CN112691235A - 以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质，其中，采用蒸馏水漂洗、组织匀浆、高速离心、振荡、梯度高渗生理盐水漂洗、低温冷冻干燥、研磨等物理的方法制备脂肪脱细胞基质颗粒；该脱细胞基质颗粒可进一步制备成可注射型水凝胶基质。本发明有效缩短了处理所需要的时间、提高了效率，并且消除了任何化学刺激性物质和对组织再生有影响的酶学物质的应用，从而最大限度的减少了制备方法对于脂肪细胞外基质的空间结构和蛋白活性的破坏，使之成为软组织修复、再生的新型生物材料。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物工程材料学领域，具体涉及以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质制备及应用。
背景技术
先天性的缺陷例如颜面部萎缩、乳腺癌等软组织肿瘤、外伤、衰老等造成软组织缺损的修复重建，一直是整形外科所面临的难题和挑战。而目前临床常用的软组织修复方式主要是应用自体皮瓣移植、游离脂肪移植和异体材料填充等。但这些方法均存在着弊端。例如自体皮瓣移植存在创伤大、皮瓣的感染坏死以及供区的继发畸形；脂肪移植为永久性填充材料，但需要抽脂获得，临床在面对脂肪吸收不确定的情况时，需要病人反复抽脂才能达到填充效果，从而给患者带来痛苦和脂肪栓塞等并发症的风险；而异体材料填充则会出现包裹、排斥以及快速吸收等问题。随着组织工程的快速发展，细胞外基质得到越来越多学者的关注和研究。细胞外基质是由细胞分泌到细胞间的大分子物质所构成的网架结构。而这些网架结构在细胞间起支撑和连接作用，调节组织的发生和细胞间的正常生理功能。细胞外基质作为理想的生物学材料，其单独的组分，例如胶原蛋白、透明质酸等均已被单独分离出来制成生物制剂，广泛应用于组织工程与再生领域。其优点是方便、快捷、生物相容性好，但缺点是快速被人体吸收，无法诱导宿主的软组织再生。
脂肪组织是一类疏松的结蹄组织。脂肪组织除了含有脂肪细胞外，还富含大量的脂肪细胞外基质。其作为脂肪再生的天然微环境，具有以下特征：1、它是由生物大分子构成的互联网络结构2、这些网络结构是由I、IV、VI等胶原蛋白、层黏连蛋白(LN)、纤维链接蛋白(FN)、糖原聚糖(GAG)、bFGF、TGF-β等多种生长因子所组成3、这些成分具有诱导脂肪细胞合成分泌、定向分化等功能4、在细胞粘附、扩增中起重要作用。毫无疑问，这些特征在脂肪组织整个再生过程当中，发挥着重要作用。
吸脂手术是目前应用最为广泛的整形外科手术之一，每年有大量的人体脂肪，作为医疗废物被丢弃。我们可以利用其作为提取脂肪细胞外基质的丰富资源。这种脱油脂、脱细胞且无免疫原性的生物材料，我们称之为脂肪脱细胞基质(DAM，Decellularizedadipose Matrix)。同时，异种源猪的皮下含有大量的脂肪，我们可以利用异种源猪的脂肪进行大规模的工业化生产，成为像透明质酸类似的填充剂。不同的是它将促进宿主组织再生，有望广泛应于与临床修复重建以及软组织再生领域，成为更有价值的新兴生物材料。
中国专利CN201610967425.9公开了可注射的脱细胞脂肪基质微粒及其在植入剂中的应用，该方法采用异丙醇等各种有机溶剂来进行脱细胞和脱脂，不但耗时长，而且会引起后续有机溶剂残留，影响基质材料的生物安全性和生物活性，导致细胞外基质的三维立体结构造成破坏，以及重要蛋白质和生长因子的消除，破坏了后期脂肪细胞生存所需要的微环境，其材料的生物活性下降，进一步影响了支架材料诱导的组织再生，从而限制其在临床当中的应用。
发明内容
本发明提出了一种物理方法制备人和猪脂肪源性脱细胞基质颗粒、可注射型水凝胶基质及其使用方法，其中，采用蒸馏水漂洗、组织匀浆、高速离心、振荡、梯度高渗生理盐水漂洗、低温冷冻干燥、研磨等物理的方法制备脂肪脱细胞基质颗粒；其缩短了处理所需要的时间、提高了效率，保留了细胞外基质的三维立体微观结构、关键蛋白和细胞生长因子等成分，有利于后期组织和细胞的再生，为软组织缺损修复、再生以及美容填充的临床应用提供了可能性。
