CN113092775A - 一种乙肝病毒表面抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药和免疫学检测技术领域，公开了一种乙肝病毒表面抗体检测试剂盒及其制备方法。所述检测试剂盒包括：包被有乙肝表面抗原的包被板、底物液、酶标乙肝表面抗原溶液、阴性对照、阳性对照、浓缩洗涤液和终止液；所述包被板中采用包被缓冲液对乙肝表面抗原进行稀释，所述乙肝表面抗原与包被缓冲液的体积比为1：(1500‑2500)；所述酶标乙肝表面抗原溶液中采用酶标稀释液对酶标乙肝表面抗原进行稀释，所述酶标乙肝表面抗原与酶标稀释液的体积比为1：(1500‑2500)。所述检测试剂盒具有灵敏性高，特异性好和重复性强的突出优势，可满足定性检测人血清或血浆中乙肝病毒表面抗体的实际需求。

Description

一种乙肝病毒表面抗体检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药和免疫学检测技术领域，尤其涉及一种乙肝病毒表面抗体检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
乙肝病毒(乙型肝炎病毒，HBV)是致人乙型肝炎的病原体，是目前世界上传染最广泛的致命病毒之一，乙型肝炎病毒的感染已全世界最重要的公共卫生问题之一。由于目前还没有治疗乙型肝炎的有效手段，因此疫苗接种、早期检测诊断是预防乙型肝炎的重点。
乙型肝炎的病原学诊断，最常用的是乙肝病毒血清标志物(HBVM)的检测。HBVM主要包括七种血清标志物：乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝核心抗体、乙肝e抗原、乙肝e抗体、HBV-DNA及DNA多聚酶。通过检测HBVM可以间接的多角度了解患者HBV感染、复制以及病情恢复情况。在现有的检测HBVM的众多方法中，ELISA(酶联免疫法)因其原理简单、使用方便和价格便宜的特性，已成为国内外应用的较为广泛的一种方法。
乙肝表面抗体(HBsAb)是一种保护性抗体，也是一种中和性抗体，是乙肝病毒表面抗原刺激人体免疫系统后产生的抗体，它能中和掉乙肝病毒的感染力，保护人体免受乙肝病毒再度袭击。乙肝表面抗体阳性表明既往感染过乙肝病毒，但已经排除病毒，或者接种过乙肝疫苗。
然而，由于现有市面上的乙肝表面抗体相关检测产品的检测效果仍有所不足，易出现假阳性或假阴性的现象。因此，希望提出一种灵敏度更高，特异性更好且重复性好的乙肝病毒表面抗体检测产品。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种乙肝病毒表面抗体检测试剂盒及其制备方法，所述检测试剂盒具有灵敏性高，特异性好和重复性强的突出优势，可满足定性检测人血清或血浆中乙肝病毒表面抗体的实际需求。
本发明提供了一种乙肝病毒表面抗体检测试剂盒，包括：包被有乙肝表面抗原的包被板、底物液、酶标乙肝表面抗原溶液、阴性对照、阳性对照、浓缩洗涤液和终止液；
所述包被板中采用包被缓冲液对乙肝表面抗原进行稀释，所述乙肝表面抗原与包被缓冲液的体积比为1：(1500-2500)；
所述酶标乙肝表面抗原溶液中采用酶标稀释液对酶标乙肝表面抗原进行稀释，所述酶标乙肝表面抗原与酶标稀释液的体积比为1：(1500-2500)。
本发明所述检测试剂盒采用双抗原夹心法(ELISA)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，可对人血清或血浆中的乙肝表面抗体进行定性检测，本发明通过方阵滴定法对包被抗原浓度和酶标记抗原的工作浓度进行筛选，最终选定上述最佳的浓度范围。并经检测表明，本发明所述检测试剂盒能够具备优良的灵敏性，特异性和重复性，能够很好的满足实际检测的需求。
优选的，所述酶标乙肝表面抗原为采用碘酸钠-乙二醇法对乙肝表面抗原进行辣根过氧化物酶的标记。
优选的，所述包被缓冲液为含0.02％NaN3的45mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝6.4-6.6。
优选的，所述酶标稀释液为含1％BSA(牛血清白蛋白)、2％液体明胶、2％PEG(聚乙二醇)、0.012％果绿和0.1％ProClin300的10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝6.7-6.9。
