CN113301928A - 生物支架和用于制备其的方法 - Google Patents

Abstract

本发明中的生物支架包括主体、生物材料层和可选的组织粘合剂层。主体至少具有非重构型胶原蛋白基质。生物材料层被至少涂覆在主体的表面，组织粘合剂层被置于主体的另一表面。当生物支架通过组织粘合剂层粘附至组织时，多个细胞从组织向粘合剂层或生物材料层移动以进行组织修复或再生。

Description

生物支架和用于制备其的方法

技术领域

本发明提供了生物支架和用于制备其的方法，该生物支架包括非重构型胶原蛋白基质和生物材料，和可选的组织粘合剂层。更具体地，该非重构型胶原蛋白基质和该生物支架可用作促进伤口愈合的敷料。

背景技术

组织工程改造是指通过使用合成物质或生物活性物质的体外培养或构建的技术对器官和组织进行重构或修复。组织工程改造涉及诸如生物学、材料学和工程学等多学科，并且已经能够对诸如骨、软骨、皮肤、肾脏、肝脏、消化道、角膜、肌肉和乳房等组织进行重建。组织工程改造的基本方法也称为“再生医学”，包括以下步骤：首先，从人体取出细胞，并对细胞进行体外培养直至达到足够数量；然后，将细胞放置到人工支架中并使其生长；有时甚至需要添加一些化学物质或生物因子以促进细胞分化；最后将人工组织移植到患者。因此，组织再生的三个要素为细胞、生物支架和生长因子。

其中，构成人体最基本的结构和功能的单元是细胞。存在于细胞之间的是细胞外基质，该细胞外基质由细胞本身产生。其是包括结构性成分的物质，如蛋白质原纤维/束(如胶原蛋白)、结晶性无机矿物等。

组织由许多具有相似形态和功能的细胞组成，并通过细胞外基质结合在一起。其中，根据不同的细胞类型，它们被分为不同的组织，例如上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织等。其中，结缔组织由大量的细胞外基质与散布在其中的细胞组成。细胞外基质含有基质、原纤维和组织液等。胶原蛋白是动物结缔组织中最重要的结构性蛋白质，也是细胞外基质中最重要的成分。在动物结缔组织中，除了60-70％的水分之外，还包含20-30％的胶原蛋白。因此，胶原蛋白是广泛存在于动物体内的蛋白质，结缔组织广泛分布于人体内并且存在于几乎所有器官。

胶原蛋白主要以不溶性原纤维的形式存在，约占人体组织中蛋白质的33％。换言之，胶原蛋白占人体中蛋白质的三分之一，并且是结缔组织中非常重要的结构性蛋白质。它发挥“床垫”及“水泥”的作用，保护并连接各组织以支撑人体结构。因此，通常将胶原蛋白用作生物假体的材料。

胶原蛋白的最基本单元是原胶原蛋白，其是由三条多肽链组成的分子。三条多肽链通过链间氢键平行紧密结合在一起以形成稳定的三螺旋结构。三螺旋链的胶原蛋白单元被称为原胶原蛋白，直径为约1.5nm，长度为约280nm。生理状态下，多个原胶原蛋白分子自聚集成胶原蛋白微原纤维结构，每个分子以约67nm的距离交错排列。然后可以将微原纤维聚集成通常为约50nm的不同直径的原纤维。在体内，原纤维堆叠成不同的四级结构，其可以形成网状原纤维，如表皮细胞下的基质。这些原纤维可以进一步聚集成纤维，如韧带和肌腱，其含有沿单一方向规则排列的胶原蛋白原纤维。

目前为止，已发现的动物胶原蛋白可以分为至少28种。除了主要为II型胶原蛋白的透明软骨，大部分的结缔组织主要含有I型胶原蛋白，占胶原蛋白总含量的约90％，并且还是使用最广泛的胶原蛋白生物材料。它的主要结构性蛋白质为结缔组织提供结缔组织所需的支撑、保护和各种机械性能，如张力、拉力、强度和粘弹性等。在生物化学性能方面，它可以促进凝血级联并催化血块的形成。胶原蛋白的功能包括控制分子渗透性、促进伤口愈合与组织修复、和调控细胞与组织的生理功能。

用于制备常规胶原蛋白基质的方法，例如中国台湾地区专利第476642号中的用于制备多孔胶原蛋白基质的方法，是在30-45℃以近似生理条件重构胶原蛋白基质。通过冷冻和冻干该基质可以获得多孔胶原蛋白基质。图3示出了常规多孔胶原蛋白基质的100×方法电子显微照片。其外观具有呈现出松散且不规则的薄片状外观的结构，并且无法提供较好的张力和抗细胞收缩性，二者是优化合适细胞迁移和增殖所需要的。此外，由于胶原蛋白的表面特性，不利于细胞进入。

美国专利第5,997,895号中的另一常规技术“使用胶原蛋白基质的硬脑膜/脑膜修复产品”提供了用于修复并促进脑膜生长的方法。可以使用不含致病病毒残留物的经证实生物相容性来源的胶原蛋白。交联反应被用于胶原蛋白基质并且以10-500μm的多孔直径形成多孔胶原蛋白结构，其使得受损脑膜得以修复并促进脑膜的生长。然而，由于胶原蛋白取自动物皮肤(例如猪皮等)的真皮层，因此当在处理猪皮的过程中未完全去除毛囊时，会破坏后续制备胶原蛋白基质的整体结构。还会影响制备的胶原蛋白的纯度，这会引起细菌感染和免疫反应，或者在临床使用中造成免疫排斥。

标题为“高纯度胶原蛋白的制备”的中国台湾地区专利第098125217号提供了用于胶原蛋白制备的方法，包括：提供表面积为20mm²至2m²的结缔组织；使用第一酸溶液以使结缔组织的体积膨胀至少50％而形成膨胀的结缔组织，其中酸溶液的pH值是1-6并且酸溶液基本上不含盐；清洗膨胀的结缔组织以去除非胶原蛋白性物质而形成胶原蛋白基质；然后使用提取溶液从胶原蛋白基质提取胶原蛋白而制备含有胶原蛋白的溶液。在上述技术中，溶液是胶原蛋白，通过常规方法形成的多孔胶原蛋白基质无法提供较好的张力和抗细胞收缩性，二者是优化合适细胞浸润和增殖所需要的。

标题为“非细胞性真皮基质及其用于移植的使用方法”的另一美国发明专利公告第US8067149B2号提供了用于提取非细胞性组织基质的方法，该方法包括去除毛囊和用表面活性剂SDS提取。然而其提取非细胞性组织基质，这不同于本发明的高纯度多孔胶原蛋白。

