KR20210122242A - 생물학적 스캐폴드 및 이의 제조 방법 - Google Patents

생물학적 스캐폴드 및 이의 제조 방법 Download PDF

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KR20210122242A
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린 엘.에이치. 후앙
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엑셀 메드, 엘엘씨
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Abstract

본 발명의 생물학적 스캐폴드는 본체, 생물재료 층 및 선택적 조직 접착층을 포함한다. 본체는 적어도 비-구성 콜라겐 기질을 가진다. 생물재료 층은 적어도 본체의 표면상에 코팅되고, 본체의 다른 표면상에 적어도 조직 접착층이 배치된다. 생물학적 스캐폴드가 조직 접착층을 통해 조직에 부착되면 조직으로부터 다수의 세포가 조직 복구 또는 재생을 위해 접착층 또는 생물재료 층으로 이동한다.

Description

생물학적 스캐폴드 및 이의 제조 방법
본 발명은 비-재구성 콜라겐 기질과 생물재료(biomaterial), 및 선택적으로 조직 접착층을 포함하는 생물학적 스캐폴드(biological scaffold) 및 이의 제조 방법을 제공한다. 특히, 이러한 비-재구성 콜라겐 기질(non-reconstituted collagen matrix) 및 생물학적 스캐폴드는 상처 치유를 촉진하기 위한 드레싱으로서 유용하다.
조직 공학은 합성 또는 생물학적 활성 물질을 사용하여 시험관 내 배양 또는 구성 기술을 통해 장기 및 조직을 재구성하거나 복구(repairing)하는 것에 관한 것이다. 조직 공학은 생물학, 재료 과학 및 공학과 같은 다양한 학문을 포함하며 뼈, 연골, 피부, 신장, 간, 소화관, 각막, 근육 및 유방과 같은 조직을 재구성할 수 있다. "재생 의학"이라고도 하는 조직 공학에 대한 기본 접근 방식은 다음 단계들로 이루어진다: 먼저, 세포(cell)를 인체에서 제거하고 이의 세포를 충분한 수에 도달할 때까지 시험관 내에서 배양한다. 그런 다음, 세포를 인공 스캐폴드에 배치하고 성장시킨다. 때로는 세포 분화를 촉진하기 위해 일부 화학적 또는 생물학적 요인을 추가해야 하는 경우도 있다. 마지막으로, 인공 조직을 환자에게 주입한다. 따라서 조직 재생의 세 가지 요소는 세포, 생물학적 스캐폴드 및 성장 인자이다.
이중에서 인체의 가장 기본적인 구조와 기능을 구성하는 단위는 세포이다. 세포 사이에는 세포 자체에 의해 생성되는 세포 외 기질이 존재한다. 이것은 단백질 피브릴(protein fibril)/다발 (예를 들면, 콜라겐), 결정성 무기 광물 등의 구조 성분을 포함하는 물질이다.
조직은 유사한 형태와 기능을 가진 많은 세포로 이루어져 있으며 세포 외 기질을 통해 함께 결합한다. 이들은 이종 세포형에 따라 상이한 조직, 예를 들어 상피 조직, 결합 조직, 근육 조직, 신경 조직 등으로 분열된다. 그 중 결합 조직은 많은 수의 세포 외 기질과 그 안에 산재된 세포로 구성되어 있다. 세포 외 기질은 기질, 피브릴, 조직액 등을 포함한다. 콜라겐은 동물 결합 조직에서 가장 중요한 구조 단백질이며, 세포 외 기질에서 가장 중요한 구성 요소이다. 동물 결합 조직에는 물 60 내지 70% 외에도 콜라겐이 20 내지 30% 함유되어 있다. 따라서, 콜라겐은 동물에 널리 존재하는 단백질이고, 결합 조직은 인체에 광범하게 분포되어 있으며 거의 모든 장기에서 발견된다.
콜라겐은 주로 불용성 피브릴의 형태로 존재하며 인간 조직에서 단백질의 약 33%를 차지한다. 즉, 콜라겐은 인체 단백질의 1/3을 차지하며 결합 조직에서 매우 중요한 구조 단백질이다. 이것은 다양한 조직을 보호하고 연결하여 인체의 구조를 지탱하는 "매트리스(mattress)"와 "시멘트(cement)"의 역할을 한다. 따라서, 콜라겐은 보통 생체인공삽입물용 물질로 사용된다.
콜라겐의 가장 기본적인 단위는 3 개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 분자인 트로포콜라겐이다. 3 개의 폴리펩티드 사슬은 사슬 간 수소 결합에 의해 평행하게 서로 단단히 결합되어 안정한 삼중 나선 구조를 형성한다. 삼중 나선 사슬의 콜라겐 단위는 직경이 약 1.5 nm이고 길이가 약 280 nm인 트로포콜라겐으로 불린다. 생리적 상태에서, 다중 트로포콜라겐 분자는 콜라겐 미소피브릴 구조로 자기 응집되며, 각 분자는 약 67 nm의 거리에서 엇갈려 배치되어 있다. 미소피브릴은 다양한 직경, 일반적으로 약 50 nm의 피브릴로 응집될 수 있다. 체내에서 피브릴은 상이한 4 차 구조로 쌓여 있으며, 이는 표피 세포 아래에 기질과 같은 망상 피브릴을 형성할 수 있다. 이러한 피브릴은 단일 방향으로 규칙적으로 배열된 콜라겐 피브릴을 포함하는 인대 및 힘줄과 같은 섬유로 추가로 응집될 수 있다.
지금까지 발견된 동물성 콜라겐은 적어도 28 종으로 나누어질 수 있다. 주로 II 형 콜라겐인 유리질 연골을 제외하고, 대부분의 결합 조직은 주로 I 형 콜라겐을 포함하는데 이는 총 콜라겐 함량의 약 90%를 차지하며 가장 널리 사용되는 콜라겐 생물재료이기도 하다. 이의 주요 구조 단백질은 결합 조직에 장력, 인장, 강도, 점탄성 등과 같이 결합 조직에 필요한 지지, 보호 및 다양한 기계적 특성을 제공한다. 생화학적 특성 측면에서, 이는 응고 캐스케이드(coagulation cascade)를 촉진하고 혈전 형성을 촉매화할 수 있다. 콜라겐의 기능에는 분자 투과성 조절, 상처 치유 및 조직 복구 촉진, 및 세포와 조직의 생리적 기능 조절이 포함된다.
기존 콜라겐 기질의 제조 방법, 예컨대 중국 특허 제476642호의 다공성 콜라겐 기질의 제조 방법은 유사한 생리적 조건으로 30 내지 45 ℃에서 콜라겐 기질을 재구성하는 것이다. 다공성 콜라겐 기질은 이러한 기질을 냉동 및 동결 건조하여 얻을 수 있다. 도 3은 기존 다공성 콜라겐 기질을 100 배로 확대한 전자 현미경 사진을 나타낸다. 이의 외형은 느슨하고 불규칙한 박리 모양을 나타내는 구조를 가지고 있으며 적절한 세포의 이동 및 증식을 최적화하는 데 필요한 더 나은 장력 및 세포 수축성을 제공하지 않는다. 또한 콜라겐의 표면 특성으로 인해 세포 진입에도 불리하다.
미국 특허 제5,997,895호에 따른 "콜라겐 기질을 사용한 경막/수막 복구 산물 (Dural/meningeal repair product using collagen matrix)"의 또 다른 종래 기술은 수막 성장을 복구 및 촉진하는 방법을 제공한다. 병원성 바이러스 잔해가 없는 입증된 생체적합성 콜라겐 공급원이 사용될 수 있다. 가교결합 반응(cross-linking reaction)이 콜라겐 기질에 사용되며 10 내지 500 ㎛의 다공성 직경을 가지는 다공성 콜라겐 구조가 형성되어 손상된 수막을 복구하고 수막의 성장을 촉진할 수 있다. 그러나, 콜라겐은 돼지 피부 등과 같은 동물 피부의 진피층에서 채취되기 때문에, 돼지 피부 가공 과정에서 모낭이 완전히 제거되지 않으면, 콜라겐 기질의 후속 제제의 전체 구조가 파괴될 수 있을 것이다. 또한, 제조된 콜라겐의 순도에 영향을 주어 세균 감염 및 면역 반응을 유발하거나 임상 사용시 면역 거부 반응을 유발할 수 있다.
"고순도 콜라겐 제조 (Preparation of high purity collagen)"란 명칭의 대만 특허 제098125217호는 다음 단계를 포함하는 콜라겐 제조 방법을 제공한다: 표면적 20 ㎟ 내지 2 ㎡의 결합 조직을 제공하는 단계; 제 1 산성 용액을 사용하여 결합 조직의 부피를 적어도 50% 팽창시켜 팽창된 결합 조직을 형성하는 단계 (여기서, 산성 용액의 pH 값은 1 내지 6이고, 산성 용액은 실질적으로 염을 함유하지 않는다); 팽창된 결합 조직을 세척하여 비-콜라겐성 물질을 제거함으로써 콜라겐 기질을 형성하는 단계; 및 이 후 추출 용액을 이용하여 콜라겐 기질로부터 콜라겐을 추출하여 콜라겐 함유 용액을 제조하는 단계. 전술한 기술에서, 용액은 콜라겐이고, 통상적인 방법으로 형성된 다공성 콜라겐 기질은 적절한 세포의 침투 및 증식을 최적화하기 위해 필요한 세포의 더 나은 장력 및 수축 방지를 제공하지 못한다.
"무세포 진피 기질 및 이식을 위한 이의 사용 방법 (Acellular dermal matrix and method of use thereof for grafting)"이란 명칭의 또 다른 미국 발명 특허 공개 제US8067149B2호는 무세포 조직 기질을 추출하는 방법을 제공하고 모낭을 제거하고 계면활성제 SDS로 추출하는 것을 포함한다. 그러나, 본 발명의 다공성 고순도 콜라겐 기질과는 다른 무 세포 조직 기질이 추출된다.