优选的，所述浓缩洗涤液为含20％NaCl、0.5％KCl和3.0％Tween-20的0.25mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝6.2-6.4。
优选的，所述终止液为1mol/L的H2SO4溶液。
优选的，所述底物液包括底物A液和底物B液。
更优选的，所述底物A液为含0.6g/L过氧化脲的10mmol/L柠檬酸-醋酸钠缓冲液；所述底物B液为含0.042％TMB(四甲基联苯胺)、0.3％丙酮、4％无水乙醇、0.3g/L EDTA-Na2、3％甘油的10mmol/L柠檬酸溶液。
优选的，所述阴性对照为采用阴性对照稀释液进行稀释后的阴性对照血清，所述阴性对照稀释液为含小牛血清、甘油、叠氮钠和果绿的磷酸盐缓冲溶液，所述阴性对照的吸光值小于0.05；
所述阳性对照为采用阳性对照稀释液进行稀释后的阳性对照血清，所述阳性对照稀释液为含小牛血清、甘油、ProClin300和胭脂红的磷酸盐缓冲溶液，所述阳性对照的吸光值大于1.5。
本发明还提出上述乙肝病毒表面抗体检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)包被：将乙肝表面抗原用包被缓冲液稀释后，按95-105μL/孔的用量添加至微孔板的孔内，于18-26℃吸附20-30h，扣干；
(2)封闭：用含0.6％干酪素钠、5％蔗糖、0.02％NaN3的10mmol/L、pH为7.3-7.5的磷酸盐缓冲液作为封闭液，以140-160μL/孔的用量添加至微孔板的孔内，于18-26℃封闭16-26h；
(3)干燥及封板：弃去封闭液，经干燥处理后密封，制得包被有乙肝表面抗原的包被板；
(4)配置并分装底物液、酶标乙肝表面抗原溶液、阴性对照、阳性对照、浓缩洗涤液和终止液，经组装，得到乙肝病毒表面抗体检测试剂盒。
本发明还提供了上述乙肝病毒表面抗体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1、配置洗涤液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水作1：25稀释；
S2、取出包被板，加入待测样品50μL/孔，同时设阴、阳性对照及空白对照各2孔，阴、阳性对照孔分别加入相应对照血清50μL，空白对照孔加入100μL洗涤液，随即加入酶标乙肝表面抗原溶液50μL/孔，混匀；覆盖封板胶后，置37℃避光温育30min；
S3、洗板：用洗涤液洗板5次，每次静置1min，扣干；
S4、显色和终止：加底物液，于37℃避光显色10min后，加入终止液50μL/孔；
S5、测定：用酶标仪450mm以空白对照孔校零或用450nm/630nm，测各孔吸光值；
S6、结果分析与判定：临界值cut-off＝2.1×阴性对照的平均吸光值，当阴性对照的平均吸光值＜0.05时，按0.05计算；当待测样品的吸光值＜Cut-off，判断为阴性；当待测样品吸光值≥Cut-off，判断为阳性。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明通过长期研发和筛选，最终选定最佳的包被乙肝表面抗原的浓度范围以及酶标乙肝表面抗原的工作浓度范围，所制得的乙肝病毒表面抗体检测试剂盒具有灵敏性高(最低检出量≤10mIU/mL)，特异性好和重复性强的突出优势，可满足定性检测人血清或血浆中乙肝病毒表面抗体的实际需求。本发明所述检测试剂盒还具有操作简便，实用性强的特点，可与乙肝‘两对半’试剂同步检测，适合各基层医疗单位使用。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
包被乙肝表面抗原的浓度选择
使用包被缓冲液(含0.02％NaN3的45mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝6.5)将基因重组乙肝表面抗原(购自厦门市波生生物技术有限公司)分别按1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000的体积比进行稀释，配置成包被液，对包被板进行包被；并选用上海永华细胞和基因高技术有限公司生产的试剂盒为对照试剂盒和北京康彻斯坦生物技术有限公司所生产的质控品(10mIU/ml)，对不同包被乙肝表面抗原浓度下阳性样品和阴性样品的吸光值进行检测，从而选择最佳的包被乙肝表面抗原的浓度范围。其中方案设计如表1所示，检测的结果如表2所示。