生物支架的当前总体状况如下。

目前，市场上大多数生物支架由重构型胶原蛋白基质制成，并且其相关产品已在多个以前的专利中公开。例如，在美国专利第4,193,813号中，先将胶原蛋白溶解在醋酸中，用戊二醛交联，然后在低温下冷冻持续较长时间(例如20小时)。解冻后，以机械方式去除水而形成海绵样基质，并且通过此方法获得的基质的孔径为约80-1400μm。美国专利第4,412,947号教导的方法包括将高纯度不可溶胶原蛋白颗粒悬浮在醋酸溶液中，以约每分钟0.3至0.4℃的冷却速率冷冻至-65℃，并冻干以形成多孔片状基底。美国专利第4,522,753号教导了将胶原蛋白和硫酸软骨素混合成共聚物，通过戊二醛交联，并冻干以得到孔径为约20至180μm的多孔基质，可以将其用作人工皮肤基底。美国专利第4,970,298号公开了可以通过碳二亚胺和脱水热法使含有酸可溶性胶原蛋白溶液或者酸可溶性胶原蛋白、透明质酸和纤连蛋白等的溶液的混合物溶液交联。在不同温度下冷冻后，采用冻干以制备多孔基质。冷冻温度为-30至-50℃，得到的基质的孔径为约50至250μm，并且含有透明质酸或纤连蛋白的胶原蛋白基质具有100-150μm的孔径。上述专利中公开的用于制备胶原蛋白基质的方法主要采用酸性或碱性胶原蛋白，在高温下交联或通过化学交联剂交联然后冻干以产生孔而得到多孔基质。由这些方法制备的基质的孔均匀性较差，并且难以控制孔径。此外，使用的化学交联剂大多数具有毒性。重构型胶原蛋白微原纤维或原纤维为基质提供有限的支撑、保护及各种机械性能，如张力、拉力、强度和粘弹性等，并且因此对于临床应用并不十分理想。

非重构型胶原蛋白基质对于临床应用具有较高的工业价值，并且发明人先前申请的标题为“用于制备多孔胶原蛋白基质的方法”的美国专利第8,198,408号公开了非重构型胶原蛋白基质的制备方法。

常规上，现有技术中使用的方法，例如标题为“多孔胶原蛋白基质的制备”的中国台湾地区发明专利第150746号，该方法最初将胶原蛋白在30至45℃引入中性溶液持续一段时间以允许胶原蛋白微原纤维重构而得到凝胶状胶原蛋白基质。将凝胶状胶原蛋白基质以适当的温度冷却速率冷冻至适当的较低温度，然后在减压下冻干以得到多孔胶原蛋白基质。在标题为“用于从结缔组织制备多孔胶原蛋白基质的方法”的中国台湾地区专利第I284665号中，在清洗步骤之后对经过基本上原位处理的结缔组织进行多孔处理步骤以从结缔组织去除杂质和非胶原蛋白，其中多孔处理步骤是获得具有多孔性能的胶原蛋白基质。该原位处理省略了撕碎或切碎结缔组织的常规程序，并且该方法不需要使用交联剂。此方法通过省略2或3个处理步骤更加方便地制备胶原蛋白基质，但并没有记载多孔结构及其承载应力和张力。

一般而言，如果人体表面存在伤口，使用纱布、绷带、贴剂和医用胶带等覆盖并包扎伤口以防止外部细菌感染。然而，上述外部敷料只能抑制外部细菌但对伤口本身没有直接帮助。

综上所述，为解决防止伤口被外部细菌感染并获得高纯度多孔胶原蛋白的问题，本发明提供用于伤口敷料的具有非重构型胶原蛋白基质的生物支架。

发明内容

本发明提供了生物支架，包括至少一种非重构型胶原蛋白基质和至少一种生物材料，生物材料均匀地覆盖非重构型胶原蛋白基质的至少一个表面或外表面和内表面二者。此外，本发明中还公开了用于制备前述非重构型胶原蛋白基质和生物支架的方法，其比传统胶原蛋白基质具有更高的强度。此外，由于本发明提供的生物支架可以被均匀地涂覆有生物材料层，因此其有利于使细胞浸润到非重构型胶原蛋白基质中。此外，可以破坏非重构型胶原蛋白基质中的毛囊组织而不破坏真皮胶原蛋白的主要结构，由此使得非重构型胶原蛋白基质比通过常规技术制备的基质具有更高的强度。其还减轻了由毛囊引起的免疫反应并帮助细胞生长，使得生物支架更适合进一步应用于外科手术、人体器官和组织的修复、再生医学、皮肤移植或美容医疗。其还可用作外科修复网状织物、牙科修复网状织物、人类皮肤替代物、人工脑膜替代物、骨科修复替代物或伤口敷料替代物。

本发明提供的生物支架包括至少的非重构型胶原蛋白基质和至少一种生物材料。非重构型胶原蛋白基质系统具有多个束状胶原蛋白原纤维和由束状胶原蛋白原纤维形成的多个孔。生物材料被涂覆在主体的至少一个外表面和/或束状胶原蛋白原纤维的外表面上。由于多个孔由束状胶原蛋白原纤维形成，即胶原蛋白原纤维形成孔的内壁，因此涂覆胶原蛋白原纤维的表面可以等同于涂覆孔的内壁。

制备非重构型胶原蛋白基质的方法可以包括：从动物皮肤组织获得真皮层片；执行脱毛步骤，脱毛步骤包括将真皮层片浸入高离子强度盐溶液，然后向盐溶液添加蛋白水解酶，由此产生脱毛的真皮层片；和执行膨润步骤，膨润步骤包括将脱毛的真皮层片浸入第一酸性溶液足够时间段以使脱毛的真皮层片形成膨润的真皮片层，由此形成非重构型胶原蛋白基质，非重构型胶原蛋白基质具有多个交织重叠的束状胶原蛋白原纤维和由束状胶原蛋白原纤维形成的多个孔。

可选地，用于制备非重构型胶原蛋白基质的方法可以还包括消毒步骤、脱脂步骤、去抗原步骤和/或强化步骤。

用于制备生物支架的方法可以包括：提供本文所述的非重构型胶原蛋白基质；在减压环境下使所述非重构型胶原蛋白基质与含有生物材料的溶液接触，由此使所述生物材料涂覆在所述非重构型胶原蛋白基质的第一外表面和多个孔的内部。

综上所述，本发明的制备方法可以还包括：进行任一步骤之前或之后的消毒处理步骤，并且用消毒溶液清洗所述片或真皮层片。最优选地，消毒溶液是过醋酸溶液。

在本发明的实施方案中，本发明提供的制备方法还包括以下步骤：首先，取出涂覆有生物材料的非重构型胶原蛋白基质；接着，将细胞培养基注入孔；然后，注入含有细胞的溶液以使细胞进入孔并粘附至生物支架。优选地，细胞可以是干细胞、卫星细胞、前体细胞或组织细胞。

在根据本发明的用于制备非重构型胶原蛋白基质的方法的一个实施方案中，动物皮肤组织是猪皮、牛皮或羊皮组织。

在根据本发明的用于制备非重构型胶原蛋白基质的方法的一个实施方案中，含有高离子强度的盐溶液是其中阴离子和阳离子以离子键结合的盐溶液。优选地，含有高离子强度的盐溶液的离子强度大于0.15N。最优选地，含有高离子强度的盐溶液的离子强度在0.5N-10N之间。最优选地，含有高离子强度的盐溶液是含有氯化钠、硫酸铵和上述化合物的混合物的溶液。该高盐条件稳定了非重构型胶原蛋白基质的结构、不会使其膨胀并挤入毛囊，使得酶可以顺利地进入毛囊进行反应。

在根据本发明的用于制备非重构型胶原蛋白基质的方法的一个实施方案中，蛋白水解酶可以作用于含有高离子强度的盐溶液。优选地，蛋白水解酶选自由以下组成的组：丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、和上述酶的组合。优选地，半胱氨酸酶选自由以下组成的组：木瓜的酶(例如，木瓜酶)、菠萝的酶(例如，菠萝酶)和上述酶的混合物。最优选地，金属蛋白酶是中性蛋白酶。