为了解决上述技术问题，本发明特提供如下技术方案：
一种以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质的制备方法，其按如下步骤制备而成:
1)将获取的取人源性或猪源性的脂肪颗粒用蒸馏水进行数次漂洗、组织匀浆、高速离心；
2)将高速离心取出的初步脂肪基质层加入同比例的缓冲液后经过定轨摇床振荡，振荡后再进行低速离心处理；
3)将制得脂肪基质层再进行蒸馏水漂洗后重复进行步骤2)；
4)将制得的脂肪基质再进行蒸馏水漂洗和机械振荡处理，最终进行蒸馏水漂洗；
5)将上述制得的脂肪基质进行低温冷冻干燥处理、裁切或研磨处理后进行低温等离子灭菌处理。
进一步的，人源性的脂肪颗粒在实施操作步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)时需保持温度在37℃；
猪源性的脂肪颗粒在实施操作步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)时需保持温度在40℃以上。
作为优选的实施例，所述步骤2)中的初步脂肪基质层，加入1M的高渗氯化钠缓冲液，所述初步脂肪基质层和缓冲液的比例为1：1，在37℃或40℃定轨摇床振荡2小时。
作为优选的实施例，所述步骤3)中加入的高渗氯化钠缓冲液为2M，该脂肪基质层和缓冲液的比例为1：1，在37℃或40℃定轨摇床振荡2小时。
作为优选的实施例，所述机械振荡处理为收集步骤4)中的经蒸馏水漂洗的脂肪脱细胞基质，将其分别装入无菌EP管当中，每个无菌EP管加入直径5mm的小钢珠3颗，机械剧烈振荡2分钟；将脂肪脱细胞基质再次收集到无菌离心管当中。
作为优选的实施例，所述低温冷冻干燥处理为将脂肪基质收集至培养皿，放入-80℃冰箱冷冻；冷冻后再通过低温真空冷冻干燥机进行脱水干燥。
一种利用以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质制备水凝胶的制备方法：将冻干的脂肪脱细胞基质以20mg/ml的浓度范围在含有2mg/ml胃蛋白酶的0.1M的HCL中消化，之后用1M NaOH将PH调整至7.4，并在1xPBS中稀释至浓度为16mg/ml，置于37℃培养箱后，可自凝胶化。
作为优选的实施例，每10mg冻干的脂肪脱细胞基质对应1mg胃蛋白酶，以比例为10：1进行添加。
一种利用脂肪脱细胞基质水凝胶的使用方法，该脂肪脱细胞基质水凝胶在提前预冷的4-10℃环境下进行注射，能够通过27g小针头进行局部注射,可用于面部年轻化及软组织缺损的修复和再生。
与现有技术相比，本发明产生的有益效果主要体现在：
本发明的以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质制备及应用，该方法不仅消除了任何刺激性化学物质和对组织再生有影响的酶学物质的应用，还进一步缩短了处理所需要的时间、提高了效率，保留了细胞外基质的三维立体结构、关键蛋白和细胞因子，为软组织缺损修复、整形外科的临床应用提供了可能性。
本发明使用的是物理的方法制备人或猪脂肪源性脱细胞基质颗粒、可注射型脂肪脱细胞基质水凝胶，一方面，采用蒸馏水漂洗、组织匀浆、高速离心、振荡、梯度高渗生理盐水漂洗、低温冷冻干燥、研磨等物理的方法所获得的脱细胞基质生物材料，经检测其dsDNA含量低于50ng/mg的阈值水平，这是被认为临床应用的安全范围；
另一方面，利用物理的方法不仅保留了关键的蛋白质和生长因子，例如I、IV、VI型等胶原蛋白、弹性蛋白(elastin)、纤维连接蛋白(fibronectin)和层粘连蛋白(laminin)等，同时还保留了其他生物因子如糖胺聚糖(GAG)和生长因子如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)。这些关键蛋白质和生长因子的保留，对于细胞外基质(ECM)在体内的软组织修复和再生成脂肪能力的整个过程都是至关重要的。
