CN113252901A - 一种乙肝病毒e抗体检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乙肝病毒e抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括：包被有乙型肝炎病毒e抗体的包被板、底物液、酶标记抗‑HBe溶液。本发明制备的试剂盒检测抗体，具有特异性强、重复性好、灵敏度高的效果。

Description

一种乙肝病毒e抗体检测试剂盒
技术领域
本发明属于体外诊断检测技术领域，具体涉及一种乙肝病毒e抗体检测试剂盒。
背景技术
乙肝病毒（乙型肝炎病毒，HBV）是致人乙型肝炎的病原体，是目前世界上传染最广泛的致命病毒之一，乙型肝炎病毒的感染已全世界最重要的公共卫生问题之一。由于目前还没有治疗乙型肝炎的有效手段，因此疫苗接种、早期检测诊断是预防乙型肝炎的重点。
乙型肝炎的病原学诊断，最常用的是乙肝病毒血清标志物（HBVM）的检测。HBVM主要包括七种血清标志物：乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝核心抗体、乙肝e抗原、乙肝e抗体、HBV-DNA及DNA多聚酶。通过检测HBVM可以间接的多角度了解患者HBV感染、复制以及病情恢复情况。ELISA（酶联免疫法）因其原理简单、使用方便和价格便宜的特性，已成为国内外应用的较为广泛的一种方法。
乙肝e抗体是反映病毒复制情况的抗体(抗-HBe)，抗-HBe是乙肝病毒e抗原刺激人体免疫系统后所产生的抗体，是人体感染乙型肝炎病毒后，继乙型肝炎核心抗体产生以后出现的另一抗体，是乙型肝炎病毒感染的又一标志物。它是在标志着乙肝病毒复制的HBeAg消失后才出现的，抗-HBe阳性，说明大多数乙肝病毒的复制停止。然而，由于现有市面上的乙肝e抗体相关检测产品的检测效果仍有所不足，易出现假阳性或假阴性的现象。因此，希望提出一种灵敏度更高，特异性更好且重复性好的乙肝病毒e抗体检测产品。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种乙肝病毒e抗体检测试剂盒，能够快速准确的鉴定乙肝病毒。
本发明还提出上述乙肝病毒抗体诊断试剂盒的应用。
根据本发明第一方面实施方式的乙肝病毒e抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括：包被有乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）的包被板、底物液、酶标记抗-HBe溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括中和试剂溶液、阴性对照、阳性对照、浓缩洗涤液和终止液。
在本发明的一些实施方式中，所述将乙型肝炎病毒e抗体的包被板的制备包括以下步骤：采用包被缓冲液对将乙型肝炎病毒e抗体进行稀释后包板，即得将乙型肝炎病毒e抗体的包被板。
在本发明的一些实施方式中，所述包被缓冲液为含0.01-0.05% NaN3的8-12mMTris-HCl缓冲液，pH为8.5-9.5。
在本发明的一些实施方式中，所述包被缓冲液为含0.02% NaN3的10mM Tris-HCl缓冲液，pH为8.9-9.1。
在本发明的一些实施方式中，所述乙型肝炎病毒e抗体与包被缓冲液的体积比为1：（250-4000）。
在本发明的一些实施方式中，所述乙型肝炎病毒e抗体与包被缓冲液的体积比为1：（800-1200）。
在本发明的一些实施方式中，所述底物液包括底物A液和底物B液；所述底物A液为含0.5-0.8g/L过氧化脲的5-20mmol/L柠檬酸-醋酸钠缓冲液；所述底物B液为含0.03-0.05%TMB、0.3-0.5%丙酮、4-6%无水乙醇、0.2-0.5g/L EDTA-Na2、3-5%甘油的8-15mmol/L柠檬酸溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述的酶标记抗-HBe溶液为辣根过氧化物酶标记的抗-HBe抗体溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述酶标记抗-HBe溶液的制备包括以下步骤：对乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）进行辣根过氧化物酶标记，得到酶标记抗-HBe溶液。