在根据本发明的用于制备非重构型胶原蛋白基质的方法的一个实施方案中，脱毛处理步骤之前或之后还包括脱脂步骤。脱脂步骤是皂化处理、有机溶剂处理或它们的组合。在皂化步骤中，使用碱性物质接触真皮层片的表面。优选地，碱性物质呈颗粒状，并且是强碱性颗粒。最优选地，强碱性颗粒是氢氧化钠颗粒。有机溶剂处理是醇处理、己烷处理或氯仿处理。

在根据本发明的用于制备非重构型胶原蛋白基质的方法的一个实施方案中，脱毛处理步骤或之后的任一步骤还包括进行震动或搅动步骤。优选地，震动或搅动步骤是超声波震荡处理。

在根据本发明的用于制备非重构型胶原蛋白基质的方法的一个实施方案中，脱毛处理步骤或之后的任一步骤还包括进行加热处理。任选地，加热处理是加热至25℃至40℃。

在根据本发明的用于制备非重构型胶原蛋白基质的方法的一个实施方案中，进行脱毛处理步骤之后的任一步骤还包括清洗步骤，在清洗步骤中将所述片或真皮层片浸入清洗溶液或通过消毒气体。优选地，清洗溶液是磷酸盐溶液或水溶液。优选地，消毒气体是臭氧。

在根据本发明的用于制备非重构型胶原蛋白基质的方法的一个实施方案中，第一酸性溶液是弱酸溶液。

在根据本发明的用于制备非重构型胶原蛋白基质的方法的一个实施方案中，在膨润处理步骤之后，还包括去抗原处理步骤。去抗原处理步骤是将所述片或真皮层片浸入第二酸性溶液。第二酸性溶液含有胃蛋白酶。最优选地，第二酸性溶液为弱酸性溶液。

在根据本发明的用于制备非重构型胶原蛋白基质的方法的一个实施方案中，在膨润处理步骤之后，还包括强化处理步骤。将所述片或真皮层片浸入添加剂。优选地地，添加剂是交联剂溶液。

在本发明的一个实施方案中，交联试剂是转谷氨酰胺酶或通过官能基团发挥作用，其中交联剂的一个官能基团选自由以下组成的组：胺、硫氢基、羰基、乙二醇、羟基、羧基、叠氮化合物、亚氨酸酯、环氧化物、醛、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、吡啶二硫醇、酰肼、光反应、碳二亚胺、双吖丙啶、氮丙啶、丙烯酰基、芳基化物、硫醇、栀子素、核黄素、类黄酮及其衍生物、羟甲基膦、异氰酸酯、马来酰亚胺、6-马来酰亚胺己酸活性酯、辛二酸二琥珀酰亚胺酯、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺)酯、N-羟基-琥珀酰亚胺酯(NHS-酯)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、五氟苯酯(PFP-酯)、乙二醇二缩水甘油醚、戊二醛、2,3-二溴丙酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、苯丁酸氮芥-N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亚胺、补骨脂素、乙烯基砜和它们的组合。

在本发明的实施方案中，主体中的多个孔的孔壁包括其中束状胶原蛋白原纤维交织重叠的结构。

在本发明的一个实施方案中，生物支架至少包括：主体，主体包括非重构型胶原蛋白基质；生物材料，生物材料涂覆在主体的至少第一表面上；和组织粘合剂层，组织粘合剂层在主体与第一表面相对的另一表面上，或在与第一表面相邻的另一表面上，或在第一表面外的两个或更多个表面上，其中组织粘合剂层包含组织粘合剂。其中，当生物支架通过组织粘合剂层粘附至组织时，多个细胞从组织粘合剂层向生物材料层移动以进行组织的重构。

在本发明的一个实施方案中，生物材料选自由以下组成的组：细胞附着材料、组织修复材料、细胞诱导材料、生长因子材料、抗菌材料和上述物质的混合物。

优选地，细胞附着材料可以是糖材料、肽、蛋白、磷脂或它们的混合物。

优选地，糖材料可以是糖胺聚糖材料。

优选地，糖胺聚糖材料选自由以下组成的组：软骨素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、角质素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、卡拉胶、透明质酸和它们的组合。

优选地，组织修复材料可以是生物材料、细胞外基质、营养物和它们的组合。

优选地，生物材料选自由以下组成的组：胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、糖胺聚糖、壳聚糖、藻酸盐、聚谷氨酸(γ-PGA)、聚赖氨酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、丝素蛋白等和它们的组合。

优选地，细胞外基质选自由以下组成的组：胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、糖蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、聚集蛋白聚糖、金属蛋白酶等和它们的组合。

优选地，营养物选自由以下组成的组：维生素、矿物质、蛋白质、脂质、碳水化合物、氨基酸、肽、核苷酸、脱氧核苷酸、草药等和它们的组合。

优选地，细胞诱导材料选自由以下组成的组：诸如维生素、矿物质、化合物、药物、草药、代谢物、中间代谢物、糖、肽、蛋白质、磷脂或它们的组合的分子。

优选地，抗菌材料是抗生素、抗微生物蛋白质或抗微生物肽。

优选地，生长因子材料选自由以下组成的组：表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-I、IGF-II)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、集落刺激因子(CSF)、干细胞因子(SCF)、角质细胞生长因子(KGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、神经胶质源性神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNF)、内皮单核细胞活化多肽、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素、骨形态发生蛋白(BMP-1、BMP-2、BMP-3等)、脑源性神经营养因子(BDNF)、BRAK、血清素、血管性血友病因子(vWF)、转化生长因子(TGF-α、TGF-β)、白介素(IL-1、IL-2、IL-3等)、肿瘤坏死因子(TNF)和它们的组合。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供的生物支架还包括孔中的细胞培养基。

优选地，其还包括细胞，其中细胞粘附至生物支架的任一孔中。

优选地，细胞可以是干细胞、卫星细胞、前体细胞或组织细胞。

在本发明的一个实施方案中，减压环境通过抽真空作用完成。

在本发明的一个实施方案中，组织粘合剂层包含：交联剂，交联剂是转谷氨酰胺酶或至少含有官能基团；一种基质成分，非重构型胶原蛋白基质本身或基质分子以外，其与交联剂交联；和猝灭剂，猝灭剂用于与交联剂的官能基团反应或与交联剂的剩余官能基团反应，以降低细胞毒性。

优选地，基质分子选自由以下组成的组：胶原蛋白、透明质酸、明胶、丝素蛋白(silk fibroin)、纤连蛋白、弹性蛋白、腱生蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、硫酸乙酰肝素、软骨素、硫酸软骨素、角质素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、卡拉胶、肝素、甲壳素、壳聚糖、藻酸盐、聚集蛋白聚糖、琼脂糖、琼脂、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糖原、纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚氨基酸、合成聚合物(例如，丙烯酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸)、它们的衍生物和它们的组合。

优选地，猝灭剂选自由由以下组成的组：氨基酸、寡肽、多肽、蛋白质、胺、二胺、低聚胺、多聚胺、羰基化合物、乙二醇化合物、羧基化合物、二羧酸盐、低聚羧酸盐、多聚羧酸盐、硫氢基化合物、低聚硫氢基化合物、多聚硫氢基化合物、羟基化合物、低聚羟基化合物、多聚羟基化合物、糖、低聚糖、多聚糖、核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、寡核苷酸、叠氮化合物、光交联化合物、和由单官能基团或异双官能基团组成的基团、和它们的组合。

