CN112501104B - 基因工程细菌及其在淋巴细胞扩增中的应用 - Google Patents

基因工程细菌及其在淋巴细胞扩增中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112501104B
CN112501104B CN202011538952.0A CN202011538952A CN112501104B CN 112501104 B CN112501104 B CN 112501104B CN 202011538952 A CN202011538952 A CN 202011538952A CN 112501104 B CN112501104 B CN 112501104B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
genetically engineered
amplification
culture
bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011538952.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112501104A (zh
Inventor
俞英豪
王冶陶
彭昉
蔡燕萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Life Ark Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Life Ark Biomedical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Life Ark Biomedical Technology Co ltd filed Critical Hangzhou Life Ark Biomedical Technology Co ltd
Priority to CN202011538952.0A priority Critical patent/CN112501104B/zh
Publication of CN112501104A publication Critical patent/CN112501104A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112501104B publication Critical patent/CN112501104B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70514—CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/72—Undefined extracts from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及基因工程细菌及其在淋巴细胞扩增中的应用。本发明利用异体原核生物作为滋养层细胞，通过基因工程手段获表达CD137L、IL21和CD4中至少一种蛋白的基因工程细菌，将该基因工程细菌表达用于扩增淋巴细胞，具有扩增效率高、安全性好的优点，且成本更低。实现结果表明，利用本发明基因工程细菌扩增纯化的NK细胞或未经纯化的淋巴细胞，NK细胞14天分别增长25892.99倍、30150.22倍。其中，对未经纯化的淋巴细胞进行培养，获得NK细胞的纯度达98.5％，显著优于传统因子培养以及现有滋养细胞技术的培养效果。

Description

基因工程细菌及其在淋巴细胞扩增中的应用
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及基因工程细菌及其在淋巴细胞扩增中的应用。
背景技术
NK细胞(自然杀伤细胞，Natural Killer Cell)又称为大颗粒性淋巴细胞。和γδT细胞，NKT细胞在形式和功能上行使着连接获得性免疫和固有免疫桥梁的作用。一方面，当机体发生感染及创伤时，NK细胞以防御者的身份通过非肽-MHC的识别方式快速，广泛，特异地识别抗原，及时地清除病原微生物，变异细胞，发挥固有免疫的作用。另一方面NK细胞被认为也部分参与了适应性免疫应答，能够影响αβT细胞和B细胞的效应功能。
在肿瘤的发生发展过程中，NK细胞既可以通过活化性受体直接识别肿瘤细胞并被活化，也可以被辅助细胞(单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞等)活化。这些辅助细胞通过其模式识别受体来应答内外环境的变化，再通过分泌多种可溶性因子或直接接触的方式将信号传导给NK细胞。在人类，已经证实存在的可溶性因子有IL12，IL-18，typeI IFN,TNF-α等；直接接触的分子有GITRL/GITR，CD48/2B4，MICA or MICB or ULBP1-ULBP3/NKG2D，AICL/NKp80等。基于以上原理在体外扩增活化的NK细胞对肿瘤细胞显示出良好的杀伤活性，并应用于肿瘤生物治疗中。
目前制约NK细胞的临床应用的主要障碍之一就是难以得到足够数量的NK细胞。如何在体外实现NK细胞大规模扩增是目前NK细胞治疗的关键问题。外周血中NK细胞仅占很小的部分。而肿瘤病人的外周血中往往NK细胞的数量和活性有明显的下降。不同人NK细胞的性质有很大差异。应用嵌合抗原受体(CAR)修饰NK细胞来治疗肿瘤也对NK细胞数量有很高要求。有所以寻找高效的个性化的NK细胞大规模扩增方法对NK细胞的临床应用有重大意义。
近年，人工抗原提呈细胞(使用基因工程技术制作的滋养层细胞)越来越多的用于NK细胞的体外扩增。比如把膜结合IL15和4-1BBL导入K562细胞，这种方法得到的人工抗原提呈细胞可以将NK细胞在21天平均扩增277倍。把MICA和4-1BBL导入K562细胞，并加以IL15刺激NK细胞可在24天平均扩增550倍.把mIL21，4-1BBL，CD64，CD86，tCD19导入K562细胞，这种方法得到的人工抗原提呈细胞可以将NK细胞3周平均扩增一万倍以上.