表1 方阵滴定法选择包被乙肝表面抗原浓度的方案
Figure BDA0002966717830000041
注：S1-S5为确认阳性样本，S6-S10为确认的阴性样本。
表2 方阵滴定法选择包被乙肝表面抗原浓度的结果
Figure BDA0002966717830000042
Figure BDA0002966717830000051
从表1-2可知，包被乙肝表面抗原稀释比过高或过低都会对检测效果带来不利影响，经综合比较，当包被乙肝表面抗原的稀释比为1:2000时，吸光值稳定且饱和，检测的灵敏度高，特异性好。而本发明在后续的检测中还发现，当包被乙肝表面抗原的稀释比为1：(1500-2500)的浓度范围时，均能实现较为良好的检测效果。
实施例2
酶标记乙肝表面抗原的工作浓度选择
采用碘酸钠-乙二醇法对基因重组乙肝表面抗原(购自厦门市波生生物技术有限公司)进行辣根过氧化物酶(购自SIGMA-ALDRICH)的标记后，得到酶标乙肝表面抗原。使用酶标稀释液(含1％BSA、2％液体明胶、2％PEG、0.012％果绿和0.1％ProClin300的10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝6.7-6.9)将酶标乙肝表面抗原分别按1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000的体积比进行稀释，配置成酶标乙肝表面抗原溶液；并选用上海永华细胞和基因高技术有限公司生产的试剂盒为对照试剂盒和北京康彻斯坦生物技术有限公司所生产的质控品(10mIU/ml)，对不同酶标乙肝表面抗原工作浓度下阳性样品和阴性样品的吸光值进行检测，从而选择最佳的酶标乙肝表面抗原的工作浓度范围。其中方案设计如表3所示，检测的结果如表4所示。
表3 方阵滴定法选择酶标记乙肝表面抗原工作浓度的方案
Figure BDA0002966717830000052
Figure BDA0002966717830000061
注：S1-S5为确认阳性样本，S6-S10为确认的阴性样本。
表4 方阵滴定法选择酶标记乙肝表面抗原工作浓度的结果
Figure BDA0002966717830000062
从表1-2可知，当酶标记乙肝表面抗原的工作浓度＞1：2000时，灵敏度高，但特异性较差；当酶标记乙肝表面抗原的工作浓度＜1：2000时，特异性好，但灵敏度低。综上所述，当酶标记乙肝表面抗原的工作浓度为1:2000时，吸光值稳定且饱和，能同时兼备灵敏度高和特异性好的优势。而本发明在后续的检测中还发现，当包被乙肝表面抗原的稀释比为1：(1500-2500)的浓度范围时，均能实现较为良好的检测效果。
实施例3
本实施例提供一种乙肝病毒表面抗体检测试剂盒，包括：
包被有乙肝表面抗原的包被板：所用基因重组乙型肝炎表面抗原购自厦门市波生生物技术有限公司，对基因重组乙型肝炎表面抗原进行纯化后，用SDS-PAGE或其他方法测定，分子量约为25KD，纯化后的抗原保存于-20℃或以下。
采用包被缓冲液对基因重组乙肝表面抗原进行稀释，其中基因重组乙肝表面抗原与包被缓冲液的体积比为1：2000；包被缓冲液为含0.02％NaN3的45mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝6.5。
底物液：包括底物A液和底物B液。底物A液为含0.6g/L过氧化脲的10mmol/L柠檬酸-醋酸钠缓冲液；底物B液为含0.042％TMB(四甲基联苯胺)、0.3％丙酮、4％无水乙醇、0.3g/L EDTA-Na2、3％甘油的10mmol/L柠檬酸溶液。
酶标乙肝表面抗原溶液：所述酶标乙肝表面抗原溶液中采用酶标稀释液对酶标乙肝表面抗原(采用碘酸钠-乙二醇法对乙肝表面抗原进行辣根过氧化物酶的标记)进行稀释，酶标乙肝表面抗原与酶标稀释液的体积比为1：2000。其中酶标稀释液为含1％BSA(牛血清白蛋白)、2％液体明胶、2％PEG(聚乙二醇)、0.012％果绿和0.1％ProClin300的10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝6.7-6.9。
其中采用碘酸钠-乙二醇法对乙肝表面抗原进行辣根过氧化物酶标记的方法，包括以下步骤：
a.称取4.0mg辣根过氧化物酶(HRP)于棕色玻璃瓶，加0.4mL的0.2mol/LDE1醋酸盐缓冲液进行溶解，并将放入转子放入瓶中；
