KR100214292B1 - B형 간염 바이러스의 특이항원인 ub hbv 코어 단백질의 정제방법 및 이를 이용한 핵 항체 단백질의 검출방법 - Google Patents

B형 간염 바이러스의 특이항원인 ub hbv 코어 단백질의 정제방법 및 이를 이용한 핵 항체 단백질의 검출방법 Download PDF

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Abstract

B형 간염 바이러스의 특이항원인 UB HBV 코어(HBV Core) 단백질의 정제 방법은 (1) UB HBV 코어 유전자가 발현되어 있는 재조합 대장균을 파쇄한 후 원심분리하여 불용성 물질을 제거하는 단계; (2) 단계 1 에서 얻어진 세포 파쇄 용액에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 가하여 용해시킨 후 원심분리하여 선별 침전시키는 단계; (3) 단계 2 에서 얻어진 단백질 용액을 CL-4B 겔 투과 크로마토그래피시키는 단계; 및 (4) 수집된 단백질 용액을 염화세슘 밀도구배를 이용하여 초원심분리시킨 후 투석하는 단계를 포함한다. 정제된 UB HBV 코어 단백질을 이용한 핵 항체의 검출 방법은 정제된 UB HBV 코어 단백질을 웰 플레이트에 흡착시키고 부동화시킨 다음, 시험 시료, 양성 표준시료 및 음성 표준시료 각각을 상기 플레이트에 가하고, 과산화효소와 사람의 혈장으로부터 정제된 핵항체를 접합시킨 효소표지항체(anti-HBV 코어-HRP)를 첨가하여 경쟁적 결합반응을 수행한 후, 과산화효소 기질로 발색시킨 다음 흡광도를 측정하는 것을 포함한다.

Description

B형 간염 바이러스의 특이항원인 UB HBV 코어 단백질의 정제방법 및 이를 이용한 핵 항체 단백질의 검출방법
본 발명은 유전자 재조합 대장균에서 발현된 B형 간염 바이러스(HBV)의 특이항원인 UB HBV 코어 단백질의 정제방법 및 이에 의해 정제된 UB HBV 코어 단백질을 이용한 핵 항체 검출 방법에 관한 것으로, UB HBV 코어 유전자가 발현된 대장균 세포의 파쇄 및 불용성 침전물 제거, PEG에 의한 선별 침전, 겔 투과 크로마토그래피, 염화세슘 밀도구배를 이용한 초원심분리 및 투석 과정을 통해 경쟁적 면역효소연결법에 대한 감도가 매우 높은 UB HBV 코어 단백질을 정제하여 핵 항체 단백질의 검출에 이용하는 방법에 관한 것이다.
B형 간염은 B형 간염 바이러스에 의해 유발되는 질병으로서 전세계적으로 심각한 공중 보건상의 문제가 되는 질환 중의 하나이지만 아직까지 효과적인 치료 방법이 존재하지 않는다. 따라서 그 예방을 위해서는 바이러스의 초기 감염 단계에서 감염 여부를 발견하는 것이 중요하다고 할 수 있다.
일반적으로 B형 간염 진단에 사용되는 혈청학적 표지로는 표면항원(HBsAg), 표면항원 항체(Anti-HBsAg), 핵항원(HBcAg), 핵항체(Anti-HBcAg), 핵항체 IgM(Anti-HBcAg IgM), e 항원(HBeAg), e 항원 항체(Anti-HBeAg)의 6 종류가 있다. 이 중 핵항원은 혈액에는 존재하지 않고 간에서 HBV의 주요 몸체로 존재하며, 핵 항체는 간염의 초기 회복단계에서 검출되는 것으로서 B형 간염에 있어 초기 회복여부를 진단하는 데 필요한 표지가 되며, 핵 항체 IgM은 핵 항체 발현초기에만 나타나 급성간염을 진단하는데 필요한 표지이다. 또한 핵 항체는 핵항원의 양이 증가할수록 혈액내에서의 그 양이 증가하기 때문에, 핵 항체의 양을 측정함으로써 간에서의 HBV의 증감을 확인할 수 있다.