优选地，组织是皮肤组织。

附图说明

图1是显示本发明实施方案中的非重构型生物支架的横截面示意图。

图2是显示本发明实施方案中的非重构型生物支架的主体的横截面示意图。

图3显示常规重构型多孔胶原蛋白基质的100×放大电子显微镜图像。

图4显示本发明用于制备非重构型胶原蛋白基质的流程图。

图5显示本发明用于制备非重构型胶原蛋白基质的另一流程图。

图6A至6C显示通过本发明方法制备的非重构型胶原蛋白基质的电子显微镜图像。

图7A至7B显示本发明实施方案的生物支架的电子显微镜图像。

图7C显示以阿尔辛蓝染色指示的透明质酸在生物支架内部分布良好。

图8显示本发明实施方案的生物支架与常规技术的生物支架之间的剪切应力的比较图。

图9A与9B显示本发明的非重构型多孔胶原蛋白基质和常规技术的重构型多孔胶原蛋白基质的储能模量和耗损模量。

图10A是显示本发明的生物支架和通过常规方法制备的重构型多孔胶原蛋白-硫酸软骨素基质对于伤口愈合的比较图。

图10B是显示不同处理下伤口愈合的图。

图11是一组显微镜图像，显示术后28天时伤口愈合状况的比较。(A)正常皮肤对照，(B)PCHM组的愈合基质，(C)Integra组的愈合基质。

图12是显示本发明实施方案中用于制备生物支架的方法的流程图。

图13A至13B是显示根据本发明另一实施方案的生物支架的横截面示意图及其局部放大图。

图14A至14C是本发明实施方案中具有不同程度生物材料涂覆的生物支架的吸水能力的比较图。

图15A至15D显示了本发明实施方案中覆盖有不同抗菌材料的生物支架的抗菌效果。

具体实施方式

参考图1，本发明提供了非重构型材料生物支架1，其包括：主体10、生物材料层20，和组织粘合剂层30。主体10包括至少一种非重构型胶原蛋白基质10a。生物材料层20和组织粘合剂层30分别涂覆在主体的一个表面和主体的相邻或相对表面上。当上述生物支架通过组织粘合剂层粘附至组织2时，多个细胞被生物材料化学引诱并从组织粘合剂层向生物材料层移动，并进行组织2的重构。

参考图2，图2显示了本发明实施方案中生物支架的主体10的横截面示意图。如图所示，主体10优选地是非重构型胶原蛋白基质10a，并且该胶原蛋白基质10a由多个柱状胶原蛋白原纤维构成，并且包括由胶原蛋白原纤维构成的多个孔10b。生物材料10c涂覆在孔10b的内表面上。

参考图4，伤口敷料是由具有本发明的非重构型胶原蛋白基质的生物支架制备的，包括：首先，如步骤S100所示，在低于15℃的环境中提供动物组织或动物皮肤组织，如猪皮、牛皮或羊皮组织，通过磨具去除动物皮肤组织的皮下脂肪，并将组织切割为28±1cm×70±1cm的尺寸；接着，将动物皮肤组织进行脱毛，并刮除残留于其上的油脂和水分，再将每块皮肤组织切割成4片，每片的尺寸为13±1cm×34±1cm；然后，通过机器对猪皮的真皮层去皮以得到至少一个真皮层片，继而以纯水进行冲洗。最优选地，真皮层取自猪皮。

此外，如步骤S102所示，通过将真皮层片浸入含有高离子强度的盐溶液进行脱毛处理步骤，并且在添加蛋白水解酶后，加热该盐溶液至25-40℃。然后执行超声波震荡处理持续两小时。将磷酸盐缓冲溶液用作清洗溶液以在脱毛处理后净化真皮层片。含有高离子强度的盐溶液是阴离子和阳离子以离子键结合的盐溶液。含有高离子强度的盐溶液的离子强度大于0.15N。最优选地，含有高离子强度的盐溶液的离子强度在0.5N至10N之间。最优选地，含有高离子强度的盐溶液是含有氯化钠、硫酸铵或上述化合物的混合物的溶液。

在一个实施方案中，含有高离子强度的盐溶液是含有氯化钠的磷酸盐缓冲溶液。该高盐条件稳定了非重构型胶原蛋白基质的结构、不会使组织膨胀并挤入毛囊，使得酶可以顺利地进入毛囊进行反应。

在一个实施方案中，蛋白水解酶作用于含有高离子强度的盐溶液。最优选地，蛋白水解酶选自由以下组成的组：丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和上述酶的组合。最优选地，半胱氨酸蛋白酶选自由以下组成的组：木瓜的酶、菠萝的酶和上述酶的混合物。最优选地，金属蛋白酶是中性蛋白酶。

参考如下表1，当将真皮层片浸入木瓜酶(木瓜的酶)的磷酸盐缓冲溶液(含有～5mM或0.16％(w/w)的L-半胱氨酸，并且木瓜酶的浓度高于0.6mg/mL(B组、C组和D组))时，猪毛被完全去除。当将真皮层片浸入菠萝酶(菠萝的酶)的磷酸盐缓冲溶液时，并且当菠萝酶浓度为0.2mg/mL和0.6mg/mL(A组和B组)时，还有未脱落的猪毛。当菠萝酶的浓度为1.2mg/mL时，猪毛被完全去除。超过0.2U/mL的中性蛋白酶也可以完全去除猪毛囊。对于对照组(仅磷酸盐缓冲液)中的猪，所有猪毛未脱落。

表1.浸入含有木瓜酶、菠萝酶或中性蛋白酶的磷酸盐缓冲溶液中的真皮层片(A组-D组)

参考图4，如步骤S104所示，进行膨润处理步骤，在膨润处理步骤中将脱毛处理后的真皮层片浸入第一酸性溶液，并将第一酸性溶液加热至33-37℃同时进行超声波震荡处理。超声波震荡处理时间持续24小时，以使真皮层片的体积膨胀至少百分之五十。优选地，第一酸性溶液是弱酸溶液，弱酸溶液选自由以下组成的组：甲酸、羧酸、草酸、醋酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、硼酸、磷酸、盐酸及其混合物。最优选地，第一酸性溶液是醋酸溶液。

如步骤S105所示，进行清洗处理步骤以从真皮层片去除非胶原蛋白性材料并获得纯化的胶原蛋白基质。接着将纯化的胶原蛋白基质在-20℃和-80℃进行冷冻，并进行冷冻干燥或冻干过程以获得纯化的非重构型多孔胶原蛋白基质。

参考图5，图5显示了本发明的非重构型胶原蛋白基质的制备方法的另一实施方案，包括：如步骤S101a所示，进行任一步骤之前或之后的消毒处理，在消毒处理中用消毒溶液清洗所述片或真皮层片。最优选地，消毒溶液为过醋酸溶液。

如步骤S102a所示，本发明的制备方法还包括：脱毛处理步骤S102之前或之后的脱脂步骤。脱脂步骤是皂化处理、有机溶剂处理或它们的组合。皂化步骤是使所述片或真皮层片与碱性物质接触，并且如果只有一个表面具有油脂，则可以接触该一个特定表面。最优选地，碱性物质是呈颗粒状形式的强碱性颗粒。最优选地，强碱性颗粒是氢氧化钠颗粒。有机溶剂处理是醇处理、己烷处理或氯仿处理。然而，需要最佳量和处理时间段以防止基质中胶原蛋白的变性。

