BRPI0822510B1 - MÉTODO DE PREPARAÇÃO E USO DE PROTEÍNAS DE LISE DE CÉLULAS VERO, E KIT DE ENSAIO PARA A DETERMINAÇÃO DE HCPs DE CÉLULAS VERO - Google Patents
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Abstract
PROTEÍNAS DE LISE DE CÉLULAS VERO, MÉTODO DE SUA PREPARAÇÃO E KIT DE ENSAIO PARA A DETERMINAÇÃO DE HCPs DE CÉLULAS VERO COMPREENDENDO-AS. A presente invenção proteínas de lise de células Vero e um método de sua preparação compreendendo as seguintes etapas; cultura e colheita de células Vero; disrupção e lise de células Vero; purificação de proteínas de lise de células Vero; e concentração para obter as proteínas de lise de células Vero. As proteínas de lise de células Vero preparadas de acordo com o método da presente invenção possuem uma ampla faixa de aplicações. Elas podem ser empregadas no controle de qualidade e análise durante a preparação de vacinas usando as células Vero, com alta sensibilidade e boa capacidade de repetição. A presente invenção também fornece um kit de teste de HCPs de células Vero, que possui forte especificidade, alta sensibilidade e boa capacidade de repetição. Pode ser empregado no controle de qualidade e análise durante a preparação de não apenas vacinas virais não secretadas contra vírus tais como o vírus da hepatite A, mas também outras vacinas produzidas usando células Vero.
Description
[0001] A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia, particularmente para as proteínas de lise de células Vero, um método de sua preparação e um kit de ensaio para determinação de HCPs de células Vero utilizando-as.
[0002] A célula Vero (célula renal de macaco verde Africano) é um substrato ideal para a produção de vacinas. Ela possui um fundo genético bem definido e um cariótipo estável, é livre de contaminação por agentes exógenos e adequada para o cultivo e produção em grande escala utilizando biorreatores, o que garante a homogeneidade e segurança na produção em massa de vacinas. Ao longo dos anos, uma variedade de vacinas produzidas usando células Vero tem sido desenvolvida e aprovada com êxito para venda no mercado no mundo, incluindo a vacina antirrábica purificada para uso humano. Vacina contra Poliomielite Inativada (Purificada) (IPV), Vacina contra a Encefalite B Japonesa (Inativada) (JE). A produção de vacinas usando células Vero pode ser realizada de duas maneiras. A primeira maneira é pelo cultivo de um vírus secretor, em que o vírus após a conclusão da replicação é secretado no meio de cultura extracelular. Durante o cultivo do vírus secretor, o vírus causará danos à estrutura das células hospedeiras de modo a utilizar o ambiente celular para a replicação viral, o que resultará na morte celular e ruptura celular, seguido pela liberação de grandes quantidades de proteínas estruturais da célula hospedeira no meio de cultura. Enquanto isso, em resposta à necessidade do crescimento e propagação da célula, as células Vero liberarão grandes quantidades de fatores do crescimento celular no meio de cultura durante o seu crescimento e propagação. A segunda maneira é pelo cultivo de um vírus não secretor, em que o vírus é cultivado dentro das células hospedeiras e permanecerá dentro das células hospedeiras assim que a replicação viral for concluída. Durante o cultivo de um vírus não secretor, tal como vírus da hepatite A ou similar nas células hospedeiras, a replicação viral não causará alterações patológicas para as células hospedeiras. Portanto, as células necessitam ser rompidas para a liberação do vírus mediante o uso de métodos físicos ou químicos. Na solução de vírus colhido, além dos fatores de crescimento celular liberados durante o crescimento e propagação da célula, existem grandes quantidades de proteínas de lise celular decorrente do rompimento das células que são mais complexas nos componentes.
[0003] Anos de aplicação clínica têm demonstrado a segurança e eficácia da célula Vero como um substrato para a produção de vacinas. Por outro lado, no entanto, não se pode descartar o risco da capacidade tumorigênese teoricamente potencial das vacinas produzidas a partir das células Vero. Existem duas medidas para controlar tal risco: uma é através do controle da passagem de células Vero em 130 a 150 gerações, e a outra é através da redução dos conteúdos de DNA residual e proteína residual de células Vero. Como não há ainda nenhum meio de detecção específica para as proteínas de células Vero no mundo, o controle de qualidade ainda é indiretamente conduzido em termos do teor total de proteínas da vacina. (Gao Enming et al., Consideration on the Residual Substances in Vero Cell Vaccines, Center for Drug Evaluation, the State Food and Drug Administration of China, 12 de Janeiro, 2007). Sob tal circunstância, certos componentes nas proteínas de células hospedeiras residuais (HCPs) podem se tornar os alérgenos na vacina. Em 1998, a World Health Organization (WHO) formulou "Protocol for Production of Biologics Using Animal Cells as Cell Substrate", exigindo que o teor de HCP na linhagem celular contínua fosse reduzido para um nível aceitável. Isto indicou que a WHO começou a se preocupar com o teor de HCP e seu impacto sobre a segurança da vacina.
[0004] Tian Bo e Ding Zhifen relataram um método para a determinação quantitativa de HCPs de células Vero em vacinas (Tian Bo, Ding Zhifen, Chinese Journal of Biologics, 2005, 18(2): 159-161, 164). Wang Hui et.al., também relataram um ensaio para as proteínas residuais de células Vero nas preparações de vacina (Wang Hui, Zhang Yuelan, Guo Qinyuan et. al., Chinese Journal of Biologies, 2007, 20(2): 937-939, 947). No entanto, os métodos de determinação para as proteínas residuais de células Vero descritos nas publicações acima são dedicados à detecção de proteínas hospedeiras residuais nas vacinas preparadas a partir da cultura de vírus secretor unicamente, e não são adequadas para a detecção das proteínas hospedeiras residuais nas vacinas preparadas a partir da cultura de vírus não secretor. Portanto, existem ainda defeitos nos métodos para a detecção de HCPs de células vero nas vacinas conforme descrito nas publicações acima.
[0005] Atualmente, nenhum kit de ensaio para detectar o teor residual de HCPs de células Vero está ainda disponível comercialmente no mundo, a principal razão para isso sendo o fato de que vários dos materiais necessários para a determinação do teor residual de HCP são difíceis de preparar. Um dos materiais é as proteínas de lise de células Vero, que podem ser usadas como imunógeno para imunizar os animais que produzem anticorpos que podem ser utilizados nas reações de ensaio subsequentes, e que podem servir como um padrão de ensaio durante a determinação.
[0006] É um objetivo da presente invenção fornecer proteínas de lise de células Vero e método de sua preparação. As proteínas podem ser usadas como um padrão e um antígeno no ensaio para HCPs de células Vero para detectar o teor residual de HCPs de células Vero, durante a produção de vacina e controle de qualidade.
[0007] É um outro objetivo da presente invenção fornecer um kit de ensaio para determinação compreendendo proteínas de lise de células Vero, com o objetivo de superar os defeitos associados com os métodos de determinação da técnica anterior para HCPs de células Vero.
[0008] De modo a alcançar os objetivos acima, em um aspecto, a presente invenção fornece um método de preparação de proteínas de lise de células Vero, compreendendo:
- a) cultura e colheita de células Vero;
- b) disrupção de células Vero e lise;
- c) purificação de proteínas de lise de células Vero; e
- d) concentração para obter proteínas de lise de células Vero.
