NL8620004A - Verbeteringen met betrekking tot virale isolaten en toepassing daarvan. - Google Patents

Description

- 1 - 8620004

Verbeteringen met betrekking tot virale isolaten en toepassing daarvan.

De uitvinding heeft betrekking op een nieuwe bepaling van antilichaam tegen retrovirussen en op nieuwe virale isolaten voor toepassing daarbij, en in het bijzonder op het isoleren van een virus verwant met humaan T-lymfotroop virus 5 en de toepassing daarvan alsook de toepassing van andere retrovirussen bij de bepaling van sera om de aanwezigheid van anti-lichamen tegen retrovirussen, in het bijzonder die welke geassocieerd zijn met acquired immune deficiency syndrome (Aids) aan te tonen.

10 Sinds enige jaren is het waarschijnlijk ge worden dat acquired immune deficiency syndrome (Aids) wordt veroorzaakt door een infecterend agens. Symptomen van deze ziekte zijn beperkt tot bepaalde risicogroepen volgens een patroon dat sterk in de richting wijst van een overdraagbaar agens bij 15 sexueel of bloedcontact. Hoewel de ziekte voor het eerst in

Amerika is waargenomen, begint hij in Europa en elders steeds meer voor te komen.

Een manier waarop de ziekte zich verspreidt is, naar wordt aangenomen, door transfusie van bloed afkomstig 20 van donoren die zelf met Aids virus zijn geïnfecteerd. Het verzamelen van donorbloed betekent dat wanneer bloed van een donor die Aids virus meedraagt, wordt verzameld met bloedmonsters van andere donors, al het bloed en andere produkten uit de verzameling besmet kunnen worden, ongeacht de grootte van het monster.

25 Vele bloeddonors met Aids virus onder de leden weten niet dat zij geïnfecteerd zijn, in het bijzonder niet in de beginfasen van de infectie, en andere geïnfecteerde donors zijn, zelfs wanneer zij weten dat zij geïnfecteerd zijn, terughoudend om te onthullen dat zij de ziekte hebben of tot een hoge risicogroep behoren.

30 Derhalve bestaat er steeds meer behoefte aan betrekkelijk eenvoudige maar volkomen betrouwbare tests waarmee monsters donor- 86 2 0 C 0 4 - 2 - bloed voor transfusie routinematig op de aanwezigheid van Aids virus of antilichamen tegen Aids virus onderzocht kunnen worden. Donorbloed dat bij de test een positieve uitslag vertoont, komt dan niet in aanmerking voor transfusie terwijl besmetting van 5 andere bloedmonsters door verzamelen met besmet monster vermeden wordt.

Sinds ongeveer 2 jaren wordt intensief onderzoek gedaan naar de identificatie en het isoleren van het agens dat Aids overbrengt, maar onder de verschillende onder-10 zoekers bestaat nog steeds onenigheid over de juiste identiteit en benaming. Van een zogenaamd Aids virus isolaat werd voor het eerst melding gemaakt in 1983 door Montagnier et al. in Frankrijk, die het materiaal "Lymphadenopathy Associated Virus One" (LAV-1) noemde. Bijna een jaar later publiceerde Gallo en 15 medewerkers in Amerika details over de isolatie van een ander zogenaamd Aids virus dat zij "Human T-lymphotropic Virus Type III" (HTLV-III) noemden.

Gevonden is dat uit een lymfonodale tumor een humaan T-lymfotroop retrovirus verwant met HTLV-III en LAV 20 en aangeduid met CBL-1, geïsoleerd kan worden. Het CBL-1 materiaal is een stabiel isolaat dat gekweekt kan worden in een gast-heercellijn en gébruikt kan worden voor een bepaling om anti-lichaam tegen Aids virus in serummonsters aan te tonen.

De uitvinding verschaft derhalve humaan 25 T-lymfotroop retrovirus CBL-1 dat verwant is of in verband staat met Aids.

Gebleken is dat CBL-1 lange tijd gehandhaafd kan worden in een leukemische T-cellijn aangeduid met CCRF-CEM en beschreven door Foley et al. in Cancer 18, 522-529 30 (1965) en de uitvinding heeft dan ook verder betrekking op CCRF- CEM cellen die het CBL-1 virus herbergen.

Monsters van CCRF-CEM cellen die CBL-1 virus volgens de uitvinding herbergen, zijn gedeponeerd bij de National (thans European) Collection of Animal Cell Cultures 35 (NCACC) van het Public Health Laboratory Service Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, 862 0 004' - 3 -

Wiltshire, SP4 OJG England. Het NCACC is onder het verdrag van Boedapest uit 1977 aangewezen als een Internationale Deponerings-Authoriteit. De deponering vond op 11 januari 1985 plaats onder het deponeringsnummer 85 01 1101.

5 Het CBL-1 materiaal werd geïsoleerd uit ge kweekte lymfocyten afkomstig uit een lymfonodale tumorbiopsie van een Britse patiënt die een behandeling onderging voor met Aids geassocieerde immunoblastische lymfoma. Fragmenten van de bicpsie werden gehandhaafd in een cultuurmedium waaraan T-cel-10 groeifactor was toegevoegd en ongeveer 2 dagen later werden CCRF-CEM cellen aan de cultuur toegevoegd die onder zodanige omstandigheden was gehandhaafd dat de primaire lymfocyten na verloop van ongeveer 1 maand verdwenen en de CCRF-CEM cellen zich vermenigvuldigden en chronisch met CBL-1 virus werden geïnfec-15 teerd.

Gebleken is dat CBL-1 virus verwant is of in verband staat met de eerder beschreven isolaten van HTLV-III op grond van: a) reverse transcriptase-activiteit met +-J- 20 voorkeur voor Mg kationen, b) de morfologie van de elektronenmicroscopisch zichtbaar gemaakte virusdeeltjes, c) indirecte immunofluorescentie specifiek voor virale antigenen in CBL-1 geïnfecteerde CCRF-CEM cellen met 25 van Aids patiënten afkomstige geprepareerde sera, en d) vergelijking met HTLV-III en LAV-1 door radioimmunologische bepaling in vaste fase, waarmee het is opgenomen in de taxonome groep van Retroviridae bevattende humane T-cel lymfotrope virus-30 sen.

DNA sequentieanalyse heeft uitgewezen dat de sequentie van het CBL-1 virus, hoewel nauw verwant met die van de andere tot dusver beschreven humane T-lymfotrope retrovirussen, niet identiek is met die van de eerder beschreven materialen maar 35 enige variatie in sequentie op verschillende lokaties vertoont.

Het is gebleken dat de bij het ECACC gedepo- 8620004 -dineerde geïnfecteerde cellen ten minste 6 maanden doorgaan met synthese van virus en virale antigenen.

