TW202041232A - 生物支架及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種生物支架及其製備方法，其至少包含一本體、一生物材料與一組織膠黏層。其中，本體至少包含一非重組型膠原蛋白基質。生物材料與組織膠黏層係分別塗佈於本體之一表面與相對之一另一表面。當上述非重組型材料支架藉由組織膠黏層貼附於一組織上時，複數個細胞由組織膠黏層往生物材料層移動，而進行此組織之重建。

Description

生物支架及其製備方法
本發明係提供一種生物支架及其製備方法，其至少包含一非重組型膠原蛋白基質、至少一生物材料與可選擇之一組織膠黏層。特別是此非重組型膠原蛋白基質及其構成之生物支架有助於促進傷口癒合而可作為敷料之用。
組織工程學，是指利用合成的或生物活性的物質，通過體外培養或構建的技術重組或修復器官及組織。組織工程學涉及到生物學、材料學和工程學等多學科，目前已經能夠再造骨、軟骨、皮膚、腎、肝、消化道、角膜、肌肉、乳房等組織器官。組織工程學的另一作法也稱為再生醫學，包含以下步驟：首先，由人體取出細胞，在體外將細胞培養至足夠的數量；接著，將細胞填入及養在人工支架裡；有時，甚至需要再加一些化學物或生物因子以促進細胞分化；最後將此人工組織移植到患者身上。因此，組織工程的三要素即為細胞、生物支架與生長因子。
其中，構成人體最基本的結構和功能的單位，就是細胞。存在於細胞與細胞之間的則是細胞外間質，細胞外間質是由細胞本身所產生的，其為一種包括結構性成分的物質如蛋白質細纖維/束(如膠原蛋白)、結晶性的無機礦物等。
眾多形態相似及功能相近的細胞，經由細胞外間質組合成的群體就叫做組織。其中，依照細胞種類的不同而分為不同的組織，如上皮組織、結締組織、肌肉組織和神經組織等。其中，結締組織是由大量的細胞外間質與散落在其中的細胞所組成，細胞外間質包含基質、細纖維和組織液等，而膠原蛋白正是動物結締組織中最主要的結構性蛋白質，同時亦為細胞外間質裡最重要的成分。在動物的結締組織中，一般除了含有大約60~70%的水分之外，還包含了約20~30%的膠原蛋白，也因此膠原蛋白是廣泛存在於動物體內的一種蛋白質， 而結締組織在人體內的分布廣泛，幾乎遍佈所有器官。
膠原蛋白主要以不溶性細纖維的形式存在於人體組織中，約占蛋白質的33%，換言之，膠原蛋白就占了人體內蛋白質的三分之一，主要皆分布在結締組織中，是結締組織中非常重要的一種結構性蛋白質，它扮演著有如「床墊」及「水泥」的角色，能保護並且連結各種組織支撐起人體的結構。也因此，膠原蛋白係常用來做為生物彌補物的材料。
承上所述，膠原蛋白最基本的單元體為膠原蛋白原，是由三條多胜肽(polypeptides)鏈所組成的分子。而三條多胜肽鏈則以分子間的氫鍵平行且緊密地結合在一起，形成穩定的三股螺旋結構，該三股螺旋鏈之膠原蛋白單元體，稱為膠原蛋白原(tropocollagen)，直徑約為1.5nm，長度約為280nm，在生理狀態下，多個膠原蛋白原分子會以前後約67nm之距離排列，自我聚合聚集成膠原蛋白微纖維結構(microfibril)，每條膠原蛋白微纖維再與側邊及前後之微纖維，可聚集成較大的細纖維束，粗細不等，一般約50nm上下，而在體內此細纖維會堆聚成不同的四級結構，可能形成網狀交織纖維(reticular fibers)，如表皮細胞下面之基質。此細纖維亦可能進一步聚合成粗纖維，如同韌帶及肌腱等含有規則排列且單一方向之膠原蛋白纖維。
到目前為止，已發現的動物膠原蛋白種類可分成至少28種型，依著組織的不同而有不同型的膠原蛋白存在，除了透明軟骨組織中主要為第二型之膠原蛋白，大部分之結締組織主要為第一型膠原蛋白的含量最多，約占全部膠原蛋白含量的90%，也是用途最廣的膠原蛋白，其主要之結構性蛋白質，賦予結締組織所需的支持、保護及各種機械性質，如張力、拉力、強度、黏彈性等。而在生化性質方面，它可促使血小板凝集而催化血塊的形成，另外膠原蛋白的功用包括可控制分子通透、促進傷口癒合與組織修復、調控細胞與組織的生理功能等等。
習知膠原蛋白基質的製備方法，如中華民國發明專利第476642號「多孔狀膠原蛋白基質之製備方法」，其方法係將膠原蛋白製備成中性膠原蛋白溶液，靜置於30至45℃下一段時間進行膠原蛋白細纖維重組得到膠原蛋白膠狀基質，再將該膠原蛋白膠狀基質進行冷凍減壓乾燥以得到多孔狀之膠原蛋白基質。如第3圖所示習知一多孔狀膠原蛋白基質之電子顯微鏡放大一百倍率圖，其外觀結構係以呈現鬆散且不規則薄片狀外觀所構成之結構，並無法提供較佳之張力 以及抗細胞收縮性，後者用以適合細胞的移入、增生等等是必須的。再者，由於此膠原蛋白基質的表面特性，不利於細胞進入。
另一美國發明專利US5997895號「Dural/meningeal repair product using collagen matrix」，其係提供一種修補及促進腦膜組織生長之方法，其提供一種已驗證生物相容的膠原蛋白來源，且無致病性病毒殘留，一交聯反應被應用於該膠原蛋白基質以形成多孔性膠原蛋白結構，其孔洞直徑為10-500微米，可讓受損腦膜組織修復及促進腦膜組織生長。然而，在上述習知技術中，膠原蛋白可能取自於動物真皮層，例如豬皮等，但當在處理豬皮的過程中未將毛囊去除乾淨時，反而會破壞後續製備膠原蛋白基質的整體結構，並影響製成的膠原蛋白基質的純度，導致臨床使用時病人容易產生細菌感染及免疫反應或造成免疫排斥性等。
另一台灣發明專利號098125217「高純度膠原蛋白之製備」，其係提供一種膠原蛋白製備方法，其包含：提供一結締組織，其表面積為20平方公釐至2平方公尺；以一第一酸液使該結締組織之體積至少膨脹百分之五十而形成一膨潤的結締組織，其中該酸液之酸鹼值為1至6且該酸液實質上不包含鹽類；清洗該膨潤結締組織以除去非膠原蛋白物質藉此形成一膠原蛋白基質；以及利用一萃取液從該膠原蛋白基質萃取出膠原蛋白，藉此製造一含有膠原蛋白之溶液。然而，在上述習知技術中為膠原蛋白之溶液，非多孔狀之膠原蛋白基質，無法提供較佳之細胞張力以及抗收縮性，這是用以適合之細胞的移入、增生等所必需的。
另一美國發明專利公告號US8067149B2「Acellular dermal matrix and method of use thereof for grafting」，其係提供一種方法提取acellular tissue matrix，該方法包括去除毛囊及利用介面活性劑SDS提取。然而其提取的是無細胞組織基質(acellular tissue matrix)，與本發明具孔洞性及高純度的膠原蛋白不一樣。
目前的生物支架的常見種類如下。
目前市面上的生物支架大多為重組型的膠原蛋白基質所製成，相關產品已揭示於許多先前之專利中，例如美國專利第4,193,813號中，係先將膠原蛋白溶於醋酸中，以戊二醛交聯後置於低溫長時間冷凍(例如20小時)，經解凍後以機械方式去水而成海綿狀基質，此方法所得的基質孔徑約為80-1400微米。美國專利第4,412,947號係將高純度的不可溶膠原蛋白顆粒懸浮於醋酸溶液中， 以約每分鐘0.3至0.4℃之降溫速率進行冷凍至-65℃，經冷凍乾燥後製成多孔狀薄片基質。美國專利第4,522,753號係將膠原蛋白與硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)混合到共聚物中，經戊二醛交聯並冷凍乾燥後得孔徑約20~180微米之多孔狀基質，其可作為人工皮膚之基材。美國專利第4,970,298號則揭示將酸可溶膠原蛋白溶液或酸可溶膠原蛋白與透明質酸、纖維連結蛋白(fibronectin)等混合之溶液，以碳亞胺酸及高溫去水法交聯基質，經不同溫度之冷凍後進行冷凍乾燥製成多孔狀基質，其使用之冷凍溫度為-30至-50℃，所得之基質孔徑約為50~250微米；而含透明質酸或纖維連結蛋白之膠原蛋白基質則具有100~150微米之孔徑。上述專利所揭示製備膠原蛋白基質之方法，主要採用酸性或鹼性膠原蛋白以高溫或化學交聯劑進行交聯，並採用冷凍乾燥法進行孔洞之製造而得到多孔狀基質。由這些方法所製得之基質，其孔洞均勻性不佳，且孔徑之控制上十分困難，更由於所使用之化學交聯劑大都具有毒性，其重組之膠原蛋白微纖維或細纖維，賦予基質有限的支持、保護及各種機械性質，如張力、拉力、強度、黏彈性等，並且於臨床應用上並不十分理想。
非重組型的膠原蛋白基質在臨床應用上具有較高的產業價值，而非重組型的膠原蛋白製程為由發明人先前所申請的美國專利8,198,408號「Method for preparing porous collagen matrices」揭露其製程。
而習知在膠原蛋白基質製備方法中，在先前技藝中所使用的方法，如中華民國發明專利476642號「多孔狀膠原蛋白基質之製備方法」，其方法係將膠原蛋白製備成中性膠原蛋白溶液，靜置於30至45℃下一段時間進行膠原蛋白微纖維重組得到膠原蛋白膠狀基質，再將該膠原蛋白膠狀基質以適當降溫速率於適當低溫冷凍後，進行冷凍減壓乾燥以得到多孔狀之膠原蛋白基質。另一中華民國發明專利I284665號「一種結締組織製備多孔狀膠原蛋白基質之方法」，其包括一實質上為原位處理之結締組織，將該結締組織經多孔狀處理步驟及清洗步驟，係將該多孔狀處理步驟後的結締組織中雜質和非膠原蛋白部分清除，以得到具多孔狀性質之膠原蛋白基質，其原位處理省略習知將結締組織進行切碎或絞碎，且製程步驟亦不需要使用交聯劑的程序，所以此膠原蛋白基質製備方法較習知製備之方法省略2至3道手續，但也並未針對孔洞結構與其承載應力及張力加以敘述。
按，一般人體之表面若有傷口時，會利用紗布、繃帶、貼布或醫療用 膠帶...等之外敷物，加以敷蓋、包覆於傷口上，以避免傷口受到外部細菌之感染。惟，上述之外敷物僅能單純地阻絕外部細菌，對傷口本身而言，並無任何直接之幫助。
綜上所述，為解決避免傷口受到外部細菌之感染，以及獲得具孔洞性及高純度的膠原蛋白，本發明提供一種用於傷口敷料之非重組型膠原蛋白基質作為生物支架。
