectuarse de modo covalente, por adsorción o mediante anticuerpos
específicos o métodos similarmente afines, p. ej. mediante el
complejo biotina/avidina, pero de preferencia por adsorción.
Como portador para la fase sólida son apropiados
los materiales sintéticos como poliestireno, cloruro de polivinilo,
poliamida y otros polímeros sintéticos, polímeros naturales, como
celulosa, así como polímeros naturales derivados, como acetato de
celulosa y nitrocelulosa, como también vidrio, especialmente fibra
de vidrio.
De preferencia, el portador es poliestireno.
Los portadores pueden presentar la forma de
esferas, varas, tubitos y placas de microtitulación o estar
disponibles en forma de suspensiones, como p. ej. partículas de
látex. También son apropiadas las conformaciones bidimensionales,
como papel en tiras, plaquitas y membranas. La superficie de los
portadores puede ser permeable, como también impermeable para
soluciones acuosas.
Los portadores preferidos son esferas, tubitos,
pequeñas escudillas, micropartículas, papeles en tiras y membranas.
Son portadores de especial preferencia las placas de
microtitulación, partículas de látex, esferas de poliestireno o
partículas que pueden atraerse magnéticamente.
Las concentraciones de péptidos para el
recubrimiento del portador asciende en general aprox.
0,01-20 \mug/ml, de preferencia
0,01-10 \mug/ml, de preferencia especial de
2-10 \mug/ml. De especial preferencia es el uso de
polipéptidos preparados por síntesis, cuya elevada pureza e intensa
antigenicidad permite el uso de mínimas cantidades de por ejemplo
0,01-2,0 \mug/ml, de preferencia
0,1-0,5 \mug/ml. La capacidad de unión del
portador, especialmente al utilizar poliestireno, por lo general no
está saturada, de modo que habitualmente puede realizarse un
recubrimiento con varios polipéptidos diferentes, en especial con
2-5, ante todo con 3-4 diferentes
polipéptidos, lo que es especialmente ventajoso.
Al utilizar los péptidos como derivados marcados
para la detección se incluyen todas las técnicas de acoplamiento
conocidas por el especialista. También pueden disponerse
procedimientos de varias fases, como por ejemplo complejos
preformados de péptido-anticuerpo, en los cuales el
anticuerpo porta la marcación, o sistemas de alta afinidad, como por
ejemplo, biotina/avidina con marcación de uno de estos compañeros de
reacción.
Como marcadores pueden usarse, por ejemplo
isótopos radioactivos, fluorescentes o colorantes
quimioluminiscentes. También las enzimas que pueden comprobarse por
ejemplo, mediante sistemas de sustratos cromógenos, luminógenos o
fluorógenos o mediante sistemas post-conectados de
intensificadores con una segunda enzima que es activada por la
primera.
De preferencia se usan enzimas como marcadores,
especialmente la fosfatasa alcalina y/o la peroxidasa de rábano
picante o quimioluminógenos, como por ejemplo, el éster de
acridinio.
La marcación se efectúa según procedimientos que
se describieron en el estado de la técnica para los marcadores
mencionados.
En el caso de la marcación de los anticuerpos con
peroxidasa, puede usarse la técnica de peryodato según NAKANE et
al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22,
1084-1090, o un procedimiento según ISHIKAWA et
al., 1983, J. Immunoassay 4, 209-327, en el cual
los compañeros de reacción son ligados con un reactivo
heterobifuncional.
Además de estos procedimientos, los péptidos
pueden utilizarse para la sensibilización de superficies adecuadas,
como por ejemplo, látex o eritrocitos, a fin de medir mediante los
anticuerpos específicos de péptidos, modificaciones fisicoquímicas
inducidas, como por ejemplo, precipitación, adición o dispersión de
luz, en forma automática o visual. Se conoce que los péptidos
también pueden usarse en forma no derivada para la inhibición de
estos principios de medición, como también de los métodos que se
enunciaron previamente.
Para la comprobación de los antígenos pueden
usarse procedimientos de inmunodiagnóstico que utilizan anticuerpos
policlonales o monoclonales preparados mediante péptidos de la
invención o derivados de ellos. Las formas de realización apropiadas
para el procedimiento de comprobación son conocidas por el
especialista y se caracterizan porque en un determinado paso se
forman complejos de anticuerpo-antígeno o la
formación de complejos es inhibida en el procedimiento de
competición mediante el agregado de un antígeno marcado.
Para el establecimiento de una prueba de
antígenos se incluyen como fases sólidas, marcadores o principio de
medición todas las posibilidades explicadas en la correspondiente
determinación de anticuerpos, donde se prefiere especialmente como
método inmunoquímico el principio de competición y la técnica
sándwich-anticuerpo doble. Allí carece de
importancia, si los procedimientos están concebidos como
procedimientos de uno, dos o tres pasos. Así pueden efectuarse
procedimientos de varios pasos con anticuerpos de comprobación no
marcados, que se determinan mediante otro anticuerpo
correspondientemente marcado que está orientado contrariamente. Para
la producción de anticuerpos es ventajoso modificar los péptidos de
modo tal, que se mejora su propiedad inmunogénica, como es posible
por ejemplo mediante el acoplamiento a la albúmina sérica o la
hemocianina keyhole limpet (B.S. Schaffhausen en Hybridoma
Technologie in the Biosciences and Medicine, ed. T. A. Springer,
Plenum Press NY, Londres,
1985).
1985).
Finalmente, la presente invención también puede
aplicarse al utilizar un elemento de inmunodiagnóstico que contiene
la fase sólida y en forma seca una parte o también todos los
reactivos necesarios, donde también aquí los nuevos péptidos están
contenidos ya sea en la fase sólida o en el reactivo de detección o
en ambos, y se lleva a cabo una determinación de anticuerpos, una
comprobación de antígenos o combinaciones con otras sustancias
analizadas.
Una ventaja de los péptidos utilizados para la
preparación de las mezclas de péptidos de la invención es que
permiten una determinación confiable de anticuerpos de VHC. Además,
a través de estos péptidos también pueden registrarse anticuerpos
tempranos de fases agudas de infección, lo que mejora notoriamente
la sensibilidad de la comprobación basada en estos péptidos,
respecto del estado de la técnica y además permite por un lado
diferenciar entre fases agudas y por el otro entre estadios crónicos
o bien, reconvalecientes, en los casos que los péptidos se
utilizaron con los correspondientes sitios de unión para estos tipos
de anticuerpos (anticuerpos tempranos, o bien, tardíos) separados
entre sí en dos diferentes procedimientos de prueba.
Finalmente resulta como ventaja adicional, la
elevada especificidad de los péptidos de la presente invención, lo
que minimiza la cantidad de muestras con reacción
falso-positiva.
En vistas por una parte de la seguridad del virus
en el sistema de donaciones de sangre y por la otra por razones de
economicidad, se desarrollaron las así llamadas pruebas combinadas,
las que estando disponibles desde 1989 permiten una comprobación
simultánea no diferencia de anti VIH 1 y anti VIH 2 (K. Körner et
al., Lab. Med. 14, 159-161, 1990). Este
desarrollo fue posible por la elevada similitud que presentan ambos
subtipos de VIH entre sí, los que además pertenecen a la misma clase
de virus. Así, la determinación de anti VIH 1 en tales pruebas
combinadas de anti VIH 1/2 también se basa en una reactividad
cruzada de anti VIH 1 con antígenos VIH 2 (M. Busch et al.,
Transfusion 30/2, 184-187, 1990), como también a la
inversa, se intensifica la comprobación de anti VIH 2 a través de
las reacciones que se producen de anti VIH 2 con antígenos VIH 1.
Sobre esta base resulta entonces relativamente sencillo establecer
una comprobación combinada de dos especificidades de anticuerpos, si
se utilizan antígenos similares, o bien, de estructura análoga.
La comprobación del agente patógeno de la
hepatitis no A no B, el así llamado virus de hepatitis C (VHC), fue
condicionante para establecer una determinación de anti VHC según la
presente invención. A pesar de la mejora resultante de las
características de rendimiento del ensayo de monitoreo, con las
modernas pruebas anti VHC también se presenta el problema, que al
analizar donantes individuales con pruebas combinadas de VIH por un
lado y con pruebas individuales anti VHC por el otro, se producen un
considerable dispendio y mayores costos.
Todas las versiones hasta el momento disponibles
en el mercado de la determinación de anti VHC, así como la mayoría
de las pruebas combinadas anti VHC, se basan en polipéptidos VHC, o
bien, VIH preparados por ingeniería genética. Pero hasta ahora no se
logró determinar distintas especificidades de anticuerpos en un solo
preparado de prueba que contiene varios antígenos diferentes,
conjuntamente en una comprobación inmunoquímica, si no pueden
utilizarse antígenos similares, dado que en el caso de VHC
(flavivirus) y VIH (retrovirus) pertenecen a diferentes clases de
virus. Por diferentes especificidades de anticuerpos se entienden
aquí anticuerpos que no presentan una reactividad cruzada entre sí
o la presentan en una medida muy reducida. Se Partió del supuesto
que una prueba tal para comprobar un total de tres especificidades
de anticuerpos contra varios antígenos virales diferentes, son más
bien inadecuados respecto de la sensibilidad y la tendencia a
dificultades (especificidad) debido a mutuas interacciones
interfirientes que las correspondientes propiedades de las
respectivas pruebas individuales.
Sorprendentemente también se encontró que varios
anticuerpos diferentes, o bien, especificidades de anticuerpos
contra en cada caso agentes patógenos diferentes, pueden comprobarse
inmunoquímicamente en una sola prueba, cuando se fijaron diferentes
epitopos de diferentes agentes patógenos en cada caso en un solo
portador.
Además, con el procedimiento descrito se
encontraron sensibilidades que equivalen como mínimo a las
sensibilidades de pruebas individuales. Así, por ejemplo, se
determinaron propiedades de sensibilidad para anti VIH 1/2 y anti
VHC para el procedimiento combinado de la invención, que equivalen
al menos a aquellas de las pruebas individuales.
Por lo tanto también resultó totalmente
sorprendente, que con el procedimiento descrito se redujo la
tendencia a presentar inconvenientes debidas a las reacciones
falso-positivas no deseadas. Así, por ejemplo,
durante la verificación de especificidad de una prueba anti VIH/anti
VHC, se obtuvo una especificidad más alta que la resultante de la
suma de ambas pruebas individuales, con la consecuencia que en total
deben desecharse erróneamente una menor cantidad de donaciones de
sangre.
Por lo tanto, también se describe un
procedimiento inmunoquímico para la comprobación y/o la
determinación de varias especificidades distintas de anticuerpos
frente a en cada caso diferentes agentes patógenos, caracterizado
porque uno o varios epitopos de los respectivos agentes patógenos se
fijan en un portador y la comprobación y/o la determinación de los
agentes patógenos mencionados se efectúa en una sola prueba.
Para determinados interrogantes, como p. ej.
análisis en serie, posiblemente sea deseable realizar la
determinación simultánea de diferentes agentes patógenos de modo no
diferenciado. Ello significa que no se distingue entre los
diferentes anticuerpos, sino que solamente se obtiene una respuesta
positiva o negativa (negativa para todas las especificidades de
anticuerpos).