[0009] Cultura e colheita de células Vero: A célula Vero utilizada é uma linhagem celular contínua de células do rim de macaco que é aceito e aprovado para utilização na produção de vacinas, em que ditas vacinas para uso humano incluem vacina anti-rábica purificada para uso humano, vacina inativada contra poliomielite (IPV), vacina inativada contra encefalite B (JE), vacina inativada contra hepatite A (HAV). Os processos para a produção das vacinas ditas acima são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, o processo para a produção de vacina inativada contra a hepatite A (HAV) utilizando células Vero é descrito na patente Chinesa ZL 0210685.9.
[00010] As células Vero utilizadas na presente invenção podem ser preparadas pela extração de acordo com os métodos descritos na literatura, por exemplo, os métodos descritos na patente Chinesa ZL 0210685.9; ou podem ser facilmente disponíveis, por exemplo, de ATCC (ATCC Series: CCL-81). Conforme descrito no Kistner et al., (Vaccine. 1998, 16: 960-968) ou na WO 96/15231, a célula Vero é adaptada ao crescimento em meio de cultura com soro, sem soro e sem soro e proteínas. Tanto o cultivo de células Vero quanto os respectivos reagentes são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica, tal como descrito na Patente US n° 4.783.407 e WO 2003/049767. Para o crescimento em meio de cultura sem soro, meio mínimo DMEM HAM’s F12 suplementado com sais inorgânicos, aminoácidos, bicarbonato de sódio (2 g/l) e levedura ou extrato de soja (1 a 10 g/l) ou outras soluções são utilizadas.
[00011] Disrupção de células Vero e lise: O produto de proteínas de lise de células Vero de acordo com a presente invenção pode ser obtido mediante a condução da disrupção celular e lise através de meios químicos (tais como solventes orgânicos), enzimáticos (tais como lisozima e EDTA), mecânicos ou físicos (tais como a homogeneização, vibração de ultra-som, homogeneização de alta pressão, agitação por fricção). A separação dos produtos intracelulares também inclui a combinação de meios mecânicos e não mecânicos. Os métodos preferidos para a condução da disrupção celular e lise incluem a lise química, disrupção osmótico, congelamento e descongelamento repetidos, lise enzimática das células, disrupção de ultra-som e lise mecânica das células, com a disrupção de ultra-som sendo mais preferível.
[00012] Purificação: uma variedade de métodos pode ser usada para purificar os produtos extracelulares (em meio de cultura celular) ou produtos intracelulares (lisato) para facilitar a purificação do produto ou remoção de contaminantes indesejados. Um método é a separação da fase sólida-líquida (tal como a centrifugação/precipitação, extração e filtração). Outro método é a concentração (tal como a evaporação, ultrafiltração, adsorção e sedimentação). Mais outro método é a cromatografia (tal como a cromatografia de exclusão molecular, cromatografia de troca iônica, cromatofocalização, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de quelação de íons metálicos, e cromatografia covalente). Estas técnicas podem ser facilmente realizadas por aqueles versados na técnica. Se necessário, técnicas de esterilização podem ser empregadas, tais como a filtragem ou aquecimento ou irradiação (para mais informações sobre purificação de proteínas, ver Ratledge C, Kristlansen B (2001) Basic biotechnology, 2a ed. Cambridge University Press, Cambridge, U.K.).
[00013] Em uma forma de realização, dita purificação inclui a pré-purificação e etapas de purificação fina. Os métodos de pré-purificação incluem precipitação de ponto isoelétrico, precipitação de sal e extração de solvente orgânico, com a extração de solvente orgânico sendo preferível. A purificação fina é alcançada pela cromatografia, incluindo a cromatografia de exclusão molecular, cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de quelação de íons metálicos, e cromatografia covalente.
[00014] Em uma forma de realização da pré-purificação, a etapa de pré-purificação envolve a adição da solução celular obtida após a disrupção em um volume igual de triclorometano, agitação da mistura durante 20 a 30 minutos, centrifugação da mistura a 4000 rpm em 2 a 8 °C durante 20 a 25 minutos, e extração da fase aquosa superior contendo proteínas.
[00015] Em uma modalidade preferida de pré-purificação, a etapa de pré-purificação envolve a adição da solução celular obtida após a disrupção em um volume igual de triclorometano, agitação da mistura durante 20 minutos, centrifugação da mistura a 4000 rpm em 2 a 8 °C durante 20 minutos, e extração da fase superior aquosa contendo proteínas.
[00016] Em uma modalidade de purificação fina, a etapa de purificação fina envolve submeter a amostra obtida após a pré-purificação à ultrafiltração de membrana, purificação de cromatografia hidrofóbica e cromatografia de exclusão molecular e coletar a proteína desejada de interesse. Dita proteína de interesse possui a mesma faixa de picos de proteína coletados como os picos coletados de vírus e seus componentes no processo de produção de vacina. Um exemplo não limitativo de dito vírus e seus componentes, é o vírus da hepatite A e seus componentes.
[00017] Nas modalidades preferidas, dita purificação através da cromatografia hidrofóbica é a purificação hidrofóbico de Phenyl Sepharose 6FF realizada como se segue: a amostra é carregada em um tampão de carga com uma velocidade de 30 a 60 cm/h, depois a coluna é enxaguada com 3 CVs (volume de coluna) de 1,0 mol/l de solução de PB (pH 6,0 a 7,5), seguido pela eluição linear com 5 CVs de 0,02 mol/l de solução de PB (pH 6,0 a 7,5), e finalmente as frações de eluição tendo uma condutividade abaixo de 48 mS/cm são coletadas. Dita cromatografia de exclusão molecular é a cromatografia em gel de exclusão molecular Sepharose 4 Fast Flow em que a eluição é conduzida usando 0,01 mol/l de solução de PBS (pH 7,4) em uma velocidade de fluxo de 45 cm/h, e o segundo pico de eluição é coletado.
[00018] Em outro aspecto, a presente invenção fornece as proteínas de lise de células Vero preparadas pelo dito método acima.
[00019] As proteínas de lise de células Vero de acordo com a presente invenção são misturas de proteínas tendo pesos moleculares nas seguintes faixas: 11 KD, 17 a 34 KD, 55 KD e 72 KD a 170 KD.
[00020] As proteínas de lise de células Vero de acordo com a presente invenção podem ser usadas para a preparação de um reagente de detecção para as HCPs de células Vero. As proteínas podem ser usadas como um imunógeno para estabelecer o método de determinação para HCPs de células Vero como um padrão do ensaio de detecção.
[00021] As proteínas de lise de células Vero de acordo com a presente invenção podem ser usadas como antígenos para preparar os anticorpos correspondentes. Estes anticorpos, que são anticorpos policlonais, possuem a capacidade de se ligar especificamente às proteínas de lise de células Vero. Exemplos não limitativos dos anticorpos são proteínas antilise de coelho de células Vero IgG e proteínas antilise de porquinho da índia de células Vero IgG.
[00022] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um kit de teste de HCPs de células Vero compreendendo uma fase sólida, anticorpos na fase sólida, anticorpos conjugados com ligante e um padrão de proteína, caracterizado pelo fato de que ditos anticorpos são anticorpos contra as proteínas de lise de células Vero de acordo com a presente invenção, e dita proteína padrão é as proteínas de lise de células Vero de acordo com a presente invenção.
[00023] Em uma modalidade preferida, o kit de teste de HCPs de células Vero de acordo com a presente invenção ainda compreende anticorpos modificados por biotina e avidina conjugada com ligante.
[00024] Em uma outra modalidade preferida, o kit de teste de HCPs de células Vero de acordo com a presente invenção ainda compreende os anticorpos modificados com 2,4-dinitrofenol e anti-2,4-dinitrofenol conjugado com ligante.
