TW202038992A - 穩定生長因子活性的製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種穩定生長因子活性的製備方法，包含將一膠原蛋白加入於一天然生長因子中，再經由一乾燥步驟，取得一長效性的生長因子組合物。該長效性的生長因子組合物於室溫下其生物活性可以維持至少七天。

Description

穩定生長因子活性的製備方法
本發明提供一種穩定生長因子活性的製備方法，以及提供以所述方法製備得到的長效性的生長因子組合物。
生長因子(growth factors)是由一群蛋白質所構成，其藉由結合至特定細胞表面的受體使細胞內或細胞之間訊息傳遞，來調節細胞的生長、分化及其它功能。生長因子有很多種，包括血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)、轉換生長因子(transforming growth factor,TGF)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、幹細胞因子(stem cell factor,SCF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factors,IGF-I,IGF-II)、神經生長因子(nerve growth factor,NGF)、骨塑形蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、群落刺激因子 (colony-stimulating factor,CSF,M-CSF)、腦衍生神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、毛狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor)、紅血球生成素(erythropoietin,EPO)、內皮細胞單核細胞活性多肽(endothelial cell monocytes active polypeptide,endothelial-monocyte activating polypeptide)、表皮中性球活性多肽(epithelial neutrophil activating peptide)、神經膠衍生神經滋養因子(glial derived neurotrophic factor,GDNF)、白血球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,GCSF)、白血球巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GMCSF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、介白素(IL-1、IL-2、IL-3等)、血清素(serotonin)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)等，各種生長因子都有其相對應的受體，因此具有高度專一性。
生長因子的臨床應用非常廣泛，包括促進傷口癒合、協助關節修復、調節牙周組織再生、促進各種組織再生、與再生醫學的細胞治療結合等，以及相關不斷進展的研究甚而癌症治療等。由於各種生長因子的生物活性容易喪失，尤其是未冷凍甚至在室溫下的生長因子穩定性和儲存，對於商業產品而言很重要。科學家通常通過重組基因工程技術或序列標籤設計各種生長因子突變體，[Int.J.Mol.Sci.2012,13,6053-6072]，以人工方式延長生長因子的生物活性，然而，諸如癌症發展等不良反應可能會影響人體的正常狀況。其中，Regranex® Gel即是一種含重組人類血小板衍生生長因子(recombinant human platelet derived growth factor，rhPDGF)的明膠，於1997年美國FDA批准上市，用於治療慢性糖尿病併發的足部潰瘍傷口。
Regranex® Gel中的rhPDGF係將自然存在的PDGF序列進行突變、刪除、置換等基因工程，然後再置入於質體中產生重組蛋白質，因此其生物活性在室溫下可以穩定。雖然Regranex® Gel的價格非常昂貴，使用不便，以及需要低溫保存的特性，但其年產值高達2.7億美元，可見其市場的需求相當龐大。然而，FDA在追蹤超過10年後才正式宣佈Regranex® Gel會增加使用者的罹癌及死亡風險，且所引發的風險高達5倍，由此說明了含有非自然存在序列的生長因子，尤其是有延長儲存活性者，不適用於臨床治療。