En su caso también es deseable determinar de modo
diferenciado la simultánea comprobación de anticuerpos. Ello es
posible sin más, en el marco de los procedimientos que se
describieron aquí, si p. ej. en una prueba inmunométrica se marcan
de modo diferenciado específico para el virus, los antígenos
utilizados, como p. ej. antígenos VIH 1 con peroxidasa, antígenos
VIH 2 con fosfatasa alcalina y antígenos VHC con
\beta-galactosidasa. Luego pueden determinarse en
forma sucesiva o simultánea, con diferentes sustratos de enzimas las
especificidades de anticuerpos unidos simultáneamente.
Una forma alternativa de diferenciación es la
inhibición de una especificidad de anticuerpo mediante la adición
específica a la muestra del correspondiente antígeno.
Por lo tanto se revela un procedimiento
inmunoquímico para la comprobación simultánea y/o la determinación
simultánea de diferentes especificidades de anticuerpos, donde la
comprobación y/o la determinación se efectúan de modo diferenciada o
no diferenciada, de preferencia de modo no diferenciada.
Como agentes patógenos diferentes se entienden
según el procedimiento de la invención, agentes patógenos, contra
los cuales se dirigen anticuerpos de diferente especificidad y en
general sin actividad de reacción cruzada o con una actividad tal
muy reducida. Estos son por ejemplo VIH 1 + 2, VHC, HTLV I + II, VHB
o Trepanoma pallidum, de preferencia VIH y VHC.
Resulta especialmente ventajoso fijar en un
portador, antígenos de los agentes patógenos mencionados,
especialmente de VIH 1, VIH 2 y VHC, que presentan una alta
densidad, o bien, concentración en sitios de unión (epitopos) de los
correspondientes anticuerpos. De ese modo pueden por ejemplo
registrarse conversiones séricas, es posible una discriminación de
muestras positivas y negativas con una elevada capacidad de
separación, por lo general no puede producirse una interferencia
debido el sistema de expresión necesario para una representación de
la proteína por tecnología genética, por lo general no se presentan
las contaminaciones de células huésped inevitables en los cultivos
de virus, en los sueros y plasmas de citrato, heparina y EDTA de
origen humano está asegurada en general una determinación segura de
anticuerpos específicos para VHC y una inactivación de las muestras
durante aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 56ºC en general
no produce resultados falso-positivos.
De preferencia se utilizan epitopos individuales
y/o combinaciones de los mismos, especialmente de polipéptidos del
VIH 1 y/o VIH 2 y VHC que son adecuados para una comprobación de
alta sensibilidad anti VIH/anti VHC y además las mezclas de
polipéptidos adecuadas como base para un ensayo de monitoreo para
una comprobación combinada de anticuerpos. Por lo tanto, se revelan
además mezclas de polipéptidos de VIH 1 y/o VIH 2 y VHC.
Los siguientes polipéptidos son especialmente
preferidos:
\vskip1.000000\baselineskip
1. VIH 1 (sistema de numeración según Ratner
et al.,
- Nature 1985, 313, 277-284):
- IV proteína transmembrana (gp 41): AA 580-AA 630
- V proteína de recubrimiento (gp 120): AA 490-AA 540
- VI proteína de núcleo (p 24): AA 240-AA 390
\vskip1.000000\baselineskip
2. VIH 2
- (sistema de numeración según Gyader et al.,
- Nature 1987, 326, 662-669):
- VII proteína transmembrana (gp 36): AA 570-AA 620
- VIII proteína de recubrimiento (gp 110): AA 480-AA 530
- IX proteína de núcleo (p 26): AA 230-AA 380
\vskip1.000000\baselineskip
3. VHC (sistema de numeración según WO 89/04669 y
WO 90/11089):
- proteína no estructural 4 (NSP 4): AA 121-AA 175
- XI proteína no estructural 3 (NSP 3): AA 1-AA 265
- XII proteína estructural (de núcleo): AA 1-AA 80
Son de mayor preferencia las mezclas de los
polipéptidos mencionados, especialmente para un ensayo de monitoreo
no diferencial anti VIH/anti VHC, siendo que se describen algunos a
modo de ejemplo sin ser ello delimitativo:
\vskip1.000000\baselineskip
- XIII
- gp 41 VIH 1
- \quad
- gp 36 VIH 2
- \quad
- NSP 3 VHC
\newpage
- XIV
- gp 41 VIH 1
- \quad
- gp 36 VIH 2
- \quad
- NSP 4 VHC
- \quad
- núcleo VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- XV
- gp 41 VIH 1
- \quad
- gp 36 VIH 2
- \quad
- NSP 3 VHC
- \quad
- NSP 4 VHC
- \quad
- núcleo VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- XVI
- gp 41 VIH 1
- \quad
- P 24 HIV 1
- \quad
- gp 36 VIH 2
- \quad
- NSP 3 VHC
- \quad
- núcleo VHC
\vskip1.000000\baselineskip
o
\vskip1.000000\baselineskip
- XVII
- gp 41 VIH 1
- \quad
- P 24 HIV 1
- \quad
- gp 36 VIH 2
- \quad
- P 24 HIV 2
- \quad
- NSP 3 VHC
- \quad
- NSP 4 VHC
- \quad
- núcleo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo general, con las mezclas de péptidos
indicadas se logran mejores propiedades inmunológicas para un uso
diagnóstico.
\newpage
Resultaron especialmente apropiados los
siguientes péptidos de VIH 1, VIH 2 y VHC:
o partes de ellos, por
ejemplo
XXI una mezcla de SP 4060 y SP 4082 (VHC, NSP
4):
XXII SP 10 (VHC, núcleo):
y/o
XXIII SP 31 (VHC, núcleo):
También es posible, integrar otros péptidos de
otras áreas de proteínas de VIH 1, VIH 2 o VHC, en tanto estos
polipéptidos sean inmunorrelevantes. A la inversa también puede ser
ventajoso, por ejemplo para interrogantes epidemiológicos, poder
excluir un anticuerpo específico en la comprobación no diferencial
al omitir los correspondientes péptidos, para por ejemplo determinar
simultáneamente con una mezcla de péptidos VIH 1 y VHC sólo anti VIH
l/anti VHC y no por ejemplo anti HBV/anti VIH l/anti VHC. Los
péptidos no idénticos con VHC, como por ejemplo VIH, pueden
derivarse y modificarse de modo análogo, como se describió
precedentemente para los péptidos VHC.
Una ventaja esencial del procedimiento descrito
es que pueden comprobarse varios anticuerpos contra distintos
agentes patógenos en una sola prueba, y se logra allí una
especificidad o bien sensibilidad tan elevada como en las pruebas
individuales.
Fig. 1 Secuencia primaria de los aminoácidos de
la región ORF de C-1OO-3 (de
WO/89/04669)
Fiq. 2 Comparación de las secuencias de la
invención de
Fórmula I y II con péptidos conocidos de la
región ORF de C-100-3
Fig. 3 Comparación de las secuencias de la
invención de la proteína de núcleo de VHC con péptidos conocidos
Los ejemplos descritos a continuación constituyen
ejemplos de realización de la invención, pero sin constituir
limitación alguna.
Ejemplo
1
A partir de soluciones madre de los péptidos de
la invención en 50% ácido acético en agua destilada, que contiene de
1 a 10 mg de péptido/ml se prepararon series dobles de dilución en
bicarbonato de sodio 0,10 M, pH 9,6, es decir una serie con las
concentraciones 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,78; 0,39; 0,2;
0,1; 0,05 y 0,01 \mug de péptido/ml. En el caso de mezclas de
diferentes péptidos se procedió de modo análogo, donde las
soluciones madre se mezclaron adicionalmente en diferentes
proporciones, p. ej. 10:1 ó 1:4, para obtener mediante la dilución
en bicarbonato de sodio 0,1 M las concentraciones finales totales
que se indicaron previamente, las que al mezclar varios péptidos
contienen a éstos en la misma concentración (en el caso de mezclas
1:1) o en distintas proporciones entre sí.
Se agregaron 100 \mul de cada dilución cada vez
a 16 cavidades de placas de microtitulación, tipo B de la empresa
Nunc, Roskilde, Dinamarca. Las placas de ensayo llenadas con
diluciones se mantuvieron durante 18 horas a 20ºC, luego se
aspiraron las soluciones en las cavidades y se lavaron las cavidades
3-4 veces con 300 \mul de una solución de 10 g/l
de albúmina sérica bovina en solución fisiológica tamponada con
fosfato, (PBS, pH 7,4) mediante un llenado y aspirado y a
continuación se secaron las placas de ensayo sobre gel de sílice a
20ºC.
Se produjeron anticuerpos contra
h-IgG según el método de KOEHLER y MILSTEIN para la
representación de anticuerpos monoclonales (Nature 256, 495, 1975),
identificándose diferentes anticuerpos monoclonales con la misma
especificidad antigénica con el método que describió STAHLI et
al. (J. of Immunological Methods 32, 297-304,
1980).
Después de una purificación por cromatografía en
gel y diálisis contra solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH
7,4), el pool que contiene la fracción de anticuerpos monoclonales
(4 mg de proteína/ml) se transformó a continuación con
N-gamma-maleimidobutililoxisuccinimida
(GMBS), adquirida de la empresa Behring Diagnostics, como se
describió en TANAMORI et al. (J. Immunol. Meth. 62,
123-131, 1983).
Se transformó cloruro de
2-iminotiolanhídrido (empresa Sigman, cat. Nº I
6256) se transformó con peroxidasa de rábano picante (POD),
adquirido de la empresa Boehringer Mannheim, cat. Nº 413470, como se
describió en KING et al. (Biochem. 17,
1499-1506, 1978). A partir del conjugado de
GMBS-IgG y el conjugado de
iminotiolan-POD se preparó un conjugado
IgG-POD, como se describió en TANAMORI et al.
(supra).
La solución obtenida del conjugado
IqG-POD presentó un contenido proteico de 360
\mug/ml. La proporción de POD respecto de IgG se determinó en 2,8.
La solución luego se diluyó a 500 ng/ml IgG-POD con
una solución de 50 ml/l de suero fetal bovino (FKS), 5 g/l
polioxietilen-(20) monolaureato de sorbitano (RTween 20) en PBS y se
denominó conjugado anti IgG/POD. Para el uso en el ELISA se varió la
siguiente dilución en buffer Tris pH 7,4, que contiene 0,5% RTween
20 (dilución entre 1:100 y 1:20.000), a efectos de preparar de modo
uniforme una dilución final de 1:26 en el buffer del conjugado, que
contiene
2-Amino-2(hidroximetil)-l,3-propanodiol
0,1 M (Tris), sal de sodio 0,1 M (NaCl) así como 0,1% RTween pH
8,4.
Los anticuerpos policlonales de conejos
representados según el estado de la técnica, se ajustaron de modo
tal, que asimismo se obtuvo una dilución de uso de 1 + 25.
Para la comprobación del conjugado anti IgG/POD
se utilizó un sistema de sustrato o una preparación de sustrato, que
contiene agua oxigenada y tetrametilbencidina (TMB), que se preparó
a partir de dos soluciones madre.