Waar is gevonden dat CCRF-CEM cellen een ideale gastheer voor CBL-1 virus zijn, is verder gevonden dat de 5 cellen ook kunnen worden gébruikt voor het herbergen van soortgelijk virus geïsoleerd uit perifeer bloed van dezelfde patiënt van wie de lymfonodale tumorbiopsie werd genomen en soortgelijke virussen geïsoleerd bij andere patiënten geïnfecteerd met Aids verwante virussen. Derhalve is gevonden dat deze cel-10 lijn een bruikbare gastheer kan zijn voor het in vitro kweken van niet alleen het CBL-1 materiaal volgens de uitvinding maar ook van andere, verwante of daarmee verband houdende materialen.

De uitvinding heeft derhalve voorts betrekking op een methode voor het bepalen van antilichaam tegen 15 retrovirussen in een biologisch monster door het monster in aanraking te brengen met 1) een onoplosbaar gemaakt antigeen dat aan globuline gebonden retrovirus antigenen bevat waarbij het globuline zelf aan een inerte, vaste drager is gehecht, en 20 2) een immunoglobuline dat een specifiek antilichaam tegen de retrovirus antigenen bevat en dat is gelabeld met een niet-radioactief aantoonbaar label, en scheiden van de vloeistoffase van de vaste fase en bepaling van de hoeveelheid aantoonbaar label verbonden met de vloeistof of vaste 25 fase.

De uitvinding heeft verder nog betrekking op een testpakket dat 1) een eerste component bestaande uit een onoplosbaar gemaakt antigeen bestaande uit aan globuline gébon- 30 den retrovirus antigenen waarbij het globuline zelf aan een inerte, vaste drager is gehecht en 2) een tweede component bestaande uit een immunoglobuline dat specifiek antilichaam tegen de retrovirus-antigenen bevat en dat is gelabeld met een niet-radioactief 35 aantoonbaar label, bevat.

Zoals vermeld wordt CBL-1 hoofdzakelijk 8620004 - 5 - gébruikt als een component in een testsysteem voor het routinematig testen van transfusiebloed om na te gaan of dit afkomstig is van iemand geïnfecteerd met Aids virus. Het testsysteem berust op gelijktijdige, competitieve bepaling onder gebruikmaking van 5 geïmmobiliseerde CBL-1 antigenen of andere retrovirus antigenen als vaste fase, en het testserum als vloeistoffase.

Meer in het bijzonder berust de gelijktijdige, competitieve bepaling op het immobiliseren van CBL-1 anti-geen of ander retrovirus antigeen door dit aan een vaste fase 10 te binden via een ligande, bijvoorbeeld globuline of ander anti-lichaam, en een mengsel van testserumantilichaam en bekend anti-lichaam tegen het Aids virus dat met het aantoonbaar label geïdentificeerd kan worden, om de bindingsplaatsen op het geïmmobiliseerde antigeen te laten competeren. Gevonden is dat de meest 15 bevredigende resultaten verkregen kunnen worden wanneer het aantoonbaar agens een enzymlabel is. Een enzymlabel heeft ten opzichte van een radiolabel het voordeel dat biologische aantasting door straling wordt vermeden en dat de immunologische incu-batiebepaling onverwacht tot 1 uur of korter teruggebracht kan 20 worden.

De aanwezigheid van aan geïmmobiliseerd antigeen gebonden bekend antilichaam kan in plaats van met een enzymlabel ook door immunofluorescentie worden aangetoond.

Zoals vermeld worden de beste resultaten 25 verkregen wanneer het antigeen middels een ligande, dat een antilichaam is, aan de vaste fase is gehecht. Een techniek is om een hoge titer humaan serum afkomstig van iemand die asymptomatisch met Aids virus is geïnfecteerd, te gebruiken. Het ideale serum dient een hoge titer aan antilichamen tegen Aids virus te hebben 30 maar afkomstig te zijn van een patiënt met een gehalte immuno-globuline binnen het normale traject. Een andere benadering is om monoklonaal antilichaam opgewekt tegen het retrovirus te gebruiken. Wanneer dit op gebruikelijke wijze is opgewekt in muizen worden bepaalde voordelen gewaarborgd zoals uit het hierna 35 volgende zal blijken.

De vaste fase is gewoonlijk polystyreen in 862 0 004 - 6 - de vorm van buizen . kralen of bij voorkeur platen met in het oppervlak putjes of andere verdiepingen . Uit het geselecteerde serum of ander antilichaam bereid γ-globuline wordt dan op het polystyreen aangebracht waarna het antigeen aan het 5 met globuline beklede polystyreen wordt gebonden om de eerste component in het testpakket te vormen. Deze component kan enkele maanden nat of droog worden bewaard.

De tweede component in het testpakket bevat de IgG fractie die uit het testserum is geïsoleerd, en wan-10 neer het aantonen wordt uitgevoerd met behulp van een enzymlabel, kan deze IgG fractie worden geconjugeerd met bijvoorbeeld mierikswortelperoxydase (MWPO) volgens gebruikelijke technieken.

Het testpakket volgens de uitvinding kan worden gebruikt om de gelabelde IgG component met het test-15 serum te mengen om daarna het mengsel met het onoplosbaar gemaakte antigeen in aanraking te brengen en vervolgens de vaste fase en vloeistoffase van elkaar te scheiden en de mate waarin het IgG aan het antigeen is gebonden, te bepalen. In overeenstemming met gelijktijdige, competitieve bepalingen is de mate waarin de 20 IgG component van de vloeistoffase aan de vaste fase is gebonden groter naarmate de hoeveelheid antilichaam of antigeen in het testserum kleiner is. Door de juiste controlewaarden te kiezen is het dus mogelijk om over een routinetest te beschikken waarmee, wanneer MWPO als aantoonbaar makend middel wordt gebruikt, het 25 testserum kan worden beschouwd als vrij van Aids antilichaam of antigeen mits de optische dichtheid (OD) in het testmonster een vooraf gekozen minimum-waarde bereikt. Elk testserummonster dat een OD beneden de gekozen waarde geeft, kan dan worden afgekeurd zodat transfusie met donorbloed dat mogelijk met Aids virus of 30 antilichaam is besmet, wordt vermeden.

In plaats van CBL-1 als het retrovirus antigeen bij de bepalingsmethode en in het diagnosetestpakket volgens de uitvinding kunnen ook andere retrovirussen worden gebruikt. Deze kunnen humane retrovirussen zijn die etiologisch 35 verwant zijn met of in verband staan met Aids zoals humaan T-lymfotroop retrovirus HTLV-III of andere humane retrovirussen 8620004 - 7 - zoals humaan T-leukemievirus, HTLV-II of HTLV-I of dierlijke retrovirussen zoals Maedi-Visna of runderleukosevirus.

Zoals hieronder nader beschreven geeft de indirecte binding van humane retrovirus antigenen aan de vaste 5 fase via het globuline een bepaalde versterking van de resultaten zodat het mogelijk is om de aan- of afwezigheid van besmetting in bloedmonsters door betrekkelijk onervaren personeel te laten uitvoeren.

Toelichting op de figuren.