在本发明的一些实施方式中，对乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）进行辣根过氧化物酶标记的方法选用碘酸钠-乙二醇法、过碘酸钠法、戊二醛二步法中的一种。
在本发明的一些实施方式中，采用酶标稀释液对酶标记抗-HBe溶液进行稀释，所述酶标记抗-HBe溶液与酶标稀释液的体积比为1：（1000-30000）。
在本发明的一些实施方式中，所述酶标记抗-HBe与酶标稀释液的体积比为1：（6000-8000）。
在本发明的一些实施方式中，所述酶标稀释液为含0.1-0.3% Tris、1-5% NaCl、0.01-0.05% MgCl2·6H2O、0.1-0.3%皂素、1-5%甘油、25-25%小牛血清、0.01-0.03%果绿、0.07%HCl和0.1% ProClin300的溶液，pH为7.2-7.4。
在本发明的一些实施方式中，所述酶标稀释液为含0.121%Tris、2%NaCl、0.02%MgCl2.6H2O、0.1%皂素、3.5%甘油、20%小牛血清、0.012%果绿、0.07% HCl和0.1% ProClin300的溶液，pH为7.2-7.4。
在本发明的一些实施方式中，所述中和试剂溶液中包括中和抗原和中和试剂稀释液。
在本发明的一些实施方式中，所述中和试剂稀释液为含0.2-0.5% Tris、0.5-0.8%EDTA-Na2、1-3% BSA、0.1-0.4%甲、丙防腐剂的溶液，pH为7.3-7.5。
在本发明的一些实施方式中，所述中和试剂稀释液为含0.242% Tris、0.75%EDTA-Na2、2% BSA、0.2%甲、丙防腐剂的溶液，pH为7.3-7.5。
在本发明的一些实施方式中，所述中和抗原与中和试剂稀释液的体积比为1：（2000-40000）。
在本发明的一些实施方式中，所述中和抗原与中和试剂稀释液的体积比为1：（8000-12000）。
在本发明的一些实施方式中，所述浓缩洗涤液为含15-25%NaCl、0.2-1%KCl和1-5%Tween-20的0.2-0.3mmol/L磷酸盐缓冲液，pH为6.0-7.0。
在本发明的一些实施方式中，所述浓缩洗涤液为含20%NaCl、0.5%KCl和3.0%Tween-20的0.25M磷酸盐缓冲液，pH为6.2-6.4。
在本发明的一些实施方式中，所述终止液为0.5-2mol/L的H2SO4溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述阴性对照为采用阴性对照稀释液进行稀释后的阴性对照血清。
在本发明的一些实施方式中，所述阴性对照稀释液为包括0.1-0.5% ProClin300和0.001-0.005%果绿的8-15mmol/L磷酸盐缓冲溶液，pH为7.3-7.5，所述阴性对照的吸光值大于1.5。
在本发明的一些实施方式中，所述阴性对照稀释液为包括0.1%ProClin300和0.004%果绿的10mmol/L磷酸盐缓冲溶液，pH为7.3-7.5。
在本发明的一些实施方式中，所述阳性对照为采用阳性对照稀释液进行稀释后的阳性对照血清。
在本发明的一些实施方式中，所述阳性对照稀释液为包括15-25%小牛血清、20-30%甘油、0.1-0.2% ProClin300和0.001-0.005%胭脂红的8-15mmol/L磷酸盐缓冲溶液，pH为7.3-7.5，所述阳性对照的吸光值小于0.05。
在本发明的一些实施方式中，所述阳性对照稀释液为包括20%小牛血清、25%甘油、0.1% ProClin300和0.005%胭脂红的10mmol/L磷酸盐缓冲溶液，pH为7.3-7.5，所述阳性对照的吸光值小于0.05。
根据本发明第二方面实施方式的乙肝病毒e抗体检测试剂盒的应用，所述应用为在乙肝病毒e抗体检测中的应用。
一种检测乙肝病毒e抗体的方法，包括如下步骤：将上述乙肝病毒e抗体检测试剂盒用于检测乙肝病毒e抗体。
一种采用上述试剂盒检测乙肝病毒e抗体的方法，包括如下步骤：