附图说明
图1是本发明的物理方法制备人和猪脂肪源性脱细胞基质颗粒的制备方法工艺流程图；
具体实施方式
为了便于理解本发明的目的、技术方案及其效果，现将结合实施例对本发明做进一步详细阐述。
实施例1
以物理方法为主制备人脂肪源性脱细胞基质
如图1所示，本发明的一种以物理方法为主制备人脂肪源性脱细胞基质的制备方法，其按如下步骤制备而成：
1)将获取的人源性的脂肪颗粒用蒸馏水进行数次漂洗、组织匀浆、高速离心；
通过吸脂技术来获取人源性的脂肪颗粒，将所得到的脂肪颗粒用蒸馏水漂洗数次，直至除血液成分；
然后在上述脂肪颗粒内加入4℃蒸馏水或低渗盐水后放置至匀浆机，利用匀浆机对脂肪进行匀浆，转速为12000rpm，时间为2分钟；随后放置定轨摇床振荡20分钟；
再将脂肪颗粒装入无菌离心管当中，采用高速离心机对其进行高速离心；其中，转速1800g，离心时间为5分钟，得到四层分层组织，其从上至下依次包括：
第1层：油脂层，弃去；
第2层：初步脂肪基质层，提取后进行下一步操作；
第3层：水份层，弃去；
第4层：细胞层，弃去；
2)将高速离心取出的初步脂肪基质层加入同比例的缓冲液后经过定轨摇床振荡，振荡后再进行低速离心处理；
收集上述步骤1)中第2层的初步脂肪基质层，将其装于无菌离心管当中，加入1M的高渗氯化钠缓冲液，其中，初步脂肪基质层组织和缓冲液比例为1：1，在37℃定轨摇床振荡2小时；
将上述收集的混合液放入离心机进行离心操作，其中，转速为300g，离心时间为5分钟；此时可进一步观察到三层分层组织，其从上至下依次包括：
第1层：油脂层，弃去；
第2层：脂肪基质层，提取后进行下一步操作；
第3层：水、细胞混合层，弃去；
3)将制得脂肪基质层再进行蒸馏水漂洗后重复进行步骤2)；
将上述收集的脂肪基质层装入无菌离心管当中，加入蒸馏水，放置定轨摇床进行振荡漂洗处理，处理时间2小时；其中，需要注意的是：每隔一小时换新的蒸馏水；
再将上述漂洗后的脂肪基质，将其装于无菌离心管当中，加入2M的高渗氯化钠缓冲液，脂肪基质层组织和缓冲液比例为1：1，在37℃把上述收集的脂肪基质放入离心机进行离心操作，转速300g，离心时间为5分钟；将上述收集的混合液放入离心机进行离心操作，其中，转速为300g，离心时间为5分钟；此时可进一步观察到三层分层组织，其从上至下依次包括：
第1层：油脂层，弃去；
第2层：脂肪基质层，提取后进行下一步操作；
第3层：水、细胞混合层，弃去；
4)将制得的脂肪基质再进行蒸馏水漂洗和机械振荡处理，最终进行蒸馏水漂洗；
收集上述的脂肪基质层装入无菌离心管当中，加入蒸馏水，放置定轨摇床进行振荡漂洗处理，处理时间6小时，每隔2小时换新的蒸馏水；
收集上述的脂肪脱细胞基质分别装入无菌EP管当中，每个管加入直径5mm的小钢珠3颗，机械剧烈振荡2分钟；将脂肪脱细胞基质再次收集到无菌离心管当中，加入蒸馏水漂洗，时间为一小时；
5)将上述制得的脂肪基质进行低温冷冻干燥处理、裁切或研磨处理后进行低温等离子灭菌处理。
收集上述的脂肪脱细胞基质放入离心机进行离心，转速300g，时间5分钟；此时水下层为脂肪脱细胞基质层；将其收集至培养皿，放入-80℃冰箱冷冻。之后通过低温真空冷冻干燥机进行脱水干燥；
再将上述所得到的脂肪脱细胞基质裁切成均匀的片状或研磨成大小颗粒均匀的粉末，装入无菌西林瓶中，用低温等离子灭菌消毒；放置在真空密封袋中，并于4℃保存备用。
实施例2
以物理方法为主制备猪脂肪源性脱细胞基质
如图1所示，本发明的一种以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质的制备方法，其按如下步骤制备而成：
1)将获取的猪源性的脂肪颗粒用蒸馏水进行数次漂洗、组织匀浆、高速离心；
通过吸脂技术来获取猪源性的脂肪颗粒，将所得到的脂肪颗粒用蒸馏水漂洗数次，直至除血液成分；
然后在上述脂肪颗粒内加入4℃蒸馏水或低渗盐水后放置至匀浆机，利用匀浆机对脂肪进行匀浆，转速为12000rpm，时间为2分钟；随后放置定轨摇床振荡20分钟；