10 Figuur 1 toont een met een elektronenmicros coop bij een vergroting van 81.000 keer gemaakte foto van CBL-1 deeltjes ontspruitend uit en gelokaliseerd aan de grens van CCRF-CEM gastheercellen.

Figuur 2 toont het gedrag van de vaste-15 fase ELISA op anti-HTLV III. Weergegeven zijn de optische dichtheden van een aantal klinische sera waaronder die van voor anti-HTLV III reactieve en niet-reactieve, resultaten die te voren bekend waren door radioimmunologische bepaling.

Figuur 3 toont soortgelijke data als fi-20 guur 2 maar dan voor anti-HTLV I, bepaald met een soortgelijke éénstaps gelijktijdige competitieve ELISA.

De hierna volgende voorbeelden dienen uitsluitend ter toelichting op de uitvinding.

Voorbeeld 1 25 Isolering en karakterisering van CBL-1♦

Virus CBL-1 werd geïsoleerd uit lymfocyten gekweekt van een lymfonodale tumorbiopsie gemaakt bij een

Britse patiënt die een behandeling voor met Aids geassocieerde immunoblastische lymfoma onderging. De lymfonodale biopsie werd 30 in kleine stukjes gesneden die in een kweekmedium bestaande uit RPMI-1640 basaal medium gesupplementeerd met 10 % foetaal kalfs- werden serum en 10 ^ig/ml fytohaemagglutinine' gebracht. Na 24 uren conditioneren werd medium dat T-celgroeifactor geoogst uit mengeul tures van tonsillaire lymfocyten bevatte, toegevoegd en werd 35 fytohaemagglutinine verwijderd. 48 Uren na initiëring van de cultuur werd antiserum tegen interferon alfa toegevoegd. Tevens 8620004 - 8 - werden op dat moment CCRF-CEM cellen (in het vervolg CEM cellen) toegevoegd. CEM-cellen zijn een permanent groeiende leukemische T-cellijn beschreven door Foley et al. in Cancer (1965) 18, 522-9.

5 Onder de omstandigheden van cocultivering verdwenen in de loop van 4 weken kweken de primaire lymfocyten terwijl de CEM-cellen exponentieel prolifereerden. De CEM-cellen werden door het door de primaire lymfocyten gevormde CBL-1 virus geïnfecteerd en na 8 weken kweken waren zij chronisch door het 10 CBL-1 virus geïnfecteerd. Om de CBL-1 geïnfecteerde CEM cellen te handhaven was geen T-celgroeifactor noch anti-interferon alfa nodig. Zoals vermeld zijn deze CBL-1 geïnfecteerde CEM cellen onder no. 85 01 11 01 bij het NCACC gedeponeerd.

Aangetoond werd dat CBL-1 virus verwant is 15 of in verband staat met eerder beschreven isolaten van HTLV-III/ LAV op grond van a) reverse transcriptase activiteit met voor- 2+ keur voor Mg kationen, morfologie van de elektronenmicroscopisch zichtbaar gemaakte virusdeeltjes (figuur 1) en b) indirecte immunofluorescentie specifiek voor virale antigenen in CBL-1 20 geïnfecteerde CEM cellen met sera van Aids patiënten, en vergelijking met ander Aids virus isolaat met vaste fase RIA.

De CEM/CBL-1 cellen bleven 6 maanden virus en virale antigenen produceren.

Voorbeeld 2 25 1· Antigeen preparaat.

Een ruw vries-dooi cellysaat werd als volgt bereid. Met HTLV-IIIB geïnfecteerde HT-H9 cellen werden in sus-pensiecultuur gekweekt tot maximale dichtheid. De cultures werden afgekoeld tot 4°C en met 6-propiolacton in 2 uren op 0,25 30 vol./vol.% gebracht. De cellen werden daarna van de cultuur- vloeistof afgecentrifugeerd en bij lage snelheid gepelleteerd.

De celpellet werd opnieuw gesuspendeerd in gedestilleerd water en onderworpen aan drie vries-dooicycli. In elke cyclus werd het residu van de celpellet zorgvuldig opnieuw gesuspendeerd. Na de 35 derde cyclus werd het extract met fj-propiolacton op 0,25 vol./vol.% gebracht en 2 uren op 4°C gehouden. Daarna werd het 30 minuten 8620004 - 9 - verwarmd bij 37°C onder handhaving van de pH op 7,4. Het ruwe lysaat werd opgehelderd en hij -20°C weggezet. Alvorens te worden gébruikt werd het verdund in Trisbuffer gesupplementeerd met 0,1 % BSA en detergent. De keuze en concentratie van het deter-5 gent zijn belangrijk en het bleek dat het gébruik van Tween 20 in een concentratie van 0,1 % optimaal was en de activiteit van het antigeenpreparaat met drie keer of soms nog hoger deed toenemen.Na verdunnen in Tris BSA/Tween 20 werd het antigeen 30 minuten bij 37°C geincubeerd. Het was in deze stap dat de verhoging van anti-10 geenactiviteit optrad.

Een aldus verkregen antigeen preparaat kan worden gebruikt om de expressie van HTLV-III antigeen onder verschillende, gekozen kweekomstandigheden te volgen. De antigeni- citeit kan worden gekwantificeerd met vaste fase RIA onder toe- 125 15 passing van vaste fase anti-HTLV-III en I anti-HTLV-III als tweede reagens. Voor de eindanalyse werd antigeen in een zodanige verdunning gébruikt dat de verhouding P en N 10:1 bedroeg met 1-2 % labelbinding in aanwezigheid van negatieve sera (zie onderstaande bepalingsmethode). Ondanks variabele uitstorting van 20 virale antigenen in de supernatant boven de cellen bleef het merendeel van aantoonbaar antigeen in de celpellet achter. Dit was het geval voor CBL-1 en andere isolaten van HTLV-III in CEM cellen of HT/H9 cellen. De antigeen zuiverheid bleef onverminderd (zie onder) en voldoende om het antigeen in de cellen 25 maximaal tot expressie te brengen. Het antigeenpreparaat is gemakkelijk te bereiden en de opbrengst per volume celcultuur is waarschijnlijk hoger dan van antigeen dat uit supernatant is bereid, en bleek stabiel bij -20°C. Het kan gemakkelijk en snel worden geïnactiveerd met β-propiolacton. Ook door het gebruik 30 van Tween 20 mag worden verwacht dat de titer aan enig infec-tieus virus aanmerkelijk wordt verlaagd.

2. Antisera.

Reagens voor de bepaling werd bereid uit hoge titer humaan sera van mensen die asymptomatisch met Aids 35 retrovirus waren geïnfecteerd. De keuze van sera voor het bereiden van reagens is belangrijk. Het serum had een hoge titer 862 0 G0 4 - 10 - aan anti-HTLV-III blijkens RIA maar was afkomstig vas een patiënt met een immunoglobulineniveau binnen het· normale traject. In de praktijk is het meestal noodzakelijk om reagentia te bereiden uit een klein aantal sera die aan voornoemde kriteria beantwoorden 5 en het gedrag van de reagentia bij de bepaling te testen. Om deze reagentia niet-infectieus te maken, werden de uitgangssera behandeld door 30 minuten verwarmen bij 56°C.

a) Bereiding van anti-HTLV-lllB globuline.