如步骤S104a所示，本发明的制备方法还包括：膨润处理步骤S104之后的去抗原处理步骤。最优选地，去抗原处理步骤是将所述片或真皮层片浸入含有胃蛋白酶的第二酸性溶液。将含有胃蛋白酶的第二酸性溶液加热至33℃至37℃之间。然后执行超声波震荡处理持续4小时。用纯水清洗掉残留在所述片或真皮层片上的溶液。在25℃用磷酸二氢钾再次处理所述片或真皮层片。优选地，第二酸性溶液是弱酸溶液，弱酸溶液选自由以下组成的组：甲酸、羧酸、草酸、醋酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、硼酸、磷酸、盐酸及其混合物。最优选地，第二酸性溶液是乙酸溶液。

如步骤S104b所示，本发明的制备方法还包括，膨润处理步骤之后的强化处理步骤，其中将多个所述片或真皮层片层压并浸入添加剂(优选交联剂溶液)。将交联剂溶液加热至33℃至37℃之间，并进行超声波震荡处理持续24小时以完成交联反应。用纯水冲洗掉所述片或真皮层片上的残留溶液。最优选地，交联剂的一个官能基团选自以下组成的组：胺、硫氢基、羰基、乙二醇、羟基、羧基、叠氮化合物、亚氨酸酯、环氧化物、醛、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、吡啶二硫醇、酰肼、光反应、碳二亚胺、双吖丙啶、氮丙啶、丙烯酰基、芳基化物、硫醇、栀子素、核黄素、类黄酮及其衍生物、羟甲基膦、异氰酸酯、马来酰亚胺、6-马来酰亚胺己酸活性酯、辛二酸二琥珀酰亚胺酯、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺)酯、N-羟基-琥珀酰亚胺酯(NHS-酯)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、五氟苯酯(PFP-酯)、乙二醇二缩水甘油醚、戊二醛、2,3-二溴丙酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、苯丁酸氮芥-N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺、补骨脂素、乙烯基砜和它们的组合。

参考图6A至6C，它们显示了根据上述方法制备的非重构型胶原蛋白基质的外观。图6A是本发明实施方案中的非重构型胶原蛋白基质的扫描电子显微镜的100×放大图像。图6B是本发明实施方案中的非重构型胶原蛋白基质的扫描电子显微镜的400×放大图像。图6C是本发明实施方案中的非重构型胶原蛋白基质的扫描电子显微镜的10000×放大图像。

与通过现有技术制备的多孔胶原蛋白基质(参见图3)相比，本发明制备的非重构型多孔胶原蛋白基由多个交错聚集的胶原蛋白原纤维束构成，并具有多个具有深度和槽壁的孔。上述胶原蛋白原纤维束由原胶原蛋白分子构成，并且直径小于100nm，但本发明并不意图受限于此。孔的外观是随机半径开口，并且孔径大小被控制在较窄范围。因此，由本文所述方法制备的胶原蛋白基质具有相对均匀的孔径。

请参考图7A至7C，它们显示了由根据上述方法制备的非重构型胶原蛋白基质制成的生物支架的外观。图7A是本发明实施方案中的生物支架的扫描电子显微镜的100×放大图像。图7B是本发明实施方案中的生物支架的扫描电子显微镜的400×放大图像。图7C是本发明实施方案中的透明质酸由CNBr预激活并且与非重构型胶原蛋白基质交联的生物支架的光学显微照片的图像。对组织学样本进行切片后，使用阿尔辛蓝染色支架内部的透明质酸衍生物的存在。图像表明透明质酸衍生物在生物支架内部分布良好。

参考图8，图8显示了根据本发明实施方案的非重构型多孔胶原蛋白基质(B线)与通过现有技术获得的常规多孔胶原蛋白基质(A线)的剪切应力测试。从结果可知，通过现有技术获得的多孔胶原蛋白基质的剪切应力在20℃的温度是63.56e-03MPa，而本发明的非重构型多孔胶原蛋白基质的剪切应力是189.07MPa。由此证明了，在相同测试条件下，本发明的非重构型多孔胶原蛋白基质的剪切强度比现有技术的多孔胶原蛋白基质的剪切强度高约3个数量级。由于可以在开始完全去除毛囊，因此非重构型多孔胶原蛋白基质在结构强度和张力方面确实优于常规多孔胶原蛋白基质。综上所述，本发明提供了用于制备非重构型多孔胶原蛋白基质的方法，该方法可以破坏毛囊组织而不破坏真皮层中胶原蛋白的天然交联，由此制备的多孔基质的结构强度高于现有技术制备的多孔基质的结构强度。

参考图9A和9B，它们显示了通过流速计监测的储能模量和损耗模量随振荡应变的变化而变化。储能模量是基质以弹性方式储存变形能量的能力的指标。这与交联程度直接相关，交联程度越高，储能模量越大。图9A是本发明的非重构型多孔胶原蛋白基质的数据，而图9B显示了常规重构型多孔胶原蛋白基质的数据。微观结构意味着材料中分子或粒子之间存在力。为了破坏微观结构，需要的力大于保持微观结构的力。当施加的力小于分子力或粒子间力时，G'大于G"；材料具有一定的储存能量的能力，并且应该能够在某种程度上恢复到施加机械力之前的初始构型。该材料表现为弹性固体，尽管不是理想的材料，因为会消耗一些机械能量。图9A和9B中的结果表明，非重构型多孔胶原蛋白基质的储能模量高于通过现有技术制备的重构型多孔胶原蛋白基质的储能模量。非重构型多孔胶原蛋白基质中的大多数天然交联被保留，而常规重构型多孔胶原蛋白基质中的大多数天然交联丢失。

此外，由于非重构型胶原蛋白基质10a本身不是亲水性材料，因此主体10可以还包括涂覆在胶原蛋白原纤维外表面上的亲水性生物材料10c。也就是，该些孔10b的内壁还涂覆有亲水性生物材料10c(如图2所示)以有利于细胞浸润至非重构型多孔胶原蛋白基质10a并继而在其内部移动和粘附/附着。优选地，上述生物材料可以是生长因子或糖胺聚糖，如透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)或乙酰肝素(Hep)。更优选地，亲水性生物材料10c是透明质酸，但本发明并不意图受限于此。

再参考图1，在本发明的优选实施方案中，涂覆在主体10的一个表面上的生长因子材料层20选自由以下组成的组：表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-I、IGF-II)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、集落刺激因子(CSF)、干细胞因子(SCF)、角质细胞生长因子(KGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、神经胶质源性神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNF)、内皮单核细胞活化多肽、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素、骨形态发生蛋白(BMP-1、BMP-2、BMP-3等)、脑源性神经营养因子(BDNF)、BRAK、血清素、血管性血友病因子(vWF)、转化生长因子(TGF-α、TGF-β)、白介素(IL-1、IL-2、IL-3等)、肿瘤坏死因子(TNF)和它们的组合。

此外，尽管用于临床医学和组织工程改造的组织粘合剂凭借其粘合性能可以实现控制药物释放、调节生物相容性材料分解或促进血管接合的效果。然而由于常规技术的组织粘合剂由诸如戊二醛(GA)、乙二醛、甲醛或三聚磷酸钠(TPP)的交联剂制成并与诸如明胶、壳聚糖或胶原蛋白(collagen)的载体材料交联，交联剂具有细胞毒性并且容易导致强烈持续性的免疫反应，使得组织粘合剂具有细胞毒性。

因此，在本发明中，使用具有较好结合强度且较低细胞毒性的组织粘合剂层30，其包含至少一种交联剂、至少一种基质成分和猝灭剂。交联剂是转谷氨酰胺酶或具有官能基团，并且基质成分用于与交联剂交联。猝灭剂用于与交联剂的官能基团反应以降低细胞毒性。