然而，天然的生長因子其活性半衰期短，且於常溫下其生物活性會迅速降解，因而限制天然生長因子於臨床治療的應用。Munisso等[https：//doi.org/10.1155/2019/4016351]也建議使用膠原蛋白/明膠海綿(CGSs)提供bFGF的保護和釋放bFGF。然而，他們使用bFGF在CGSs中並不屬於乾燥形式，生物活性只能保護不超過5天。換句話說，7天後bFGF的生物活性明顯下降。
因此，在商業和臨床應用上，一種天然保留生長因子生物活性的方法有很大的需求。本申請提出一種乾燥膠原蛋白和生長因子混合物的自然方法(一種穩定生長因子活性的製備方法)，而生長因子的生物活性可以在室溫下保存至少7天。此外，生長因子的生物活性可以與膠原蛋白等細胞外混合物在室溫乾燥狀態下被保留。且生長因子的生物活性可以在潮濕條件下恢復。
為解決上述問題，本發明提供一種穩定生長因子活性的製備方法，包含：提供一天然生長因子；加入一基質分子(如一膠原蛋白、一膠原蛋白衍生物、一明膠、一透明質酸、或一混合物)於該生長因子中；以及進行一乾燥或冷凍乾燥步驟，以取得一長效性的生長因子組合物。該長效性的生長因子組合物，其活性於室溫下可維持至少七天。
然而，於本發明中，經實驗證實將生長因子與基質分子混合併將混合物進行乾燥或凍乾過程，可以在室溫下穩定天然生長因子的生物活性。
該組合物(長效性的生長因子組合物)放置室溫7天以上後(例如7至20天，1-6個月或12個月以上)，與第0天的生物活性相比，生物活性可以保留70%±30%(例如40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%，99%或100%)。
本發明中所提到的「天然生長因子」，係指該生長因子的序列係自然存在於動物中尤其是人體中，且其胺基酸序列沒有經過突變、刪除、置換等基因工程來改變該序列中的基因密碼。較佳的，此天然生長因子存在其天然活性，如結合其受體並媒介下游訊息。該天然生長因子選自由，但不限制於：血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)、轉換生長因子(transforming growth factor,TGF-α,TGF-β)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、幹細胞因子(stem cell factor,SCF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factors,IGF-I,IGF-II)、神經生長因子(nerve growth factor,NGF)、骨塑形蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、群落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF,M-CSF)、腦衍生神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、毛狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor)、紅血球生成素(erythropoietin,EPO)、內皮細胞單核細胞活性多肽(endothelial cell monocytes active polypeptide,endothelial-monocyte activating polypeptide)、表皮中性球活性多肽(epithelial neutrophil activating peptide)、神經膠衍生神經滋養因子(glial derived neurotrophic factor,GDNF)、白血球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,GCSF)、白血球巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GMCSF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、介白素(IL-1、IL-2、IL-3等)、血清素(serotonin)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)等所組成。
本發明中所提到的「乾燥步驟」，係指以冷凍及乾燥或冷凍乾燥方法。
本發明中所提到的基質分子濃度係介於1至100mg/ml，及「天然生長因子」與「基質分子」的含量或濃度比例為1x10-9至1：1。