Solución madre 1: se disolvió diclorhidrato de
TMB bajo agitación en una concentración de 5 g/l, es decir de 16
mmol/l en agua bidestilado y se ajustó con ácido clorhídrico 5 N a
un valor de pH 1,5. A esta solución se agregó penicilina G bajo
agitación en una concentración final de 200 mg/l, es decir, de 0,56
mmol/l.
Solución madre 2: se agregó a 900 ml de agua
bidestilada, 1,4 ml de ácido acético glacial, 1,5 ml de NaOH 1 N y
250 mg, es decir, 3 mmol de H_{2}O_{2} como aducto de
urea-agua oxigenada. Después de disolver
completamente se completó con agua bidestilada a 1 l.
Preparación del sustrato de TMB: una parte en
volumen de la solución madre 1 y 10 partes en volumen de la solución
madre 2 se mezclaron entre sí.
Ejemplo
3
A modo de ejemplo se utilizó un kit de ensayo
ELISA (HP1) que puede obtenerse en el mercado, en el cual se utilizó
como antígeno la construcción
C-100-3 preparado por ingeniería
genética en levadura y descrito en el documento WO 89/04669. Durante
el estudio de de sueros y plasma humanos se procedió como indicado
en el prospecto adjunto al estuche del fabricante, p. ej. dilución
de muestra de 1:11 e incubación de 1 h de suero, incubación de 1 h
del conjugado anti human IgG/POD, así como el sistema de sustrato
enzimático con o-fenilendiamina (OPD) como sustrato,
medición fotométrica a 492 nm, así como la fijación de valor límite
(se agrega al valor medio de los controles negativos un umbral de
0,40 E).
De modo totalmente análogo se trabajó con otro
ELISA (HP 2) que puede obtenerse en el mercado, el que además de la
construcción C-100 contiene adicionalmente epitopos
del área del núcleo, así como del área NSP 3 (c33c), es decir, que
durante el análisis de muestras humanas se aplicó el kit de ensayo
original manteniendo todas las instrucciones de ejecución enunciadas
por el fabricante -como se describió previamente-.
En contraposición, durante la determinación de
anticuerpos específicos para VHC en suero o plasma de chimpancés se
procedió de modo tal con ambos productos comerciales, que con un
anticuerpo policlonal producido en el conejo se detectó contra IgG
humano. Para ello, se purificó la fracción IgG del antisuero de
conejo, como se describió en el ejemplo 2, se dializó y se marcó con
peroxidasa (POD). La concentración final se ajustó en comparación
con el conjugado monoclonal anti IgG/POD con una concentración de
aproximadamente 4 veces, a fin de conformar de modo seguro para IgG
de chimpancés, la reacción cruzada validad en los preensayos de los
anticuerpos contra IgG humano.
La determinación del valor límite debió
modificarse del modo que se describió en la Tabla 10
A-C, dado que los valores iniciales de todos los
valores iniciales de todos los chimpancés ya presentaban valores
superiores (véase Tab. 10 A-C).
En la prueba combinada comparativa de anti VIH 1
+ 2 para la determinación no diferencial de anticuerpos VIH 1 y VIH
2 se trata de un producto que puede obtenerse comercialmente (HP 3),
que se basa en péptidos de VIH 1 y VIH 2 preparados mediante
síntesis. También en esta prueba se procedió según el prospecto
adjunto del fabricante, p. ej. dilución de muestra 1:2, incubación
de 30 minutos del conjugado (anti IgG/POD humano) así como del
sistema de sustrato enzimático con tetrametilbencidina (TMB) como
sustrato, medición fotométrica a 450 nm así como la determinación
del valor límite (al valor medio de los controles negativos se suma
un umbral de 0,250).
Ejemplo
4
Determinación de anticuerpos humanos de la
inmunoglobulina clase G contra VHC en el ELISA con los péptidos de
la invención
Se agregaron 50 \mul de suero o plasma a 50
\mul de buffer de muestra, que contiene Tris 0,3 M, NaCl 0,3 M,
20% de suero bovino y 0,1% de RTween 20 en cavidades de placas de
microtitulación, que se recubrieron del modo descrito con péptidos,
o bien, mezclas de péptidos. Después de la incubación durante 30
minutos a 37ºC se retiró por absorción el contenido de la cavidad y
se lavó las cavidades 5 veces con buffer de lavado que contiene 1
g/l de RTween 20 en PBS. Luego se efectuó el agregado de 100 \mul
de conjugado en dilución final a las cavidades, operándose de
preferencia con una predilución de 1:3000 en Tris-, 0,5% Tween 20 y
una dilución final de 1:26 buffer de conjugado. Después de una
incubación durante 30 minutos a 37ºC, se retiró mediante absorción
el contenido de las cavidades, y se lavó nuevamente cinco veces.
Luego se agregó a cada cavidad 100 \mul de preparación de sustrato
TMB, se incubó durante 30 minutos a 20-22ºC y se
finalizó la incubación mediante el agregado de 100 \mul de ácido
sulfúrico 1 N. La extinción de la solución teñida se midió con una
longitud de onda de 450 nm (E_{450}) en contraposición a un valor
vacío de PBS.
Se clasificaron como positivas para anti VHC
aquellas muestras que produjeron una E_{450} mayor a 0,10, como
valor límite anti VHC las muestras, cuya E_{450} se ubicaba en el
rango de 0,05 a 0,10 y como negativo para anti VHC aquellas muestras
que produjeron una E_{450} inferior a 0,05.
En la Tabla 1 se resumen los resultados que se
obtuvieron por la determinación que se describió en los Ejemplos 1,
2 y 4 de muestras humanas con el péptido 4083 de la invención, así
como una mezcla de secuencias más cortas de la Fórmula I. De modo
análogo se obtienen los datos de la Tabla 2 con el péptido SP 10 de
la invención, comparándose los resultados de ambos ELISA con
aquellos del HP 1 (Ejemplo 3).
| Positivo con péptido ELISA | ||||
| (2 \mug 4083/ml) | (2 \mug 4060/ml y | |||
| 2 \mug 4082/ml) | ||||
| Inicial | retesteo | retesteo | ||
| Positivo | positivo | positivo | ||
| Muestras positivas | ||||
| Para anti VHC (HP1) | ||||
| de Francia | n = 15 | 15 | 15 | 15 |
| de Austria | n = 17 | 17 | 17 | 17 |
| de Alemania | n = 20 | 20 | 20 | 20 |
| de EE.UU. | n = 49 | 49 | 49 | 49 |
| Total | \hskip0.57cm n = 101 | \hskip0.83cm 101^{1)} | \hskip0.83cm 101^{1)} | \hskip0.83cm 101^{1)} |
| Sueros/plasma conjuntos de donantes sanos de sangre | ||||
| N = 250 sueros | 2 | 1 | s.d. | |
| N = 259 plasmas | 1 | 0 | s.d. | |
| ^{1)} \begin{minipage}[t]{148mm} n = 97 muestras mostraron extinciones de >> 2,5 E, de lo que resultaron con un valor límite de 0,10 E, índices de >25\end{minipage} | ||||
| ^{2)} n = 94 muestras mostraron extinciones de > 2,5 E. |
Sólo 4, o bien 7 muestras mostraron una reacción
menor, pero aún bastante intenso con valores E_{450} entre 0,8 y
2,5 y un valor límite de 0,10 E.
\vskip1.000000\baselineskip
| Positivo con péptido ELISA | |||
| (2 \mug SP 10/ml) | |||
| Muestras positivas | Inicial | Retesteo | |
| Para anti VHC (HP1) | positivo | positivo | |
| de Francia | n = 35 | 35 | 35 |
| de Austria | n = 26 | 26 | 26 |
| de Alemania | n = 29 | 29 | 29 |
| de EE. UU. | n = 53 | __53__ | __53__ |
| Total | \hskip1.6cm 143 | 143^{1)} | 143^{1)} |
| Sueros/plasmas conjuntos (véase curva de distribución de donantes de sangre sanos de la Figura 2) | |||
| n = 500 suero | 0 | 0 | |
| n = 500 plasmas | 0 | 0 | |
| ^{1)} \begin{minipage}[t]{148mm} n = 142 muestras mostraron extinciones de > 2,5 E, de lo que resultaron con un valor límite de 0,1 E, índices de >> 25; sólo una muestra mostró una reacción menor, pero aún bastante más fuerte que con el ELISA (HP 1) que se obtiene en el mercado.\end{minipage} |
De las muestras humanas analizadas que habían
sido clasificadas con un ensayo comercial (HP1) como positivas para
anti VHC, se encontró que también fueron positivas todas las
muestras realizadas con todos los ELISA basándose en los péptidos de
la invención. Llama la atención además de la excelente coincidencia
con los resultados del ensayo comercial (HP1) una muy fuerte
formación de señal del péptido de los ELISA. Simultáneamente, se
desprende de los resultados de los estudios en serie de donantes de
sangre sanos, que la tendencia a inconvenientes del ensayo es muy
reducida. Así al analizar suero y plasma de donantes sanos, se
observó una unión inespecífica extremadamente pequeña con los
péptidos de la invención, es decir, sólo se obtuvo una cantidad
reducida de resultados falso-positivos.
En la Tabla 3 se indican otros resultados que se
obtuvieron del estudio de muestras humanas con ELISA (según Ejemplos
1, 2 y 4), que se basan en el uso de secuencias menores (15
aminoácidos) de la Fórmula (I). Se desprende que los péptidos son
adecuados para la definición de epitopos de anticuerpos VHC, o bien,
como mezcla de varios péptidos, que contiene preferentemente de 3 a
6 péptidos, para la determinación de anti VHC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se representan las reactividades, del modo como
fueron obtenidas con una mezcla de péptidos de la invención. Llama
la atención que debido a la muy intensa formación de señal del
péptido de ELISA se logra una discriminación confiable entre los
resultados positivos y negativos. También se lograron resultados
análogos con los siguientes péptidos, o bien, mezclas de péptidos de
la invención.
4074/4081 (cada 2 \mug/ml)
4074/4082 (0,5 y 0,125 \mug/ml)
4060/4071/4081 (cada 2 \mug/ml), resultando
adecuadas las mezclas de péptidos más pequeños que incluyen
aproximadamente 15 AA:
4056/4055 y 4052 (cada 0,5 \mug/ml).
En ningún caso pudo comprobarse la dependencia de
la reactividad de las muestras respecto de su origen geográfico, al
estudiar todos los péptidos de la invención.
\newpage
Ejemplo
5
Como parámetro modificable de la determinación
ELISA se variaron principalmente las concentraciones de péptidos
utilizados en el recubrimiento o en mezclas de péptidos, cuyas
concentraciones totales, así como la relación entre sí con una
concentración constante del conjugado de una dilución de 1:3000 y
1:26. Adicionalmente se varió en las concentraciones fijadas de los
recubrimientos, las prediluciones del conjugado. Ambas magnitudes
modificables se validaron respecto de la especificidad mediante el
análisis de sueros y plasma de donantes de sangre, así como
respecto de la sensibilidad mediante la determinación de anti VHC en
conjuntos positivos. Además, se determinó la sensibilidad límite en
forma de la sensibilidad analítica mediante la dilución serial de
muestras positivas para anti VHC (1:2, 1; 4 etc. en sueros negativos
para anti VHC) y se comparó con los datos de un ensayo comercial,
así como también con los resultados que se obtuvieron utilizando los
péptidos que se describieron en la literatura.