핵 항원은 간염 환자의 간조직이나 혈장에서 순수분리하여 그 면역학적 특성 및 생화학적 특성을 연구해 왔다(Ohori, H.,et al., J. Gen. Virol., 65,405-414 (1984); Ohori, H.,et al., Intervirology, 13,74-82(1980)). 그러나 이러한 방법은 충분한 양의 시료를 확보하기가 어려울 뿐만 아니라 감염의 위험이 있어 쉽게 이용할 수가 없다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위해 유전자 재조합 기술에 의해 대장균에서 HBV의 핵항원을 대량 발현시킨 다음 정제하는 방법들이 개발되었다. 특히, 핵항원을 보다 손쉽게 대량으로 제조하기 위해 핵항원과 유비퀴틴의 융합단백질(UB HBV Core)로서 발현시키는 방법이 개발되었으며(한국 특허출원 제 93-09792 호), 발현된 UB HBV 코어 단백질을 분리 정제하는데 성공하였다(한국 특허출원 제 93-09912 호).
상기 종래의 UB HBV 코어 단백질 정제방법에서는 UB HBV 코어 단백질이 발현된 재조합 대장균 세포의 파쇄, 6M 우레아의 존재하에서의 DEAE-세파로스 이온 교환 크로마토그래피 및 S-300 겔 투과 크로마토그래피 단계를 거쳐 상기 융합 단백질을 고순도로 정제한 후, B형 간염 바이러스에 감염된 환자의 혈청으로부터 분리한 면역 글로불린을 이용한 웨스턴 블롯팅(Western blotting)으로 검출하였다(한국 특허출원 제 93-09912 호). 그러나 이 방법에 의해 정제된 UB HBV 코어 단백질은 경쟁적 면역효소연결법(competitive enzyme-linked immunosorbent assay, competitive ELISA)에 대한 감도가 낮아서 이 방법을 사용하여 B형 간염 진단시약에서 핵항체 검출을 위한 항원으로 사용되기에 부적합한데, 그 주된 이유는 정제과정 중에 첨가되는 우레아에 의한 것으로 밝혀졌다. 또한 우레아를 투석에 의해 제거한 경우 면역효소연결법에 대한 감도가 100배 이상 증가하였으나 이 과정에서 다량의 침전이 생기는 문제가 있다.
본 발명의 목적은 경쟁적 면역효소연결법에 대해 높은 감도를 가져 핵항체 검출에 이용할 수 있는 UB HBV 코어를 고순도로 정제하는 방법 및 이에 의해 정제된 UB HBV 코어 단백질을 이용하여 핵 항체를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 UB HBV 코어(HBV Core) 단백질의 정제과정을 개요하여 도시한 것이고,
도 2은 종래의 UB HBV 코어 단백질 정제방법과 본 발명의 정제방법에 의해 정제된 UB HBV 코어 단백질의 경쟁적 면역효소연결법에서의 감도를 비교한 것이고,
도 3은 본 발명에 따른 정제 과정중 각 단계에서 얻어지는 산물 및 최총 정제된 UB HBV 코어 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 UB HBV 코어 단백질 정제 방법은
(1) UB HBV 코어 유전자가 발현되어 있는 재조합 대장균을 파쇄한 후 원심분리하여 불용성 물질을 제거하는 단계;
(2) 단계 1 에서 얻어진 세포 파쇄 용액에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 가하여 용해시킨 후 원심분리하여 선별 침전시키는 단계;
(3) 단계 2 에서 얻어진 단백질 용액을 CL-4B 겔 투과 크로마토그래피시키는 단계; 및
(4) 수집된 단백질 용액을 염화세슘 밀도구배를 이용하여 초원심분리시킨 후 투석하는 단계를 포함한다.
이하 본 발명에 따른 UB HBV 코어 단백질을 정제하는 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.
도 1은 상기와 같은 본 발명의 UB HBV 코어 단백질 정제과정을 개략한 것이다.
먼저 B형 간염 바이러스의 코어(HBV Core) 유전자와 유비퀴틴(UB) 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 대장균(E. coliW3110, ATCC 37339)을 한국 특허 출원공개 제 94-26210 호에 개시된 방법에 따라 제조하고, 이를 20㎍/㎖의 엠피실린이 함유된 루리아(Luria) 배지에서 선별 배양한다. 배양액을 2% 카사미노산과 10㎍/㎖의 트립토판이 함유된 M9 배지로 옮기고 2시간 정도 배양한 뒤 인돌아크릴산(indole acrylic acid, IAA)을 최종농도가 50㎍/㎖이 되도록 첨가하여 UB HBV 코어 재조합 단백질을 발현시킨 다음 3시간 정도 더 배양한다(한국 특허출원 제 93-09912 호).