本發明中所提到的「基質分子」，係指該基質分子為在細胞外基質中發現的細胞外分子。該基質分子選自由，但不限制於：膠原蛋白，透明質酸，明膠，纖連蛋白，彈性蛋白，肌腱蛋白，層粘連蛋白，玻連蛋白，聚集蛋白聚醣，多肽，硫酸乙酰肝素，軟骨素，硫酸軟骨素，角質素，硫 酸角質素，硫酸皮膚素，角叉菜膠，肝素，甲殼質，殼聚醣，藻酸鹽，瓊脂醣，瓊脂，纖維素，甲基纖維素，羧甲基纖維素，醣原及其衍生物。另外，基質分子可以是纖維蛋白，纖維蛋白原，凝血酶和聚谷胺酸，合成聚合物(例如丙烯酸酯，聚乳酸，聚乙醇酸或聚(乳酸-共-乙醇酸))，絲素蛋白，聚賴胺酸，聚胺基酸。
上述膠原蛋白可以使用任何天然存在的膠原蛋白或其功能變體。目前，已經發現了至少28種遺傳上不同的膠原蛋白。膠原蛋白可以很容易地從富含膠原蛋白的組織(例如人和動物的皮膚，腱，韌帶和骨骼)中分離和純化。分離和純化膠原蛋白的方法是本領域眾所周知的。(參見，美國專利5,512,291；美國專利公開號20040138695；Methods in Enzymology,vol.82,pp.33-64,1982；The Preparation of Highly Purified Insoluble Collagen,Oneson,I.,et al.,Am.Leather Chemists Assoc.,Vol.LXV,pp.440-450,1970；U.S.Pat.No.6,090,996)。膠原蛋白也可以通過重組技術來製備，例如Advanced Tissue Sciences(La Jolla,Calif.)所敘述方法，或購自市售供應商(例如，Fibrogen；South San Francisco,Calif.)。
，包含生長因子和基質分子水溶液，和選自一種或其他多種任選材料可以於pH2-10(例如pH5-8)的緩衝溶液中製備。可使用低離子溶液，例如含0.135M的氯化鈉。
上述溶液進行乾燥處理使溶液中去除水，可以使用本領域已知的任何合適的乾燥方法，例如，冷凍與乾燥，凍乾，真空乾燥等。
本發明之一實施例中，於較佳實施例中其中該乾燥步驟係採用冷凍乾燥法。
本發明之一實施例中，其中該膠原蛋白的濃度為1-100毫克/毫升，且該天然生長因子與該膠原蛋白的濃度比為1x10-9到1：1。
本發明之一實施例中，可進一步將該固狀或膠狀的生長因子組合物儲存於-80~37℃中。
本發明進一步提供一種長效性的生長因子組合物，其係以本發明所提供之製備方法製備而成，包含：一生長因子；以及一生物材料。其中，所述長效性係指該生長因子組合物的生物活性於室溫下可以保留至少七天。於較佳實施例中，該生長因子與該生物材料的濃度比為1x10-3~1x10-6：1。
本發明之一實施例中，其中該生物材料係為膠原蛋白。於較佳實施例中，該膠原蛋白的濃度為3~60毫克/毫升。
本發明之一實施例中，該生長因子係選自由，但不限制於：血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)、轉換生長因子(transforming growth factor,TGF-α，TGF-β)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、幹細胞因子(stem cell factor,SCF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、神經生長因子(nerve growth factor,NGF)、骨塑形蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、群落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF,M-CSF)、腦衍生神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、毛狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor)、紅血球生成素(erythropoietin,EPO)、內皮細胞單核細胞活性多肽(endothelial cell monocytes active polypeptide,endothelial-monocyte activating polypeptide)、表皮中性球活性多肽(epithelial neutrophil activating peptide)、神經膠衍生神經滋養因子(glial derived neurotrophic factor,GDNF)、白血球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,GCSF)、白血球巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GMCSF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、介白素(IL-1、IL-2、IL-3等)、血清素(serotonin)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)等所組成。