[00025] O kit de teste de acordo com a presente invenção pode compreender, se desejável, reagentes para a detecção da avidina conjugada com ligante referida acima (ou rotulada) ou anti-2,4-dinitrofenol conjugado com ligante (ou rotulado).
[00026] Proteína-padrão:
[00027] As proteínas de lise de células Vero de acordo com a presente invenção, obtidas de acordo com o método de preparação acima, são fornecidas no kit de teste de acordo com a presente invenção de um proteína-padrão para uso na determinação do teor residual de HCPs de células Vero no processo de produção de vacina e controle de qualidade.
[00028] Anticorpos:
[00029] Como aqui utilizado, "anticorpos contra proteínas de lise de células Vero" refere-se aos anticorpos preparados mediante o uso das proteínas de lise acima referidas de células Vero como antígenos. Estes anticorpos, que são anticorpos policlonais, possuem a capacidade de se ligar especificamente às proteínas de lise de células Vero. Exemplos não limitativos dos anticorpos são proteínas antilise de coelho de células Vero IgG e proteínas antilise de porquinho da índia de células Vero IgG.
[00030] Os anticorpos contra as proteínas de lise de células Vero podem ser preparados usando as proteínas de lise de células Vero como antígenos, usando os métodos convencionais conhecidos na técnica para obter os anticorpos correspondentes.
[00031] Por exemplo, as proteínas antilise de coelho de células Vero IgG ou as proteínas antilise de porquinho da índia de células Vero IgG podem ser preparadas pelas seguintes etapas:
1) imunizar o coelho ou porquinho da índia quatro vezes com proteínas de lise de células Vero de acordo com a presente invenção seguido pela coleta de sangue, em que:
para o coelho, tal como tendo um peso corporal de 2 kg, a primeira imunização é feita em uma dose de 0,5 mg de proteínas/coelho, seguido pela segunda imunização 4 semanas mais tarde em uma dose de 0,5 mg de proteínas/coelho, seguido pela terceira imunização 10 dias mais tarde da mesma maneira, e finalmente seguido pela quarta imunização 2 semanas após a terceira imunização, e então 1 semana depois o sangue é coletado;
para o porquinho da índia, tal como tendo um peso corporal de 250 g, a primeira imunização é feita em uma dose de 0,2 mg de proteínas/porquinho da índia, seguido pela segunda imunização duas semanas mais tarde em uma dose de 0,4 mg de proteínas/porquinho da índia, seguido pela terceira imunização 10 dias mais tarde da mesma maneira, e finalmente seguido pela quarta imunização 2 semanas após a terceira imunização, e então 1 semana depois o sangue é coletado;
2) selecionar o antissoro com título mais elevado respectivamente dos dois animais e submeter o antissoro à purificação;
3) detectar o título após a purificação.
1) imunizar o coelho ou porquinho da índia quatro vezes com proteínas de lise de células Vero de acordo com a presente invenção seguido pela coleta de sangue, em que:
para o coelho, tal como tendo um peso corporal de 2 kg, a primeira imunização é feita em uma dose de 0,5 mg de proteínas/coelho, seguido pela segunda imunização 4 semanas mais tarde em uma dose de 0,5 mg de proteínas/coelho, seguido pela terceira imunização 10 dias mais tarde da mesma maneira, e finalmente seguido pela quarta imunização 2 semanas após a terceira imunização, e então 1 semana depois o sangue é coletado;
para o porquinho da índia, tal como tendo um peso corporal de 250 g, a primeira imunização é feita em uma dose de 0,2 mg de proteínas/porquinho da índia, seguido pela segunda imunização duas semanas mais tarde em uma dose de 0,4 mg de proteínas/porquinho da índia, seguido pela terceira imunização 10 dias mais tarde da mesma maneira, e finalmente seguido pela quarta imunização 2 semanas após a terceira imunização, e então 1 semana depois o sangue é coletado;
2) selecionar o antissoro com título mais elevado respectivamente dos dois animais e submeter o antissoro à purificação;
3) detectar o título após a purificação.
[00032] A purificação de IgG pode ser feita pela precipitação de sais de sulfato de amônio, método de ácido caprílico-sulfato de amônio, cromatografia de coluna por afinidade de Proteína A ou coisa parecida.
[00033] Na presente invenção, "título" é apresentado como o título final, isto é, a diluição máxima do soro em que os anticorpos positivos podem ser detectados.
[00034] Anticorpos conjugados por ligante (ou anticorpos rotulados):
[00035] Como é bem-conhecido por aqueles versados na técnica, os anticorpos purificados podem ser quantificados por serem rotulados (ou conjugados) com a enzima (tal como com peroxidase, β-D-galactosidase, fosfatase alcalina e desidrogenase de glicose-6-fosfato ou similar), rotulados (ou conjugados) com fluorescência ou isótopo radioativo, e tais anticorpos são referidos como "anticorpos conjugados por ligante" ou "anticorpos rotulados". Se os anticorpos forem rotulados com uma enzima, quando a enzima reage na presença de um substrato adequado, o produto da reação enzimática pode ser usado como o rótulo para quantitativa ou qualitativamente detectar os antígenos aos quais os anticorpos especificamente se ligam. Da mesma forma, quando se usa anticorpos rotulados com fluorescência ou rotulados com isótopo radioativo, a fluorescência ou radioatividade pode ser usada como o rótulo para quantitativa ou qualitativamente detectar os antígenos aos quais os anticorpos especificamente se ligam.
[00036] Os "anticorpos conjugados por ligante" ou "anticorpos rotulados" incluem aqueles anticorpos modificados com biotina, 2,4-dinitrofenol ou coisa parecida. A biotina é especificamente ligada por avidina, enquanto 2,4-dinitrofenol é especificamente ligado por anti-2,4-dinitrofenol. Portanto, os anticorpos rotulados acima referidos podem ser quantitativa ou qualitativamente detectados utilizando avidina rotulada com enzima, nuclídeo ou fluoresceína ou anti-2,4-dinitrofenol.
[00037] Os anticorpos rotulados acima referidos podem ser preparados pela reação de um reagente rotulado com biotina (NHS-LC-Biotin, Pierce Co., Ltd) e/ou peroxidase que carrega um agente de acoplamento (Maleimide activated HRP, Pierce Co., Ltd), com os anticorpos.
[00038] Em algumas formas de realização do kit de teste de HCPs de células Vero de acordo com a presente invenção, os rótulos em ditos anticorpos conjugados com ligante incluem, mas não limitado a estes, enzimas, nuclídeos e fluoresceínas. As enzimas são selecionadas, sem limitação, a partir de peroxidase, β-D-galactosidase, fosfatase alcalina e desidrogenase de glicose-6-fosfato; os nuclídeos são selecionados, sem limitação, de 3H, 188Re, 131I, e as fluoresceínas são selecionadas, sem limitação, de isotiocianato de fluoresceína, tetraetil rodamina, isotiocianato de tetrametil rodamina, quelatos de lantanídeo trivalentes tais como o európio (Eu3+), térbio (Tb3+) e cério (Ce3+) ou similares.
[00039] Quando o rótulo for uma enzima, o kit de acordo com a presente invenção ainda compreende reagentes auxiliares, incluindo uma solução de substrato, uma solução cromogênica, uma solução de parada da reação e uma solução tampão de lavagem para a reação enzimática.
[00040] Um reagente auxiliar exemplar possui a seguinte composição:
- 1. solução de substrato: 3 % de H2O2 preparado em tampão de fosfato-citrato (pH 5,0);
- 2. solução cromogênica: 0,0004 mol/l TMB em metanol ou 0,0013 mol/l de solução de cloridrato de TMB;
- 3. solução de parada da reação: 2 mol/l de ácido sulfúrico;
- 4. solução tampão de lavagem: solução de PBS.
