CN103740641A

CN103740641A - 一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基及其诱导方法

Info

Publication number: CN103740641A
Application number: CN201310738966.0A
Authority: CN
Inventors: 冯文峰; 佘志勇; 方海庆; 陈建兴
Original assignee: GUANGZHOU ETHICAL BIOTECH CO Ltd
Current assignee: Chen Jianxing; Fang Haiqing; Feng Wenfeng; She Zhiyong
Priority date: 2013-12-26
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2014-04-23

Abstract

本发明公开了一种诱导培养基及其诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法。所述诱导培养基包含下述含量的以下组分：葡萄糖10mM-20mM；维生素B55mM-15mM；活化素-A10nM-30nM；唾液素-45nM-15nM；肝细胞生长因子50pM-150pM；五肽胃泌素5nM-15nM。所述诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，包括以下步骤：采用上述诱导培养基诱导间充质干细胞分化。本发明诱导培养基含有多中诱导因子，不含有有毒有害物质，更安全。本发明诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，3天即可获得胰岛样细胞，大大缩短了诱导分化时间；具有广阔的临床应用前景。

Description

一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基及其诱导方法

技术领域

本发明属于干细胞领域，具体涉及一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基及其诱导方法。

背景技术

糖尿病是一组由于胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病。据报道，近年来糖尿病的发病率激增，严重影响人类的健康。持续高血糖与长期代谢紊乱等可导致全身组织器官，特别是眼、肾、心血管及神经系统的损害及其功能障碍和衰竭。严重者可引起失水，电解质紊乱和酸碱平衡失调等急性并发症酮症酸中毒和高渗昏迷。

传统糖尿病的治疗包括饮食治疗、运动治疗、药物治疗等几个方面，该类方法均无法达到长期有用的效果。细胞生物疗法治疗糖尿病是从细胞层面上修复、补充受损细胞，其效果是其他疗法所不能比拟的。这种治疗用的原始细胞能够分化出很多具有各种功能的细胞，当这种细胞分化形成新的细胞和组织后，其长期效果将是传统医学无法达到的。

研究表明，脂肪间充质干细胞易于获取，体外增殖分化能力强，是非常有前途的细胞治疗用细胞来源。然而怎样才能将其高效诱导分化成胰岛样细胞，用于细胞生物治疗其中仍存在许多问题亟需解决:1)干细胞分化为胰岛样细胞，受干扰因素非常多，首先是分化周期长；2)采用的诱导因子单一，不能保证干细沿预期方向分化、增殖；3)多采用β-巯基乙醇，其毒性令人望而却步，影响后续临床应用；4)诱导分化后的胰岛样细胞胰岛素分泌效率低。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种诱导培养基及其诱导脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法。具体通过以下技术方案来实现。

一种诱导培养基，由以下组分按下述含量组成：葡萄糖10mM-20mM；维生素B55mM-15mM；活化素-A10nM-30nM；唾液素-45nM-15nM；肝细胞生长因子50pM-150pM；五肽胃泌素5nM-15nM；FBS10%（V/V）；青霉素100u/L；链霉素100u/L；L-DMEM培养基余量。

优选地，所述诱导培养基由以下组分按下述含量组成：葡萄糖17.5mM；维生素B510mM；活化素-A20nM；唾液素-410nM；肝细胞生长因子100pM；五肽胃泌素10nM；FBS10%（V/V）；青霉素100u/L；链霉素100u/L；L-DMEM培养基余量。

一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，包括以下步骤：使用上述任何一种诱导培养基诱导间充质干细胞分化。

优选地，诱导时间为3天。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、诱导培养基含有多种诱导因子，多因子相互作用，诱导效果更好；不含有毒有害物质，更安全。

2、本发明诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，多因子联合一步法，3天即可获得胰岛样细胞，与现有技术7-20天的诱导时间相比，大大缩短了诱导分化时间；

3、人离体脂肪组织易于获得；分化后胰岛样细胞的胰岛素分泌浓度为400mU/L以上，诱导所得的胰岛样细胞具有足够存活量和存活期，为糖尿病细胞治疗提供理想的种子细胞，为糖尿病细胞移植治疗将提供新途径，具有广阔的临床应用前景。