Dit materiaal werd gebruikt om HTLV-IIIB 10 antigeen op een vaste fase in situ te zuiveren. Hieraan zijn aanzienlijke voordelen verbonden. Globuline uit door verwarmen behandeld serum werd twee keer met 40 %-ig verzadigd ammonium-sulfaat geprecipiteerd. Dit is het eenvoudigste reagens voor bekleden met globuline maar totaal serum of gezuiverd igG kan ook 15 worden gebruikt. Het globuline werd gebruikt bij een optimale verdunning die door afzonderlijke titratie van het reagens moest worden bepaald. Het vaste fasemateriaal was polystyreen in de vorm van een microtiterplaat met putjes en werd met het globuline bekleed. Overtollige bindingsplaatsen werden daarna geblokkeerd 20 met een inert proteïne, in dit geval 0,1 % runderserumalbumine (BSA). De beklede en geblokkeerde vaste fase werd maanden nat bij 4°C bewaard. Drogen gaf een stabieler produkt. De vaste fase werd bekleed met het hierboven beschreven HT-H9/HTLV-IIIB lysaat verdund in Tris/BSA/Tween buffer tot een verdunningsgraad 25 waarmee bij het testen 1-2 % van de label aan een negatief serum kon worden gebonden. De meest doeltreffende manier van bekleden was door antigeen 2 dagen in de vaste fase bij kamertemperatuur te incuberen en daarna in vochtige toestand bij 4°C te bewaren totdat het werd gebruikt.

30 Eerder uitgevoerde proeven hadden aange toond dat de vaste fase in deze vorm enkele maanden stabiel bleef. Maar hij kan ook worden gedroogd zonder aanmerkelijk verlies in sterkte en blijft dan enkele maanden stabiel.

b) Merken van globuline.

35 Het boven onder 2a) beschreven IgG werd op gebruikelijke wijze geconjugeerd met MWPO onder gebruikmaking van heterobifunctionele derivaten om een molaire substitutieverhouding 8620004 - 11 - van 1:3 te bereiken. Het aan de boven onder 2a) beschreven vaste fase gebonden materiaal werd gébruikt voor een enzymatische immunobepaling om antilichaam tegen Aids retrovirussen in monsters lichaamsvloeistof aan te tonen.

125 5 Ter vergelijking werd een met I gemerkt

IgG monster met een specifieke activiteit van 15 ^iCi per jig proteïne gebruikt.

Voorbeeld 3 Eénstapspompetitieve ELISA van anti-CEM/CBL-1 serumreagentia♦ 10 Een humaan serum met een hoge titer aan anti-HTLV-III werd gebruikt voor het bekleden van globuline zoals beschreven in voorbeeld 2.2.

Microtiterplaten uit polystyreen en met putjes met een ronde bodem werden bekleed met optimaal verdund 15 globuline waarna de vrije plaatsen werden afgedekt met een inert proteïne (0,1 % BSA). Uit hetzelfde serum werd immunoglobuline gewonnen dat werd gezuiverd door ionenuitwisselingschromatogra-fie over DE 52 zoals hiervoor beschreven. IgG werd gekoppeld met mierikswortelperoxydase in een substitutieverhouding van onge-20 veer 3 mol mierikswortelperoxydase en 1 mol IgG.

Het gedrag van het conjugaat werd bepaald door incuberen in putjes die te voren waren bekleed met een indirect antilichaam tegen virusantigenen afkomstig uit HTLV III geïnfecteerde cellen en met antigenen niet-geïnfecteerde cellen.

25 Als optimum voor de verdunning van het conjugaat werd de maximale kleurvorming door binding met het geïnfecteerde celantigeen en de minimale kleurvorming door binding met de niet-geïnfecteerde cellen genomen.

CEM/CBL-1 antigeen.

30 Met CEM/CBL 1 virus persistent geïnfecteerde cellen werden in niet-aanhechtende roercultures gekweekt tot maximale dichtheid. De roercultures werden gekoeld tot 4°C en daarna met β-propiolacton op 0,25 vol.% gebracht. Na 2 uren incuberen bij 4°C werd de celpellet geoogst en onderworpen aan 35 vries-dooicycli, om daarna te worden opgehelderd zoals hiervoor beschreven door centrifugeren. Het weefselcultuurextract werd 8 6 2 " 0 0 4 - 12 - nog 2 uren geïncubeerd bij 4°C met 0,25 % β-propiolacton en na afloop gehydrolyseerd zoals hiervoor beschreven. Als verdunnings-middel om de cellen open te breken en voor de vries-dooi-cycli werd een fosfaat gebufferde zoutoplossing, gesupplemen-5 teerd met 0,1 % Tween 20, gebruikt. Antigeenpreparaten of bereidingen werden vervolgens getitreerd op een microtiterplaat bekleed met hoge-titer anti-HTLV III globuline. Voor het daaropvolgend testen werd een werkverdunning gebruikt met een verdun-ningsgraad die onder de hieronder aangegeven omstandigheden een 10 OD van 450 nm bij 1,0-1,2 gaf.

Optimalisering en uitvoering van testen.

Met hoge-titer globuline beklede en daarna geblokkeerde putjes werden geïncubeerd met een 100 ƒ11 optimale verdunning van CEM/CBL-1 antigeen. Na een nacht incuberen bij 15 kamertemperatuur werd het antigeenextract uit de putjes gewassen die daarna werden gedroogd onder zodanige omstandigheden dat de stabiliteit van geïmmobiliseerde CEM/CBL-1 virusantigenen er door werd verhoogd. Voor testen werd 25 ƒ11 antilichaam positieve en antilichaam negatieve sera in afzonderlijke putjes gébracht 20 waaraan 75 ƒ11 ELISA conjugaat in detergent-gesupplementeerd gedestilleerd water werd toegevoegd. Het mengsel van testserum en conjugaat werd in de putjes gedurende verschillende tijden en onder verschillende omstandigheden geïncubeerd (immuunincubatie). Na afloop werden de putjes drie keer gewassen met zoutoplossing/ 25 Tween (0,8 %-ige natriumchloride-oplossing gesupplementeerd met 0,1 % Tween 20). Hierna werden de putjes gevuld met zoutoplossing/ Tween 20 en 2 minuten bij kamertemperatuur geweekt waarna het wassen nog drie keer werd herhaald.