本發明之一實施例中，可進一步將該長效性的生長因子組合物儲存於-80~37℃中。
〔圖1〕顯示生長因子儲存於-80℃在第0天和第7個月的生物活性測量結果。
〔圖2〕顯示生長因子在經過不同次數的冷凍解凍過程後的生物活性測量結果。
〔圖3〕顯示生長因子儲存在室溫經過不同時間點下的生物活性測量結果。
〔圖4〕顯示不同濃度的生長因子加入膠原蛋白後的生物活性測量結果。
〔圖5〕顯示在室溫6小時下，測得不同濃度的生長因子與3mg/mL膠原蛋白組合後凍乾，與PDGF溶液的生物活性相比結果。
〔圖6〕顯示不同製備方式所得到的生長因子之生物活性測量結果。在生物活性測定前，將三種濃度的生長因子與膠原蛋白一起或個別進行冷凍乾 燥，並與各自的生長因子水溶液一起在室溫下保存0、1、2、3、7天。
〔圖7〕顯示所示各種生長因子的生物活性測量結果。生長因子、膠原蛋白含量及其保存條件，如圖下方所標示之實驗條件。
〔圖8〕顯示所示各種生長因子的生物活性測量結果。生長因子、膠原蛋白含量及其保存條件，如圖下方所標示之實驗條件。
出乎意料地發現，通過將生長因子與基質分子混合併將混合物進行乾燥或凍乾過程，可以在室溫下穩定天然生長因子的生物活性。
實施例1、重組人PDGF B(rhPDGF B)表達載體的構建以及rhPDGF B蛋白的純化
利用PCR(聚合酶鏈鎖反應)方法從pCMV-SPORT6(Invitrogen,Grand Island,NY USA)取得天然的hPDGF B線性DNA片段基因序列編碼，正股引子為(5'-GGA TTC AGC CTG GGT TCC CTG ACC ATT-3'；SEQ ID號：1)和反股引子(5'-GCA GCT GCA CGG CCT GTG ACC TGA-3'；SEQ ID NO：2)，其中引入了EcoRI位點。所得的rhPDGF B cDNA片段用EcoR I(日本，TaKaRa)限制酶切雙位點，透過瓊脂醣凝膠電泳進行純化，並克隆到pPICZαA中產生，得到pPICZαA/rhPDGF B。小規模製備質體，用限制酶消化，連接和轉化的程序均遵循標準方法。使用2.5U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)進行PCR，最終體積為50μL，使用以下條件：95℃ 10分鐘，30個循環(95℃進行60秒，55℃進行30秒和72℃進行60秒)，最後在72℃下延伸反應7分鐘。
X33的電滲透及重組菌株的篩選
將質體pPICZαA/rhPDGF B用Sac I線性化，並根據供應商的指示使用電滲透方法轉化到畢赤酵母菌株X33(yeast Pichia pastoris strain X33)中。然後將轉化的細胞接種到含有100μg/mL zeocin的YPDS(酵母膏腖葡萄糖瓊脂培養基)上，並在30℃孵育至少3天。將單個菌落同時轉移到最小甲醇培養基(MM)和最小葡萄糖培養基(MD)盤上，以測試其甲醇利用表現。將MM和MD平板在30℃下孵育2天，以區分Muts和Mut+重組型。通過菌落PCR篩選含有rhPDGF B基因的重組菌株。以小規模表達選擇了幾個具有最大表達rhPDGF B量的Mut+表現型的菌落，並將其儲存在含有15%甘油的YPD中，以進行下一步的規模培養。
酵母中的rhPDGF B過度表達
選擇具zeocin-resistant轉化型的菌落，接種到含100μg/mL zeocin的5mL酵母提取物-蛋白-葡萄糖(YPD)液體培養基(1%酵母提取物，2%蛋白腖，2%葡萄糖)中，在30℃下生長到靜止時期後，接種於300mL緩衝的甘油複合培養基(BMGY)。在30℃下進行100rpm搖動培養後，將細胞以3,000×g離心10分鐘，然後將沉澱顆粒再懸浮培養於1000mL緩衝的甲醇複合培養基(BMMY)中，直至OD600數值為1。細胞在30℃下成長到72小時，每24小時加入甲醇至終濃度0.5~1%(v/v)，以誘導目標蛋白的表達。72小時後，以3,000×g離心5分鐘去除細胞，並收集上清液。對於重組蛋白檢測，以15%(w/v)SDS-PAGE分析上清液。
預期成熟蛋白質的分泌會導致蛋白質醣基化。該構建體包含酵母α因子啟動子，該啟動子誘導rhPDGF B蛋白的分泌，為成熟rhPDGF B的序 列，起始於胺基酸位置1的谷胺酸。
從酵母菌中純化rhPDGF B蛋白