有鑑於此，本發明提供一種生物支架，其至少包含一非重組型膠原蛋白基質與至少一生物材料，此生物材料在減壓條件下均勻的包覆於該非重組型膠原蛋白基質之至少一表面或內外表面。同時，上述非重組型膠原蛋白基質和生物支架的製備方法亦揭露於本發明中，其相較於傳統膠原蛋白基質具有更高強度的結構。再者，本發明所提供之生物支架由於其表面可均勻地塗佈一生物材料層，將有利於細胞移入此非重組膠原蛋白基質結構內，且此非重組之膠原蛋白基質在不破壞真皮層膠原蛋白主要結構的條件下，破壞毛囊組織，進而製備出結構強度較習知技術提升之膠原蛋白基質，亦降低毛囊引起的免疫反應及幫助細胞生長，而使得此種生物支架更適合進一步應用於外科手術、人體器官組織的修復、再生醫學、皮膚移植或美容醫療，也可用於外科修補用網狀織物、牙科修補用網狀織物、人類皮膚替代物、人工腦膜替代物、骨科修補用替代物或創傷被敷材替代物。
本發明所提供之生物支架其至少包含一非重組型膠原蛋白基質與至少一生物材料。其中，非重組型膠原蛋白基質係具有複數條束狀膠原蛋白細纖維以及由該些束狀膠原蛋白細纖維構成之複數個槽孔。而生物材料則是包覆於該些束狀膠原蛋白細纖維之外表面。由於複數個槽孔是由複數條束狀膠原蛋白細纖維形成的，即膠原蛋白細纖維形成了槽孔的內壁，因此塗覆膠原蛋白細纖維的表面可以等同於塗覆槽孔之內壁。
一種製備本發明生物支架的方法，包括：提供一動物皮膚組織，由該動物皮膚組織取得一真皮層薄片；一去毛囊處理步驟，係將該真皮層薄片浸漬於一含有高離子強度之鹽類溶液中，並加入一蛋白分解酵素；一膨潤處理步驟，係將去毛囊處理後之該真皮層薄片浸漬於一第一酸性溶液中足夠時間，以 形成一膨潤真皮層片，清洗去除不純物後獲得非重組膠原蛋白基質，該非重組型膠原蛋白基質係具有複數條束狀膠原蛋白細纖維以及由該些束狀膠原蛋白細纖維構成之複數個槽孔。
可選擇地，本發明之製備方法於進行任一步驟之前或之後更進一步包含一消毒處理步驟、脫脂步驟、去抗原處理步驟、和/或強化處理步驟。
一種用於製備生物支架的方法包括：提供一非重組的膠原蛋白基質，在低壓環境下使非重組的膠原蛋白基質與包含生物材料的溶液接觸，使得生物材料塗覆在非重組膠原蛋白基質的第一外表面和多個孔的內表面。
綜上所述，本發明之製備方法於進行任一步驟之前或之後更進一步包含一消毒處理步驟，係以一消毒溶液清洗該真皮層薄片。最佳地，該消毒溶液為一過醋酸溶液。
在本發明一實施例中，本發明所提供之製備方法更包含下列步驟：首先，取出包覆有該生物材料之非重組型膠原蛋白基質；接著，注入一細胞培養基於該些槽孔；接著，注入一包含有一細胞之溶液，以使該細胞進入槽孔並貼附於該生物材料上。較佳地，上述細胞可為幹細胞、衛星細胞、前驅細胞或組織細胞。
本發明所述之一種非重組膠原蛋白基質的製備方法之一實施例中，其中該動物皮膚組織為一豬皮、牛皮或羊皮組織。
本發明所述之一種非重組膠原蛋白基質的製備方法之一實施例中，其中該含有高離子強度之鹽類溶液是由陰離子和陽離子以離子鍵結合的鹽類溶液。較佳地，該含有高離子強度之鹽類溶液的離子強度係大於0.15N。最佳地，該含有高離子強度之鹽類溶液的離子強度係介於0.5N-10N。最佳地，該含有高離子強度之鹽類溶液為一含有氯化鈉、硫酸銨鹽和上述化合物之混合物所組成的溶液，此高鹽條件可以穩定非重組型膠原蛋白基質的結構，不會使其膨脹後擠壓到毛囊，使得酵素可以順利進入毛囊進行反應。
本發明所述之一種非重組膠原蛋白基質的製備方法之一實施例中，其中該蛋白分解酵素可作用於該含有高離子強度之鹽類溶液。較佳地，該蛋白分解酵素係選自由絲胺酸酶(serine proteases)、蘇胺酸酶(threonine proteases)、半胱胺酸酶(cysteine proteases)、天門冬胺酸酶(aspartate proteases)、谷胺酸酶(glutamate proteases)、含金屬蛋白酶(metalloproteases)和上述酵素之混合物所組成之群組。最佳地，該半胱胺酸酶係選自由木瓜酵素、鳳梨酵素和上述物質之混合物所組成之群組。最佳地，該含金屬蛋白酶係為中性蛋白酶(dispase)。
本發明所述之一種非重組膠原蛋白基質的製備方法之一實施例中，其中於進行該去毛囊處理步驟之前或之後更包含一去油脂步驟。該去油脂步驟係為一皂化處理、一有機溶劑處理或上述之組合。該皂化處理步驟，係以一鹼性物質接觸該真皮層薄片之一表面。較佳地，該鹼性物質為顆粒狀，並且為一強鹼顆粒。最佳地，該強鹼顆粒為一氫氧化鈉顆粒。該有機溶劑處理係為酒精處理、己烷(hexane)處理或氯仿(chloroform)處理。
本發明所述一種非重組膠原蛋白基質的製備方法之一實施例中，其中於該去毛囊處理步驟或之後的任一步驟更包含進行一震盪或一攪拌步驟。較佳地，該震盪或該攪拌步驟係為超音波震盪處理。
本發明所述一種非重組膠原蛋白基質的製備方法之一實施例中，其中於該去毛囊處理步驟或之後的任一步驟更包含進行一加熱處理。最佳地，該加熱處理為加熱至25℃至40℃。
本發明所述一種非重組膠原蛋白基質的製備方法之一實施例中，其中於進行該去毛囊處理步驟後的任一步驟更包含一清洗處理步驟，係將該真皮層薄片浸漬於一清洗溶液中或是通入一消毒氣體。較佳地，該清洗溶液為磷酸鹽溶液或水溶液。較佳地，該消毒氣體為臭氧。
本發明所述一種非重組膠原蛋白基質的製備方法之一實施例中，其中該第一酸性溶液為一弱酸溶液。
本發明所述一種非重組膠原蛋白基質的製備方法之一實施例中，其中於該膨潤處理步驟後更包含一去抗原處理步驟。該去抗原處理步驟係將該真皮層薄片浸漬於一第二酸性溶液中，該第二酸性溶液含有一胃蛋白酶。最佳地，該第二酸性溶液為一弱酸溶液。
本發明所述一種非重組膠原蛋白基質的製備方法之一實施例中，其中於該膨潤處理步驟後更包含一強化處理步驟，係將該真皮層薄片浸漬於一添加劑中。較佳地，該添加劑為一交聯劑溶液。
在本發明一實施例中，該交聯劑溶液係由轉谷氨酰胺酶或通過所述官 能基起作用，其中所述交聯劑的一個官能基係選自胺基(amine)、硫氫基(sulfhydryl)、羰基(carbonyl)、乙二醇基(glycol)、羧基(carboxyl)、疊氮(azide)、亞胺酯(imidoester)、環氧基(epoxide)、醛基(aldehyde)、鹵代乙酰基(haloacetyl)、吡啶二硫化物(pyridyl disulfide)、吡啶二硫代(pyridyldithiol)、醯胼(hydrazide)、光反應基團(photo-reacting group)、碳二醯亞胺(carbodiimide)、雙吖丙啶(diazirine)、氮丙環(aziridine)、丙烯酰基(acryloyl)、芳基(arylate)、硫醇基(thiol)、梔子素(genipin)、核黃素(riboflavin)、類黃酮(flavonoid)及其衍生物、羥甲基膦(hydroxymethyl phosphine)、異氰酸酯類(isocyanate)、馬來亞醯胺(maleimide)、6-(馬來醯亞胺基)己酸活性酯(6-maleimidohexanoic acid active ester)、雙琥珀亞胺醯辛二酸酯[disuccinimidyl suberate,bis(sulfosuccinimidyl)suberate]、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxy-succinimide ester,NHS-ester)、4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀醯亞胺酯[sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate]、五氟苯酯(pentafluorophenyl ester,PFP-ester)、乙二醇二縮水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether、戊二醛(glutaraldehyde)、2,3-二溴丙酰N-羥基丁二醯亞胺酯(2,3-dibromopropionyl N-hydroxysuccinimide ester)、磺基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(sulfo-N-hydroxysuccinimide ester)、苯丁酸氮芥-N-羥基琥珀醯亞胺酯(chlorambucil-N-hydroxysuccinimide ester)、1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二醯亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)、補骨脂素(psoralen)、乙烯基碸(vinyl sulfone)及其組合所組成的群組。
在本發明一實施例中，其中該些槽孔之槽壁係包含一該些束狀膠原蛋白細纖維交織重疊聚集之結構。
在本發明一實施例中，該生物支架，至少包含：一本體，係由一非重組型膠原蛋白基質所組成，一生物材料，位於該本體之一表面，和一組織膠黏層，位於該本體相對於該表面之一另一表面，或相鄰之一表面，或除外第一表面之二或多表面，其中組織膠黏層含一組織膠黏劑。其中，當該生物支架藉由該組織膠黏層貼附於一組織上時，一複數個細胞由該組織膠黏層往該生物材料層移動，而進行該組織之重建。
在本發明之一實施例中，其中該生物材料為係選自由一細胞貼附材料、 一組織修復材料、一細胞誘導材料、一生長因子材料、一抗菌材料和上述物質之混合物所組成之群組。
較佳地，上述細胞貼附材料可為一醣類材料、一胜肽、一蛋白、一磷脂質或上述物質混合物之群組。
較佳地，上述醣類材料可為葡萄胺聚醣材料。
較佳地，上述葡萄胺聚醣材料係選自由軟骨素、硫酸軟骨素、肝素、硫酸肝素、硫酸肝素蛋白多醣、角質素、硫酸角質素、硫酸角質素、硫酸皮膚素、卡拉膠、透明質酸和上述物質之混合物所組成之群組。
較佳地，組織修復材料可以是生醫材料、細胞外間質、營養素、和上述物質之混合物所組成之群組等。
較佳地，上述該生醫材料選自膠原蛋白、明膠、彈性蛋白、醣胺聚醣、殼聚醣、藻酸鹽、聚谷胺酸(γ-PGA)、聚賴胺酸、聚乳酸-甘胺酸(PLGA)、絲蛋白、纖維蛋白等，和上述物質之混合物所組成之群組等。
較佳地，上述細胞外間質選自膠原蛋白，明膠，彈性蛋白，醣胺聚醣，蛋白聚醣，醣蛋白，纖連蛋白，層粘連蛋白，聚集蛋白聚醣，含金屬蛋白酶等，和上述物質之混合物所組成之群組等。
較佳地，上述營養素係選自維生素、礦物質、蛋白質、脂質、碳水化合物、胺基酸、胜肽、核苷酸、脫氧核苷酸、草藥等，和上述物質之混合物所組成之群組等。