Vervolgens werd 100 ƒ11 3,3',5,5'-tetra-30 methylbenzidine (TMB) als chromogeen-substraat toegevoegd. Na 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur werd de chromogeen-afgifte beëindigd door toevoegen van 50 ƒ11 4N zwavelzuur. De kleurvorming werd spectrofotometrisch bij 450 nm gemeten. Als werkverdunning voor een bepaald CEM/CBL 1 antigeen werd die ver-35 dunning genomen welke met ELISA een optische dichtheid van 1-1,2 met negatief serum gaf onder optimale omstandigheden, dat 8620004 - 13 - wil zeggen een immuunincubatie van 1 uur bij 45°C.

Resultaten.

Uit vergelijking van de resultaten verkregen met gebruikelijke RIA onder toepassing van de vaste fase en 125

5 I gemerkt IgG zoals beschreven in voorbeeld 2 en de ELISA

resultaten verkregen in dit voorbeeld, blijken twee onverwachte voordelen met ELISA. Ten eerste konden suboptimale antigeen-preparaten of bereidingen die met RIA middelmatige resultaten gaven, bij dezelfde titer goede ELISA resultaten geven. Ten 10 tweede was het met RIA niet mogelijk om de incubatietijd tot minder dan 3 uren terug te brengen zoals blijkt uit onderstaande tabel. Voor transfusie is een snelle bepaling van in totaal 1-2 uren nodig en dit is alleen maar mogelijk met ELISA.

Tabel 125 15 Tijd/tempera tuur proeven met RIA met I gemerkt IgG.

Tijd, Temperatuur _Controle sera_

Uren_negatief_afsnijding_positief 18 1 1,13* 0,28 0,08 20 3 L kamer- 0,37 0,19 0,1 2 * temp. 0,30 0,18 0,09 1 J 0,34 0,15 0,1 3 1 0,43 0,15 0,11 2 S 37 °C 0,43 0,19 0,09 25 1 ƒ 0,28 0,18 0,12 3 Ί 0,45 0,14 0,06 2 > 45°C 0,40 0,14 0,07 1 ƒ 0,27 0,13 0,05 30 * % binding van uitgangsniveau.

In figuur 2 zijn de resultaten weergegeven van testen met ELISA van 56 klinische sera afkomstig van haemo-filie patiënten behandeld met handels- en niet handels Factor VIII concentraten en van homosexuelen. Uit de figuur blijkt dat 35 er een duidelijke scheiding bestaat tussen voor anti-CEM/CBL-1 reactieve en niet-reactieve sera. In dit speciale voorbeeld bedroeg de gemiddelde optische dichtheid van 16 voor CEM/CBL-1 antilichaam reactieve sera 0,085 (0,037-0,327) en de gemiddelde 8620004 - 14 - optische dichtheid van 40 voor dit antilichaam niet-reactieve sera 1,16 (0,736-1,352). Serum a was afkomstig van een terminale Aids patiënt en was zwak-reactief bij IF en directe bindings-bepalingen. De sera b en c waren bij opnieuw testen niet-reactief.

5 Exact hetzelfde formaat is toegepast bij een onderzoek van bloedtransfusiesera in Groot-Brittannië. Tot op heden zijn 12.000 sera van donors getest. Drie sera gaven screen-testreactie maar, bij opnieuw testen, bleek slechts één enkele donor reactief. Het serum was herhaaldelijk reactief, en was 10 titreerbaar, en vertoonde bij immunofluorescentiebepaling sterke reactiviteit tegen geïnfecteerde maar niet tegen niet-geïnfecteer-de cellen. De spreidingsreactiviteit van sera die niet in relatie stond tot CEM/CBL-1 infectie, was daarom bijzonder laag. Bij daaropvolgende proeven met titreren van voor anti-HTLV III reac-15 tieve sera bleek dat de titers ruimschoots dezelfde waren bij testen met zowel CEM/CBL-1 ELISA als directe bepalingen. Dit is bevestigd door daarop volgend onderzoek aan sera van patiënten met acute seroconversie na primaire HTLV III infectie. Weer was er globaal genomen geen verschil in niveau of tijd van begin-20 reactiviteit bij zowel rectstreekse bindingsbepaling als competitieve ELISA. Met dezelfde bepaling waren sera afkomstig van patiënten met oligo- en pan-reactieve anti-lymfocyt-antilichamen en sera afkomstig van patiënten met auto-immune aandoening niet-reactief bij competitieve ELISA. Alles bij elkaar blijkt uit deze 25 gegevens dat de specificiteit en gevoeligheid van deze competitieve ELISA van antilichaam tegen Aids verwant retrovirus hoog zijn.

Voorbeeld 4

Eenstaps competitieve ELISA van anti-HTLV I.

30 Op dezelfde wijze als voor de CEM/CBL-1 irnmunobepaling in voorbeeld 3 werden sera en reagentia gekozen en bereid maar met dit verschil dat met HTLV I geïnfecteerde cellen voor antigeenbereiding werden gebruikt, en dat als bron van reagentia sera afkomstig van met HTLV I geïnfecteerde pa-35 tiënten werden gebruikt. In figuur 3 is de optische dichtheid van 32 klinische sera met inbegrip van drie bekende zwak-posi- 8620004 - 15 - tieve controles weergegeven. Tussen reactieve en niet-reactieve sera trad duidelijke differentiatie op met een gemiddelde optische dichtheid van 5 voor dit antilichaam reactieve sera van 0,099 (0,060-0,129) en een gemiddelde optische dichtheid voor 5 24 tegen dit antilichaam niet-reactieve sera van 1,64 (1,48- 1,83) . De test werd niet verfijnd uitgevoerd en de omstandigheden konden worden gewijzigd, maar bij uitvoering werd besloten om te optimaliseren op een immuun-incubatie van 1 uur bij 45°C. Dit was parallel aan de omstandigheden voor het aantonen van CEM/CBL-1 10 antilichaam.

Deze test is op dezelfde wijze uitgevoerd om meer dan 1000 ongeselecteerde Britse bloeddonors te selecteren waarbij geen reactieve sera werden opgespoord. Daarentegen werd bij selectief onderzoek van ongeveer 75 donors van Afrikaanse 15 en Caribische oorsprong één enkele seropositieve donor die voor het eerst bloed gaf, geïdentificeerd.

De boven beschreven uitvoering werd herhaald maar met sera afkomstig van met HTLV II geïnfecteerde patiënten als bron voor globulinebekleding en als bron van IgG. Met HTLV 20 II geïnfecteerde cellen werden als antigeenbron gébruikt. Deze reagentia werden op dezelfde wijze als beschreven in voorbeeld 2 voor de anti-HTLV III RIA geselecteerd en bereid.

Voorbeeld 5

Vervaardiging en gebruik van een testpakket.

25 1. Reagentia.

