HU204929B - Method and test set for detecting antibodies of aids retrovirus, as well as producing the retrovirus - Google Patents

Description

A találmány tárgya új eljárás retrovfrus antitestek kimutatására, továbbá az eljárásban alkalmazható új CBL-1 vírusizolátumok előállítására; közelebbről a találmány az emberi T-Iimfotrop vírussal rokon CBL-1 retrovírus elkülönítésére, és ezek alkalmazására terjed ki szérumvizsgálatokban a szerzett immunhiányos tünetcsoporttal (AIDS-szel) kapcsolatban állő retrovfrusok antítestjei jelenlétének kimutatására.

Néhány éve megnőtt a fertőzés következtében fellépő szerzett űnmunhiányos tünetcsoport (AIDS) gyakorisága. A betegség tünetei bizonyos jól meghatározható rizikócsoportokra korlátozódnak, amelyek alapján határozottan szexuális kapcsolattal vagy vér útján átvihető kórokozót lehet feltételezni. Bár a betegséget eredetileg az Amerikai Egyesült Államokban vették észre, máshol is Európát is beleértve - fokozódik az elterjedése.

A betegség terjedésének egyik feltételezett módja az olyan véradók vérével végzett vértranszfuzió, akik AIDS-vírussal fertőzöttek. A véradók vérének közös vérkészletben való tárolása azt eredményezi, hogy ha egy AIDS-vírust hordozó véradó vérét más véradók vérével tárolják együtt, akkor az egész vér és más, ebből a vérkészletből készített készítmények fertőzöttek lehetnek, bármilyen sok vagy kevés legyen is a fertőzött minta. Sok AIDS-vírust hordozó véradó nincs tudatában fertőzőttségének, különösen azok, akik a fertőzés kezdeti fázisaiban vannak; más fertőzött véradók pedig, még ha tudnak is fertőzésükről, vonakodnak annak közlésétől, hogy ebben a betegségben szenvednek vagy hogy egy rizikócsoportba tartoznak. Növekvő igény van ezért olyan viszonylag egyszerű, de teljesen megbízható vizsgálatokra, amelyekkel a transzfúzió céljára adott vér mintáit rutinszerűen lehet megvizsgálni, hogy jelen yan-e bennük az AIDS-vírus vagy annak antitestjei, A vizsgálat során pozitívnak bizonyult vér felhasználását transzfüzióra vissza lehet utasítani és el lehet kerülni a többi vérminták megfertőződését, ami a fertőzött vérrel egy készletben való tárolás révén következne be.

Az AIDS okozójának azonosítására és elkülönítésére irányuló kutatásokat körülbelül 2 éve folytatják aktívan, de még mindig vannak véleménykülönbségek különböző kutatók között a pontos azonosítást és elnevezést illetően. Egy úgynevezett AIDS-vírus izolátumról először Montagmer és munkatársai adtak hírt Francia- ^í országból 1983-ban; az anyagot „Lymphadenopathy Associated Vírus One”-nak, azaz LAV-l-nek (nyirokcsomó-bántalommal összefüggő vírus I. típusa) nevezték el. Majdnem egy évvel később Gallo és munkatársai az Amerikai Egyesült Államokban közzétették egy 5 másik úgynevezett AIDS-vírus elkülönítésének részleteit; a vírust „Humán T-Iymphotrophic Vírus Type ΠΓ’nak, azaz HTLV-IH-nak (emberi T-limfotrop vírus Hl. típusa) nevezték el. [Science 220, 865-867 (1983)]. Ismeretesek HTLV-I/H/III alkalmazásán alapuló kimu- 5 tatási eljárások [J. of Exp. Med. 159, 1117-1131 (1984); The Láncét, 1984. június 9,1253-1256].

Nyirokcsomó-daganatból sikerült elkülönítenünk egy a HTLV-III-mal és az LAV-val rokon emberi T-limfotrop retrovfrust, amelyet CBL-l-nek nevezetünk el. 61

CBL-1 jelű anyagunk egy stabil izolátum, amelyet gazdasejtvonalban tenyészteni lehet és felhasználható szérummintákban levő AIDS-vírus antitestek kimutatására szolgáló vizsgálatban.

A találmány tehát kiterjed az etiológiailag az AIDSszel kapcsolatban levő CBL-1 jelű emberi T-limfotrop retrovírus előállítására nyirokcsomó-daganatsejtekból.

Azt találtuk, hogy a CBL-l-et hosszú ideig fenn lehet tartani CCRF-CEM jelű leukémiás T-sejtvonalak0 bán [ismerteti Foley és munkatársai: Cancer, 18, 522529, (1965)], és a találmány további részét képezik a CCRF-CEM sejtek alkalmazása a CBL-1 vírus befogadására.

Igazolásul CBL-1 vírusainkat befogadó CCRF5 CEM sejteket tartalmazó mintákat deponáltunk a National (jelenleg European) Collection of Animál Cell Cultures (NCACC) sejttenyészet-gyűjteményben, a Public Health Laboratory Service Centre fór Applied Microbiology and Research intézménynél, Porton 0 Down, Salisbury, Wiltshiie, SP4 OJG, Anglia. Az NCACC az 1977-es Budapesti Szerződés értelmében kijelölt nemzetközi letéteményes szerv. A deponálás dátuma 1985.01.11., száma 85 011101.

DBC-1 jelű anyagunkat olyan limfocitákból külőní5 tettük el, amelyeket angol beteg nyirokcsomó-daganatának biopsziás mintájából tenyésztettünk ki; a beteget AIDS kapcsán fellépő immunoblasztikus Iymphomával kezelték. A biopsziás minta részeit olyan tápközegben tartottuk, amely T-sejt növekedési faktort tartalma) zott és körülbelül 2 nap múlva a CCRF-CEM sejteket hozzáadtuk a tenyészethez, amelyet olyan körülmények között tartottunk, hogy a primer limfociták körülbelül egy hónap alatt eltűnjenek, mialatt a CCRR-CEM sejtek szaporodnak és CBL-1 vírussal krónikusan fer> tőzötté válnak.

Kimutattuk, hogy a CBL-1 vírus rokon a korábban leírt HTVL-IH izolátumokkal, az alábbiak alapján:

a) van reverz transzkriptáz aktivitása, magnézium(II)kationokkal szemben mutatott preferenciával;

¹ b) az elektronmikroszkóppal láthatóvá tett vírusrészecskék morfológiáját tekintve;

c) közvetett immunfluoreszcens módszer alapján, amely a CBL-l-gyel fertőzött CCRF-CEM sejtek vírus antigénjeinek AIDS-fertőzött betegek szérumával való reakciójára specifikus;

d) szilárd fázisú radioimmunoassay alapján összehasonlítva HTLV-III-mal és LAV-l-gyel;

mindezek alapján a Retroviridae rendszertani csoportba tartozik, amely tartalmazza az emberi T-sejt limfotrop vírusokat.