較佳地，該細胞誘導材料係選自由維生素、礦物質、化合物、藥物、中草藥、代謝物、中間代謝物、醣類、胜肽、蛋白質、磷脂質及其組合所組成之群組。
較佳地，抗菌材料可為抗生素、抗菌蛋白質或抗菌胜肽。
較佳地，上述該生長因子材料係選自由表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、神經生長因子(nerve growth factor,NGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)、群落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF)、幹細胞因子(stem cell factor,SCF)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)、顆粒球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,GCSF)、巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,MCSF)、顆粒球-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GMCSF)、神經膠衍生神經滋養因子(glial derived neurotrophic factor,GDNF)、毛狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor,CNF)、內皮細胞單核細胞活性多肽(endothelial-monocyte activating polypeptide)、表皮中性球活性多肽(epithelial neutrophil activating peptide)、紅血球生成素(erythropoietin)、骨塑型蛋白(bone morphogenetic protein)、腦衍生神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor)、BRAK、血清素(serotonin)、溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)、轉換生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白血球介素(IL-1、IL-2、IL-3等)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)，和上述物質之混合物所組成之群組。
在本發明一實施例中，本發明所提供之生物支架之該些槽孔中更包含一細胞培養基。
較佳地，其更包含一細胞，其中該細胞係貼附於該生物支架之任一槽孔。
較佳地，上述細胞可為幹細胞、衛星細胞、前驅細胞或組織細胞。
在本發明一實施例中，其中該減壓環境係藉由一抽真空動作來完成。
在本發明一實施例中，其中該組織膠黏層包含：一交聯劑，其是轉谷氨酰胺酶或該交聯劑具有至少一官能基；一基質分子，此非重組型膠原蛋白基質本身或添加一基質分子，其與該交聯劑產生交聯；以及一阻停劑，其係用以與該交聯劑之該官能基反應或交聯劑剩餘之官能基反應，以降低細胞毒性。
較佳地，該基質分子係選自由膠原蛋白(collagen)、透明質酸(hyaluronan)、明膠(gelatin)、絲蛋白(silk protein)、纖維蛋白(fibroin)、纖維連蛋白(fibronectin)、彈性蛋白(elastin)、細胞粘合素(tenascin)、層黏連蛋白(laminin)、玻連蛋白(vitronectin)、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、軟骨素(chondroitin)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)、角質素(keratin)、硫酸角質素(keratan sulfate)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate)、卡拉膠(carrageenan)、肝素(heparin)、甲殼素(chitin)、 幾丁聚醣(chitosan)、海藻酸鹽(alginate)、蛋白聚醣聚合物(aggrecan)、瓊膠(agarose)、洋菜(agar)、纖維素(cellulose)、甲基纖維素(methyl cellulose)、羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)、肝醣(glycogen)、纖維蛋白、纖維蛋白原、凝血酶、聚麩胺酸、聚離胺酸、聚胺基酸、合成聚合物(例如，丙烯酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-甘醇酸)及上述基質分子之衍生物所組成的群組。
較佳地，該阻停劑係選自由胺基酸、寡胜肽、多胜肽、蛋白質、二胺(diamine)、寡胺(oligoamine)、多胺(polyamine)、羰基化合物(carbonyl compound)、乙二醇化合物(glycol compound)、羧基化合物(carboxyl compound)、二羧酸化合物(dicarboxylate)、寡羧酸化合物(oligo-carboxylate)、聚羧酸化合物(polycarboxylate)、硫醇化合物(sulfhydryl compound)、寡硫醇化合物(oligosulfhydryl compound)、多硫醇化合物(polysulfhydryl compound)、羥基化合物(hydroxyl compound)、寡羥基化合物(oligohydroxyl compound)、多羥基化合物(polyhydroxyl compound)、醣類、寡醣、多醣、核醣核酸(ribonucleic acid,RNA)、去氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)、寡核苷酸、疊氮化合物(azide)、光交聯化合物(photo-crosslinking compound)、及上述所組成的群組；其中該阻停劑之官能基為單種官能基、異雙種官能基或多種官能基。
較佳地，該組織為一皮膚組織。
1:生物支架
10:本體
10a:非重組型膠原蛋白基質
10b:槽孔
10c:生物材料
20:生物材料層
30:組織膠黏層
2:組織
S100~S105:製備非重組膠原蛋白基質的方法
S100~S104b:製備非重組膠原蛋白基質的方法
S106~S109:生物支架的製備方法
圖1顯示本發明一實施例中非重組型生物支架的橫截面示意圖。
圖2顯示本發明一實施例中非重組型生物支架之本體的橫截面示意圖。
圖3顯示習知一重組型多孔狀膠原蛋白基質之電子顯微鏡放大一百倍率圖。
圖4顯示本發明非重組型膠原蛋白基質的製備流程圖。
圖5顯示本發明非重組型膠原蛋白基質的另一製備流程圖。
圖6A至第6C圖顯示本發明方法製備出的非重組型膠原蛋白基質的電子顯微鏡影像。
圖7A與圖7B顯示本發明一實施例之生物支架的電子顯微鏡影像圖。
圖7C顯示本發明一實施例之生物支架以阿爾辛藍染色結果表明透明質酸在生物 之架內分布良好。
圖8顯示本發明一實施例之生物支架與習知技術之剪應力測試比較圖。
圖9A與圖9B顯示本發明的非重組膠原蛋白基質和先前技術之經交聯處理重組膠原蛋白基質的儲存和耗損模量。
圖10A顯示本發明的生物支架和由習知方法製備的重組多孔膠原蛋白-硫酸軟骨素基質對於傷口癒合的比較圖。
圖10B顯示傷口經不同處理對於傷口之治癒時間比較圖。
圖11顯示不同材料支架對於傷口之治癒狀況比較之顯微鏡影像圖，(A)正常皮膚對照，(B)PCHM組的癒合基質，(C)Integra組的癒合基質。
圖12顯示本發明一實施例中生物支架之製備方法流程圖。
圖13A、圖13B顯示本發明另一實施例之生物支架的橫截面示意圖及其局部放大圖。
圖14A至圖14C顯示本發明一實施例中具有不同生物材料包覆程度之生物支架的吸水性比較圖。
圖15A至圖15D顯示本發明一實施例中包覆不同抗菌材料之生物支架的抗菌效果圖。
有鑑於此，請先參考圖1，本發明提供一種用於傷口敷料之非重組型材料生物支架1，其至少包含一本體10、一生物材料層20與一組織膠黏層30。其中，本體10至少包含一非重組型膠原蛋白基質10a。生物材料層20與組織膠黏層30係分別塗佈於本體之一表面與相鄰或相對之一另一表面。當上述生物支架藉由組織膠黏層貼附於一組織上時，複數個細胞由組織膠黏層往生物材料層移動，而進行此組織2之重建。
其中，請先參考圖2，圖2顯示本發明一實施例中生物支架之本體的橫截面示意圖。如圖所示，本體10較佳地為一非重組型膠原蛋白基質10a，且此膠原蛋白基質10a係由複數條柱狀的膠原蛋白細纖維組合而成並包含由該些膠原蛋白細纖維所構成的複數個槽孔10b。一生物材料10c包覆於槽孔的內表 面。
請參考圖4，本發明之一種傷口敷料之非重組型生物支架，其中該非重組膠原蛋白基質的製備方法包含：首先，如步驟S100所示，提供一動物組織或皮膚組織，如豬皮、牛皮或羊皮組織，於15℃以下的環境，先利用削脂機去除該動物皮膚組織的皮下脂肪，並裁減為適當大小，如28±1cm×70±1cm之尺寸。接著，將該動物皮膚組織進行除毛並刮除殘留於其上的油脂及水分，再使用模具將每片皮膚組織裁切成4片(如：各13±1cm×34±1cm)，之後利用取皮機將豬皮之真皮層進行薄片分層而取得至少一真皮層薄片，再以純水進行沖洗，完成由該動物皮膚組織取得該真皮層薄片之目的。最佳地，該真皮層薄片係取自於豬皮。
再者，如步驟S102所示，進行一去毛囊處理步驟，係將該真皮層薄片浸漬於一含有高離子強度之鹽類溶液中，並於加入一蛋白分解酵素後，加熱該鹽類溶液至25℃至40℃以及進行一超音波震盪處理持續兩個小時，再以磷酸鹽溶液作為一清洗溶液，清洗去毛囊處理後之該真皮層薄片。該含有高離子強度之鹽類溶液是由陰離子和陽離子以離子鍵結合的鹽類溶液。該含有高離子強度之鹽類溶液的離子強度係大於0.15N。最佳地，該含有高離子強度之鹽類溶液的離子強度係介於0.5N-10N。最佳地，該含有高離子強度之鹽類溶液為一含有氯化鈉、硫酸銨鹽和上述化合物之混合物所組成的溶液。