Van een polystyreen microtiterplaat met 96 putjes werd ten minste het binnenoppervlak van de putjes bekleed met gezuiverd, warmtebehandeld, humaan antilichaam tegen CBL-1. Het antilichaam was afkomstig uit een warmtebehandeld 30 serum van iemand met Aids retrovirusinfectie. Na het bekleden van de polystyreenplaat met het antilichaam werden de extra bindingsplaatsen geblokkeerd door bedekken met een inert proteïne, in dit geval runderserumalbumine. Als antigeen voor het onoplosbaar maken op de polystyreenplaten werd CBL-1 gebruikt. Dit werd 35 eerst behandeld met het viricide β-propiolacton waarna de behandelde polystyreenplaten ongeveer 2 dagen bij kamertemperatuur 8620004 - 16 - werden geïncübeerd met een suspensie van geïnactiveerd CBL-1 in Tris/BSA/Tween buffer. Aldus werd het CBL-1 door indirecte binding aan de polystyreendrager middels het antilichaam onoplosbaar gemaakt. Deze component was de eerste in het testpakket.

5 De tweede component in het testpakket werd bereid door hetzelfde humaan antilichaam dat voor het bekleden van de polystyreenplaten was gebruikt, te labelen. Het antilichaam werd op gébruikelijke wijze geconjugeerd met mieriks-wortelperoxydase (MWPO). Het MWPO gelabelde antilichaam werd in 10 gevriesdroogde toestand bewaard en vlak voor gebruik gerecon-stitueerd met een suspensie in een waterig verdunningsmiddel.

Behalve deze twee componenten is het gewenst om in het testpakket hulpreagentia op te nemen zodat alle benodigde aantoonbaar makende reagentia en controle reagentia 15 beschikbaar zijn. Voor het hier beschreven testpakket met MWPO als label was het geschikt om 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) als substraat voor het enzym te gébruiken. Het TMB verkeerde in de vorm van tabletten die elk voldoende substraat voor 96 putjes verschaften.

20 Vlak voor gebruik werden de TMB tabletten opgelost in een waterige oplossing van trinatriumcitraat en wa-terstofperoxyde. Ook is het gewenst om over positieve en negatieve controlesera te beschikken. Het negatieve controleserum in dit geval was normaal humaan serum, niet-reactief voor anti-25 lichaam tegen CBL-1. Het positieve controleserum was warmtébe-handeld humaan serum dat bij de test reactief voor antilichaam tegen CBL-1 is. Daarnaast is het gewenst om als afsnijdings-of begrenzings- (cut-off) controleserum warmtebehandeld humaan serum, reactief (op het afsnijdings- of begrenzingsniveau bij de 30 test) voor antilichaam tegen CBL-1, alsook een zout en Tween 20 bevattende wasvloeistof te verschaffen.

2. Gebruik van het testpakket.

Het gelabeld MWPO antilichaam werd vlak voor gebruik gereconstitueerd. De test werd uitgevoerd met 25 jü. 35 serummonsters per putje. In twee putjes werd negatief controleserum gébracht, in één putje positief controle serum, in drie 8620004 - 17 - putjes afsnijdings- of begrenzingscontroleserum en in de overige putjes testmonsters. In elk putje werd 75 ƒ11 gereconstitueerd MWPO gelabeld antilichaam gebracht en de microtiterplaat werd na afdekken 1 uur op een verwarmingsblok bij 45°C geïncubeerd, 5 of in plaats daarvan, 1s-nachts 16 uren bij 20-25°C. Na afloop van het incuberen werd de plaat gewassen en werd in elk putje 100 ^il substraatoplossing gebracht. De plaat werd daarna 20 minuten bij 18-25°C geïncubeerd waarna zich in de putjes met negatieve monsters een blauwe kleur ontwikkelde. Vervolgens werd in 10 elk putje 50 ƒ11 2M zwavelzuur gébracht waarop de blauwe kleur omsloeg tot geel. Binnen 30 minuten na het toevoegen van de zwavelzuur werd van elk putje de absorbantie bij 450 nm bepaald met een microtiterplaatregistreerapparaat.

3. Resultaten.

15 De meetresultaten werden als volgt uitge werkt:

Van de drie afsnijdings- of begrenzings-controlesera werd de gemiddelde absorbantie berekend. Elk monster met een absorbantie gelijk aan of groter dan de gemiddelde 20 begrenzingscontrolewaarde werd als negatief voor antilichaam tegen Aids retrovirus binnen de limiet van het testsysteem beschouwd. Elk monster met een absorbantielager dan die van de gemiddelde begrenzingscontrolewaarde of tot 10 % boven de gemiddelde begrenzingscontrolewaarde werd opnieuw getest.

25 Elk serum dat bij de test herhaaldelijk positief bleek, werd daarna ter bevestiging opnieuw getest onder toepassing van immunofluorescentie of Western vloeipapier.

Met de boven beschreven procedure werden 1600 routine bloedbankdonormonsters getest met negatieve uit-30 slag. Maar bij testen van andere klinische specimina afkomstig van patiënten met een klinische diagnose van Aids, Aids-verwant complex of andere aandoeningen, werden positieve resultaten aangetoond en in praktisch alle gevallen bevestigd door immuno-fluorescentiebepaling of een andere, enzymatische immuno-35 bepaling. De resultaten zijn in onderstaande tabel samengevat.

8629004 5 - 18 -Tabel

Reactiviteit van sera afkomstig van bloeddonors en patiënten met Aids, Aids geassocieerde toestand en andere ziekten.

Klinische Aantal Antilichaam Bevestigd groep monsters positief anti- bij gebruik lichaam van het posi- 10 _testpakket_tief ' bloeddonors 1600 0

Aids 44 4

Ais gerelateerd complex 39 39 39 hoge risicogroepen 77 7 15 andere ziekten*3 ^ infectieuze mononucleose 48 0 - c) hepatitis B 25 3 2 syfillis 117 2 2 rheumatoïde arthritis 90 20 andere infecties*^ 37 0 - a) bevestigende tests omvatten immunofluorescentiebepaling en een alternatieve enzymimmunobepaling 25 b) alleen positieve monsters bevestigd c) één monster positief op 2 van 4 testgevallen; bevestigd negatief 30 d) omvat rubella (18 gevallen), parvovirus (9), cytomegalovirus (5), toxoplasmose (5).

Het principe om een humaan antiserum te gebruiken voor het binden van viraal antigeen aan een vaste fase 35 geeft een vaste fase die zelf het patroon van virale antigenen weerspiegelt dat het best bij mensen wordt herkend. Dit kan voordelig zijn omdat het mengsel van geherbergde antigenen en het 8620004 - 19 - profiel van humane antilichamen goed op elkaar "passen". Verder kunnen de voor antigeenbereiding toegepaste milde omstandigheden preservatie toelaten van delicate aanpassingsepitopen die niet voorkomen in gradiëntgezuiverde en verbroken preparaten of be-5 reidingen toegepast bij andere vaste fasebepalingen. Het is nu mogelijk om het mengsel van vaste fase antigenen aan te passen door de vaste fase te bekleden met murien monoklonaal anti-lichaam van bepaalde specificiteit zodat de geïmmobiliseerde antigenen van een te voren bepaalde specificiteit zijn.