Az előzetes DNS-szekvenciaanalízis azt mutatja, hogy a CBL-1 vírus szekvenciája, bár közeli rokonságban van az eddig leírt többi emberi T-limfotrop retrovírusokéval, nem azonos a korábban leírt anyagokéval, hanem különböző helyeken bizonyos szekvenciális módosulásokat mutat

Kimutattuk, hogy azok a fertőzött sejtek, amelyeket az ECACC sejttenyészet-gyűjteményben letétbe helyeztünk, legalább 6 hónapig folytatják a vírusok és a vírus antigén termelését.

HU 204929 Β

Míg a CCRF-CEM sejteket ideális gazdaszervezetnek találtuk CBL-1 vírusaink számára, azt is megállapítottuk, hogy ezek a sejtek olyan hasonló vírusok befogadására is alkalmasak, amelyeket ugyanannak a betegnek a periferikus véréből különítettünk el, akitől a nyirokcsomó-daganat biopsziás mintáját is vettük, továbbá más, AIDS-szel kapcsolatban álló vírusokkal fertőzött betegekből elkülönített hasonló vírusok befogadására is felhasználhatók, így kimutattuk hogy ez a sejtvonal hasznos gazdaszervezet lehet nemcsak CBL-1 anyagunk, hanem más hasonló anyagok in vitro tenyésztésére is.

A találmány tárgya továbbá egy olyan vizsgálati módszer, amellyel biológiai mintákban az emberi T-limfotrop CBL-1 retrovírus antitestjei kimutathatók. Az eljárás értelmében a biológiai mintát érintkezésbe hozzuk

1. egy olyan inszolubilizált antigénnel, amely inért szilárd hordozóhoz kötött globulint és ehhez a globulinhoz kötve CBL-1 retrovírus antigéneket tartalmaz, és

2. egy olyan immunoglobulinnal, amely a CBL-1 retrovírus antigénekre specifikus antitesteket tartalmaz, és amely egy jelzőenzimmel van megjelölve, majd a folyadékfázist elválasztjuk a szilárd fázistól és meghatározzuk vagy a szilárd vagy a folyékony fázishoz kötött jelzőenzim mennyiségét.

A találmány még további tárgyát képezi egy olyan vizsgálati felszerelés, amely tartalmaz

1. egy inszolubilizált antigén első komponenst, amely inért szilárd hordozóhoz kötött globulint és ehhez a globulinhoz kötve humán T-limfotrop CBL-1 retrovírus antigént tartalmaz, és

2. egy olyan immunoglobulin második komponenst, amely a retrovírus antigénekre specifikus antitesteket tartalmaz, és amely egy jelzóenzimmel van megjelölve.

Mint ezt már említettük, a CBL-1 főként olyan vizsgálati rendszerek összetevőjeként alkalmazható, amelyek a transzfúziós vér rutinvizsgálatára szolgálnak annak kimutatására, hogy a vér nem AIDS-vírussal fertőzött személytől származik-e. Kifejlesztettünk egy olyan rendszert, amely egy egyidejű kompetitív mérésen alapul immobilizált CBL-1 antigéneket használva szilárd fázisként és a vizsgálandó szérumot használva folyékony fázisként.

Egyidejű kompetitív vizsgálati módszerünk közelebbről a CBL-1 antigén immobilizálásán alapul, amit az antigént egy ligandummal, például globulinnal vagy más antitesttel egy szilárd fázishoz kötve végzünk, és ennek az immobilizált antigénnek a kötőhelyeiért egy olyan keverék komponensei versengenek, amely a vizsgálandó szérum antitestjeit és az AIDS-vírus ismert, jelzőanyag alapján azonosítható antitestjeit tartalmazza. Azt találtuk, hogy úgy érhetjük el a legkielégítőbb eredményeket, ha jelzőanyagként egy enzimet használunk. Az enzimjelzés használatának előnye a radiojelzéssel szemben az, hogy kiküszöböli a sugárzás biológiai veszélyét; egy váratlan következménye pedig az, hogy lehetővé teszi a vizsgálat inkubálási idejének 1 órára vagy még rövidebb időre való csökkentését.

Mint azt már jeleztük, úgy találtuk, hogy a legjobb eredményeket akkor kapjuk, ha az antigént a szilárd fázishoz egy antitestligandummal kapcsoljuk. Az egyik módszer egy olyan nagy titerű emberi szérum alkalmazása, amelyet AIDS-vírussal aszimptomatikusan fertőzött személytől vettek. Az ideális szérumnak nagy antitesttitere van AIDS-vírussal szemben, de olyan betegtől származik, akinek immunglobulin-szintje a normális határok között van. Egy másik megközelítés szerint a retrovírus ellen képződő monoklonális antitestet alkalmazunk. Ha ezt szokásos módon, egereket használva hozzuk létre, biztosíthatunk bizonyos, részletesen később ismertetendő előnyöket.

A szilárd fázis anyaga célszerűen polisztirol, amelyet használhatunk csövek, gyöngyök, vagy előnyösen lemezek formájában, számos felszíni üreggel vagy más, rovátkolt vagy csipkézett felülettel. A kiválasztott szérumból vagy más antitestből készített gamma-globulinnal azután bevonjuk a polisztirolt és az antigént a globulinnal burkolt polisztirolhoz kötjük, így hozzuk létre a vizsgálathoz használt első komponenst. Ezt a komponenst nedvesen vagy szárazon néhány hónapig tárolhatjuk.

A vizsgálathoz használt második komponens tartalmazza a vizsgálandó szérumból izolált IgG-frakciót, és amennyiben a jelölést enzimmel végezzük, ezt az IgGfrakciót összekapcsolhatjuk például torma-peroxidázzal ismert módszerek alkalmazásával.

A találmány szerinti vizsgálati felszerelést úgy használhatjuk, hogy a jelzéssel ellátott IgG-komponenst összekeverjük a vizsgálandó szérummal, majd ezt a keveréket érintkezésbe hozzuk az inszolubilizált antigénnel, elválasztjuk egymástól a szilárd fázist és a folyékony fázist, és meghatározzuk az IgG antigénhez való kötődésének mértékét. Az egyidejű kompetitív vizsgálatok szerint minél nagyobb mértékben kötődik a folyékony fázis IgG-komponense a szilárd fázishoz, annál kisebb az antigén vagy az antitest mennyisége a vizsgálandó szérumban. A megfelelő ellenőrző értékek kiválasztásával ezért létrehozható egy olyan rutinvizsgálat, amelyben - ha torma-peroxidázt használunk jelzőanyagként - a vizsgálandó szérumot AIDS-antitesttől vagy -antigéntől mentesnek tekintjük, ha a vizsgálandó minta optikai sűrűsége elér egy előre meghatározott legkisebb szintet. Minden olyan vizsgálandó szérumminta, amely az előre meghatározott szintnél kisebb optikai sűrűséget mutat, elutasítható, így el lehet kerülni az olyan vénei végzett transzfuziót, amely AIDS-vírussal vagy -antitesttel fertőzött lehet.