현재의 일반적인 생물학적 스캐폴드 상황은 다음과 같다.
현재, 시판중인 대부분의 생물학적 스캐폴드는 재구성된 콜라겐 기질로 구성되어 있으며, 이의 관련 제품이 많은 이전 특허에서 개시되었다. 예를 들어, 미국 특허 제4,193,813호에서는, 콜라겐을 먼저 아세트산에 용해시키고 글루타르알데히드로 가교결합시킨 다음 저온에서 장시간 (예를 들면, 20 시간)동안 냉동시킨다. 해동 후, 물을 기계적으로 제거하여 스폰지상 기질을 형성하는데, 이 방법으로 수득한 기질의 기공(pore) 크기는 약 80 내지 1400 ㎛이다. 미국 특허 제4,412,947호는 아세트산 용액에 고순도 불용성 콜라겐 미립자를 현탁시키고, 분당 약 0.3 내지 0.4 ℃의 냉각 속도로 -65 ℃까지 냉동시키고, 동결 건조하여 다공성 시트 기재를 형성하는 방법을 교시한다. 미국 특허 제4,522,753호는 콜라겐과 콘드로이틴 설페이트를 공중합체로 혼합하고, 글루타르알데히드로 가교결합한 후 동결 건조시켜 인공 피부 기질로 사용할 수 있는 약 20 내지 180 ㎛의 기공 크기를 갖는 다공성 기질을 수득한다고 교시한다. 미국 특허 제4,970,298호는 산 용해성 콜라겐 용액 또는 산 용해성 콜라겐, 히알루로난(hyaluronan) 및 피브로넥틴의 용액 등을 포함하는 혼합 용액을 카보디이미드와 탈수열법에 의해 가교결합시킬 수 있음을 교시한다. 상이한 온도에서 냉동시킨 후 동결 건조를 이용하여 다공성 기질을 만든다. 냉동 온도는 -30 내지 -50 ℃이고, 수득된 기질의 기공 크기는 약 50 내지 250 ㎛이며, 히알루로난 또는 피브로넥틴을 함유하는 콜라겐 기질의 기공 크기는 100 내지 150 ㎛이다. 상기 특허에 개시된 콜라겐 기질의 제조 방법은 주로 고온 또는 화학적 가교결합제에 의해 가교결합된 산성 또는 알칼리성 콜라겐을 사용하고 동결 건조에 의해 기공을 생성하여 다공성 기질을 수득한다. 이러한 방법으로 제조된 기질은 기공의 균일성이 좋지 않고 기공 크기를 제어하기가 어렵다. 더욱이, 사용되는 대부분의 화학 가교결합제는 독성이 있다. 재구성된 콜라겐 미소피브릴 또는 피브릴은 기질에 제한된 지지력, 보호 및 다양한 기계적 특성, 예컨대 장력, 인장, 강도 및 점탄성을 제공하기 때문에 임상 적용에 적합하지 않다.
비-재구성 콜라겐 기질은 임상 적용에 높은 산업적 가치를 가지며, 이러한 비-재구성 콜라겐 기질의 제조 방법이 본 발명자가 이전에 출원한 "다공성 콜라겐 기질의 제조 방법 (Method for preparing porous collagen matrices)"이란 명칭의 미국 특허 제8,198,408호에 의해 개시되었다.
통상적으로, 종래 기술에서 사용되는 방법, 예컨대 "다공성 콜라겐 기질의 제조 (Preparation of a porous collagen matrix)"란 명칭의 중국 발명 특허 제150746호에서의 방법은 먼저 콜라겐을 30 내지 45 ℃에서 콜라겐 미소피브릴의 재구성을 허용하는 시간 동안 중성 용액으로 만들어 젤라틴성 콜라겐 기질을 얻는다. 젤라틴성 콜라겐 기질을 적절한 온도의 냉각 속도로 적절한 저온으로 냉동시킨 다음, 감압(decompression)하에 동결 건조하여 다공성 콜라겐 기질을 얻는다. "결합조직으로부터 다공성 콜라겐 기질을 제조하는 방법 (Process for preparing porous collagen matrix from connective tissue)"이란 명칭의 중국 특허 제1284665호에서는, 실질적으로 제자리에서 처리된 결합 조직을 결합 조직으로부터 불순물과 비콜라겐을 제거하기 위한 세척 단계 후에 다공성 처리 단계에 적용하는데, 여기서 다공성 처리 단계는 다공성 특성을 갖는 콜라겐 기질을 얻기 위한 것이다. 상기 제자리 처리는 결합 조직을 자르거나 분쇄하는 통상적인 절차를 생략하고, 공정에서는 가교결합제를 사용할 필요가 없다. 이 방법은 2 내지 3 개의 처리 단계를 생략하여 콜라겐 기질을 제조하는 데 보다 편리하지만 다공성 구조와 이가 지니는 응력 및 장력에 대해서는 설명하지 않았다.
일반적으로, 인체 표면에 상처가 있는 경우 거즈, 붕대, 패치 및 의료용 테이프 등으로 상처를 덮고 감싸서 외부 세균에 의한 감염을 방지한다. 그러나, 위에서 언급한 외부 드레싱(external dressing)은 외부 박테리아만을 소멸시킬 수 있으며 상처 자체에 직접적으로 도움이 되지는 않는다.
요약하면, 상처가 외부 세균에 의해 감염되는 것을 방지하고 다공성 고순도 콜라겐을 수득하는 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 상처 드레싱용의 비-재구성 콜라겐 기질을 갖는 생물학적 스캐폴드를 제공한다.
[발명의 요약]
본 발명은 적어도 하나의 비-재구성 콜라겐 기질 및 적어도 하나의 생물재료를 포함하고 여기서 생물재료는 비-재구성 콜라겐 기질의 적어도 하나의 표면 또는 외부 및 내부 표면을 모두 균일하게 덮고 있는 생물학적 스캐폴드를 제공한다. 또한, 본 발명에서는 통상적인 콜라겐 기질보다 강도가 높은 상기 언급된 비-재구성 콜라겐 기질 및 생물학적 스캐폴드를 제조하는 방법도 개시한다. 또, 본 발명에 의해 제공되는 생물학적 스캐폴드는 생물재료 층으로 균일하게 코팅될 수 있기 때문에, 비-재구성 콜라겐 기질로의 세포 침투가 용이할 수 있다. 또한, 이러한 비-재구성 콜라겐 기질에서 모낭 조직은 진피 콜라겐의 주요 구조의 파괴 없이 파괴될 수 있으며, 따라서 종래 기술로 만들어진 기질보다 더 높은 강도를 갖는 비-재구성 콜라겐 기질로 이어진다. 또한 모낭에 의한 면역 반응을 감소시키고 세포 성장을 도움으로써, 이 생물학적 스캐폴드를 수술, 인간 장기 및 조직 복구, 재생 의학, 피부 이식 또는 미용 의학에 추가 사용하기에 더 적합하게 한다. 이것은 외과적 재건 메쉬 패브릭, 치과적 복구 메쉬 패브릭, 인간 대용 피부, 인공 대용 수막, 정형 외과적 재건 대용물 또는 상처 드레싱 대용물로 사용될 수도 있다.
본 발명에 의해 제공되는 생물학적 스캐폴드는 적어도 비-재구성 콜라겐 기질 및 적어도 하나의 생물재료를 포함한다. 비-재구성 콜라겐 기질 시스템은 다수의 다발화된 콜라겐 피브릴(bundled collagen fibril) 및 상기 다발화된 콜라겐 피브릴에 의해 형성된 다수의 기공을 갖는다. 생물재료는 본체의 적어도 하나의 외부 표면 및/또는 다발화된 콜라겐 피브릴의 외부 표면에 코팅된다. 다수의 기공이 다발화된 콜라겐 피브릴에 의해 형성되기 때문에, 즉 콜라겐 피브릴이 기공의 내벽을 형성하기 때문에, 콜라겐 피브릴의 표면을 코팅하는 것은 기공의 내벽을 코팅하는 것과 동일할 수 있다.
비-구성 콜라겐 기질의 제조 방법은 동물 피부 조직으로부터 진피 층 시트(layer sheet)를 수득하는 단계; 상기 진피층 시트를 고이온 강도 염 용액에 침지한 후, 이의 염 용액에 단백질 분해 효소를 첨가하여 털이 제거된(depilated) 진피층 시트를 생성하는 것을 포함하는 털제거 단계를 수행하는 단계; 및 털이 제거된 진피층 시트가 팽윤된 진피 시트 층을 형성하기에 충분한 시간 동안 상기 털이 제거된 진피층 시트를 제 1 산성 용액에 침지시켜 비-재구성 콜라겐 기질을 형성하는 것을 포함하는 팽윤 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있으며, 상기 재구성된 콜라겐 기질은 교직(interwoven)되고 겹쳐진(overlapped) 다수의 다발화된 콜라겐 피브릴 및 다발화된 콜라겐 피브릴에 의해 형성된 다수의 기공을 갖는다.
선택적으로, 비-구성 콜라겐 기질을 제조하는 방법은 살균 단계, 탈지(degreasing) 단계, 탈항원(de-antigen) 단계 및/또는 강화 단계를 추가로 포함할 수 있다.
생물학적 스캐폴드를 제조하는 방법은 본원에 기술된 비-재구성 콜라겐 기질을 제공하는 단계; 비-재구성 콜라겐 기질을 감압 환경하에서 생물재료를 포함하는 용액과 접촉시켜 생물재료를 비-재구성 콜라겐 기질의 다수 기공 내부와 제 1 외부 표면상에 코팅하는 단계를 포함할 수 있다.
결론적으로, 본 발명의 제조 방법은 임의의 단계를 수행하기 전 또는 후에, 시트 또는 진피층 시트를 살균 용액으로 세척하는 살균 처리 단계를 추가로 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는 살균 용액은 과아세트산 용액이다.
