JP2001508544A - インフルエンザに対する血清α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの診断用および予後判定用ＥＬＩＳＡアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 インフルエンザウイルス感染細胞はα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを血流中へ分泌し、その結果Ｇｃタンパク質が脱グルコシル化される。これによりＧｃタンパク質のＭＡＦ前駆体活性が不活性化され、このため免疫抑制が生じる。したがって患者の血流中のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性を診断および予後判定の指標として利用できる。インフルエンザ患者の血清または血漿α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを検出し、診断／予後判定指標として用いるために、抗原としてのインフルエンザウイルス特異性α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼに対する抗体サンドイッチ型ＥＬＩＳＡ法およびキットを開発した。

Description

【発明の詳細な説明】 インフルエンザに対する血清α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの 診断用および予後判定用ＥＬＩＳＡアッセイ 発明の分野 本発明は、インフルエンザ患者の血流中に見出された、免疫抑制を生じる特定 の酵素、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを利用した診断法および予後判 定法、ならびにα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを検出するための酵素結 合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）に関する。 用語一覧 Ｇｃタンパク質 ビタミンＤ₃−結合タンパク質 ＭＡＦ マクロファージ活性化因子 ＧｃＭＡＦ Ｇｃタンパク質由来マクロファージ活性化因子 ＨＡ ヘマグルチニン Ｎａｇ α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ ＮａｇＡｇ 抗原としてのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ ＥＬＩＳＡ 酵素結合イムノソルベントアッセイ 発明の概要 ビタミンＤ₃−結合タンパク質（Ｇｃタンパク質）はマクロファージ活性化因 子（ＭＡＦ）の前駆体である。インフルエンザウイルス感染細胞はα−Ｎ−アセ チルガラクトサミニダーゼを血流中へ分泌し、その結果Ｇｃタンパク質が脱グル コシル化される。これによりＧｃタンパク質のＭＡＦ前駆体活性が不活性化され 、このため免疫抑制が生じる。したがって患者の血流中のα−Ｎ−アセチルガラ クトサミニダーゼ活性を診断および予後判定の指標として利用できる。インフル エンザ患者の血清または血漿α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを検出し、 診断／予後判定指標として用いるために、抗原としてのインフルエンザウイルス 特異性α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼに対する抗体サンドイッチ型ＥＬ Ｉ ＳＡ法およびＥＬＩＳＡキットを開発した。図面の説明 本発明の他の目的および付随する多数の特色は容易に理解されるであろう。こ れらは以下の詳細な記述を添付の図面と合わせて考慮すると、より良く理解され る。 図１ａは、Ｇｃタンパク質からマクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）への変換 を図式で説明したものである。 図１ｂは、インフルエンザ患者の血流中でのＧｃタンパク質の脱グルコシル化 を図式で説明したものである。 図２は、インフルエンザ抗原としてのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ とＥＬＩＳＡのアルカリホスファターゼ活性に関する吸光度（色濃度）との標準 的相関を示す。 発明の背景 Ａ．ＭＡＦ前駆体活性喪失により生じる免疫抑制 感染により炎症が起き、これによりマクロファージが引き寄せられ、活性化さ れる。炎症病変部からリゾリン脂質が放出される。マウスに少量（５〜２０μｇ ／マウス）のリゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−Ｐｃ）その他のリゾリン脂 質を投与すると、マクロファージの食作用能およびスーパーオキシド発生能が著 しく高まった（ＮｇｗｅｎｙａおよびＹａｍａｍｏｔｏ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅ ｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ． ，１９３：１１８，１９９０；Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｉｎｆ．Ｉｍｍ． ，６１：５３８８，１９９３；Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｉｎｆｌ ａｍｍａｔｉｏｎ ，１８：３１１，１９９４）。この炎症感作（ｉｎｆｌａｍｍ ａｔｉｏｎ−ｐｒｉｍｅｄ）マクロファージ活性化プロセスは、主要なマクロフ ァージ活性化カスケードであり（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ，３３：１１５７，１９９６）、これにはＢおよびＴリンパ球ならびに血清ビタ ミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ；ヒトＤＢＰはグループ特異性成分またはＧｃタ ンパク質として知られている）。炎症感作（またはｌｙｓｏ−Ｐｃ処理）Ｂ細胞 の 誘導性β−ガラクトシダーゼ（Ｂｇｌ_i ）およびＴ細胞のＮｅｕ−１シアリダー ゼは、Ｇｃタンパク質をマクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）、すなわちＮ−ア セチルガラクトサミンを残留糖部分として含むタンパク質に変換する（図１ａ） （ＹａｍａｍｏｔｏおよびＨｏｍｍａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ，８８：８５３９，１９９１；ＹａｍａｍｏｔｏおよびＫｕｍａｓｈｉ ｒｏ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２７９４，１９９３；Ｎａｒａｐａｒａ ｊｕおよびＹａｍａｍｏｔｏ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，４３：１４３，１ ９９４；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３３：１１５７，１９ ９６）。このようにＧｃタンパク質はＭＡＦの前駆体である。Ｇｃタンパク質を 固定化β−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと共にインキュベートすると、 明らかに高い力価のＭＡＦ（ＧｃＭＡＦという）が生成する（Ｙａｍａｍｏｔｏ ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３３：１１５７，１９９６；Ｙａｍａｍｏｔｏお よびＫｕｍａｓｈｉｒｏ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２７９４，１９９３ ；ＮａｒａｐａｒａｊｕおよびＹａｍａｍｏｔｏ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ． ，４３：１４３，１９９４；米国特許第５，１７７，００２および５，３２６， ７４９号）。ごく少量（１０ｐｇ／マウス；１００ｎｇ／ヒト）のＧｃＭＡＦを 投与すると、マクロファージの食作用能およびスーパーオキシド発生能が著しく 高まった。 インフルエンザ患者４８人の末梢血単球／マクロファージ(食細胞)を少量(１ ００ｐｇ／ｍｌ)のＧｃＭＡＦで処理すると、すべての患者の食細胞が活性化さ れ、健康人に関する４．０ｎｍｏｌ／分／食細胞１０⁶個より多量のスーパーオ キシドを生成した。末梢血単核細胞（リンパ球と食細胞の混合体）をｌｙｓｏ− Ｐｃ １μｇ／ｍｌで３０分間処理し、Ｇｃタンパク質（１ｎｇ／ｍｌ）または 健康人の血清もしくは血漿（０．１％）を補充した培地中で３時間培養すると、 すべての患者の食細胞が活性化され、４．０ｎｍｏｌ／分／食細胞１０⁶個より 多量のスーパーオキシドを生成した。この結果は、これらの患者のリンパ球がＧ ｃタンパク質をＭＡＦに変換しうることを示す。しかし、ｌｙｓｏ−Ｐｃ処理し たリンパ球および食細胞の混合体を、Ｇｃタンパク質源として患者自身の血清も しくは血漿（０．１％）を補充した培地中で３時間培養した場合は、インフルエ ンザ患者集団の約３５％の患者血清につき食細胞活性が低下し、生成したスーパ ーオキシドは２．５ｎｍｏｌ／分／食細胞１０⁶個未満であった（表１）。しか し電気泳動分析では血清Ｇｃタンパク質の量または分子量のいずれにも検出でき る変化はみられなかった。したがって、患者Ｇｃタンパク質前駆体活性の喪失ま たは低下はＧｃタンパク質の脱グルコシル化によるものである（Ｙａｍａｍｏｔ ｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６：２８２７，１９９６；Ｙａｍａｍｏｔｏ ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７：２９５，１９９７；Ｙａｍａｍｏｔｏら，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏ． ，１１：１３７３，１９９５）。 脱グルコシル化されたＧｃタンパク質はＭＡＦに変換できない（図１ｂ）。した がって、特定のインフルエンザ患者ではマクロファージ活性化が大幅に低下する 可能性がある。食作用および抗原提示のためのマクロファージ活性化が免疫発現 カスケードの第１段階であるので、マクロファージ活性化不能な患者は著しく免 疫抑制され、これが二次感染（すなわち肺炎）の原因となる。 本発明者の先の３つの米国特許第５，１７７，００２、５，３２６，７４９お よび５，６２０，８４６号（それらの開示内容全体が、前記に引用した本発明者 の報文と同様に、参考として本明細書に含まれるものとする）に、マクロファー ジ活性化因子、それらの調製方法、ならびにマクロファージ活性化を必要とする 者においてマクロファージ活性化を誘導する方法、ならびに癌およびエイズ患者 における血清α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの診断用または予後判定用 アッセイが開示されている。 Ｂ．α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの由来 インフルエンザ感染患者の血清はすべてα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダー ゼを含有していた。インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質であるヘマ グルチニン（ＨＡ）がα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性を含むことが 見出された。インフルエンザウイルス感染細胞はこの酵素を組立てられていない ＨＡタンパク質およびそのフラグメントとして血流中へ分泌することができ、そ の結果Ｇｃタンパク質を脱グルコシル化する。脱グルコシル化されたＧｃタンパ ク質はＭＡＦに変換できない。こうしてインフルエンザ患者ではマクロファージ 活性化が起きないことにより免疫抑制が生じ、これが二次感染（すなわち肺炎） の原因となる場合が多い。インフルエンザ患者の血清α−Ｎ−アセチルガラクト サミニダーゼはウイルスによりコードされる生成物であり、ＨＡタンパク質上に あることが見出されたので、患者血流中のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダー ゼ活性はウイルス負荷を示すものであって、これらのインフルエンザ患者の診断 および予後判定のための指標として利用できると思われる。 発明の記述 Ａ．診断および予後判定におけるインフルエンザ患者血流中のα−Ｎ−アセチル ガラクトサミニダーゼ活性の有用性 １．インフルエンザ患者血流中のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを検出 するためのアッセイプロトコール ｉ）概要の説明 インフルエンザ患者血流中の血清Ｇｃタンパク質脱グルコシル化酵素、α−Ｎ −アセチルガラクトサミニダーゼの検出法 段階Ｉ．血漿または血清の段階的３０％および７０％硫酸アンモニウム沈殿： 血漿／血清（１ｍｌ）＋３０％飽和硫酸アンモニウム、次いで７０％飽和硫酸 アンモニウム 同緩衝液に対し４℃で一夜透析 透析物を１ｍｌの容量に調整した。 段階ＩＩ．α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの酵素アッセイ 反応混合物：透析試料２５０μｌ ＋ 基質としてｐ−ニトロフェニルＮ−ア セチル−α−Ｄ−ガラクトサミニド５μｍｏｌを含有する５０ｍＭクエン酸リン 酸緩衝液（ｐＨ６．０）２５０ｍｌ インキュベーション時間：６０分、１０％ＴＣＡ ２００μｌの添加により停 止。反応混合物の遠心分離後、０．５Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃ ３００μｌを上清に添加 した。 活性測定：解離したｐ−ニトロフェノールの量を表す吸光度を、４２０ｎｍで ベックマンＤＵ６００分光光度計を用いる分光測光法により測定し、比活性単位 ｎｍｏｌ／分／ｍｇとして表した。タンパク質濃度をブラッドフォード法により 測定した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２：２４８，１ ９７６）。 ｉｉ）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの酵素アッセイ法の説明 患者の血漿／血清（０．３ｍｌ）を７０％飽和硫酸アンモニウムで沈殿させた 。硫酸アンモニウム沈殿を５０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解 し、同緩衝液に対し４℃で透析した。透析物の容量を１ｍｌに調整した。硫酸ア ンモニウム沈殿により、酵素が生成物阻害物質からも分離される。基質溶液（２ ５０μｌ）は、５０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中にｐ−ニトロフ ェニルＮ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニド５μｍｏｌを含有していた。透 析試料２５０μｌの添加により反応を開始し、３７℃に６０分間保持し、１０％ ＴＣＡ ２００μｌの添加により停止した。反応混合物の遠心分離後、０．５Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃溶液３００μｌを上清に添加した。解離したｐ−ニトロフェノール の量を、４２０ｎｍでベックマンＤＵ６００分光光度計を用いる分光測光法によ り測定し、比活性単位ｎｍｏｌ／分／ｍｇとして表した。タンパク質濃度をブラ ッドフォード法により推定した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ． ，７２：２４８，１９７６）。 ２．診断および予後判定におけるインフルエンザ患者血清α−Ｎ−アセチルガラ クトサミニダーゼの利用 血清α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性により、感染ウイルス負荷が 評価される。この血清酵素量は組立てられていないウイルスエンベロープ成分と それらの分解生成物（すなわちＨＡ）の全量であり、これはウイルス負荷に比例 するからである。 表１に示すように、患者１２人の血清α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ 活性は、彼らの血清Ｇｃタンパク質のＭＡＦ前駆体活性と反比例関係を示す診断 指標となる。食作用と抗原提示のためのマクロファージ活性化は免疫発現プロセ スの第１段階であるので、マクロファージ活性化が起きないと免疫抑制が生じる 。したがって、患者血流中のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性をイン フルエンザの診断および予後判定の指標として利用できる。 