Mint azt a továbbiakban részletesen ismertetjük, az emberi retrovírus antigének közvetített kötődése a szilárd fázishoz globulinon keresztül biztosítja az eredmények bizonyos kiterjesztését, és a vizsgálati mód lehetővé teszi a fertőzöttség meglétének vagy hiányának egyszerű, gyors és pontos meghatározását vérmintákban viszonylag képzetlen és tapasztalatlan technikusok számára is.

Az 1. ábra 81 000-szeres nagyítású elektronmikroszkópos képet mutat a CCRF-CEM gazdasejtekből kinövő és azok határán elhelyezkedő CBL-1 részecskékről.

A 2, ábra szilárd fázisú ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, enzimkötéses immunszorbens vizsgálat) vizsgálat eredményét mutatja. Az ábra azo3

HU 204929 Β kát az optikai sűrűségeket tünteti fel, amelyeket bizonyos számú klinikai szérum vizsgálatával kaptunk, beleértve az anti-HTLV-m-ra reaktívakat és nem reaktívakat is, amit korábbi radioimmunoassay (RIA) eredményeként tudunk. 5

A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük.

1. példa

CBL-1 retrovírus elkülönítése és jellemzése 10

AIDS-szel társult immunoblasztikus lymphoma-val kezelt angol beteg nyirokcsomó-daganat biopsziás mintájából tenyésztett límfocítákból CBL-1 vírust különítünk el. A nyirokcsomóból vett biopsziás mintát kis részekre vágjuk és olyan tápközegbe helyezzük, amely 15 RPMI-1640 alapközeget, 10% boqúmagzat-szérumot és 10 pg/ml fitohemagglutínint tartalmaz. Környezeti hőmérsékleten 24 óra elteltével T-sejt növekedési faktort tartalmazó kondicionált közeget adunk hozzá, amelyet tonzilláris limfociták kevert tenyészetéből 20 nyertünk ki, és a fitohemagglutínint eltávolítjuk. A tenyésztés elkezdése után 48 órával α-interferon antiszérumot adagolunk; 48 óra után CCRF-CEM sejteket (a továbbiakban CEM-sejtek) is adunk a tenyészethez. A CEM-sejt egy állandóan növekvő leukémiás T-sejtvo- 25 nal, amelyet Foley és munkatársai ismertetnek [Cancer, 75,522-9, (1965)].

A közős tenyésztés körülményei között a primer limfociták 4 hetes tenyésztés alatt eltűnnek, míg a CEM-sejtek exponenciálisan szaporodnak. A primer 30 limfociták által termelt CBL-1 vírus megfertőzi a CEM-sejteket és 8 hetes tenyésztés után a CEM-sejtek a CBL-1 vírussal krónikusan fertőzöttek. A CBL-1gyel fertőzött CEM-sejtek fenntartásához nem szükséges T-sejt növekedési faktor vagy anti-a-interferon. 35 Ezeket a CBL-l-gyel fertőzött CEM-sejteket a fent ismertetett módon letétbe helyeztük az NCACC-nál, 85 011101 deponálási számon.

A CBL-1 vírus hasonlóságát a korábban lent HTLVΙΠ/LAV izolátumokhoz kimutattuk a) annak alapján, 40 hogy reverz teanszkripíáz aktivitást mutat, preferenciával a Mg²⁺-katíonok iránt, továbbá az elektronmikroszkóppal láthatóvá tett vírusrészecskék morfológiája is hasonló (vő. 1. ábra), és b) AIDS-es betegek szérumát alkalmazva közvetett immunfluoreszcenciás vizsgálattal, amely a 45 CBL-l-gyel fertőzött CEM-sejtek vírus antigénjeire specifikus, továbbá összehasonlítva már vírusizolátumokkal szilárd fázisú RIA segítségével. A CEM/CBL-1 sejtek 6 hónapig folytatták a vírus és a vírus antigén szintézisét

2. példa

Antiszérum

A vizsgálathoz szükséges reagenst olyan nagy titerű emberi szérumból készítjük, amelyet AIDS-retrovírussal aszimptomatikusan fertőzött betegektől vettünk. A szérum kiválasztása reagenskészítésre fontos tényező. A szérumnak RIA-val meghatározva nagy anti-HTLV-IH titere van, de olyan betegtől származik, akinak immunglobulinszintje a normális tartományban van. A gyakorlatban általában szükséges a reagenseket kisszámú olyan szérumból készíteni, amelyek kielégítik a fenti feltételeket, és a vizsgálatban ellenőrizni a reagensek milyenségét. Annak érdekében, hogy a reagensek ne legyenek fertőzóek, a kiindulási szérumokat 56 ’C-on hőkezeljük 30 percig.

2. Antigén készítmény

Nyers, fagyasztott-felengedett sejtbomlásterméket készítünk a következőképpen. HTLV-IHB -vei fertőzött HTH9 sejteket szuszpenziós tenyészetben a maximális sűrűségig engedünk szaporodni. A tenyészetet 4 ’C-ra hűtjük és 2 óra hosszat 0(25 térfogat% β-propiolaktont adunk hozzá. A sejteket ezután kicentrifugáljuk a tenyésztőfolyadékból és kis sebességen labdacsokká alakítjuk. A sejtlabdacsokat desztillált vízben újraszuszpendáljuk és három fagyasztási-felengedési ciklusnak vetjük alá. A sejtlabdacs maradékát minden egyes ciklusban gondosan újraszuszpendáljuk. A harmadik ciklus után az extraktumot β-propiolaktonnal 0,25 térfogat%-osra állítjuk be, majd 4 ’C-on tartjuk 2 óra hosszat, ezt követően 37 ’C-ra melegítjük fél órára. Ez alatt az idő alatt a pH-t 7,4 körül tartjuk. A nyers HT-H9/HTLV-IIIB sejtbomlásterméket tisztítjuk és -20 ’C-on tároljuk Felhasználás előtt 0,1% szarvasmarha-szénimalbumint (BSA) és felületaktív anyagot tartalmazó triszpuffenel hígítjuk A felületaktív anyag megválasztása és koncentrációja fontos, és legjobbnak a Tween 20 alkalmazását találtuk 0,1 % koncentrációban, amely háromszorosára vagy néha még jobban növeli az antigénkészítmény aktivitását. TriszBSA/Tween 20 eleggyel végzett hígítás után az antigént 30 percig inkubáljuk 37 ’C-on. Ez az a lépés, amelynek során az antigén aktivitásnővekedése megtörténik.