[00041] Fase sólida:
[00042] Como aqui usado, "fase sólida" refere-se a qualquer substrato sólido sobre o qual um múltiplo de amostras líquidas pode ser separadamente analisado utilizando o método de acordo com a presente invenção, tal como uma placa de teste ELISA, um veículo de microplaqueta de proteína, por exemplo, uma membrana, uma lâmina de vidro, etc. Quando aqui usado, um "reservatório de reação" de uma fase sólida se refere ao limite na fase sólida que serve como uma área de recepção da amostra. Os reservatórios de reação em uma fase sólida típica são obtidos mediante a formação de reentrâncias sobre a superfície de uma placa, cada uma das reentrâncias sendo suficiente para receber e manter o volume de uma amostra e os volumes dos tampões ou soluções de lavagem adicionadas em qualquer etapa durante a determinação. Como aqui usado, a "medida" de uma molécula alvo refere-se à determinação, quantificação ou determinação do teor de uma molécula análito ou alvo.
[00043] O kit de teste de HCPs de células Vero fornecido pela presente invenção pode ser eficazmente usado para detectar o teor residual de HCPs de células Vero com as seguintes etapas: coleta de uma amostra; execução da determinação usando o kit de teste de HCPs de células Vero acima referido; e análise do resultado.
[00044] Meios de determinação:
[00045] Os anticorpos são os reagentes essenciais em muitas técnicas de determinação usadas na medicina, medicina veterinária e outros campos. Tais técnicas de determinação incluem as técnicas de ensaio imunológico muito convencionalmente utilizadas, tais como ensaios de microplaqueta de proteína, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), imuno-histoquímica (IHC) e imunofluorescência (IF). Para a introdução geral destas técnicas, ver Ausubel et. al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1987. Adicionalmente, o imunoensaio fornece um meio para a visualização do manchamento de imuno-histoquímica (IHC) ou de imunofluorescência (IF) em uma amostra de tecido. Ver "Principles and Practice of Immunoassay", Christopher P. Price and David J. Neoman, Stockton Press, New York, N.Y, 1991.
[00046] Em uma modalidade particular, o meio de análise na presente invenção é o ensaio imunoenzimométrico, em que os anticorpos policlonais contra uma forma molecular particular de proteínas de lise de células Vero a serem determinados são utilizados para detectar o teor de proteínas de lise total (não complexadas acrescidas de anticorpos complexos) ou livre (não complexas) de células Vero em uma amostra de vacina, por exemplo. Um exemplo não limitativo do ensaio imunoenzimétrico é executado como se segue:
- 1. Revestimento de placa: a superfície dos reservatórios de reação de uma placa de ensaio é recoberta com anticorpos contra as proteínas de lise de células Vero em uma concentração ideal. A concentração ideal de anticorpos é determinada a partir de uma curva padrão traçada em gráfico usando concentrações conhecidas de proteínas de lise de células Vero, a curva tendo a sensibilidade e precisão desejadas na faixa requerida de concentrações eficazes. Para proteínas de lise de células Vero, a faixa de concentrações eficazes de proteínas de lise de células Vero que pode ser detectada pelo kit de teste de acordo com a presente invenção é de 62,5 ng/ml e 4000 ng/ml. Aqueles versados na técnica devem facilmente determinar, sem experimentação indevida, se a sensibilidade e precisão adequada são obtidas dentro da faixa requerida.
- 2. Lavagem de placa: a solução de revestimento deve ser decantada, e o tampão de lavagem (cerca de 400 ul/reservatório) é adicionado e depois decantado. Esta etapa de lavagem é repetida várias vezes conforme necessário. O tampão de lavagem pode ser 0,01 mol/l de tampão de fosfato (0,0027 mol/l de cloreto de potássio, 0,137 mol/l de cloreto de sódio, pH 7,4, contendo 0,01% p/v de TritonX-100).
- 3. Bloqueio de placa: o tampão de bloqueio (tampão de revestimento contendo BSA a 1%/Triton X-100 a 0,1%) que compreende proteína e surfactante é adicionado aos reservatórios de reação. A placa pode ser armazenada bloqueada.
- 4. Amostra e padrão de adição: a placa é lavada como descrito acima. Cem (100) μl de cada um do padrão e da amostra a serem determinados é adicionado ao respectivo reservatório de reação da placa, e depois 50 μl de reagente conjugado são adicionados a cada reservatório. A mistura é suavemente misturada durante 15 segundos, seguido pela incubação a 37°C durante 60 minutos. A solução de reação é descartada, e a placa de reação é enxaguada 5 vezes com tampão. Após a remoção da água em excesso, 50 μl de solução cromogênica são adicionados a cada reservatório e a incubação é executada a 37°C durante 15 minutos, em cujo tempo a reação é interrompida. A placa de reação é colocada em um leitor de ELISA e lida com relação a densidade ótica. As reações cromogênicas diferentes em cada um dos reservatórios resultam em diferentes valores de densidade ótica.
- 5. Exemplos de substratos de enzima adequados úteis para a quantificação do desenvolvimento da cor do complexo são: fosfato de nitrofenila para a fosfatase alcalina ou sulfonato de tetrametilbenzidina (TMBS) para a peroxidase de raiz forte. O grau de desenvolvimento da cor pode ser lido nas unidades de absorbância (AU; para o p-nitrofenol, a absorbância é lida em 405 nm, enquanto para o TMBS, a absorbância é lida em 450 nm), que servem como um índice do teor de HCP na amostra determinada. A concentração exata de HCP pode ser obtida através da leitura da absorbância da amostra determinada e referência da curva padrão preparada usando o padrão de HCP.
- 6. Quando os sinais de detecção suficientes forem obtidos durante a leitura, a medição dos sinais é feita utilizando a leitora de ELISA comprimento de onda total ou leitora de ELISA de fluorescência ou similar.
- 7. O processamento de dados é executado através da preparação de uma curva de calibração a partir dos sinais de detecção obtidos usando soluções-padrão de concentrações conhecidas de proteínas de lise de células Vero. A curva de calibração é utilizada para o cálculo para se obter a concentração de proteínas de lise de células Vero na amostra determinada.
[00047] Efeitos benéficos
[00048] A presente invenção fornece proteínas de lise de células Vero e seu método de preparação. As proteínas podem ser usadas como um imunógeno para estabelecer o método de determinação para as HCPs de células Vero e como um padrão do teste de detecção. As proteínas de lise de células Vero de acordo com a presente invenção possuem uma ampla faixa de aplicações. Elas podem ser usadas não só para a produção de vacinas virais não secretoras intracelulares contra os vírus tais como o vírus da hepatite A, mas também ser empregadas no controle de qualidade e análise durante a preparação de outras vacinas de células Vero, com forte especificidade, alta sensibilidade e boa capacidade de reprodução.
[00049] A presente invenção também fornece um kit de teste de HCPs de células Vero correspondente, que possui forte especificidade, alta sensibilidade e boa capacidade de reprodução. Pode ser empregado no controle de qualidade e análise durante a preparação não só das vacinas virais não secretoras contra os vírus tais como o vírus da hepatite A, mas também outras vacinas produzidas a partir das células Vero.
[00050] A figura 1 mostra o fluxograma do método de preparação de proteínas de lise de células Vero.
[00051] A figura 2 mostra o cromatograma da purificação de células Vero no gel hidrofóbico Phenyl Sepharose 6 Fast Flow.
[00052] A figura 3 mostra o cromatograma da purificação de células Vero no gel de exclusão molecular Sepharose 4 Fast Flow.
