CN110063968A - 一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞领域，提供一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法，用于提高胰岛的修复效果。本发明提供的一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法，包括：S11.将自体脂肪间充质细胞离心后获得的细胞以脂肪干细胞培养并传代至P3代；S12.将P3代脂肪间充质干细胞消化后重悬于脂肪间充质干细胞培养基中，培养36h，然后每隔72h半量更换培养基，培养8天，得到细胞液，所述培养基中包括胰岛脱细胞基质；S13.在PBS溶液中加入纳米多孔微支架，分散后同细胞液混合，得到胰岛修复液，将胰岛修复液注射到胰岛处。选自自体的特异性干细胞可以提高胰岛修复的成功率，促进病变胰岛及时转变为正常组织。

Description

一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法。
背景技术
脂肪间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，它能够定向分化为胰岛样细胞、软骨细胞等多种细胞。脂肪间充质干细胞具有来源广泛、取材方便、对供体部位损伤小、无伦理问题等优势，并已有文献证明脂肪间充质干细胞能诱导分化为具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞，为临床治疗糖尿病提供新的技术方案。但采用直接将诱导分化后的胰岛素分泌细胞注射移植到体内的方式，这些胰岛素分泌细胞会随血液循环到身体各个部位，导致利用细胞率较低，不能针对损伤的胰岛组织进行修复，治疗效果不显著。利用脂肪间充质干细胞作为种子细胞通过在脱细胞基质上制备的类胰岛组织的方法，可以提供充足新型供体、降低异基因供体移植的副反应，提高细胞利用率，来有效的治疗Ⅰ型糖尿病。
生物支架通过模拟人体天然微环境的理化特性，能有效促进干细胞的自我更新、增殖以及定向分化等，近年来被广泛应用于再生医学领域，被大量应用在组织再生和肿瘤免疫治疗研究领域。目前传统的多孔支架具有较大的物理尺寸，阻碍了营养物质和细胞进入支架内部，严重影响了支架上细胞的存活和扩增。
发明内容
本发明解决的技术问题为提高胰岛的修复效果，提供一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法，包括：S11.将自体脂肪间充质细胞离心后获得的细胞以脂肪干细胞培养并传代至P3代；S12.将P3代脂肪间充质干细胞消化后重悬于脂肪间充质干细胞培养基中，培养36h，然后每隔72h半量更换培养基，培养8天，得到细胞液，所述培养基中包括胰岛脱细胞基质；S13.在PBS溶液中加入纳米多孔微支架，分散后同细胞液混合，得到胰岛修复液，将胰岛修复液注射到胰岛处。
将自体脂肪间充质干细胞通过胰岛脱细胞基质诱导分化为胰岛组织，注入到人体内，可以提高病变的胰岛组织中逐渐出现正常的胰岛细胞，提高胰岛正常组织的比重，降低病变组织的比重，进而修复胰岛。
选自自体的特异性干细胞可以提高胰岛修复的成功率，促进病变胰岛及时转变为正常组织。
优选地，所述胰岛脱细胞基质的制备方法为：S21.在无菌条件下取出鼠胰岛组织，以PBS冲洗至清洗液澄清后浸在PBS中反复冻融裂解组织中的细胞，每个冻融循环包括液氮15min，37℃水浴5min共进行7~10个循环；S22.将冻融裂解后的组织放入低渗裂解液中，在4℃震荡消化24h后，用PBS冲洗组织8次后放入2ml核酸消化液中37℃消化组织4h。采用胰岛脱细胞基质可以促进脂肪间充质干细胞分化为胰岛细胞。