(a) Anti-HTLV-IIIB-globulin készítése Ezt az anyagot in situ tisztításra használjuk szilárd fázisú HTLV-ΠΙΒ antigénen. Ez a stratégia jelentős előnyöket biztosít. A hőkezelt szérumból a globulint kétszer kicsapjuk 40%-os telített ammónium-szulfáttal. Ez a legegyszerűbb reagens globulinbevonat készítésére, bár használható a teljes szérum vagy a tisztított IgG is. A globulint optimális hígításban alkalmazzuk, amelyet a reagens egyedi titrálásával kell meghatározni. A szilárd fázis anyaga üreges polisztirol, amelyet bevonunk globulinnal és a szabad kötődési helyeket egy inért fehérjével - ebben az esetben 0,1%-os borjú-szérumalbuminnal (BSA) - lekötjük. Ezt a bevont és fehérjével inaktivált szilárd fázist nedvesen 4 ’C-on hónapokig tárolhatjuk; a szárítás stabilabb terméket eredményez. A szilárd fázis bevonására a fent leírt HT-H9/HTLV-IHB sejtbomlásterméket trisz(BSA) Tween pufierben annyira hígítjuk, hogy az ezt kővető vizsgálat során a negatív szérumhoz a jelzőenzim 1-2%-a kötődhessen. A bevonást leghatékonyabban úgy hajthatjuk végre, hogy az antigént szobahőmérsékleten 2 napig inkubáljuk a szilárd fázissal, majd nedvesen 4 ‘C-on tároljuk felhasználásig. Az előzetes kísérletek azt mutatták, hogy a szilárd fázis ebben a formában néhány hónapig stabil.

Ki is lehet azonban számítani jelentős hatékonyságvesztés nélkül és így is stabil marad több hónapig.

HU 204929 Β (b) Globulin megjelölése

A fent leírt IgG-t torma-peroxidázzal kapcsoljuk össze heterobifunkcionális származékok alkalmazásával a szokásos módon [J. Histochem. Cytochem. 22, 1084 (1974)], a kapott moláris szubsztitúciós arány 1:3. Ezt az anyagot a fent leírt szilárd fázissal összekapcsolva alkalmazzuk egy olyan enzimes immunvizsgálatban, amely testfolyadék-mintákban AIDS-retrovírusok antitestjeinek kimutatására szolgál.

Összehasonlításra egy további IgG-mintát szilárd fázisú ¹²ⁱI-dal (gyártó: Warriener Pierce Ltd. Nagy-Britannia) jelzünk Salaeinski és mtsai: Endocrinology, 81, 131 (1979) módszere szerint 15 pCi/pg fehérje specifikus aktivitást állítva be.

Egylépéses kompetitív ELISA anti-CEM/CBL-1 szérum reagensek

Nagy anti-HTVL-IH titeru emberi szérumot használunk a bevonó globulinnak a fent leírt módon való előállításához. Kerek aljú polisztirolüregeket bevonunk az optimális hígítású globulinnal, majd a szabad kötődési helyeket lekötéssel inaktiváljuk egy inért fehérjével, ebben az esetben 0,1% BSA-nal. Ugyanezt a szérumot használjuk immunglobulin-forrásként, amelyet ioncserés kromatográfiával tisztítunk DE 52-n, oly módon, hogy a teljes szérumot 20 mmólos foszfátpufferrel (pH 8,6) dializáljuk, 10 térfogatrész DE 52-t előzőleg kiegyensúlyozunk a pufferral és a szérumot az előzőleg kiegyensúlyozott DE 52-vel töltött oszlop tetejére töltjük. 30 perc elteltével a szérumot friss puffemek az oszlopra vitelével eluáljuk. Az oszlopról először eluálódó proteincsúcs tartalmazza az IgG-frakciót. Az IgG-t torma-peroxidázzal kapcsoljuk össze; megfelelő az a szubsztitúciós arány, amelynél 3 molekula torma-peroxidáz jut 1 molekula IgG-re.

Az összekapcsolt tennék milyenségét inkubálással határozzuk meg olyan üregekben, amelyeket korábban egy közvetett antitesten kersztül HTLV-III-mal fertőzött sejtekből és fertőzésmentes sejtekből származó vírus antigénnel vontunk be. A összekapcsolt terméket az optimális hígításban alkalmazzuk, amelynél a legnagyobb színreakciót adó kötődés a fertőzött sejt antigénjeinél és a leghalványabb szín a fertőzésmentes sejtekkel jön létre.

CEMICBL-1 antigén

CEM/CBL-1 vírussal perzisztensen fertőzött sejteket (deponált sejtek, lásd 12. o.) nem rögzített kevertetett tenyészetben maximális sűrűségig tenyésztünk. A tenyésztést mágneses keverővei ellátott lombikban végezzük úgy, hogy a CEM/CBL-1 vírussal fertőzött sejteket 3-szoros térfogatú fertőzés nélküli CEM-sejtekkel 200 ml-re egészítjük ki. Miután a settenyészet a közeget (RPMI táptalaj kiegészítve 10% borjúmagzat-szérummal) sárgára kezdte színezni (rendszerint 2-4 nap), azonos térfogatú friss közeget adunk hozzá. Ezt addig ismételjük, míg a tenyészet teljes térfogata 1-1,5 liter. Miután a tenyészet beért (a közeg sárgává vált), a sejteket megvizsgáljuk maximális sűrűségre. A tenyésztést 37 ’C-on, keverés közben, 5% szén-dioxidot tartalmazó levegő alatt végezzük. A lombikokat hetente egy-két alkalommal kinyitjuk és a maximális sűrűségű antigént begyűjtjük. A keverés sebessége 20-30/perc.

A kevertetett tenyészetet 4 ’C-ra hűtjük, majd β-propiolaktonnal 0,25 térfogat%-osra állítjuk be. 4 ’C-on végzett 2 órányi inkubálás után az üledéket elkülönítjük és fagyasztás-felengedés ciklusoknak vetjük alá, majd a korábbihoz hasonló módon centrifugálással derítjük. Ezután a szövettenyészet-extraktumot további 2 órát inkubáljuk 4 ’C-on 0,25% β-propiolaktonnal, majd a korábban leírthoz hasonló módon hidrolizáljuk. A sejt szétroncsolásához és a fagyasztás-felengedés ciklushoz ezúttal foszfáttal pufferolt konyhasóoldatot használunk, amely 0,1% Tween 20-at is tartalmaz. Ezt követően az antigénkészítményeket nagy titerű antiHTVL-III-globulinnal bevont szilárd fázison titráljuk; az ezt követő vizsgálathoz olyan hatásos hígítást alkalmazunk, amely az alább ismertetendő körülmények között 450 nm-en 1,0-1,2 optikai sűrűséget mutat.