在优选实施方案中，上述交联剂是转谷氨酰胺酶，或者其官能基团的一个选自由含有以下的反应活性化合物组成的组：胺、硫氢基、羰基、乙二醇、羟基、羧基、叠氮化合物、亚氨酸酯、环氧化物、醛、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、吡啶二硫醇、酰肼、光反应、碳二亚胺、双吖丙啶、氮丙啶、丙烯酰基、芳基化物、硫醇、栀子素、核黄素、类黄酮及其衍生物、羟甲基膦、异氰酸酯、马来酰亚胺、6-马来酰亚胺己酸活性酯、辛二酸二琥珀酰亚胺酯、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺)酯、N-羟基-琥珀酰亚胺酯(NHS-酯)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、五氟苯酯(PFP-酯)、乙二醇二缩水甘油醚、戊二醛、2,3-二溴丙酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、苯丁酸氮芥-N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺、补骨脂素、乙烯基砜和它们的组合。

在优选实施方案中，基质成分选自由以下组成的组：胶原蛋白、透明质酸、明胶、丝素蛋白(silk fibroin)、纤连蛋白、弹性蛋白、腱生蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、硫酸乙酰肝素、软骨素、硫酸软骨素、角质素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、卡拉胶、肝素、甲壳素、壳聚糖、藻酸盐、聚集蛋白聚糖、琼脂糖、琼脂、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糖原、纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚氨基酸、合成聚合物(例如，丙烯酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸)、它们的衍生物和它们的组合。

更优选地，基质成分可以由任何天然产生的胶原蛋白或其官能变体和/或透明质酸制备。此外，已经显示透明质酸(特别是高分子量透明质酸(即大于5kDa))可以有效地促进血管生成并进而促进伤口愈合。例如，透明质酸的分子量可以是50kDa至5000kDa、70kDa至1500kDa、200kDa至1500kDa、500kDa至1500kDa或700kDa至1500kDa。当细胞在胶原蛋白或透明质酸的基质中生长时，细胞具有良好的存活能力。因此，在本发明中使用的组织粘合剂层30的基质成分中，透明质酸的浓度是0.001mg/mL至100mg/mL，胶原蛋白的浓度是0.001mg/mL至100mg/mL。优选地，胶原蛋白的浓度是0.1mg/mL至100mg/mL，透明质酸的浓度是0.01mg/mL至35mg/mL。更优选地，胶原蛋白的浓度是3mg/mL至75mg/mL(如6mg/mL或9mg/mL)，透明质酸的浓度是0.2mg/mL至20mg/mL。

在优选实施方案中，猝灭剂选自由以下组成的组：氨基酸、寡肽、多肽、蛋白质、胺、二胺、低聚胺、多聚胺、羰基化合物、乙二醇化合物、羧基化合物、二羧酸盐、低聚羧酸盐、多聚羧酸盐、硫氢基化合物、低聚硫氢基化合物、多聚硫氢基化合物、羟基化合物、低聚羟基化合物、多聚羟基化合物、糖、低聚糖、多聚糖、核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、寡核苷酸、叠氮化合物、光交联化合物、单官能基团或异双官能基团、和它们的组合。更优选地，本发明中使用的猝灭剂包括精胺、鱼精蛋白、1-6己二胺和聚赖氨酸，其具有不同分子量的不同基团。聚赖氨酸的平均分子量分别是3.4kDa、20kDa、99kDa、212kDa和225kDa。

图10A是显示出植入有

人工皮肤或PCMH的豚鼠的背部皮肤中的全厚度伤口的愈合的比较图。用作对照的

人工皮肤是通过脱水热交联的常规方法制备的重构型多孔胶原蛋白-硫酸软骨素基质。PCHM是本发明的生物支架，由非重构型多孔胶原蛋白基质和涂覆在基质的外表面和内表面上的透明质酸构成。PCHM的稳定多孔结构使真皮细胞比对照组的真皮细胞更好地浸润多达4倍。因此，用PCHM填充的伤口的愈合速度被证明比Integra组中的伤口的愈合速度快得多(约80％)。在术后第4个月，PCHM组的再生基质的组织学显示的愈合质量也比对照组好得多。

参考图11，在术后第28天，与正常皮肤相比，PCHM的生物支架在两周内降解，并且PCHM组的愈合基质基本上被新基质代替，如图11B指示的组织学。如图11C所示，观察到Integra人工皮肤的一些碎片，这些碎片干扰了伤口愈合的再生过程。

参考图12，如步骤S106至步骤S109所示，使非重构型胶原蛋白基质与含有生物材料的溶液接触，并将非重构型胶原蛋白基质提供在减压环境中。在一个实施方案中，将非重构型胶原蛋白基质的一端放置在含有至少一种生物材料的溶液中。在非重构型胶原蛋白基质的另一端建立减压环境使得生物材料可以被吸收至非重构型胶原蛋白基质的结构中以允许生物材料被均匀地涂覆在束状胶原蛋白原纤维的外表面和内表面(也可以认为被均匀地涂覆在孔的内壁)上，如步骤S108所示。必须说明的是，由于非重构型胶原蛋白基质的多孔直径极小，无法通过仅仅将非重构型胶原蛋白基质浸入溶液而避免空气残留。因此，在本发明中，利用虹吸原理间接去除空气，使得生物材料可以完全覆盖束状胶原蛋白原纤维的外表面(也可以认为孔的内壁)。此外，上述减压环境优选地通过抽真空作用进行。

上述生物材料选自由以下组成的组：细胞附着材料、组织修复材料、细胞诱导材料、生长因子材料、抗菌材料和它们的组合。优选地，上述细胞附着材料是糖、肽、蛋白质、磷脂或它们的组合。优选地，糖材料是糖胺聚糖材料。优选地，糖胺聚糖材料选自由以下组成的组：软骨素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、角质素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、卡拉胶、透明质酸和它们的组合。优选地，本发明中使用的生物材料选自由以下组成的组：胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖、壳聚糖、藻酸盐、聚谷氨酸(γ-PGA)、聚赖氨酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、丝蛋白(silk protein)和丝心蛋白(fibroin)，但本发明并不意图受限于此。

优选地，细胞诱导材料选自由以下组成的组：诸如维生素、矿物质、生长因子、化合物、药物、草药、代谢物、中间代谢物、糖、肽、蛋白质、磷脂或它们的组合的分子。

优选地，生长因子材料选自由以下组成的组：表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-I、IGF-II)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、集落刺激因子(CSF)、干细胞因子(SCF)、角质细胞生长因子(KGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、神经胶质源性神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNF)、内皮单核细胞活化肽、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素、骨形态发生蛋白(BMP-1、BMP-2、BMP-3等)、脑源性神经营养因子(BDNF)、BRAK、血清素、血管性血友病因子(vWF)、转化生长因子(TGF-α、TGF-β)、白介素(IL-1、IL-2、IL-3等)、肿瘤坏死因子(TNF)和它们的组合。

优选地，抗菌材料是抗生素、抗微生物蛋白质、抗微生物肽或它们的组合。

对于非重构型胶原蛋白基质的详细结构请参考图2，图2是根据本发明实施方案的生物支架的横截面示意图。如上所示，非重构型胶原蛋白基质10a由多个包括多个孔10b的束状胶原蛋白原纤维构成。生物材料10c通过虹吸原理被吸收至非重构型胶原蛋白基质10a中并且被涂覆在束状胶原蛋白原纤维的外表面。也就是，孔10b的内壁全部涂覆有生物材料10c，这更有利于细胞进入孔并粘附至生物材料以用于后续应用。