再将脂肪颗粒装入无菌离心管当中，采用高速离心机对其进行高速离心；其中，转速1800g，离心时间为5分钟，得到四层分层组织，其从上至下依次包括：
第1层：油脂层，弃去；
第2层：初步脂肪基质层，提取后进行下一步操作；
第3层：水份层，弃去；
第4层：细胞层，弃去；
2)将高速离心取出的初步脂肪基质层加入同比例的缓冲液后经过定轨摇床振荡，振荡后再进行低速离心处理；
收集上述步骤1)中第2层的初步脂肪基质层，将其装于无菌离心管当中，加入1M的高渗氯化钠缓冲液，其中，初步脂肪基质层组织和缓冲液比例为1：1，在40℃定轨摇床振荡2小时；
将上述收集的混合液放入离心机进行离心操作，其中，转速为300g，离心时间为5分钟；此时可进一步观察到三层分层组织，其从上至下依次包括：
第1层：油脂层，弃去；
第2层：脂肪基质层，提取后进行下一步操作；
第3层：水、细胞混合层，弃去；
3)将制得脂肪基质层再进行蒸馏水漂洗后重复进行步骤2)；
将上述收集的脂肪基质层装入无菌离心管当中，加入蒸馏水，放置定轨摇床进行振荡漂洗处理，处理时间2小时；其中，需要注意的是：每隔一小时换新的蒸馏水；
再将上述漂洗后的脂肪基质，将其装于无菌离心管当中，加入2M的高渗氯化钠缓冲液，脂肪基质层组织和缓冲液比例为1：1，在40℃把上述收集的脂肪基质放入离心机进行离心操作，转速300g，离心时间为5分钟；将上述收集的混合液放入离心机进行离心操作，其中，转速为300g，离心时间为5分钟；此时可进一步观察到三层分层组织，其从上至下依次包括：
第1层：油脂层，弃去；
第2层：脂肪基质层，提取后进行下一步操作；
第3层：水、细胞混合层，弃去；
4)将制得的脂肪基质再进行蒸馏水漂洗和机械振荡处理，最终进行蒸馏水漂洗；
收集上述的脂肪基质层装入无菌离心管当中，加入蒸馏水，放置定轨摇床进行振荡漂洗处理，处理时间6小时，每隔2小时换新的蒸馏水；
收集上述的脂肪脱细胞基质分别装入无菌EP管当中，每个管加入直径5mm的小钢珠3颗，机械剧烈振荡2分钟；将脂肪脱细胞基质再次收集到无菌离心管当中，加入蒸馏水漂洗，时间为一小时；
5)将上述制得的脂肪基质进行低温冷冻干燥处理、裁切或研磨处理后进行低温等离子灭菌处理。
收集上述的脂肪脱细胞基质放入离心机进行离心，转速300g，时间5分钟；此时水下层为脂肪脱细胞基质层；将其收集至培养皿，放入-80℃冰箱冷冻。之后通过低温真空冷冻干燥机进行脱水干燥；
再将上述所得到的脂肪脱细胞基质裁切成均匀的片状或研磨成大小颗粒均匀的粉末，装入无菌西林瓶中，用低温等离子灭菌消毒；放置在真空密封袋中，并于4℃保存备用。
一种利用以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质制备水凝胶的制备方法：将冻干的脂肪脱细胞基质以20mg/ml的浓度范围在含有2mg/ml胃蛋白酶的0.1M的HCL中消化，之后用1M NaOH将PH调整至7.4，并在1xPBS中稀释至浓度为16mg/ml，置于37℃培养箱后，可自凝胶化。
作为优选的实施例，每10mg冻干的脂肪脱细胞基质对应1mg胃蛋白酶，以比例为10：1进行添加。
一种利用脂肪脱细胞基质水凝胶的使用方法，该脂肪脱细胞基质水凝胶在提前预冷的4-10℃环境下进行注射，能够通过27g小针头进行局部注射,可用于面部年轻化及软组织缺损的修复和再生。
本专利叙述的脂肪脱细胞基质颗粒，采用物理方法予以制备，由吸脂手术收集人或猪源性脂肪组织，采用蒸馏水漂洗、组织匀浆、高速离心、振荡、梯度高渗生理盐水漂洗、低温冷冻干燥、研磨等物理的方法制备脂肪脱细胞基质颗粒；
本发明采用的物理破碎脂肪细胞和脱脂方法以及应用梯度生理盐水温和脱细胞的技术，操作简便，有效缩短了处理所需要的时间、提高了效率。
本发明不仅消除化学刺激性物质的残留和对组织再生有破坏性的酶学物质的应用，而且保留了组织的三维结构和活性成分，所获得的材料更接近人体天然脂肪组织微环境，可通过进一步处理为可注射型脂肪脱细胞基质水凝胶，用27g的小针头进行注射，注射后更利于细胞的增殖和分化，从而促进组织的修复与再生，起到长久的填充效果。