S1、取出包被板，分别加入待测样品溶液、阴性对照液、阳性对照液和空白对照液，孵育完后弃去孔内液体，用洗涤液冲洗后拍干；
S2、加入酶结合物，孵育完成后弃去孔内液体，洗液清洗后拍干；
S3、加入底物液显色；
S4、加入终止液；
S5、测定反应液的吸光值，临界值cut-off=阴性对照的平均吸光值×0.5，当待测样品吸光值＞Cut-off，判断为阴性，当待测样品吸光值≤Cut-off，判断为阳性，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种乙肝病毒e抗体检测试剂盒及其应用。本发明的乙肝病毒e抗体检测试剂盒通过竞争抑制法（ELISA），通过倍比稀释法对包被抗体浓度、酶标记抗体、中和抗原的工作浓度进行筛选，得到最佳的浓度范围，同时再结合化学发光底物显色，使用本发明制备的试剂盒检测乙肝病毒e抗体，具有特异性强、重复性好、灵敏度高的效果。本发明所述诊断试剂盒还具有操作简便，实用性强的特点，能够很好的满足实际检测的需求。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
本实施例制备了一种乙肝病毒e抗体检测试剂盒，包括以下组分。
（1）包被有乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）的包被板
所用乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）购自厦门市波生生物技术有限公司，将抗体采用亲和层析进行纯化后，用SDS-PAGE或其他方法测定呈现两条条带，分子量约为25KD、50KD，纯化后的抗体保存于-20℃或以下。
包被：将乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）用包被缓冲液稀释后，按100μL/孔的用量添加至微孔板的孔内，于18-26℃吸附20-30h，扣干；封闭：用含0.121%Tris、1%BSA、5%蔗糖和0.02%硫柳汞、pH为8.9-9.1的溶液为封闭液，以150μL/孔的用量添加至微孔板的孔内，于18-26℃封闭16-26h；干燥及封板：弃去封闭液，经干燥处理后密封，置2-8℃保存，制得包被有乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）的包被板。
包被缓冲液为含0.02% NaN3的10mM Tris-HCl缓冲液，pH为9.0。
（2）化学发光底物
化学发光底物包括底物A液和底物B液；包括底物A液和底物B液。底物A液为含0.6g/L过氧化脲的10mmol/L柠檬酸-醋酸钠缓冲液；底物B液为含0.042% TMB（四甲基联苯胺）、0.3%丙酮、4%无水乙醇、0.3g/L EDTA-Na2、3%甘油的10mmol/L柠檬酸溶液。
（3）酶标记抗-HBe溶液
酶标记抗-HBe溶液中采用酶标稀释液对酶标记抗-HBe（采用碘酸钠-乙二醇法对乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）进行辣根过氧化物酶的标记）进行稀释，酶标记抗-HBe与酶标稀释液的体积比为1：7000。其中，酶标稀释液为含0.121%Tris、2%NaCl、0.02%MgCl2 .6H2O、0.1%皂素、3.5%甘油、20%小牛血清、0.012%果绿、0.07%HCl和0.1% ProClin300的溶液，pH为7.3。
其中，采用碘酸钠-乙二醇法对乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）进行辣根过氧化物酶标记的方法，包括以下步骤：
a.称取4.0mg辣根过氧化物酶（HRP）于棕色玻璃瓶，加0.4mL的0.2mol/LDE1醋酸盐缓冲液进行溶解，并将放入转子放入瓶中；
b.把磁力搅拌器放置在2-8℃环境下工作，然后将a中的溶液瓶放在磁力搅拌器上面，将转速调到最慢，在溶液瓶中的转子连续转动的条件下，加入0.1mol/L的NaIO4溶液0.2mL，混匀，然后用锡纸包住整个瓶身，避光反应30min；