在一實施例中，該含有高離子強度之鹽類溶液係為一含有氯化鈉之磷酸鹽溶液。此高鹽條件可以穩定非重組型膠原蛋白基質的結構，不會使其膨脹後擠壓到毛囊，使得酵素可以順利進入毛囊進行反應。
在一實施例中，該蛋白分解酵素可作用於該含有高離子強度之鹽類溶液。最佳地，該蛋白分解酵素係選自由絲胺酸酶(Serine proteases)、蘇胺酸酶(Threonine proteases)、半胱胺酸酶(Cysteine proteases)、天門冬胺酸酶(Aspartate proteases)、谷胺酸酶(Glutamate proteases)、含金屬蛋白酶(Metallo proteases)和上述酵素之混合物所組成之群組。最佳地，該半胱胺酸酶係選自由木瓜酵素、鳳梨酵素和上述物質之混合物所組成之群組。最佳地，該含金屬蛋白酶係為中性蛋白酶(dispase)。
再參考下表1所示，將真皮層薄片浸漬於摻有木瓜酵素之磷酸鹽溶液中(含有5mM or 0.16%(w/w)的半胱胺酸)，當木瓜酵素的濃度高於0.6mg/mL(組別B、C、D)時，豬毛係全數脫落，而將真皮層薄片浸漬於摻有鳳梨酵素之磷酸鹽溶液中，且當鳳梨酵素的濃度為0.2mg/mL、0.6mg/mL(組別A、B)時，雖尚有未脫落之豬毛，但當鳳梨酵素的濃度為1.2mg/mL時，豬毛係全數脫落。超過0.2U/mL的中性蛋白酶也可以完全清除豬毛囊。至於，對照組(僅磷酸鹽緩衝溶液)之豬毛全數未脫落。
表1、真皮層薄片(A-D組)浸漬於含有木瓜酵素、含有鳳梨酵素或含有中性蛋白酶之磷酸鹽溶液。
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請繼續參考圖4，如步驟S104所示，進行一膨潤處理步驟，係將去毛囊處理後之該真皮層薄片浸漬於一第一酸性溶液中，以及進行一超音波震盪處理，該超音波震盪處理時間為連續24小時，以使真皮層薄片的體積至少膨脹百分之五十，避免反應溫度超過37℃。較佳地，該第一酸性溶液為一弱酸溶液，係可選擇自由甲酸、羧酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸、 鹽酸或其混合物所組成之群組。最佳地，該第一酸性溶液為醋酸溶液。
如步驟S105所示，執行洗滌處理步驟以從真皮層片去除非膠原蛋白材料，並獲得純化的膠原蛋白基質。接著是將純化的膠原蛋白基質在-20℃~-80℃下冷凍，並進行冷凍乾燥的過程，以獲得純化的非重組膠原蛋白基質。
請參考圖5方法，圖5係顯示本發明非重組膠原蛋白基質的另一製備方法，包含：如步驟S101a所示，本發明之製備方法於進行任一步驟之前或之後更包含一消毒處理步驟，係以一消毒溶液清洗該真皮層薄片。最佳地，該消毒溶液為一過醋酸溶液。
如步驟S102a所示，本發明之製備方法於進行該去毛囊處理步驟S102之前或之後更包含一去油脂步驟。該去油脂步驟係為一皂化處理、一有機溶劑處理或上述之組合，並於處理後立即多次清洗或置換到適當的水溶液。該皂化處理步驟，係以一鹼性物質接觸該真皮層薄片之一表面。最佳地，該鹼性物質為顆粒狀，並且為一強鹼顆粒。最佳地，該強鹼顆粒為一氫氧化鈉顆粒。該有機溶劑處理係為酒精處理、己烷(hexane)處理或氯仿(chloroform)處理。然而，較佳的處理時間和劑量可以防止基質中的膠原蛋白變性。
如步驟S104a所示，本發明之製備方法於該膨潤處理步驟S104後更包含一去抗原處理步驟。最佳地，該去抗原處理步驟為將該真皮層薄片浸漬於一第二酸性溶液中，該第二酸性溶液含有胃蛋白酶。此步驟可以一超音波震盪處理連續2小時或以上，該含有胃蛋白酶之第二酸性溶液應避免加熱超過37℃，適當於33℃度至37℃之間；接著，以中性磷酸鹽溶液再次處理該真皮層薄片以中止反應或以純水沖洗掉殘留於真皮層薄片上之溶液。較佳地，該第二酸性溶液為一弱酸溶液，係可選擇自由甲酸、羧酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸、鹽酸及其混合物所組成之群組。
如步驟S104b所示，在一實施例中，本發明之製備方法於該膨潤處理 之步驟後更包含一強化處理步驟，係將真皮層薄片浸漬於一添加劑中，較佳的，該添加劑係為交聯劑溶液。此步驟必要時可以超音波震盪處理，並適當加熱該交聯劑溶液但不超過40℃，譬如可以在33℃至37℃之間以一超音波震盪處理連續24小時完成交聯反應，再以純水沖洗掉殘留於真皮層薄片上之溶液。最佳地，該交聯劑溶液係通過轉谷氨酰胺酶之作用，或其中交聯劑的一個官能基係選自胺基(amine)、硫氫基(sulfhydryl)、羰基(carbonyl)、乙二醇基(glycol)、羧基(carboxyl)、疊氮(azide)、亞胺酯(imidoester)、環氧基(epoxyl)、醛基(aldehyde)、鹵代乙酰基(haloacetyl)、吡啶二硫化物(pyridyl disulfide)、吡啶二硫代(pyridyldithiol)、醯胼(hydrazide)、光反應基團(photo-reacting group)、碳二醯亞胺(carbodiimide)、雙吖丙啶(diazirine)、氮丙環(aziridine)、丙烯酰基(acryloyl)、芳基(arylate)、硫醇基(thiol)、梔子素(genipin)、核黃素(riboflavin)、類黃酮(flavonoid)及其衍生物、羥甲基膦(hydroxymethyl phosphine)、異氰酸酯類(isocyanate)、馬來亞醯胺(maleimide)、6-(馬來醯亞胺基)己酸活性酯(6-maleimidohexanoic acid active ester)、雙琥珀亞胺醯辛二酸酯[disuccinimidyl suberate,bis(sulfosuccinimidyl)suberate]、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxy-succinimide ester,NHS-ester)、4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀醯亞胺酯[sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate]、五氟苯酯(pentafluorophenyl ester,PFP-ester)、乙二醇二縮水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether、戊二醛(glutaraldehyde)、2,3-二溴丙酰N-羥基丁二醯亞胺酯(2,3-dibromopropionyl N-hydroxysuccinimide ester)、磺基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(sulfo-N-hydroxysuccinimide ester)、苯丁酸氮芥-N-羥基琥珀醯亞胺酯(chlorambucil-N-hydroxysuccinimide ester)、1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二醯亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)、補骨脂素(psoralen)、乙烯基碸(vinyl sulfone)及其組合所組成的群組。
請參考圖6A圖至6C，係根據前文所述方法製備出的非重組膠原蛋白基質之外觀，圖6A為本發明一實施例中非重組膠原蛋白基質之電子顯微鏡放大一百倍率的影像，圖6B為本發明一實施例中非重組膠原蛋白基質之電子顯微鏡放大四百倍率的影像，圖6C中為本發明一實施例中非重組膠原蛋白基質之電子顯微鏡放大一萬倍率的影像。
與先前技術所製備出的膠原蛋白基質(圖3)相比，本發明所製備出的非重組膠原蛋白基質，如圖6A-6C所示，係由複數條束狀膠原蛋白細纖維交織重疊聚集而構成，並具有複數個槽孔，該些槽孔具有一深度且具有槽壁。上述束狀膠原蛋白細纖維係由原膠原分子所組成且直徑小於100nm，但本發明並不欲以此為限。上述該些槽孔外觀係為一隨機半徑開口狀，與習知先前技術相比，本技術可得孔徑大小控制於較窄範圍，亦即孔徑較均勻成型的非重組膠原蛋白基質。
請參考圖7A至圖7C，其示出了由根據上述方法製備的非重組膠原蛋白基質製成的生物支架的外觀。圖7A是本發明的一個實施方案中的生物支架的掃描電子顯微鏡的100倍放大圖像。圖7B是本發明的一個實施方案中的生物支架的掃描電子顯微鏡的400倍放大圖像。圖7A與7B的左邊圖為非重組膠原蛋白基質，而右邊圖為由CNBr預激活透明質酸並與非重組膠原蛋白基質交聯的生物支架的掃描電子顯微照片的圖像。圖7C是本發明的一個實施方案中的透明質酸包覆於非重組膠原蛋白基質，並以組織樣本進行縱切片後，用阿爾辛藍染色觀察生物支架內透明質酸衍生物的分布於光學顯微照片的圖像，其結果表明透明質酸衍生物在生物支架內分佈良好。
請參考圖8，係顯示本發明一實施例之非重組膠原蛋白基質(線條B)與習知技術所取得之膠原蛋白基質(線條A)的剪應力試驗。由結果可知，在攝氏溫度20℃時，習知技術所取得的膠原蛋白基質之剪應力為63.56×10-3MPa，而本發明非重組膠原蛋白基質之剪應力為189.07MPa，由此可知，在同一測試條件下， 本發明非重組膠原蛋白基質之剪力強度，較習知技術之膠原蛋白基質多約3個級數之數值。也就是說，由於一開始毛囊可被完整去除，避免了習知技術上必須破壞皮膚組織進而破壞膠原蛋白基質結構本體的問題，因此本發明所述製備方法所得到的非重組膠原蛋白基質，其結構強度與張力確實優於習知技術製備的膠原蛋白基質。綜上所述，本發明提供一種非重組膠原蛋白基質的製程，其係可在不破壞真皮層膠原蛋白狀態的條件下，破壞毛囊組織，進而製備出結構強度較習知技術提升之非重組膠原蛋白基質。