본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 제조 방법은 다음 단계를 추가로 포함한다: 먼저, 생물재료로 코팅된 비-재구성 콜라겐 기질을 취한다. 이어, 세포 배양 배지를 기공에 주입한 후; 세포를 포함하는 용액을 주입하여 세포가 기공으로 들어가 생물학적 스캐폴드에 부착되도록 한다. 바람직하게는, 세포는 줄기세포, 위성 세포(satellite cell), 전구 세포 또는 조직 세포일 수 있다.
본 발명에 따른 비-재구성 콜라겐 기질을 제조하는 방법의 일 실시양태에서, 동물 피부 조직은 돼지 가죽, 소 가죽 또는 양가죽 조직이다.
본 발명에 따른 비-재구성 콜라겐 기질을 제조하는 방법의 일 실시양태에서, 고이온 강도를 가지는 염 용액은 음이온과 양이온이 이온 결합에 의해 결합된 염 용액이다. 바람직하게는, 고이온 강도를 가지는 염 용액의 이온 강도는 0.15 N보다 크다. 가장 바람직하게는 고이온 강도를 가지는 염 용액의 이온 강도는 0.5 N 내지 10 N이다. 가장 바람직하게는 고이온 강도를 가지는 염 용액은 염화나트륨, 황산암모늄 및 상기 화합물의 혼합물을 함유하는 용액이다. 이러한 고염 상태(high salt condition)는 비-재구성 콜라겐 기질의 구조를 안정화시키고 팽윤시키지 않고 모낭으로 압출되어 효소가 모낭으로 원활하게 들어가 반응하게 할 수 있다.
본 발명에 따른 비-재구성 콜라겐 기질을 제조하는 방법의 일 실시양태에서, 단백질 분해 효소는 고이온 강도를 가지는 염 용액에 작용할 수 있다. 바람직하게는, 단백질 분해 효소는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 글루타메이트 프로테아제, 메탈로프로테아제 및 상기 효소의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 시스테인 효소는 파파야 효소 (예를 들어, 파파인), 파인애플 효소 (예를 들어, 브로멜라인) 및 상기 효소의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는 메탈로프로테아제는 디스파제이다.
본 발명에 따른 비-재구성 콜라겐 기질을 제조하는 방법의 일 실시양태에서, 털제거 처리 단계 전후에 탈지 단계가 추가로 포함된다. 탈지 단계는 비누화 처리, 유기 용매 처리 또는 이들의 조합이다. 비누화 단계에서는, 알칼리성 물질을 사용하여 진피층 시트의 표면을 접촉시킨다. 바람직하게는, 알칼리성 물질은 입상 및 강알칼리성 입자이다. 가장 바람직하게는 강염기 입자는 수산화나트륨 입자이다. 유기 용매 처리는 알콜 처리, 헥산 처리 또는 클로로포름 처리이다.
본 발명에 따른 비-재구성 콜라겐 기질을 제조하는 방법의 일 실시양태에서, 털제거 처리 단계 또는 그 이후의 임의의 단계는 진탕 또는 교반 단계를 수행하는 것을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 진탕 또는 교반 단계는 초음파 진동 처리이다.
본 발명에 따른 비-재구성 콜라겐 기질을 제조하는 방법의 일 실시양태에서, 털제거 처리 단계 또는 이후 임의의 단계는 열처리를 수행하는 것을 추가로 포함한다. 최적의 열처리는 25 ℃ 내지 40 ℃로 가열하는 것이다.
본 발명에 따른 비-재구성 콜라겐 기질을 제조하는 방법의 일 실시양태에서, 털제거 처리 단계를 수행한 후의 임의의 단계는 시트 또는 진피층 시트를 세척 용액에 침지시키거나 살균 가스에 통과시키는 세척 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 세척 용액은 인산염 용액 또는 수용액이다. 바람직하게는, 살균 가스는 오존이다.
본 발명에 따른 비-재구성 콜라겐 기질을 제조하는 방법의 일 실시양태에서, 제 1 산성 용액은 약산 용액이다.
본 발명에 따른 비-재구성 콜라겐 기질을 제조하는 방법의 일 실시양태에서, 팽윤 처리 단계 후, 탈항원 처리 단계를 추가로 포함한다. 탈항원 처리 단계는 시트 또는 진피층 시트를 제 2 산성 용액에 침지시키는 것이다. 제 2 산성 용액은 펩신을 함유한다. 가장 바람직하게는, 제 2 산성 용액은 약산성 용액이다.
본 발명에 따른 비-재구성 콜라겐 기질을 제조하는 방법의 일 실시양태에서, 팽윤 처리 단계 이후에 강화 처리 단계가 더 포함된다. 시트 또는 진피층 시트가 첨가제에 침지된다. 바람직하게는, 첨가제는 가교결합제 용액이다.
본 발명의 일 실시양태에서, 가교결합제는 트랜스글루타미나제이거나, 작용기(functional group)를 통해 작용하는 것이며, 여기서 가교결합제의 하나의 작용기는 아민, 설프히드릴, 카보닐, 글리콜, 하이드록실, 카복실, 아지드, 이미도에스테르, 에폭시드, 알데히드, 할로아세틸, 피리딜 디설파이드, 피리딜디티올, 하이드라지드, 광 반응(photo-reacting), 카보디이미드, 디아지린, 아지리딘, 아크릴로일, 아릴레이트, 티올, 제니핀, 리보플라빈, 플라보노이드 및 이의 유도체, 하이드록시메틸 포스핀, 이소시아네이트, 말레이미드, 6-말레이미도헥산산 활성 에스테르, 디숙신이미딜 수베레이트, 비스(설포숙신이미딜)수베레이트, N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (NHS-에스테르), 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트, 펜타플루오로페닐 에스테르 (PFP-에스테르), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 글루타르알데히드, 2,3-디브로모프로피오닐 N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 설포-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 클로람부실-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드, 소랄렌(psoralen), 비닐 설폰 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 본체내 다수 기공의 벽은 다발화된 콜라겐 피브릴이 교직되고 겹쳐진 구조를 포함한다.
본 발명의 일 실시양태에서, 생물학적 스캐폴드는 적어도 비-재구성 콜라겐 기질을 포함하는 본체, 적어도 본체의 제 1 표면에 코팅된 생물재료, 및 제 1 표면에 대향하거나 제 1 표면에 인접한 본체의 다른 표면, 또는 제 1 표면 이외의 2 이상의 표면상에 조직 접착층을 포함하고, 여기서, 조직 접착층은 조직 접착제를 포함한다. 생물학적 스캐폴드가 조직 접착층에 의해 조직에 부착된 경우, 다수의 세포가 조직 접착층에서 생물재료층으로 이동하여 조직의 재건을 수행한다.
본 발명의 일 실시양태에서, 생물재료는 세포 부착 물질, 조직 복구 물질(tissue repair material), 세포 유도 물질, 성장 인자 물질, 항균 물질 및 상기 물질의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 세포 부착 물질은 사카라이드(saccharide) 물질, 펩티드, 단백질, 인지질 또는 이들의 조합일 수 있다.
바람직하게는, 사카라이드 물질은 글리코사미노글리칸 물질일 수 있다.
바람직하게는, 글리코사미노글리칸 물질은 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 케라탄, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 카라기난, 히알루로난 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 조직 복구 물질은 생물재료, 세포 외 기질, 영양소 및 이들의 조합일 수 있다.
바람직하게는, 생물재료는 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 글리코사미노글리칸, 키토산, 알기네이트, 폴리글루탐산 (γ-PGA), 폴리라이신, 폴리(락트-코-글리콜산) (PLGA), 실크 피브로인(silk fibroin) 등 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 세포 외 기질은 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 당단백질, 피브로넥틴, 라미닌, 아그레칸, 메탈로프로테이나제 등 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 영양소는 비타민, 미네랄, 단백질, 지질, 탄수화물, 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 한약품(herbal medicine) 등 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 세포 유도 물질은 비타민, 미네랄, 화학 물질, 의약, 한약품, 대사물, 중간 대사물, 사카라이드, 펩티드, 단백질, 인지질 또는 이들의 조합과 같은 분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 항균 물질은 항생제, 항균 단백질 또는 항균 펩티드이다.
바람직하게는, 성장 인자 물질은 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 결합 조직 성장 인자 (CTGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-I, IGF-II), 신경 성장 인자 (NGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 콜로니(colony) 자극 인자 (CSF), 줄기세포 인자 (SCF), 각질세포 성장 인자 (KGF), 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF), 대식세포 콜로니 자극 인자 (MCSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GMCSF), 신경교 유래 신경 영양 인자 (GDNF), 섬모 신경 영양 인자 (CNF), 내피 단핵구 활성화 폴리펩티드, 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리트로포이에틴, 뼈 형태 형성 단백질 (BMP-1, BMP-2, BMP-3 등), 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), BRAK, 세로토닌, 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand factor; vWF), 형질전환 성장 인자 (TGF-α, TGF-β), 인터루킨 (IL-1, IL-2, IL-3 등), 종양 괴사 인자 (TNF), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 생물학적 스캐폴드는 기공에 세포 배양 배지를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 생물학적 스캐폴드는 세포를 추가로 포함하고, 여기서 세포는 어느 하나의 기공에서 생물학적 스캐폴드에 부착된다.
바람직하게는, 세포는 줄기세포, 위성 세포, 전구 세포 또는 조직 세포일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 감압 환경은 진공화 작용(vacuuming action)에 의해 실시된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 조직 접착층은 트랜스글루타미나제이거나, 적어도 작용기를 함유하는 가교결합제; 하나의 기질 성분, 비-재구성 콜라겐 기질 자체 또는 가교결합제와 가교결합된 기질 분자가 추가된 것; 및 세포 독성을 감소시키기 위해 가교결합제의 작용기 또는 가교결합제의 잔여 작용기와 반응하는데 사용되는 켄칭제(quenching agent)를 포함한다.