优选地，所述低渗裂解液含有质量分数0.01%~0.03%的Tris/EDTA、体积分数0.4~0.8%的Triton-X100和0.174μg/mL的PMSF。低渗裂解液可以将胰岛的组织细胞破坏，释放细胞基质。
优选地，所述核酸消化液为每毫升PBS中含有50~60单位的DNase和1单位的RNase。核酸消化液将脱细胞基质中核酸消化，去除遗传物质。
优选地，所述纳米多孔微支架为海藻酸钠修饰的纳米二氧化硅，所述纳米多孔微支架的制备方法为：S51.取Pluronic P-123 3~10质量份，去离子水120~140质量份，浓盐酸21~30质量份，剧烈搅拌1.5~4h，充分混和后，在50℃水浴下，搅拌下加入正硅酸乙酯5~10质量份，搅拌18h，升温至80~85℃，恒温30h；然后离心，用去离子水洗涤沉淀，干燥后在马弗炉内煅烧，得到纳米二氧化硅；S52.将纳米二氧化硅分散到海藻酸钠溶液中，混合均匀，冷冻干燥后，加入氯化钙溶液，PBS浸洗后再次冷冻干燥，得到海藻酸钠改性纳米二氧化硅；S53.将海藻酸钠改性的纳米二氧化硅置于离心管中，加入液氮，用均质仪破碎，待液氮挥发完全后，加入氯化钙溶液，反应后过滤，所得颗粒冷冻干燥后粉碎，得到纳米多孔微支架。采用纳米多孔微支架可以确保有相当一部分的分化的胰岛细胞可以同胰岛结合，同时促进脂肪间充质干细胞增殖、分化。
优选地，所述液氮加入量为离心管容积的15~20%；氯化钙溶液的浓度为2%，反应时间为8~12min；采用均质仪破碎所用转速为30000~35000rpm，高速破碎2~8min。采用均质仪进行破碎，可以使得纳米多孔微支架的物理尺寸更小，利于营养物质进入，促进细胞及组织的生长。
优选地，所述纳米二氧化硅改性后再经海藻酸钠改性，所述纳米二氧化硅的改性方法为：取硝酸铜0.5~2质量份，硝酸钴3~5质量份，所述纳米二氧化硅15~30质量份，正硅酸丁酯1~5质量份，羧酸4~6质量份；将硝酸铜、正硅酸丁酯及羧酸溶于乙醇中，将混合溶液在水浴60℃下搅拌蒸发，蒸发一半的液体后，将纳米二氧化硅浸渍在剩余溶液中，得到前驱体；将前驱体在110~160℃下干燥36h，于800℃下焙烧8h得到第一粉末；将硝酸钴溶于去离子水，等体积浸渍于第一粉末，100~150℃干燥12~24h，于300~500℃下焙烧6h，得到第二粉末；将第二粉末分散到去离子水中，加入纳米二氧化锆1~2质量份，超声分散后干燥，所得固体物质焙烧后粉碎，得到改性纳米二氧化硅。改性后纳米二氧化硅粒径更加均匀，可以更快的同营养物质组合，在胰岛细胞扩增过程中，逐渐的释放一定的营养物质，促进胰岛细胞的生长。
优选地，所述纳米二氧化锆为改性纳米二氧化锆，所述纳米二氧化锆的改性方法为：取硝酸铈0.8~1.5质量份，氢氧化钠4~10质量份，去离子水40~50质量份，纳米二氧化锆0.5~0.8质量份，；将硝酸铈溶于20~25质量份的去离子水中，氢氧化钠溶于20~25质量嗯的去离子水中，将两份溶液混合，搅拌均匀，在高压环境中在140℃下反应48h后，去除一半的上清液，加入等体积的去离子水，加入纳米二氧化锆，搅拌均匀后，140℃下反应48h，过滤取固体物质，洗涤后干燥，在空气气氛中500~600℃焙烧3h，得到改性纳米二氧化锆。改性的二氧化锆将纳米二氧化硅改性后，进而生成的纳米多孔微支架可以更进一步的促进胰岛细胞的生长。
优选地，所述硝酸铈1~1.5质量份，氢氧化钠6~10质量份，去离子水45~50质量份，纳米二氧化锆0.6~0.8质量份。
优选地，所述硝酸铈1质量份，氢氧化钠6质量份，去离子水45质量份，纳米二氧化锆0.6质量份。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：选自自体的特异性干细胞可以提高胰岛修复的成功率，促进病变胰岛及时转变为正常组织；采用多重改性的纳米多孔微支架，可以加快胰岛修复的速度，促进血糖水平尽快回复到正常水平。