现有技术ZL201310053084.0：使用跨膜IL21、CD14、CD19、CD86和CD137的混合物与IL2共同作用扩增激活淋巴细胞，其中跨膜IL21为IL21与CD8α的胞外结构域相连而成的复合物，该复合物为K562工程细胞。
利用细胞因子在体外与NK细胞共培养，扩增效果有限，基本不能得到临床所需的效应细胞。而利用滋养细胞的方法扩增NK细胞虽然能得到较高质量的效应细胞，但是现有技术的滋养细胞都是采用肿瘤细胞，虽然经过辐照，但是进入人体后依然被担心存在一定的风险。
益生菌为一类对人体有益的活性微生物，定植于人体口腔、肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥对肠道有益作用。目前尚未发现将细菌为滋养层细胞用于淋巴细胞的扩增、培养的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种基因工程细菌及其在淋巴细胞扩增中的应用。本发明利用异体细菌替代K562作为滋养层细胞扩增淋巴细胞，具有扩增效率高、安全性好的优点，且成本更低。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了表达CD137L、IL21和CD4中至少一种蛋白的基因工程细菌。
其中，所述细菌包括益生菌和条件致病菌。
一些实施方案中，所述益生菌包括乳酸菌、双歧杆菌，所述条件致病菌为大肠杆菌。
一些具体实施例中，所述乳酸菌为口乳杆菌。
本发明还提供了所述基因工程细菌在淋巴细胞扩增中的应用。
进一步的，所述淋巴细胞具体为NK细胞。
本发明还提供一种淋巴细胞的扩增方法，利用本发明所述的基因工程细菌扩增淋巴细胞。
一些实施方案中，淋巴细胞的扩增方法具体包括：
步骤1：构建CD137L、IL21和CD4中至少一种蛋白的重组载体，转化细菌，获得基因工程细菌；
步骤2：将淋巴细胞接种到KBM581培养液中，依次白细胞介素2、加入自体血浆和所述基因工程益生菌共培养。
一些实施方案中，所述淋巴细胞的接种浓度为2×103-2×1010cell/mL。一些具体实施例中，所述淋巴细胞的接种浓度为2×107cell/mL。
一些实施方案中，以体积百分比计，所述自体血浆的体积百分含量为1-10％。一些具体实施例中，所述自体血浆的体积百分含量为1％、5％或10％。
一些实施方案中，所述步骤2还包括每周补加一次基因工程细菌的步骤。一些具体实施例中，所述补加的时间具体为：于第7天补加一次，或在第7天、第14天各补加一次。
本发明利用异体原核生物细菌替代K562作为滋养层细胞，通过基因工程手段获表达CD137L、IL21和CD4中至少一种蛋白的基因工程细菌，将该基因工程细菌表达用于扩增淋巴细胞，具有扩增效率高、安全性好的优点，且成本更低。实现结果表明，利用本发明基因工程细菌扩增纯化的NK细胞或未经纯化的淋巴细胞，NK细胞14天分别增长25892.99倍、30150.22倍。其中，对未经纯化的淋巴细胞进行培养，获得NK细胞的纯度达98.5％，显著优于传统因子培养以及现有滋养细胞技术的培养效果。
附图说明
图1示使用不同方法对提纯后的NK细胞进行培养，14天内的NK细胞扩增倍数比较图；
图2示使用不同方法对PBMC进行培养，14天内的NK细胞扩增倍数比较图；
图3示本发明扩增方法对NK细胞扩增14天的纯度图；
图4示本发明扩增方法扩增后的NK细胞的存活率。
具体实施方式
本发明提供了基因工程细菌及其在淋巴细胞扩增中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明益生菌工程细胞的制备
1、构建表达CD137L基因的重组质粒；
PCR扩增CD137L基因，将CD137L基因克隆至同一载体中，获得表达CD137L的重组质粒。
2、重组质粒转染细胞株
材料:细胞株、重组质粒、培养基、链霉素/青霉素(双抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷酸盐缓冲溶液)、胰酶/EDTA消化液、转染试剂(Lipofectamine TM2000)。
2.1准备细胞
贴壁细胞：转染前24h，在500μL无双抗完全培养基中接种0.5-2×105个细胞，转染时细胞融合度为80-90％。(注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。)
2.2对于每个转染样品，按下面的方法准备：
(1)用50μL Opti-MEM稀释0.8μg质粒DNA，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。
(2)轻轻颠倒混匀转染试剂，用50μL Opti-MEM稀释2.0μL LipofectamineTM2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。
(3)混合转染试剂和质粒DNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。注:转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。
(4)转染复合物加入到24孔细胞板中，100μL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。
(5)将细胞板置于37℃、5％CO2培养箱中培养6h左右，进行换液，换成含10％血清的普通培养基，在37℃，5％CO2孵育箱中继续培养24h左右。
2.3稳定转染细胞株的筛选