A vizsgálat optimalizálása és formája

Nagy titerű globulinnal bevont, majd fehérjével inaktivált üregeket optimális hígítású CEM/CBL-1 antigén 100 μΐ-ével inkubálunk. Egy éjszakai szobahőmérsékleten végzett inkubálás után az antigénextraktumot lemossuk az üregekről, amelyeket azután szárítunk az immobilizált CEM/CBL-1 vírus antigénstabilítását elősegítő körülmények között (lefagyasztva szárítjuk). Vizsgálati célra 25-25 μΐ antitestpozitív és antitestnegatív szérumot helyezünk külön-külön üregekben, és hozzáadunk 75 μΐ ELISA összekapcsolt reagenst felületaktív anyagot is tartalmazó desztillált vízben. A vizsgálandó szérum és az összekapcsolt reagens keverékét az üregekben inkubáljuk (immuninkubálás) különböző ideig és eltérő feltételek között. Ezután az üregeket Tween-es konyhasóoldattal (0,8 %-os nátrium-klorid-oldat, amely 0,1% Tween 20-at tartalmaz) mossuk. Három mosás után az üregeket megtöltjük Tween-es konyhasóoldattal és engedjük átitatódni 2 percig szobahőmérsékleten, majd a mosást megismételjük három mosási ciklust végezve. Ezután 100 μΐ kromogén szubsztrátumot- ebben az esetben 3,3’,5,5’tetrametil-benzidint (TMB) - adunk hozzá. Szobahőmérsékleten végzett 20 perces inkubálás után meghatározzuk a kromogénfelszabadulást 50 μΐ 4 n kénsav hozzáadásával. A szín intenzitását spektrofotometriásán mérjük 450 nm-en. Hatásos hígításnak nevezzük bármely CEM/CBL-1 antigén olyan hígítását, amely ELISA-ban optimális körülmények között - azaz 1 óráig 45 ’C-on végzett immuninkubáció alkalmazásával - megbízhatóan 1 és 1,2 közötti optikai sűrűséget mutat negatív szérummal.

Eredmények

Összehasonlítva a hagyományos RIA-módszemel szilárd fázis és ¹²⁵I-jelzés alkalmazásával (leírása a 2. példában) kapott eredményeket az ELISA-módszer ebben a példában kapott eredményeivel két nem várt előnyt tapasztalhatunk, amelyek az ELISA mellett szólnak. Először is a szuboptimális antigénkészítmények, amelyek RIA-módszerrel közepes eredményt adtak, ugyanannál a titemél jó eredményeket mutattak

HU 204929 Β

ELISA-módszerrel. Másodszor, amint azt az I. táblázat szemlélteti, RIA-módszerrel az inkubációs időt nem lehetett 3 óra alá csökkenteni. A transzfúziós állomáson gyors, azaz összesen 1-2 órát igénybe vevő vizsgálatra van szükség és ez csak ELISA-módszerrel lehetséges.

I. táblázat

Idő/hőmérséklet kísérletek RIA-módszerrel, ⁵²⁵I-jelzésű IgG-vel

Idő (óra)	Hőmérséklet	Konfrollszérum Negatív „Cut-off”** Pozitív
18	szoba-	1,13*	0,28	0,08
3	hőmérséklet	0,37	0,19	0,1'
2		0,30	0,18	0,09
1		0,34	0,15	0,1
3		0,43	0,15	0,11
2	37 ’C	0,43	0,19	0,09
1		0,28	0,18	0,12
3		0,45	0,14	0,06
2	45’C	0,40	0,14	0,07
1		0,27	0,13	0,05

* a bemenő szint százalékos kötődése ** gyengén pozitív kontroll

A 2. ábrán 56 olyan klinikai szérum ELISA-módszerrel végzett vizsgálatának eredményei láthatók, amelyek kereskedelmi és nem kereskedelmi VIH faktor 30 koncentrátumokkal kezelt hemofiliásoktól, valamint homoszexuálisoktól származnak. Mint az az ábrán látható, az anti-CEM/CBL-l-re reaktív és nem reaktív szérumok tisztán elkülönülnek egymástól. Ebben a példában a 16, CEM/CBL-1 antitestre reaktív szérum átla- 35 gos optikai sűrűsége 0,085 (0,037-től 0,327-ig) és a 40, erre az antitestre nem reaktív szérum átlagos optikai sűrűsége 1,16 (0,736-tól 1,352- ig). Az „a” szérum egy végső stádiumban levő AIDS-es beteg széruma, és interferonvizsgálatban és közvetlen kötődési vizsgálat- 40 bán gyengén reaktív volt. A „b” és „c” szérumok újravizsgáláskor nem reaktívak voltak.

Pontosan ugyanezt a formát használták a vértranszfúziós szérumok egy Nagy-Britanniában végzett felmérésénél. Eddig több, mint 12 000 szérumdonort vizs- 45 gáltak meg. A szűrésben három száram mutatott vizsgálati reakciókat, de újravizsgáláskor csak egyetlen véradót találtak reaktívnak. A szérum ismételhetően reaktív, és títrálható volt és immunfluoreszcenciás vizsgálatban erősen reaktív volt fertőzött sejtekkel 50 szemben, de fertőzésmentes sejtekkel szemben nem. A szérum véletlenszerű reaktivitása, amely független a CEM/CBL-1 fertőzéstől, emiatt különösen alacsony volt. Az ezt követő, anti-HTVL-HÍ-ra reaktív szérum titrálására vonatkozó kísérletek azt mutatták, hogy a 55 literek nagyjából ugyanazok a CEM/CBL-1 ELISA, illetve a közvetlen vizsgálatok esetén. Ezt megerősítette az ezután végzett vizsgálat olyan betegektől vett szérumon, akik primer HTLV-ΠΙ fertőzést követő akut szerokonverzión estek át. Megint nem volt jelentős 60 különbség a kezdeti reaktivitás szintjéban vagy idejében a közvetlen kötődési vizsgálat és a kompetitív ELISA esetében. Ugyanezt a vizsgálatot alkalmazva betegek kissé reaktív és teljesen reaktív antilimfocita antitesteket tartalmazó szérumai és autoimmun-betegségben szenvedő betegek szérumai nem reaktívnak bizonyultak kompetitív ELISA-ban. Összevetve ezek az adatok azt mutatják, hogy kompetitív ELISA nagy specifítású és érzékenységűmódszer AIDS-szel kapcsolat10 bán álló retrovírusok antitestjeinek meghatározására.