請參考圖9A和9B圖，其顯示透過測壓儀監測振動應變的變化時測量物儲存模數和損耗模數的變化。儲存數表明基質以彈性方式儲存變形能的能力。這與交聯程度直接相關，交聯程度越高，儲存數越大。圖9A是本發明的非重組膠原蛋白基質的數據，而圖9B是一般的重組膠原蛋白基質經過交聯處理的數據。微觀結構意味著材料中分子或粒子之間存在力。為了破壞微觀結構，需要的力大於保持微觀結構的力。當施加的力小於分子力或粒子間力時，G'大於G"；該材料具有一定的儲能技術，並且應該能夠在某種程度上恢復到力學力之前的初始配置該材料表現為彈性固體，儘管不是理想的材料，因為會消耗一些力學能，圖9A和9B的結果表明，非重組膠原蛋白基質的儲存模數高於重組膠原蛋白基質的儲存模數，顯示非重組膠原蛋白基質中的天然交聯大多數被保留，而在一般重組的多孔膠原蛋白基質中，大多數的天然交聯則無法保留，雖然經過化學交聯處理，儲存模數和損耗模數仍低於非重組膠原蛋白基質。
再者，由於非重組型膠原蛋白基質10a本身並非親水性材料，故本體10更可包含一親水性生物材料10c塗佈於該些膠原蛋白纖維之外表面。也就是說，該些槽孔10b的內壁均塗佈有親水性生物材料10c(如圖2所示)，以有利於後續細胞進入非重組型膠原蛋白基質10a中並於其內移動與附著。較佳地，上述生物材料可為生長因子，或一醣胺聚醣，如透明質酸(hyaluronic acid,HA)、軟骨素(chontroitin sulfate,CS)或肝素(heparan,Hep)等。更佳地，上述親水性生物材 料10c為透明質酸，但本發明並不欲以此為限。
請再參考圖1，在本發明之較佳實施例中，塗佈於本體10之一表面的生物材料層20可為生長因子，包含表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、神經生長因子(nerve growth factor,NGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、群落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF)、幹細胞因子(stem cell factor,SCF)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)、顆粒球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,GCSF)、巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,MCSF)、顆粒球-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GMCSF)、神經膠衍生神經滋養因子(glial derived neurotrophic factor,GDNF)、毛狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor,CNF)、內皮細胞單核細胞活性多肽(endothelial-monocyte activating polypeptide)、表皮中性球活性多肽(epithelial neutrophil activating peptide)、紅血球生成素(erythropoietin)、骨塑型蛋白(bone morphogenetic protein)、腦衍生神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor)、BRAK、血清素(serotonin)、溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)、轉換生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白血球介素(IL-1、IL-2、IL-3等)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)或上述物質之組合物。
另外，雖然應用於臨床醫學及組織工程之組織膠黏劑，可藉由具有黏著性之特性，達到控制藥物釋放、調控生物相容性材料分解或促進接合血管等功效。但，由於現有技術之組織膠黏劑係由諸如戊二醛(glutaraldehyde,GA)、乙二醛(glyoxal)、甲醛(formaldehyde)或三聚磷酸鈉(sodium tripolyphosphate,TPP)等交聯劑(cross-linking agent)與諸如明膠(gelatin)、幾丁聚醣(chitosan)或膠原蛋白(collagen)等載體材料交聯所形成，其中交聯劑具有細胞毒性，且容易導致強烈且持續性的免疫反應(immune response)，使得細胞組織膠黏劑具有毒性。
因此，本發明中係使用具有較佳鍵結強度以及低細胞毒性之組織膠黏 層30，其至少包含一交聯劑、至少一基質分子與一阻停劑。上述交聯是透過轉谷氨酰胺酶之作用，或交聯劑的官能基作用，基質分子係用以與交聯劑產生交聯。至於阻停劑係用以與交聯劑未反應之官能基反應，以降低細胞毒性。
在較佳實施例中，其中上述交聯劑係轉谷氨酰胺酶或一官能基係選自於含有胺基(amine)、硫氫基(sulfhydryl)、羰基(carbonyl)、乙二醇基(glycol)、羧基(carboxyl)、疊氮(azide)、亞胺酯(imidoester)、環氧基(epoxide)、醛基(aldehyde)、鹵代乙酰基(haloacetyl)、吡啶二硫化物(pyridyl disulfide)、吡啶二硫代(pyridyldithiol)、醯胼(hydrazide)、光反應基團(photo-reacting group)、碳二醯亞胺(carbodiimide)、雙吖丙啶(diazirine)、氮丙環(aziridine)、丙烯酰基(acryloyl)、芳基(arylate)、硫醇基(thiol)、梔子素(genipin)、核黃素(riboflavin)、類黃酮(flavonoid)及其衍生物、羥甲基膦(hydroxymethyl phosphine)、異氰酸酯類(isocyanate)、馬來亞醯胺(maleimide)、6-(馬來醯亞胺基)己酸活性酯(6-maleimidohexanoic acid active ester)、雙琥珀亞胺醯辛二酸酯[disuccinimidyl suberate,bis(sulfosuccinimidyl)suberate]、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxy-succinimide ester,NHS-ester)、4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀醯亞胺酯[sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate]、五氟苯酯(pentafluorophenyl ester,PFP-ester)、乙二醇二縮水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether、戊二醛(glutaraldehyde)、2,3-二溴丙酰N-羥基丁二醯亞胺酯(2,3-dibromopropionyl N-hydroxysuccinimide ester)、磺基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(sulfo-N-hydroxysuccinimide ester)、苯丁酸氮芥-N-羥基琥珀醯亞胺酯(chlorambucil-N-hydroxysuccinimide ester)、1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二醯亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)、補骨脂素(psoralen)、乙烯基碸(vinyl sulfone)及其組合所組成的群組。
在較佳實施例中，其中上述基質分子係選自於由膠原蛋白(collagen)、透明質酸(hyaluronan)、明膠(gelatin)、絲蛋白(silk protein)、纖維蛋白(fibroin)、纖維連蛋白(fibronectin)、彈性蛋白(elastin)、細胞粘合素(tenascin)、層黏連蛋白(laminin)、玻連蛋白(vitronectin)、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、軟骨素(chondroitin)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)、角質素(keratin)、硫酸角質素(keratan sulfate)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate)、卡拉膠(carrageenan)、肝素 (heparin)、甲殼素(chitin)、幾丁聚醣(chitosan)、海藻酸鹽(alginate)、蛋白聚醣聚合物(aggrecan)、瓊膠(agarose)、洋菜(agar)、纖維素(cellulose)、甲基纖維素(methyl cellulose)、羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)、肝醣(glycogen)、纖維蛋白、纖維蛋白原、凝血酶、聚麩胺酸、聚離胺酸、聚胺基酸、合成聚合物(例如，丙烯酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-甘醇酸)及上述基質分子之衍生物所組成的群組。
更佳地，基質分子可由任何自然產生的膠原蛋白或其官能變體以及透明質酸製備而得。且，目前已顯示透明質酸，特別是高分子量的透明質酸(即大於5kDa)，可有效地促進血管新成，進而促進傷口癒合。例如美國暫時申請案61/390,789，透明質酸之分子量係50kDa至5,000kDa、70kDa至1,500kDa、200kDa至1,500kDa、500kDa至1,500kDa或700kDa至1,500kDa。當細胞生長於膠原蛋白或透明質酸之基質中，具有良好存活能力。因此，本發明所使用之組織膠黏層30的基質分子，其中透明質酸之濃度係每毫升0.001毫克(mg/mL)至100mg/mL；膠原蛋白之濃度係0.001mg/mL至100mg/mL。較佳地，膠原蛋白之濃度為0.1mg/mL至100mg/mL，透明質酸之濃度係0.01mg/mL至35mg/mL。更佳地，膠原蛋白之濃度係3mg/mL至75mg/mL(如6mg/mL或9mg/mL)，透明質酸之濃度係0.2mg/mL至20mg/mL。