상기의 대장균 세포를 원심분리기로 원심분리하여 수확하고 수확된 세포에 완충용액을 가하여 현탁시킨 뒤 얼음위에서 라이소자임(Lysozyme)을 가하여 초음파 파쇄기로 세포를 파쇄한다. 세포 파쇄액을 원심분리기로 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고 상등액을 모은다.
상기 상등액에 0.2 내지 0.7M 염화나트륨을 가한 후, 폴리에틸렌 글리콜 8,000(PEG 8,000)을 2 내지 3.5%가 되도록 가하고 원심분리하여 상등액을 모은다. 이 상등액을 다시 PEG 8,000을 6 내지 10%가 되도록 첨가하고 원심분리하여 침전물을 모은 후 완충용액으로 용해시킨 다음 다시 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고 상등액을 모은다.
상기에서 얻어진 상등액을 CL-4B 겔 투과 크로마토그래피에 통과시키고 일정한 속도로 용출시킨 다음 UB HBV 코어 단백질 함유 분획을 모아 농축시키고 20 내지 35% 농도의 염화세슘을 첨가하여 밀도구배를 이용하여 초원심분리를 수행한다. 원심분리관의 위쪽에서부터 1㎖씩 분획한 후 각 분획을 SDS-전기영동하여 UB HBV 코어 단백질이 나타나는 분획을 모아 트리스-염화나트륨 완충용액(pH 8.0)에 대해 투석함으로써 목적하는 UB HBV 코어를 얻을 수 있다.
이와 같이 정제된 UB HBV 코어 단백질은 경쟁적 면역효소연결법을 이용하여 핵항체(anti-UB HBV 코어) 검출에 사용할 수 있다. 즉, 본 발명에 따라 정제된 고감도의 UB HBV 코어 단백질을 웰 플레이트에 흡착시키고 부동화시킨 다음, 시험할 시료, 양성 표준시료 및 음성 표준시료 각각을 상기 플레이트에 가하고, 과산화효소와 사람의 혈장으로부터 정제된 핵항체를 접착시킨 효소표지항체(anti-HBV 코어-HRP)를 첨가하여 경쟁적 결합반응을 수행한다. 이어서 플레이트를 세척한 후 과산화효소의 기질을 첨가하여 발색시킨 다음 흡광도를 측정함으로써 항원-항체 반응에 의해 핵항체를 검출할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 UB HBV 코어 단백질을 이용하여 경쟁적 면역효소연결법에 의해 핵항체를 검출함으로써 B형 간염을 보다 민감하게 조기 진단할 수 있게 된다.
도 2는 종래의 UB HBV 코어 단백질 정제방법과 본 발명의 정제방법에 의해 정제된 UB HBV 코어 단백질의 경쟁적 면역효소연결법에서의 감도를 비교한 것이다. 여기에서, - △ -는 한국 특허출원 제 93-19912 호의 방법에 의해 정제된 UB HBV 코어 단백질을 나타낸 것이고, --- □ ---는 한국 특허출원 제 93-19912 호의 방법에 의해 정제한 후 인산-염화나트륨 완충용액으로 투석하여 얻은 UB HBV 코어 단백질이며, - ■ -는 본 발명에 따라 정제된 UB HBV 코어 단백질이다. 본 발명에 의해 정제한 UB HBV 코어 단백질의 경우 항체 농도가 높게 검출되어 항체 검출을 위한 항원으로서 유용하게 이용할 수 있음을 알 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 대장균 세포로부터 고감도 UB HBV 코어 단백질의 분리 및 정제
(단계 1) 재조합 대장균 세포의 배양
한국 특허출원 제 93-09912 호에 기재된 방법에 따라 B형 간염 바이러스의 특이항원인 HBV 코어 유전자와 유비퀴틴(UB) 유전자가 클로닝된 벡터(ptrpH-UB-HBV-Core, ATCC 69287)를 50㎍/㎖의 엠피실린이 함유된 10㎖의 루리아(Luria) 배지(1ℓ 당 박토트립톤 10g, 효모추출물 5g, 염화나트륨 10g)에서 37℃로 12시간 동안 진탕배양한 다음, 2% 카사미노산 및 10㎍/㎖의 트립토판이 함유된 M9 배지(40mM K2H2PO4, 22mM KH2PO4, 0.1mM CaCl2, 10㎍/㎖ 비타민 B1)(1ℓ)로 옮겨 37℃에서 2시간 정도 진탕배양하고 배양액의 O.D.가 650nm에서 0.35 정도 되었을 때 인돌아크릴산(IAA)를 최종농도 50㎍/㎖가 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한지 약 3시간 후 배양액의 O.D.가 650nm에서 0.38 정도 되었을 때 세포 배양액을 원심분리기에서 6,000rpm으로 15분간 원심분리하여 세포 침전물을 수확하였다.