바람직하게는, 기질 분자는 콜라겐, 히알루로난, 젤라틴, 실크 피브로인, 피브로넥틴, 엘라스틴, 테나신, 라미닌, 비트로넥틴, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 케라틴, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 카라기난, 헤파린, 키틴, 키토산, 알기네이트, 아그레칸, 아가로스, 한천, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 카복실 메틸 셀룰로오스, 글리코겐, 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 폴리글루탐산, 폴리라이신, 폴리아미노산, 합성 폴리머 (예를 들면, 아크릴레이트, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산-글리콜산), 이의 유도체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 켄칭제는 아미노산, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 아민, 디아민, 올리고아민, 폴리아민, 카보닐 화합물, 글리콜 화합물, 카복실 화합물, 디카복실레이트, 올리고-카복실레이트, 폴리카복실레이트, 설프히드릴 화합물, 올리고설프히드릴 화합물, 폴리설프히드릴 화합물, 하이드록실 화합물, 올리고하이드록실 화합물, 폴리하이드록실 화합물, 사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 올리고뉴클레오티드, 아지드, 광 가교결합 화합물, 및 일작용성 또는 헤테로이작용성 기 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 조직은 피부 조직이다.
도 1은 본 발명의 일 실시양태에서의 비-재구성 생물학적 스캐폴드를 나타내는 개략 단면도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시양태에서의 비-재구성 생물학적 스캐폴드의 본체를 나타내는 개략 단면도이다.
도 3은 통상적인 재구성 다공성 콜라겐 기질의 100 배 확대 전자 현미경 이미지를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 비-재구성 콜라겐 기질의 제조를 위한 흐름도를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 비-재구성 콜라겐 기질의 제조를 위한 또 다른 흐름도를 나타낸다.
도 6a 내지 6c는 본 발명의 방법에 의해 제조된 비-재구성 콜라겐 기질의 전자 현미경 이미지를 나타낸다.
도 7a 내지 7b는 본 발명의 일 실시양태로부터의 생물학적 스캐폴드의 전자 현미경 이미지를 나타낸다.
도 7c는 생물학적 스캐폴드 내부에 히알루로난이 잘 분포되어 있음을 보여주는 알시안 블루 염색을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시양태와 종래 기술의 생물학적 스캐폴드 간의 전단 응력 시험 비교 다이아그램이다.
도 9a 및 9b는 본 발명의 비-재구성 다공성 콜라겐 기질 및 종래 기술로부터의 재구성 다공성 콜라겐 기질의 저장 및 손실 탄성률를 나타낸다.
도 10a는 본 발명에 의한 생물학적 스캐폴드 및 종래의 방법으로 제조한 재구성 다공성 콜라겐-콘드로이틴 설페이트 기질의 상처 치유를 나타낸 비교 다이아그램이다.
도 1Ob는 상이한 치료에서의 상처 치유를 보여주는 그래프이다.
도 11은 수술 후 28 일째 상처 치유 상태의 비교를 보여주는 현미경 이미지 세트이다. (A) 정상 피부 대조군, (B) PCHM 그룹의 치유 기질, (C) 인테그라 그룹의 치유 기질.
도 12는 본 발명의 일 실시양태에서 생물학적 스캐폴드를 제조하는 방법을 나타내는 순서도이다.
도 13a 내지 13b는 본 발명의 다른 실시양태에 따른 생물학적 스캐폴드를 도시한 개략 단면도 및 부분 확대도이다.
도 14a 내지 14c는 본 발명의 일 실시양태에서 생물재료 코팅의 정도가 다른 생물학적 스캐폴드의 흡수 능력 비교 다이아그램이다.
도 15a 내지 15d는 본 발명의 일 실시양태에서 상이한 항균 물질로 덮인 생물학적 스캐폴드의 항균 효과를 나타낸다.
[상세한 설명]
도 1을 참조하면, 본 발명은 본체 (10), 생물재료 층 (20) 및 조직 접착층 (30)을 포함하는 비-재구성 물질의 생물학적 스캐폴드 (1)를 제공한다. 본체 (10)는 적어도 하나의 비-재구성 콜라겐 기질 (10a)을 포함한다. 생물재료 층 (20) 및 조직 접착층 (30)은 각각 신체의 한 표면과 신체의 인접 또는 반대 표면에 코팅된다. 전술한 생물학적 스캐폴드가 조직 접착층에 의해 조직 (2)에 접착되면, 다수의 세포가 생물재료에 의해 화학 유인되고 조직 접착층으로부터 생물재료 층으로 이동하여 조직 (2)의 재구성이 수행된다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 생물학적 스캐폴드의 본체 (10)의 개략 단면도를 나타내는 도 2를 참조한다. 도면에 도시된 바와 같이, 본체 (10)는 바람직하게는 비-재구성 콜라겐 기질 (10a)이고, 이 콜라겐 기질 (10a)은 다수의 원주형 콜라겐 피브릴로 구성되고 콜라겐 피브릴로 구조화된 다수의 기공 (10b)을 포함한다. 기공 (10b)의 내부 표면에 생물재료 (10c)가 코팅된다.
본 발명의 비-재구성 콜라겐 기질을 갖는 생물학적 스캐폴드로부터 제조된 상처 드레싱인 도 4를 참조하면, 먼저 단계 (S100)에 나타낸 바와 같이, 동물 조직 또는 동물 피부 조직, 예컨대 돼지 가죽, 소 가죽 또는 양피 조직을 15 ℃ 이하의 환경에 제공하고, 샤프너(sharpener)로 동물 피부 조직의 피하 지방을 제거하고, 조직을 28±1 cm × 70±1 cm 크기로 절단하는 단계를 포함한다. 이어, 동물의 피부 조직에서 털을 제거하고 그 위에 잔류하는 유수분을 긁어내고, 각 피부 조직을 13±1 cm × 34±1 cm 크기로 4 조각으로 절단한다. 그런 다음, 돼지 피부의 진피층을 기계로 박리하여 적어도 하나의 진피층 시트를 얻은 다음 순수한 물로 헹군다. 가장 바람직하게는 진피층은 돼지 피부에서 유래된다.
또한, 단계 (S102)에 도시된 바와 같이, 진피층 시트를 고이온 강도를 가지는 염 용액에 침지하고, 단백질 분해 효소를 첨가한 후, 염 용액을 25 내지 40 ℃로 가열하여 털제거 처리 단계를 수행한다. 이어 초음파 진동 처리를 2 시간 동안 수행한다. 털제거 처리 후 인산염 완충 용액을 세척 용액으로 사용하여 진피층 시트를 세척한다. 고이온 강도를 가지는 염 용액은 음이온과 양이온이 이온 결합된 염 용액이다. 고이온 강도를 가지는 염 용액의 이온 강도는 0.15 N보다 크다. 가장 바람직하게는 고이온 강도를 가지는 염 용액의 이온 강도는 0.5 N 내지 10 N이다. 가장 바람직하게는 고이온 강도를 가지는 염 용액은 염화나트륨, 황산암모늄 또는 상기 화합물의 혼합물을 포함하는 용액이다.
일 실시양태에서, 고이온 강도를 가지는 염 용액은 염화나트륨을 함유하는 인산염 완충 용액이다. 이 고염 상태는 비-재구성 콜라겐 기질의 구조를 안정시키고 조직을 팽윤시키지 않고 모낭으로 압출되어 효소가 모낭으로 원활하게 들어가 반응하게 할 수 있다.
일 실시양태에서, 단백질 분해 효소는 고이온 강도를 가지는 염 용액에 작용한다. 가장 바람직하게는, 단백질 분해 효소는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 글루타메이트 프로테아제, 메탈로프로테아제 및 상기 효소의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 시스테인 프로테아제는 파파야 효소, 파인애플 효소 및 상기 효소의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는 메탈로프로테아제는 디스파제이다.
아래 표 1을 참조하면, 진피층 시트를 약 5 mM 또는 0.16% (w/w) L-시스테인을 함유하는 인산염 완충 용액 중에 파파인 (파파야 효소)과 침지시킨 경우, 파파인의 농도가 0.6 mg/mL보다 높으면 (그룹 B, C 및 D), 돼지 털이 완전히 제거되었다. 진피층 시트를 인산염 완충 용액 중에 브로멜라인 (파인애플 효소)과 침지시킨 경우, 브로멜라인 농도가 0.2 mg/mL, 0.6 mg/mL이면 (그룹 A 및 B), 돼지 털은 여전히 붙어있었다. 브로멜라인의 농도가 1.2 mg/mL인 경우 돼지 털이 완전히 제거되었다. 0.2 U/mL 초과 디스파제를 사용하여 돼지 모낭을 완전히 제거할 수도 있다. 대조군 (인산염 완충 용액 단독)의 돼지는 모든 돼지 털이 빠지지 않았다.
Figure pct00001
도 4를 참조하면, 단계 (S104)에 나타낸 바와 같이, 털제거 처리 후 진피층 시트를 제 1 산성 용액에 침지하고 제 1 산성 용액을 초음파 진동 처리와 함께 33 내지 37 ℃로 가열하는 팽창 처리 단계가 수행된다. 초음파 진동 처리 시간은 24 시간 동안 지속되므로 진피층 시트의 부피는 최소 50% 팽창된다. 바람직하게는, 제 1 산성 용액은 포름산, 카복실산, 옥살산, 아세트산, 시트르산, 락트산, 말산, 붕산, 인산, 염산 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 약산 용액이다. 가장 바람직하게는, 제 1 산성 용액은 아세트산 용액이다.
단계 (S105)에 나타낸 바와 같이, 진피층 시트로부터 비콜라겐성 물질을 제거하기 위해 세척 처리 단계를 수행하고 정제된 콜라겐 기질을 얻는다. 이어 정제된 콜라겐 기질을 -20 ℃ 및 -80 ℃에서 냉동시키고, 냉동 건조 또는 동결 건조 공정을 거쳐 정제된 비-재구성 다공성 콜라겐 기질을 수득한다.
본 발명의 비-재구성 콜라겐 기질의 제조 방법의 또 다른 실시양태를 나타내는 도 5를 참조하면, 단계 (S101a)에 나타낸 바와 같이, 임의의 단계를 수행하기 전 또는 후에, 시트 또는 진피층 시트를 살균 용액으로 세척하는 살균 처리 단계를 포함한다. 가장 바람직하게는, 살균 용액은 과아세트산 용액이다.
단계 (S102a)에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조 방법은 털제거 처리 단계 (S102) 전 또는 후에 탈지 단계를 추가로 포함한다. 탈지 단계는 비누화 처리, 유기 용매 처리 또는 이들의 조합이다. 비누화 단계는 시트 또는 진피층 시트를 알칼리성 물질과 접촉시키는 것으로, 한쪽 표면만 그리이징(greasing)되면 한 특정 표면과 접촉할 수 있다. 가장 바람직하게는, 알칼리성 물질은 강염기 입자의 과립 형태이다. 가장 바람직하게는 강염기 입자는 수산화나트륨 입자이다. 유기 용매 처리는 알콜 처리, 헥산 처리 또는 클로로포름 처리이다. 그럼에도 불구하고, 기질에서 콜라겐 변성을 방지하기 위해서는 최적의 처리량과 기간이 필요하다.
단계 (S104a)에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조 방법은 팽윤 처리 단계 (S104) 후에 탈항원 처리 단계를 추가로 포함한다. 가장 바람직하게는, 탈항원 처리 단계는 시트 또는 진피층 시트를 펩신을 함유하는 제 2 산성 용액에 침지하는 것이다. 펩신을 함유하는 제 2 산성 용액을 33 ℃ 내지 37 ℃로 가열한다. 이어 초음파 진동 처리를 4 시간 동안 수행한다. 시트 또는 진피층 시트에 남아 있는 용액을 순수한 물로 세척해 낸다. 시트 또는 진피층 시트를 25 ℃에서 인산이수소칼륨 용액으로 재처리한다. 바람직하게는, 제 2 산성 용액은 포름산, 카복실산, 옥살산, 아세트산, 시트르산, 락트산, 말산, 붕산, 인산, 염산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 약산 용액이다. 가장 바람직하게는, 제 2 산성 용액은 아세트산 용액이다.
단계 (S104b)에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조 방법은 팽윤 처리 단계 후에, 다수의 시트 또는 진피층 시트를 적층하고 첨가제, 바람직하게는 가교결합제 용액에 침지하는 강화 처리 단계를 추가로 포함한다. 가교결합제 용액을 33 ℃ 내지 37 ℃로 가열하고 초음파 진동 처리를 24 시간 동안 수행하여 가교결합 반응을 완료한다. 시트 또는 진피층 시트에 남아 있는 용액을 순수한 물로 세척해 낸다. 가장 바람직하게는, 가교결합제의 하나의 작용기는 아민, 설프히드릴, 카보닐, 글리콜, 하이드록실, 카복실, 아지드, 이미도에스테르, 에폭시드, 알데히드, 할로아세틸, 피리딜 디설파이드, 피리딜디티올, 하이드라지드, 광-반응, 카보디이미드, 디아지린, 아지리딘, 아크릴로일, 아릴레이트, 티올, 제니핀, 리보플라빈, 플라보노이드 및 이의 유도체, 하이드록시메틸 포스핀, 이소시아네이트, 말레이미드, 6-말레이미도헥산산 활성 에스테르, 디숙신이미딜 수베레이트, 비스(설포숙신이미딜)수베레이트, N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (NHS-에스테르), 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트, 펜타플루오로페닐 에스테르 (PFP-에스테르), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 글루타르알데히드, 2,3-디브로모프로피오닐 N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 설포-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 클로람부실-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드, 소랄렌, 비닐설폰 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
전술한 방법에 따라 제조된 비-재구성 콜라겐 기질의 외관을 나타내는 도 6a 내지 6c를 참조한다. 도 6a는 본 발명의 일 실시양태에 따른 비-재구성 콜라겐 기질의 100 배 확대한 주사 전자 현미경 사진 이미지이다. 도 6b는 본 발명의 일 실시양태에 따른 비-재구성 콜라겐 기질의 400 배 확대한 주사 전자 현미경 사진 이미지이다. 도 6c는 본 발명의 일 실시양태에 따른 비-재구성 콜라겐 기질의 10,000 배 확대한 주사 전자 현미경 사진 이미지이다.
선행 기술에 의해 제조된 다공성 콜라겐 기질 (도 3 참조)과 비교하여, 본 발명에 의해 제조된 비-재구성 다공성 콜라겐 기질은 얽히고 응집된 다수의 콜라겐 피브릴 다발로 구성되며, 깊이와 홈 벽이 있는 다수의 기공을 가진다. 상술한 콜라겐 피브릴 다발은 프로콜라겐 분자로 구성되고 직경이 100 nm 미만이지만, 본 발명이 이에만 한정되는 것은 아니다. 기공의 외관은 무작위 반경 개구이며, 구경 크기는 더 좁은 범위로 제어된다. 따라서, 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 콜라겐 기질은 비교적 균일한 개구를 갖는다.
상술한 방법에 따라 제조된 비-재구성 콜라겐 기질로 만들어진 생물학적 스캐폴드의 외관을 나타내는 도 7a 내지 7c를 참조한다. 도 7a는 본 발명의 일 실시양태에 따른 생물학적 스캐폴드의 100 배 확대한 주사 전자 현미경 사진 이미지이다. 도 7b는 본 발명의 일 실시양태에 따른 생물학적 스캐폴드의 400 배 확대한 주사 전자 현미경 사진 이미지이다. 도 7c는 본 발명의 일 실시양태에서 CNBr에 의해 사전 활성화되고 비-재구성 콜라겐 기질에 가교결합된 히알루로난을 갖는 생물학적 스캐폴드의 광학 현미경 이미지이다. 조직학적 샘플을 절편한 후 스캐폴드 내부에 히알루로난 유도체의 존재를 알아보기 위해 알시안 블루를 사용하여 염색하였다. 이미지는 히알루로난 유도체가 생물학적 스캐폴드 내부에 잘 분포되어 있음을 나타낸다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 비-재구성 다공성 콜라겐 기질 (라인 B)과 선행 기술에 의해 얻은 종래 다공성 콜라겐 기질 (라인 A)의 전단 응력 시험을 나타내는 도 8을 참조한다. 결과에 의하면 선행 기술에 의해 얻은 다공성 콜라겐 기질의 전단 응력은 20 ℃의 온도에서 63.56e-03 MPa이고, 본 발명의 비-재구성 다공성 콜라겐 기질의 전단 응력은 189.07 MPa였다. 따라서, 동일한 시험 조건하에서, 본 발명의 비-재구성 다공성 콜라겐 기질의 전단 강도는 선행 기술의 다공성 콜라겐 기질보다 약 3 배 더 높다는 것이 입증되었다. 모낭을 처음부터 완전히 제거할 수 있기 때문에, 비-재구성 다공성 콜라겐 기질은 종래 다공성 콜라겐 기질보다 구조 강도와 장력이 실제로 우수하다. 요약하면, 본 발명은 진피층에서 콜라겐의 천연 가교를 파괴하지 않고 모낭 조직을 파괴할 수 있는 비-재구성 다공성 콜라겐 기질을 제조하는 방법을 제공하여 선행 기술의 것보다 높은 구조적 강도를 갖는 다공성 기질을 제공한다.
리오미터 (reometer)에 의해 모니터링된 진동 변형 변화와 함께 저장 탄성률 및 손실 탄성률의 변화를 나타내는 도 9a 및 9b를 참조한다. 저장 탄성률은 탄성 방식으로 변형 에너지를 저장할 수 있는 기질의 능력을 나타낸다. 이것은 가교 정도와 직접적인 관련이 있으며, 가교 정도가 높을수록 저장 탄성률이 커진다. 도 9a는 본 발명의 비-재구성 다공성 콜라겐 기질의 데이터이고, 도 9b는 종래 재구성된 다공성 콜라겐 기질의 데이터를 나타낸다. 미세 구조는 물질 내 분자 또는 입자들 사이에 힘이 있음을 의미한다. 미세 구조를 깨기 위해서는 이것을 유지하는 것보다 더 큰 힘이 필요하다. 인가된 힘이 분자 또는 입자 간 힘보다 작으면, G'는 G"보다 크다; 물질은 에너지를 저장할 수 있는 능력을 일부 가지며 기계적 힘이 인가되기 전의 초기 구성으로 어느 정도 돌아갈 수 있어야 한다. 이 물질은 일부 기계적 에너지가 소멸되기 때문에 이상적인 것은 아니지만 탄성 고체로 거동한다. 도 9a 및 9b의 결과는 비-재구성 다공성 콜라겐 기질의 저장 탄성률이 종래 기술에 의해 제조된 재구성된 다공성 콜라겐 기질의 것보다 크다고 제시한다. 비-재구성 다공성 콜라겐 기질에서 대부분의 천연 가교는 보존되는 반면, 종래 재구성된 다공성 콜라겐 기질에서는 대부분의 천연 가교를 잃는다.
또한, 비-재구성 콜라겐 기질 (10a) 자체는 친수성 물질이 아니기 때문에, 본체 (10)는 콜라겐 피브릴의 외부 표면에 코팅된 친수성 생물재료 (10c)를 더 포함할 수 있다. 즉, 이들 기공 (10b)의 내벽은 또한 친수성 생물재료 (10c)로 코팅되어 (도 2에 도시된 바와 같이) 세포가 비-재구성 다공성 콜라겐 기질 (10a)로 침투하여 그 안에서 이동하고 접착/부착되는 것을 용이하게 한다. 바람직하게는, 상술한 생물재료는 성장 인자 또는 히알루로난 (HA), 콘드로이틴 설페이트 (CS) 또는 헤파란 (Hep)과 같은 글리코사미노글리칸일 수 있다. 보다 바람직하게는, 친수성 생물재료 (10c)는 히알루로난이지만, 본 발명이 이에만 한정되는 것은 아니다.