[00053] A figura 4 mostra o padrão de manchamento com prata SDS-PAGE do padrão de proteínas de lise de células Vero.
[00054] A figura 5 mostra a curva padrão preparada usando ELISA em sanduíche para o padrão de proteínas de lise de células Vero.
[00055] A figura 6 mostra o teste de especificidade do método de determinação de HCPs células Vero de acordo com a presente invenção.
[00056] A presente invenção é ainda ilustrada com referência aos seguintes exemplos específicos. É observado que estes exemplos são apenas ilustrativos da presente invenção em vez de limitativo do escopo da presente invenção. Os procedimentos experimentais nos seguintes exemplos para os quais as condições particulares não são especificadas são geralmente executados em conformidade com as condições convencionais ou as condições recomendadas pelos fabricantes. Proporções e porcentagens são baseadas em peso ou volume, a não ser que de outra maneira particularmente indicada.
[00057] Fontes de materiais:
[00058] Célula semente de trabalho de células Vero: ATCC Series N°: CCL-81.
[00059] Animais Experimentais
[00060] Coelho (classe convencional, peso corporal: 2 kg), da Shanghai Puxin Biological Co., Ltd., Shanghai, China;
[00061] Porquinho da índia (classe limpa, peso corporal: 250 g), da Shangai Laboratory Animal Center, Chinese Academy of Science.
[00062] Principais instrumentos e reagentes:
[00063] Disruptor celular ultrassônico: SONICS VCF1500, potência máxima de saída 1500W; Ultrafiltro: Pellicon 2 Cassette Filter; Biomax-100 A (MWCO = 100 KD) (Millipore Corp); Concentrador de ultrafiltração (MWCO = 100 KD) (Millipore Corp); Cromatógrafo: AKTA Pilot (GE Healthcare Co., Ltd); Coluna cromatográfica: BPG 140/950, ÍNDEX 140/500 (GE Healthcare Co., Ltd); Meio de purificação: gel hidrofóbico tipo Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Co. , Ltd); gel de exclusão molecular tipo Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Co., Ltd), coluna de afinidade Protein-A, peroxidase de raiz forte (HRP) (Sigma Co., Ltd); placa de ELISA (Costar Co., Ltd); leitora de ELISA, tipo Thermo Multiskan MK3; soro bovino, adquirido da Lanzhou Minhai Biotechnology, Co., Ltd., Gansu, China, batelada n° : 051203; Solução de cultura celular: 199 media (GIBCO), albumina de soro bovino (BSA, Fraction V), fabricado pela Calbiochem Co., Ltd e subacondicionado por Yicheng Bioscience Co., Ltd., Shanghai, China; HRP de coelho anticabra, HRP de porquinho da índia anti-cabra, todos adquiridos da KPL Co., Ltd; Ovalbumina (albumina de clara de ovo de galinha), fabricado pela Sigma Co., Ltd; vírus da hepatite A (HAV), cepa do vírus da hepatite A pHM175, 10,81 ug/ml, adquirido da BIODESIGN Internacional; padrão Anti-HAV-IgG, 75 IU/ml, adquirido do National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, China; tripsina, fabricada pela BD Co., Ltd; hidrolisado de lactoalbumina, fabricado pela GIBCO Co., Ltd; Proclin 300, fabricado pela Supelco Co., Ltd; cloridrato de TMB, adquirido da Suzhou BEC Biology Technology Co., Ltd, Jiangsu, China.
[00064] Método de preparação:
- 1. Cultivo e colheita de células: as células de um tubo de cepa de células Vero retiradas do banco de células de trabalho foram inoculadas em um frasco de cultura celular e o 199 media contendo soro fetal bovino a 10 % foi adicionado seguido pela incubação a 37 ± 1 °C. Depois que as células reavivadas crescem em uma monocamada densa, as células Vero obtidas foram digeridas com tripsina para passagem e propagação e incubadas a 37 ± 1 °C durante 25 dias, em cujo tempo as células foram colhidas. As células foram digeridas com tripsina e centrifugadas a 3500 rpm a 4 °C durante 30 minutos. O grânulo de células foi coletado para posterior utilização como fonte para a preparação das amostras de proteínas de lise.
- 2. Disrupção e lise das células: as células Vero colhidas foram submetidas a disrupção e submetidas a lise por sonicação em uma potência de saída de 1400 W, até a ausência da estrutura de célula intacta.
- 3. Extração de proteínas com clorofórmio: A solução celular submetida a disrupção foi adicionada com um volume igual de clorofórmio, e a mistura foi agitada em agitador recíproco em 300 rpm durante 20 minutos tal que o clorofórmio foi colocado em contato pleno com as células. Logo que os fragmentos celulares se estabeleceram, a mistura foi centrifugada em 4000 rpm a 4 °C durante 20 minutos, a fase aquosa superior contendo proteínas foi removida. O copo de centrifugação foi adicionado com um teor igual de 0,01 mol/l de PBS (pH 7,8) e a extração foi repetida 4 vezes.
- 4. Concentração: todas as soluções de extração foram combinadas e submetidas à concentração utilizando uma membrana de ultrafiltração MWCO 100 KD. O concentrado de ultrafiltração foi adicionado com sal tampão PB que foi completamente dissolvido para obter uma concentração final de PB de 1,0 mol/l, pH 6,8.
- 5. Purificação: o concentrado foi adsorvido em gel hidrofóbico tipo Phenyl Sepharose 6 Fast Flow em uma taxa de fluxo de 50 cm/h, depois que a adsorção é concluída, enxágue com 3 CVs de 1,0 mol/l de solução de PB (pH 6,8) e depois eluição linear com 5 CVs de 0,02 mol/l de solução de PB (pH 6,8). As frações de eluição tendo uma condutividade abaixo de 48 mS/cm foram coletadas e submetidas à concentração, utilizando uma membrana de ultrafiltração MWCO 100 KD. O concentrado resultante foi carregado no gel de exclusão molecular tipo Sepharose 4 Fast Flow e eluído com 0,01 mol/l de solução de PBS (pH 7,4) em uma taxa de fluxo de 45 cm/h, e o segundo pico de eluição foi coletado.
- 6. Outra concentração: a solução coletada foi em primeiro lugar concentrada em 200 ml usando uma membrana de ultrafiltração MWCO 100 KD e depois concentrada em 30 ml usando um tubo de centrífuga de ultrafiltração de 50 ml (MWCO = 100 KD), obtendo proteínas de lise específicas de células Vero (padrão de proteínas de lise de células Vero ou HCPs de células Vero).
[00065] Resultados experimentais: a concentração das proteínas de lise de células Vero foi determinada pelo método de Lowry para ser 540 μg/ml. Os dados experimentais relevantes da presente invenção são apresentados na tabela 1 abaixo. 
[00066] Os resultados da eletroforese SDS-PAGE e manchamento de prata são mostrados na figura 4, em que: 1. proteína de peso molecular padrão; 2. proteínas de lise não purificadas de células Vero da etapa 4; 3. proteínas de lise de células Vero. Os resultados mostram que as proteínas de lise de células Vero obtidas após a purificação continham vários componentes de nas faixas de peso molecular de 55 KD, 11 KD, 170 a 72 KD e 34 a 17 KD.