从37℃，5％CO2孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用PBS冲洗细胞2遍，胰蛋白酶消化，接种1/2的细胞到100mm培养皿中，加入含500μg/ml G418的新鲜培养基，每2-3天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。当正常细胞完全死亡后，换用新的不含G418的培养基培养。每天观察细胞生长状态。在细胞达到60％汇合率时再用含500μg/ml G418的培养基筛选一次。当细胞达到90％以上汇合率时将细胞转移至培养瓶中继续培养(转染后10-12天左右)。以后每隔4-5天再用含500μg/ml G418的培养基筛选。直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后收集菌体，获得本发明基因工程益生菌(约转染后15天左右)。注：以后继续培养时加入的G418浓度降一半。
实施例2比较不同扩增方法对纯化后的NK细胞的扩增倍数和纯度的影响
将健康捐献人的NK细胞(或PBMC)接种至KBM581培养液中，依次加入白细胞介素2、5％的自体血浆。分别在第0天，第7天，第14天向培养液中加入实施例1制备的L21-CD137L-CD4-口乳杆菌后共同培养。以IL21-4-1BB-CD4-K562复合物、IL21-4-1BB-K562复合物和目前常见的扩增效果较好的因子试剂盒作为对照，记录并计算NK细胞的扩增倍数，结果见图1。
结果显示，NK细胞在IL21-CD137L-CD4-口乳杆菌和低剂量白介素2的共同作用下，数量显著增加，14天时约增长了25892.99倍，扩增效果明显强于IL21-4-1BB-K562细胞和常见的扩增效果较好的因子试剂盒。
实施例3测试不同扩增方法直接对PBMC进行培养，比较培养14天内的NK细胞扩增倍数、纯度和存活率
将健康捐献人的PBMC接种至KBM581培养液中，加入1-10％的自体血浆。分别在第0天，第7天，第14天向培养液中加入实施例1制备的L21-CD137L-CD4-口乳杆菌后共同培养。以IL21-4-1BB-CD4-K562复合物、IL21-4-1BB-K562复合物和常见的扩增效果较好的因子试剂盒作为对照。记录并计算NK细胞的扩增倍数，结果见图2。通过流式细胞仪检测NK细胞的纯度，结果见图3。细胞存活率见图4。
结果显示，NK细胞在IL21-CD137L-CD4-口乳杆菌和低剂量白介素2的共同作用下，数量显著增加，14天时约增长了30150.22倍，扩增效果明显优于IL21-4-1BB-K562细胞和常见的扩增效果较好的因子试剂盒。通过流式细胞仪检测NK细胞纯度(CD3-CD56+)为98.5％，因子试剂盒扩增纯度一般为30-80％，平均为50％，极限为83％，K562滋养细胞方法一般为75-95％，平均为88％。
由图4可知，PBMC细胞在IL21-CD137L-CD4-口乳杆菌和低剂量白介素2的共同作用下，NK细胞存活率达93.86％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.表达CD137L、IL21和CD4的基因工程细菌；
所述细菌为益生菌；
所述益生菌为口乳杆菌。
2.权利要求1所述的基因工程细菌在NK细胞扩增中的应用。
3.一种NK细胞的扩增方法，其特征在于，利用权利要求1所述的基因工程细菌扩增NK细胞。
4.根据权利要求3所述的扩增方法，其特征在于，包括：
步骤1：构建表达CD137L、IL21和CD4的重组载体，转化口乳杆菌，获得基因工程细菌；
步骤2：将NK细胞接种到淋巴细胞基础培养基中，依次加入白细胞介素2、自体血浆和所述基因工程细菌共培养。
5.根据权利要求4所述的扩增方法，其特征在于，所述淋巴细胞基础培养基为KBM581培养液。
6.根据权利要求4所述的扩增方法，其特征在于，所述NK细胞的接种浓度为2×103-2×1010cell/mL。
7.根据权利要求5所述的扩增方法，其特征在于，所述自体血浆的添加量为所述淋巴细胞基础培养基体积的1～10％。
8.根据权利要求4所述的扩增方法，其特征在于，所述步骤2还包括每周补加一次基因工程细菌的步骤。
CN202011538952.0A 2020-12-23 2020-12-23 基因工程细菌及其在淋巴细胞扩增中的应用 Active CN112501104B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011538952.0A CN112501104B (zh) 2020-12-23 2020-12-23 基因工程细菌及其在淋巴细胞扩增中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011538952.0A CN112501104B (zh) 2020-12-23 2020-12-23 基因工程细菌及其在淋巴细胞扩增中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112501104A CN112501104A (zh) 2021-03-16
CN112501104B true CN112501104B (zh) 2022-09-09

Family

ID=74923186