다시 도 1을 참조하면, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본체 (10)의 한 표면에 코팅된 성장 인자 물질 층 (20)은 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 결합 조직 성장 인자 (CTGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-I, IGF-II), 신경 성장 인자 (NGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 콜로니 자극 인자 (CSF), 줄기세포 인자 (SCF), 각질세포 성장 인자 (KGF), 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF), 대식세포 콜로니-자극 인자 (MCSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GMCSF), 신경교 유래 신경 영양 인자 (GDNF), 섬모 신경 영양 인자 (CNF), 내피 단핵구 활성화 폴리펩티드, 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리스로포이에틴, 뼈 형태 형성 단백질 (BMP-1, BMP-2, BMP-3 등), 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), BRAK, 세로토닌, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 형질전환 성장 인자 (TGF-α, TGF-β), 인터루킨 (IL-1, IL-2, IL-3 등), 종양 괴사 인자 (TNF) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한, 조직 접착제는 이의 접착 특성으로 인해 임상 의학 및 조직 공학에 사용돠어 약물 방출 제어, 생체 적합성 물질의 분해 조절 또는 혈관 연결 촉진 효과를 얻을 수 있다. 그러나, 종래 기술의 조직 접착제는 글루타르알데히드 (GA), 글리옥살, 포름알데히드 또는 소듐 트리폴리포스페이트 (TPP)와 같은 가교결합제로 만들어지고 젤라틴, 키토산 또는 콜라겐과 같은 담체 물질과 가교결합되기 때문에, 가교결합제는 세포 독성이고 강력하고 지속적인 면역 반응을 쉽게 유도하여 조직 접착제를 세포 독성으로 만든다.
따라서, 본 발명에서는 적어도 하나의 가교결합제, 적어도 하나의 기질 성분 및 켄칭제를 포함하는 더 나은 결합 강도 및 낮은 세포 독성을 갖는 조직 접착층 (30)이 사용된다. 가교결합제는 트랜스글루타미나제이거나 작용기를 가지며, 기질 성분은 가교결합제와의 가교결합에 사용된다. 켄칭제는 가교결합제의 작용기와 반응하여 세포 독성을 감소시키는 데 사용된다.
바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 가교결합제는 트랜스글루타미나제이거나, 이의 작용기 중 하나는 아민, 설프히드릴, 카보닐, 글리콜, 하이드록실, 카복실, 아지드, 이미도에스테르, 에폭시드, 알데히드, 할로아세틸, 피리딜 디설파이드, 피리딜디티올, 하이드라지드, 광 반응, 카보디이미드, 디아지린, 아지리딘, 아크릴로일, 아릴레이트, 티올, 제니핀, 리보플라빈, 플라보노이드 및 이의 유도체, 하이드록시메틸 포스핀, 이소시아네이트, 말레이미드, 6-말레이미도헥산산 활성 에스테르, 디숙신이미딜 수베레이트, 비스(설포숙신이미딜)수베레이트, N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (NHS-에스테르), 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트, 펜타플루오로페닐 에스테르 (PFP-에스테르), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 글루타르알데히드, 2,3-디브로모프로피오닐 N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 설포-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 클로람부실-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드, 소랄렌, 비닐 설폰 및 이들의 조합을 함유하는 반응성 화합물로 구성된 군으로부터 선택된다
바람직한 실시양태에서, 기질 성분은 콜라겐, 히알루로난, 젤라틴, 실크 피브로인, 피브로넥틴, 엘라스틴, 테나신, 라미닌, 비트로넥틴, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 케라틴, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 카라기난, 헤파린, 키틴, 키토산, 알기네이트, 아그레칸, 아가로스, 한천, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 카복실 메틸 셀룰로오스, 글리코겐, 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 폴리글루탐산, 폴리라이신, 폴리아미노산, 합성 중합체 (예를 들면, 아크릴레이트, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산-글리콜산), 이의 유도체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 기질 성분은 천연적으로 생성된 콜라겐 또는 이의 기능성 변이체 및/또는 히알루로난으로부터 제조될 수 있다. 더욱이, 히알루로난, 특히 고분자량 히알루로난 (5 kDa 초과)은 혈관 신생을 효과적으로 촉진하고 상처 치유를 더욱 촉진할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 히알루로난의 분자량은 50 kDa 내지 5,000 kDa, 70 kDa 내지 1,500 kDa, 200 kDa 내지 1,500 kDa, 500 kDa 내지 1,500 kDa, 또는 700 kDa 내지 1,500 kDa일 수 있다. 세포가 콜라겐 또는 히알루로난의 기질에서 성장하면 생존력이 우수하다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 조직 접착층 (30)의 기질 성분에서 히알루로난의 농도는 0.001 mg/mL 내지 100 mg/mL이고 콜라겐의 농도는 0.001 mg/mL 내지 100 mg/mL이다. 바람직하게는 콜라겐의 농도는 0.1 mg/mL 내지 100 mg/mL이고, 히알루로난의 농도는 0.01 mg/mL 내지 35 mg/mL이다. 보다 바람직하게는 콜라겐의 농도는 3 mg/mL 내지 75 mg/mL (예를 들면, 6 mg/mL 또는 9 mg/mL)이고, 히알루로난의 농도는 0.2 mg/mL 내지 20 mg/mL이다.
바람직한 실시양태에서, 켄칭제는 아미노산, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 아민, 디아민, 올리고아민, 폴리아민, 카보닐 화합물, 글리콜 화합물, 카복실 화합물, 디카복실레이트, 올리고-카복실레이트, 폴리카복실레이트, 설프히드릴 화합물, 올리고설프히드릴 화합물, 폴리설프히드릴 화합물, 하이드록실 화합물, 올리고하이드록실 화합물, 폴리하이드록실 화합물, 사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 올리고뉴클레오티드, 아지드, 광 가교결합 화합물, 일작용성 또는 헤테로이작용성 기, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 켄칭제는 분자량이 다양한 상이한 그룹의 스퍼민, 프로타민, 1-6 헥산디아민 및 폴리라이신을 포함한다. 폴리라이신의 평균 분자량은 각각 3.4 kDa, 20 kDa, 99 kDa, 212 kDa 및 225 kDa이다.
도 10a는 Integral® 인공 피부 또는 PCMH가 이식된 기니피그의 등쪽 피부에서 전층 상처의 치유를 나타내는 비교 다이아그램이다. 대조군으로 제공된 Integra® 인공 피부는 탈수 열가교결합을 통해 통상적인 방법으로 제조된 재구성 다공성 콜라겐-콘드로이틴 설페이트 기질이다. PCHM은 비-재구성 다공성 콜라겐 기질과 기질의 외부 및 내부 표면에 코팅된 히알루로난으로 구성된 본 발명의 생물학적 스캐폴드이다. PCHM의 안정적인 다공성 구조는 대조군보다 최대 4 배까지 진피 세포의 더 나은 침투를 가능케 한다. 따라서, PCHM으로 채워진 상처의 치유 속도는 Integral 그룹에서보다 훨씬 빠른 것이 입증되었다 (약 80%). PCHM 그룹의 재생 기질 조직학에서 입증된 치유 질(healing quality)은 수술 후 4 개월째 대조군보다 훨씬 더 좋았다.
도 11을 참조하면, 도 11b에 표시된 조직학으로 볼 때, 수술 후 28 일째에 정상 피부와 비교하여 PCHM의 생물학적 스캐폴드는 2 주 이내에 분해되었으며, PCHM 그룹의 치유된 기질은 기본적으로 새기질 (neomatrix)로 대체되었다. 도 11c에 예시된 바와 같이, Integra 인공 피부에서 상처 치유의 재생 과정을 방해하는 일부 잔해물이 관찰되었다.
도 12를 참조하면, 단계 (S106) 내지 (S109)에 나타낸 바와 같이, 비-재구성 콜라겐 기질을 생물재료를 포함하는 용액과 접촉시키고, 비-재구성 콜라겐 기질을 감압 환경에 제공한다. 일 실시양태에서, 비-재구성 콜라겐 기질의 한 단부를 적어도 하나의 생물재료를 포함하는 용액에 위치시킨다. 단계 (S108)에 나타낸 바와 같이, 비-재구성 콜라겐 기질의 다른 단부에 감압 환경을 형성하여 생물재료를 비-재구성 콜라겐 기질의 구조에 흡수시킴으로써 생물재료가 다발화된 콜라겐 피브릴의 외부 및 내부 표면에 고르게 코팅되도록 할 수 있다 (또한 모공의 내벽에 균일하게 코팅된 것으로 간주될 수도 있다). 비-재구성 콜라겐 기질의 다공성 직경이 매우 작기 때문에 비-재구성 콜라겐 기질을 용액에 침지하는 것만으로는 공기 잔여물을 피할 수 없다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 본 발명에서는 사이펀 원리(principle of siphon)를 이용하여 간접적으로 공기를 제거하여 생물재료가 다발화된 콜라겐 피브릴의 외부 표면 (기공의 내벽으로 간주될 수도 있음)을 완전히 덮을 수 있도록 한다. 또한, 전술한 감압 환경은 바람직하게는 진공화 작용에 의해 수행된다.