c.选取合适规格的透析袋，剪取适合的长度，放置装有适量纯化水的烧杯中，加热煮沸1-2min（应根据标记总液量选取合适规格的透析袋，目的是要使得透析袋的袋口能完全打开，便以加液），备用；
d.待c中的反应完成后，将磁力搅拌器及溶液瓶从2-8℃环境取出放置室温，同样保持在溶液瓶中的转子连续转动的条件下，加入2.5％乙二醇水溶液0.4mL，混匀，室温避光反应30min；
e.待d中的反应完成后，按每0.5mL溶液加冰冷过的无水乙醇2mL，混匀后以1120g离心力离心5min（ZY0500离心机调制4500r/min的转速），用移液器充分吸走上清液，再加0.5mL纯化水复溶沉淀；
f.将透析袋的一端折叠，夹紧密封，按实际需求量取e中的复溶液、抗体或抗原分别加入加进透析袋中（按1mL复溶液中加入4mg的抗原，1mL复溶液中加入1mg的抗体的比例计算），混匀，慢慢将袋内的气泡往上挤离溶液，并折叠透析袋另一端，夹紧密封，在夹子上标记好抗原抗体名称。取3L的大烧杯装适量的CB溶液（碳酸盐缓冲液）并放进大转子，然后置于磁力搅拌器，于2-8℃搅拌过夜。
g.加5mg/mL的NaHB4溶液0.08mL进行终止（NaHB4溶液用量计算方法：按1mgHRP需加5mg/mL NaHB4 20μL计），混匀，2-8℃放置2h，1小时后需混匀一次；
h.加入等体积的甘油，混匀，再用1mol/L的NaH2PO4调整至pH约为7.0，置于-20℃或以下保存。
（4）阴性对照液
阴性对照为采用阴性对照稀释液进行稀释后的阴性对照血清。
阴性对照稀释液为包括阴性对照稀释液为含0.1%ProClin300和0.004%果绿的10mmol/L磷酸盐缓冲溶液，pH为7.3-7.5；阴性对照的吸光值大于1.5。
（5）阳性对照液
阳性对照为采用阳性对照稀释液进行稀释后的阳性对照血清。
阳性对照稀释液为包括含20%小牛血清、25%甘油、0.1% ProClin300和0.005%胭脂红的10mmol/L磷酸盐缓冲溶液，pH=7.3-7.5；其中阳性对照的吸光值小于0.05。
（6）中和试剂
采用中和试剂稀释液对中和抗原进行稀释，中和抗原与中和试剂稀释液的体积比为1：10000。其中中和试剂稀释液为含0.242%Tris、0.75%EDTA-Na2、2%BSA、0.2%甲、丙防腐剂的溶液，pH=7.4。
采用本实施例的试剂盒检测HCV抗体的方法，包括以下步骤：
S1、配置洗涤液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水作1：25稀释；
S2、取出包被板，加入待测样品50μL/孔，同时设阴、阳性对照及空白对照各2孔，阴、阳性对照孔分别加入相应对照血清50μL，空白对照孔加入150μL洗涤液，随即加入中和试剂50µL/孔及酶标记物50µL/孔（空白对照孔不加），混匀；覆盖封板胶后，置37℃避光温育30min；
S3、洗板：用洗涤液洗板5次，每次静置1min，扣干；
S4、显色和终止：加底物液，于37℃避光显色10min后，加入终止液50μL/孔；
S5、测定：用酶标仪450nm以空白对照孔校零或用450nm/630nm，测各孔吸光值；
S6、结果分析与判定：临界值cut-off=阴性对照的平均吸光值×0.5，当待测样品吸光值＞Cut-off，判断为阴性，当待测样品吸光值≤Cut-off，判断为阳性。
对比例1
本对比例采用购自上海科华生物工程股份有限公司生产的乙型肝炎病毒e抗体检测试剂盒(酶联免疫法)。
对比例2
本对比例与实施例1制备的乙型肝炎病毒e抗体检测试剂盒的区别仅在于化学发光底物采用显色剂A液过氧化氢和B液四甲基联苯胺，两者的体积比为1：1。
试验例
1、包被乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）的浓度选择