預先以緩衝液(0.01M磷酸鈉，1.5M硫酸銨；pH 6)平衡管柱(GE Healthcare,Piscataway,美國紐澤西)後，將培養上清液添加到苯基管柱內。上樣後，使用相同緩衝液但以1.5~0M的硫酸銨線性梯度洗脫蛋白質。使用60mL/h的流速收集活性成分(5mL)。在4℃下以20,000×g離心30分鐘後，使用AKTA Explorer 10S系統將每個樣品上樣到CM-Sepharose(GE Healthcare，Piscataway，美國紐澤西)，其已預先經0.01M磷酸鈉緩衝液(pH 6)平衡。以含有1M NaCl的相同緩衝液洗脫含有rhPDGF B的成分，並以120mL/h的流速收集。含有rhPDGF B的洗脫液用過濾裝置濃縮，在4℃下以3,000×g離心60分鐘，並通過15%SDS-PAGE以考馬斯亮藍法分析。使用山羊抗His抗體(1：1000)(Clontech,Mountain View，美國加州)檢測攜帶有6-His標籤的rhPDGFB蛋白質印跡，其於畢赤酵母轉化型的培養上清液中過表達rhPDGF B-6His。純化的rhPDGF B含量以牛血清白蛋白(BSA)為標準，通過BCA蛋白分析確定。
實施例2、利用PDGFRβ過度表達的冷光酶報導細胞檢測PDGF生物活性
293-SL/PR細胞係是在293T細胞表面表達PDGF受體PDGFRβ的轉化細胞系。293-SL/PR細胞以1×104細胞/cm2的密度接種到培養盤中。細胞在含有10%FBS(胎牛血清)的DMEM(達爾伯克氏必需基本培養基)中培養20小時待細胞貼附後移除血清，再培養16小時後，在含有2%FBS的DMEM中添加不同濃度的PDGF，並在37℃下於5%CO2的培養箱中培養細胞。在不 同時間點，將細胞在室溫下用一倍的細胞裂解緩衝液(Promega)震盪裂解15分鐘，然後在4℃以13,680×g離心10分鐘。將冷光酶分析試劑(100μL；Promega)添加到20μL上清液中，並以冷光光度計(Berthold)測量生物發光。
實施例3、低溫下的生物活性測試
請參考圖1，將實施例2所製備出的生長因子，以冷光酶檢測法測量其生物活性(第0天)，隨後儲存於-80℃中，並於七個月後再次測量其生物活性。結果顯示，不同濃度(0ng/mL、18ng/mL、180ng/mL)的生長因子，在第0天以及七個月後，其生物活性沒有明顯差異。另外，將實施例1所製備出的生長因子，在重複的冷凍(-80℃)-解凍(0℃)方式處理下，測量其生物活性，結果如圖2所示，圖中空白組則為含0ng/mL的生長因子。不同濃度(18ng/mL、180ng/mL)的生長因子，在進行1次、2次或3次的冷凍-解凍過程後，其生物活性並沒有減少。綜合以上結果可知，生長因子的生物活性於低溫儲存下能維持至少七個月，且於重複的冷凍解凍過程中皆具有相當的穩定性。
實施例4、在室溫或以上的生物活性測試
由於PDGF溶液儲存在-80℃下的生物活性非常穩定，且不受反覆冷凍解凍之影響。將實施例1所製備出的生長因子，用DMEM培養液溶解並稀釋至180ng/mL，於37℃下分別培養0、2、4、6、12、24、36和48小時後，以Human PDGF-BB FlowCytomix Simplex Kit(Invitrogen)和流式細胞儀來測量其生物活性，結果顯示生長因子的生物活性於室溫以上非常不穩定，請參考圖3。
另外，若將實施例1所製備出的生長因子，先用DMEM培養液溶解並稀釋至180ng/mL，再加入9mg/mL膠原蛋白(即生長因子+膠原蛋白組)，於37℃下培養6小時，測量其生物活性，如圖4所示。結果顯示，在相同濃度下(180ng/mL)，沒有添加膠原蛋白的生長因子(即生長因子組)，其生物活性較高，而且即使將9mg/mL膠原蛋白分別加入到900ng/mL、1800ng/mL、9000ng/mL的生長因子溶液中，其生物活性亦沒有隨著生長因子的濃度增加而相對地增加(表一)。以上結果顯示，在生長因子溶液中加入生物材料(如膠原蛋白)，可能使得生長因子活性有緩釋效果，且並不會因為生長因子濃度的提升而提高緩釋出的生長因子活性。
表一
Figure 108148439-A0202-12-0013-1
實施例5、室溫下穩定生長因子組合物的製備
將實施例1所製備出的天然生長因子，加入膠原蛋白，再進行冷凍乾燥。製備各100μL溶液，分別包含3mg/mL膠原蛋白和不同濃度的生長因子(0、30、60、90、120、150、180、360或900ng/mL)。參見表2。將膠原蛋白與生長因子混合溶液在-80℃下冷凍8小時，然後通過冷凍乾燥機凍乾。冷凍乾燥機的條件如表3所示。
表二
Figure 108148439-A0202-12-0014-2
表三
Figure 108148439-A0202-12-0014-3
圖5的結果顯示，生長因子溶液對照組於120ng/mL下具有較高的生物活性(3.4×105RLU/sec)，然而，隨著生長因子濃度的增加，其生物活性則相對減少，顯示有抑制現象的產生。而在實驗組，生長因子在濃度為30ng/mL時具有3.1×105RLU/sec的生物活性，且隨著生長因子濃度的增加，其生物活性相對增加。除此之外，使用與膠原蛋白凍乾的各種濃度的生長因子的生物活性均高於其相應的生長因子溶液的生物活性。結果表明凍乾膠原蛋白保留了生物活性。