具体实施方式
以下实施列是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法，包括：S11.将自体脂肪间充质细胞离心后获得的细胞以脂肪干细胞培养并传代至P3代；S12.将P3代脂肪间充质干细胞消化后重悬于脂肪间充质干细胞培养基中，培养36h，然后每隔72h半量更换培养基，培养8天，得到细胞液，所述培养基中包括胰岛脱细胞基质；S13.在PBS溶液中加入纳米多孔微支架，分散后同细胞液混合，得到胰岛修复液，将胰岛修复液注射到胰岛处。所述胰岛脱细胞基质的制备方法为：S21.在无菌条件下取出鼠胰岛组织，以PBS冲洗至清洗液澄清后浸在PBS中反复冻融裂解组织中的细胞，每个冻融循环包括液氮15min，37℃水浴5min共进行8个循环；S22.将冻融裂解后的组织放入低渗裂解液中，在4℃震荡消化24h后，用PBS冲洗组织8次后放入2ml核酸消化液中37℃消化组织4h。所述低渗裂解液含有质量分数0.02%的Tris/EDTA、体积分数0.5%的Triton-X100和0.174μg/mL的PMSF。所述核酸消化液为每毫升PBS中含有55单位的DNase和1单位的RNase。所述纳米多孔微支架为海藻酸钠修饰的纳米二氧化硅，所述纳米多孔微支架的制备方法为：S51.取Pluronic P-123 5质量份，去离子水130质量份，浓盐酸25质量份，剧烈搅拌3h，充分混和后，在50℃水浴下，搅拌下加入正硅酸乙酯7质量份，搅拌18h，升温至80~85℃，恒温h；然后离心，用去离子水洗涤沉淀，干燥后在马弗炉内煅烧，得到纳米二氧化硅；S52.将纳米二氧化硅分散到海藻酸钠溶液中，混合均匀，冷冻干燥后，加入氯化钙溶液，PBS浸洗后再次冷冻干燥，得到海藻酸钠改性纳米二氧化硅；S53.将海藻酸钠改性的纳米二氧化硅置于离心管中，加入液氮，用均质仪破碎，待液氮挥发完全后，加入氯化钙溶液，反应后过滤，所得颗粒冷冻干燥后粉碎，得到纳米多孔微支架。所述液氮加入量为离心管容积的18%；氯化钙溶液的浓度为2%，反应时间为8~12min；采用均质仪破碎所用转速为32000rpm，高速破碎6min。所述纳米二氧化硅改性后再经海藻酸钠改性，所述纳米二氧化硅的改性方法为：取硝酸铜1质量份，硝酸钴4质量份，所述纳米二氧化硅20质量份，正硅酸丁酯3质量份，羧酸5质量份；将硝酸铜、正硅酸丁酯及羧酸溶于乙醇中，将混合溶液在水浴60℃下搅拌蒸发，蒸发一半的液体后，将纳米二氧化硅浸渍在剩余溶液中，得到前驱体；将前驱体在150℃下干燥36h，于800℃下焙烧8h得到第一粉末；将硝酸钴溶于去离子水，等体积浸渍于第一粉末，120℃干燥18h，于400℃下焙烧6h，得到第二粉末；将第二粉末分散到去离子水中，加入纳米二氧化锆1.5质量份，超声分散后干燥，所得固体物质焙烧后粉碎，得到改性纳米二氧化硅。所述纳米二氧化锆为改性纳米二氧化锆，所述纳米二氧化锆的改性方法为：取硝酸铈1质量份，氢氧化钠6质量份，去离子水45质量份，纳米二氧化锆0.6质量份；将硝酸铈溶于22.5质量份的去离子水中，氢氧化钠溶于22.5质量嗯的去离子水中，将两份溶液混合，搅拌均匀，在高压环境中在140℃下反应48h后，去除一半的上清液，加入等体积的去离子水，加入纳米二氧化锆，搅拌均匀后，140℃下反应48h，过滤取固体物质，洗涤后干燥，在空气气氛中550℃焙烧3h，得到改性纳米二氧化锆。
将自体脂肪间充质干细胞通过胰岛脱细胞基质诱导分化为胰岛组织，注入到人体内，可以提高病变的胰岛组织中逐渐出现正常的胰岛细胞，提高胰岛正常组织的比重，降低病变组织的比重，进而修复胰岛。