[00067] 1. Imunização de coelhos:
[00068] Três coelhos foram imunizados. A imunização primária foi feita com uma emulsão de 0,5 mg das proteínas de lise de células Vero como preparadas no Exemplo 1, que é totalmente emulsificada em um volume igual de adjuvante completo de Freund mediante a injeção da emulsão por via subcutânea em 6 a 8 locais no dorso de cada coelho. Quatro semanas mais tarde, uma imunização secundária foi feita com uma emulsão de 0,5 mg de proteínas de lise de células Vero como preparadas no Exemplo 1, que é totalmente emulsificada em um volume igual de adjuvante incompleto de Freund mediante a injeção da emulsão por via subcutânea e intramuscular em múltiplos locais. Dez dias após a imunização secundária, uma terceira imunização foi feita da mesma maneira. Finalmente, duas semanas após a terceira imunização, uma quarta imunização foi dada. Uma semana após a quarta imunização, o sangue foi coletado e analisado com relação ao título. 
[00069] 2. Imunização de porquinhos da índia.
[00070] Três porquinhos da índia foram imunizados. A imunização primária foi feita com uma emulsão de 0,2 mg das proteínas de lise de células Vero como preparadas no Exemplo 1, que é totalmente emulsificada em um volume igual de adjuvante completo de Freund mediante a injeção da emulsão por via subcutânea em 5 a 6 locais no dorso de cada porquinho da índia e cada local é injetado com 0,1 ml de emulsão. Duas semanas mais tarde, uma imunização secundária foi feita com uma emulsão de 0,4 mg das proteínas de lise de células Vero como preparadas no Exemplo 1, que é totalmente emulsificada em volume igual de adjuvante incompleto de Freund mediante a injeção da emulsão por via subcutânea em múltiplos locais. Dez dias após a imunização secundária, uma terceira imunização foi feita da mesma maneira.
Finalmente, duas semanas após a terceira imunização, uma quarta imunização foi dada. Uma semana após a quarta imunização, o sangue foi coletado e analisado com relação ao título.
Finalmente, duas semanas após a terceira imunização, uma quarta imunização foi dada. Uma semana após a quarta imunização, o sangue foi coletado e analisado com relação ao título.
[00071] 3. Purificação do antissoro:
[00072] O antissoro com título mais elevado de cada um dos dois animais acima foi respectivamente selecionado para purificação. A cromatografia de afinidade foi executada utilizando uma coluna de afinidade Protein-A Sepharose pré-acondicionada comercialmente disponível, obtendo proteínas de antilise de células Vero IgG. As absorbâncias a 280 nm e 260 nm foram determinadas e a concentração de proteína de anticorpos foi calculada com a seguinte fórmula: C (mg/ml) . 1,45 × OD280nm . 0,74 × OD260nm.
[00073] 4. Determinação do título de anticorpos após a purificação:
[00074] A determinação do título de anticorpos foi executada usando um método ELISA indireto. Particularmente, as proteínas de lise de células Vero como preparadas no Exemplo 1 foram diluídas com tampão de carbonato (0,05 mol/l de CB, pH 9,6) em 10 μg/ml. A placa de microtítulo foi coberta com 100 μΙ da diluição por reservatório e incubada a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, a placa foi lavada duas vezes com PBS. Então a placa foi bloqueada com BSA a 2 % em 125 μl/reservatório e incubada em temperatura ambiente durante 2 horas, seguido pela lavagem por duas vezes com PBS. As IgGs contra proteínas de lise de células Vero obtidas na Etapa 3 acima foram respectivamente diluídas em 1 mg/ml seguido pela diluição em série de 10 vezes, e as diluições foram adicionadas na placa de microtitulação de 100 μl/reservatório. A placa foi incubada a 37 °C durante 60 minutos, lavada e secada por drenagem. Depois cada reservatório foi adicionado com 100 μl de um anticorpo secundário conjugado com a enzima (HRP anticoelho de cabra ou HRP antiporquinho da índia de cabra) e a placa foi incubada a 37 ° C durante 30 minutos, seguido pela lavagem e drenagem para secar. Cada reservatório foi adicionado com soluções de reagente cromogênico A e reagente cromogênico B e a placa foi incubada a 37 °C durante 15 minutos. Dois (2) mol/l de ácido sulfúrico foi adicionado para interromper a reação. O desenvolvimento da cor foi determinado em uma leitora de microplacas e o título de anticorpo foi calculado. 
[00075] As IgGs contra proteínas de lise de células Vero da Etapa 3 acima tendo o título mais elevado (1# IgG de porquinho da índia contra proteínas de lise de células Vero e 2# IgG de coelho contra as proteínas de lise de células Vero) foram separadamente selecionadas e rotuladas com peroxidase de raiz forte (HRP) utilizando o método de periodato de sódio (Luo Jiali et al. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, de 1981, 13:1).
[00076] As proteínas antilise de porquinho da índia de células Vero IgG como preparadas no Exemplo 2 foram diluídas com 0,05 mol/l de CB (pH 9,6) para 50 a 20 μg/ml. Uma placa de microtítulo foi coberta com a diluição em 100 μl/reservatório e incubada a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, a placa foi lavada duas vezes com 0,01 mol/l de PBS (pH 7,4). Depois a placa foi adicionada com 150 μL de BSA-PBS a 2% por reservatório e bloqueada em temperatura ambiente durante 2 horas, seguido pela lavagem de duas vezes com PBS e secada com ar. As diluições em série do padrão de proteínas de lise de células Vero (como preparadas no Exemplo 1, as concentrações apresentadas na tabela 7) foram adicionadas e a placa foi deixada reagir em 37 °C durante 60 minutos. Depois a placa foi lavada quatro vezes e drenada para secar. As proteínas antilise de coelho de anticorpo HRP conjugadas com enzima de células Vero IgG foram diluídas com PBS-T (contendo 10 % de soro fetal bovino e 0,03 % de Proclin 300) (1:500 a 1:1000). A placa foi adicionada com as diluições em 100 μΙ por reservatório e deixada reagir a 37 °C durante 60 minutos seguido pela lavagem de 4 vezes com PBS-T e drenada para secar. Depois a reação de desenvolvimento da cor foi deixada prosseguir a 37°C durante 10 minutos, a reação foi então interrompida e o desenvolvimento da cor foi determinado. Os resultados mostraram que a concentração de revestimento ideal para a placa estava na faixa de 5 a 20 μg/ml. 
[00077] A placa de microtítulo revestidas com as proteínas antilise de porquinho da índia purificadas de células Vero IgG como preparadas conforme o Exemplo 2 (10 mg/mL) foi adicionada com as diluições em série do padrão de proteínas de lise de células Vero (como preparadas no Exemplo 1, as concentrações apresentadas na tabela 8) e deixada reagir a 37 °C durante 60 minutos, lavada 4 vezes e drenadas para secar. As proteínas antilise de coelho de HRP de anticorpo conjugado com enzima de células Vero IgG foram diluídas em relações adequadas de diluição (1:500 a 1:1000) com PBS-T (contendo 10 % de soro fetal bovino e 0,03 % de Proclin 300). Cem (100) μΙ do anticorpo conjugado por enzima diluído foram adicionados em cada reservatório da placa e bem misturados por agitação. A placa foi deixada reagir a 37 °C durante 60 minutos seguido pela lavagem de 4 vezes com PBS-T e drenada para secar. Depois a reação de desenvolvimento da cor foi deixada prosseguir em 37 °C durante 10 minutos, a reação foi então interrompida e o desenvolvimento da cor foi determinado. Os resultados mostraram que as relações ideais de diluição para as proteínas antilise de coelho de HRP de células Vero IgG estavam na faixa de 1:500 a 1:1000. 
[00078] Placa de revestimento: as proteínas antilise de porquinho da índia purificadas de células Vero IgG foram diluídas com 0,05 mol/L de CB (pH 9,6) para 50 a 20 μg/ml. A placa de microtítulo foi coberta com a diluição em 100 μl/reservatório e incubada a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, a placa foi lavada duas vezes com 0,01 mol/l de PBS (pH 7,4). Depois a placa foi adicionada com 150 μL de BSA-PBS a 2% por reservatório e bloqueada em temperatura ambiente durante 2 horas, seguido pela lavagem de duas vezes com PBS e secado com ar. A placa foi selada em um saco fechado em que uma pequena embalagem de dessecante foi anexada, e armazenada a 4 °C para uso posterior.
[00079] Amostra de adição: o padrão de proteínas de lise de células Vero como preparadas no Exemplo 1 foi diluído com PBS-T em 4000 ng/ml, 2000 ng/ml, 1000 ng/ml, 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml e 62,5 ng/ml. Cem (100) μl da respectiva diluição do padrão acima foram adicionados em cada reservatório da placa juntamente com 0,01 mol/l de PBS-T e a amostra a ser detectada. A mistura foi deixada reagir a 37 °C durante 60 min, a placa foi então lavada 4 vezes com PBS-T e drenada para secar.
[00080] Adição de proteínas antilise de coelho de HRP de células Vero IgG: as proteínas antilise de coelho HRP de células Vero IgG como preparadas no exemplo 2 foram diluídas em relações adequadas de diluição (1:500 a 1:1000) com PBS-T (contendo 10 % de soro fetal bovino e 0,03 % de Proclin 300). Cento (100) μl das proteínas antilise de coelho de HRP diluídas de células Vero IgG foram adicionados a cada reservatório da placa e bem misturados por agitação. A placa foi deixada reagir a 37 °C durante 60 minutos seguido pela lavagem de 4 quatro vezes com PBS-T e drenada para secar.
[00081] Desenvolvimento da cor: Cada reservatório foi adicionado com agente cromogênico do substrato A (0,1 mol/l de tampão de acetato-citrato de sódio, que contém 0,0038 mol/l de peroxidase de hidrogênio, 20000 unidades/l de gentamicina, pH 5,0) e agente cromogênico B (0,02 mol/l de tampão Tris-HCl, que contém 0,0005 mol/l di-hidrato de ácido etilenodiaminotetracético dissódico, 0,0013 mol/l de cloridrato de TMB), e a mistura foi deixada reagir a 37 °C durante 10 minutos.
[00082] Determinação do desenvolvimento da cor: cada reservatório foi adicionado com 50 μΙ de solução de interrupção (2 mol/l de H2SO4) e bem misturado por agitação. O valor OD de cada reservatório foi lido em uma leitora de ELISA em 450 nm.
[00083] Cálculo: uma curva-padrão foi preparada pela subtração do valor OD de 0 ng/ml do padrão (isto é, solução de diluição de amostra: 0,01 mol/l de PBS-T) a partir dos valores OD de diferentes concentrações do padrão e da amostra (anulação zero). As equações de regressão linear e os valores de R2 são mostrados. O teor de HCPs de células Vero na amostra foi calculado com base na curva-padrão.
[00084] O padrão de proteínas de lise de células Vero como preparadas no Exemplo 1 foi diluído em dobro em concentrações de 4000 ng/ml a 62,5 ng/ml. As diluições de diferentes concentrações foram detectadas como descrito no Exemplo 6. A curva foi traçada em gráfico com a ordenada representando as concentrações do padrão de proteínas de lise de células Vero e a abscissa representando 1000 × os valores OD obtidos a partir da subtração do valor OD de 0 ng/ml do padrão (isto é, solução de diluição da amostra: 0,01 mol/l de PBS-T) a partir dos valores OD de diferentes concentrações do padrão (anulação zero), a curva sendo aproximadamente linear, como mostrada na figura 5. A correlação da curva é vista (R2 ≥ 0,99) quando a concentração do padrão está na faixa de 62,5 a 4000 ng/ml.
Tabela 9. Resultados da determinação do padrão de proteínas de lise de células Vero
Exemplo 8: um kit de teste de HCPs de células Vero para a determinação
Placa de reação revestida com as proteínas antilise de porquinho da índia de células Vero IgG
96 reservatórios × 1 placa
Padrão (proteínas de lise purificadas de células Vero como preparadas no Exemplo 1,8000 ng/ml)
500 μL × 1 frasco
Proteínas antilise de coelho de HRP de células Vero IgG
50 μl × 1 frasco
Tampão de diluição enzimática 20 ml × 1 frasco
20 × tampão de lavagem de PBS50 ml × 1 frasco
Agente cromogênico A7 ml × 1 frasco
Agente cromogênico B7 ml × 1 frasco
Solução de interrupção (2 mol/l de H2SO4)7 ml × 1 frasco
Exemplo 9: um kit de teste de HCPs de células Vero
Placa de reação revestida com proteínas antilise de coelho de células Vero IgG
96 reservatórios × 1 placa
Padrão (proteínas de lise purificadas de células Vero como preparadas no Exemplo 1, 8000 ng/ml)
500 μL × frasco
Proteínas antilise de coelho de HRP de células Vero IgG
50 μl × 1 frasco
Tampão de diluição enzimática20 ml × 1 frasco
20 × tampão de lavagem de PBS 50 ml × 1 frasco
Agente cromogênico A7 ml × 1 frasco
Agente cromogênico B7 ml × 1 frasco
Solução de interrupção (2 mol/l de H2SO4)7 ml × 1 frasco
Tabela 9. Resultados da determinação do padrão de proteínas de lise de células Vero
Placa de reação revestida com as proteínas antilise de porquinho da índia de células Vero IgG
96 reservatórios × 1 placa
Padrão (proteínas de lise purificadas de células Vero como preparadas no Exemplo 1,8000 ng/ml)
500 μL × 1 frasco
Proteínas antilise de coelho de HRP de células Vero IgG
50 μl × 1 frasco
Tampão de diluição enzimática 20 ml × 1 frasco
20 × tampão de lavagem de PBS50 ml × 1 frasco
Agente cromogênico A7 ml × 1 frasco
Agente cromogênico B7 ml × 1 frasco
Solução de interrupção (2 mol/l de H2SO4)7 ml × 1 frasco
Exemplo 9: um kit de teste de HCPs de células Vero
Placa de reação revestida com proteínas antilise de coelho de células Vero IgG
96 reservatórios × 1 placa
Padrão (proteínas de lise purificadas de células Vero como preparadas no Exemplo 1, 8000 ng/ml)
500 μL × frasco
Proteínas antilise de coelho de HRP de células Vero IgG
50 μl × 1 frasco
Tampão de diluição enzimática20 ml × 1 frasco
20 × tampão de lavagem de PBS 50 ml × 1 frasco
Agente cromogênico A7 ml × 1 frasco
Agente cromogênico B7 ml × 1 frasco
Solução de interrupção (2 mol/l de H2SO4)7 ml × 1 frasco
[00085] O kit de teste conforme descrito no Exemplo 8 é principalmente utilizado para detectar os teores de proteínas da célula hospedeira nos produtos intermediários durante a produção de vacinas de células Vero. Estes produtos intermediários podem conter outros componentes diferentes das proteínas da célula hospedeira. Tais componentes, que incluem soro fetal bovino, solução de cultura celular, BSA, ovalbumina, vírus da hepatite A (HAV), anti-HAV IgG, tripsina e hidrolisado de lactoalbumina, entre outros, não devem interferir com a determinação pelo kit. Portanto, empregando o kit de teste para a determinação como descrito no Exemplo 8, a determinação foi executada de acordo com a descrição do Exemplo 6 utilizando soro fetal bovino, solução de cultura celular, BSA a 2%, ovalbumina a 2%, HAV (diluição 1:4, 2,7 g/ml), anti-HAV IgG (2 IU/ml), tripsina a 0,25% e hidrolisado de lactoalbumina a 2% como amostras de modo a verificar a especificidade deste método de determinação.