3. példa

A vizsgálati felszerelés előállítása és használata

1. Reagensek üreget tartalmazó polisztirollemezt legalább az üregek belső felületén bevonunk tisztított, hőkezelt emberi CBL-1 antitesttel. A tisztított, hőkezelt CBL-1 antitestet a lemezbevonat Kaprilos frakcionálásával [Arch. Biochem. Biophys. 134,279 (1969)] és akonju20 gáláshoz protein A-val [hnniunochemistry 15, 429 (1978)] állítjuk elő. A bevonást úgy végezzük, hogy a protein 20 mmólos triszpufferral (pH 7,6) készült vizes oldatát, amely 0,1% nátrium-azidot tartalmaz, abszorbeáltatjuk a műanyaggal. Globulint tartalmazó antites25 tét állítunk elő 1 térfogatrész szérumhoz 2 térfogatrész, foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldat hozzáadásával, majd az oldatot keverjük és fokozatosan hozzáadunk 2 térfogatrész telített, vizes ammónium-szulfátoldatot. A kivált csapadék a globulinftakció. A lekötést úgy végezzük, hogy az üregek leszívatása után azokat megtöltjük 0,2% borjú-szérumalbumint tartalmazó triszpufferral. Szobahőmérsékleten legalább 30 perces állás után az üreges lemezt közvetlenül felhasználjuk vagy tároljuk. Apolisztirollemezeken inszolubilizálásra használt antigén CBL-1, amelyet először a viricid hatású β-propiolaktonnal kezelünk, és az inaktivált CBL-1 CBL-1 trisz/BSA/Tween pufferrel készített szuszpenzióját a kezelt polisztirollal körülbelül 2 napig inkubáljuk szobahőmérsékleten. Ily módon a CBL-1 inszolubilizálódik az antitesten keresztül közvetett kötéssel a polisztirolhordozóhoz kapcsolódva. Ez a vizsgálati felszerelés első komponense.

A vizsgálati felszerelés második komponensét úgy készítjük, hogy jelzőenzimmel látjuk el ugyanazt az emberi antitestet, amelyet a fent leírt módon a polisztirol bevonására használtunk. Az antitestet úgy jelöljük meg, hogy szokásos összekapcsolási módszerek [pl. J. Histochem. Cytochem. 22, 1084 (1974)] alkalmazásával torma-peroxidázzal kapcsoljuk össze. Ezt a tormaperoxidázzal megjelölt antitestet fagyasztva szárított formában tároljuk és felhasználás előtt közvetlenül rekonsíituáljuk vízzel hígított szuszpenzióként.

A fent említett két komponensen kívül kívánatos a vizsgálati felszerelésben segédreagenseket is alkalmazni, hogy valamennyi szükséges jelzőanyag és kontrolireagens hozzáférhető legyen. Ehhez a felszereléshez íorma-peroxidázt használva jelzőként - célszerű 3,3’,5,5’-tetrametil-benzidint (TMB) alkalmazni enzimszubsztrátumként; a ΊΜΒ-t tabletta formájában alkalmazzuk és minden egyes tabletta 96 üreghez ele6

HU 204 929 B gendó szubsztrátumot tartalmaz. Közvetlenül felhasználás előtt a TMB-tablettákat feloldjuk 0,15 mólos trinátrium-citrátot és 0,015% hidrogén- peroxidot tartalmazó vizes oldatban. Kívánatos pozitív és negatív kontrollszérum biztosítása is. A negatív kontrollszéruni olyan normális emberi szérum, amely ebben a vizsgálatban nem reaktív a CBL-1 antitestre. A pozitív kontrollszérum olyan hókezelt emberi szérum, amely a vizsgálati eljárásban reaktív a CBL-1 antitestre. Emellett kívánatos biztosítani gyengén pozitív (cut-off) kontrollszérumként olyan hőkezelt emberi szérumot, amely - a vizsgálat „cut-off’ szintjén - reaktív a CBL1 antitestre, továbbá mosófolyadékot is, amely literenként 170 g nátrium-klorid, 10 ml Tween 20 és 20 ml Bronidox-1 koncentrátumának 10-szeres mennyiségű vérrel való hígításával készül.

2. A vizsgálati felszerelés alkalmazása

A torma-peroxidázzal megjelölt antitestet közvetlenül a felhasználás előtt rekonstruáljuk. A vizsgálatot üregenként 25 μΐ mintát alkalmazva hajtjuk végre. Két üregbe negatív, egybe pozitív, háromba gyengén pozitív kontrollszérumot töltünk, és a vizsgálandó mintákat a fennmaradó üregekbe tesszük. Mindegyik üregbe 75 μΐ rekonstituált, torma-peroxidázzal megjelölt antitestet teszünk és az üregeket tartalmazó lemezt lefedjük a melegítő blokkban 45 °C-on 1 óra hosszat, vagy 20-25 °C-on egy éjszakán át, legalább 16 óra hosszat Ínkubáljuk. Az inkubálási időszak végén a lemezt mossuk és mindegyik üregbe 100 μΐ szubsztrátoldatot töltünk. A lemezt ezután 20 percig ínkubáljuk 18-25 °C hőmérsékleten, amely idő elteltével a negatív mintákat tartalmazó üregekben kék szín látható. Ezután mindegyik üregbe 50 μΐ 2 M kénsavat teszünk, ekkor a kék szín sárgára változik. Ezután mindegyik üreg abszorbanciáját megmérjük 450 nm-en, a kénsav hozzáadását követő 30 percen belül, mikroüreg-lemezleolvasót használva (flow multiscan MCC).

3. Eredmények

Az eredményeket a következőképpen értékeljük: kiszámítjuk a három „cut-off’ kontrollszérum átlagos abszorbanciáját. Minden olyan mintát, amelynek abszorbanciája azonos az átlagos „cut-off’ kontrollértékekkel vagy annál nagyobb, a vizsgálati rendszer határain belül, AIDS-retrovírus antitestekre negatívnak tekintünk. Minden olyan mintát, amelynek abszorbanciája az átlagos „cut-off’ kontrollérték alatt van, vagy annál legfeljebb 10%-kal nagyobb, újravizsgálunk.

Bármely szérumot, amely ebben a vizsgálatban ismételten pozitívnak bizonyult, ellenőrzésként immunfluoreszcenciával Westem-féle szűrőpapiros módszerrel is megvizsgáltunk.

A leírt eljárással 1600 vérbanki vérminta rutinvizsgálatát végeztük el negatív eredménnyel. Más olyan klinikai mintákat vizsgálva azonban, amelyek olyan betegektől származtak, akiknek diagnózisa AIDS, AIDS-szel kapcsolatban álló komplex vagy egyéb megbetegedések, pozitív eredményeket kaptunk, amit az immunfluoreszcenciás vizsgálat és a másfajta enzimes immunvizsgálat szinte minden esetben megerősített. A következő eredményeket kaptuk.