使用包被缓冲液（含0.02% NaN3的10mM Tris-HCl缓冲液，pH=9.0）将乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）（购自厦门市波生生物技术有限公司）分别按1：250、1：500、1：1000、1：2000、1：4000的体积比进行稀释，配置成包被液，对包被板进行包被；并选用上海科华生物工程股份有限公司生产的试剂盒为对照试剂盒和北京康彻斯坦生物技术有限公司所生产的质控品（4NCU/ml），对不同包被乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）浓度下阳性样品和阴性样品的吸光值进行检测，从而选择最佳的包被乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）的浓度范围。倍比稀释法选择包被乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）浓度的方案如表1所示。
表1
Figure 857474DEST_PATH_IMAGE001
注：S1-S5为确认阳性样本，S6-S10为确认的阴性样本。
倍比稀释法选择包被乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）浓度的实验结果如表2所示，从表中可以看出，包被乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）稀释比过高或过低都会对检测效果带来不利影响，经综合比较，当包被乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）的稀释比为1：1000时，吸光值稳定且饱和，检测的灵敏度高，特异性好，在包被乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）的稀释比为1：（800-1200）的浓度范围时，均能实现较为良好的检测效果。
表2
Figure 913155DEST_PATH_IMAGE002
2、酶标记抗-HBe的工作浓度选择
采用碘酸钠-乙二醇法对乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）（购自厦门市波生生物技术有限公司）进行辣根过氧化物酶（购自SIGMA-ALDRICH）的标记后，得到酶标记抗-HBe。使用酶标稀释液（含0.121%Tris、2%NaCl、0.02%MgCl2·6H2O、0.1%皂素、3.5%甘油、20%小牛血清、0.012%果绿、0.07%HCl和0.1% ProClin300的溶液，pH=7.2-7.4）将酶标记抗-HBe分别按1：1750、1：3500、1：7000、1：14000、1：28000的体积比进行稀释，配置成酶标记抗-HBe溶液；并选用上海科华生物工程股份有限公司生产的试剂盒为对照试剂盒和北京康彻斯坦生物技术有限公司所生产的质控品（4NCU/ml），对不同酶标记抗-HBe工作浓度下阳性样品和阴性样品的吸光值进行检测，从而选择最佳的酶标记抗-HBe的工作浓度范围。倍比稀释法选择酶标记抗-HBe工作浓度的方案设计如表3所示。
表3
Figure 729801DEST_PATH_IMAGE003
注：S1-S5为确认阳性样本，S6-S10为确认的阴性样本。
倍比稀释法选择酶标记抗-HBe工作浓度的实验结果如表4所示，从表中可以看出，当酶标记抗-HBe的工作浓度＞1：7000时，灵敏度高，但特异性较差；当酶标记抗-HBe的工作浓度＜1：7000时，特异性好，但灵敏度低。综上所述，当酶标记抗-HBe的工作浓度为1：7000时，吸光值稳定且饱和，能同时兼备灵敏度高和特异性好的优势，同时在酶标记抗-HBe的稀释比为1：（6000-8000）的浓度范围时，均能实现较为良好的检测效果。
表4
Figure 263551DEST_PATH_IMAGE004
3、中和抗原浓度的选择
使用中和试剂稀释液（0.242%Tris、0.75%EDTA-Na2、2%BSA、0.2%甲、丙防腐剂的溶液，pH=7.3-7.5），将中和抗原分别按1：2500、1：5000、1：10000、1：20000、1：40000的体积比进行稀释，配置成中和试剂溶液；并选用上海科华生物工程股份有限公司生产的试剂盒为对照试剂盒和北京康彻斯坦生物技术有限公司所生产的质控品（4NCU/ml），对不同中和试剂工作浓度下阳性样品和阴性样品的吸光值进行检测，从而选择最佳的中和抗原的工作浓度范围。其中倍比稀释法选择中和抗原工作浓度的方案设计如表5所示。
表5
Figure 85138DEST_PATH_IMAGE005