Los resultados obtenidos con muestras humanas se
resumieron a modo de ejemplo en la Tabla 4.
De los ejemplos de la Tabla 4 se desprende que la
sensibilidad de los ELISA que se basan en los péptidos de la
invención, con relación a la sensibilidad límite de titulaciones
séricas es al menos tan buena como el ensayo comercial (HP1) probado
a los fines comparativos en diluciones idénticas de suero. En muchos
casos incluso se midieron muestras diluidas con un resultado
significativamente positivo con el péptido de ELISA, las que en los
ensayos comerciales (HP1) ya evidenciaron una repetida reacción
negativa, de modo que en general resulta una mejor límite de
comprobación de anticuerpos VHC con los péptidos de la invención. Se
lograron resultados análogos asimismo con otras concentraciones de
péptidos, secuencias de péptidos o mezclas de los nuevos péptidos;
como por ejemplo:
- 4083 (0,25 \mug/ml)
- 4014/4081 (cada 0,25 \mug/ml)
- 4014/4082 (cada 0,5 \mug/ml)
- 4074/4082 (0,5 y 0,125 \mug/ml)
- 4060/4082 (cada 2 \mug/ml)
\newpage
Además de la determinación de la sensibilidad
límite, se verificó en sistemas optimados también la especificidad
mediante anticuerpos específicos no VHC, así como otros potenciales
factores de interferencias, de lo que resultó que la determinación
de anti VHC con los péptidos de la invención es específica para VHC
y no está sometida a ningún tipo de interferencias conocidas, como
p. ej., reacciones cruzadas de otros anticuerpos, inconvenientes a
través de la inactivación por calor u otros. Según el sentido ello
también se aplica para otros nuevos péptidos o mezclas de péptidos
indicados, en los cuales se aplicó de modo uniforme una elevada
concentración sérica (dilución 1:2 en buffer de muestra), a efectos
de aumentar la sensibilidad lo que se posibilitó en la fase sólida a
través de la pureza de los péptidos y la elevada densidad de
antígenos.
De las comparaciones resumidas en la Tabla 5
entre otro péptido de núcleo de la invención, el SP10 y HP1 se
desprende asimismo que el péptido de la invención ofrece ventajas
respecto del estado de la técnica, que a su consisten en mejorados
valores de sensibilidad límite, es decir mayor sensibilidad
analítica. Así se determinó una sensibilidad aumentada en el factor
2 a 4 en las 4 titulaciones de la Tabla 5 respecto del péptido
publicado, y en comparación con el ensayo comercial (HP1), aumentada
incluso en un factor 8 a 32.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
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\newpage
La evaluación de otro péptido del núcleo (SP 23)
de la invención produjo resultados similares. En los resultados
representados en forma comparativa en la Tabla 6 puede observarse,
que el SP 23 equivale al SP 10 con respecto de la sensibilidad,
diferenciándose ambos péptidos en forma favorable del péptido que se
describe en la literatura.
Aunque el péptido SP 12 (AS
47-75) análogo a la literatura no corresponde
exactamente al péptido que describe OKAMOTO et al. (AS
39-74), puede verse a través de los resultados de la
secuencia intermedia (SP 11, As 24-53, Tab. 6), que
en el siguiente área de secuencia (AS 39-47) no
existen epitopos inmunorrelevantes y la muy débil reactividad del SP
11 que aún puede comprobarse, se debe al área terminal carboxi allí
contenida del SP 10 (área superpuesta AA 24-30 según
Figura 3).
Resulta especialmente clara esta sorprendente
ventaja de sensibilidad al analizar muestras sin diluir. Así se
determina la reactividad de todas las 11 muestras representadas en
la Tabla 7, positivas para anti VHC con el péptido de la invención,
mientras que el péptido que se describe en la literatura sólo
presenta una reacción positiva en 6 muestras y no reacciona en forma
positiva en ningún caso con el ensayo comercial (HP1). Con respecto
a las muestras con reacción positiva coincidente con ambos péptidos,
llama la atención que el péptido de la invención en las mismas
condiciones de prueba reacciona de modo significativamente más
fuerte, lo que brinda considerables ventajas especialmente para la
discriminación positiva/negativa.
| Suero Nº. | Péptido según la | Péptido descrito en | VHC por ELISA (HP1) | ||
| invención SP10 2 \mug/ml | la bibliografía (OKAMOTO) | cut off 0,454 E | |||
| cut off: 0,100 E | SP12 2 \mug/ml cut off: 0,100 E | ||||
| HC 90-224 | 1,952 | 2,005 | 0,114 | Neg. | |
| HC 90-284 | 2,417 | 0,451 | 0,095 | Neg. | |
| HC 90-289 | > 2,500 | 1,220 | 0,278 | Neg. | |
| HC 90-300 | > 2,500 | 0,288 | g. w. | 0,208 | Neg. |
| HC 90-323 | > 2,500 | > 2,500 | 0,313 | Neg. | |
| HC 90-493 | > 2,500 | 0,051 | Neg. | 0,088 | Neg. |
| HC 90-509 | > 2,500 | 0,081 | Neg. | 0,083 | Neg. |
| HC 90-512 | > 2,500 | 0,049 | Neg. | 0,110 | Neg. |
| HC 90-531 | 2,208 | 0,257 | g.w. | 0,081 | Neg. |
| HC 90-536 | 2,500 | 0,234 | g.w. | 0,069 | Neg. |
| HC 90-494 | 1,279 | n.d. | 0,114 | Neg. | |
| HC 90-495 | > 2,500 | > 2,500 | > 2,500 | Pos. |
Estos resultados derivados de sueros humanos
nativos preseleccionados y con ayuda de titulaciones (Tabla 5) y
(Tabla 7) con los péptidos núcleo se confirman con los resultados
del ensayo con Serumpanel que se obtiene en comercios (lote N.º PHV
202 y lote N.º PHV 201, Boston Biomedica, Estados Unidos).
En detalle, se resumen los resultados del llamado
panel de anti VHC de bajo título en la Tabla 8 y los resultados del
panel de anti VHC de título mixto en la Tabla 9. Los resultados de
los datos obtenidos con el péptido del núcleo según la invención se
confrontaron con los datos obtenidos con pruebas comerciales como
estado de la técnica.
Tabla
8
La Tabla 8 muestra la comparación de la
sensibilidad de un péptido por ELISA (SP 20, 2 \mug/ml) con el
estado de la técnica en caso de muestras nativas positivas para anti
VHC del panel PHV 201, que comprende 15 muestras positivas para anti
VHC de bajo título bien caracterizadas (comercialización del
material y los resultados de ensayo comparativos por la empresa
Boston Biomedica, Estados Unidos). Todos los datos de ELISA se dan
como valores de relación, con los cuales se describe la relación de
extinción de muestras respecto del cut-off. Los
valores < 1,0 se consideran negativos y > 2,0 como
positivos.
| Miembro I.D. | Resultados comparativos | ELISA con péptido según la invención (SP10/2 \mug/ml) | ||
| VHC EIA | VCH ELISA | |||
| Número | S/CO | S/CO | Resultado | S/CO |
| PHV101-01 | 3,717 | 0,964 | POS | 18 + |
| PHV101-02 | 0,167 | 0,268 | N | 0,25 - |
| PHV101-03 | 1,880 | 1,323 | POS | 0,90 - |
| PHV101-04 | 1,757 | 3,076 | POS | > 25 |
| PHV101-05 | 3,404 | 2,169 | POS | 4,0 |
| PHV101-06 | 1,640 | 1,642 | POS | > 25 |
| PHV101-07 | 2,281 | 1,624 | POS | > 25 |
| PHV101-08 | 3,009 | 1,588 | POS | > 25 |
| Miembro I.D. | Resultados comparativos | ELISA con péptido según la invención (SP10/2 \mug/ml) | ||
| VHC EIA | VCH ELISA | |||
| Número | S/CO | S/CO | Resultado | S/CO |
| PHV101-09 | 1,855 | 1,119 | POS | > 25 |
| PHV101-10 | 3,649 | 3,098 | POS | > 25 |
| PHV101-11 | 0,662 | 1,820 | POS | > 25 |
| PHV101-12 | 3,018 | 2,205 | POS | > 25 |
| PHV101-13 | 2,805 | 2,770 | POS | > 25 |
| PHV101-14 | 1,912 | 0,846 | POS | > 25 |
| PHV101-15 | 3,686 | 3,240 | POS | > 25 |
| Miembro | Datos de confirmación | ELISA | |||||||||
| I.D. | RIBA 2.0 | con | |||||||||
| péptido | |||||||||||
| según | |||||||||||
| la inv. | |||||||||||
| (SP 10/2 | |||||||||||
| \mug/ml) | |||||||||||
| Número | 5-1-1 | C-100-3 | C33C | C22-C | Result.* | Alt** | anti | HBsAq* | anti | anti | S/Co |
| HBc* | VIH* | HTLV* | |||||||||
| PHV101-01 | 1 | +/- | +/- | 2 | POS | L | N | N | N | N | 18 + |
| PHV101-02 | - | - | - | - | N | L | N | N | N | N | 0,25 - |
| PHV101-03 | +/- | +/- | +/- | - | N | L | N | N | N | N | 0,90 - |
| PHV101-04 | +/- | +/- | 4 | +/- | POS | L | POS | N | N | N | > 25 |
| PHV101-05 | - | +/- | - | 4 | N | L | N | N | N | N | 4,0 |
| PHV101-06 | +/- | - | 1 | - | POS | L | POS | N | N | N | > 25 |
| PHV101-07 | - | +/- | 1 | 4 | POS | L | POS | N | N | N | > 25 |
| PHV101-08 | +/- | - | 1 | 4 | POS | G | POS | N | N | N | > 25 |
| PHV101-09 | - | - | 1 | 4 | POS | L | N | N | N | N | > 25 |
| PHV101-10 | 1 | - | 2 | 4 | POS | L | POS | N | N | N | > 25 |
| PHV101-11 | 1 | +/- | 1 | 1 | POS | L | N | N | N | N | > 25 |
| PHV101-12 | 2 | - | 4 | 4 | POS | L | POS | N | N | N | > 25 |
| PHV101-13 | +/- | +/- | 3 | 3 | POS | L | POS | N | N | N | > 25 |
| PHV101-14 | +/- | - | 3 | 3 | POS | L | POS | N | N | N | > 25 |
| PHV101-15 | 1 | - | 4 | 4 | POS | L | POS | N | N | N | > 25 |
| *POS = positivo, N = negativo, NA = no aplicable | |||||||||||
| **L = menos que 2 x límite superior de lo normal, G = mayor que 2 x límite superior de lo normal |
Los resultados ALT son aquellos leídos según la
filtración estéril y el envasado y no reflejan el estado ALT del
donante al momento de la donación.