选自自体的特异性干细胞可以提高胰岛修复的成功率，促进病变胰岛及时转变为正常组织。采用胰岛脱细胞基质可以促进脂肪间充质干细胞分化为胰岛细胞。低渗裂解液可以将胰岛的组织细胞破坏，释放细胞基质。核酸消化液将脱细胞基质中核酸消化，去除遗传物质。采用纳米多孔微支架可以确保有相当一部分的分化的胰岛细胞可以同胰岛结合，同时促进脂肪间充质干细胞增殖、分化。采用均质仪进行破碎，可以使得纳米多孔微支架的物理尺寸更小，利于营养物质进入，促进细胞及组织的生长。改性后纳米二氧化硅粒径更加均匀，可以更快的同营养物质组合，在胰岛细胞扩增过程中，逐渐的释放一定的营养物质，促进胰岛细胞的生长。改性的二氧化锆将纳米二氧化硅改性后，进而生成的纳米多孔微支架可以更进一步的促进胰岛细胞的生长。
实施例2
一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法，包括：S11.将自体脂肪间充质细胞离心后获得的细胞以脂肪干细胞培养并传代至P3代；S12.将P3代脂肪间充质干细胞消化后重悬于脂肪间充质干细胞培养基中，培养36h，然后每隔72h半量更换培养基，培养8天，得到细胞液，所述培养基中包括胰岛脱细胞基质；S13.在PBS溶液中加入纳米多孔微支架，分散后同细胞液混合，得到胰岛修复液，将胰岛修复液注射到胰岛处。所述胰岛脱细胞基质的制备方法为：S21.在无菌条件下取出鼠胰岛组织，以PBS冲洗至清洗液澄清后浸在PBS中反复冻融裂解组织中的细胞，每个冻融循环包括液氮15min，37℃水浴5min共进行7个循环；S22.将冻融裂解后的组织放入低渗裂解液中，在4℃震荡消化24h后，用PBS冲洗组织8次后放入2ml核酸消化液中37℃消化组织4h。所述低渗裂解液含有质量分数0.01%的Tris/EDTA、体积分数0.4%的Triton-X100和0.174μg/mL的PMSF。所述核酸消化液为每毫升PBS中含有50单位的DNase和1单位的RNase。所述纳米多孔微支架为海藻酸钠修饰的纳米二氧化硅，所述纳米多孔微支架的制备方法为：S51.取Pluronic P-123 3质量份，去离子水120质量份，浓盐酸21质量份，剧烈搅拌1.5h，充分混和后，在50℃水浴下，搅拌下加入正硅酸乙酯5质量份，搅拌18h，升温至80℃，恒温30h；然后离心，用去离子水洗涤沉淀，干燥后在马弗炉内煅烧，得到纳米二氧化硅；S52.将纳米二氧化硅分散到海藻酸钠溶液中，混合均匀，冷冻干燥后，加入氯化钙溶液，PBS浸洗后再次冷冻干燥，得到海藻酸钠改性纳米二氧化硅；S53.将海藻酸钠改性的纳米二氧化硅置于离心管中，加入液氮，用均质仪破碎，待液氮挥发完全后，加入氯化钙溶液，反应后过滤，所得颗粒冷冻干燥后粉碎，得到纳米多孔微支架。所述液氮加入量为离心管容积的15%；氯化钙溶液的浓度为2%，反应时间为8min；采用均质仪破碎所用转速为30000rpm，高速破碎2min。所述纳米二氧化硅改性后再经海藻酸钠改性，所述纳米二氧化硅的改性方法为：取硝酸铜0.5质量份，硝酸钴3质量份，所述纳米二氧化硅15质量份，正硅酸丁酯1质量份，羧酸4质量份；将硝酸铜、正硅酸丁酯及羧酸溶于乙醇中，将混合溶液在水浴60℃下搅拌蒸发，蒸发一半的液体后，将纳米二氧化硅浸渍在剩余溶液中，得到前驱体；将前驱体在110℃下干燥36h，于800℃下焙烧8h得到第一粉末；将硝酸钴溶于去离子水，等体积浸渍于第一粉末，100℃干燥12h，于300℃下焙烧6h，得到第二粉末；将第二粉末分散到去离子水中，加入纳米二氧化锆1质量份，超声分散后干燥，所得固体物质焙烧后粉碎，得到改性纳米二氧化硅。所述纳米二氧化锆为改性纳米二氧化锆，所述纳米二氧化锆的改性方法为：取硝酸铈0.8质量份，氢氧化钠4质量份，去离子水40质量份，纳米二氧化锆0.5质量份，；将硝酸铈溶于20质量份的去离子水中，氢氧化钠溶于20质量嗯的去离子水中，将两份溶液混合，搅拌均匀，在高压环境中在140℃下反应48h后，去除一半的上清液，加入等体积的去离子水，加入纳米二氧化锆，搅拌均匀后，140℃下反应48h，过滤取固体物质，洗涤后干燥，在空气气氛中500℃焙烧3h，得到改性纳米二氧化锆。
实施例3
一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法，包括：S11.将自体脂肪间充质细胞离心后获得的细胞以脂肪干细胞培养并传代至P3代；S12.将P3代脂肪间充质干细胞消化后重悬于脂肪间充质干细胞培养基中，培养36h，然后每隔72h半量更换培养基，培养8天，得到细胞液，所述培养基中包括胰岛脱细胞基质；S13.在PBS溶液中加入纳米多孔微支架，分散后同细胞液混合，得到胰岛修复液，将胰岛修复液注射到胰岛处。所述胰岛脱细胞基质的制备方法为：S21.在无菌条件下取出鼠胰岛组织，以PBS冲洗至清洗液澄清后浸在PBS中反复冻融裂解组织中的细胞，每个冻融循环包括液氮15min，37℃水浴5min共进行10个循环；S22.将冻融裂解后的组织放入低渗裂解液中，在4℃震荡消化24h后，用PBS冲洗组织8次后放入2ml核酸消化液中37℃消化组织4h。所述低渗裂解液含有质量分数0.03%的Tris/EDTA、体积分数0.8%的Triton-X100和0.174μg/mL的PMSF。所述核酸消化液为每毫升PBS中含有50~60单位的DNase和1单位的RNase。所述纳米多孔微支架为海藻酸钠修饰的纳米二氧化硅，所述纳米多孔微支架的制备方法为：S51.取Pluronic P-123 10质量份，去离子水140质量份，浓盐酸30质量份，剧烈搅拌4h，充分混和后，在50℃水浴下，搅拌下加入正硅酸乙酯10质量份，搅拌18h，升温至80~85℃，恒温30h；然后离心，用去离子水洗涤沉淀，干燥后在马弗炉内煅烧，得到纳米二氧化硅；S52.将纳米二氧化硅分散到海藻酸钠溶液中，混合均匀，冷冻干燥后，加入氯化钙溶液，PBS浸洗后再次冷冻干燥，得到海藻酸钠改性纳米二氧化硅；S53.将海藻酸钠改性的纳米二氧化硅置于离心管中，加入液氮，用均质仪破碎，待液氮挥发完全后，加入氯化钙溶液，反应后过滤，所得颗粒冷冻干燥后粉碎，得到纳米多孔微支架。所述液氮加入量为离心管容积的20%；氯化钙溶液的浓度为2%，反应时间为12min；采用均质仪破碎所用转速为35000rpm，高速破碎8min。所述纳米二氧化硅改性后再经海藻酸钠改性，所述纳米二氧化硅的改性方法为：取硝酸铜2质量份，硝酸钴5质量份，所述纳米二氧化硅30质量份，正硅酸丁酯5质量份，羧酸6质量份；将硝酸铜、正硅酸丁酯及羧酸溶于乙醇中，将混合溶液在水浴60℃下搅拌蒸发，蒸发一半的液体后，将纳米二氧化硅浸渍在剩余溶液中，得到前驱体；将前驱体在160℃下干燥36h，于800℃下焙烧8h得到第一粉末；将硝酸钴溶于去离子水，等体积浸渍于第一粉末，150℃干燥24h，于500℃下焙烧6h，得到第二粉末；将第二粉末分散到去离子水中，加入纳米二氧化锆2质量份，超声分散后干燥，所得固体物质焙烧后粉碎，得到改性纳米二氧化硅。所述纳米二氧化锆为改性纳米二氧化锆，所述纳米二氧化锆的改性方法为：取硝酸铈1.5质量份，氢氧化钠10质量份，去离子水50质量份，纳米二氧化锆0.8质量份，；将硝酸铈溶于25质量份的去离子水中，氢氧化钠溶于25质量嗯的去离子水中，将两份溶液混合，搅拌均匀，在高压环境中在140℃下反应48h后，去除一半的上清液，加入等体积的去离子水，加入纳米二氧化锆，搅拌均匀后，140℃下反应48h，过滤取固体物质，洗涤后干燥，在空气气氛中600℃焙烧3h，得到改性纳米二氧化锆。
实施例4
实施例4同实施例1不同之处在于，所述纳米二氧化硅未改性，直接同海藻酸钠复合。
实施例5
实施例5同实施例1不同之处在于，所述纳米二氧化锆未改性。
对比例1
对比例1同实施例1不同之处在于，包括：S11`.将自体脂肪间充质细胞离心后获得的细胞以脂肪干细胞培养并传代至P3代；S12`.将P3代脂肪间充质干细胞消化后重悬于脂肪间充质干细胞培养基中，培养36h，然后每隔72h半量更换培养基，培养8天，得到细胞液，所述培养基中包括胰岛脱细胞基质。
对比例2
对比例2同实施例1不同之处在于，包括：S11`.将自体脂肪间充质细胞离心后获得的细胞以脂肪干细胞培养并传代至P3代；S13`.在PBS溶液中加入纳米多孔微支架，分散后同细胞液混合，得到胰岛修复液，将胰岛修复液注射到胰岛处。
实验例
取Ⅰ型糖尿病鼠模型，分别注射实施例1~5和对比例1~2中的胰岛修复液，测量一定时间后鼠模型的空腹血糖水平，结果如下。
表 1 平均血糖水平（mmol/L）
从表1可以看出，治疗后实施例1~5中模型鼠的血糖水平均大幅下降，而对比例1~2中的模型鼠的血糖水平下降不大，血糖水平仍较高。
实施例1~3中的模型鼠的血糖水平在治疗28天后均叨叨了较为稳定的状态，同时实施例1~3中的模型鼠的血糖水片在治疗5天后就大幅下降，表明本申请的胰岛修复方法可以快速的降低血糖水平，并长期的有效，可以有效的控制血糖水平。实施例1中的胰岛修复液的各组成成分均进行了优化，因此其降低血糖水平的效果最好。
对比例1和2中的胰岛修复的方法中，一个未采用胰岛细胞基质，一个未采用纳米多孔微支架，其胰岛修复效果较差，血糖水平下降较低。
上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，以上实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (10)

1.一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法，其特征在于，包括：S11.将自体脂肪间充质细胞离心后获得的细胞以脂肪干细胞培养并传代至P3代；S12.将P3代脂肪间充质干细胞消化后重悬于脂肪间充质干细胞培养基中，培养36h，然后每隔72h半量更换培养基，培养8天，得到细胞液，所述培养基中包括胰岛脱细胞基质；S13.在PBS溶液中加入纳米多孔微支架，分散后同细胞液混合，得到胰岛修复液，将胰岛修复液注射到胰岛处。
2.根据权利要求1所述的一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法，其特征在于，所述胰岛脱细胞基质的制备方法为：S21.在无菌条件下取出鼠胰岛组织，以PBS冲洗至清洗液澄清后浸在PBS中反复冻融裂解组织中的细胞，每个冻融循环包括液氮15min，37℃水浴5min共进行7~10个循环；S22.将冻融裂解后的组织放入低渗裂解液中，在4℃震荡消化24h后，用PBS冲洗组织8次后放入2ml核酸消化液中37℃消化组织4h。
3.根据权利要求2所述的一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法，其特征在于，所述低渗裂解液含有质量分数0.01%~0.03%的Tris/EDTA、体积分数0.4~0.8%的Triton-X100和0.174μg/mL的PMSF。
4.根据权利要求2所述的一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法，其特征在于，所述核酸消化液为每毫升PBS中含有50~60单位的DNase和1单位的RNase。
5.根据权利要求1所述的一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法，其特征在于，所述纳米多孔微支架为海藻酸钠修饰的纳米二氧化硅，所述纳米多孔微支架的制备方法为：S51.取Pluronic P-123 3~10质量份，去离子水120~140质量份，浓盐酸21~30质量份，剧烈搅拌1.5~4h，充分混和后，在50℃水浴下，搅拌下加入正硅酸乙酯5~10质量份，搅拌18h，升温至80~85℃，恒温30h；然后离心，用去离子水洗涤沉淀，干燥后在马弗炉内煅烧，得到纳米二氧化硅；S52.将纳米二氧化硅分散到海藻酸钠溶液中，混合均匀，冷冻干燥后，加入氯化钙溶液，PBS浸洗后再次冷冻干燥，得到海藻酸钠改性纳米二氧化硅；S53.将海藻酸钠改性的纳米二氧化硅置于离心管中，加入液氮，用均质仪破碎，待液氮挥发完全后，加入氯化钙溶液，反应后过滤，所得颗粒冷冻干燥后粉碎，得到纳米多孔微支架。
6.根据权利要求5所述的一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法，其特征在于，所述液氮加入量为离心管容积的15~20%；氯化钙溶液的浓度为2%，反应时间为8~12min；采用均质仪破碎所用转速为30000~35000rpm，高速破碎2~8min。
7.根据权利要求6所述的一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法，其特征在于，所述纳米二氧化硅改性后再经海藻酸钠改性，所述纳米二氧化硅的改性方法为：取硝酸铜0.5~2质量份，硝酸钴3~5质量份，所述纳米二氧化硅15~30质量份，正硅酸丁酯1~5质量份，羧酸4~6质量份；将硝酸铜、正硅酸丁酯及羧酸溶于乙醇中，将混合溶液在水浴60℃下搅拌蒸发，蒸发一半的液体后，将纳米二氧化硅浸渍在剩余溶液中，得到前驱体；将前驱体在110~160℃下干燥36h，于800℃下焙烧8h得到第一粉末；将硝酸钴溶于去离子水，等体积浸渍于第一粉末，100~150℃干燥12~24h，于300~500℃下焙烧6h，得到第二粉末；将第二粉末分散到去离子水中，加入纳米二氧化锆1~2质量份，超声分散后干燥，所得固体物质焙烧后粉碎，得到改性纳米二氧化硅。
8.根据权利要求7所述的一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法系统，其特征在于，所述纳米二氧化锆为改性纳米二氧化锆，所述纳米二氧化锆的改性方法为：取硝酸铈0.8~1.5质量份，氢氧化钠4~10质量份，去离子水40~50质量份，纳米二氧化锆0.5~0.8质量份，；将硝酸铈溶于20~25质量份的去离子水中，氢氧化钠溶于20~25质量嗯的去离子水中，将两份溶液混合，搅拌均匀，在高压环境中在140℃下反应48h后，去除一半的上清液，加入等体积的去离子水，加入纳米二氧化锆，搅拌均匀后，140℃下反应48h，过滤取固体物质，洗涤后干燥，在空气气氛中500~600℃焙烧3h，得到改性纳米二氧化锆。
9.根据权利要求8所述的一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法系统，其特征在于，所述硝酸铈1~1.5质量份，氢氧化钠6~10质量份，去离子水45~50质量份，纳米二氧化锆0.6~0.8质量份。
10.根据权利要求8所述的一种特异性干细胞修复病变胰岛的方法，其特征在于，所述硝酸铈1质量份，氢氧化钠6质量份，去离子水45质量份，纳米二氧化锆0.6质量份。
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