[00086] Os resultados são mostrados na figura 6, em que: 1) padrão de proteínas de lise de células Vero; 2) PBS-T; 3) meio de cultura celular; 4) soro fetal bovino; 5) BSA; 6) ovalbumina; 7) HAV; 8) HAV-IgG; 9) tripsina; e 10) hidrolisado de lactoalbumina. Os resultados mostram que o kit de teste para determinação de acordo com a presente invenção não possui nenhuma reação cruzada com o soro fetal bovino, solução de cultura celular, BSA, ovalbumina, HAV, anti-HAV IgG, tripsina e hidrolisado de lactoalbumina, e é, portanto, altamente específico.
[00087] Exemplo 11: teste de precisão do kit de teste de HCPs de células Vero
[00088] Usando o kit de teste como descrito no Exemplo 8, os valores OD450nm de 10 reservatórios cada um contendo 1000 ng/ml do padrão na mesma placa foram determinados de acordo com o método descrito no Exemplo 6. As determinações foram executadas em triplicata, e a média do coeficiente intrabatelada de variação (% CV) foi calculada para ser 6,0 %. 
[00089] Quatro bateladas de amostras de vacinas inativadas contra a hepatite A foram preparadas de acordo com a descrição na patente Chinesa N° ZL 0210685.9. Estas amostras foram detectadas 6 vezes de acordo com o método descrito no Exemplo 6, utilizando o kit de teste para a determinação como descrito no Exemplo 8. Os resultados dos teores de HCPs de células Vero estão apresentados na tabela 11, em que o CV médio = 6,2 %, o que indica boa capacidade de reprodução.
Tabela 11. Concentração de HCPs de células Vero nas amostras de vacina
Tabela 11. Concentração de HCPs de células Vero nas amostras de vacina
[00090] As proteínas totais nas quatro bateladas de amostras de vacinas acima descritas foram determinadas usando o método de Lowry, e os resultados foram comparados com aqueles da determinação das HCPs de células Vero nas amostras de vacina inativada da hepatite A produzidas a partir das células Vero. É demonstrado que a presente invenção que serve como um meio de detecção e controlo da qualidade para as vacinas inativadas de hepatite A produzidas a partir de células Vero é mais direcionada em relação ao controle de qualidade indireta em termos de proteína total das vacinas. Os critérios de qualidade das amostras de vacina são consequentemente aumentados, garantindo assim um nível mais elevado de segurança das vacinas.
Tabela 12. Comparação dos resultados dos dois métodos de detecção
Tabela 12. Comparação dos resultados dos dois métodos de detecção
[00091] Usando o kit de teste como descrito no Exemplo 8, e em conformidade com as etapas no Exemplo 6, as diluições de HCP padrão diluído com a amostra de vacina da batelada 3 (após diluição dupla) e as diluições do HCP padrão diluído com PBS-T foram detectadas simultaneamente. A taxa de recuperação de HCP na amostra da vacina em média é 96 % (vide as tabelas 13 e 14), o que indica ausência de qualquer interferência com a especificidade do método para a detecção de HCPs de acordo com a presente invenção pelo substrato da amostra de vacina. 
[00092] A presente invenção não deve ser limitada no escopo pelas formas de realização específicas descritas neste documento, que são apenas destinadas como ilustrações isoladas dos aspectos individuais da invenção. Os métodos e componentes funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da invenção. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas aqui mostradas e descritas se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição anterior e desenhos que acompanham. Tais modificações destinam-se a cair dentro do escopo das reivindicações anexas. As divulgações de cada uma das referências citadas acima são aqui inteiramente incorporadas por referência.
Claims (16)
- Método para preparação de proteínas de lise de células Vero, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
- (a) cultura e colheita de células Vero;
- (b) disrupção e lise de células Vero;
- (c) pré-purificação das proteínas de lise de células Vero;
- (d) concentração para obter proteínas de lise de células Vero; a amostra obtida após a pré-purificação para ultrafiltração com membrana MWCO = 100 KD e uma concentração com tubos MWCO = 100 KD; e
- (e) purificação da concentração da etapa (d) pela purificação hidrofóbica de Fenil-Sepharose 6FF realizada da seguinte forma: a amostra é carregada em um tampão de carregamento com uma taxa de fluxo de 30-60 cm/h, depois a coluna é enxaguada com 3 CVs de solução PB 1,0 mol/L pH 6,0-7,5, seguida de eluição linear com 5 CVs de solução PB 0,02 mol/L pH 6,0-7,5 e finalmente as frações de eluição com condutância abaixo de 48 mS/cm são coletadas; a referida cromatografia de exclusão molecular é a cromatografia em gel de exclusão molecular do tipo Sepharose 4 Fast Flow, em que a eluição é conduzida usando uma solução PBS de 0,01 mol/L pH 7,4 a uma taxa de fluxo de 45 cm/h e o segundo pico de eluição é coletado.
- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas disrupção e lise celulares incluem lise celular química, disrupção osmótica, congelamento e descongelamento repetidos, lise celular enzimática, disrupção de ultra-som e lise celular mecânica.
- Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as referidas disrupção e lise celulares são pela disrupção de ultrassom.
- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido método de pré-purificação é m método de extração de solvente orgânico.
- Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida extração de solvente orgânico envolve a adição da solução de células obtida após a disrupção em um volume igual de triclorometano, agitação da mistura durante 20 a 30 minutos, centrifugação da mistura em 4000 rpm a 2 a 8 °C durante 20 a 25 minutos, e extração da fase aquosa superior contendo proteínas.
- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido vírus e seus componentes é o vírus da hepatite A e os seus componentes.
- Uso de proteínas de lise de células Vero preparadas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um reagente de detecção para as HCPs de células Vero.
- Kit de teste de HCPs de células Vero, caracterizado pelo fato de que compreende uma fase sólida, anticorpos na fase sólida, anticorpos conjugados ao ligante e uma proteína-padrão, em que os referidos anticorpos são anticorpos contra as proteínas de lise de células Vero, e a referida proteína-padrão são proteínas de lise de células Vero, e as referidas proteínas de lise de células Vero são preparadas usando o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
- Kit de teste de HCPs de células Vero de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda anticorpos modificados por biotina e avidina conjugada com ligante.
- Kit de teste de HCPs de células Vero de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda anticorpos modificados com 2,4-dinitrofenol e anti-2,4-dinitrofenol conjugado com ligante.
- Kit de teste de HCPs de células Vero de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a referido anticorpo é IgG contra as proteínas de lise de anticorpos de células Vero e é produzido em porquinho da índia ou coelho.
- Kit de teste de HCPs de células Vero de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o marcador no referido anticorpo conjugado com ligante é um dentre uma enzima, um nuclídeo ou uma fluoresceína.
- Kit de teste de HCPs de células Vero de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a referida enzima é selecionada dentre peroxidase, β-D-galactosidase, fosfatase alcalina e glicose-6-fosfato desidrogenase.
- Kit de teste de HCPs de células Vero de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido nuclídeo é selecionado dentre 3H, 188Re ou 131I.
- Kit de teste de HCPs de células Vero de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a referida fluoresceína é selecionada dentre isotiocianato de fluoresceína, tetraetilrodamina, isotiocianato de tetrametilrodamina ou um quelato lantanídeo trivalente.
- Kit de teste de HCPs de células Vero de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a referida fase sólida é uma placa de ensaio ELISA ou um veículo de microplaqueta de proteína.
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