注：S1-S5为确认阳性样本，S6-S10为确认的阴性样本。
倍比稀释法选择中和抗原工作浓度的实验结果如表6所示，当中和抗原的工作浓度＞1：10000时，灵敏度高，但特异性较差；当中和抗原的工作浓度＜1：10000时，特异性好，但灵敏度低。在中和抗原的稀释比为1：（8000-12000）的浓度范围时，均能实现较为良好的检测效果，当中和抗原的工作浓度为1：10000时，效果最好，吸光值稳定且饱和，能同时兼备灵敏度高和特异性好的优势。
表6
Figure 311720DEST_PATH_IMAGE006
4、化学发光底物的选择
采用实施例1制备的乙肝病毒e抗体检测试剂盒和对比例2制备的乙肝病毒e抗体检测试剂盒对阳性样品和阴性样品的吸光值进行检测，实验方案如表7所示。
表7
Figure 350083DEST_PATH_IMAGE007
注：S1-S5为确认阳性样本，S6-S10为确认的阴性样本。
实验结果如表8所示，从表中可以看出，实施例1制备的乙型肝炎病毒e抗体和比例2制备的乙型肝炎病毒e抗体，均能实现较为良好的检测效果，但是实施例1制备的乙型肝炎病毒e抗体的灵敏度更高，吸光值稳定且饱和，能同时兼备灵敏度高和特异性好的优势。
表8
Figure 232064DEST_PATH_IMAGE008
5、产品性能测试
取100例已确认的阳性临床样本和100例已确认的阴性临床样本，用考核试剂和对照试剂在实验室进行检测比较，建立2×2联表（表9），并用下列公式进行计算：
阳性符合率=A/(A+C)×100%；
阴性符合率=D/(B+D)×100%；
总符合率=（A+D）/(A+B+C+D)；
Figure 173738DEST_PATH_IMAGE009
。
表9
Figure 40063DEST_PATH_IMAGE010
对照试剂：采用上海科华生物工程股份有限公司生产的乙型肝炎病毒e抗体检测试剂盒(酶联免疫法)。
考核试剂：本发明实施例1中所制得的乙肝病毒e抗体检测试剂盒。
评价标准：
1.阳性符合率、阴性符合率：取值范围在0-100%之间，其值越接近于100%，真实性愈大。
2.总符合率指考核试剂与对照试剂检测结果一致的样本占检测总样本的比例，取值范围在0-100%之间，其值越接近100%，与对照方法符合程度越高。
3.Kappa值在0至+1间判断一致性才有意义。Kappa值越大，表示一致性越好。一般认为Kappa值≥0.75，说明已经取得相当满意的一致程度。若Kappa值＜0.4，则说明一致程度不够理想。
使用采用对比例1的乙型肝炎病毒e抗体检测试剂盒(酶联免疫法)和本发明实施例1中所制得的乙肝病毒e抗体检测试剂盒。对200例临床样本进行检测，测试结果如表10所示，统计结果如表11所示。
表10 100例阳性样本与100例阴性样本检测结果
Figure 300143DEST_PATH_IMAGE011
Figure 175695DEST_PATH_IMAGE012
Figure 204831DEST_PATH_IMAGE013
表11
Figure 507636DEST_PATH_IMAGE014
实验结果如表10-11所示，从表中可以看出，临床上所提供的100例阳性样本与100例阴性样本（共200例样本）中，对照试剂检测出阳性102例、阴性98例；考核试剂检测出阳性100例、阴性100例。
阳性符合率=100/102×100%=98%；
阴性符合率=98/98×100%=100%；
总符合率=198/200×100%=99%；
Kappa=0.98。
经SPSS15.0软件Kappa检验，Kappa=0.98，P＜0.01，考核试剂与对照试剂检测结果一致性有统计学意义，检测一致性极好。并且相较于对照试剂，考核试剂（本申请方案实施例1制备的试剂盒）的检测准确率更好，表明本发明所制得的乙肝病毒e抗体检测试剂盒能够具备更好的检测效果。
6、特异性试验
用本申请方案实施例1制备乙肝病毒e抗体检测试剂盒检测丙肝病毒、丙肝病毒抗体、甲型肝炎病毒、甲型肝炎病毒抗体和乙肝病毒标准阳性血清，除乙肝病毒标准阳性血清的吸光值小于的临界值cut-off，其余血清吸光值均大于临界值cut-off，符合阴性血清的判定标准，表明这种方法的特异性良好。
7、灵敏度检测