b.把磁力搅拌器放置在2-8℃环境下工作，然后将a中的溶液瓶放在磁力搅拌器上面，将转速调到最慢，在溶液瓶中的转子连续转动的条件下，加入0.1mol/L的NaIO4溶液0.2mL，混匀，然后用锡纸包住整个瓶身，避光反应30min；
c.选取合适规格的透析袋，剪取适合的长度，放置装有适量纯化水的烧杯中，加热煮沸1-2min(应根据标记总液量选取合适规格的透析袋，目的是要使得透析袋的袋口能完全打开，便以加液)，备用；
d.待c中的反应完成后，将磁力搅拌器及溶液瓶从2-8℃环境取出放置室温，同样保持在溶液瓶中的转子连续转动的条件下，加入2.5％乙二醇水溶液0.4mL，混匀，室温避光反应30min；
e.待d中的反应完成后，按每0.5mL溶液加冰冷过的无水乙醇2mL，混匀后以1120g离心力离心5min(ZY0500离心机调制4500r/min的转速)，用移液器充分吸走上清液，再加0.5mL纯化水复溶沉淀；
f.将透析袋的一端折叠，夹紧密封，按实际需求量取e中的复溶液、抗体或抗原分别加入加进透析袋中(按1mL复溶液中加入4mg的抗原，1mL复溶液中加入1mg的抗原的比例计算)，混匀，慢慢将袋内的气泡往上挤离溶液，并折叠透析袋另一端，夹紧密封，在夹子上标记好抗原抗体名称。取3L的大烧杯装适量的CB溶液(碳酸盐缓冲液)并放进大转子，然后置于磁力搅拌器，于2-8℃搅拌过夜。
g.加5mg/mL的NaHB4溶液0.08mL进行终止(NaHB4溶液用量计算方法：按1mgHRP需加5mg/mL NaHB4 20μL计)，混匀，2-8℃放置2h，1小时后需混匀一次；
h加入等体积的甘油，混匀，再用1mol/L的NaH2PO4调整至pH约为7.0，置-20℃或以下保存。
阴性对照：采用阴性对照稀释液(阴性对照稀释液为含5％小牛血清、15％甘油、0.02％叠氮钠和0.04％果绿的10mmol/L磷酸盐缓冲溶液，pH＝7.3-7.5)进行稀释后的阴性对照血清，其中阴性对照的吸光值小于0.05。
阳性对照：采用阳性对照稀释液(含20％小牛血清、25％甘油、0.1％ProClin300和0.005％胭脂红的10mmol/L磷酸盐缓冲溶液，pH＝7.3-7.5)进行稀释后的阳性对照血清，其中阳性对照的吸光值大于1.5。
浓缩洗涤液：含20％NaCl、0.5％KCl和3.0％Tween-20的0.25mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝6.2-6.4。
终止液：1mol/L的H2SO4溶液。
本实施例中乙肝病毒表面抗体检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)包被：将乙肝表面抗原用包被缓冲液稀释后，按100μL/孔的用量添加至微孔板的孔内，于18-26℃吸附20-30h，扣干；
(2)封闭：用含0.6％干酪素钠、5％蔗糖、0.02％NaN3的10mmol/L、pH为7.3-7.5的磷酸盐缓冲液作为封闭液，以150μL/孔的用量添加至微孔板的孔内，于18-26℃封闭16-26h；
(3)干燥及封板：弃去封闭液，经干燥处理后密封，置2-8℃保存，制得包被有乙肝表面抗原的包被板；
(4)配置并分装底物液、酶标乙肝表面抗原溶液、阴性对照、阳性对照、浓缩洗涤液和终止液，经组装，制得乙肝病毒表面抗体检测试剂盒。
实施例4
本实施例提供一种乙肝病毒表面抗体检测试剂盒，与实施例3相比，组分与制备方法基本相同，区别在于仅在于：酶标乙肝表面抗原溶液中酶标乙肝表面抗原与酶标稀释液的体积比为1：2100。
实施例5
本实施例提供一种乙肝病毒表面抗体检测试剂盒，与实施例3相比，组分与制备方法基本相同，区别在于仅在于：包被板中采用包被缓冲液将乙肝表面抗原进行稀释，乙肝表面抗原与包被缓冲液的体积比为1：1800。
实施例6
本实施例提供实施例3-5中乙肝病毒表面抗体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤
S1、配置洗涤液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水作1：25稀释；
S2、取出包被板，加入待测样品50μL/孔，同时设阴、阳性对照及空白对照各2孔，阴、阳性对照孔分别加入相应对照血清50μL，空白对照孔加入100μL洗涤液，随即加入酶标乙肝表面抗原溶液50μL/孔，混匀；覆盖封板胶后，置37℃避光温育30min；