Ｂ．インフルエンザ患者血流中の抗原としてのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニ ダーゼ活性に関する酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法の説明 血清または血漿α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（Ｎａｇ）を抗原（Ｎ ａｇＡｇ）として検出するためのイムノアッセイ法において、抗体サンドイッチ 型ＥＬＩＳＡキットを調製した。 １．抗体の調製。 ウイルスＮａｇ酵素を、孵化鶏卵増殖させたインフルエン ザウイルス溶解物からショ糖濃度勾配遠心により精製し(完全ビリオンを排除)、 動物（ウサギ、ヤギおよびマウス）の免疫化に用いた。α−Ｎ−アセチルガラク トサミニダーゼ（ＮａｇＡｇ）に対するポリクローナル抗体（ヤギおよびウサギ ）およびモノクローナル抗体を調製した。免疫グロブリン画分を、抗血清または モノクローナル腹水から、硫酸アンモニウム(５０％飽和)分画、および１０ｍＭ ＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液）を用いるＤＥ５ ２イオン交換カラム、またはプロテインＡカラムにより精製した。 ２．抗体へのアルカリホスファターゼのコンジュゲーション。 ｐＨ６．８の ０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中におけるモノクローナル抗体５ｍｇ／ｍｌの 溶液を、４℃で一夜透析する。透析抗体０．５ｍｇを１０ｍＭ ＰＢＳ １０ｍ ｌ中のアルカリホスファターゼ（イムノアッセイ用；ベーリンガー・マンハイム 、インディアナ州インディアナポリス）１．５ｍｇに添加する。２５％グルタル アルデヒド８０μｌを添加し、おだやかに混合する。室温に２時間放置する。等 容量（１０ｍｌ）のＰＢＳＬＥ（リシン１００ｍＭおよびエタノールアミン１０ ０ｍＭを含有する１０ｍＭ ＰＢＳ）を添加して反応を停止する。セファデック スＧ２５カラムを用い、ＰＢＳＮ（０．０５Ｍ ＮａＮ₃を含有する１０ｍＭ ＰＢＳ）中で脱塩する。アルカリホスファターゼー抗体コンジュゲート２０ｍｌ を、４０ｍｌのブロッキング用緩衝液（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．０５％ト ゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５％ＢＳＡおよび０． ０５％ＮａＮ₃を含有する０．１７Ｍホウ酸緩衝液）と混合する。滅菌のため、 コンジュゲート６０ｍｌをタンパク質結合性の低いフィルター、ミレックス（Ｍ ｉｌｌｅｘ）ＧＶ ０．４５μｍ（ミリポア社、マサチュセッツ州ベッドフォー ド）でろ過し、４℃に保存する。 ３．抗体被覆マイクロタイタープレートの調製。 マルチチャンネルピペット とティップを用いて、ＰＢＳＮ中２μｇ／ｍｌのポリクローナル抗体またはモノ クローナル抗体溶液５０μｌをマイクロタイタープレートの各ウェル（ミクロウ ェル）に分注する。プレートをプラスチックラップで覆ってシールし、３７℃で ２時間、または室温で一夜インキュベートする。蒸留水を注ぐことにより、抗体 被覆プレートを３回以上すすぐ。各ウェルにブロッキング用緩衝液をボトルから の液流として分配充填し、室温で３０分間インキュベートする。プレートを蒸留 水で３回すすぎ、表側をペーパータオル上にかるくたたきつけることにより残り の液体を除去する。 ４．ＥＬＩＳＡ用抗原（ＮａｇＡｇ）の調製 ａ）標準曲線用標準抗原の調製。 ＥＬＩＳＡ用標準抗原曲線を作成するた めに、１．３０〜４．５０ｎｍｏｌ／分／ｍｇの既知α−Ｎ−アセチルガラクト サミニダーゼ（ＮａｇＡｇ）活性を含む数例の患者血清を選んだ。三重アッセイ のため、標準ＮａｇＡｇ（既知の酵素活性）のＰＢＳＮ中１０倍希釈液５０μｌ ずつ３つを抗体被覆ウェル３つに装入した。室温で２時間のインキュベーション 後、ウェルプレートを蒸留水で３回すすぎ、ブロッキング用緩衝液を充填し、室 温で１０分間インキュベートした。水ですすいだ後、インフルエンザ−ＮａｇＡ ｇ特異性モノクローナル抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲート（３００ ｎｇ／ｍｌ）５０μｌずつを添加し、室温で２時間インキュベートした。プレー トを水で洗浄した後、リン酸ｐ−ニトロフェニル（ＮＰＰ）基質溶液（４μｍｏ ｌ／ｍｌ）７５μｌを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ア ルカリホスファターゼ活性は溶液の色を変化させる。色濃度（吸光度）はＮａｇ Ａｇの量に関連する。プレートを４０５ｎｍのフィルター付きマイクロタイター プレート読取器で読み取る。 ｂ）被験試料。 インフルエンザ患者の血清または血漿を検査する。三重ア ッセイのため、被験ＮａｇＡｇ（酵素活性が未知の患者血漿）のＰＢＳＮ中１０ 倍希釈液５０μｌずつ３つを抗体被覆ウェル３つに装入した。インフルエンザ酵 素特異性モノクローナル抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲート（３００ ｎｇ／ｍｌ）を用いて、前記方法に従って吸光度を測定した。 ５．ＥＬＩＳＡ 既知の酵素活性をもつ数例のインフルエンザ患者血清により、ＥＬＩＳＡのた めの標準曲線を作成した。図２に示すように、ＮａｇＡｇ濃度を酵素活性として 表してｘ軸上にプロットし、アルカリホスファターゼ活性の吸光度（色濃度）を ｙ軸上にプロットした。被験患者血漿試料の吸光度を補間して、α−Ｎ−アセチ ルガラクトサミニダーゼ活性を判定した。