10 Uit de vermelde resultaten blijkt dat de test voordelig is met een gekozen monoklonaal antilichaam dat met p25 (een proteïne met een molecuulgewicht van 25 K dalton) op de vaste fase. De voordelen zijn dat voor een geschikte bepaling minder antigeen nodig is (onderstaande tabel A) en dat de 15 gevoeligheid van de test toeneemt. Dit laatste blijkt uit onderstaande tabel B omdat de eindpuntverdunningen (lagere OD) van afzonderlijke sera bij de monoklonale test een grotere inhibitie geven dan bij de polyklonale test. Vanwege de verhoogde gevoeligheid is de test doeltreffender dan andere bepalingen om anti-20 lichaamvorming vroegtijdig aan te tonen. Bovendien wordt met het gebruik van een murien antilichaam op de vaste fase het mogelijk probleem van rheumatoïde-achtige factoren die tussen vaste fase humaan IgG en het humaan IgG conjugaat bij de homologe bepaling dwarsbindingen vormen, vermeden. In de praktijk zijn enkele sera 25 herkend die bij de monoklonale bepaling consistent een hogere inhibitiegraad vertonen dan bij de polyklonale bepaling. Dit is waarschijnlijk het gevolg van het lage niveau en de lage titer-reactiviteit waarmee conjugaat aan de vaste fase op een niet-specifieke wijze bij alleen de homologe bepaling wordt gebonden. 30 Dit of een soortgelijk verschijnsel kan ook een andere, onverwachte vondst verklaren dat de spreiding in optische dichtheid-reactiviteit van normale sera bij de monoklonale bepaling veel nauwer is dan bij een gelijktijdig uitgevoerde polyklonale bepaling.

35 Nu het eenvoudig is gebleken om een mono klonaal antilichaam tegen een retroviraal gag genprodukt te ge- 8620004 - 20 - bruiken, waarmee in wezen een competitieve bepaling van de humaan anti-HTLV-III kernrespons wordt verschaft, kunnen waarschijnlijk door gébruik van antilichamen tegen bepaalde env produkten analoge bepalingen voor antilichamen tegen geselecteerde omhullings-5 antigenen worden ontwikkeld. Daardoor kan de humane respons op verschillende virusantigenen veel nauwkeuriger worden onderzocht hetgeen van belang kan zijn voor klinische en prognostische controles en controle op infectie.

Tabel A

10 Titratie van CEM/CBL-1 antigeen op polyklonale en _monoklonale vaste fasen._ _Vaste fase bekleding_

Antigeenverdunning Polyklonaal Monoklonaal nega- afsnij- posi- nega- afsnij- posi- 15 _tief ding* tief tief ding_tief

10 1,34** 0,69 0,05 NG NG NG

20*** 1,14 0,45 0,03 1,85 0,86 0,11

30 0,82 0,42 0,03 NG NG NG

40 NG NG NG 1,50 0,37 0,09 20 60 NG NG NG 1,36 0,38 0,08 80 NG NG NG 1,23 0,28 0,07 100_NG_NG_NG 1,18*** 0,27 0,07 * afsnijding - zwak positieve controle ** OD bij 450 nm bij standaardconditie test voor anti- 25 CEM/CBL-1 *** "werk" titer van antigeen preparaat NG = niet getest.

30 8620004 - 21 -

Tabel B

OD 450 nm van verdunningen van 19 sera getitreerd tot 50 % inhibiterend eindpunt, getest op poly-klonale en monoklonale vaste fase.

5 _ vaste fase bekleding serum - _polyklonaal_monoklonaal_ controle positief 0,08 0,09 afsnijding 0,76 0,55 10 negatief 1,39 1,42 hemofilie 1 1,08 0,86 2 0,95 0,77 3 1,01 0,77 4 1,04 0,74 15 Aids 1 0,63 0,48 2 0,93 0,71 3 0,85 0,52 4 0,70 0,56 PGL 1 0,84 0,62 20 (persistente 2 0,84 0,58 algehele 3 0,73 0,56 lymfadeno- 4 0,60 0,48 pathie geneesmiddel- 1 0,50 0,44 25 verslaving 2 0,66 0,50 3 0,95 0,73 4 0,85 0,63 gezond 1 0,50 0,41 2 0,56 0,42 30 3 0,69 0,49

In de bovenstaande voorbeelden is de bepaling uitgevoerd aan met de vaste fase verbonden label. Maar omdat het gehalte label verbonden met de uitgangssera is of kan 35 worden bepaald, is het ook mogelijk om de vermindering in radio activiteit of gehalte enzym verbonden met de vloeistoffase te volgen nadat de bekende gelabelde sera en testsera met het vaste-fase antigeen in aanraking zijn gebracht en kan de vermindering in labelgehalte van de vloeistoffase worden gébruikt als maat 40 voor het gehalte antilichaam in de testsera.

De voordelen van de gelijktijdige competi- 8620004 - 22 - tieve bepaling kunnen als volgt worden samengevat:

Antigeen preparaat c.q. bereiding

Hoewel in voorbeeld 2 de toepassing van gezuiverde HTLV-III virussen is beschreven, maakt de verhoogde bin-5 ding die het gevolg is van het gebruik van een geïmmobiliseerd antilichaam het mogelijk om voor het bekleden een ruw cellysaat-preparaat te gebruiken dat zich opzich, zoals een antigeen, niet direct op geschikte wijze aan een vaste fase bindt. Daarmee wordt de beperkende noodzaak om sterk gezuiverd antigeen voor het ver-10 vaardigen van een diagnostisch testpakket te gébruiken, vermeden, en wordt het vervaardigen ervan eenvoudiger. Dit voordeel is niet van toepassing op directe bepalingen waarbij een totale humaan globulinebekleding met de eind-anti-humaanglobulinelabel een onvermijdelijk signaal zou geven.

15 Uitvoering

Het gebruik van onverdund serum biedt een aanmerkelijk voordeel voor bloedtransfusiecentra waar het bloed eerst moet worden verdund hetgeen een belasting van werk betekent. De volumeverhouding serum en enzym-label kan worden gevarieerd van 20 1:1 tot 1:10 met slechts geringe wijzigingen in de testuitvoering.

De optimale volumeverhouding bedraagt 1:3 onder gebruikmaking van 25 jil serum en 75 ƒ11 enzym-label, en geeft een goede differentiatie tussen positieve en negatieve sera. Door toepassing van ELISA kan de bepalingstijd worden verkort tot 1 uur of minder.

25 Gevoeligheid

Een maat voor de gevoeligheid van een bepaling van Aids antilichaam is de hoeveelheid serum die van terminale Aids patiënten die positief blijven, moet worden afgenomen. Bij directe bepalingen schijnt het dat een wisselend aantal pa-30 tiënten antilichaamsreactiviteit verliest. Dit gebeurt niet met een competitieve bepaling hetgeen doet vermoeden dat de gevoeligheid van de competitieve bepaling even goed is als of beter is dan de andere, tegenwoordig gebruikelijke bepalingen.