以0、60、及180ng/mL不同濃度的生長因子製備成三種型式，水溶液、凍乾粉末、及與膠原蛋白凍乾之組合物，於室溫下分別培養0、1、2、3和7天，甚至長達6個月後，其中生長因子的生物活性以冷光酶活性分析檢測，如圖6所示。樣品用於處理293-SL/PR細胞30分鐘後偵測冷光酶活性。生長因子凍乾粉末組僅有基礎冷光酶活性，對照組的生長因子溶液在一天前顯示初始冷光酶活性，而與膠原蛋白凍乾之組合物顯示儲存達6個月的穩定冷光酶活性(數據未顯示)。圖6，生長因子於60ng/mL以及180ng/mL的水溶液組，在第0天時皆顯示具有生物活性。然而在培養開始後，其生物活性急速下降，至培養1天後，其生物活性即與冷凍乾燥組的生長因子相同。與對照組60ng/mL相比，實驗組60ng/mL生長因子與膠原蛋白凍乾組合物的生物活性較對照組高，且其生物活性在培養1天後不減反增，並且可維持至少七天/維持6個月，而在180ng/mL的實驗組中亦有相同現象。
由以上結果顯示，加入膠原蛋白後再進行冷凍乾燥(本發明製備方法)所製備出的組合物於室溫下具有較高的生物活性，且其生物活性具高度穩定性。
實施例6、天然生長因子之製備
部分天然生長因子購自商業來源；部分人的天然生長因子購自美國Addgene總部或其他資源，構建並篩選了生長因子基因的表達載體。在酵母表達系統或其他合適的表達系統如CHO細胞系統和昆蟲系統中表達。將表達的生長因子蛋白純化，純化後，將生長因子蛋白等分並保存在-80℃，以保持其活性可供使用。
實施例7、乾燥製備法
將實施例1所製備出的天然生長因子在-80℃冷凍進行冷凍乾燥。冷凍乾燥程序包括通過在真空條件下或非常低的壓力下冰晶昇華而從生長因子中除去水分。為了與膠原蛋白混合，採取兩種步驟：(1)首先將溶液中的膠原蛋白和生長因子混合，然後進行乾燥步驟以在低氣壓下蒸發水氣或使用凍乾機進行冷凍乾燥步驟；(2)首先將膠原蛋白乾燥，然後浸入或噴灑生長因子溶液，然後進行如上所述的乾燥步驟。
實施例8、透過細胞增殖進行生物活性測量
將NIH3T3細胞以1.2×104細胞/cm2的密度接種在48孔培養盤中。細胞在DMEM-10%FBS培養基貼附24小時後，將不同濃度生長因子與DMEM-1%FBS在37℃下於5%CO2的培養箱中培養。培養3天後，用無菌水裂解細胞，並在-80℃和室溫之間的凍融循環釋放DNA。將DNA樣品轉移至黑色螢光檢測板後，將每2μg/ml Hoechst 33258與1倍TNE緩衝液混合加入每個孔中，並在365nm激發波長和460nm發射波長下檢測螢光強度。上述DNA檢測的細胞數量可以由已知細胞數的DNA標準曲線求得。
透過上述細胞增殖試驗檢測生長因子的生物活性(參閱圖7、圖8)，在3天的測定期內，生長因子對細胞增殖的功效與它的生物活性。將100ng/mL(圖7)或500ng/mL(圖8)的各種生長因子與10mg/mL或60mg/mL的膠原蛋白溶液混合或滴在已乾燥膠原蛋白上，然後通過離心真空系統蒸發。圖7和圖8顯示了6個實驗組和每個生長因子的結果：(1)製備新鮮的生長因子溶液，(2)在凍乾前將生長因子與10mg/mL膠原蛋白預混合後，並在使用前保存在-80℃，(3)在凍乾前將生長因子與60mg/mL膠原蛋白預混合，並在使用前於-80℃保存，(4)將生長因子加入乾燥的膠原蛋白(60 mg/mL)中，並在使用前凍乾並保存於-80℃，(5)與(3)相同，但在使用前於室溫下保存1週，(6)與(4)相同，但在使用前於室溫下保存1週。
圖7和圖8中的結果證明，水溶液中的生長因子aFGF，bFGF，VEGF165，VEGF121，PDGF和EGF的生物活性確實低於相對應的生長因子與膠原蛋白組合物的生物活性。儘管對於不同生長因子的生物活性有所不同，但是較高數量的膠原蛋白保留較多生長因子的生物活性。比較圖7和圖8中的第三條至第六條。生長因子和膠原蛋白混合的乾燥組合物的儲存溫度對生長因子的生物活性沒有顯著影響。比較圖7和圖8中各生長因子的第3和第4條(-80℃儲藏)與相對應的第5和第6條(室溫下儲藏)的數據。結果表明，生長因子的乾燥組合物在室溫下保存仍可以保留其生物活性。膠原蛋白和生長因子混合物應保持乾燥，但是乾燥的方法之間沒有顯著差異。
目前發現，在乾燥狀態下與膠原蛋白混合後的生長因子其生物活性可以保存多年，並且觀察到相似的生物活性水平可以維持至少12個月。更進一步發現，在各種環境下，生長因子與明膠或膠原蛋白衍生物混合對其生物活性保存可以達到與膠原蛋白組合物相同的效果。藉由乾燥狀態的方式，使混合的膠原蛋白與生長因子達到生物活性的保留，因此合理地推斷，可以其它材料如其它細胞外基質來保留生長因子的生物活性。