表２にインフルエンザ患者１４人の血 清酵素活性を例示する。 表１．急性インフルエンザ患者の血流中に検出されたＧｃタンパク質前駆体活性 およびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性 健康人におけるこの酵素活性はα−ガラクトシダーゼであることが認められた 。 表２．ＥＬＩＳＡにより測定したインフルエンザウイルス感染患者の血清α−Ｎ −アセチルガラクトサミニダーゼ活性 引用した参考文献 以下の参考文献を引用する。これらは、本明細書中で前記に述べたすべての参 考文献と同様に、それらの全体が本明細書に含まれるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．インフルエンザをスクリーニングするために、血漿または血清中のα−Ｎ −アセチルガラクトサミニダーゼを検出する方法であって： ａ）インフルエンザウイルスα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼに対する ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用意し； ｂ）これらの抗体で被覆したマイクロタイタープレートを用意し； ｃ）血清または血漿をマイクロタイタープレートに添加し； ｄ）インフルエンザウイルスα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼと反応性 である、アルカリホスファターゼー抗体コンジュゲートをマイクロタイタープレ ートに供給し； ｅ）リン酸ｐ−ニトロフェニルをマイクロタイタープレートに供給し；そして ｆ）工程（ａ）〜（ｅ）の結果として起きる反応を標準曲線と比較して、正常 な個体と比較したインフルエンザウイルスα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダー ゼ量を判定する 工程を含む方法。 ２．血漿または血清中のインフルエンザウイルスα−Ｎ−アセチルガラクトサ ミニダーゼを検出することによりインフルエンザ感染をスクリーニングするため の抗体サンドイッチ型ＥＬＩＳＡキットであって： ａ）インフルエンザウイルスα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼに特異的 なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体で被覆した、マイクロタイター プレート； ｂ）インフルエンザウイルスα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼと反応性 である、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体−アルカリホスファター ゼコンジュゲート； ｃ）リン酸ｐ−ニトロフェニル；および ｄ）抗原標準としてのインフルエンザウイルスα−Ｎ−アセチルガラクトサミ ニダーゼ を含むキット。 ３．インフルエンザウイルス感染患者およびインフルエンザウイルスに感染し ていると疑われる者の血清または血漿中のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダー ゼ活性を測定する方法であって、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性を 含む血清または血漿を硫酸アンモニウム沈殿させて沈殿を生じさせ、次いでこの 沈殿をクエン酸リン酸緩衝液で透析し、次いで沈殿をｐ−ニトロフェニル−Ｎ− アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニドと共にインキュベートする工程を含む方法 。 ４．インフルエンザウイルス感染患者およびインフルエンザウイルスに感染し ていると疑われる者の血清または血漿中の抗原としてのα−Ｎ−アセチルガラク トサミニダーゼ活性を測定するための酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬ ＩＳＡ）法であって、インフルエンザα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼに 対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、α−Ｎ−アセチルガラク トサミニダーゼ（抗原として）を含む血清または血漿、抗体捕獲したマイクロタ イタープレート、およびアルカリホスファターゼー抗体コンジュゲートを用意し 、そしてマイクロタイタープレートを、血清または血漿、アルカリホスファター ゼー抗体コンジュゲート、および基質としてのリン酸ｐ−ニトロフェニルと共に 段階的にインキュベートすることにより抗体サンドイッチ型ＥＬＩＳＡアッセイ を行う工程を含む方法。 ５．インフルエンザに対する抗体サンドイッチ型ＥＬＩＳＡキットであって、 下記の構成要素： ａ）インフルエンザウイルスα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼに特異的 なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体で被覆した、マイクロタイター プレート； ｂ）標準曲線用の１．３０〜４．５０ｎｍｏｌ／分／ｍｇの既知α−Ｎ−アセ チルガラクトサミニダーゼ活性を含む血清； ｃ）被験抗原としてのインフルエンザウイルス感染患者血清／血漿（１０μｌ ）；および ｄ）モノクローナル抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲート を含むキット。