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011538952.0A Active CN112501104B (zh) 2020-12-23 2020-12-23 基因工程细菌及其在淋巴细胞扩增中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112501104B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114874986A (zh) * 2022-06-16 2022-08-09 杭州中赢生物医疗科技有限公司 一种采用k562细胞扩增nk细胞的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106635987A (zh) * 2016-12-27 2017-05-10 宁波枫林生物科技有限公司 一种体外高效扩增nk细胞的方法及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106635987A (zh) * 2016-12-27 2017-05-10 宁波枫林生物科技有限公司 一种体外高效扩增nk细胞的方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
乳酸杆菌对宫颈癌Hela细胞抑制作用机制的研究;王爱红;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20110425(第04期);E072-374，参见全文，尤其是摘要、正文第10页第1段-第12页第2段 *
人源CD137L 基因在不同表达系统中表达效率的比较;何东洋等;《生物技术通报》;20141231(第8期);第178-183页，参见全文，尤其是摘要 *
具有潜在免疫调节功能Lactobacillus菌株的体外筛选及作用机理研究;妥彦峰;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 基础科学辑》;20110715;A006-82，参见全文，尤其是第61页第2段-第76页第5段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112501104A (zh) 2021-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107922925B (zh) 用于自然杀伤细胞扩增的方法
CN110964698B (zh) 一种人工抗原递呈细胞及其制备方法和应用
Boissel et al. Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells
CN107177548B (zh) 一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用
CN105624107B (zh) 一种多种淋巴细胞亚群的扩增方法及其应用
US9670459B2 (en) Production method for cell populations
JP5247431B2 (ja) フィーダー細胞を用いることによる細胞集団のｉｎｖｉｔｒｏ産生
CN109777773A (zh) 一种从造血干细胞分化产生nk细胞的方法及其培养基
Huibregtse et al. Genetically modified lactococcus lactis for delivery of human interleukin‐10 to dendritic cells
CN109055430A (zh) 一种共表达il18和ccl19蛋白及靶向muc1基因car-t细胞的制备方法
JP2022065102A (ja) ナチュラルキラー細胞の生産方法
CN112501104B (zh) 基因工程细菌及其在淋巴细胞扩增中的应用
CN113293132A (zh) 一种nk细胞体外扩增体系及培养方法
CN112626027A (zh) 一种Treg细胞培养方法
CN105838674A (zh) 一种免疫抑制剂诱导调节性cd8+t细胞体外扩增的方法
Bohnenkamp et al. Bioprocess development for the cultivation of human T-lymphocytes in a clinical scale
CN110283785A (zh) 一种γδT-NK细胞共培养的方法
WO2013040688A1 (en) Enhancement of eukaryotic cell properties using ultrasound
CN112553157B (zh) 一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法
WO2012096376A1 (ja) 制御性ｔ細胞の製造方法
CN116286638A (zh) 促进cd34+细胞向cd16+巨噬细胞分化并向m2极化的方法
Xu et al. Immunoregulatory effect of neuronal-like cells in inducting differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
CN105219717A (zh) 一种一型极化树突状细胞及其诱导方法和应用
WO2008056734A1 (fr) Procédé de production de cellules dendritiques à partir de cellules souches d'embryons humains
CN116286666B (zh) 滋养层细胞及其制备方法、应用和扩增nk细胞的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant