CN111225663A - 改进的超颗粒 - Google Patents

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A·维斯
F·卡鲁索
M·比约恩马尔姆
马玉添
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University of Melbourne
Bionics Institute of Australia
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Abstract

本公开涉及负载有高水平的有效载荷的改进的超颗粒以及用于生产所述超颗粒的方法。此类超颗粒可用于一系列治疗应用中，例如，以改善细胞的生长或存活和/或治疗疾病。

Description

改进的超颗粒
技术领域
本公开涉及负载有高水平的有效载荷的改进的超颗粒以及用于生产所述超颗粒的方法。此类超颗粒可用于一系列治疗应用中。
发明背景
介孔二氧化硅是已被广泛用于封装各种化合物和用于各种纳米结构材料的模板合成的具有极高表面积的多孔材料。虽然这种类型的多孔材料在诸如药物递送的各种各样的应用中令人关注，但是诸如有效负载和持续药物递送的各种问题仍未解决。
将希望提供这种类型的新材料以及制备此类材料的新方法，因为将预期，所述新材料可具有许多令人感兴趣的性质。
因此，需要改进的超颗粒。
发明内容
本公开基于可负载有高水平的有效载荷的超颗粒的意外产生。本发明人还已经鉴定，本公开的超颗粒似乎具有独特的孔径，这可说明增加的负载水平的原因。因此，在第一实例中，本公开涉及一种包含超颗粒的组合物，其中所述超颗粒包含至少1.5μg的有效载荷。在另一个实例中，本公开涉及一种包含超颗粒的组合物，其中所述超颗粒包含至少5μg的有效载荷。在另一个实例中，本公开涉及一种包含超颗粒的组合物，其中所述超颗粒包含至少8μg的有效载荷。在另一个实例中，本公开涉及一种包含超颗粒的组合物，其中所述超颗粒包含至少10μg的有效载荷。在另一个实例中，本公开涉及一种包含超颗粒的组合物，其中所述超颗粒包含1.5μg至10μg的有效载荷。
在一个实例中，所述超颗粒包含直径为至少60nm的孔。在另一个实例中，所述超颗粒包含直径为至少100nm的孔。在另一个实例中，所述超颗粒包含直径为至少60-200nm的孔。在另一个实例中，所述超颗粒包含直径为至少50-100nm的孔。
在另一个实例中，所述超颗粒具有无序孔结构。
在一个实例中，所述超颗粒由具有双峰孔结构的纳米颗粒组成。在一个实例中，所述纳米颗粒双峰孔结构具有大于30nm的大孔径。
在另一个实例中，所述有效载荷是小分子、肽或蛋白质。例如，所述有效载荷可以是抗体。在一个实例中，所述有效载荷是干细胞、病毒、核酸、神经营养因子、抗癌剂、神经保护剂或它们的组合。在一个实例中，所述有效载荷是神经营养因子。在另一个实例中，所述有效载荷是神经营养蛋白。在一个实例中，所述神经营养因子具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，所述有效载荷是神经营养蛋白-3。在另一个实例中，所述有效载荷是BDNF或神经营养蛋白-3。
在另一个实例中，所述超颗粒包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种不同的有效载荷。在另一个实例中，所述超颗粒包含至少两种有效载荷，一种有效载荷是神经营养因子。在另一实例中，所述超颗粒包含至少两种有效载荷，一种有效载荷是神经营养蛋白。
在其他实例中，本文公开的组合物包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个超颗粒。在这些实例中，所述超颗粒可包含不同的有效载荷。
在一个实例中，可通过将包含纳米颗粒的组合物电喷雾到双阳离子水溶液中来产生超颗粒。在一个实例中，所述包含纳米颗粒的组合物还包含海藻酸或所述海藻酸的多糖衍生物。因此，在一个实例中，可通过将包含纳米颗粒和海藻酸或所述海藻酸的多糖衍生物的组合物电喷雾到双阳离子水溶液中来产生超颗粒。在这些实例中产生的超颗粒可负载有1.5μg至15μg的有效载荷，如神经营养蛋白。在这些实例中，超颗粒也可在负载有效载荷之前进行煅烧以除去海藻酸。在一个实例中，在约650℃下进行煅烧。在一个实例中，进行所述煅烧持续约6至约30个小时。在一个实例中，海藻酸是海藻酸钠盐。因此，在一个实例中，本公开涵盖包含本文公开的超颗粒的组合物，其中通过将包含纳米颗粒和海藻酸或所述海藻酸的多糖衍生物的组合物电喷雾到双阳离子水溶液中来制造所述超颗粒。在此实例中，所述超颗粒可进行煅烧以除去海藻酸。在一个实例中，在约650℃下进行所述煅烧。在一个实例中，进行所述煅烧持续约6至约30个小时。
本发明人还已经鉴定，在一些方面，本文公开的超颗粒可在相对长的时间段内释放有效载荷。此外，在一些方面，本文公开的超颗粒可以各种制剂形式提供以操纵有效载荷的释放。例如，本发明人已经在某些实例中鉴定，根据本公开的超颗粒可在延长的持续时间内释放它们的相应有效载荷。他们还已经鉴定，在一些方面，本文公开的超颗粒可以各种制剂形式提供，以加速或减缓有效载荷的释放。因此，在一个实例中，本文公开的超颗粒或组合物可以缓释制剂的形式提供。在一个实例中，所述缓释制剂是泡沫或凝胶。在一个实例中，本文公开的组合物包含糖原水凝胶。在另一个实例中，本文公开的组合物包含海藻酸[(C6H8O6)n]或所述海藻酸的多糖衍生物。在另一个实例中，本文公开的组合物包含海藻酸钠盐[Na(C6H8O6)n]或所述海藻酸钠盐的多糖衍生物。
在一个实例中，本文公开的组合物以加速释放制剂的形式提供。在一个实例中，所述加速释放制剂是泡沫或凝胶。在一个实例中，所述凝胶或泡沫是热可逆的。例如，所述加速制剂可包含本文公开的超颗粒和基于PF127的水凝胶。
在另一个实例中，本公开涵盖本文所定义的组合物在制造用于治疗疾病或病症的药剂中的用途。在一个实例中，所述疾病或病症是听力损失。在一个实例中，所述听力损失被表征为感音神经性听力损失(SNHL)、老年性耳聋或由噪声诱导的。
在另一个实例中，本公开涵盖一种用于促进受试者的耳朵中的螺旋神经节神经元的存活的方法，所述方法包括向受试者施用本文所定义的组合物。例如，可将所述组合物施用至受试者的耳朵。
在另一个实例中，本公开涵盖一种用于治疗其中期望在受试者中持续递送治疗性有效载荷的疾患的方法，所述方法包括向受试者施用本文所定义的组合物。在一个实例中，将所述组合物施用至受试者的耳朵。在另一个实例中，腹膜内施用所述组合物。在另一个实例中，将所述组合物施用至中枢神经系统。在另一个实例中，经由脑室施用来施用所述组合物。在另一个实例中，在保留所述超颗粒的支架中施用所述组合物。
在另一个实例中，本公开涵盖一种当用于治疗疾病或病症时包括本文所定义的组合物的药盒。在一个实例中，所述病症是听力损失。在另一个实例中，所述药盒还包括耳蜗植入物。
本发明人还已经鉴定，对包含纳米颗粒和海藻酸的组合物进行电喷雾可产生可负载有高水平的有效载荷的超颗粒。因此，在一个实例中，本公开还涵盖一种当用于制造本文所定义的超颗粒时包含纳米颗粒和海藻酸的组合物。在一个实例中，海藻酸是海藻酸钠盐。
在另一个实例中，本公开涵盖一种制造超颗粒的方法，所述方法包括将包含纳米颗粒和海藻酸或所述海藻酸的多糖衍生物的组合物电喷雾到双阳离子水溶液中。在一个实例中，所述方法还包括使所述超颗粒经历煅烧以除去海藻酸。在一个实例中，在约650℃下进行煅烧。在一个实例中，进行所述煅烧持续约6至约30个小时。
除非另外明确陈述，否则本文的任何实施例都应被视为向任何其他实施例施加必要的变更。
本公开不限于本文所描述的特定实施例的范围，所述特定实施例仅意图出于示例性目的。如本文所描述，功能等效的产物、组合物和方法明确处于本发明的范围内。
在本说明书通篇中，除非另外具体陈述或上下文另外需要，否则提及单一步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组将视为涵盖那些步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组中的一个和多个(即一个或多个)。
本公开在下文中借助于以下非限制性实施例且参照附图进行描述。
附图说明
图1.制备MS-SP的程序。
图2.随不同pH值变化的MS-SP的ζ电位。在10mM乙酸钠缓冲液(pH 4)、10mM磷酸盐缓冲液(pH 6)、10mM HEPES缓冲液(pH 8)和10mM碳酸氢钠缓冲液(pH 10)中进行ζ电位测量。
图3.负载有FITC-溶菌酶(绿色)的MS-SP的共焦显微镜图像。a，b)不同放大倍数下的MS-SP。c)在负载有FITC-溶菌酶的片段化MS-SP内部。
图4.使用不同的FITC溶菌酶负载浓度，在3天(72小时)孵育时间后的药物负载。a)FITC溶菌酶到无孔MS-SPalg(黑色圆圈)、小孔MS-SPalg(蓝色正方形)和MS-SPalg(红色三角形)中的吸附量对比FITC-溶菌酶负载浓度。b)FITC溶菌酶到无孔MS-SP(黑色圆圈)、小孔MS-SP(蓝色正方形)和MS-SP(红色三角形)中的吸附量对比FITC-溶菌酶负载浓度。c)MS-SPalg中的FITC溶菌酶负载效率，以及d)MS-SP。所呈现的数据是各自使用五个SP的三次重复实验的平均值，并且误差线代表标准偏差。
图5.来自具有不同直径的MS-SP的FITC-溶菌酶负载和释放行为。a)FITC-溶菌酶负载量，b)体外FITC-溶菌酶释放特征，c)在每个单独时间点释放的FITC-溶菌酶的值，d)来自直径为200、550、650、1000μm的MS-SP的体外FITC-溶菌酶释放标准曲线。
图6.与不同数量的MS-SP一起孵育48小时的人脑成胶质细胞瘤细胞(U87MG细胞系)的细胞存活力。将乙醇添加至带有插入片段的细胞中制备为阴性(细胞毒性)对照，并且未处理的细胞代表100％存活力。所呈现的数据是四个样品的平均值，并且误差线代表标准偏差。
图7.体外累积药物释放特征。a).来自MS-SP(红色圆圈)和MS-SPalg(黑色三角形)的体外FITC-溶菌酶(0.2mg mL-1，药物负载3天)释放。所呈现的数据是各自使用十个SP的三次重复实验的平均值，并且误差线代表标准偏差。b)来自MS-SP的体外FITC-溶菌酶(1.0mgmL-1，药物负载3天)释放。(b)中的插图是从6天开始的体外FITC-溶菌酶释放特征。c)来自MS-SP(1.0mg mL-1，药物负载3天)的体外BDNF释放。BDNF ELISA(Abcam)用于测量BDNF浓度。
图8.MS-SPalg和MS-SP在每个单独时间点释放的FITC-溶菌酶的值(负载条件：负载100μL的0.2mg mL-1的FITC溶菌酶，3天负载时间)。所呈现的数据是各自使用十个超颗粒的三次重复实验的平均值，并且误差线代表标准偏差。
图9.MS-SP在每个单独时间点释放的FITC-溶菌酶的值(负载条件：在3天内负载100μL的1.0mg mL-1的FITC-溶菌酶)。药物负载是每个超颗粒6.49±0.48μg。所呈现的数据是各自使用十个MS-SP的三次重复实验的平均值，并且误差线代表标准偏差。
图10.体外BDNF药物研究在每个单独时间点的绝对值(负载条件：在3天内负载1.0mg mL-1BDNF)。所呈现的数据是各自使用一个MS-SP的三次重复实验的平均值，并且误差线代表标准偏差。
图11.a)MicroBCA测定用于测量来自MS-SP的BDNF。b)在使用MS-SP的每个单独时间点释放的BDNF的值。药物负载是每个超颗粒6.82μg。所呈现的数据是三次重复实验的平均值，并且误差线代表标准偏差。
图12.a)PF127水凝胶系统中MS-SP(红色圆圈)和MS-SPalg(黑色正方形)的体外FITC-溶菌酶释放特征。b)对于图(a)(负载100μL的0.2mg mL-1FITC-溶菌酶)，在每个单独的时间点释放的FITC-溶菌酶的值。在MS-SP和MS-SPalg中，药物负载分别是每个超颗粒1.89±0.08μg和每个超颗粒1.93±0.03μg。所呈现的数据是各自使用十个超颗粒的三次重复实验的平均值，并且误差线代表标准偏差。
图13.在50％负载(3.65μg/SP)时的体外释放特征
图14.在150天的体外药物释放研究后，MS-SP的降解。a)在37℃下在PBS(pH 7.4)中孵育150天后，MS-SP的SEM图像。b，c)在37℃下在PBS(pH 7.4)中孵育150天后，MS-SP的表面结构的SEM图像。
图15.示出神经营养蛋白-3的量(负载的％)和总量(μg)。在植入1周后，每个SP均含有约2ug的初始负载量的神经营养蛋白-3(约40％)。
具体实施方式
通用技术和选定的定义
除非另外明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都应视为具有与由本领域(例如生理学、临床研究、分子生物学、高表面积分子、电喷雾和生物化学)的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
除非另有说明，否则本公开中使用的技术是本领域技术人员众所周知的标准程序。此类技术在如以下的资源的文献中进行了描述并且说明：J.Perbal，A PracticalGuide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)；J.Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)；T.A.Brown(编辑)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，第1卷和第2卷，IRLPress(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，以及F.M.Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括迄今为止所有更新版本)；Ed Harlow和David Lane(editors)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)；以及J.E.Coligan等(编辑)，Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons(包括迄今为止所有更新版本)。
如在本说明书和所附权利要求中所使用，单数和单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”中的术语例如任选地包括复数指代物，除非内容另外明确表明。因此，例如，提及“一个超颗粒”包括多个超颗粒。
除非相反陈述，否则如本文所用，术语“约”是指指定值的+/-10％、更优选+/-5％、更优选/-1％。
术语“和/或”(例如“X和/或Y”)应理解为表示“X和Y”或“X或Y”，且应视为提供对两种含义或任一含义的明确支持。
在整篇本说明书中，词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变化形式应理解为暗示包括所述要素、整数或步骤、或一组要素、整数或步骤，而非排除任何其他要素、整数或步骤、或一组要素、整数或步骤。
如本文所用，术语“治疗”是指设计用来在临床病理学过程中改变所治疗的个体或细胞的自然过程的临床介入。治疗的示例性合乎需要的作用包括减轻与所治疗病症相关的症状。在治疗听力损失的情况下，合乎需要的治疗作用包括降低听力损失的速率和改善或减轻听力损失。例如在与病症相关的一种或多种症状得以减轻或消除时，个体得到成功“治疗”。
“治疗有效量”是指实现特定病症的可测量的改善所需的至少最低量。治疗有效量还可至少包括在受试者病症中实现可测量的改善所需的最小量。有效量可在一次或多次施用中提供。治疗有效量可根据所治疗病症的严重程度以及还根据所治疗受试者的体重、年龄、种族背景、性别、健康和/或身体状况而变化。通常，有效量将处于可以通过医学从业者的常规试验和实验来确定的相对广泛的范围(例如“剂量”范围)内。治疗有效量可在单次剂量或在治疗期内在重复一次或若干次的剂量中施用。
有效载荷
根据本公开，超颗粒可包含各种有效载荷。“有效载荷”可以是可用于治疗病症的任何剂。剂的实例包括生物产物，如多核苷酸、抗体、单克隆抗体、抗体片段、抗体药物缀合物、蛋白质、生物活性蛋白质、融合蛋白、重组蛋白、肽、多肽、合成多肽、疫苗、治疗性血清、病毒、多核苷酸、细胞(如干细胞或其部分)以及小分子。
示例性病毒有效载荷可包括适当修饰的逆转录病毒、腺病毒(AdV)、腺相关病毒(AAV)或重组形式，如重组腺相关病毒(rAAV)及其衍生物，如自互补AAV(scAAV)和非整合AV。其他示例性病毒治疗性有效载荷可包括单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒、痘苗和水疱性口炎病毒(VSV)。例如，所述病毒治疗性有效载荷可包括AAV。各种AAV血清型是已知的并且可以是适合的病毒有效载荷。在一个实例中，所述AAV是血清型2。在另一个实例中，所述AAV是血清型1。在其他实例中，所述AAV是血清型3、4、7、8、9、10、11、12或13。
在一个实例中，所述小分子是神经递质。术语“神经递质”在本公开的上下文中用来指跨化学突触将信号从一个细胞传递至另一细胞的物质。一般而言，神经递质跨化学突触将信号从一个神经元传递至靶细胞，如另一神经元、肌肉细胞或腺细胞。在另一个实例中，所述小分子是受体激动剂。术语“激动剂”在本公开的上下文中用来指当与受体组合时引发生理应答的物质。在另一个实例中，所述小分子是受体拮抗剂。术语“拮抗剂”在本公开的上下文中用来指干扰或抑制受体的生理作用的物质。
示例性多核苷酸包括反义多核苷酸、双链DNA(dsDNA)或双链RNA(dsRNA)。在一个实例中，所述dsDNA或dsRNA是适体。在另一个实例中，所述dsRNA是siKNA、miRNA或shRNA。
示例性抗体及其片段包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体或单结构域抗体。在一个实例中，所述抗体可以是双特异性的抗体-药物缀合物或生物类似抗体。其他示例性多肽包括细胞因子、趋化因子、激素和凝血因子。在一个实例中，所述多肽是酶。示例性酶包括蛋白酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、1iprotamase、组织纤溶酶原活化物、胶原酶、谷氨酰胺酶、透明质酸酶、链激酶、尿酸酶、尿激酶或核酸酶，如可编程核酸酶。在一个实例中，所述酶可以是DNA甲基转移酶。在一个实例中，所述酶可以是靶向将遗传修饰引入基因或其调控因子区域中的可编程核酸酶。例如，所述可编程核酸酶可以是RNA引导的工程化核酸酶(RGEN)。在一个实例中，所述RGEN来自古细菌基因组或者可以是其重组型式。在另一个实例中，所述RGEN可来自细菌基因组或其重组型式。在另一个例子中，所述RGEN来自I型(CRISPR)-cas(CRISPR-相关)系统。在另一个实例中，所述RGEN来自II型(CRISPR)-cas(CRISPR-相关)系统。在另一个实例中，所述RGEN来自III型(CRISPR)-cas(CRISPR-相关)系统。在一个实例中，所述核酸酶来自I类RGEN或II类RGEN。
在另一个实例中，所述治疗有效载荷是DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰基转移酶抑制剂或组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
在另一个实例中，所述治疗性有效载荷可以是在受试者中刺激免疫应答的抗原。示例性抗原包括蛋白质、肽、多糖或寡糖(游离或与蛋白质载体缀合)或它们的混合物。其他示例性抗原包括细胞或其部分或病毒颗粒或其部分。
在一个实例中，所述治疗性有效载荷是抗肿瘤剂。
其他示例性治疗性有效载荷包括针对内耳中的膜受体的激动剂或拮抗剂。此类治疗性有效载荷可调节神经传递。在另一个实例中，所述治疗性有效载荷是可用于治疗一种或多种神经系统病症如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癫痫或多发性硬化症的神经学剂。
在一个实例中，所述有效载荷是“神经营养因子”。术语神经营养因子在本公开的上下文中用来指增强任何细胞(包括来自听觉系统的那些细胞)的生长或存活潜力的分子。例如，本公开涵盖的神经营养因子可增强来自听觉系统的细胞或所述细胞的位于内耳、中耳或前庭系统中的突触连接的生长或存活。示例性细胞包括螺旋神经节神经元(SGN)、毛细胞(包括内耳毛细胞和外耳毛细胞)、耳蜗神经胶质细胞和施万细胞。示例性突触连接包括毛细胞之间、毛细胞与SGN或以上论述的其他神经元之间的连接。其他实例包括卢森塔尔管(Rosenthal’s canal)中的神经元细胞体或它们的突触连接、上中耳蜗区域中的神经元或突触连接和/或骨螺旋板中的神经纤维。
示例性神经营养因子可包括以上论述的具有用于直接或间接地增强来自听觉系统的细胞和/或所述细胞的突触连接的存活的已知治疗功效的剂。
在一个实例中，所述神经营养因子是神经营养肽。示例性神经营养肽包括脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、睫状神经营养因子(CNTF)家族的成员如CNTF、白血病抑制因子(LIF)、白介素-6(IL-6)、神经胶质成熟因子(GMF)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、神经调节蛋白1、神经调节蛋白2、神经调节蛋白3和神经调节蛋白4、血管内皮生长因子(VEGF)、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)家族的成员如GDNF、神经秩蛋白(NRTN)、artemin(ARTN)和persephin(PSPN)、肝配蛋白如A1、A2、A3、A4、A5、B1、B2和B3、胰岛素生长因子-1(IGF-1)和白介素如IL-11。
在一个实例中，所述神经营养因子选自由以下组成的组：脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和IL-11。
螺旋神经节神经元变性的一个原因是神经营养蛋白的内源性供应的丧失。因此，在一个实例中，所述神经营养因子是神经营养蛋白。术语“神经营养蛋白”在本公开的上下文中用来指诱导神经元的存活、发育和/或功能和/或神经元的突触连接的蛋白质。示例性神经营养蛋白在上文进行了论述并且包括BDNF、神经生长因子、神经营养蛋白-3和神经营养蛋白-4。因此，在一个实例中，所述超颗粒包含BDNF。在另一个实例中，所述超颗粒包含神经生长因子。在另一个实例中，所述超颗粒包含神经营养蛋白-3。在另一个实例中，所述超颗粒包含神经营养蛋白-4。在一个实例中，超颗粒可包含至少两种不同的神经营养蛋白。在其他实例中，超颗粒可包含至少三种或四种不同的神经营养蛋白。
通过施用包含多种不同的治疗性有效载荷的超颗粒可改善治疗功效。因此，在一个实例中，超颗粒可包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少10种不同的治疗性有效载荷。
例如，超颗粒可包含至少两种不同的神经营养因子。在其他实例中，超颗粒可包含至少三种、至少四种、至少五种不同的神经营养因子。在这些实例中，考虑了神经营养因子如神经营养蛋白的各种组合。神经营养因子的示例性组合包括BDNF和神经生长因子；BDNF和神经营养蛋白-3；BDNF和神经营养蛋白-4；BDNF和CNTF；BDNF和GDNF；BDNF和IL-11；神经营养蛋白-3和神经营养蛋白-4；神经营养蛋白-3和CNTF；神经营养蛋白-3和CNTF；神经营养蛋白-3和GDNF；神经营养蛋白-3和IL-11；神经营养蛋白-4和CNTF；神经营养蛋白-4和GDNF；神经营养蛋白-4和IL-11；CNTF和GDNF；CNTF和IL-11；GDNF和IL-11；BDNF、神经营养蛋白-3和神经营养蛋白-4；BDNF、神经营养蛋白-3和CNTF；BDNF，神经营养蛋白-3和GDNF；BDNF、CNTF和GDNF；BDNF、CNTF和IL-11；神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4和CNTF；神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4和GDNF；神经营养蛋白-3、CDNF和GDNF；神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4和IL-11；神经营养蛋白-4、CNTF和GDNF；神经营养蛋白-4、CNTF和IL-11；BDNF、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4和CNTF；BDNF、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4和GDNF；BDNF、神经营养蛋白-3、CNTF和GDNF；BDNF、神经营养蛋白-4、CNTF和GDNF；BDNF、BDNF、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4和IL-11；神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、CNTF和GDNF；神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、CNTF和IL-11。
各种耳部干预(如手术程序和听力装置的植入)可导致副作用，如中耳和内耳的组织损伤、炎症和/或感染。针对此类副作用的生物应答可间接地影响来自听觉系统的细胞和/或所述细胞的突触连接的生长或存活潜力。因此，在一个实例中，神经营养因子有助于组织修复、减轻炎症和/或减少感染。因此，另外的示例性神经营养因子包括类固醇或抗氧化剂。其他示例性神经营养因子包括抗体或其他结合蛋白，如抗-原肌球蛋白受体激酶(TrK)B、抗-TrK C或与p75神经营养蛋白受体相互作用的结合蛋白。例如，p75神经营养蛋白受体拮抗剂。在另一个实例中，神经营养因子包括核酸。例如，神经营养因子可包括基因疗法、沉默RNA(如siRNA或miRNA)、表达构建体(如包含目标核酸的DNA质粒)。在一个实例中，所述神经营养因子是包含编码视蛋白的核酸的表达构建体。
神经营养因子的另外示例性组合包括类固醇、抗氧化剂、抗体或核酸以及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同的神经营养因子。例如，超颗粒可包含类固醇如地塞米松或泼尼松龙，以及BDNF、神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4和GDNF中的任何一种或多种。在另一个实例中，超颗粒可包含表达载体，所述表达载体包含视蛋白以及BDNF、神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4和GDNF中的任何一种或多种。在另一个实例中，超颗粒可包含抗体如抗原肌球蛋白受体激酶(TrK)B或抗TrK C，以及BDNF、神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、GDNF和IL-11中的任何一种或多种。
在一个实例中，超颗粒可包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同的治疗性有效载荷，其中至少一种治疗性有效载荷是神经营养因子。例如，超颗粒可包含至少三种不同的治疗性有效载荷，其中两种治疗性有效载荷是神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒可包含至少四种不同的治疗性有效载荷，其中三种治疗性有效载荷是神经营养因子。在这些实例中，所述治疗性有效载荷不需要增强来自听觉系统的细胞的生长或存活潜力，而是可提供另一种治疗益处。例如，治疗性有效载荷可在超颗粒施用后抑制受试者的免疫系统。在另一个实例中，超颗粒可包含降低来自听觉系统的细胞或所述细胞的突触连接的存活的有效载荷和神经营养因子。在此实例中，所述神经营养因子可减轻由治疗性有效载荷引起的来自听觉系统的细胞或所述细胞的突触连接的存活降低。在一个实例中，超颗粒包含抗肿瘤剂，包括顺铂或相关化合物；抗生素，包括氨基糖苷，如妥布霉素或相关化合物；髓袢利尿剂如呋塞米；抗代谢物，如甲氨蝶呤；水杨酸酯，如阿司匹林或放射性部分以及神经营养因子。为此，超颗粒可包含抗生素以及BDNF、神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、GDNF和IL-11中的任何一种或多种。
取决于施用部位，有效载荷可能需要从中耳扩散至内耳或前庭系统。这可经由有效载荷在圆窗或卵圆窗上的扩散发生。因此，在一个实例中，超颗粒可包含帮助有效载荷跨过圆窗和卵圆窗扩散至内耳和/或前庭系统的分子。
在一个实例中，所述有效载荷具有大于7的等电点。在另一个实例中，所述有效载荷具有大于8的等电点。在另一个实例中，所述有效载荷具有大于9的等电点。在另一个实例中，所述有效载荷具有大于10的等电点。在另一个实例中，所述有效载荷具有介于7与10之间的等电点。在另一个实例中，所述有效载荷具有介于7与9之间的等电点。在另一个实例中，所述有效载荷具有介于8与10之间的等电点。在另一个实例中，所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。
在本公开的上下文中，包含有效载荷的超颗粒可被称为经负载的超颗粒。对产生经负载的超颗粒的方法没有特别限制，只要所得超颗粒可负载有至少1.5μg的有效载荷即可。优选地，所得超颗粒可将有效载荷递送至受试者的耳朵。示例性的负载方法综述于Wang等人(2009)J.Mater.Chem.19，6451中并且包括有效载荷封装和包埋。在一个非限制性实例中，可通过使超颗粒与有效载荷的水溶液接触、然后孵育一段时间来负载超颗粒。有效载荷溶液可含有过量的量的待负载到超颗粒上的有效载荷，并且孵育可在室温下发生。含有超颗粒和有效载荷的溶液的搅动可用于增强有效载荷的负载。
本领域的技术人员将了解，有效载荷的所需水平将可能受到有效载荷本身和根据本公开待治疗的适应症的影响。
超颗粒
术语“超颗粒”(“SP”)在本公开的上下文中用来指包括孔网络的附聚颗粒。孔网络为超颗粒提供较大的孔体积和表面积，以携带有效载荷。大的孔体积和表面积是有利的，因为它可增加超颗粒能够携带的有效载荷的量。在一个实例中，根据本公开的超颗粒是附聚纳米颗粒。
在一个实例中，根据本公开的超颗粒包含至少1.5μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少2.0μg的有效载荷。
在另一个实例中，根据本发明的超颗粒包含至少2.5μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少2.6μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少2.7μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少2.7μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少2.8μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少2.9μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.0μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.1μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.2μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.3μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.4μg的有效载荷。在另一个例子中，超颗粒包含至少3.5μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.6μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.7μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.8μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.9μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少4.0μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少4.5μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少5.0μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少5.5μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少6.0μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少6.5μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少7.0μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少7.5μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少8.0μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少8.5μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少9.0μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少9.5μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少10μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少10.5μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少11μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少11.5μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少12μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少15μg的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒包含至少20μg的有效载荷。
例如，超颗粒可包含至少6μg的有效载荷。
在另一个实例中，超颗粒可包含介于约2.5与10μg之间的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约3与10μg之间的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约4与10μg之间的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约5与10μg之间的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约6与10μg之间的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约5与15μg之间的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约5与20μg之间的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约8与20μg之间的有效载荷。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约8与15μg之间的有效载荷。
例如，超颗粒可包含介于约6与8μg之间的有效载荷。
在一个实例中，根据本公开的超颗粒包含至少1.5μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少2.0μg的神经营养因子。
在另一个实例中，超颗粒包含至少2.5μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.0μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.5μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少4.0μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少5.0μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少6.0μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少7.0μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少8.0μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少9.0μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少10μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少10.5μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少11μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少11.5μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少12μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少15μg的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒包含至少20μg的神经营养因子。
例如，超颗粒可包含至少6μg的神经营养因子。
在另一个实例中，超颗粒可包含介于约2.5与10μg之间的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约5与10μg之间的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约6与10μg之间的神经营养因子。例如，超颗粒可包含介于约6与8μg之间的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约5与15μg之间的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约5与20μg之间的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约8与20μg之间的神经营养因子。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约8与15μg之间的神经营养因子。
在一个实例中，根据本公开的超颗粒包含至少1.5μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少2.0μg的神经营养蛋白。
在另一个实例中，超颗粒包含至少2.5μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.0μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.5μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少4.0μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少5.0μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少6.0μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少7.0μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少8.0μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少9.0μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少10μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少10.5μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少11μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少11.5μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少12μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少15μg的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒包含至少20μg的神经营养蛋白。
例如，超颗粒可包含至少6μg的神经营养蛋白。
在另一个实例中，超颗粒可包含介于约2.5与10μg之间的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约5与10μg之间的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约6与10μg之间的神经营养蛋白。例如，超颗粒可包含介于约6与8μg之间的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约5与15μg之间的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约5与20μg之间的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约8与20μg之间的神经营养蛋白。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约8与15μg之间的神经营养蛋白。
在一个实例中，根据本公开的超颗粒包含至少1.5μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少2.0μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。
在另一个实例中，超颗粒包含至少2.5μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.0μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少3.5μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少4.0μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少5.0μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少6.0μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少7.0μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少8.0μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少9.0μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少10μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少10.5μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少11μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少11.5μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少12μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少15μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒包含至少20μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。
例如，超颗粒可包含至少6μg的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。
在另一个实例中，超颗粒可包含介于约2.5与10μg之间的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约5与10μg之间的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约6与10μg之间的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。例如，超颗粒可包含介于约6与8μg之间的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约5与20μg之间的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约5与15μg之间的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约8与20μg之间的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。在另一个实例中，超颗粒可包含介于约8与15μg之间的有效载荷，其中所述有效载荷具有介于9与10之间的等电点。例如，所述有效载荷可以是具有介于9与10之间的等电点的神经营养蛋白。
在一个实例中，可在海藻酸盐水凝胶中提供具有上述有效载荷的超颗粒。
本公开的超颗粒可负载有以上例示的有效载荷，并且可具有选自下文论述的实例的孔径。在一个实例中，超颗粒是微孔的。术语“微孔”在本公开的上下文中用来指具有小于约2nm的孔径的颗粒。例如，微孔超颗粒可具有约0.5nm至约2nm的孔径。在其他实例中，微孔超颗粒具有约1nm至约2nm、约1.5nm至约2nm的孔径。在另一个实例中，超颗粒是介孔的。术语“介孔的”在本公开的上下文中用来指具有直径介于约2nm与约50nm之间的孔的颗粒。例如，介孔超颗粒可具有约2nm至约50nm的孔径。在其他实例中，介孔超颗粒具有约2nm至约40nm、约2nm至约30nm的孔径。在另一个实例中，超颗粒是大孔的。术语“大孔的”在本公开的上下文中用来指具有大于约50nm的孔径的颗粒。例如，大孔超颗粒可具有约50nm至约500nm的孔径。在其他实例中，大孔超颗粒具有约50nm至约250nm、约50nm至约150nm、约50nm至约100nm的孔径。
在一个实例中，超颗粒由微孔纳米颗粒组成。在一个实例中，超颗粒由孔径为约0.5nm至约2nm的纳米颗粒组成。在其他实例中，超颗粒由孔径为约1nm至约2nm、约1.5nm至约2nm的纳米颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由介孔纳米颗粒组成。在一个实例中，超颗粒由孔径为约2nm至约50nm的纳米颗粒组成。在其他实例中，超颗粒由孔径为约2nm至约40nm、约2nm至约30nm的纳米颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由大孔纳米颗粒组成。在一个实例中，超颗粒由孔径为约50am至约95nm的纳米颗粒组成。在其他实例中，超颗粒由孔径为约50nm至约85nm、约50nm至约75nm、约50nm至约65nm的纳米颗粒组成。
在另一个实例中，超颗粒由具有双峰孔结构的纳米颗粒组成。术语“双峰”在本公开的上下文中用来指包括多个孔径，通常较小的孔径和较大的孔径的颗粒。例如，超颗粒可包含具有介孔和大孔的纳米颗粒。在一个实例中，此类超颗粒由具有2nm至95nm范围内的孔的纳米颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由具有10nm至95nm范围内的孔的双峰纳米颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由具有15nm至95nm范围内的孔的双峰纳米颗粒组成。
在其他实例中，超颗粒可包括1nm至200nm范围内的孔径。在其他实例中，超颗粒由具有约1nm至约5nm的较小孔径和约10nm至约50nm的较大孔径的双峰纳米颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由具有约2nm至约4nm的较小孔径和约15nm至约40nm的较大孔径的双峰纳米颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由具有约2nm至约3nm的较小孔径和约4nm至约40nm的较大孔径的双峰纳米颗粒组成。在其他实例中，超颗粒由具有约10nm至约50nm的较小孔径和约70nm至约95nm的较大孔径的双峰纳米颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由具有约15nm至约40nm的较小孔径和约80nm至约95nm的较大孔径的双峰纳米颗粒组成。
在一个实例中，超颗粒由微颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由微孔微颗粒组成。在一个实例中，超颗粒由孔径为约0.5nm至约2nm的微颗粒组成。在其他实例中，超颗粒由孔径为约1nm至约2nm、约1.5nm至约2nm的微颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由介孔微颗粒组成。在一个实例中，超颗粒由孔径为约2nm至约50nm的微颗粒组成。在其他实例中，超颗粒由孔径为约2nm至约40nm、约2nm至约30nm的微颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由大孔微颗粒组成。在一个实例中，超颗粒由孔径为约50nm至约500nm的微颗粒组成。在其他实例中，超颗粒由孔径为约50nm至约250nm、约50nm至约150nm、约50nm至约100nm的微颗粒组成。
在另一个实例中，超颗粒由具有双峰孔结构的微颗粒组成。例如，超颗粒可包括具有介孔和大孔的微颗粒。在一个实例中，此类超颗粒由具有2nm至500nm范围内的孔的微颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由具有10nm至250nm范围内的孔的双峰微颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由具有15nm至150nm范围内的孔的双峰微颗粒组成。
在其他实例中，超颗粒由具有约1nm至约5nm的较小孔径和约10nm至约50nm的较大孔径的双峰微颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由具有约2nm至约4nm的较小孔径和约15nm至约70nm的较大孔径的双峰微颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由具有约2nm至约3nm的较小孔径和约15nm至约65nm的较大孔径的双峰微颗粒组成。在其他实例中，超颗粒由具有约10nm至约30nm的较小孔径和约15nm至约200nm的较大孔径的双峰微颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由具有约15nm至约40nm的较小孔径和约15nm至约150nm的较大孔径的双峰微颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由具有约20nm至约30nm的较小孔径和约100nm至约120nm的较大孔径的双峰微颗粒组成。
在另一个实例中，超颗粒负载有至少3μg的上述有效载荷，并且由具有约2nm至约4nm的较小孔径和约15nm至约40nm的较大孔径的双峰纳米颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒负载有至少5μg的上述有效载荷，并且由具有约2nm至约4nm的较小孔径和约15nm至约40nm的较大孔径的双峰纳米颗粒组成。
在另一个实例中，超颗粒负载有至少8μg的上述有效载荷，并且由具有约2nm至约4nm的较小孔径和约15nm至约40nm的较大孔径的双峰纳米颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒负载有至少10μg的上述有效载荷，并且由具有约2nm至约4nm的较小孔径和约15nm至约40nm的较大孔径的双峰纳米颗粒组成。在这些实例中，所述超颗粒可以海藻酸盐水凝胶的形式提供。
在另一个实例中，超颗粒由微颗粒和纳米颗粒组成。在此实例中，微颗粒和纳米颗粒可具有以上提及的孔径。例如，超颗粒可由具有双峰孔结构的微颗粒和纳米颗粒组成。
在一个实例中，超颗粒可具有基本上均匀的孔径。在另一个实例中，超颗粒具有可变的孔径。在此实例中，孔径可以是可变的，但是落在特定尺寸范围内。例如，超颗粒可主要是介孔的。在另一个实例中，超颗粒可主要是大孔的。在另一个实例中，超颗粒由具有基本上均匀的孔径的纳米颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由具有基本上均匀的小孔径和大孔径的双峰纳米颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由具有基本上均匀的孔径的微颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒由具有基本上均匀的小孔径和大孔径的双峰微颗粒组成。
在一个实例中，以上提及的超颗粒可具有有序的孔结构。这些超颗粒具有带规则的三维间距的孔。在另一个实例中，以上提及的超颗粒可具有无序的孔结构。这些超颗粒具有带不规则的三维间距的孔。在另一个实例中，超颗粒具有有序孔结构和无序孔结构两者的组合。
本领域技术人员将认识到，超颗粒孔径可通过例如透射电子显微术(TEM)、扫描电子显微术(SEM)和X射线计算机断层摄影术来测量。本领域技术人员可通过测量跨超颗粒的三维结构的最宽点的宽度来鉴定具有以上例示的孔径的超颗粒。在一个实例中，所述最宽点或孔可位于超颗粒的表面。
本公开的超颗粒可通过其颗粒之间的距离来表征。在一个实例中，颗粒之间的平均距离可在约80nm至约400nm的范围内。在另一个实例中，胶体颗粒之间的平均距离在约90nm至约300nm、约100nm至的范围内。
在一个实例中，超颗粒孔是连通的。例如，超颗粒可包含一系列互相连通的孔。在另一个实例中，超颗粒孔不连通。在另一个实例中，超颗粒具有连通孔和不连通孔两者的组合。
本公开的超颗粒的特征可在于它们的孔的体积。在一个实例中，超颗粒孔体积在约0.5mLg-1至约10mLg-1的范围内。在另一个实例中，超颗粒具有约0.8mLg-1至约5mLg-1、约1mLg-1至约2.5mLg-1、约1.5mLg-1至约2mLg-1的孔体积。
本公开的超颗粒可具有中空核心或环形核心。在一个实例中，超颗粒核心的内部体积是所述超颗粒的总体积的至少约45％、至少约55％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％。产生中空核心超颗粒的示例性方法包括酸核工艺，如在US 4,468,498中描述的那些；和酯核工艺，如在US 5,157,084和5,521,253中描述的那些。
本公开的超颗粒的特征可在于它们的结构的表面积。在一个实例中，超颗粒的表面积在约500m2g-1至约1500m2g-1的范围内。在另一个实例中，超颗粒具有介于约5500m2g-1与约1250m2g-1、约600m2g-1与1000m2g-1、约600m2g-1与700m2g-1之间的表面积。在一个实例中，超颗粒的表面积是约600m2g-1。在一个实例中，超颗粒的表面积是约620m2g-1。
根据本公开的超颗粒的特征可在于特定的体外释放特征。在一个实例中，超颗粒释放有效载荷持续至少50天。在一个实例中，超颗粒释放有效载荷持续至少100天。在一个实例中，超颗粒释放有效载荷持续至少150天。
在另一个实例中，超颗粒释放有效载荷的初始突释，随后有效载荷的持续释放。例如，超颗粒释放高水平的有效载荷持续约3至10天，随后30天或更长时间的持续释放特征。在另一个实例中，超颗粒释放高水平的有效载荷持续约8至10天，随后50天或更长时间的持续释放特征。
在一个实例中，有效载荷的初始突释是1.2μg/天持续至少2天。在另一个实例中，有效载荷的初始突释是1.3μg/天持续至少3天。在另一个实例中，有效载荷的初始突释是1.4μg/天持续2至4天。持续释放特征的一个实例是至少0.04μg/天。持续释放特征的另一个实例是至少0.06μg/天。持续释放特征的其他实例是至少0.07μg/天和至少0.1μg/天。
在另一个实例中，超颗粒释放至少2μg的有效载荷持续至少20天。在另一个实例中，超颗粒释放至少2μg的有效载荷持续至少30天。在另一个实例中，超颗粒释放至少2μg的有效载荷持续至少40天。在另一个实例中，超颗粒释放至少4μg的有效载荷持续至少20天。在另一个实例中，超颗粒释放至少4μg的有效载荷持续至少30天。在另一个实例中，超颗粒释放至少4μg的有效载荷持续至少40天。
在另一个实例中，超颗粒释放至少2μg的神经营养因子持续至少20天。在另一个实例中，超颗粒释放至少2μg的神经营养因子持续至少30天。在另一个实例中，超颗粒释放至少2μg的神经营养因子持续至少40天。在另一个实例中，超颗粒释放至少4μg的神经营养因子持续至少20天。在另一个实例中，超颗粒释放至少4μg的神经营养因子持续至少30天。在另一个实例中，超颗粒释放至少4μg的神经营养因子持续至少40天。例如，超颗粒释放至少2μg的BDNF持续至少20天。在其他实例中，超颗粒可释放至少2μg的BDNF持续至少40天。在另一个实例中，超颗粒可释放至少4μg的BDNF持续至少20天。在另一个实例中，超颗粒可释放至少4μg的BDNF持续至少40天。
本领域技术人员可使用多种方法来测量超颗粒的体外释放特征。此类方法的实例在下文的实施例7中论述。例如，本文公开的超颗粒可在溶液如PBS中孵育之前负载有标记的有效载荷，如FITC-溶菌酶。荧光的间歇测量可用于确定随时间推移释放的有效载荷的水平(例如μg)。
在一个实例中，本公开的超颗粒由直径介于约1nm与100nm之间的纳米颗粒产生。在另一个实例中，超颗粒由直径介于约0.1μm与100μm之间的微颗粒产生。在另一个实例中，超颗粒由纳米颗粒和微颗粒产生。
形成本公开的超颗粒的示例性颗粒包括有机颗粒、无机颗粒、金属颗粒或它们的组合。示例性的有机颗粒包括聚合物颗粒，如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚(甲基丙烯酸)、聚(乙基丙烯酸)、聚丙烯酸(PAA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)、聚酰胺、聚-2-羟基丁酸酯(PHB)、明胶、聚己内酯(PCL)以及聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)。示例性的无机颗粒包括矿物填料如重质填料或高密度填料、颜料、粘土和其他合成颗粒。其他示例性无机颗粒包括矿物质，如重晶石、赤铁矿、氧化镁，包括二氧化钛、氧化钙、氧化锌、氧化镁、氧化铈、二氧化锆和二氧化硅在内的无机氧化物。在一个实例中，所述材料是二氧化硅(silicondioxide)(即二氧化硅(silica))。因此，在一个实例中，超颗粒可被称为二氧化硅超颗粒。示例性的金属颗粒包括金、银和铜。在一个实例中，超颗粒可包含相同的颗粒。例如，超颗粒可基本上由二氧化硅颗粒组成。在另一个实例中，超颗粒可包含不同的颗粒；例如二氧化硅和粘土颗粒。在其他实例中，超颗粒可包含至少三种、至少四种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种不同的颗粒。
在一个实例中，超颗粒包含聚电解质或聚电解质材料。此类超颗粒的实例公开于WO 2006/037160中。在此实例中，聚电解质可以是带正电的聚电解质(或具有带正电的能力)或带负电的聚电解质(或具有带负电的能力)或具有零净电荷。
本公开的超颗粒可具有各种形状。例如，超颗粒可具有球形形状。示例性球形形状包括球形和卵形。在另一个实例中，超颗粒具有非球形形状。示例性的非球形形状包括哑铃形、半球形、盘形、四面体形、纤维形、球柱形和不规则形状。在一个实例中，超颗粒可具有有序结构。例如，超颗粒可包含有序阵列。
本公开的球形超颗粒可通过它们的直径来表征。例如，本公开的超颗粒具有大于100μm的直径。例如，本公开的超颗粒可具有至少约150μm、约200μm、约250μm、约300μm、约350μm、约400μm、约450μm、约500μm、约550μm、约600μm、约650μm、约700μm、约750μm、约800μm、约850μm、约900μm、约950μm、约1000μm的直径。例如，超颗粒可具有约550μm的直径。超颗粒的这种直径是有利的，因为它允许高药物负载，同时有助于经由套管内耳递送。在其他实例中，超颗粒可具有介于约150μm与约1000μm、约200μm与约900μm、约300μm与约800μm之间的直径。在另一个实例中，超颗粒可具有介于约400μm与约600μm之间的直径。在另一个实例中，超颗粒可具有介于约450μm与约550μm之间的直径。在另一个实例中，超颗粒可具有介于约520μm与约580μm之间的直径。在另一个实例中，超颗粒可具有介于约460μm与约540μm之间的直径。在另一个实例中，超颗粒可具有介于约470μm与约530μm之间的直径。在另一个实例中，超颗粒可具有介于约480μm与约520μm之间的直径。在另一个实例中，超颗粒可具有介于约490μm与约510μm之间的直径。在其他实例中，超颗粒的特征可在于跨它们的三维结构的最宽点的宽度。例如，超颗粒可具有与以上例示的直径一致的宽度。
在另一个实例中，通过添加功能性部分来对超颗粒表面进行改性以增强有效载荷的负载。可将任何数量的功能性部分添加至超颗粒的表面，选择功能性部分的选择以补充所负载的有效载荷。在一个实例中，将诸如3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)的部分接枝到二氧化硅超颗粒的表面上。这引入可与有效载荷上存在的任何羧基相互作用的胺官能团。在另一个实例中，对超颗粒进行改性以携带可增强有效载荷的负载的总体净电荷(Tan等人Adv.Mater.(2012)24，3362-3366)。例如，可对超颗粒的表面进行改性以携带总体净正电荷，以使得携带总体净负电荷的有效载荷的负载增强。在另一个实例中，对超颗粒的表面进行改性携带总体净负电荷，以使得携带总体净正电荷的有效载荷的负载增强。
本公开的超颗粒还可包含交联的功能性部分。例如，功能性部分可通过化学反应交联。在一个实例中，聚乙醇酸(PGA)分子通过PGA分子与胱胺的化学反应而交联(Tan等人Adv.Mater.(2012)24，3362-3366)。
制剂
可将超颗粒配制为适合施用至受试者的药物组合物。示例性药物组合物可单独提供超颗粒或与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合提供超颗粒。在这些组合物中，以足以向受试者递送治疗有效量的有效载荷的量提供超颗粒。根据取决于特定施用途径，可使用本领域中已知的多种可接受的载体，例如像Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)中所描述。
示例性药用组合物还可包含药学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、混悬液、乳液，以及仅在使用前重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。适合的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适混合物、植物油和可注射的有机酯如油酸乙酯。适当流动性可例如通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散液的情况下通过维持所要求的粒度、以及通过使用表面活性剂来维持。此类组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂或抗菌剂和抗真菌剂。
在另一个实例中，超颗粒可并入缓释或靶向递送系统中。例如，本发明人已经鉴定，向本文公开的超颗粒提供海藻酸盐水凝胶减缓有效载荷从超颗粒的释放。此类缓释系统可包括用于局部施用的泡沫、凝胶、滴剂和喷雾剂，或用于注射或注射套管的贮库。示例性缓释系统包括聚合物基质、脂质体和微球。聚合物基质包括基于储库的系统，其中超颗粒被封闭在多孔聚合物涂层中(Yang和Pierstorff(2012)JALA.17，50-58)；和整体基质系统，其中其中超颗粒被包埋在聚合物基质中(Langer R(1990)Science.249，1527-1533)。脂质体可以是生物可降解的两亲性药物递送系统，其可使用磷脂和胆固醇来配制。可使用生物可降解和生物相容性聚合物来配制微球。在另一个实例中，缓释系统可以是基于多糖的。例如，超颗粒制剂可包含阴离子多糖。在一个实例中，多糖可以是海藻酸或其衍生物。例如，超颗粒可包含海藻酸盐水凝胶。各种海藻酸衍生物是本领域已知的。实例包括海藻酸钠、海藻酸钾和海藻酸钙。其他实例包括海藻酸钡和海藻酸锶。在一个实例中，海藻酸是海藻酸钠。因此，在一个实例中，本公开涵盖包含以上以及的超颗粒和海藻酸钠的制剂。海藻酸盐可从多种来源获得(例如，Sigma，FMC Health andNutrition)。在另一个实例中，多糖是无支链多糖，例如糖胺聚糖。例如，多糖可以是透明质酸。
在另一个实例中，超颗粒以加速有效载荷释放的制剂的形式提供。例如，超颗粒可提供有基于普朗尼克F127(PF127)的水凝胶或其类似物。在一个实例中，超颗粒可提供有基于PF127的水凝胶。
在另一个实例中，提供了超颗粒的制剂，以增强跨受试者耳朵内的膜(例如鼓膜、卵圆窗或圆窗)上的扩散。例如，超颗粒制剂可包含人工外淋巴。
在另一个实例中，超颗粒被并入或包埋在受试者相容并且降解成对受试者无害的产物的支架中。这些支架容纳有待移植到受试者体内的超颗粒。
多种不同的支架可成功地用于实践本发明。示例性支架包括但不限于生物可降解的支架。天然生物可降解支架包括胶原蛋白、纤连蛋白和层连蛋白支架。适合的支架包括聚乙醇酸支架或合成聚合物，如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。
治疗与施用
本公开涵盖治疗疾病或病症的方法，所述方法包括施用本文所定义的超颗粒。因此，在一个实例中，将包含根据本公开的超颗粒的组合物以有效治疗受试者的疾病或病症的量施用至受试者。在一个实例中，所述疾病或病症是听力损失。术语“听力损失”在本公开的上下文中用来指受试者检测或处理声音的能力的任何降低。因此，提及听力损失包括部分听力缺损或完全失听。
在一个实例中，听力损失被表征为感音神经性听力损失(SNHL)。SNHL在本公开的上下文中用于指由于对耳蜗内的脆弱感觉毛细胞的损害或它们与螺旋神经节神经元(SGN)的突触连接的丧失或耳蜗施万细胞的功能障碍而导致的听力损失。在一个实例中，听力损失被表征为老年性耳聋。在另一个实例中，听力损失是由噪声诱导的。在另一个实例中，听力损失是疾病诱导的或遗传的。在另一个实例中，听力损失是通过暴露于耳毒素，例如氨基糖苷引起的。
在一个实例中，所述受试者是哺乳动物。在一个实例中，所述受试者是人。例如，人受试者可以是成人。在一个实例中，人受试者是儿童。其他示例性哺乳动物受试者包括伴侣动物，如狗或猫，或家畜，如马或牛。诸如“受试者”、“患者”或“个体”的术语是在上下文中可在本公开中互换使用的术语。
在一个实例中，腹膜内施用根据本公开的超颗粒。本公开还涵盖经由耳朵将有效载荷递送至受试者的细胞、组织或器官的方法，所述方法包括向受试者的耳朵施用根据本公开的超颗粒。在此实例中，所述方法可将有效载荷从受检者的内耳、中耳和/或前庭系统递送至细胞。在另一个实例中，所述方法将治疗性有效载荷递送至受试者的神经细胞、神经组织或脑。
在一个实例中，将组合物施用到鼓膜上。在此实例中，组合物可被配制用于局部施用的(例如滴剂、凝胶、泡沫、喷雾剂)。
在另一个实例中，将组合物施用至“中耳”腔。在本公开的上下文中，术语“中耳”用于指鼓膜与内耳之间的空间。因此，中耳在所有内耳组织的外部。例如，可经由通过鼓膜注射将组合物施用至中耳。在此实例中，超颗粒可作为贮库型注射剂施用。在另一个实例中，鼓膜中的开口可由治疗临床医生产生以促进组合物进入中耳。当将组合物施用至中耳时，可将组合物施用到圆窗和/或卵圆窗上。
在另一个实例中，将超颗粒施用至内耳中。例如，可将超颗粒施用至耳蜗。在一个实例中，可将超颗粒施用至耳蜗的底回(basal turn)。用于接近内耳的耳蜗或其他结构的外科技术是本领域已知的。用于外科手术接近人耳蜗的示例性技术在例如Clark GM，等人，″Surgery for an improved multiple-channel cochlear implant″，Ann OtolRhinol Laryngol 93：204-7，1984以及Clark GM，的，″Surgical and safetyconsiderations of multichannel cochlear implants in children″，Ear and Hearing增刊12：15S-24S，1991中进行了描述。
上文论述了超颗粒与耳部干预的组合。在这些实例中，耳部干预可与超颗粒的施用同时发生。例如，可将耳蜗装置与超颗粒同时植入。但是，螺旋神经节神经元的存活率增加可根据人工耳蜗的实用性。因此，可能希望在已经施用超颗粒后植入耳蜗装置。例如，可在已经施用超颗粒后约一个月、约两个月、约三个月、约六个月植入耳蜗装置。在这些实例中，可将额外的超颗粒与耳蜗装置一起施用。
在一个实例中，将第一剂量的超颗粒施用至受试者耳蜗，并且将至少第二剂量的超颗粒施用至受试者圆窗和/或卵圆窗上。
在一个实例中，将治疗有效量施用至受试者的耳朵。在一个实例中，将多个超颗粒施用至受试者的耳朵。例如，可将至少两个、至少三个、至少四个、至少5个、至少10个、至少20个超颗粒施用至受试者的耳朵。在另一个实例中，施用约1至10个超颗粒。在其他实例中，将约2至9、约3至8、约4至7、约5至6个超颗粒施用至受试者的耳朵。在这些实例中，超颗粒可包含相同的有效载荷。或者，在另一个实例中，超颗粒负载有不同的有效载荷。例如，可施用负载有神经营养因子的超颗粒和负载有类固醇的超颗粒。在另一个实例中，可施用负载有神经营养因子的超颗粒和负载有抗生素的超颗粒。在另一个实例中，可将负载有神经营养因子的超颗粒与抗生素一起施用。
组合物/药盒
根据本公开的超颗粒可以药盒或包装的形式提供。例如，本文公开的组合物可与用于治疗内耳病症的书面说明书一起包装在适合的容器中。在一个实例中，可在单剂量容器如耳滴管或预填充注射器中提供组合物。
在一个实例中，所述药盒包括用于治疗内耳病症的方法中的根据本公开的超颗粒。在另一个实例中，所述药盒包括用于治疗听力损失的方法中的根据本公开的超颗粒。在一个实例中，听力损失是SNHL。在另一个实例中，听力损失是由噪声诱导的听力损失。在一个实例中，根据本公开的药盒还包括助听器或植入物。因此，在一个实例中，所述药盒可包括超颗粒和耳蜗植入物。
制造
本公开涵盖可负载有高水平的有效载荷的超颗粒的方法。在一个实例中，所述超颗粒可由包含纳米颗粒和海藻酸或所述海藻酸的多糖衍生物的组合物制造。上文提供了纳米颗粒的各种实例。在一个实例中，所述纳米颗粒具有双峰孔结构。可使用各种方法来产生纳米颗粒。一种这样的方法描述于Cui等人2015，ACS Nano，9，1571-1580中。
在另一个实例中，根据本公开的超颗粒通过电喷雾产生。电喷雾的实例综述于JaworekA.，2007 Powder Technology 1，18-35中。下文也举例说明电喷雾的实例。在一个实例中，本公开涵盖一种制造超颗粒的方法，所述方法包括将包含纳米颗粒和海藻酸或所述海藻酸的多糖衍生物的组合物电喷雾到双阳离子水溶液中。
本领域的技术人员将了解，可基于用于电喷涂的溶液的类型来优化电喷雾参数。例如，可优化电压和流速以提供所需尺寸的超颗粒。在一个实例中，流速是约6-10mL h-1。在另一个实例中，流速是约7-9mL h-1。在另一个实例中，流速是约8mL h-1。在一个实例中，电压介于约10与25KV之间。在另一个实例中，电压介于约11与20KV之间。在另一个实例中，电压介于约12与14KV之间。在另一个实例中，电压是约13KV。
在一个实例中，通过对纳米颗粒溶液进行电喷雾来产生超颗粒。在一个实例中，溶液中纳米颗粒的浓度是约20mg/ml。在一个实例中，溶液中纳米颗粒的浓度是约30mg/ml。在一个实例中，溶液中纳米颗粒的浓度是约40mg/ml。在一个实例中，溶液中纳米颗粒的浓度是约50mg/ml。在一个实例中，溶液中纳米颗粒的浓度是约60mg/ml。
在另一个实例中，通过对包含海藻酸或其衍生物的纳米颗粒溶液进行电喷雾来产生超颗粒。在一个实例中，所述纳米颗粒溶液由5mg mL-1海藻酸溶液制备。在一个实例中，所述纳米颗粒溶液由10mg mL-1海藻酸溶液制备。在一个实例中，所述纳米颗粒溶液由20mgmL-1海藻酸溶液制备。在一个实例中，所述纳米颗粒溶液由30mgmL-1海藻酸溶液制备。在另一个实例中，所述纳米颗粒溶液由5mg mL-1至30mg mL-1海藻酸溶液制备。在另一个实例中，所述纳米颗粒溶液由10mgmL-1至30mgmL-1海藻酸溶液制备。在另一个实例中，所述纳米颗粒溶液由20mg mL-1至30mg mL-1海藻酸溶液制备。
在一个实例中，所述纳米颗粒溶液由水中的5mg mL-1海藻酸制备。在一个实例中，所述纳米颗粒溶液由水中的10mg mL-1海藻酸制备。在一个实例中，所述纳米颗粒溶液由水中的20mg mL-1海藻酸制备。在一个实例中，所述纳米颗粒溶液由水中的30mg mL-1海藻酸制备。在另一个实例中，所述纳米颗粒溶液由水中的5mg mL-1至30mg mL-1海藻酸制备。在另一个实例中，所述纳米颗粒溶液由水中的10mg mL-1至30mg mL-1海藻酸制备。在另一个实例中，所述纳米颗粒溶液由水中的20mg mL-1至30mg mL-1海藻酸制备。
在另一个实例中，通过对包含海藻酸的纳米颗粒溶液进行电喷雾来产生超颗粒。
海藻酸衍生物没有特别限制，只要它们在限定的温度下形成凝胶即可。在一个实例中，海藻酸衍生物是多糖衍生物。海藻酸衍生物包括各种海藻酸盐形式。实例包括海藻酸钠、海藻酸钾和海藻酸钙。其他实例包括海藻酸钡和海藻酸锶。在一个实例中，海藻酸是海藻酸钠。在另一个实例中，通过对包含海藻酸的纳米颗粒溶液进行电喷雾来产生超颗粒。
取决于超颗粒的所需的尺寸和形状，各种粘度的海藻酸盐可用于产生根据本公开的超颗粒。例如，可使用粘度为约20至300mPa*s的海藻酸盐。在另一个实例中，海藻酸盐具有约20至200mPa*s的粘度。在一个实例中，海藻酸盐具有20mPa*s的粘度。在另一个实例中，海藻酸盐具有100mPa*s的粘度。在另一个实例中，海藻酸盐具有200mPa*s的粘度。
在一个实例中，通过将包含纳米颗粒的组合物电喷雾到水溶液中来产生超颗粒。在一个实例中，这是双阳离子水溶液。示例性的双阳离子组分包括Ca2+和Ba2+。例如，所述水溶液可包含氯化钙。在另一个实例中，所述水溶液包含氯化钡。
在一个实例中，通过对组合物进行电喷雾来产生超颗粒，其中所述组合物中海藻酸盐的浓度是5mg mL-1至30mg mL-1，所述组合物中纳米颗粒的浓度是20mg mL-1至50mg mL-1，并且电压是10kV至25kV。在另一个实例中，通过对组合物进行电喷雾来产生超颗粒，其中所述组合物中海藻酸盐的浓度是10mg mL-1至30mg mL-1，所述组合物中纳米颗粒的浓度是30mg mL-1至50mg mL-1，并且电压是11kV至21kV。在另一个实例中，通过对组合物进行电喷雾来产生超颗粒，其中所述组合物中海藻酸盐的浓度是20mg mL-1至30mg mL-1，所述组合物中纳米颗粒的浓度是35mg mL-1至45mg mL-1，并且电压是12kV至14kV。在这些实例中，流速可以是8mL h-1。
在另一个实例中，通过对组合物进行电喷雾来产生超颗粒，其中所述组合物中海藻酸盐的浓度是30mgmL-1，所述组合物中纳米颗粒的浓度是40mg mL-1，电压是13kV，并且流速是8mL h-1。
在一个实例中，使用本文所定义的方法制造的超颗粒进行煅烧以除去海藻酸或其衍生物。在一个实例中，在约500℃下进行煅烧。在另一个实例中，在约550℃下进行煅烧。在另一个实例中，在约600℃下进行煅烧。在另一个实例中，在约650℃下进行煅烧。在另一个实例中，在约700℃下进行煅烧。在一个实例中，进行煅烧持续约6至约30个小时。在另一个实例中，进行煅烧持续约10个小时。在另一个实例中，进行煅烧持续约20个小时。在另一个实例中，进行煅烧持续约30个小时。
实施例
实施例1-纳米颗粒产生
使用基于Cui等人2015，ACS Nano，9，1571-1580中描述的那些的方法产生介孔二氧化硅纳米颗粒(MS-NP)。在搅拌下将1.1g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)完全溶解于50mlMilli-Q中。随后在室温(25℃)下在剧烈搅拌20分钟下添加4.3g的聚(丙烯酸溶液)(PAA，Mw＝250kDa，于水中的35wt％溶液)，直到获得澄清溶液。然后在剧烈搅拌下将3.5ml氢氧化铵溶液(28％-30％)添加至溶液中，从而得到乳状悬浮液。搅拌20分钟后，添加4.46ml的原硅酸四乙酯(TEOS)。将溶液再搅拌15分钟，然后将混合物转移至特氟龙密封的高压釜中，将所述混合物在90℃下放置48小时。
将如此合成的MS-NP用乙醇洗涤一次，用水洗涤两次，并且用乙醇洗涤两次，且最后在90℃下干燥。通过在550℃下煅烧30小时除去有机模板。
实施例2-起始超颗粒制造方法-方法A
根据Wang等人(2010)Chem Mater.22，3829-3831制备介孔二氧化硅(MS)纳米颗粒。将MS纳米颗粒以5wt％的浓度分散在Milli-Q水中，并进行短暂超声处理以形成稳定的胶体悬浮液。然后将MS纳米颗粒分散液的0.5至2.0μL等分试样施加至平坦的表面，所述表面用石蜡膜预先覆盖。将液滴在气流下干燥，以经由毛细管力作用将MS纳米颗粒组装成介孔二氧化硅超颗粒(毛细作用力MS-SP)。毛细作用力MS-SP的尺寸由施加在液滴中的纳米颗粒分散体的体积控制。
在毛细作用力下，MS胶体自组装成紧凑的结构以形成MS-SP。然后将毛细作用力MS-SP从石蜡膜中移出并转移到陶瓷容器中，并且在923K下退火，以增强毛细作用力MS-SP的机械稳定性。然后，将毛细作用力MS-SP负载有效载荷。每个颗粒负载约1.33μg蛋白质。据显示毛细作用力MS-SP具有双峰孔结构(2-3nm和15-30nm)，并且毛细作用力MS-SP中的大孔(密集堆积的纳米颗粒之间的空间)是100-200nm。
实施例3-修改的制造方法-方法B
将80mg MS-NP粉末添加至2ml海藻酸钠盐溶液(在水中30mg mL-1)中。将所得溶液超声处理1小时，直到MS-NP均匀分布在海藻酸钠盐溶液中。
为了形成大孔MS-SP(LMS-SP)，将经超声处理的溶液添加至3mL塑料注射器中，并置于注射泵中，然后使用大约8mL h-1的流速将液体电喷雾到氯化钙溶液浴中(在水中制备的1wt％)(电喷雾设置如图1所示)。通过在管的末端与氯化钙溶液之间施加电场来控制液滴尺寸。从氯化钙浴中收集海藻酸盐珠粒MS-SP(LMS-SPalg)，并负载有效载荷。与通过方法A产生的那些颗粒相比，对于这些颗粒(LMS-SP)观察到显著增强的药物负载性能：每个颗粒约7.8μg蛋白质，机械稳定性提高。
实施例4-修改的制造方法-方法C
使用实施例3中所述的方法产生MS-SP(LMS-SPalg)。通过在650℃下煅烧30小时除去海藻酸钠盐。此步骤除去了所有有机组分，仅留下了介孔二氧化硅纳米颗粒(MS-SP)和痕量的氯化钙和氯化钠。然后，将MS-SP负载有效载荷。与通过方法A产生的那些颗粒相比，对于这些颗粒(LMS-SP)观察到显著增强的药物负载性能：每个颗粒约7.8μg蛋白质。
超颗粒也由无孔的纳米颗粒(无孔NMS-SPalg；NMS-SPalg)和孔径＜2nm的纳米颗粒(小孔MS-SSPalg；SMS-SPalg)制成。从这些超颗粒中除去海藻酸盐后，药物负载性能显著降低(表1)。
表1中总结由方法B和方法C产生的MS-SP的最大药物负载。
表1：由方法B和方法C产生的MS-SP的负载
颗粒类型 q<sub>max</sub>(ug/颗粒)
无孔<sup>N</sup>MS-SP<sup>alg</sup> q<sub>max</sub>＝8.215
无孔<sup>N</sup>MS-SP q<sub>max</sub>＝2.009
小孔<sup>S</sup>MS-SP<sup>alg</sup> q<sub>max</sub>＝10.06
小孔<sup>S</sup>MS-SP q<sub>max</sub>＝2.802
大孔<sup>L</sup>MS-SP<sup>alg</sup> q<sub>ma</sub>x＝9.245
大孔<sup>L</sup>MS-SP q<sub>max</sub>＝7.843
实施例5-超颗粒释放性质
溶菌酶
通过将灭菌的SP与100μL的FITC-溶菌酶溶液(Milli-Q水中0.2mg mL-1)一起孵育来制备用于体外释放研究的负载FITC-溶菌酶的SP。溶菌酶是模拟神经营养蛋白BDNF的良好模型蛋白质(因为溶菌酶便宜且容易获得，而BDNF昂贵)，因为它具有相似的物理化学性质(溶菌酶，Mw＝14.3±0.5KDa，
Figure BDA0002455761180000392
且pI＝11；BDNF，Mw＝13KDa，
Figure BDA0002455761180000391
且pI＝10)。
载有溶菌酶的MS-SP的体外释放特征显示在图4的a)和b)部分以及图7的a)部分中。由方法A和C产生的MS-SP的释放特征相似。尽管由方法C产生的MS-SP负载显著更高水平的标记的溶菌酶。与由方法A和C产生的MS-SP相比，对于由方法B产生的MS-SP，有效载荷释放显著降低。
ζ电位
然后将MS-SP负载荧光素标记的溶菌酶(FITC-溶菌酶)。如图2所示，随着pH值从4增加至10，MS-SP表现出在约-7.6mV至约-33.9mV范围内的负ζ电位。因此，可借助静电驱动力将带正电荷的溶菌酶和BDNF负载到MS-SP中。共焦显微镜图像(图3a，b)显示FITC-溶菌酶负载到MS-SP的表面上。然而，由于MS-SP的尺寸非常大(直径数百微米)，因此标准激光扫描共焦显微术不适用于对SP的内部结构进行成像。然而，用手术刀使MS-SP破裂后，可对内部进行成像，并且发现在MS-SP的多孔内部结构中也观察到FITC-溶菌酶(图3c)。
负载容量的另外评估
然后以3天孵育时间以不同的负载浓度使用FITC-溶菌酶，研究不同类型SP的负载容量(图4)。一般而言，随着FITC-溶菌酶的浓度增加，药物负载的量增加。结果表明，含海藻酸盐的NMS-SPalg、SMS-SPalg和LMS-SPalg的负载容量高于除去了海藻酸盐的NMS-SP、SMS-SP和LMS-SP(在相当的浓度下)。这可能是由于在中性pH值附近带正电荷的FITC-溶菌酶与带负电荷的海藻酸盐之间的静电相互作用增加。此外，在低FITC-溶菌酶负载浓度(＜0.4mg mL-1)下，LMS-SPalg具有与无孔MS-SPalg和SMS-SPalg相似的药物负载容量，但是当浓度较高时(＞0.4mg mL-1)，与NMS-SPalg和SMS-SPalg相比，更多的FITC-溶菌酶可负载到LMS-SPalg中。对于除去了海藻酸盐的MS-SP，观察到类似的趋势：与NMS-SP和SMS-SP相比，LMS-SP可负载更多的FITC-溶菌酶。这些结果表明，大的多孔结构(在LMS-SP和LMS-SPalg中)是提高药物负载的关键因素，这可能是通过提供额外的表面且因此在外部颗粒表面和内部颗粒区域(在SP结构中)已通过药物完全饱和时提供了负载容量。另外，负载容量还取决于MS-SP的直径，其中较大的MS-SP(1000μm)具有比较小的MS-SP(200μm)更大的负载容量(图5)。
实验确定的FITC-溶菌酶到NMS-SP和SMS-SPalg中的最大负载量分别为每个SP约3μg和每个SP 2μg，显著低于每个SP具有大约15μg的LMS-SP(FITC-溶菌酶浓度是1.5mg mL-1，并且负载时间是3天。此外，实验确定的FITC-溶菌酶到NMS-SP和SMS-SPalg中的最大负载量分别为每个SP约2μg和每个SP 1μg，也显著低于每个SP具有大约10μg的LMS-SP(FITC-溶菌酶浓度是5.0mg mL-1，并且负载时间是3天。
六种不同SP的药物负载效率如图4c和4d所示。随着FITC-溶菌酶的负载浓度增加，更多的FITC-溶菌酶可负载到SP中。
BDNF
通过将MS-SP浸泡在100μl的乙醇(80vol/vol％)中4小时、然后用100μl的Milli-Q水冲洗6次来将所述MS-SP灭菌。然后将MS-SP在0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤一次。通过将MS-SP放入含有15μL的BDNF(Geneway，BDNF Human Protein，目录#10-663-45078)溶液(1mg/ml的BDNF)的Eppendorf管中且在室温下孵育三天伴随偶尔手动振荡来负载MS-SP。值得注意地，实现了约10μg BDNF的负载。