(단계 2) 세포 파쇄 및 불용성 단백질 제거
단계 1 에서 수확된 세포 20g당 20mM 트리스(pH 8.0) 100㎖와 40㎎ 라이소자임을 가하여 현탁시킨 후 얼음위에서 초음파 파쇄기로 5분 사이를 두고 5분간씩 2회 처리하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄액을 16,000rpm에서 20분간 원심분리하여 불용성 침전물을 버리고 상등액을 모았다.
(단계 3) 폴리에틸렌글리콜 8,000(PEG 8,000)을 이용한 선별 침전
단계 2 에서 얻은 상등액에 염화나트륨을 0.5M이 되도록 첨가하고 얼음위에서 PEG 8,000을 최종농도가 3%가 되도록 서서히 첨가하여 용해시킨 다음, 30분간 방치한 후 16,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 모았다. 모아진 상등액에 얼음위에서 PEG 8,000을 7% 되도록 서서히 첨가하여 용해시킨 다음 30분간 방치한 후 16,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 버리고 침전물을 모았다.
(단계 4) CL-4B 겔 투과 크로마토그래피
(단계 3)에서 얻은 침전물에 20mM 트리스(pH8.0)-0.5M 염화나트륨 완충 용액 40㎖를 가하여 30분간 용해시킨 다음 16,000rpm에서 20분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고 상등액을 모았다. 이 상등액을 20mM 트리스(pH8.0)-0.5M NaCl 완충용액으로 이미 평형화된 CL-4B 겔 투과 크로마토그래피 칼럼(Pharmacia 사, 50x100㎝)에 분당 2㎖(2㎖/분)의 속도로 주입하고, 분획당 40㎖가 되도록 같은 속도로 용출시켰다. 각 분획을 SDS-PAGE를 수행하여 UB HBV 코어가 나타나는 분획을 확인한 후 모았다.
(단계 5) 염화세슘-밀도구배를 이용한 초원심분리
단계 4에서 CL-4B 크로마토그래피로부터 용출된 분획들을 한외여과막(Amicon, YM100)을 장착한 농축기(Amicon Stirred Cell)로 60㎖가 되도록 농축한 다음, 염화세슘을 30%가 되도록 가하고 HCl 이나 NaOH 를 사용하여 pH가 7.0이 되도록 조정하였다. 상기의 용액을 55,000rpm에서 22시간동안 초원심분리하고 원심분리관의 위쪽에서부터 1㎖씩 분획한 다음 각 분획을 SDS-PAGE하여 UB HBV 코어 단백질이 나타나는 분획을 확인한 후 모았다. 모든 분획을 트리스-염화나트륨 완충용액(TBS, pH8.0)에 대해 투석하여 고순도의 UB HBV 코어를 얻었다.
도 3은 상기 정제 단계별로 얻어지는 산물 및 최종 정제된 UB HBV 코어 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동한 결과를 나타낸 것이다. 여기에서, M열은 표준 분자량 표지 단백질이고, 제 1 열은 세포 파쇄액을, 제 2 열은 세포 파쇄액을 원심분리한 후의 상등액을, 제 3 열은 폴리에틸렌글리콜로 선별침전한 용액을, 제 4 열은 CL-4B 겔 투과 크로마토그래피로부터 용출된 단백질을, 제 5 열은 겔 투과 크로마토그래피로부터 용출된 단백질을 농축한 용액을, 제 6 열은 염화세슘 밀도구배 초원심분리 후 정제된 UB HBV 코어 단백질이다.