Π.táblázat

Véradók, AIDS-ben, AIDS-szel összefüggő betegségekben és más megbetegedésekben szenvedő betegek szérumának reaktivitása

Klinikai csoport A minták Vizsgálati Igazolt száma felszereléssel antitest vizsgálva anti- pozitív⁸ test pozitív

Véradók	1600	0	—
AIDS	4	4	4
AIDS-szel kapcsolatos 39 komplex megbetegedések	39	39
Rizikócsoportok	7	7	7
Más megbetegedések11 Mononucleosis infectiosa	48	0
Hepatitis B 25 Szifilisz 117 2 2	3C	2
Reumatoid arthritis	9	0	-
Más fertőzések4	37	0	-

a=az ellenőrző vizsgálatok során immunfluoreszcenciás és egy más enzimmel végzett immunvizsgálatot hajtottunk végre hacsak a pozitív mintákat ellenőriztük c=4 vizsgálatból kettőben pozitívnak mutatkozott minta; az ellenőrzés során negatív d=rubeola (18 eset), parvovírus (9 eset), cytomegalovírus (5 eset), toxoplasmosis (5 eset)

Az emberi antiszérum alkalmazásának elve vírus antigénnek szilárd fázishoz kötésére egy olyan szilárd fázist eredményez, amely az emberi szervezet által legjobban felismert vírus antigén rendszert képviseli. Ez előnyös lehet azért, mert jó illeszkedés lesz a megkötött antigének keveréke és az emberi antitestek profilja között. Ezenfelül az antigén előállítására alkalmazott enyhe körülmények lehetővé tehetik az olyan finom szerkezeti sajátságok megőrzését, amelyek az egyéb szilárd fázisú vizsgálatoknál alkalmazott gradienstisztított és roncsolt készítményeknél nincsenek meg. Lehetséges a szilárd fázisú antigének keverékét úgy alakítani, hogy a szilárd fázist meghatározott specifitású egér monoklonális antitesttel vonjuk be, így az immobilizált antigének előre meghatározott specifitásúak lesznek.

Az alább feltüntetett adatok szemléltetik, hogy mennyivel hatékonyabb a vizsgálat, ha a szilárd fázison olyan szelektált monoklonális antitestet alkalmazunk, amely p25-tel (egy, 25 kDalton-os, a retrovírus magjában lévő gag fehérje) reagál. Az előnyök abban nyilvánulnak meg, hogy a megfelelő vizsgálathoz (III. táblázat) kevesebb antigénre van szükség, és a vizsgálat érzékenysége nagyobb, amint az a IV. táblázatból

HU 204929 Β

IV. táblázat

Poliklonálís és monoklonális szilárd fázison vizsgált,

50%-os inhibiciós végpontig titrált 19 szérum hígításainak 450 nm-en mért optikai sűrűsége látszik, amely azt mutatja, hogy az egyes szérumok végponti hígítása (azaz a legkisebb leolvasható optikai sűrűség) a monoklonális vizsgálatban nagyobb inhibiciót mutatott, mint a polifclonálisban. Az érzékenység növekedése a vizsgálatot hatékonyabbá teszí a korai antítesttermelés kimutatása szempontjából számos egyéb vizsgálati módszernél. Ezenfelül egérantitest alkalmazása a szilárd fázison lehetővé teszi annak a lehetséges nehézségnek az elkerülését, hogy reumatoid jellegű faktorok keresztkötést létesítsenek a szilárd fázisú emberi IgG és az emberi IgG-t tartalmazó összekapcsolt tennék között a homológ vizsgálatban. Gyakorlatilag néhány olyan szérumot azonosítottunk, amelyek következetesen nagyobb fokú inhibiciót mutatnak a monoklonális alapú vizsgálatban a poliklonálís alapú vizsgálathoz képest. Ez a jelenség nyilvánvalóan annak az alacsony szintű és kis titerű reaktivitásnak a következménye, amely csak a homológ vizsgálatban köti az összekapcsolt terméket nem specifikus módon a szilárd fázishoz. Ez vagy egy ehhez hasonló jelenség megmagyarázhat más váratlan tapasztalatokat is, például azt, hogy normál szérumok optikai sűrűséggel mérhető reaktivitásának eloszlása sokkal szűkebb a monoklonális alapú vizsgálatban, mint az egyidejűleg végrehajtott poliklonálisban.

Mivel a monoklonális antitestek alkalmazása retrovirális „gag” géntermékhez egyszerűnek bizonyuk, és így lényegében egy kompetitív vizsgálatot lehet biztosítani az emberi anti-HTLV-ΙΠ alapválaszra, valószínű, hogy meghatározott „env” anyagok antitestjeinek alkalmazása lehetővé teszi analóg vizsgálatok kifejlesztését a kiválasztott burok antigének antigénjeire. Ez lehetővé teszi a különböző vírus antigénekre adott emberi válaszok sokkal pontosabb vizsgálatát, aminek klinikai, prognosztikai és fertőzésellenőrzési szempontból lehet jelentősége.

Szérum		A szilárd fázis bevonata
poliklonálís	monoklonális
Pozitív kontroll	0,08	0,09
„Cut-off’ kontroll	0,76	0,55
Negatív kontroll	1,39	1,42
Hemofiliás	1	1,08	0,86
	2	0,95	0,77
	3	1,01	0,77
	4	1,04	0,74
AIDS	1	0,63	0,48
	2	0,93	0,71
	3	0,85	0,52
	4	0,70	0,56
Perzisztáló	1	0,84	0,62
általános	2	0,84	0,58
lymphadeno-	3	0,73	0,56
pathia	4	0,60	0,48
Kábítószer-	1	0,50	0,44
élvező	2	0,66	0,50
	5	0,95	0,73
	4	0,85	0,63
Egészséges	1	050	0,41
	2	056	0,42
	3	0,69	0,49

IH. táblázat

CEM/CBL-1 antigén titrálása poliklonálís és 40 monoklonális szilárd fázison

Antigén- A szilárd fázis bevonata hígítás Poliklonálís Monoklonális

Negatív „Cut-off’*Pozitív Negatív „Cut-off’Pozitív 45

10	1,34**	0,69	0,05	NV	NV	NV
20***	1,14	0,45	0,03	1,85	0,86	0,11
30	0,82	0,42	0,03	NV	NV	NV
40	NV	NV	NV	1,50	0,37	0,09
60	NV	NV	NV	1,36	0,38	0,08
80	NV	NV	NV	1,23	0,28	0,07
100	NV	NV	NV***	1,18	0,27	0,07

„Cut-off’ - gyengén pozitív kontroll optikai sűrűség 450 nm-en az anti-CEM/CBL1-re szokásos vizsgálati körülmények között az antigénkészítmény „hatásos” titere NV«nem vizsgált

A fenti példákban a vizsgálatot a szilárd fázishoz kötődött jelzőanyag meghatározásával végeztük. Mint35 hogy azonban a kiindulási szérumhoz kötődött jelzőanyagszintet is meghatározzuk vagy meghatározhatjuk, arra is lehetőség van, hogy nyomon kövessük a folyékony fázishoz kötődött jelzőanyag pl. radioaktív anyag mennyiségének vagy az enzimszintnek a csökkenését azután, hogy az ismert, jelzéssel ellátott, szérumot és a vizsgálandó szérumot érintkezésbe hoztuk a szilárd fázisú antigénnel; a vizsgálandó szérum antitesttartalmának mértékéül a jelzőanyagszínt csökkenését vesszük folyékony fázisban.