A partir de los datos de la Tabla 8 se puede ver
que, con una excepción (PHV 01-03), todas las
muestras positivas para anti VHC reaccionan bien positivamente con
el nuevo péptido. En comparación con las pruebas comerciales, llama
la atención que la intensidad de la señal, expresada en la señal de
relación de la muestra: cut-off se determinó más
significativamente con el péptido según la invención que con los
ensayos probados de manera comparativa, donde se expresa una
confiabilidad claramente mejorada del nuevo péptido por ELISA.
De acuerdo con estos datos (relación > 25, que
corresponde a extinciones de > 2,5), sólo se trata de muestras de
bajo título según la definición de acuerdo con el estado de la
técnica, que sorprendentemente se determinan de modo muy reactivo
con el nuevo péptido.
Una excepción (muestra 03) surge de los datos del
resultado comparativo de la prueba de confirmación que comprueba una
falta de anticuerpos específicos del núcleo en esta muestra (C22C
representa la proteína del núcleo preparada por tecnología genética
en E. coli). De acuerdo con esta muestra, la muestra 03
incluso debería clasificarse como negativa.
En observaciones similares, se realiza el ensayo
del segundo panel resumido en la Tabla 9: del total de las 22
muestras positivas para anti VHC se hallaron 19 con extinciones
mayores que 2,5 (corresponde a la relación > 25) extremadamente
positivas, lo cual era sorprendente. Los tres sueros negativos para
anti VHC contenidos en el panel se clasifican correctamente como
negativos (relaciones < 1,0). Finalmente, también se hallan
correctas las muestras nros. PHV 201-08, -10 y -20
en el sentido del cuestionamiento, ya que estas muestras no
presentan (-08 y -10) o presentan pocos anticuerpos específicos del
núcleo (-20) de acuerdo con el ensayo de confirmación.
La Tabla 9 muestra la comparación de la
sensibilidad de un péptido por ELISA (SP 10, 2 \mug/ml) con el
estado de la técnica en el caso de muestras nativas positivas para
anti VHC del panel PHV 201, que comprende muestras positivas para
anti VHC bien caracterizadas con diferentes títulos de anti VHC
(comercialización del material y los resultados de los ensayos
comparativos por la empresa Boston Biomedica, Estados Unidos). Todos
los datos de ELISA se reproducen como relaciones que representan el
cociente de la extinción de las muestras y el valor de
cut-off. Los valores < 1,0 representan un
resultado negativo y los valores de > 1,0 representan un
resultado positivo.
| Miembro I.D. | Resultados comparativos | ELISA con péptido según la invención (SP10/2 \mug/ml) | ||
| VHC EIA | VCH ELISA | |||
| Número | S/CO | S/CO | Resultado* | S/CO |
| PHV201-01 | 1,689 | 1,475 | POS | > 25 |
| PHV201-02 | 3,660 | 5,660 | POS | > 25 |
| PHV201-03 | 3,793 | 3,946 | POS | > 25 |
| PHV201-04 | 0,271 | 0,176 | N | 0,10 - |
| PHV201-05 | 3,417 | 2,591 | POS | > 25 |
| PHV201-06 | 3,711 | 4,805 | POS | > 25 |
| PHV201-07 | 0,260 | 0,108 | N | 0,25 - |
| PHV201-08 | 1,515 | 1,244 | POS | 0,75 - |
| PHV201-09 | 2,530 | 1,274 | POS | > 25 |
| PHV201-10 | 2,174 | 2,745 | POS | 0,25 - |
| PHV201-11 | 2,883 | 2,469 | POS | > 25 |
| PHV201-12 | 3,641 | 4,769 | POS | > 25 |
| PHV201-13 | 4,115 | 5,662 | POS | > 25 |
| PHV201-14 | 2,669 | 4,300 | POS | > 25 |
| Miembro I.D. | Resultados comparativos | ELISA con péptido según la invención (SP10/2 \mug/ml) | ||
| VHC EIA | VCH ELISA | |||
| Número | S/CO | S/CO | Resultado* | S/CO |
| PHV201-15 | 4,115 | 5,660 | POS | > 25 |
| PHV201-16 | 4,115 | 5,662 | POS | > 25 |
| PHV201-17 | 4,115 | 5,662 | POS | > 25 |
| PHV201-18 | 3,530 | 3,943 | POS | > 25 |
| PHV201-19 | 0,490 | 1,520 | N | 0,25 - |
| PHV201-20 | 2,611 | 2,371 | POS | > 25 |
| PHV201-21 | 3,430 | 2,666 | POS | > 25 |
| PHV201-22 | 1,721 | 1,690 | POS | > 25 |
| PHV201-23 | 4,115 | 5,662 | POS | > 25 |
| PHV201-24 | 2,500 | 2,631 | POS | > 25 |
| PHV201-25 | 4,115 | 5,660 | POS | > 25 |
| Miembro | Datos de confirmación | ELISA | |||||||||
| I.D. | RIBA 2.0 | con | |||||||||
| péptido | |||||||||||
| según | |||||||||||
| la inv. | |||||||||||
| (SP 10/2 | |||||||||||
| \mug/ml) | |||||||||||
| Número | 5-1-1 | C-100-3 | C33C | C22-C | Result.* | Alt** | anti | HBsAq* | anti | anti | S/Co |
| HBc* | VIH* | HTLV* | |||||||||
| PHV201-01 | +/- | - | 2 | 4 | POS | L | N | N | N | N | > 25 |
| PHV201-02 | 1 | 2 | 4 | 4 | POS | L | POS | N | N | N | > 25 |
| PHV201-03 | - | 1 | - | 4 | POS | L | N | N | N | N | > 25 |
| PHV201-04 | - | - | - | - | N | L | N | N | N | N | 0,10 - |
| PHV201-05 | 2 | +/- | +/- | 4 | POS | L | N | N | N | N | > 25 |
| PHV201-06 | 2 | 1 | 4 | 4 | POS | L | N | N | N | N | > 25 |
| PHV201-07 | - | - | - | - | N | L | N | N | N | N | 0,25 - |
| PHV201-08 | - | +/- | 3 | - | I | L | POS | N | N | N | 0,75 - |
| PHV201-09 | 1 | - | 4 | 4 | POS | L | POS | N | N | N | > 25 |
| PHV201-10 | +/- | +/- | 2 | - | I | G | N | N | N | N | 0,25 - |
| PHV201-11 | 2 | +/- | 3 | 3 | POS | G | N | N | N | N | > 25 |
| PHV201-12 | 2 | 2 | 2 | 3 | POS | L | N | N | N | N | > 25 |
| Miembro | Datos de confirmación | ELISA | |||||||||
| I.D. | RIBA 2.0 | con | |||||||||
| péptido | |||||||||||
| según | |||||||||||
| la inv. | |||||||||||
| (SP 10/2 | |||||||||||
| \mug/ml) | |||||||||||
| Número | 5-1-1 | C-100-3 | C33C | C22-C | Result.* | Alt** | anti | HBsAq* | anti | anti | S/Co |
| HBc* | VIH* | HTLV* | |||||||||
| PHV201-13 | 4 | 4 | 4 | 4 | POS | L | N | N | N | N | > 25 |
| PHV201-14 | 2 | +/- | 4 | 4 | POS | L | POS | N | N | POS | > 25 |
| PHV201-15 | 2 | +/- | 4 | 4 | POS | L | N | N | N | N | > 25 |
| PHV201-16 | 4 | 4 | 4 | 4 | POS | L | N | N | N | N | > 25 |
| PHV201-17 | 4 | 4 | 4 | 4 | POS | L | POS | N | N | N | > 25 |
| PHV201-18 | +/- | 2 | 4 | 3 | POS | L | POS | N | N | N | > 25 |
| PHV201-19 | - | +/- | - | - | N | L | N | N | N | N | 0,25 - |
| PHV201-20 | 1 | 1 | 1 | +/- | POS | L | N | N | N | N | > 25 |
| PHV201-21 | 1 | +/- | 3 | 4 | POS | L | POS | N | N | N | > 25 |
| PHV201-22 | +/- | - | 4 | 4 | POS | L | N | N | N | N | > 25 |
| PHV201-23 | 4 | 3 | 4 | 4 | POS | L | POS | N | N | N | > 25 |
| PHV201-24 | 2 | 4 | 4 | 4 | POS | G | POS | POS | N | N | > 25 |
| PHV201-25 | 4 | 1 | 4 | 4 | POS | L | N | N | N | N | > 25 |
| *POS = positivo, N = negativo, I = indeterminado, NA = no aplicable | |||||||||||
| **L = menos que 2 x límite superior de lo normal, G = mayor que 2 x límite superior de lo normal |
Los resultados ALT son aquellos leídos según la
filtración estéril y el envasado y no reflejan el estado ALT del
donante al momento de la donación.
Ejemplo
6
Determinación de anti VHC en sueros de chimpancés
con los péptidos según la invención en péptidos según la invención
en ELISA
Se investigan diferentes péptidos o mezclas de
péptidos, adsorbidas en cavidades de placas de microtitulación con
sueros de chimpancés que se habían infectado con distintas dosis
infecciosas de NANBV. De las extracciones secuenciales cada 2
semanas después de la inoculación, se midieron además de GOT también
GPT con pruebas comerciales y se determinaron todas las muestras en
paralelo y en ELISA con péptidos según la invención. Al igual que en
la prueba comercial (HP1) del Ejemplo 3, se utilizaron para la
detección en el péptido por ELISA los anticuerpos policlonales de
conejo, marcados con POD, con una concentración cuatro veces mayor,
en donde se utilizó el sustrato enzimático TMB con medición
fotométrica a 450 nm. La realización de la muestra correspondió a la
determinación antes descrita de anti VHC humano con 0,1 E como
fijación del valor límite, así como reproducción de los resultados
de la Tabla 10 como relación de los valores específicos de extinción
al valor de cut off (relaciones).
Los resultados enumerados en la Tabla 10A a 10C y
11A y 11B con péptidos del área de NSP 4 representan las así
llamadas "relaciones", con las cuales se define el cociente de
señal específica y valor límite.
\newpage
Tabla 10
A-C
Determinación de anti VHC en muestras de
chimpancés con una prueba comercial (HP1) y ELISA con péptidos o
mezclas de péptidos según la invención del área de HSP 4. Los datos
resultan en el caso de los 3 primeros valores temporales en
extinciones que sirven para el establecimiento de los valores
límite, a partir de lo cual se formaron las siguientes relaciones de
señal específica y valor límite.
\vskip1.000000\baselineskip
\text{*}) asegurado por medio de ensayo con
microscopio electrónico de biopsias de hígado como infectados por
NANB.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr
\cr}
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr \cr
\cr}
\newpage
Los resultados representados en las Tablas 10
A-C subrayan las ventajas de los péptidos según la
invención, en especial cuando se compara con los pertinentes
resultados de la prueba comercial (HP1) y el curso de ALT.
De esta manera, por ejemplo el animal Nº 123 de
la prueba comercial (HP1) no se halla positivo a anticuerpos en
absoluto, a pesar de que se comprobó NANBH con el microscopio
electrónico con biopsias de hígado. Conforme a ello, con ELISA es
posible en base a 4083 casi al mismo tiempo con el aumento de ALT
una detección confiable de anticuerpos de VHC.