Specificiteit 35 Van een competitieve bepaling mag niet worden verwacht dat deze belangrijke problemen met betrekking tot vals- 8620004 - 23 - positieve reactiviteit geeft- Opname van lymfocytmembraan-antigenen in de omhulling van HTLV virionen leidt beslist tot valse reactiviteit net als de aanwezigheid van IgG aggregaten die niet-specifiek aan de vaste fase hechten. Een dergelijk ver-5 schijnsel brengt geen reactiviteit bij de competitieve bepaling teweeg. Niet-specifieke invloeden van schommelingen in de pro-teïneconcentratie kunnen worden geminimaliseerd door een juiste volumeverhouding serum en label te kiezen (1:3 zoals boven vermeld) en door een afsnijding van meer dan 50 % inhibitie toe te 10 passen. Sera die een inhibitie van labelbinding gelijk aan of groter dan die met een intern controleserum geven, worden als screentest positief aangemerkt maar de test moet worden herhaald. Vanwege het geringe aantal gevallen van valse reactiviteit, op minder dan 1 op 5000 geschat, is het onwaarschijnlijk dat vals-15 positieve reacties bij de competitieve ELISA dergelijke omvangrijke problemen zullen geven zoals, naar het schijnt, bij directe bepalingen. Dit is in het bijzonder het geval waar directe bepalingen zonder een controle antigeen worden uitgevoerd. Voorzien wordt dat dit het geval zal zijn in transfusiecentra omdat 20 het gébruik van een controle antigeen een verdubbeling van de behoefte aan reagentia voor directe bepaling met zich mee brengt. Samenvatting

De combinatie van eenvoudige uitvoering, hoge gevoeligheid en hoge specificiteit maken dat de competi-25 tieve bepaling bij uitstek geschikt is voor selectief onderzoek van bloeddonaties en voor diagnostische doeleinden. En omdat in transfusiecentra een directe bepaling van anti-HTLV-III wordt gebruikt, kan het bovendien beter blijken te zijn om serum-reactiviteit te bevestigen door opnieuw testen met een competi-30 tieve bepaling in plaats van de sera te onderwerpen aan het meer bewerkelijk en minder gevoelig Western vloeiing (Western Blotting) die door de FDA in Amerika kan worden aanbevolen.

8623004

Claims (21)

1. Methode voor het bepalen van antilichaam tegen retrovirussen in een biologisch monster door het biologisch 5 monster in aanraking te brengen met 1. een onoplosbaar gemaakt antigeen bestaande uit retrovirus antigenen gebonden aan globuline waarbij het globuline zelf aan een inerte, vaste drager is gehecht, en 2. een immunoglobuline dat een specifiek 10 antilichaam tegen de retrovirus antigenen bevat en dat is gelabeld met een niet-radioactief aantoonbaarmakend label, de vloei-stoffase van de vaste fase te scheiden en de hoeveelheid aantoonbaarmakend label geassocieerd met de vloeistof of de vaste fase te bepalen.

2. Methode volgens conclusie 1 waarbij het retrovirus humaan T-lymfotroop retrovirus CBL-1 is.

3. Methode volgens conclusie 1, waarbij het retrovirus humaan T-lymfotroop retrovirus HTLV-III, humaan T-leukemie retrovirus HTLV-II of humaan T-leukemie retrovirus

4. Methode volgens een der voorgaande conclusies waarbij het biologisch monster serum of plasma afkom-tig uit humaan bloed is.

5. Methode volgens conclusie 4 waarbij het 25 retrovirus humaan T-lymfotroop retrovirus CBL-1 of humaan T- lymfotroop retrovirus HTLV-III is en waarbij het met het aantoonbaarmakend middel gelabelde immunoglobuline afkomstig is van een patiënt die asymptomatisch is geïnfecteerd met het Aids retrovirus maar een een normaal immunoglobulinegehalte heeft.

6. Methode volgens een der voorgaande con clusies waarbij het aantoonbaarmakend label een enzymlabel is.

7. Methode volgens een der voorgaande conclusies waarbij het aan de drager gehechte globuline monoklonaal antilichaam dat zich aan retrovirus antigeen bindt, is.

8. Testpakket omvattende 1. een eerste component bestaande uit een 8620004 - 25- onoplosbaar gemaakt antigeen bestaande uit retrovirus antigenen gebonden aan globuline waarbij het globuline zelf aan een inerte, vaste drager is gehecht en 2. een tweede component bestaande uit een 5 immunoglobuline dat een specifiek antilichaam tegen de retrovirus antigenen bevat en dat met een niet-radioactief aantoonbaarmakend label is gemerkt.

9. Testpakket volgens conclusie 8 waarin het retrovirus humaan T-lymfotroop virus CBL-1 is.

10. Testpakket volgens conclusie 8 waarin het retrovirus humaan T-lymfotroop virus HTLV-III, humaan T-leukemie virus HTLV-II of humaan T-leukemie virus HTLV-I is.

11. Testpakket volgens conclusie 8 waarin het retrovirus humaan T-lymfotroop retrovirus CBL-1 of humaan

12. Testpakket volgens conclusie 8-11 waar- 20 in het aantoonbaarmakend label een enzymlabel is.

13. Testpakket volgens conclusie 8-12 waarin het aan de drager gehechte globuline monoklonaal antilichaam dat zich aan retrovirus antigeen bindt, is.

14. Humaan T-lymfotroop retrovirus CBL-1 25 etiologisch verwant of verband houdend met Aids.

15. Leukemie T-cellen CCRF-CEM die humaan T-lymfotroop retrovirus CBL-1 herbergen.

15 T-lymfotroop retrovirus HTLV-III is, en het immunoglobuline afkomstig is van een patiënt die asymptomatisch met het Aids retrovirus is geïnfecteerd maar een normaal immunoglobuline-géhalte heeft.

16. Onoplosbaar gemaakt humaan T-lymfo-troop retrovirus CBL-1 antigenen gebonden aan globuline waarbij 30 het globuline zelf aan een inerte, vaste drager is gehecht.

17. Onoplosbaar gemaakte antigenen volgens conclusie 16, waarbij het globuline afkomstig is van een patiënt die al asymptomatisch met Aids retrovirus is besmet maar een normaal immunoglobulinegehalte heeft.

18. Onoplosbaar gemaakte antigenen volgens conclusie 16 waarbij het globuline monoklonaal antilichaam dat 8620004 -Λ - zich aan retrovirus antigeen bindt, is.

19. Methode volgens conclusie 1 zoals beschreven in de beschrijving en voorbeelden.

20. Testpakket volgens conclusie 8 zoals be-5 schreven in de beschrijving en voorbeelden.

20 HTLV-I is.

21. Onoplosbaar gemaakte antigenen volgens conclusie 16 zoals beschreven in de beschrijving en voorbeelden. 10 8620004