S3、洗板：用洗涤液洗板5次，每次静置1min，扣干；
S4、显色和终止：加底物液，于37℃避光显色10min后，加入终止液50μL/孔；
S5、测定：用酶标仪450mm以空白对照孔校零或用450nm/630nm，测各孔吸光值；
S6、结果分析与判定：临界值cut-off＝2.1×阴性对照的平均吸光值，当阴性对照的平均吸光值＜0.05时，按0.05计算；当待测样品的吸光值＜Cut-off，判断为阴性；当待测样品吸光值≥Cut-off，判断为阳性。
产品性能测试
一致性测试
取100例已确认的阳性临床样本和100例已确认的阴性临床样本，用考核试剂和对照试剂在实验室进行检测比较，建立2×2联表(表5)，并用下列公式进行计算：
阳性符合率＝A/(A+C)×100％
阴性符合率＝D/(B+D)×100％
总符合率＝(A+D)/(A+B+C+D)
Figure BDA0002966717830000091
表5 2×2联表
Figure BDA0002966717830000092
对照试剂：采用上海科华生物工程股份有限公司生产的乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒(酶联免疫法)。
考核试剂：本发明实施例3中所制得的乙肝病毒表面抗体检测试剂盒。
评价标准：
1.阳性符合率、阴性符合率：取值范围在0-100％之间，其值越接近于100％，真实性愈大。
2.总符合率指考核试剂与对照试剂检测结果一致的样本占检测总样本的比例，取值范围在0-100％之间，其值越接近100％，与对照方法符合程度越高。
3.Kappa值在0至+1间判断一致性才有意义。Kappa值越大，表示一致性越好。一般认为Kappa值≥0.75，说明已经取得相当满意的一致程度。若Kappa值＜0.4，则说明一致程度不够理想。
采用上述方法对100例已确认的阳性临床样本和100例已确认的阴性临床样本进行检测，测试结果如表6所示，统计结果如表7所示。
表6：100例阳性样本与100例阴性样本检测结果
Figure BDA0002966717830000101
Figure BDA0002966717830000111
表7：2×2联表(检测结果统计分析)
Figure BDA0002966717830000112
从表6-7可知，临床上所提供的100例阳性样本与100例阴性样本(共200例样本)中，对照试剂检测出阳性101例、阴性99例；考核试剂检测出阳性100例、阴性100例。
阳性符合率＝100/101×100％＝99％
阴性符合率＝99/99×100％＝100％
总符合率＝199/200×100％＝99.5％
Kappa＝0.99
经SPSS15.0软件Kappa检验，Kappa＝0.99，P＜0.01，考核试剂与对照试剂检测结果一致性有统计学意义，检测一致性极好。并且相较于对照试剂，考核试剂的检测准确率更好，表明本发明所制得的乙肝病毒表面抗体检测试剂盒能够具备更好的检测效果。
重复性验证
采用本发明实施例3中所制得的乙肝病毒表面抗体检测试剂盒对同一份待测样本(该待测样品的浓度为10mIU/mL)重复测试10孔，获得一组S/CO数据，求出平均值(X)和标准偏差(S)，最后得出相对标准偏差(变异系数，CV)值，操作时严格按照操作规程执行，测试结果如表8所示。
表8 重复性验证结果
Figure BDA0002966717830000121
从表8可知：变异系数CV为6.00％，符合变异系数CV≤15％的要求，证实将本发明所制得的乙肝病毒表面抗体检测试剂盒用于实际检测时具备良好的重复性。

Claims (10)

1.一种乙肝病毒表面抗体检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有乙肝表面抗原的包被板、底物液、酶标乙肝表面抗原溶液、阴性对照、阳性对照、浓缩洗涤液和终止液；
所述包被板中采用包被缓冲液对乙肝表面抗原进行稀释，所述乙肝表面抗原与包被缓冲液的体积比为1：(1500-2500)；
所述酶标乙肝表面抗原溶液中采用酶标稀释液对酶标乙肝表面抗原进行稀释，所述酶标乙肝表面抗原与酶标稀释液的体积比为1：(1500-2500)。
2.根据权利要求1所述的乙肝病毒表面抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标乙肝表面抗原为采用碘酸钠-乙二醇法对乙肝表面抗原进行辣根过氧化物酶的标记。