En especial la congruencia temporal de los
resultados del péptido por ELISA con los valores aumentados de ALT
es clara en el animal Nº 048, donde con todos los péptidos o mezclas
de péptidos descritos resulta una detección muy confiable de anti
VHC casi simultáneamente con el aumento de ALT y en promedio 18
semanas antes de la prueba comercial (HP1) en el sentido de una
precisa discriminación positivo-negativo. En
especial, las comparaciones entre los péptidos hacen suponer que el
reconocimiento de los anticuerpos tempranos de VHC por el péptido
total de la fórmula I (4083) es determinado de manera considerable
por la secuencia media de aminoácidos, tal como deja en claro la
comparación de la mezcla de 4060 y 4081 (secuencias con terminales
amino y carboxi) y el 4090 que comprende la estructura central.
A similares resultados de una determinación
temprana, casi simultánea de ALT de anticuerpos de VHC llevaron las
pruebas del animal Nº 147, en el que es posible una detección
confiable de anticuerpos de VHC casi simultáneamente con el aumento
de ALT otra vez aproximadamente 16-18 semanas antes
que con la prueba comercial (HP1).
Tablas 11 A y
B
Determinación de anti VHC en muestras de suero de
2 chimpancés que fueron infectados con VHC. Se representan los
resultados con la prueba comercial (HP1) en comparación con un
péptido del núcleo preparado por síntesis según la invención (SP
10,2 \mug/ml), en donde los resultados se representan como
relaciones de señal específica y valor límite.
También los resultados representaros en las
Tablas 11 A y B con un nuevo péptido del núcleo subrayan las
ventajas de los péptidos según la invención, en especial cuando se
comparan con los correspondientes resultados de ELISA comercial
(HP1) y el curso de ALT.
En especial la congruencia temporal de los
resultados del péptido del núcleo por ELISA con los valores
aumentados de ALT es clara en el animal Nº 048, donde resulta una
detección muy confiable de anti VHC casi simultáneamente con el
aumento de ALT y en promedio 20 semanas antes de ELISA comercial
(HP1) en el sentido de una precisa discriminación
positivo-negativo.
A similares resultados de una determinación
temprana, casi simultánea de ALT de anticuerpos de VHC llevaron las
pruebas del animal Nº 147, en el que es posible una detección
confiable de anticuerpos de VHC casi simultáneamente con el aumento
de ALT otra vez aproximadamente 4 semanas antes que con la prueba
comercial (HP1).
En total, los péptidos según la invención o bien
su uso en procedimientos inmunoquímicos de detección se presentan
esencialmente más sensibles que todos los procedimientos descritos
hasta ahora en base a proteínas producidas por tecnología genética,
así como otros péptidos sintéticos del estado de la técnica. Con una
mejor sensibilidad en fases de infección tardías, los nuevos
péptidos ofrecen adicionalmente esenciales ventajas, haciendo
factible la determinación de de anticuerpos se VHC tempranos sean
confiables, reduciendo así parcialmente de manera significativa las
fallas de diagnóstico existentes. Más allá de ello, los péptidos
según la invención están representados esencialmente más insensibles
frente a uniones inespecíficas, lo cual se expresa no por último en
un antecedente drásticamente reducido frente a una prueba comercial
(HP1) (máx. 0,10 E_{450}) en comparación con máx. 0,4 E_{492} en
el caso de una prueba comercial (HP1), y tanto en muestras de origen
animal como también de origen humano, de modo que es posible una
discriminación negativo-positivo mucho más precisa.
Finalmente, como aspectos ventajosos se han de mencionar la menor
duración total y la determinación más precisa por el volumen de las
muestras de 50 \mul que se debe
pipetear.
pipetear.
\newpage
Ejemplo
7
A partir de soluciones madre de los péptidos SP
10 y 4083 en ácido acético al 50% en agua destilada, que contiene 6
mg de péptido/ml cada una, se formaron dobles series de diluciones
en bicarbonato de sodio 0,10 M pH 9,6, es decir, se obtuvo una serie
con las concentraciones 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,78; 0,39;
0,2; 0,1; 0,05 y 0,01 \mug de péptido/ml. En el caso de las
mezclas de péptidos individuales, se procedió de forma análoga, en
donde las soluciones madre se mezclaron adicionalmente en distintas
proporciones, por ejemplo 10:1 ó 1:4, a fin de obtener por dilución
en bicarbonato de sodio 0,1 M las concentraciones finales totales
indicadas con anterioridad, pero que en el caso de mezclas de varios
péptidos, tenían la misma concentración (en una mezcla 1:1) o
distintas proporciones entre sí.
Se dispusieron 100 \mul de cada dilución en
cada una de las 16 cavidades de las placas de microtitulación, tipo
B, de la empresa Nunc, Roskilde, Dinamarca. Las placas de ensayo
rellenas con las diluciones se dejaron durante 18 horas a 20ºC,
luego las soluciones se filtraron por filtración de las cavidades y
éstas se lavaron 3-4 veces con 300 \mul de una
solución de 10 g/l de albúmina de suero bovino en solución
fisiológica tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) por llenado y
filtración por succión, y las placas de ensayo se secaron luego
sobre gel de sílice a 20ºC.
Se mostró apropiada una concentración de 1 \mug
de 40 83/ml y 1 \mug de SP 10/ml para el revestimiento de la
mezcla de péptidos, en donde esta concentración representa la base
de los resultados resumidos en las Tablas 12 a 14, que se obtuvieron
tal como se describió en los Ejemplos 4 y 5.
Contrariamente a las comparaciones hasta la fecha
con el estado de la técnica, se tienen por objeto todas las
siguientes confrontaciones de un ELISA de anti VHC comercial de
segunda generación (HP 2) tal como se describe en el Ejemplo 3.
Tablas 12 y
13
Los datos respecto de ELISA HP 2 según la
invención y comercial representan los llamados títulos de punto
final con los que se define la máxima predilución de un suero en
suero negativo para anti VHC, que se determinó de modo reproducible
positivo en un ensayo dado.
| Especificidad en % después de | Especificidad en % después de | |
| prueba inicial | repetición | |
| n = 930 sueros | 99,5 | 99,7 |
| n = 930 plasmas | 99,6 | 99,7 |
Ejemplo
8
Los polipéptidos SPH 9 (fórmula XVIII), SPH 20
(fórmula XIX), 4083 (fórmula XX) y SP 10 (fórmula XXII) se
disolvieron en una concentración de 6 mg/ml en ácido acético al 50%
(v/v).
Estas 4 soluciones madre se mezclaron hasta una
base de volumen en diferentes relaciones tal como se mencionó en el
Ejemplo 4 y se diluyeron en bicarbonato de sodio 0,10 M (pH 9,6) de
modo tal que la concentración total de los polipéptidos era de entre
0,2 y 8 \mug/ml.
100 \mul de cada una de las soluciones diluidas
se colocaron en 16 cavidades de placas de microtitulación, tipo B,
de la empresa Nunc, Roskilde, Dinamarca. Las placas de ensayo llenas
se incubaron durante 18 horas a 20ºC. Luego se filtraron las
soluciones por succión y las cavidades se enjuagaron
3-4 veces con 300 \mul de una solución de 10 g/l
de albúmina de suero bovino en solución fisiológica tamponada con
fosfato (PBS, pH 7,4) y las placas de ensayo se secaron luego sobre
gel de sílice a 20ºC.
Ejemplo
9
Partiendo con una relación de volúmenes de las
cuatro soluciones madre descritas en el Ejemplo 8 de 1:1:1:1 (v/v),
se modificaron las cuatro proporciones modificables de modo
independiente, pero manteniendo constantes las otras tres, a fin de
obtener en la solución de revestimiento las siguientes
concentraciones finales de cada uno de los péptidos de VIH 1, VIH 2
y VHC (en \mug/ml):
| Péptido XVIII | Péptido XIX | Péptido XX | Péptido XXII |
| 2 | 2 | 2 | 2 |
| 1 | 2 | 2 | 2 |
| 0,5 | 2 | 2 | 2 |
| 0,2 | 2 | 2 | 2 |
| 0,1 | 2 | 2 | 2 |
| 0,05 | 2 | 2 | 2 |
| Péptido XVIII | Péptido XIX | Péptido XX | Péptido XXII |
| 2 | 1 | 2 | 2 |
| 2 | 0,5 | 2 | 2 |
| 2 | 0,2 | 2 | 2 |
| 2 | 0,1 | 2 | 2 |
| 2 | 0,05 | 2 | 2 |
| 2 | 2 | 1 | 2 |
| … | |||
| etc. hasta | |||
| 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
Estas mezclas se fijaron, tal como se describió
en el Ejemplo 8, en placas de microtitulación y se evaluaron en
ELISA tal como se describió en los Ejemplos 4 y 5, en donde se
optimizó asimismo la concentración del anticuerpo marcado con
peroxidasa con inmunoglobulina humana G.
Las muestras con las que se evaluó la
optimización estaban compuestas por muestras de anti VIH 1, anti VIH
2 y anti VHC de título bajo, que se prepararon por diluciones
seriales de correspondientes sueros humanos positivos en suero
humano negativo. Además, se ensayaron asimismo varias muestras de
anti VIH y negativas para anti VHC, para poder definir la reacción
de fondo (es decir, la unión inespecífica en una placa de
microtitulación revestida dada).
Como criterio de selección, se utilizó una señal
específica lo más alta posible, es decir, una alta sensibilidad
límite en la determinación de las series de titulación de muestras
humanas de anti VIH o bien positivas para anti VHC con un simultáneo
fondo bajo en el ensayo de muestras de anti VIH y negativas para
anti VHC.
De acuerdo con estos criterios se hallaron en
general mezclas de revestimiento favorables, de las que se
seleccionó la siguiente mezcla:
| XXI | SPH | 9 | 0,500 \mug/ml |
| SPH | 20 | 0,250 \mug/ml | |
| SP | 4083 | 0,500 \mug/ml | |
| SP | 10 | 0,125 \mug/ml |
Como favorable se determinó una concentración de
conjugado del Ejemplo 2 de 1:3000 con una dilución final adicional
única de 1:26, en donde la realización de la prueba se llevó a cabo
de acuerdo con el Ejemplo 4.
Contrariamente al establecimiento actual de los
valores límite, en estas condiciones se clasificaron muestras como
positivas para anti VIH y/o anti VHC, que presentaban una extinción
a 450 nm, que es mayor que el valor medio de los controles negativos
más un adicional de 0,250 D. O. (nueva fijación de valor
límite).
Estos establecimientos se utilizaron en los
siguientes Ejemplos 10 a 15 de forma única y sin modificaciones.
Ejemplo
10
Las muestras representadas en las Tablas
15-17 se ensayaron tal como se describió en el
Ejemplo 4 en condiciones óptimas del Ejemplo 9 con la mezcla de
péptidos de la fórmula XIV. Respecto de anti VIH 1 ó 2, se
compararon las reactividades del procedimiento según la invención
con una prueba combinada de anti VIH 1/2 (Enzygnost^{R} Anti VIH
1/2, empresa Behringwerke AG, HP 3). Para control se utilizaron
Western blots que se obtienen en comercios (anti VIH 1 y anti VIH 2)
de la empresa DuPont. El VHC se detectó por medio de dos
procedimientos distintos de ELISA (HP1 y HP2).