實施例9、生長因子的生物活性可以被其它基質分子穩定化
首先，分別製備含有15毫克/毫升的1560KDa透明質酸(20μl)，10毫克/毫升的明膠或10毫克/毫升的白蛋白，且其中包含100或500ng/mL的生長因子(bFGF和EGF)，並分別將其加入兩個48孔培養盤中。將培養盤在-80℃下冷凍4小時後再凍乾2小時。一培養盤在25℃下保存2天，另一培養盤在 -80℃下保存。
將NIH3T3(1.2×104細胞/cm2)接種到48孔培養盤中，並與含有10%FBS的DMEM培養直至細胞貼附。接下來將培養基換成含有各指示濃度和條件之生長因子於1%FBS的DMEM中。培養到第4天，將細胞如上述以凍融循環裂解釋出DNA。用TNE緩衝液(10mM Tris-鹼，1mM EDTA，200mM NaCl，pH 7.4)製備Hoechst 33258(Advancing Assay Technologies Bioquest)，將其加入培養盤中並在室溫下靜置10分鐘。在365nm激發波長和460nm發射波長(MDI SpectraMax M2e)下獲取螢光讀數。

Claims (24)

  1. 一種穩定生長因子活性的製備方法，包含：
    提供一種溶液，包含一生長因子和一基質分子；其中該天然生長因子與該基質分子的濃度比為1：1至1x10-9：1；以及
    進行一乾燥步驟，以取得一長效性的生長因子組合物。
  2. 如申請專利範圍第1項之製備方法，其中該乾燥步驟係採用冷凍乾燥法。
  3. 如申請專利範圍第1項之製備方法，其中所述基質分子為一膠原蛋白、一膠原蛋白衍生物、一明膠、一透明質酸或其組合。
  4. 如申請專利範圍第1項之製備方法，其中該基質分子濃度為1至100mg/ml。
  5. 如申請專利範圍第4項之製備方法，其中該基質分子濃度為3至60mg/ml。
  6. 如申請專利範圍第1項之製備方法，其中該生長因子的濃度為1ng/mL至1μg/mL。
  7. 如申請專利範圍第1項之製備方法，其中該生長因子與該基質分子的比例為1.67×10-8至3.33×10-4：1。
  8. 如申請專利範圍第1項之製備方法，進一步將該長效性的生長因子儲存於-80℃~37℃中。
  9. 如申請專利範圍第1項之製備方法，其中所述基質分子是膠原蛋白。
  10. 如申請專利範圍第1項之製備方法，其中該長效性的生長因 子係指其生物活性於室溫下可保留至少七天。
  11. 如申請專利範圍第1項之製備方法，其中該天然生長因子係選自由血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)、轉換生長因子(transforming growth factor,TGF-α,TGF-β)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、幹細胞因子(stem cell factor,SCF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factors,IGF-I,IGF-II)、神經生長因子(nerve growth factor,NGF)、骨塑形蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、群落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF,M-CSF)、腦衍生神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、毛狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor)、紅血球生成素(erythropoietin,EPO)、內皮細胞單核細胞活性多肽(endothelial cell monocytes active polypeptide,endothelial-monocyte activating polypeptide)、表皮中性球活性多肽(epithelial neutrophil activating peptide)、神經膠衍生神經滋養因子(glial derived neurotrophic factor,GDNF)、白血球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,GCSF)、白血球巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GMCSF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、介白素(IL-1、IL-2、IL-3等)、血清素(serotonin)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)等所組成。