상술된 생물재료는 세포 부착 물질, 조직 복구 물질, 세포 유도 물질, 성장 인자 물질, 항균 물질 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 언급된 세포 부착 물질은 사카라이드, 펩티드, 단백질, 인지질 또는 이들의 조합이다. 바람직하게는, 사카라이드 물질은 글리코사미노글리칸 물질이다. 바람직하게는, 글리코사미노글리칸 물질은 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 케라탄, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 카라기난, 히알루로난 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 생물재료는 콜라겐, 엘라스틴, 글리코사미노글리칸, 키토산, 알기네이트, 폴리글루탐산 (γ-PGA), 폴리라이신, 폴리(락트산-코-글리콜산) PLGA, 실크 단백질, 및 피브로인을 포함하나 본 발명이 이에만 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 세포 유도 물질은 비타민, 미네랄, 성장 인자, 화학 물질, 의약, 한약품, 대사물, 중간 대사물, 사카라이드, 펩티드, 단백질, 인지질 또는 이들의 조합과 같은 분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 성장 인자 물질은 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 결합 조직 성장 인자 (CTGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-I, IGF-II), 신경 성장 인자 (NGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 콜로니 자극 인자 (CSF), 줄기세포 인자 (SCF), 각질세포 성장 인자 (KGF), 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF), 대식세포 콜로니 자극 인자 (MCSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GMCSF), 신경교 유래 신경 영양 인자 (GDNF), 섬모 신경 영양 인자 (CNF), 내피-단핵구 활성화 폴리펩티드, 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리트로포이에틴, 뼈 형태 형성 단백질 (BMP-1, BMP-2, BMP-3 등), 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), BRAK, 세로토닌, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 형질전환 성장 인자 (TGF-α, TGF-β), 인터루킨 (IL-1, IL-2, IL-3 등), 종양 괴사 인자 (TNF), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 항균 물질은 항생제, 항균 단백질, 항균 펩티드 또는 이들의 조합이다.
비-재구성 콜라겐 기질의 자세한 구조는 본 발명의 일 실시양태에 따른 생물학적 스캐폴드의 개략 단면도인 도 2를 참조한다. 전술한 바와 같이, 비-재구성 콜라겐 기질 (10a)은 다수의 기공 (10b)을 포함하는 다수의 다발화된 콜라겐 피브릴로 구성된다. 생물재료 (10c)는 사이펀 원리에 의해 비-재구성 콜라겐 기질 (10a)로 흡수되고 다발화된 콜라겐 피브릴의 외부 표면에 코팅된다. 즉, 기공 (10b)의 내벽은 모두 생물재료 (10c)로 코팅되어 있으며, 이는 세포가 기공으로 들어가 후속 적용을 위해 생물재료에 부착되도록 하기에 더 전도성이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 도 2에는 도시되지 않았지만, 다발화된 콜라겐 피브릴의 외부 표면에 생물재료를 코팅한 후, 세포를 생물학적 스캐폴드에 도입할 수 있다. 세포가 비-재구성 콜라겐 기질의 기공에 들어갈 수 있도록 세포 배양 배지 또는 세포를 함유하는 용액을 기공 (10b)에 주입한다. 즉, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 생물학적 스캐폴드는 도 13a에 도시된 바와 같이 세포를 추가로 포함한다. 도 13a에 있는 점선 원의 부분 확대도인 도 13b를 참조하면, 세포 (30)가 기공 (10b) 내 생물재료 (10c)에 부착되어 있다. 바람직하게는, 세포는 줄기세포, 위성 세포, 선조 세포 (progenitor cell), 전구 세포 (precursor cell) 또는 조직 세포일 수 있고, 조직 세포는 또한 피부 조직, 연골 조직 또는 지방 조직 등을 포함할 수 있다.
아래 표 2는 생물재료가 없는 비-재구성 콜라겐 기질과 생물재료가 있는 비-재구성 콜라겐 기질의 부착된 세포 수를 상이한 시야에서 비교한 것이다. 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 비-재구성 콜라겐 기질 자체는 소수성 물질로, 세포가 모공에 부착하도록 하는 전도성이 없다. 그러나, 본 발명이 비-재구성 콜라겐 기질의 표면을 세포 부착 물질로 추가로 코팅하게 되면, 후속 세포가 이러한 기공에 들어가 생물학적 스캐폴드에 부착하는 데에 유익한 것으로 나타났다.
Figure pct00002
다음으로, 생물재료가 없는 비-재구성 콜라겐 기질 (Al), 히알루로난으로 코팅된 (1 회) 비-재구성 콜라겐 기질 (A2) 및 히알루로난으로 코팅된 (5 회) 비-재구성 콜라겐 기질 (A3)의 수분 흡수를 추가로 비교하였다. 도 14a 내지 14c를 참조한다. 이들 세 도면은 각각 A1, A2 및 A3의 수분 흡수 조건을 나타낸다. 이에 따라, 더 많은 층의 생물재료로 코팅된 비-재구성 콜라겐 기질이 더 나은 흡수 능력을 가지고 있음이 입증되었다.
본 발명에 의해 제공되는 상처 드레싱에 사용된 생물학적 스캐폴드의 효과가 확인되었다. 도 10b 및 11을 참조한다. 도 10b는 상이한 생물학적 스캐폴드의 상처 치유 시간을 비교한 것이고, 도 11은 상이한 생물학적 스캐폴드의 상처 치유 상태를 비교한 것이다.
먼저, 도 10b는 상처 부위와 치유 시간 사이의 관계를 관찰하기 위해 그룹 A, B, C, D 및 E로 나누어진 상이한 상처 치료를 나타낸다. 이 중, 초기 상처 부위는 100%였으며, 상처가 완전히 치유될 때까지 2 일마다 측정하였다. A는 처리되지 않은 상처를 나타내고, B는 다공성 콜라겐 기질 (PCM)로 처리한 상처를 나타내고, C는 다공성 콜라겐 기질과 결합된 CNBr 활성화 히알루로난 (aH) (PCM-aH)으로 처리한 상처를 나타내고, D는 5 mg/mL의 히알루로난이 추가된 PCM-aH로 처리한 상처를 나타내고, E는 Integra® 인공 피부로 처리한 상처를 나타낸다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 그룹 B, 그룹 C 및 그룹 D의 상처는 모두 약 30 일 만에 치유되었으나 인공 피부로 처리된 상처 (그룹 E)는 치유에 44 일이 걸렸다. 그룹 A는 약간 빨리 회복되었지만 상처 수축 등의 증상을 보였다.
도 10b에 나타낸 바와 같이, 12 일 후, 그룹 C (PCM-aH로 처리된 상처)의 섬유모세포 증식 상태는 실제로 그룹 E (인공 피부로 처리된 상처)의 것을 초과하였다. 이와 같이 생물재료와 결합된 상기 언급된 본체 (10)는 상처 수축을 일으키지 않고 효과적으로 세포 증식을 촉진할 수 있으며 종래 기술의 인공 피부보다 더 빨리 상처를 치유할 수 있는 것으로 나타났다.
다음으로, 다른 실시양태에서, 도 15a 내지 15d에 도시된 바와 같이, 생물학적 스캐폴드를 도 15a 및 15b에서의 항균성 펩티드 펙시가난 (Pexiganan) 및 도 15c 및 15d에서의 네오마이신과 같이 상이한 항균 물질로 코팅하였다. 그 결과 항균 효과는 농도 의존적이며 항균 물질로 코팅된 생물학적 스캐폴드가 우수한 항균 효과를 가지는 것으로 나타났다.
요약하면, 본 발명의 목적은 상처 드레싱에 사용될 수 있는 생물학적 스캐폴드를 제공하는 것이다. 일 실시양태에서, 본체의 한 면은 생물재료 층으로 코팅되고, 다른 면은 농도 구배의 효과에 따라 세포의 본체 내에서의 이동을 허용하는 조직 접착층으로 코팅된다. 또한, 본체에는 친수성 생물재료가 포함되어 있어 세포의 이동과 부착을 더욱 용이하게 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 제공되는 생물학적 스캐폴드는 상처 감염을 예방하기 위해 외래 세균의 침입을 효과적으로 차단하는 것 외에도 세포 성장을 가속화하고 상처 치유 속도를 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 통상적인 기술에서 분쇄한 콜라겐을 생물재료 (예컨대, 히알루로난)에 첨가한 다음 가교결합시켜 하나의 구조로 응고시키는 것이 알려져 있지만, 콜라겐과 생물재료가 서로 얽혀 있어(intertwined) 생물학적 스캐폴드의 외부는 완전히 친수성이지 않다. 또한, 재구성된 콜라겐 스캐폴드를 먼저 준비 (도 3에 도시된 바와 같이)한 다음, 본 발명에 의해 제공되는 방법을 적용하면 재구성된 콜라겐 기질의 지지력이 생물재료로 스캐폴드를 후속 코팅하는데 필요한 진공 단계에 의해 인가되는 외부 압력을 견디기에 충분치 않을 수 있다 (도 9 및 위의 관련 설명 참조). 상술한 바와 같이, 생물재료가 비-재구성 콜라겐 기질에 완전히 흡수 또는 도입되어 표면을 균일하게 코팅할 수 있도록 사이펀 원리를 적용함으로써 생물학적 스캐폴드의 표면이 세포 침투 및 부착에 유리해진다. 이 생물학적 스캐폴드는 수술, 인간 장기 및 조직 복구, 재생 의학, 피부 이식 또는 미용 의학에 널리 적용될 수 있으며, 외과적 재건 메쉬 패브릭, 치과적 복구 메쉬 패브릭, 인간 대용 피부, 인공 대용 수막, 정형 외과적 재건 대용물 또는 상처 드레싱 대용물로 사용될 수 있다.
상기 상세한 설명은 본 발명의 특정 가능한 실시양태에 대한 구체적인 설명이지만, 이들 실시양태는 본 발명의 특허 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 동등한 구현 또는 변경은 본 발명의 특허 범위 내에 포함되어야 한다. 본원에 인용된 모든 간행물은 이의 전체가 본원에 참조로 포함된다.
1 생물학적 스캐폴드
10 본체
10a 비-재구성 콜라겐 기질
10b 기공
10c 생물재료
20 생물재료 층
30 조직 접착층
2 조직
S100~S105 비-재구성 콜라겐 기질의 제조 방법
S100~S104b 비-재구성 콜라겐 기질의 제조 방법
S100~S109 생물학적 스캐폴드의 제조

Claims (38)

  1. 교직(interwoven)되고 겹쳐진 다수의 다발화된 콜라겐 피브릴(bundled collagen fibril) 및 상기 다발화된 콜라겐 피브릴에 의해 형성된 다수의 기공(pore)을 함유하는 비-재구성 콜라겐 기질(non-reconstituted collagen matrix)을 포함하는 본체; 및
    상기 본체의 다수의 기공 내부와 제 1 외부 표면을 코팅하는 생물재료를 포함하는 생물학적 스캐폴드(biological scaffold).