在較佳實施例中，其中上述阻停劑係選自於由胺基酸、寡胜肽、多胜肽、蛋白質、二胺(diamine)、寡胺(oligoamine)、多胺(polyamine)、羰基化合物(carbonyl compound)、乙二醇化合物(glycol compound)、羧基化合物(carboxyl compound)、二羧酸化合物(dicarboxylate)、寡羧酸化合物(oligo-carboxylate)、聚羧酸化合物(polycarboxylate)、硫醇化合物(sulfhydryl compound)、寡硫醇化合物(oligosulfhydryl compound)、多硫醇化合物(polysulfhydryl compound)、羥基化合物(hydroxyl compound)、寡羥基化合物(oligohydroxyl compound)、多羥基化合物(polyhydroxyl compound)、醣類、寡醣、多醣、核醣核酸(ribonucleic acid,RNA)、去氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)、寡核苷酸、疊氮化合物(azide)、光交聯化合物(photo-crosslinking compound)、及上述所組成的群組；其中該阻停劑之官能基為單種官能基、異雙種官能基或多種官能基。更佳地，本發明所使用之阻停劑包括精胺(spermine)、魚胺類(protamine)、1-6己二胺(1,6-hexanediamine)， 聚離胺酸則係可以有不同分子量。聚離胺酸的平均分子量可以為3.4kDa、20kDa、99kDa、212kDa、225kDa或更高。
請參考圖10A是在植入有Integra®人造皮膚或PCHM的天竺鼠背皮膚中全深度層傷口癒合的比較圖。用作對照之Integra®人造皮膚是一種通過熱脫氫交聯的一般方法製備的重組型膠原蛋白-軟骨素硫酸鹽基質。PCHM是本發明的生物支架，其由非重組型膠原蛋白基質和塗覆在基質的外表面和內表面上的透明質酸組成。PCHM的穩定多孔結構使真皮細胞比對照組更好地浸潤多達4倍。因此，事實證明，用PCHM填充的傷口的癒合速度比Integra組要快得多(約80%)。術後4個月PCHM組的再生基質組織學顯示的癒合質量也比對照組好得多。
請參考圖11，與正常皮膚相比，PCHM的生物支架在兩週內降解，並且PCHM組的癒合基質基本上被新組織代替，如圖11B，接著再如圖11C所示，觀察到一些Integra人造皮膚碎片，這些碎片乾擾了傷口癒合的再生過程。
接著，請繼續參考圖12。如步驟S106至步驟S109所示，將該非重組型膠原蛋白基質接觸包含有一生物材料之溶液中，並提供一減壓環境於該非重組型膠原蛋白基質；在一實施例中，將非重組型膠原蛋白基質的一端置入包含有至少一生物材料的溶液中，並於非重組型膠原蛋白基質的另一端製造一減壓環境而使得生物材料可被吸入非重組型膠原蛋白基質的結構中，使該生物材料均勻地包覆於該些束狀膠原蛋白細纖維的外表面(亦可視為均勻塗佈於該些槽孔的內壁)，如步驟S108所示。必須說明的是，由於上述非重組型膠原蛋白基質的槽孔尺徑極小，若是直接浸置於溶液中仍無法避免空氣的殘留。因此，在本發明中發明人係利用虹吸原理，間接排除空氣，使生物材料能夠完全包覆於該些束狀膠原蛋白細纖維的外表面(亦可視為該些槽孔的內壁)。另外，上述減壓環境較佳地係經由一抽真空的動作來完成。再者，上述生物材料為係選自由一細胞貼附材料、一組織修復材料、一細胞誘導材料、一生長因子材料、一抗菌材料和上述物質之混合物所組成之群組。較佳地，上述細胞貼附材料為一醣類、一胜肽、一蛋白質、一磷脂質或其組合所組成之材料。較佳地，上述醣類材料可為葡萄胺聚醣材料。較佳地，上述葡萄胺聚醣材料可為醣胺多醣(glycosaminoglycans,GAG)，係如透明質酸(hyaluronic acid,HA)、軟骨素 (chontroitin sulfate,CS)或肝素(heparan,Hep)硫酸軟骨素、硫酸乙酰肝素，硫酸乙酰肝素蛋白聚醣，角質素，硫酸角質素，硫酸皮膚素，角叉菜膠，透明質酸。較佳地，本發明所使用之生物材料係選自由軟骨素、肝素、透明質酸、膠原蛋白、彈性蛋白、糖胺聚醣、殼聚醣、藻酸鹽、聚谷胺酸(γ-PGA)、聚賴胺酸、聚乳酸-乙醇酸PLGA、絲蛋白、纖維蛋白和上述物質之混合物所組成之群組，但本發明並不欲以此為限。
較佳地，上述細胞誘導材料為一生長因子材料，係選自由表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、神經生長因子(nerve growth factor,NGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、群落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF)、幹細胞因子(stem cell factor,SCF)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)、顆粒球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,GCSF)、巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colohy-stimulating factor,GMCSF)、神經膠衍生神經滋養因子(glial derived neurotrophic factor,GDNF)、毛狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor)、內皮細胞單核細胞活性多肽(endothelial-monocyte activating polypeptide)、表皮中性球活性多肽(epithelial neutrophil activating peptide)、紅血球生成素(erythropoietin)、骨塑型蛋白(bone morphogenetic protein)、腦衍生神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor)、BRAK、血清素(serotonin)、溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)、轉換生長因子(transforming growth factor,TGF-α,TGF-β)、介白素(IL-1,IL-2,IL-3)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)和上述物質之混合物所組成之群組。
較佳地，上述抗菌材料為抗生素、抗微生物蛋白質、抗微生物胜肽或上述組合之組合物。
至於，非重組型膠原蛋白基質的詳細結構則可進一步參考圖2，圖2係顯示本發明一實施例之生物支架的橫截面示意圖。如前文所示，非重組型膠 原蛋白基質10a包含有由複數條束狀膠原蛋白細纖維所構成之複數個槽孔10b，而藉由虹吸原理吸入非重組型膠原蛋白基質10a內的生物材料10c係包覆於該些束狀膠原蛋白細纖維之外表面。也就是說，該些槽孔10b的內壁均塗佈有生物材料10c，更有利於細胞進入該些槽孔中並貼附於生物材料上，以進行後續應用。
在本發明之較佳實施例中，雖圖2未示，但在將生物材料包覆於該些束狀膠原蛋白細纖維之外表面後，可隨後注入一細胞培養基於該些槽孔10b。隨後，注入一包含有一細胞之溶液，以使細胞進入非重組型膠原蛋白基質的該些槽孔中。也就是說，在本發明之較佳實施例中，本發明所提供之生物支架更包含細胞，如圖13A所示。請進一步參考圖13B，圖13B係為圖13A中虛線所圈部份的局部放大圖，其中細胞3貼附於槽孔10b內之生物材料10c上。較佳地，上述細胞可為幹細胞、衛星細胞、前驅細胞、祖細胞或組織細胞，且組織細胞亦可包含有皮膚組織、軟骨組織或脂肪組織等等。
請參考下表2，其係顯示未塗佈生物材料之非重組型膠原蛋白基質與塗佈有生物材料之非重組型膠原蛋白基質於不同視野下之細胞貼附數量的比較。由表2可知，非重組型膠原蛋白基質本身為一疏水性材料，並不利於細胞進入孔洞之貼附，然而當本發明進一步於非重組型膠原蛋白基質表面塗佈有細胞貼附材料時，明顯有利於後續細胞進入該些槽孔中並貼附於含生物材料之非重組型膠原蛋白基質上。
表2、細胞數量
Figure 108148440-A0202-12-0024-31
Figure 108148440-A0202-12-0025-3
接著，進一步比較未塗佈有生物材料之非重組型膠原蛋白基質(A1)、塗佈有透明質酸(1次)之非重組型膠原蛋白基質(A2)以及塗佈有透明質酸(5次)之非重組型膠原蛋白基質(A3)的吸水性。請參考圖13A至圖13C，上述三圖分別顯示A1、A2、A3的吸水狀況。因此，由圖可知，塗佈有越多層生物材料的非重組型膠原蛋白基質，其吸水性越好。
於本發明所提供之可用於傷口敷料之生物支架的效果，可經由圖9與圖10來加以佐證。其中，圖10B顯示不同生物支架對於傷口之治癒時間比較，圖11顯示不同生物支架對於傷口之治癒狀況比較。
首先，圖10B係將傷口進行不同的處理，而分為A、B、C、D、E五組來觀察其傷口面積與時間的關係。其中，初始傷口面積為100%，每隔兩天量測一次直至傷口完全癒合。再者，A代表未經任何處理之傷口，B代表經多孔性非重組膠原蛋白基質(Porous Collagen Matrix,PCM)處理之傷口，C代表經有溴化氰活化之透明質酸(CNBr-activated hyaluronan)包覆的多孔性非重組膠原蛋白基質(PCHM)處理之傷口，D代表再多添加5mg/mL透明質酸包覆於有溴化氰活化之透明質酸(CNBr-activated hyaluronan,aH)結合的多孔性非重組膠原蛋白基質(H-PCHM)處理的傷口，E代表經人工皮膚(Integra® dermal regeneration template,IT)處理之傷口。此時，如圖所示，B組、C組與D組之傷口均於30天左右即癒合，但經人工皮膚處理之傷口(E組)卻需44天才癒合。至於未經任何處理的傷口(A組)雖然癒合的稍微快一點，但卻會造成傷口緊縮形變等狀況。