Tal como confirman los datos de las Tablas 15 a
17, se comprueban de manera segura y confiable anti VIH 1 y anti
VIH, así como anti VHC en muestras de origen humano con el
procedimiento según la invención.
| \begin{minipage}[t]{155mm} Muy reactivo significa extinciones de > 2,5 en la evaluación fotométrica; las 76 muestras positivas para anti VIH 1 son negativas para VHC.\end{minipage} | |||
| Cantidad de muestras | Origen de la muestra | Procedimiento según | Prueba combinada comercial |
| la invención | anti VIH 1/2 | ||
| n = 12 | Europa | n = 12 | n = 12 |
| (positiva para anti VIH 1) | muy reactivo | muy reactivo | |
| n = 57 | África occidental | n = 57 | n = 57 |
| (positiva para anti VIH 1) | muy reactivo | muy reactivo | |
| n = 7 | África occidental | n = 7 | n = 7 |
| (coinfecciones por VIH 1/VIH 2) | muy reactivo | muy reactivo | |
| n = 76 | n = 76 positivo | n = 76 positivo |
\vskip1.000000\baselineskip
| \begin{minipage}[t]{155mm} Muy reactivo significa extinciones de > 2,5 en una evaluación fotométrica; las 28 muestras positivas para anti VIH 2 son negativas para VHC.\end{minipage} | |||
| Cantidad de muestras | Origen de las muestras | Procedimiento según | Prueba combinada comercial |
| la invención | anti VIH 1/2 | ||
| n = 21 | África occidental | n = 21 | n = 21 |
| (anti VIH 2) | muy reactivo | muy reactivo | |
| n = 7 | África occidental | n = 7 | n = 7 |
| (coinfecciones por VIH 1/VIH 2) | muy reactivo | muy reactivo | |
| n = 76 | n = 28 positivo | n = 28 positivo |
| \begin{minipage}[t]{155mm} Muy reactivas se denominaron muestras que lograron extinciones de > 2,500. Para las muestras medianamente reactivas se indican las llamadas relaciones, por las cuales se entiende el cociente de la extinción de la muestra respecto del cut off de un ELISA dado. Valores por debajo de 1,0 se consideran negativos según convenio. Los valores por encima de 1,0 se consideran positivos, en donde la reactividad es más intensa cuanto mayor sea el valor de la relación; todas las muestras positivas para anti VHC son negativas para VIH\end{minipage} | ||||
| Cantidad de | Origen de las | Procedimiento según | anti VHC por ELISA comercial | |
| muestras | muestras | la invención | HP 1 | HP 2 |
| n = 61 | Europa | n = 57 | n = 57 | n = 57 |
| positiva | muy reactivo | muy | muy | |
| para anti | reactivo | reactivo | ||
| VHC | ||||
| Europa | n = 4 | |||
| HC 90-346 | > 9,0 ++ | 2,7 (+) | > 5,0 ++ | |
| -351 | 6,4 + | negativo | 3,9 + | |
| -516 | 6,8 + | negativo | 5,0 + | |
| -570 | 6,9 + | 1,9 (+) | > 5,0 + | |
| n = 53 | Estados | n = 51 | n = 51 | n = 51 |
| positiva | Unidos | muy reactivo | muy | muy |
| para anti | reactivo | reactivo | ||
| VHC | ||||
| Estados | n = 2 | |||
| Unidos | ||||
| HC 90-511 | 4,2 + | 1,2 (+) | 3,99 + | |
| -566 | 4,6 + | negativo | > 5,0 + | |
| n = 114 | n = 114 | n = 111 | n = 114 | |
| positivo | positivo | positivo |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Para evaluar la sensibilidad de ELISA según la
invención se prepararon titulaciones de modelo de muestras positivas
y se ensayaron en ELISA descrito en el Ejemplo 9. En total se
prepararon diluciones de tres sueros humanos positivos para anti VIH
1 o anti VIH 2 en suero negativo para anti VIH y anti VHC y se
definió la sensibilidad límite como última predilución aún reactiva
en el correspondiente sistema de ensayo, utilizando el nuevo valor
límite (valor medio de los controles negativos más 0,250 de
umbral).
Los resultados de esta prueba de sensibilidad
límite se resumen en la Tabla 18 (anti VIH 1), la Tabla 19 (anti VIH
2) y la Tabla 20 (anti VHC) como valores de extinción.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Se prediluyeron tres muestras positivas
confirmadas para anti VIH 1 con sueros negativos humanos para anti
VIH 1 y anti VHC en dos etapas y estas prediluciones se evaluaron
según el Ejemplo 3 o bien de acuerdo con el prospecto del fabricante
de la prueba comparativa. Todos los datos representan valores de
extinción (E_{450}). Todas las muestras positivas para anti VIH
reaccionaron de modo negativo en HP 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Se prediluyeron tres muestras positivas
confirmadas para anti VIH 2 con sueros negativos humanos para anti
VIH y anti VHC en dos etapas y estas prediluciones se evaluaron
según el Ejemplo 3 o bien de acuerdo con el prospecto del fabricante
de la prueba comparativa. Todos los datos representan valores de
extinción (E_{450}). Todas las muestras positivas para anti VIH
reaccionaron de modo negativo en HP 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Se prediluyeron cuatro muestras positivas
confirmadas para anti VHC con sueros negativos humanos para anti VIH
y anti VHC en dos etapas y estas prediluciones se evaluaron según el
Ejemplo 3. Todos los datos representan valores de extinción
(E_{450} nm).
Análogo fue en el procedimiento de anti VHC, en
el que se prepararon de cuatro muestras positivas para anti VHC
series de dilución como se describió en la Tabla 20, se ensayaron y
se evaluaron análogamente a anti VIH y se compararon con los
resultados por medio de ELISA anti VHC comercial de segunda
generación (HP 2).
Además se probó en ensayos individuales la
especificidad de las reactividades de cada uno de los donantes,
ensayando las muestras positivas para anti VIH 1 y anti VIH 2
también sin diluir en la prueba de anti VHC, así como al revés, las
muestras positivas para anti VHC en pruebas combinadas de anti VIH
1/2 (Enzygnost^{R} Anti VIH 1/2).
Los resultados reunidos en las Tablas 18 a 20
clarifican que la sensibilidad límite del ELISA según la invención
equivale a la sensibilidad límite de la prueba combinada de anti VIH
1/2 en lo que respecta a anti VIH 1 y a anti VIH 2. La sensibilidad
límite de VHC del ELISA según la invención también se correspondía
con la sensibilidad límite de un ELISA anti VHC asequible en
comercios (HP 2). Sin embargo, mientras que para la detección de
estas tres especificidades de anticuerpos según el estado de la
técnica son necesarios al menos dos pruebas (prueba combinada anti
VIH 1/2, así como al menos una prueba anti VHC), esta detección con
el procedimiento según la invención también resulta confiable y
comparativamente sensible sólo con una tanda de prueba.
Además, de los datos de las Tablas 18 a 20 puede
observarse que la fuerte reactividad de las muestras positivas para
anti VIH y anti VHC en el nuevo ELISA es particularmente ventajosa,
ya que las muestras anti VIH reaccionaron negativamente en la prueba
específica anti VHC y las muestras positivas para anti VHC
reaccionaron negativamente en la prueba específica de anti VIH.
Ejemplo
12
Se evaluaron en total 3 pacientes, de los que en
el transcurso de fases muy tempranas de una infección por VIH 1 se
obtuvieron repetidamente extracciones de sangre secuenciales en
momentos definidos. Este panel de sueros puede adquirirse en
comercios (Boston Biomedica Inc., Estados Unidos). En la Tabla 21 se
reprodujeron los resultados obtenidos con el ELISA según la
invención en comparación con una prueba combinada de anti VIH
1/2.
Los resultados de la Tabla 21 aclaran que el
ELISA según la invención detecta confiablemente muestras positivas
para anti VIH 1 para título bajo, asimismo como la prueba combinada
de anti VIH 1/2 (Enzygnost^{R} Anti VIH 1/2). También puede
observarse de la comparación con los datos de la Tabla 21 que
incluso el momento más temprano en el que resulta la primera
detección de anticuerpos específicos de VIH 1 con el nuevo péptido
por ELISA, es posible al menos tan temprano como con pruebas
singulares específicas de anti VIH 1 como estado de la técnica.
Ejemplo
13
En la Tabla 22 se resumen los resultados que se
obtuvieron en el ensayo de un "panel de anti VIH de bajo
título" asequible en comercios con el nuevo péptido de VIH/VHC
por ELISA en comparación con una prueba combinada anti VIH 1/2
(Enzygnost^{R} Anti VIH 1/2).
El panel de muestras de la empresa Boston
Biomedica, Inc., Estados Unidos, comprende un total de 15 muestras
que se clasificaron con ayuda de métodos de determinación de anti
VIH 1 como positivas para anti VIH 1 de bajo título.
Todos los datos representan valores de extinción
con una longitud de onda de 450 nm. Los valores sobre los valores
límite indicados son positivos.
Tal como permiten reconocer los resultados de la
Tabla 22, en comparación con la prueba combinada anti VIH 1/2
(Enzygnost^{R} Anti VIH 1/2) con el péptido por ELISA VIH/VHC
según la invención se determinaron todas las muestras
comparativamente muy reactivas.
De modo interesante, cuatro muestras del panel se
determinan más reactivamente con el nuevo péptido por ELISA que con
la prueba combinada anti VIH 1/2 (Enzygnost^{R} Anti VIH 1/2)
(Nros. 1, 2, 12 y 15). Pruebas adicionales de estas muestras dieron
como resultado al mismo tiempo anticuerpos de VHC presentes, lo cual
confirmó nuevamente la confiabilidad de una detección no
diferenciada de anti VIH 1/-VIH 2 y -VHC según el procedimiento de
acuerdo con la invención.
Ejemplo
14
La Tabla 23 contiene los resultados que se
obtuvieron con el nuevo péptido por ELISA de VIH 1/VIH 2 y VHC y el
panel de anti VHC de bajo título de la empresa Boston Biomedica
Inc., Estados Unidos. En esta Tabla 23 también están contenidos
datos que fueron recabados del mismo panel con un ELISA de anti VHC
moderno ELISA (HP 2).
Los datos respecto del ELISA según la invención y
el comercial representan los llamados títulos de punto final, con
los que se define la máxima predilución de un suero en suero
negativo para anti VHC, que se calculó en una prueba dada de modo
reproducible positivo.
Los resultados de la Tabla 23 dejan en claro que
con el ELISA según la invención, las 14 muestras positivas se
calcularon claramente de modo positivo y confiable. En este caso
llama la atención que la intensidad de la señal es muy alta, lo cual
debe atribuirse a una gran reactividad.
Esta elevada reactividad también se refleja en
las sensibilidades límite calculadas de la Tabla 23. Estos límites
de detección se definieron prediluyendo las muestras nativas humanas
en dos etapas en suero negativo para anti VHC y luego ensayándolas
de acuerdo con el Ejemplo 4, en donde la última etapa de predilución
aún reactiva representa el llamado título final.