  12. 如申請專利範圍第1項之製備方法，其中該溶液進一步包含 一材料，該材料係選自由一細胞附著材料、一組織修復材料、一細胞誘導材料，一抗菌材料及其組合組成的材料。
  13. 一種長效性的生長因子組合物，係以專利範圍第1-12項所述製備方法製備而成，包含：
    一生長因子；以及
    一基質分子；
    其中該生長因子與該膠原蛋白的濃度比為1：1~10-9：1，並且保留了生長因子的生物活性。
  14. 如申請專利範圍第13項之生長因子組合物，其中所述基質分子為一膠原蛋白、一膠原蛋白衍生物、一明膠、一透明質酸或其上述組合。
  15. 如申請專利範圍第14項之生長因子組合物，其中所述基質分子係為膠原蛋白。
  16. 如申請專利範圍第15項之生長因子組合物，其中該膠原蛋白濃度為3mg/ml到60mg/ml。
  17. 如申請專利範圍第13項之生長因子組合物，其中該生長因子係選自由血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)、轉換生長因子(transforming growth factor,TGF-α,TGF-β)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、幹細胞因子(stem cell factor,SCF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factors,IGF-I,IGF-II)、神經生長因子(nerve growth factor,NGF)、骨塑形蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、群落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF,M-CSF)、腦衍生神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、毛狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor)、紅血球生成素(erythropoietin,EPO)、內皮細胞單核細胞活性多肽(endothelial cell monocytes active polypeptide,endothelial-monocyte activating polypeptide)、表皮中性球活性多肽(epithelial neutrophil activating peptide)、神經膠衍生神經滋養因子(glial derived neurotrophic factor,GDNF)、白血球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,GCSF)、白血球巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GMCSF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、介白素(IL-1、IL-2、IL-3等)、血清素(serotonin)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)等所組成。
  18. 如申請專利範圍第13項之生長因子組合物，進一步將該長效性的生長因子組合物儲存於-80℃~37℃中。
  19. 如申請專利範圍第13項之生長因子組合物，其中該長效性係指其生物活性於室溫下可保留至少七天。
  20. 如申請專利範圍第13項之生長因子組合物，其中該生長因子組合物進一步包含一材料，該材料係選自由一細胞附著材料、一組織修復材料、一細胞誘導材料，一抗菌材料及其組合所組成的材料。
  21. 如申請專利範圍第20項之生長因子組合物，其中該抗菌材料是抗生素、抗菌蛋白、抗菌肽或其組合。
  22. 如申請專利範圍第20項之生長因子組合物，其中該細胞附著材料為一醣類、一胜肽、一蛋白質、一磷脂質或其上述組合。
  23. 如申請專利範圍第22項之生長因子組合物，其中該醣類是一醣胺聚多醣材料。
  24. 如申請專利範圍第23項之生長因子組合物，其中，該醣胺聚多醣係選自由軟骨素、硫酸軟骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸乙酰肝素蛋白聚醣、透明質酸及其上述組合。
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