  2. 제1항에 있어서, 생물재료는 세포 부착 물질, 조직 복구 물질(tissue repair material), 세포 유도 물질, 성장 인자 물질, 항균 물질 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 스캐폴드.
  3. 제2항에 있어서, 항균 물질은 항생제, 항균성 단백질, 항균성 펩티드 또는 이들의 조합인 생물학적 스캐폴드.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 세포 부착 물질은 사카라이드(saccharide), 펩티드, 단백질, 인지질 또는 이들의 조합인 생물학적 스캐폴드.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 사카라이드 물질은 글리코사미노글리칸 물질인 생물학적 스캐폴드.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코사미노글리칸 물질은 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 케라탄, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 카라기난, 히알루로난 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 스캐폴드.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 성장 인자 물질은 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 결합 조직 성장 인자 (CTGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-I, IGF-II), 신경 성장 인자 (NGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 콜로니(colony) 자극 인자 (CSF), 줄기세포 인자 (SCF), 각질세포 성장 인자 (KGF), 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF), 대식세포 콜로니 자극 인자 (MCSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GMCSF), 신경교 유래 신경 영양 인자 (GDNF), 섬모 신경 영양 인자 (CNF), 내피 단핵구 활성화 폴리펩티드, 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리트로포이에틴, 뼈 형태 형성 단백질 (BMP-1, BMP-2, BMP-3 등), 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), BRAK, 세로토닌, 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrant factor; vWF), 형질전환 성장 인자 (TGF-α, TGF-β), 인터루킨 (IL-1, IL-2, IL-3 등), 종양 괴사 인자 (TNF) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 스캐폴드.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 유도 물질은 비타민, 미네랄, 화학 물질, 의약, 한약품(herbal medicine), 대사물, 중간 대사물, 사카라이드, 펩티드, 단백질, 인지질, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 스캐폴드.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 복구 물질은 생물재료(biomaterial), 세포 외 기질, 영양소 또는 이들의 조합인 생물학적 스캐폴드.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 생물재료는 콜라겐, 젤라틴, 히알루로난, 엘라스틴, 글리코사미노글리칸, 키토산, 알기네이트, 폴리글루탐산 (γ-PGA), 폴리라이신, 폴리(락트-코-글리콜산) (PLGA), 실크 피브로인(silk fibroin), 폴리아미노산, 셀룰로오스 및 이의 유도체, 또는 이들의 조합인 생물학적 스캐폴드.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 외 기질은 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 당단백질, 피브로넥틴, 라미닌, 아그레칸, 메탈로프로테이나제 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 스캐폴드.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 영양소는 비타민, 미네랄, 단백질, 지질, 탄수화물, 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 한약품 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 스캐폴드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 본체의 다수의 기공에 세포를 추가로 포함하는 생물학적 스캐폴드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 줄기세포, 위성 세포(satellite cell), 선조 세포 (progenitor cell), 전구 세포 (precursor cell) 또는 조직 세포인 생물학적 스캐폴드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 생물재료는 본체의 전체 표면 및 내부를 실질적으로 코팅하는 생물학적 스캐폴드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 본체의 제 2 표면에 코팅된 조직 접착층을 추가로 포함하는 생물학적 스캐폴드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 접착층은
    작용기(functional group) 또는 이작용기(bifunctional group)를 갖는 가교결합제;
    적어도 가교결합제로 가교결합된 기질 분자; 및
    상기 기질 분자와 반응하지 않은 가교결합제의 임의의 과잉 작용기 또는 이작용기와 반응하기 위한 켄칭제(quenching agent)를 포함하는,
    생물학적 스캐폴드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 가교결합제의 하나의 작용기는 아민, 설프히드릴, 카보닐, 글리콜, 하이드록실, 카복실, 아지드, 이미도에스테르, 에폭시드, 알데히드, 할로아세틸, 피리딜 디설파이드, 피리딜디티올, 하이드라지드, 광 반응(photo-reacting), 카보디이미드, 디아지린, 아지리딘, 아크릴로일, 아릴레이트, 티올, 제니핀, 리보플라빈, 플라보노이드 및 이의 유도체, 하이드록시메틸 포스핀, 이소시아네이트, 말레이미드, 6-말레이미도헥산산 활성 에스테르, 디숙신이미딜 수베레이트, 비스(설포숙신이미딜)수베레이트, N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (NHS-에스테르), 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트, 펜타플루오로페닐 에스테르 (PFP-에스테르), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 글루타르알데히드, 2,3-디브로모프로피오닐 N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 설포-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 클로람부실-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드, 소랄렌(psoralen), 비닐설폰 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 스캐폴드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 기질 분자는 콜라겐, 히알루로난, 젤라틴, 실크 단백질, 피브로인, 피브로넥틴, 엘라스틴, 테나신, 라미닌, 비트로넥틴, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 케라틴, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 카라기난, 헤파린, 키틴, 키토산, 알기네이트, 아그레칸, 아가로스, 한천, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 카복실 메틸 셀룰로오스, 글리코겐, 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 폴리글루탐산, 폴리라이신, 폴리아미노산, 합성 중합체 (예를 들어, 아크릴레이트, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산-글리콜산), 이의 유도체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 스캐폴드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 기질 분자는 본체내 콜라겐인 생물학적 스캐폴드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 켄칭제는 아미노산, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 아민, 디아민, 올리고아민, 폴리아민, 카보닐 화합물, 글리콜 화합물, 카복실 화합물, 디카복실레이트, 올리고-카복실레이트, 폴리카복실레이트, 설프히드릴 화합물, 올리고설프히드릴 화합물, 폴리설프히드릴 화합물, 하이드록실 화합물, 올리고하이드록실 화합물, 폴리하이드록실 화합물, 사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 올리고뉴클레오티드, 아지드, 광 가교결합 화합물, 일작용성 또는 헤테로이작용성 기 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 스캐폴드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 비-재구성 콜라겐 기질은
    결합 조직의 층 시트(layer sheet)를 수득하고;
    상기 층 시트를 고이온 강도 염 용액에 침지한 후, 이의 염 용액에 단백질 분해 효소를 첨가하여 털이 제거된(depilated) 층 시트를 생성하는 것을 포함하는 털제거 단계를 수행하고;
    상기 털이 제거된 층 시트가 팽윤된 층 시트를 형성하기에 충분한 시간 동안 상기 털이 제거된 층 시트를 제 1 산성 용액에 침지시켜 비-재구성 콜라겐 기질을 형성하는 것을 포함하는 팽윤 단계를 수행하는 것을 포함하는 절차에 의해 제조되는,
    생물학적 스캐폴드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 층 시트는 동물 피부 조직으로부터 얻은 진피층 시트인 생물학적 스캐폴드.
  24. 동물 피부 조직으로부터 진피층 시트를 수득하는 단계;
    상기 진피층 시트를 고이온 강도 염 용액에 침지한 후, 이의 염 용액에 단백질 분해 효소를 첨가하여 털이 제거된 진피층 시트를 생성하는 것을 포함하는 털제거 단계를 수행하는 단계; 및
    상기 털이 제거된 진피층 시트가 팽윤된 진피 시트 층을 형성하기에 충분한 시간 동안 상기 털이 제거된 진피층 시트를 제 1 산성 용액에 침지시켜 비-재구성 콜라겐 기질을 형성하는 것을 포함하는 팽윤 단계를 수행하는 단계를 포함하는,
    비-구성 콜라겐 기질의 제조 방법으로서,
    상기 비-재구성 콜라겐 기질은 교직되고 겹쳐진 다수의 다발화된 콜라겐 피브릴 및 상기 다발화된 콜라겐 피브릴에 의해 형성된 다수의 기공을 갖는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 염 용액의 이온 강도는 0.15 N보다 큰 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 이온 강도는 0.5 N 내지 10 N인 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 염 용액은 염화나트륨, 황산암모늄 또는 이들의 혼합물을 함유하는 인산염 용액인 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 분해 효소는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 글루타메이트 프로테아제, 메탈로프로테아제 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 살균 단계를 추가로 포함하는 방법.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 털제거 단계 전 또는 후에 탈지(degreasing) 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 팽윤 단계 후에, 펩신을 함유하는 제 2 산성 용액에 비-재구성 콜라겐 기질을 침지시키는 것을 포함하는 탈항원(de-antigen) 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 팽윤 단계 후, 팽윤된 진피 시트 층을 첨가제에 침지시키는 것을 포함하는 강화 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 비-재구성 콜라겐 기질을 제공하는 단계;
    상기 비-재구성 콜라겐 기질을 감압(decomposition) 환경하에서 생물재료를 포함하는 용액과 접촉시켜 생물재료를 비-재구성된 콜라겐 기질의 다수의 기공 내부와 제 1 외부 표면에 코팅시키는 단계를 포함하는,
    생물학적 스캐폴드의 제조 방법.
  34. 제33항에 있어서, 감압 환경은 진공화 작용(vacuuming action)에 의해 제공되는 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서,
    비-재구성 콜라겐 기질의 다수의 기공으로 세포 배양 배지를 주입하는 단계; 및
    생물재료에 세포가 부착되도록 세포를 다수의 기공으로 주입하는 단계를 추가로 포함하는,
    방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 생물재료는 세포 부착 물질, 조직 복구 물질, 세포 유도 물질, 성장 인자 물질, 항균 물질 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 비-재구성 콜라겐 기질의 제 1 외부 표면을 생물재료를 함유하는 용액과 접촉시키고, 상기 비-재구성 콜라겐의 제 2 외부 표면을 조직 접착층으로 코팅하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 접착층은 작용기 또는 이작용기를 갖는 가교결합제; 적어도 가교결합제로 가교결합된 기질 분자; 및 기질 분자와 반응하지 않은 가교결합제의 임의의 과잉 작용기 또는 이작용기와 반응하기 위한 켄칭제를 포함하는 방법.
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