Sobre esta base, los datos de la Tabla 23
permiten reconocer que el nuevo péptido de VIH 1-/VIH 2-/VHC por
ELISA presenta en el panel PHV 101 incluso mejores límites de
detección respecto de anti VHC que el estado de la técnica.
Ejemplo
15
Para la determinación de la frecuencia de
reacciones inespecíficas que en el ELISA llevan a resultados
positivos falsos, se tomaron en total n = 512 dadores de sangre
sanos. De estos dadores se extrajo al mismo tiempo suero y plasma,
para poder investigar también una posible influencia perjudicial del
sistema de la coagulación sobre el procedimiento.
Las muestras que eran reactivas en uno de estos
tres ensayos (ELISA según la invención, ELISA de anti VHC HP 2 y
anti VIH 1/2 HP 3) (llamadas pruebas iniciales) se repitieron en la
misma prueba (llamadas retesteo) y se ensayaron con una reactividad
reproducible en Western blot de anti VIH 1 y ELISA de anti VHC (HP
1) como procedimiento comparativo.
Ninguna de las muestras presentadas como
reactivas en este control en uno de los tres ELISA pudo confirmarse
como positiva para anti VIH 1 o anti VHC con ayuda de este
procedimiento de confirmación. De esta manera, todas las muestras
separadas en el control fueron clasificadas como -positivas falsas
en cada uno de los procedimientos.
| n = 512 sueros y n = 512 plasmas en | nuevo péptido por ELISA | Anti VIH 1/2 | Anti VIH |
| pares de un total de 512 dadores de | (HP 3) | (HP 2) | |
| sangre sanos | suero/plasma | suero/plasma | suero/plasma |
| Cantidad de resultados falsos | 3/2 | 1/1 | 5/4 |
| positivos | |||
| ensayo inicial | |||
| Especificidad inicial (5) | 99,41/99,60 | 99,80/99,80 | 99,02/99,22 |
| Cantidad de resultados falsos | 2/2 | 1/1 | 4/4 |
| positivos | |||
| después de repetición | |||
| Especificidad inicial (5) | 99,60/99,60 | 99,80/99,80 | 99,22/99,22 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la primera serie de ensayos
(resultados iniciales) están resumidos en la Tabla 24. Mientras que
según el procedimiento de acuerdo con la invención tres sueros (y
dos plasmas correspondientes) eran reactivos, con un suero de ELISA
1 de anti VIH 1/2 (y un correspondiente plasma) y el ELISA de anti
VHC se calcularon reactivamente cinco sueros (y cuatro plasmas
correspondientes). Los dadores reactivos en cada ELISA no eran
idénticos.
Después de repetir la realización del ensayo de
estos nueve sueros reactivos, resultó el cuadro representado en la
Tabla 25 de dos sueros (dos plasmas en pares), que eran "reactivos
al retesteo" en el péptido por ELISA según la invención, un suero
(un plasma "en pares"), que era reactivo en el ELISA de anti
VIH ½, así como cuatro sueros (cuatro plasmas en pares), que eran
reactivos en el ELISA de anti VHC.
Suponiendo que ninguna de estas muestras se pueda
detectar como positiva para anti VIH y/o anti VHC, se calcularon los
datos de especificidad representados en la Tabla 25 para cada uno de
los ELISA ensayados, así como para sueros y plasmas, calculando la
parte porcentual de las muestras determinadas como correctamente
negativas (en total 512 sueros y 512 plasmas).
En base a los datos de la Tabla 25, se tendrían
que haber excluido según la prueba obligatoria del estado de la
técnica de anti VIH y anti VHC en total cinco dadores: un dador era
repetidamente falso positivo en la prueba de anti VIH 1/2 y cuatro
dadores eran repetidamente falsos positivos en la prueba de anti
VHC. Conforme a ello, la cantidad de los dadores calculables
reactivos falsos en el ELISA según la invención es sólo dos.
En resumen, se puede decir que el nuevo péptido
para la detección simultánea no diferenciada de anti VIH 1, anti VIH
2 y anti VHC respecto de los criterios de la sensibilidad en parte
válidos responde al menos a las características óptimas de
rendimiento de las dos pruebas individuales de anti VIH 1/2, por un
lado, y anti VHC, por el otro: los datos de la prueba de los
paneles, es decir, las pruebas nativas que contienen anti VIH 1 y/o
anti VIH 2 y/o anti VHC remiten asimismo a una eficacia comparable
con la prueba de las sensibilidades límite y el momento del
reconocimiento más precoz de muestras de anti VIH 1 o anti VIH 2 o
anti VHC de título bajo. Mientras que la detección de estas tres
especificidades de anticuerpos sólo es posible según el estado de la
técnica de esta manera con tres pruebas diferentes o respecto de la
prueba combinada de anti VIH 1/2 con dos pruebas diferentes, el
ELISA según la invención ofrece la ventaja de tener que efectuar
sólo una prueba con la misma eficacia. Justamente para los bancos de
sangre que están obligados a una toma de muestras de anti VIH 1,
anti VIH 2 y anti VHC, el nuevo péptido por ELISA implica una
considerable reducción de trabajo y costos con al menos igual
confiabilidad y seguridad en la determinación de anti VIH 1, anti
VIH 2 y anti VHC.
En la determinación de las fallas de esta nueva
prueba resultó totalmente sorprendente que, en virtud de la muy
buena especificidad, es decir, sólo un bajo número de resultados
falsos positivos, son necesarias menos pruebas posteriores, así como
menos pruebas de confirmación y también que se deban excluir menos
dadores que en el caso del procedimiento de control convencional del
uso de una prueba de anti VIH 1/2 y por separado, de una prueba de
anti VHC. De esta manera, el procedimiento según la invención ofrece
ventajas económicas y especializadas que también ofrecen otras
constelaciones de péptidos de VIH y VHC de las fórmulas IV a XII o
bien XIII a XVII.
El procedimiento según la invención también es
apropiado para otros cuestionamientos en los que la sensibilidad
límite máxima optimizada desempeña el papel más importante. De esta
manera, en otras condiciones de ensayo o, por ejemplo, como cálculo
en los Ejemplos 10 a 14 se puede mostrar que también es posible
generar características de sensibilidad del procedimiento según la
invención que son significativamente mejores que las del estado de
la técnica, cuando se toman datos de especificidad más desfavorables
pero que siguen respondiendo al estado de la técnica.
Si se redujera por ejemplo el valor límite
(Ejemplo 9) a 0,1 extinciones, todas las sensibilidades límite para
anti VIH 1, anti VIH 2 y anti VHC mejorarían considerablemente en un
factor de al menos 2. Para el índice de las muestras inespecíficas,
es decir, que reaccionan de modo falso positivo en el control de los
dadores de sangre sanos (Ejemplo 15), resultarían en total cinco
dadores calculados repetidamente de forma reactiva, lo cual responde
absolutamente al resultado de ambas pruebas individuales, en donde,
no obstante, se mejoró esencialmente la sensibilidad de la detección
de anticuerpos.
Claims (18)
1. Mezcla de al menos un péptido del grupo A
(región del núcleo del VHC), que consiste en los péptidos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y al menos un péptido del grupo B
(área de proteína no estructural del VHC), que consiste en los
péptidos:
\vskip1.000000\baselineskip
2. Mezcla de acuerdo con la reivindicación 1
compuesta por:
3. Mezclas de acuerdo con al menos una de las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque la secuencia de
aminoácidos de los péptidos frente a la secuencia natural está
modificada por sustitución de uno o varios aminoácidos de modo tal
que su inmunorreactividad se conserva o mejora esencialmente y en
donde la sustitución está limitada al intercambio mutuo dentro de
los siguientes grupos separados entre sí por punto y coma: Gly, Ala;
Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; Phe, Tyr;
Ala, Ser; Ala, Thr; Ala, Val; Ala, Pro; Ala, Glu; Leu, Gln; Gly,
Phe; Ile, Ser; Ile, Met.
4. Mezclas de acuerdo con al menos una de las
reivindicaciones 1, 2 ó 3, en donde los péptidos pueden estar
modificados por sustitución de una secuencia hidrofóbica compuesta
por 2 a 20 aminoácidos hidrofóbicos.
5. Mezclas de acuerdo con la reivindicación 4, en
donde la secuencia adicional es la siguiente:
Phe-Ala-Phe-Ala-Phe.
6. Mezclas de acuerdo con al menos una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas porque los péptidos
están unidos entre sí.
7. Mezclas de acuerdo con al menos una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizadas porque los péptidos
están unidos a un portador.
8. Secuencias de ADN que codifican los péptidos
de una mezcla de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones
1-7.
9. Procedimiento inmunoquímico para detectar y/o
determinar anticuerpos de VHC utilizando mezclas de péptidos como
antígeno, caracterizado porque éstas son mezclas de péptidos
de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones
1-7.
10. Procedimiento analítico para detectar y/o
determinar VHC, caracterizado porque como etapa específica se
aplica una reacción de hibridación en la que se usan sondas de ácido
nucleico que en su parte específicas son complementarias a las
secuencias de ADN de acuerdo con la reivindicación 8.
11. Procedimiento para la preparación de un
agente que contiene mezclas de acuerdo con al menos una de las
reivindicaciones 1-7 para usar como inmunógeno para
la generación de anticuerpos en mamíferos, en especial en seres
humanos.
12. Mezclas de péptidos de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizadas porque los péptidos se
sintetizan por la química de los péptidos.
13. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, en donde las mezclas de péptidos están fijadas a
un portador.
14. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13, caracterizado porque el portador está
seleccionado del grupo compuesto por poliestireno, cloruro de
polivinilo, poliamida y otros polímeros sintéticos, polímeros
naturales como celulosa, así como polímeros naturales derivados como
acetato de celulosa y nitrocelulosa, así como vidrio, en especial
como fibras de vidrio.
15. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 14, caracterizado porque el portador es
poliestireno.
16. Procedimiento de acuerdo con al menos una de
las reivindicaciones 13-15, caracterizado
porque la detección se realiza con ayuda de anticuerpos marcados con
enzimas, marcados con fluorescencia, marcado con
quimioluminiscencia, marcados con biotina o marcados radiactivamente
contra los anticuerpos unidos a epitopos.
17. Prueba de acuerdo con la reivindicación 10,
caracterizada porque como anticuerpos marcados con enzimas se
usan las enzimas fosfatasa alcalina y/o peroxidasa de
Meerrettich.
18. Kit de ensayo que contiene un portador al que
están fijadas mezclas de péptidos de acuerdo con al menos una de las
reivindicaciones 1-7.
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| DE4120281A DE4120281C2 (de) | 1991-06-19 | 1991-06-19 | Immunchemisches Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis von mehreren verschiedenen Antikörperspezifitäten, Peptidmischungen und Test dazu |
| DE4121431 | 1991-06-28 | ||
| DE4121431A DE4121431A1 (de) | 1991-06-28 | 1991-06-28 | Synthetische core-peptide zur bestimmung von hcv-antikoerpern und hcv-antigenen, mittel dazu und ihre verwendung in diesen nachweis-verfahren |
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