Az egyidejűkompetitív vizsgálat előnyeit az alábbiakban foglalhatjuk össze:

Antigénkészítmény

Az immobilizált antitest alkalmazásából kővetkező megnövekedett kötődési hajlam lehetővé teszi nyers sejtlizátum-készítmény alkalmazását bevonásra, ha az ilyen antigén magában nem kötődik használható módon közvetlenül a szilárd fázishoz. Ez a lépés kiküszöböli az igen tiszta antigén alkalmazásának szükséges55 ségét a diagnosztikus vizsgálati felszerelések előállítására és könnyebbé teszi készítésüket. Ez egy olyan előny, amely nem aknázható ki közvetlen vizsgálatokban, ahol egy teljes emberi globulinból álló bevonat elkerülhetetlenül jelet adna a végső anti emberi globu60 linjelzéssel.

HU 204 929 B

A vizsgálat formája

Az, hogy hígítatlan szérum bizonyos mennyiségét alkalmazzuk, jelentős előnyt biztosít a vértranszfúziós állomásoknak, ahol egy kezdeti hígítás készítésének szükségessége szaporítaná a munkát. A szérumnak és a jelzóenzimnek a térfogataránya 1:1-1:10 között változhat úgy, hogy ez a vizsgálat eredményében csak csekély változást okoz. Az optimális érték 1:3,25 pl szérum és 75 μΐ jelzőenzim alkalmazásával és ez biztosítja a pozitív és negatív szérumok jó elkülöníthetoségét. A vizsgálat ideje az ELISA-módszer alkalmazásával 1 órára vagy még kevesebbre csökkenthető.

Érzékenység

Bármely, AIDS-antitestek kimutatására szolgáló vizsgálat érzékenységének mértékét az a szérumarány jelzi, amely AIDS végső fázisában levő betegektől vett szérum esetében még pozitív. A közvetlen vizsgálatokban úgy látszik, hogy változó számú beteg elveszti az antitest reaktivitását. Ez nem történik meg a kompetitív vizsgálatnál, ami azt mutatja, hogy a kompetitív vizsgálat érzékenysége van olyan jó, vagy még jobb, mint más jelenleg használt módszereké.

Specifitás

Kompetitív vizsgálat esetén nem várható, hogy a téves pozitív reaktivitás komoly nehézséget okoz. A limfocita membránantigének beépülése a HTLV-virionok burkába biztosan téves reaktivitáshoz vezet éppúgy, mint az IgG-aggiegátumok jelenléte, amelyek nem specifikusan tapadnak a szilárd fázishoz. Ilyen jelenségek nem okoznak reaktivitást a kompetitív vizsgálatban. A fehéqekoncentráciő nem specifikus hatásai a lehető legkisebbre csökkenthetők a szérum/jelzőanyag arány megfelelő megválasztásával (1:3, vö. a fentiekkel) és olyan „cut-off” érték alkalmazásával, amely 50% inhibiciónál nagyobb. Azok a szérumok, amelyek a belső kontrollszérummal meghatározott értékkel azonos vagy annál nagyobb jelzőanyag kötődési inhibiciót váltanak ki, a szűrővizsgálatban pozitívnak tekintendők, de a vizsgálatot meg kell ismételni. Figyelembe véve a téves reaktivitás alacsony szintjét, amely várhatóan kevesebb, mint 1 az 5000-hez, valószínűtlen, hogy a téves pozitív reakciók a kompetitív ELISAmódszer esetén olyan számszerűleg jelentős gondot okozzanak, mint amilyet úgy látszik a közvetlen vizsgálatokban okoznak. Ez különösképpen így van akkor, ha a közvetlen vizsgálatot kontroliantigén nélkül hajtják végre. Feltételezhető, hogy a transzfúziós központokban ez a helyzet, mivel a kontrollantigén alkalmazása megkétszerezné a közvetlen vizsgálat reagensszükségletét.

A fentiek alapján a találmány szerinti vizsgálati módszer egy egyszerű vizsgálati forma nagy érzékenységgel és nagy specifitással, ami ezt a kompetitív vizsgálatot ideálissá teszi a véradók által adott vér szűrővizsgálatára és diagnosztikai alkalmazásra.

Claims (9)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás az emberi T-limfotrop CBL-1 retrovírus antitestek kimutatására biológiai mintákban, azzal jellemezve, hogy a biológiai mintát érintkezésbe hozzuk (1) egy olyan inszolubilizált antigénnel, amely inért szilárd hordozóhoz kötött globulint és ehhez a globulinhoz kötve CBL-1 retrovírus antigéneket tartalmaz, és (2) egy olyan immunoglobulinnal, amely a CBL-1 retrovírus antigénekre specifikus antitesteket tartalmaz, és amely egy jelzőenzimmel van megjelölve, majd a folyadékfázist elválasztjuk a szilárd fázistól és meghatározzuk a szilárd vagy folyékony fázishoz kötött jelzőenzim mennyiségét.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy biológiai mintaként emberi vérből származó plazmát vagy szérumot alkalmazunk.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (2) lépésben jelzőenzimmel jelzett immunoglobulinként AEDS-retrovírussal tünetmentesen fertőzött, de normális immunoglobulin szintű embertől számlázó immunoglobulint alkalmazunk.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (1) lépésben szilárd hordozóhoz kötött globulinként monoklonális antitestet alkalmazunk, amely megköti a retrovírus antigént.
5. 5. Vizsgálati készlet a szerzett immunhiányos tünetcsoporttal kapcsolatos retrovírus antitestek kimutatására, azzal jellemezve, hogy (1) inért szilárd hordozóhoz kötött globulint és ehhez a globulinhoz kötve emberi T-limfotrop CBL-1 retrovírus antigéneket tartalmazó inszolubilizált antigén első komponensből és (2) CBL-1 retrovírus antigénekre specifikus antitesteket tartalmazó, és jelzőenzimmel megjelölt immunoglobulin második komponensből áll.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy az immunoglobulin AEDS-retrovírussal tünetmentesen fertőzött, de normális immunoglobulin szintű embertől származik.
7. 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy a szilárd hordozóhoz kötött globulin monoklonális antitest, amely megköti a retrovírus antigént.
8. 8. Eljárás az emberi T-limfotrop CBL-1 retrovírus előállítására, azzal jellemezve, hogy nyirokcsomó-daganatból származó limfocitákat emésztünk és a felszabaduló CBL-1 retrovírust CCRF-CEM sejtekbe zárjuk.
9. 9. Eljárás immobilizált emberi T-limfotrop CBL-1 retrovírus előállítására, azzal jellemezve, hogy a CBL-1-et olyan monoklonális antitesthez kötjük, amely inért szilárd hordozóhoz van rögzítve.