接著，如圖10B所示，經12天後，經PCHM處理之傷口(圖11(B))的纖維母細胞增生狀況確實高於經人工皮膚處理之傷口(圖11(C))。由此可知，上述結合生物材料之本體10，可在不造成傷口緊縮的狀況下有效促進細胞增生，而且相較於習知技術之人工皮膚，可更快速地使傷口癒合。
接著，本案另一實施例，如圖15A-15D所示，生物支架包覆不同抗菌材料，如圖15A、15B包覆廣譜抗微生物肽(Pexiganan)以及圖15C、15D包覆新黴素(Neomycin)，其結果顯示，抗菌效果呈現濃度依賴性，可見生物支架包覆抗菌材料均具有良好抗菌效果。
綜上所述，本發明之目的係提供一種可用於傷口敷料之生物支架，其本體之一面塗佈有生長因子材料層，而另一面塗佈有組織膠黏層，可使細胞基於濃度梯度的效應於本體內移動。再者，由於本體內更包含有親水性生物材料，而可更有助於細胞的移動與附著。故，本發明所提供之生物支架除了有效阻擋外來細菌的入侵防止傷口感染外，更可用以加速細胞生長促進傷口之癒合速度。
再者，雖習知技術上有見將切碎後的膠原蛋白加入生物材料(如：透明質酸)一起再去交聯凝結成一個結構，但此時由於膠原蛋白和生物材料兩者係為相互交錯，並無法使整個生物支架外面均成為親水性。另外，若是使用先製備完成的重組型膠原蛋白支架(如圖3所示)，再用本發明所提供之方法時，則會因該重組型膠原蛋白基質的支撐力不夠(請同時參考圖9及前文相關敘述)，而在後續生物材料塗佈時所需進行的抽真空步驟中因外部壓力導致整體結構的崩毀。因此，本發明所提供之包覆有生物材料的生物支架，基於虹吸原理使得生物材料可完全吸入非重組型膠原蛋白基質內而均勻包覆於其表面，使得生物支架表面有利於進行細胞的誘導或貼附，可廣泛地應用於外科手術、人體器官組織的修復、再生醫學、皮膚移植、美容醫療、外科修補用網狀織物、牙科修補用網狀織物、人類皮膚替代物、人工腦膜替代物、骨科修補用替代物或創傷被敷材替代物中。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本發明之專利範圍中。
1:生物支架
10:本體
20:生物材料層
30:組織膠黏層
2:組織

Claims (38)

  1. 一種生物支架，至少包含：
    一本體，係由一非重組膠原蛋白基質所組成，以及
    一生物材料，位於該本體之一表面，及在該本體的複數個槽孔壁上；
    其中該非重組膠原蛋白基質具有一複數條束狀膠原蛋白細纖維，以及該複數條束狀膠原蛋白細纖維交織重疊聚集之結構及構成複數個槽孔。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之生物支架，其中該生物材料係選自一細胞貼附材料、一組織修復材料、一細胞誘導材料、一生長因子材料、一抗菌材料及其組合所組成之群組。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之生物支架，其中該抗菌材料為抗生素、抗微生物蛋白質、抗微生物胜肽或其組合所組成之群組。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之生物支架，其中該細胞貼附材料為一醣類、一胜肽、一蛋白質、一磷脂質或其組合所組成之材料。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之生物支架，其中該醣類為一葡萄胺聚醣材料。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之生物支架，其中該葡萄胺聚醣材料係選自由軟骨素、硫酸軟骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸乙酰肝素蛋白聚醣、角質素、硫酸角質素、硫酸皮膚素、卡拉膠、透明質酸及其組合所組成之群組。
  7. 如申請專利範圍第2項所述之生物支架，其中該生長因子材料係選自由表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、神經生長因子(nerve growth factor,NGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、群落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF)、幹細胞因子(stem cell factor,SCF)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)、顆粒球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,GCSF)、巨噬細胞群落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GMCSF)、神經膠衍生神經滋養因子(glial derived neurotrophic factor,GDNF)、毛狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor,CNF)、內皮細胞單核細胞活性多肽(endothelial-monocyte activating polypeptide)、表皮中性球活性多肽(epithelial neutrophil activating peptide)、紅血球生成素(erythropoietin,EPO)、骨塑形蛋白(bone morphogenetic protein,BMP-1,BMP-2,BMP-3等)、腦衍生神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、BRAK、血清素(serotonin)、溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)、轉換生長因子(transforming growth factor,TGF-α,TGF-β)、介白素(IL-1,IL-2,IL-3)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)及上述物質之混合物所組成之群組。
  8. 如申請專利範圍第2項所述之生物支架，其中該細胞誘導材料係選自由維生素、礦物質、化合物、藥物、中草藥、代謝物、中間代謝物、醣類、胜肽、蛋白質、磷脂質及上述物質之混合物所組成之群組。
  9. 如申請專利範圍第2項所述之生物支架，其中該組織修復材料為一生醫材料、一細胞外基質、一營養物或上述物質之混合物所組成之群組。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之生物支架，其中該生醫材料為膠原蛋白、明膠、透明質酸、彈性蛋白、醣胺聚醣、殼聚醣、藻酸鹽、聚谷胺酸(γ-PGA)、聚賴胺酸、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、絲素蛋白、聚胺基酸、纖維素及其衍生物或上述物質之混合物所組成之群組。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之生物支架，其中該細胞外基質係選自由膠原蛋白、明膠、彈性蛋白、醣胺聚醣、蛋白聚醣、糖蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、聚集蛋白聚醣、金屬蛋白酶和及上述物質之混合物所組成之群組。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之生物支架，其中該營養物係選自由維生素、礦物質、蛋白質、脂質、碳水化合物、胺基酸、胜肽、核苷酸、脫氧核苷酸、中草藥和及上述物質之混合物所組成之群組。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之生物支架，其中該本體進一步包含一細胞於複數個孔洞中。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之生物支架，其中該複數個細胞為幹細胞、衛星細胞、前驅細胞、祖細胞或組織細胞。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之生物支架，其中該生物材料覆蓋該本體的表面和內部。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之生物支架，其中該本體的第二表面包含一組織膠黏層。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之生物支架，其中該組織膠黏層包含：
    一交聯劑，其具有官能基與該生物支架分子產生交聯；以及