用实施例1制备的试剂盒和对比例1的试剂盒同时检测不同稀释倍数的含乙肝病毒的血清，从表12中可以看出血清稀释5-40倍时，两种试剂盒检测抗体均为阳性，当血清稀释60倍时，对比例1的试剂盒有假阴性的情况出现，说明实施例1制备的试剂盒的灵敏度更高。
表12不同稀释倍数的感染血清检测结果
Figure 989433DEST_PATH_IMAGE015
8、重复性验证
采用本发明实施例1中所制得的乙肝病毒e抗体检测试剂盒对同一份待测样本（该待测样品的浓度为4NCU/mL）重复测试10孔，获得一组S/CO数据，求出平均值（X）和标准偏差（SD），最后得出相对标准偏差（变异系数，CV）值，操作时严格按照操作规程执行，测试结果如表13所示。
表13 重复性验证结果
Figure 161352DEST_PATH_IMAGE016
从表13中可以看出，变异系数CV为3.7%，符合变异系数CV≤15%的要求，证实将本发明所制得的乙肝病毒e抗体检测试剂盒用于实际检测时具备良好的重复性。
9、试剂盒保存期试验
试剂盒保存条件为2-8℃，保存12个月后经过测定，试剂盒的最大吸光度值(零添加)、乙肝病毒e抗体添加实际测定值均在正常范围之内，同时测试结果稳定性好。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置3个月，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻2周，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃保存12个月以上。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (9)

1.一种乙肝病毒e抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有乙型肝炎病毒e抗体的包被板、底物液、酶标记抗-HBe溶液；所述乙型肝炎病毒e抗体的包被板的制备包括以下步骤：采用包被缓冲液对将乙型肝炎病毒e抗体进行稀释后包板，即得将乙型肝炎病毒e抗体的包被板；所述乙型肝炎病毒e抗体与包被缓冲液的体积比为1：（250-4000）。
2.根据权利要求1所述的乙肝病毒e抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记抗-HBe溶液为辣根过氧化物酶标记的抗-HBe抗体溶液。
3.根据权利要求1所述的乙肝病毒e抗体检测试剂盒，其特征在于，采用酶标稀释液对酶标记抗-HBe抗体进行稀释，所述酶标记抗-HBe抗体与酶标稀释液的体积比为1：（1000-30000）。
4.根据权利要求1所述的乙肝病毒e抗体检测试剂盒，其特征在于，底物液包括底物A液和底物B液；所述底物A液为含0.5-0.8g/L过氧化脲的5-20mmol/L柠檬酸-醋酸钠缓冲液；所述底物B液为含0.03-0.05% TMB、0.3-0.5%丙酮、4-6%无水乙醇、0.2-0.5g/L EDTA-Na2、3-5%甘油的8-15mmol/L柠檬酸溶液。
5.根据权利要求1所述的乙肝病毒e抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括中和试剂溶液、阴性对照、阳性对照、样品稀释液、浓缩洗涤液和终止液。
6.根据权利要求5所述的乙肝病毒e抗体检测试剂盒，其特征在于，所述中和试剂溶液中包括中和抗原和中和试剂稀释液。
7.根据权利要求6所述的乙肝病毒e抗体检测试剂盒，其特征在于，所述中和抗原与中和试剂稀释液的体积比为1：（2000-40000）。
8.根据权利要求5所述的乙肝病毒e抗体检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为采用阴性对照稀释液进行稀释后的阴性对照血清。
9.根据权利要求5所述的乙肝病毒e抗体检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为采用阳性对照稀释液进行稀释后的阳性对照血清。
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