在本发明的优选实施方案中，尽管图2未示出，在将生物材料涂覆在束状胶原蛋白原纤维的外表面上后，可以将细胞引入生物支架。将细胞培养基或含有细胞的溶液注入孔10b，以使细胞进入非重构型胶原蛋白基质的孔。也就是，在本发明的优选实施方案中，本发明提供的生物支架还包括细胞，如图13A所示。参考图13B，图13B是图13A中虚线圆圈的局部放大图，其中细胞30附着至孔10b中的生物材料10c。优选地，细胞可以是干细胞、卫星细胞、前体细胞、祖细胞或组织细胞，且组织细胞可以进一步包括皮肤组织、软骨组织或脂肪组织等等。

以下表2显示了无生物材料的非重构型胶原蛋白基质与具有生物材料的非重构型胶原蛋白基质在不同视野下的附着细胞的数量的比较。由表2可知，非重构型胶原蛋白基质本身是疏水性材料，其不利于细胞贴附附着至孔中。然而，当本发明还用细胞附着材料涂覆非重构型胶原蛋白基质的表面时，显示出有利于后续细胞进入这些孔并附着至生物支架。

表2

接着，进一步比较无生物材料的非重构型胶原蛋白基质(A1)、涂覆(1次)有透明质酸的非重构型胶原蛋白基质(A2)和涂覆(5次)有透明质酸的非重构型胶原蛋白基质(A3)的吸水性。参见图14A至图14C。这三个图分别显示A1、A2和A3的吸水状况。因此，证明了涂覆有越多层的生物材料的非重构型胶原蛋白基质具有越好的吸水能力。

确认了本发明提供的用于伤口敷料中使用的生物支架的效果。参见图10B和图11。图10B比较了不同生物支架的伤口治愈时间，图11比较了不同生物支架的伤口治愈状况。

首先，图10B显示了对伤口的不同处理，其被分为A、B、C、D和E组以观察伤口面积与愈合时间的关系。其中，初始伤口面积是100％，每隔两天测量一次伤口面积直至伤口完全愈合。A代表未处理的伤口，B代表用多孔胶原蛋白基质(PCM)处理的伤口，C代表用CNBr活化的透明质酸(aH)与多孔胶原蛋白基质(PCM-aH)联合处理的伤口，D代表用具有额外5mg/mL透明质酸的PCM-aH处理的伤口，E代表用

人工皮肤处理的伤口。如图所示，B组、C组与D组的伤口都在30天左右愈合，但用人工皮肤处理的伤口(E组)花费44天愈合。尽管A组愈合略快，但显示出伤口收缩和其它状况。

如图10B所示，12天后，C组(用PCM-aH处理的伤口)的纤维母细胞增殖状况确实超过E组(用人工皮肤处理的伤口)的纤维母细胞增殖状况。由此证明，上述结合生物材料的主体10可以有效地促进细胞增殖而不引起伤口收缩，而且相比于常规技术的人工皮肤，可使伤口更快速地愈合。

接着，在另一实施方案中，如图15A-15D所示，生物支架涂覆有不同抗菌材料，例如图15A和15B中涂覆有抗微生物肽培西加南(Pexiganan)与图15C和15D中涂覆有新霉素(Neomycin)。结果显示，抗菌效果呈浓度依赖性，并且涂覆有抗菌材料的生物支架具有良好抗菌效果。

综上所述，本发明的目的是提供可以用于伤口敷料的生物支架。在一个实施方案中，主体的一侧涂覆有生物材料层，而另一侧涂覆有组织粘合剂层，其可使细胞基于浓度梯度的作用在主体内移动。此外，由于主体含有亲水性生物材料，它还可以有助于细胞的移动与附着。因此，除了有效地阻挡外来细菌侵袭以防止伤口感染外，本发明提供的生物支架还可以用于加快细胞生长并促进伤口愈合速度。

此外，尽管常规技术中已知将切碎的胶原蛋白添加至生物材料(例如透明质酸)并继而使它们交联以凝结成结构，但是由于胶原蛋白和生物材料相互交织，生物支架的外部不是完全亲水性的。此外，如果首先制备好重构型胶原蛋白支架(如图3所示)，然后进行本发明提供的方法，则重构型胶原蛋白基质的支撑力将不足(参见图9和以上相关描述)以承受抽真空步骤施加的外部压力，抽真空步骤是后续用生物材料涂覆支架时所需的。如上所述，应用虹吸原理使得生物材料可以被完全吸收或引入至非重构型胶原蛋白基质中并均匀涂覆表面，使得生物支架的表面有利于进行细胞浸润和附着。该生物支架可以广泛地应用于外科手术、人体器官和组织的修复、再生医学、皮肤移植或美容医疗，并且还可以用于外科修复网状织物、牙科修复网状织物、人类皮肤替代物、人工脑膜替代物、骨科修复替代物或伤口敷料替代物。

上列详细说描述是本发明某些可行实施方案的具体说明，但是这些实施方案并不意图限制本发明的专利范围。任何未脱离本发明技术精神的等同实施或改变都应包括在本发明的专利范围内。本文引用的所有出版物通过参考以其整体并入本文。

【符号说明】

1 生物支架

10 主体

10a 非重构型胶原蛋白基质

10b 孔

10c 生物材料

20 生物材料层

30 组织粘合剂层

2 组织

S100～S105 用于制备非重构型胶原蛋白基质的方法

S100～S104b 用于制备非重构型胶原蛋白基质的方法

S106～S109 生物支架的制备

Claims (38)

1.一种生物支架，包括：

主体，包括非重构型胶原蛋白基质，其中所述非重构型胶原蛋白基质含有多个交织重叠的束状胶原蛋白原纤维和由所述束状胶原蛋白原纤维形成的多个孔；和

生物材料，涂覆所述主体的第一外表面和所述多个孔的内部。

2.如权利要求1所述的生物支架，其中所述生物材料选自由以下组成的组：细胞附着材料、组织修复材料、细胞诱导材料、生长因子材料、抗菌材料和它们的组合。

3.如权利要求2所述的生物支架，其中所述抗菌材料是抗生素、抗微生物蛋白质、抗微生物肽或它们的组合。

4.如权利要求2至3所述的生物支架，其中所述细胞附着材料是糖、肽、蛋白质、磷脂或它们的组合。

5.如权利要求2至4所述的生物支架，其中糖材料是糖胺聚糖材料。

6.如权利要求2至5所述的生物支架，其中所述糖胺聚糖材料选自由以下组成的组：软骨素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、角质素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、卡拉胶、透明质酸和它们的组合。

7.如权利要求2至6所述的生物支架，其中所述生长因子材料选自由以下组成的组：表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-I、IGF-II)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、集落刺激因子(CSF)、干细胞因子(SCF)、角质细胞生长因子(KGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、神经胶质源性神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNF)、内皮单核细胞活化多肽、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、骨形态发生蛋白(BMP-1、BMP-2、BMP-3等)、脑源性神经营养因子(BDNF)、BRAK、血清素、血管性血友病因子(vWF)、转化生长因子(TGF-α、TGF-β)、白介素(IL-1、IL-2、IL-3等)、肿瘤坏死因子(TNF)和它们的组合。

8.如权利要求2-7所述的生物材料，其中所述细胞诱导材料选自由以下组成的组：维生素、矿物质、化合物、药物、草药、代谢物、中间代谢物、糖、肽、蛋白质、磷脂和它们的组合。