3.根据权利要求1所述的乙肝病毒表面抗体检测试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液为含0.02％NaN3的45mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝6.4-6.6。
4.根据权利要求1所述的乙肝病毒表面抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标稀释液为含1％BSA、2％液体明胶、2％PEG、0.012％果绿和0.1％ProClin300的10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝6.7-6.9。
5.根据权利要求1所述的乙肝病毒表面抗体检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含20％NaCl、0.5％KCl和3.0％Tween-20的0.25mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝6.2-6.4。
6.根据权利要求1所述的乙肝病毒表面抗体检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为1mol/L的H2SO4溶液。
7.根据权利要求1所述的乙肝病毒表面抗体检测试剂盒，其特征在于，所述底物液包括底物A液和底物B液；所述底物A液为含0.6g/L过氧化脲的10mmol/L柠檬酸-醋酸钠缓冲液；所述底物B液为含0.042％TMB、0.3％丙酮、4％无水乙醇、0.3g/L EDTA-Na2、3％甘油的10mmol/L柠檬酸溶液。
8.根据权利要求1所述的乙肝病毒表面抗体检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为采用阴性对照稀释液进行稀释后的阴性对照血清，所述阴性对照稀释液为含小牛血清、甘油、叠氮钠和果绿的磷酸盐缓冲溶液，所述阴性对照的吸光值小于0.05；
所述阳性对照为采用阳性对照稀释液进行稀释后的阳性对照血清，所述阳性对照稀释液为含小牛血清、甘油、ProClin300和胭脂红的磷酸盐缓冲溶液，所述阳性对照的吸光值大于1.5。
9.权利要求1-8中任一项所述的乙肝病毒表面抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)包被：将乙肝表面抗原用包被缓冲液稀释后，按95-105μL/孔的用量添加至微孔板的孔内，于18-26℃吸附20-30h，扣干；
(2)封闭：用含0.6％干酪素钠、5％蔗糖、0.02％NaN3的10mmol/L、pH为7.3-7.5的磷酸盐缓冲液作为封闭液，以140-160μL/孔的用量添加至微孔板的孔内，于18-26℃封闭16-26h；
(3)干燥及封板：弃去封闭液，经干燥处理后密封，制得包被有乙肝表面抗原的包被板；
(4)配置并分装底物液、酶标乙肝表面抗原溶液、阴性对照、阳性对照、浓缩洗涤液和终止液，经组装，得到乙肝病毒表面抗体检测试剂盒。
10.权利要求1-8中任一项所述的乙肝病毒表面抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、配置洗涤液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水作1：25稀释；
S2、取出包被板，加入待测样品50μL/孔，同时设阴、阳性对照及空白对照各2孔，阴、阳性对照孔分别加入相应对照血清50μL，空白对照孔加入100μL洗涤液，随即加入酶标乙肝表面抗原溶液50μL/孔，混匀；覆盖封板胶后，置37℃避光温育30min；
S3、洗板：用洗涤液洗板5次，每次静置1min，扣干；
S4、显色和终止：加底物液，于37℃避光显色10min后，加入终止液50μL/孔；
S5、测定：用酶标仪450mm以空白对照孔校零或用450nm/630nm，测各孔吸光值；
S6、结果分析与判定：临界值cut-off＝2.1×阴性对照的平均吸光值，当阴性对照的平均吸光值＜0.05时，按0.05计算；当待测样品的吸光值＜Cut-off，判断为阴性；当待测样品吸光值≥Cut-off，判断为阳性。
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