    一阻停劑，其係用以與該交聯劑之該官能基反應。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之生物支架，其中該交聯劑之官能基係選自由胺基(amine)、硫氫基(sulfhydryl)、羰基(carbonyl)、乙二醇基(glycol)、羧基(carboxyl)、疊氮(azide)、亞胺酯(imidoester)、環氧基(epoxide)、醛基(aldehyde)、鹵代乙酰基(haloacetyl)、吡啶二硫化物(pyridyl disulfide)、吡啶二硫代(pyridyldithiol)、醯胼(hydrazide)、光交聯基團(photo-crosslinking group)、碳二醯亞胺(carbodiimide)、雙吖丙啶(diazirine)、氮丙環(aziridine)、丙烯酰基(acryloyl)、芳基(arylate)、硫醇基(thiol)、梔子素(genipin)、核黃素(riboflavin)、類黃酮(flavonoid)及其衍生物、羥甲基膦(hydroxymethyl phosphine)、異氰酸酯類(isocyanate)、馬來亞醯胺(maleimide)、6-(馬來醯亞胺基)己酸活性酯(6-maleimidohexanoic acid active ester)、雙琥珀亞胺醯辛二酸酯[disuccinimidyl suberate,bis(sulfosuccinimidyl)suberate]、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxy-succinimide,NHS-ester)、4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀醯亞胺酯[sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate]、五氟苯酯(pentafluorophenyl ester,PFP-ester)、乙二醇二縮水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether、戊二醛(glutaraldehyde)、2,3-二溴丙酰N-羥基丁二醯亞胺酯(2,3-dibromopropionyl N-hydroxysuccinimide ester)、磺基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(sulfo-N-hydroxysuccinimide ester)、苯丁酸氮芥-N-羥基琥珀醯亞胺酯(chlorambucil-N-hydroxysuccinimide ester)、1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二醯亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)、補骨脂素(psoralen)、乙烯基碸(vinyl sulfone)及其組合所組成的群組。
  19. 如申請專利範圍第17項所述之生物支架，其中該基質分子係選自由膠原蛋白(collagen)、透明質酸(hyaluronan)、明膠(gelatin)、絲蛋白(silk protein)、纖維蛋白(fibroin)、纖維連蛋白(fibronectin)、彈性蛋白(elastin)、細胞粘合素 (tenascin)、層黏連蛋白(laminin)、玻連蛋白(vitronectin)、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、軟骨素(chondroitin)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)、角質素(keratin)、硫酸角質素(keratan sulfate)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate)、卡拉膠(carrageenan)、肝素(heparin)、甲殼素(chitin)、幾丁聚醣(chitosan)、海藻酸鹽(alginate)、蛋白聚醣聚合物(aggrecan)、瓊膠(agarose)、洋菜(agar)、纖維素(cellulose)、甲基纖維素(methyl cellulose)、羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)、肝醣(glycogen)、纖維蛋白、纖維蛋白原、凝血酶、聚麩胺酸、聚離胺酸、聚胺基酸、合成聚合物及上述基質分子之衍生物所組成的群組。
  20. 如申請專利範圍第17項所述之生物支架，其中該基質分子係為一膠原蛋白。
  21. 如申請專利範圍第17項所述之生物支架，其中該阻停劑係選自由胺基酸、寡胜肽、多胜肽、蛋白質、胺類、二胺(diamine)、寡胺(oligoamine)、多胺(polyamine)、羰基化合物(carbonyl compound)、乙二醇化合物(glycol compound)、羧基化合物(carboxyl compound)、二羧酸化合物(dicarboxylate)、寡羧酸化合物(oligo-carboxylate)、聚羧酸化合物(polycarboxylate)、硫醇化合物(sulfhydryl compound)、寡硫醇化合物(oligosulfhydryl compound)、多硫醇化合物(polysulfhydryl compound)、羥基化合物(hydroxyl compound)、寡羥基化合物(oligohydroxyl compound)、多羥基化合物(polyhydroxyl compound)、醣類、寡醣、多醣、核醣核酸(ribonucleic acid,RNA)、去氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)、寡核苷酸、疊氮化合物(azide)、光交聯化合物(photo-crosslinking compound)、及上述所組成的群組；其中該阻停劑之官能基為單種官能基、異雙種官能基或多種官能基。
  22. 一種製備如申請專利範圍第1項所述之生物支架的方法，其中該非重組膠原蛋白基質透過以下步驟，包含：
    一結締組織；
    一去毛囊處理步驟，係將該結締組織浸漬於一含有高離子強度之鹽類溶液中，並加入一蛋白分解酵素；以及
    一膨潤處理步驟，係將去毛囊處理後之該真皮層薄片浸漬於一第一酸性溶液中，以形成一非重組膠原蛋白基質，該非重組型膠原蛋白基質，係具有一複數條束狀膠原蛋白纖維以及由該複數條束狀膠原蛋白纖維構成之複數個槽孔。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之生物支架的方法，其中該結締組織係由該動物 皮膚組織取得一真皮層薄片。
  24. 一種製備如申請專利範圍第22項所述之非重組型膠原蛋白基質的方法，包含：一動物皮膚組織，該動物皮膚組織係為一真皮層薄片；
    一去毛囊處理步驟，係將該結締組織浸漬於一含有高離子強度之鹽類溶液中，並加入一蛋白分解酵素；以及
    一膨潤處理步驟，係將去毛囊處理後之該真皮層薄片浸漬於一第一酸性溶液中，以形成一非重組膠原蛋白基質，該非重組型膠原蛋白基質，係具有一複數條束狀膠原蛋白纖維以及該複數條束狀膠原蛋白纖維構成之複數個槽孔。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之非重組型膠原蛋白基質的方法，其中該含有高離子強度之鹽類溶液的離子強度係大於0.15N。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之非重組型膠原蛋白基質的方法，其中該含有高離子強度之鹽類溶液的離子強度係介於0.5N-10N。
  27. 如申請專利範圍第24項所述之非重組型膠原蛋白基質的方法，其中該含有高離子強度之鹽類溶液包含磷酸鹽溶液、氯化鈉、硫酸銨鹽或上述之混合物所組成的溶液。
  28. 如申請專利範圍第24項所述之非重組型膠原蛋白基質的方法，其中該蛋白分解酵素係選自由絲胺酸酶(serine proteases)、蘇胺酸酶(threonine proteases)、半胱胺酸酶(cysteine proteases)、天門冬胺酸酶(aspartate proteases)、谷胺酸酶(glutamate proteases)、含金屬蛋白酶(metalloproteases)及其混合之混合物所組成的群組。
  29. 如申請專利範圍第24項所述之非重組型膠原蛋白基質的方法，其中該步驟包含一消毒步驟。
  30. 如申請專利範圍第29項所述之非重組型膠原蛋白基質的方法，其中該消毒步驟在脫毛步驟之前或脫脂步驟之後。
  31. 如申請專利範圍第24項所述之非重組型膠原蛋白基質的方法，其中於進行該膨潤處理步驟後更包含一去抗原處理步驟，該去抗原處理步驟為將該真皮層薄片浸漬於一第二酸性溶液中，該第二酸性溶液係含有一胃蛋白酶。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之非重組型膠原蛋白基質的方法，其中於進行該膨潤處理步驟後更包含一強化處理步驟，係將該膨潤處理後之真皮層薄片浸漬於一添加劑中，該添加劑係為交聯劑溶液。
  33. 一種製備生物支架的方法，包含：
    如申請專利範圍第24-32任一項所得的一非重組型膠原蛋白基質；
    在減壓環境使該膠原蛋白和該生物材料結合，以使生物材料包覆在非重組型膠原蛋白基質的一第一表面和一多孔內部。
  34. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該減壓環境係藉由一抽真空動作來完成。
  35. 如申請專利範圍第34項所述之方法，更包含下列步驟：
    取出包覆有該生物材料之該非重組型膠原蛋白基質；
    注入一細胞培養基於該些槽孔；以及
    注入一包含有一細胞之溶液，以使該細胞進入該些槽孔並貼附於該生物材料上。
  36. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該生物材料更係選自一細胞貼附材料、一組織修復材料、一細胞誘導材料、一生長因子材料、一抗菌材料及其組合所組成之群組。
  37. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該非重組型膠原蛋白基質的該第一表面與該生物材料混合，其中該非重組型膠原蛋白基質的該第二表面與一組織膠黏層結合。
  38. 如申請專利範圍第37項所述之方法，其中該組織膠黏層包含
    一交聯劑，其具有官能基；
    至少該非重組型膠原蛋白之一基質分子，其與該交聯劑產生交聯；以及
    一阻停劑，其係用以與該交聯劑之未反應官能基反應。
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