实施例6-超颗粒细胞毒性
为了研究MS-SP是否能够用作生物相容性药物载体，对MS-SP进行了体外细胞毒性研究。将人脑成胶质细胞瘤细胞(U87MG细胞系)与MS-SP一起孵育，并通过Alamar Blue测定评估细胞存活力。如图6所示，即使当MS-SP的数量增加至每孔十个(每孔1×104个细胞)时，MS-SP也无毒。类似颗粒系统的典型体内治疗方案建议每个内耳施用1-8个SP。
实施例7-药物释放
基于负载容量的结果，通过在37℃下在PBS(pH 7.4)中孵育10个LMS-SP和10个MS-SPalg来进行FITC-溶菌酶的释放研究(负载时间3天，负载浓度0.2mg mL-1)。
通过对SP进行灭菌、然后将十个MS-SP或十个MS-SPalg与100μL‘低浓度’FITC溶菌酶溶液(在Milli-Q水中0.2mg mL-1)一起孵育来制备用于体外释放研究的负载FITC-溶菌酶的SP。三天后，除去上清液，并将100μL磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)添加至每个管中并在37℃下孵育。在限定的时间间隔(在150天内)，收集90μL溶液并用新鲜PBS更换。使用Infinite M200微板阅读器和使用标准曲线测量所收集的样品的荧光，然后可确定上清液中FITC-溶菌酶的浓度。
对于LMS-SP和LMS-SPalg，在低浓度溶液中负载后，FITC-溶菌酶负载分别时每个SP1.89±0.02μg和1.93±0.01μg。如图7a所示，在超过150天内，释放了每个MS-SP＞1μg的FITC-溶菌酶，而在这段时间内从MS-SPalg释放较低量的FITC-溶菌酶(每个SP约0.4μg)。从后者释放的FITC-溶菌酶的量较低的可能原因是海藻酸盐的存在，海藻酸盐潜在可阻塞二氧化硅初级颗粒的大孔或与溶菌酶强烈相互作用，从而阻止或抑制溶菌酶释放。图8示出在每个时间点测量的FITC-溶菌酶释放的各个值(用于制备图7中所示的累积结果)。
随着用于负载SP的药物的负载浓度增加，可将更多的药物负载到LMS-SP中。因此，研究了在较高孵育浓度(1.0mg mL-1)下FITC-溶菌酶和BDNF的药物释放特征。在这种浓度(1.0mg mL-1)下FITC-溶菌酶负载量是每个SP 6.49±0.48μg。在两个释放阶段中观察到FITC-溶菌酶的释放特征：前三天突发释放，并且在超过110天内持续释放(图7b)。在突发阶段，每个SP释放约4.2μg FITC-溶菌酶。3天后，约2.3μg FITC-溶菌酶(负载量-突释期间释放的量)仍然保留在SP中，随后观察到更持续的释放行为。在每个时间点释放的FITC-溶菌酶的单个值是每个SP数十至数百纳克(图9)。如图7c所示，体外BDNF释放特征与FITC-溶菌酶相似，前三天观察到突发释放，随后持续释放超过40天。40天后SP的累积释放值为是约4.68μg药物，并且每个SP的重量是约0.05mg。因此，观察到的累积释放是约93.6μg mg-1。与最近针对纳米多孔二氧化硅纳米颗粒所观察到的相比，这是4000倍的改进。在每个时间点释放的BDNF的单个值在每个SP数十至数百纳克的范围内(图10)。还通过MicroBCA测定(图11)测量了所释放的BDNF的量，结果相似。
为了研究进一步调整药物释放行为并帮助内耳进行手术的潜在方法，测试了并入PF127水凝胶内的MS-SP和MS-SPalg的体外药物释放研究。PF127水凝胶在低温(例如4℃)下形成为粘稠液体，并且在人体温度(37℃)下形成为凝胶。在这些研究中，到大约第14天观察到大多数FITC-溶菌酶从MS-SP和MS-SPalg(均在PF127水凝胶中)释放(图12)，从而表明加速的释放动力学。因此，当需要短期药物释放(约1周)时，超颗粒-PF127系统更适合，而不含PF127水凝胶的SP更适合长期(数月)药物释放。
当SP被负载大约50％时，还进行了体外实验以建立随时间推移的BDNF释放动力学。与来自溶菌酶的数据一致，BDNF释放在前4周更线性(例如，不存在突发释放；图13)。
实施例8-超颗粒的降解
多孔二氧化硅颗粒可在生物环境中降解(例如成硅酸，其可以通过尿液排出)，并且在多种生物医学应用中引起关注。为了研究降解速率，将MS-SP孵育150天(PBS，pH 7.4，37℃)(图14)。观察到MS-SP的直径减少约55％，并且MS-SP的形状/形态也显著改变。MS-SP表面的二氧化硅初级颗粒的形态和尺寸均发生变化。
实施例9-药代动力学
进行体内研究以确定在植入4小时、3天和7天后在植入耳朵的超颗粒中递送的神经营养蛋白的药物有效载荷和清除率。目的是确定一段时间内耳蜗中剩余的神经营养蛋白的量。
将含有放射性标记的神经营养蛋白-3的1个SP植入每个耳蜗中。在4小时(n＝5)、3天(n＝7)或7天(n＝4)之后收获耳蜗。测量整个耳蜗的γ计数以确定神经营养蛋白-3随时间推移的清除率。图15中示出神经营养蛋白-3的剩余量(负载的％)和总量(μg)。在植入1周后，每个SP均含有约2ug的初始负载量的神经营养蛋白-3(约40％)。
进行了进一步的实验(n＝2)，以检查圆窗递送后神经营养蛋白-3的清除率。植入后3天-再次使用完整耳蜗测量值来确定神经营养蛋白-3从圆窗膜上的清除率。与耳蜗内递送部位相比，使用圆窗观察到类似水平的清除率(在圆窗递送后剩余47.4％的神经营养蛋白-3，相比之下耳蜗内递送为56％)。
这些数据表明，可实现神经营养蛋白-3的延长释放，即使在治疗1周后仍可获得高水平的神经营养蛋白-3。
本领域技术人员应了解，在不背离广泛描述的本公开的范围的情况下，可对如具体实施方案中所示的公开内容进行众多的变化和/或修改。因此，本实施方案视为在所有方面为说明性的而非限制性的。
本申请要求2017年9月20日提交的AU2017903828、2017年9月20日提交的AU2017903829和2018年7月11日提交的AU 2018902513的优先权，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。
以上论述的所有出版物整体并入本文。对文件、法案、材料、装置、物品等的已包括在本说明书中的任何论述都仅出于提供本公开的上下文的目的。不应视为认可的是任何或所有这些事项因为在本申请的各权利要求的优先日期之前存在而形成为先前技术基础的一部分或是与本公开相关的领域中的普通常识。
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Claims (40)

1.一种包含超颗粒的组合物，其中所述超颗粒包含至少1.5μg的有效载荷。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述超颗粒包含至少5μg的有效载荷。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述超颗粒包含1.5μg至10μg的有效载荷。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述超颗粒包含直径为至少60nm的孔。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述超颗粒包含直径为至少50-100nm的孔。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述超颗粒具有无序孔结构。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述超颗粒由具有双峰孔结构的纳米颗粒组成。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述纳米颗粒双峰孔结构具有大于30nm的大孔径。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述有效载荷是小分子、肽或蛋白质。
10.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述有效载荷是干细胞、病毒、核酸、神经营养因子、抗癌剂、神经保护剂或它们的组合。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述有效载荷是神经营养因子。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述神经营养因子具有介于9与10之间的等电点。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述神经营养因子是BDNF。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述神经营养因子是神经营养蛋白-3。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述超颗粒包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种不同的有效载荷。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述超颗粒包含至少两种有效载荷，一种有效载荷是神经营养因子。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，所述组合物包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个超颗粒。
18.根据权利要求17所述的组合物，所述组合物包含具有不同有效载荷的超颗粒。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述组合物以缓释制剂的形式提供。
20.如权利要求19所述的组合物，所述组合物包含糖原水凝胶。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中所述超颗粒通过将包含纳米颗粒和海藻酸或所述海藻酸的多糖衍生物的组合物电喷雾到双阳离子水溶液中来制造。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物，所述组合物包含海藻酸[(C6H8O6)n]或所述海藻酸的多糖衍生物。
23.根据权利要求22所述的组合物，所述组合物包含海藻酸钠盐[Na(C6H8O6)n]或所述海藻酸钠盐的多糖衍生物。
24.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物在制造用于治疗疾病或病症的药剂中的用途。
25.如权利要求25所述的用途，其中所述病症是听力损失。
26.如权利要求26所述的用途，其中所述听力损失被表征为感音神经性听力损失(SNHL)、老年性耳聋或由噪声诱导的。
27.一种用于促进受试者的耳朵中的螺旋神经节神经元的存活的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求1至23中任一项所述的组合物。
28.一种用于治疗其中期望在受试者中持续递送治疗性有效载荷的疾患的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求1至23中任一项所述的组合物。
29.如权利要求27或权利要求28所述的方法，其中将所述组合物施用至受试者的耳朵。
30.如权利要求27或权利要求28所述的方法，其中腹膜内施用所述组合物。
31.如权利要求27或权利要求28所述的方法，其中在保留所述超颗粒的支架中施用所述组合物。
32.一种药盒，所述药盒当用于治疗疾病或病症时包括根据权利要求1至23中任一项所述的组合物。
33.如权利要求32所述的药盒，其中所述病症是听力损失。
34.如权利要求33所述的药盒，所述药盒还包括耳蜗植入物。
35.一种组合物，所述组合物当用于制造超颗粒时包含纳米颗粒和海藻酸。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述海藻酸是海藻酸钠盐。
37.一种制造超颗粒的方法，所述方法包括将包含纳米颗粒和海藻酸或所述海藻酸的多糖衍生物的组合物电喷雾到双阳离子水溶液中。
38.如权利要求37所述的方法，所述方法还包括使所述超颗粒经历煅烧以除去海藻酸。
39.如权利要求38所述的方法，其中在约650℃下进行煅烧。
40.如权利要求38所述的方法，其中进行所述煅烧持续约6至约30个小时。
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