附图说明

图1人脂肪间充质干细胞与使用本发明方法诱导分化后的胰岛样细胞的细胞形态图；左图为人脂肪间充质干细胞的成纤维细胞形态；右图为诱导分化3天后的胰岛样细胞的细胞形态。

图2人脂肪间充质干细胞与诱导分化后的胰岛样细胞的胰岛素分泌图；左边柱形图为未分化人脂肪间充质干细胞在高浓度葡萄糖（18.7mMol/L）中未检测到胰岛素的分泌；中间柱形图为使用本发明方法诱导分化3天后的胰岛样细胞在低浓度葡萄糖（5.8mMol/L）中检测到胰岛素，含量约为28mU/L；右边柱形图为使用本发明方法诱导分化3天后的胰岛样细胞在高浓度葡萄糖（18.7mMol/L）中检测到胰岛素，含量约为52mU/L。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施方式做进一步说明。本领域的公知常识、常用的物质检测、鉴定方法等，因是本领域技术人员所熟知的，本发明未一一赘述。本发明中使用的各种试剂都是市售试剂。

在人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化诱导过程中，适当浓度的肝细胞生长因子和葡萄糖有利于胰岛样细胞团的形成和胰岛素分泌。维生素B5（烟酸）又名维生素PP，也称抗癞皮病维生素，是吡啶衍生物，作为葡萄糖耐受因子的组分，促进胰岛素反应。

活化素（activin）是转化生长因子-β超家族成员，主要分布于睾丸、脑和骨髓，促进促卵泡激素等多种垂体后叶激素合成与分泌，促进中胚叶发育、神经元存活，抑制其分化，增强正常红系前体细胞产生，刺激红细胞样集落形成单位和红细胞样爆发形成单位形成。

Exendin-4是从希拉毒蜥唾液中分离的一种多肽激素，由39个氨基酸残基组成，与胰高血糖素样肽1(GLP-1)有53%的同源性。Exendin-4具有高度的组织特异性，仅在希拉毒蜥的唾液腺中表达。Exendin-4首先翻译成N端多余45个氨基酸残基的前体，然后在激素原转化酶催化下分解产生具有生物活性的Exendin-4。Exendin-4的N端是一段不规则卷曲，第7-28氨基酸残基形成α螺旋，C端是不规则亲水片段。Exendin-4的受体是G蛋白，N端是激活受体信号转导途径的关键区域，中间部位和C端是受体结合域。Exendin-4与GLP-1类似，可提高胰岛素基因的转录水平，刺激胰岛素的释放，从而控制血糖浓度，但GLP-1的半衰期2分钟，Exendin-4半衰期却长达9.57小时，因而在治疗Ⅱ型糖尿病方面具有广阔的前景。

肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)由728个氨基酸构成，其活性形式是由一条69kd重链(a)和一条34kd轻链(B)组成的异二聚体，a链N端有一发夹结构；B链有丝氨酸蛋白酶样结构。c—met是HGF的特异性膜表面受体，表达于多种组织细胞，如心肌细胞、血管内皮细胞，介导HGF所有的生物学作用。c—met是由c—met原癌基因编码的异二聚体蛋白，由A、B两个基组成。HGF是存在于急性肝损伤动物血浆中的蛋白因子，它能刺激肝细胞的DNA合成，且在肝再生过程中起重要作用。愈来愈多的报道表明，HGF不只是作用于肝再生，而且对许多组织和细胞的生长、分化起重要调控作用。

五肽胃泌素（N-[（1，1-二甲乙氧基）羰基]-β-丙氨酰-L－色氨酰-L-甲硫氨酰-L-门冬氨酰-L-苯丙酰胺）分子式为C37H49N7O9S，分子量为767.9，能促进胃酸、胃蛋白酶及内因子的分泌，其促胃酸分泌作用相当于内源性胃泌素的1/4，作用可持续10-40分钟。临床上主要用于胃酸分泌机能的检查。

实施例1

诱导培养基由以下组分按下述含量组成：葡萄糖17.5mM；维生素B510mM；活化素-A20nM；唾液素-410nM；肝细胞生长因子100pM；五肽胃泌素10nM；FBS10%（V/V）；青霉素100u/L；链霉素100u/L；L-DMEM培养基余量。将上述物质按常规的配制方法配制成诱导培养基备用。使用时，要将上述培养基置于37℃预热后使用。

实施例2

与实施例1基本相同，仅组分含量稍有变化。诱导培养基由以下组分按下述含量组成：葡萄糖10mM；维生素B515mM；活化素-A10nM；唾液素-415nM；肝细胞生长因子50pM；五肽胃泌素15nM；FBS10%（V/V）；青霉素100u/L；链霉素100u/L；L-DMEM培养基余量。

实施例3

与实施例1基本相同，仅组分含量稍有变化。诱导培养基由以下组分按下述含量组成：葡萄糖20mM；维生素B55mM；活化素-A30nM；唾液素-45nM；肝细胞生长因子150pM；五肽胃泌素5nM；FBS10%（V/V）；青霉素100u/L；链霉素100u/L；L-DMEM培养基余量。

实施例4

与实施例1基本相同，仅组分含量稍有变化。诱导培养基由以下组分按下述含量组成：葡萄糖15mM；维生素B58mM；活化素-A25nM；唾液素-412nM；肝细胞生长因子75pM；五肽胃泌素12nM；FBS10%（V/V）；青霉素100u/L；链霉素100u/L；L-DMEM培养基余量。

实施例5

一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，包括以下步骤：

（1）获得离体人脂肪组织，消化得单细胞悬液。

取5g脂肪组织，先用无菌的手术剪刀或者小刀剪碎，长度要求不大于3毫米，然后收集于15毫升离心管，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静至5分钟，等分为两层后小心收集上层部分（包含有间充质干细胞、脂肪细胞、磷酸盐缓冲液及红细胞），去掉下层的油脂/脂质，收集的上层部分采用磷酸盐缓冲液洗涤3遍；加入等体积的0.075%的胶原酶I，37℃水浴30分钟；加入等体积的含10%胎牛血清的DMEM终止消化，充分混均后室温静至10分钟分层；去掉上层（脂质/碎片），20℃，280g离心5min收集下层部分（基质血管部分、干细胞、红细胞）；红细胞裂解，采用160mM NH4Cl重悬3分钟，40微米滤膜过滤到含5mL DMEM，10%FBS的管中；20℃，280g离心5min收集细胞，并于含1%青霉素/链霉素和10%FBS的L-DMEM中培养，即获得间充质干细胞。

(2)贴壁细胞培养。

将获得的间充质干细胞于含有10%FBS，2mM L-谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100mg/mL链霉素，5ng/mL碱性成纤维生长因子的L-DMEM中培养，汇合度达80-90%时传代。

(3)采用实施例1中的诱导培养基诱导间充质干细胞分化。

收集细胞，采用低贴附力的6孔培养板进行胰岛样细胞诱导分化，细胞接种量为2-3×10⁵/孔，诱导3天。对照组采用普通培养基，普通培养基的配方为FBS10%（V/V）；青霉素100u/L；链霉素100u/L；L-DMEM培养基余量。

(4)获得胰岛样细胞。

诱导分化3天后，胰岛样细胞的形态如图1所示。

在培养第0，1，2，3天分别取分化组与对照组上清。第0天的上清即诱导培养基和普通培养基，目的是排除在诱导培养液以及普通培养液中含有胰岛素的可能。取出上清后，1000rpm离心5min去除细胞，立即分装成200μL/管，3个平行样，保存于-80℃超低温冰箱中待检。

上清中胰岛素浓度通过放射免疫法检测。结果如下:第0天的细胞培养上清没有检测到胰岛素。分化第一天上清已检测到胰岛素的分泌，分化第二天、第三天的上清中胰岛素含量上升，第三天胰岛素分泌浓度为400mU/L以上。

实施例6

为了更好的证明分化后的胰岛样细胞的胰岛素分泌能力，对未分化的人脂肪间充质干细胞和实施例5分化3天后胰岛样细胞进行了胰岛素分泌能力的测定。如图2所示，对照组（左边柱形图）中未检测到胰岛素的分泌；实验组1（中间柱形图）胰岛素含量约为28mU/L；实验组2（右边柱形图）胰岛素含量约为52mU/L，分泌量随着葡萄糖浓度的增加而上升。

Claims

1.一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基，其特征在于，由以下组分组成：

2.根据权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基由以下组分组成：

3.一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用权利要求1或2所述的诱导培养基诱导间充质干细胞分化，诱导3天。