本发明的产品将会在面部年轻化和软组织缺损的修复、再生等方面成为新型的生物医学材料。
上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (9)
1.一种以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质的制备方法，其特征在于：其按如下步骤制备而成：
1)将获取的人源性或猪源性的脂肪颗粒用蒸馏水进行数次漂洗、组织匀浆、高速离心；
2)将高速离心取出的初步脂肪基质层加入同比例的缓冲液后经过定轨摇床振荡，振荡后再进行低速离心处理；
3)将制得脂肪基质层再进行蒸馏水漂洗后重复进行步骤2)；
4)将制得的脂肪基质再进行蒸馏水漂洗和机械振荡处理，最终进行蒸馏水漂洗；
5)将上述制得的脂肪基质进行低温冷冻干燥处理、裁切或研磨处理后进行低温等离子灭菌处理。
2.根据权利要求1所述的以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质的制备方法，其特征在于：
人源性的脂肪颗粒在实施操作步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)时需保持温度在37℃；
猪源性的脂肪颗粒在实施操作步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)时需保持温度在40℃以上。
3.根据权利要求1所述的一种以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质的制备方法，其特征在于：
所述步骤2)中的初步脂肪基质层，加入1M的高渗氯化钠缓冲液，所述初步脂肪基质层和缓冲液的比例为1：1，在37℃或40℃定轨摇床振荡2小时。
4.根据权利要求1所述的以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质的制备方法，其特征在于：
所述步骤3)中加入的高渗氯化钠缓冲液为2M，该脂肪基质层和缓冲液的比例为1：1，在37℃或40℃定轨摇床振荡2小时。
5.根据权利要求1所述的以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质的制备方法，其特征在于：
所述机械振荡处理为收集步骤4)中的经蒸馏水漂洗的脂肪脱细胞基质，将其分别装入无菌EP管当中，每个无菌EP管加入直径5mm的小钢珠3颗，机械剧烈振荡2分钟；将脂肪脱细胞基质再次收集到无菌离心管当中。
6.根据权利要求1所述的以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质的制备方法，其特征在于：
所述低温冷冻干燥处理为将脂肪基质收集至培养皿，放入-80℃冰箱冷冻；冷冻后再通过低温真空冷冻干燥机进行脱水干燥。
7.一种利用权利要求1中的以物理方法为主制备人和猪脂肪源性脱细胞基质制备水凝胶的制备方法：将冻干的脂肪脱细胞基质以20mg/ml的浓度范围在含有2mg/ml胃蛋白酶的0.1M的HCL中消化，之后用1M NaOH将PH调整至7.4，并在1xPBS中稀释至浓度为16mg/ml，置于37℃培养箱后，可自凝胶化。
8.根据权利要求6所述的脂肪脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于：
每10mg冻干的脂肪脱细胞基质对应1mg胃蛋白酶，以比例为10：1进行添加。
9.一种利用权利要求6中的脂肪脱细胞基质水凝胶的使用方法，其特征在于：
该脂肪脱细胞基质水凝胶在提前预冷的4-10℃环境下进行注射，能够通过27g小针头进行局部注射,可用于面部年轻化及软组织缺损的修复和再生。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210423 |
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