9.如权利要求2-8所述的生物支架，其中所述组织修复材料是生物材料、细胞外基质、营养物或它们的组合。

10.如权利要求2-9所述的生物支架，其中所述生物材料是胶原蛋白、明胶、透明质酸、弹性蛋白、糖胺聚糖、壳聚糖、藻酸盐、聚谷氨酸(γ-PGA)、聚赖氨酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、丝素蛋白、聚氨基酸、纤维素及其衍生物、或它们的组合。

11.如权利要求2-10所述的生物支架，其中所述细胞外基质选自由以下组成的组：胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、糖蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、聚集蛋白聚糖、金属蛋白酶和它们的组合。

12.如权利要求2-11所述的生物支架，其中所述营养物选自由以下组成的组：维生素、矿物质、蛋白质、脂质、碳水化合物、氨基酸、肽、核苷酸、脱氧核苷酸、草药和它们的组合。

13.如权利要求1至12所述的生物支架，还包括所述主体中的所述多个孔中的细胞。

14.如权利要求1至13所述的生物支架，其中所述细胞是干细胞、卫星细胞、祖细胞、前体细胞或组织细胞。

15.如权利要求1-14中任一项所述的生物支架，其中所述生物材料基本上涂覆所述主体的整个表面和内部。

16.如权利要求1-15中任一项所述的生物支架，还包括涂覆在所述主体的第二表面上的组织粘合剂层。

17.如权利要求1至16所述的生物支架，其中所述组织粘合剂层包含：

交联剂，所述交联剂具有官能基团或双官能基团；

至少的基质分子，所述基质分子与所述交联剂交联；和

猝灭剂，所述猝灭剂用于与未与所述基质分子反应的所述交联剂的任何过量官能基团或双官能基团反应。

18.如权利要求1至17所述的生物支架，其中所述交联剂的一个官能基团选自由以下组成的组：胺、硫氢基、羰基、乙二醇、羟基、羧基、叠氮化合物、亚氨酸酯、环氧化物、醛、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、吡啶二硫醇、酰肼、光反应、碳二亚胺、双吖丙啶、氮丙啶、丙烯酰基、芳基化物、硫醇、栀子素、核黄素、类黄酮及其衍生物、羟甲基膦、异氰酸酯、马来酰亚胺、6-马来酰亚胺己酸活性酯、辛二酸二琥珀酰亚胺酯、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺)酯、N-羟基-琥珀酰亚胺酯(NHS-酯)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、五氟苯酯(PFP-酯)、乙二醇二缩水甘油醚、戊二醛、2,3-二溴丙酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、苯丁酸氮芥-N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺、补骨脂素、乙烯基砜和它们的组合。

19.如权利要求1至18所述的生物支架，其中所述基质分子选自由以下组成的组：胶原蛋白、透明质酸、明胶、丝蛋白、丝心蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、腱生蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、硫酸乙酰肝素、软骨素、硫酸软骨素、角质素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、卡拉胶、肝素、甲壳素、壳聚糖、藻酸盐、聚集蛋白聚糖、琼脂糖、琼脂、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糖原、纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚氨基酸、合成聚合物(例如，丙烯酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸)、它们的衍生物和它们的组合。

20.如权利要求1至19所述的生物支架，其中所述基质分子是所述主体中的胶原蛋白。

21.如权利要求1至20所述的生物支架，其中所述猝灭剂选自由以下组成的组：氨基酸、寡肽、多肽、蛋白质、胺、二胺、低聚胺、多聚胺、羰基化合物、乙二醇化合物、羧基化合物、二羧酸盐、低聚羧酸盐、多聚羧酸盐、硫氢基化合物、低聚硫氢基化合物、多聚硫氢基化合物、羟基化合物、低聚羟基化合物、多聚羟基化合物、糖、低聚糖、多聚糖、核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、寡核苷酸、叠氮化合物、光交联化合物单官能基团或异双官能基团、和它们的组合。

22.如权利要求1至21所述的生物支架，其中所述非重构型胶原蛋白基质是通过包括以下的程序制备的：

获得结缔组织的层片；

执行脱毛步骤，所述脱毛步骤包括将所述层片浸入高离子强度盐溶液，然后向所述盐溶液添加蛋白水解酶，由此产生脱毛的层片；和

执行膨润步骤，所述膨润步骤包括将所述脱毛的层片浸入第一酸性溶液足够时间段以使所述脱毛的层片形成膨润的层片，由此形成所述非重构型胶原蛋白基质。

23.如权利要求1至22所述的生物支架，其中所述层片是从动物皮肤组织获得的真皮层片。

24.一种制备非重构型胶原蛋白基质的方法，包括：

从动物皮肤组织获得真皮层片；

执行脱毛步骤，所述脱毛步骤包括将所述真皮层片浸入高离子强度盐溶液，然后向所述盐溶液添加蛋白水解酶，由此产生脱毛的真皮层片；和

执行膨润步骤，所述膨润步骤包括将所述脱毛的真皮层片浸入第一酸性溶液足够时间段以使所述脱毛的真皮层片形成膨润的真皮片层，由此形成所述非重构型胶原蛋白基质，所述非重构型胶原蛋白基质具有多个交织重叠的束状胶原蛋白原纤维和由所述束状胶原蛋白原纤维形成的多个孔。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述盐溶液的离子强度大于0.15N。

26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述离子强度在0.5N至10N之间。

27.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述盐溶液是含有氯化钠、硫酸铵或其混合物的磷酸盐溶液。

28.如权利要求24-27中任一项所述的方法，其中所述蛋白水解酶选自由以下组成的组：丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、和它们的混合物。

29.如权利要求24-28中任一项所述的方法，还包括消毒步骤。

30.如权利要求24-29中任一项所述的方法，还包括所述脱毛步骤之前或之后的脱脂步骤。

31.如权利要求24-30中任一项所述的方法，还包括所述膨润步骤之后的去抗原步骤，所述去抗原步骤包括将所述非重构型胶原蛋白基质浸入含有胃蛋白酶的第二酸性溶液。

32.如权利要求24-31中任一项所述的方法，还包括所述膨润步骤之后的强化步骤，所述强化步骤包括将所述膨润的真皮片层浸入添加剂。

33.一种制备生物支架的方法，包括：

提供通过权利要求24-31中任一项所述的方法制备的非重构型胶原蛋白基质；

在减压环境下使所述非重构型胶原蛋白基质与含有生物材料的溶液接触，由此使所述生物材料涂覆在所述非重构型胶原蛋白基质的第一外表面和多个孔的内部。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述减压环境通过抽真空作用提供。

35.如权利要求33或34所述的方法，还包括：

将细胞培养基注入所述非重构型胶原蛋白基质中的所述多个孔；和

将细胞注入所述多个孔以使所述细胞附着至所述生物材料。

36.如权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述生物材料选自由以下组成的组：细胞附着材料、组织修复材料、细胞诱导材料、生长因子材料、抗菌材料、和它们的组合。

37.如权利要求33-36中任一项所述的方法，其中使所述非重构型胶原蛋白基质的所述第一外表面与所述含有生物材料的溶液接触，还包括用组织粘合剂层涂覆所述非重构型胶原蛋白的第二外表面。

38.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中所述组织粘合剂层包含：

交联剂，所述交联剂具有官能基团或双官能基团；

至少的基质分子，所述基质分子与所述交联剂交联；和

猝灭剂，所述猝灭剂用于与未与所述基质分子反应的所述交联剂的任何过量官能基团或双官能基团反应。

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