실시예 2: 경쟁적 면역효소연결법을 이용한 핵항체 검출
실시예 1 에서 정제된 UB HBV 코어의 항원성을 경쟁적 면역효소연결법으로 알아보았다. 먼저 100mM 탄산나트륨 완충용액에 UB HBV 코어를 0.1 - 0.5㎍/㎖이 되도록 희석한 후, 단백질 흡착용 96 웰 플레이트에 100㎕씩 분주하고 상온에서 12 내지 18시간동안 부동화시킨 다음, 250㎖의 0.5% 젤라틴/인산-염화나트륨 완충용액으로 항원이 부동화된 웰을 코팅시킨 후 말려서 사용하였다. 상기 플레이트에 실험할 시료와 양성 표준시료 및 음성 표준시료를 각각 100㎕씩 분주하고, 여기에 고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)와 사람 혈장으로부터 정제된 핵항체(anti-HBV 코어)를 접합시킨 효소표지 항체(anti-HBV 코어-HRP)를 100㎕씩 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 경쟁적 결합반응을 수행한 후 5회 세척하였다. 이어서 고추냉이 과산화효소의 기질인 TMB(테트라메틸 벤지딘)와 과산화수소 용액을 세척된 웰에 100㎕씩 분주하고 30분간 상온에서 반응시킨 후 1N 황산용액으로 반응을 정지시킨 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 컷오프(cutoff)는 (음성 표준 시료의 흡광도 + 양성 표준시료의 흡광도)/2로 산정하여 이 값보다 높으면 음성으로, 낮으면 양성으로 판정하였다. 이것을 공인된 판넬을 가지고 애보트(Abbott)사의 Corzyme 시험방법에 의한 결과와 비교하였을 때 0.15㎍/㎖의 농도에서 유사한 감도를 나타내었다. 이 결과를 표 1 에 나타내었다.
시 료 Corzyme UB HBV Core
0.3㎍/㎖ 0.15㎍/㎖ 0.1㎍/㎖
음성표준시료 1.561 1.300 1.353 1.101
양성표준시료 0.067 0.015 0.036 0.025
cutoff 0.665 0.651 0.695 0.561
Paul-Erlich Institute unit 시료번호
16 1 0.079 0.037 0.032
8 2 0.123 0.121 0.089
4 3 0.212 0.290 0.237 0.132
2 4 0.309 0.539 0.532 0.277
1 5 0.680 0.897 0.734 0.496
0.5 6 0.889 1.295 0.972 0.725
0.2 7 0.973 1.061 0.880
0.1 8 1.104 1.233 0.844
0.1 9 1.068 1.233 1.007
N 10 1.272 1.246 1.065
* 회색으로 채색된 부분은 양성을 나타냄
본 발명에 따르면 경쟁적 면역효소연결법에 대한 감도가 높아서 핵항체 검출에 이용할 수 있는 UB HBV 코어를 고순도로 정제할 수 있으며, 이를 이용하여 경쟁적 면역효소연결법에 의해 핵항체를 검출함으로써 B형 간염을 보다 민감하게 조기 진단할 수 있다.

Claims (4)

  1. (1) UB HBV 코어 유전자가 발현되어 있는 재조합 대장균을 파쇄한 후 원심분리하여 불용성 물질을 제거하는 단계;
    (2) 단계 1 에서 얻어진 세포 파쇄 용액에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 가하여 용해시킨 후 원심분리하여 선별 침전시키는 단계;
    (3) 단계 2 에서 얻어진 단백질 용액을 CL-4B 겔 투과 크로마토그래피시키는 단계; 및
    (4) 수집된 단백질 용액을 염화세슘 밀도구배를 이용하여 초원심분리시킨 후 투석하는 단계를 포함하는, 재조합 대장균으로부터 B형 간염 바이러스 특이항원 융합 단백질인 UB HBV 코어 단백질을 정제하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 단계(2)가 세포 파쇄액에 0.2 내지 0.7M 염화나트륨을 첨가한 다음, 2 내지 3.5% PEG 를 가하여 원심분리한 후 얻은 상등액에 다시 6 내지 10% PEG 를 가하여 원심분리하여 선별침전시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 단계(4)에서 염화세슘의 농도가 20 내지 35%인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항의 방법에 의해 정제된 UB HBV 코어 단백질을 웰 플레이트에 흡착시키고 부동화시킨 다음, 시험 시료, 양성 표준시료 및 음성 표준시료 각각을 상기 플레이트에 가하고, 과산화효소와 사람의 혈장으로부터 정제된 핵항체를 접합시킨 효소표지 항체(anti-HBV 코어-HRP)를 첨가하여 경쟁적 결합반응을 수행한 후, 과산화효소 기질로 발색시킨 다음 흡광도를 측정하여 핵항체(anti-HBV core)를 검출하는 방법.
KR1019970023547A 1997-06-09 1997-06-09 B형 간염 바이러스의 특이항원인 ub hbv 코어 단백질의 정제방법 및 이를 이용한 핵 항체 단백질의 검출방법 KR100214292B1 (ko)

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