JP2510503B2 - 脳由来細胞増殖因子 - Google Patents
脳由来細胞増殖因子Info
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- afgf
- cells
- heparin
- vascular
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- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
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- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/04—Hollow or tubular parts of organs, e.g. bladders, tracheae, bronchi or bile ducts
- A61F2/06—Blood vessels
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- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/507—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials for artificial blood vessels
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/113—Acidic fibroblast growth factor (aFGF, FGF-1)
Description
【発明の詳細な説明】 脳由来酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）は、培養血管
（vascular）内皮細胞に対する活性マイトジエンであ
り、以下について有用である。
（vascular）内皮細胞に対する活性マイトジエンであ
り、以下について有用である。
１） ポリマー性（polymeric）血管移植片を覆うため
に上記培養細胞を生育させるのに有用。
に上記培養細胞を生育させるのに有用。
２） 移植用血管を作成するための管状（tubular）支
持体上に上記培養細胞を生育させるのに有用。
持体上に上記培養細胞を生育させるのに有用。
３） インビボにおける血管生長の刺激及び促進、及び
修復に有用。
修復に有用。
脳由来aFGFの精製及びその傷治癒活性は、ケネス エ
イ．トーマス，ジュニア（Kenneth A.Thomas,Jr）（昭
和59年４月24日発行）の米国特許第4,444,760号に記載
されている。上記たんぱく質は、トーマス（Thomas）、
プロク．ナトル．アカド．サイ．（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）USA81,357−361（1984）にもまた記載されている。
同一又は同様のたんぱく質は、中枢神経系及び他の器官
から抽出された、他の部分精製抽出物中に存在している
可能性がある。（例えば、マシアグ（Maciag）等、サイ
エンス、225、932（1984）を参照） 過去においては、血管内皮細胞の増殖は、高濃度（10
〜30％）のウシ胎児血清又は成熟ウシ血清を用いて行わ
れていたが、結果は、子牛血清の各ロットによって一定
せず、細胞増殖速度は一般的におそかった。しかし、こ
こに本増殖因子を用いることにより、速い増殖速度が、
０〜２％の血清レベルで達成される。
イ．トーマス，ジュニア（Kenneth A.Thomas,Jr）（昭
和59年４月24日発行）の米国特許第4,444,760号に記載
されている。上記たんぱく質は、トーマス（Thomas）、
プロク．ナトル．アカド．サイ．（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）USA81,357−361（1984）にもまた記載されている。
同一又は同様のたんぱく質は、中枢神経系及び他の器官
から抽出された、他の部分精製抽出物中に存在している
可能性がある。（例えば、マシアグ（Maciag）等、サイ
エンス、225、932（1984）を参照） 過去においては、血管内皮細胞の増殖は、高濃度（10
〜30％）のウシ胎児血清又は成熟ウシ血清を用いて行わ
れていたが、結果は、子牛血清の各ロットによって一定
せず、細胞増殖速度は一般的におそかった。しかし、こ
こに本増殖因子を用いることにより、速い増殖速度が、
０〜２％の血清レベルで達成される。
純粋なたんぱく質マイトジエンによる血管内皮増殖を
再現性良く促進する本新規方法は、以下の事項を可能に
する。
再現性良く促進する本新規方法は、以下の事項を可能に
する。
１） ヒトを含めた宿主動物からの非血栓生成性血管内
皮細胞で合成ポリマー血管をおおう。これにより、合成
血管移植片に関連する凝固の問題の多く又はすべてを防
ぐことができる。
皮細胞で合成ポリマー血管をおおう。これにより、合成
血管移植片に関連する凝固の問題の多く又はすべてを防
ぐことができる。
２） 管状支持体上で宿主血管内皮細胞を生育させるこ
とによりインビトロにおいて血管を製造し、これをヒト
を含む上記動物宿主へ移植し、これにより移植組織の免
疫学的拒否反応が防止され、移植用の患者の健全な血管
の供給が制限されなくなるであろう。
とによりインビトロにおいて血管を製造し、これをヒト
を含む上記動物宿主へ移植し、これにより移植組織の免
疫学的拒否反応が防止され、移植用の患者の健全な血管
の供給が制限されなくなるであろう。
３） インビボにおける血管の生育を刺激、促進し、酸
素又は／及び他の血液により運搬される成分が十分でな
い組織への血流を増加させる。
素又は／及び他の血液により運搬される成分が十分でな
い組織への血流を増加させる。
本発明の新規方法において有用な脳由来aFGFは、米国
特許第4,444,760号に記載されたように調製され、その
開示は、ここに参考として引用する。
特許第4,444,760号に記載されたように調製され、その
開示は、ここに参考として引用する。
aFGFの完全なアミノ酸配列が決定されている。還元及
びカルボキシメチル化たんぱく質の配列決定により、２
種のアミノ末端が存在することが明らかとなった。長い
方の配列、すなわちaFGF−１は、短い方の配列aFGF−２
形においては見出されていない６つのアミノ末端残基を
含んでいる。
びカルボキシメチル化たんぱく質の配列決定により、２
種のアミノ末端が存在することが明らかとなった。長い
方の配列、すなわちaFGF−１は、短い方の配列aFGF−２
形においては見出されていない６つのアミノ末端残基を
含んでいる。
マイトジエンのこれら２つの微小不均一形（microhet
erogeneous form）の相対量は、精製品ごとに異るが、S
DSポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるたんぱく質
の２つのバンド（band）（トーマス、等、プロク．ナト
ル．アカド．サイ.USA,81,357（1984））の存在量と密
接な相関関係を有する。予期できるように、アミノ末端
配列の長い方の量は、上記SDSゲル上の高い方の質量バ
ンドの相対量と相関関係を有する。SDSゲル上で観察さ
れた２つの微小不均一形態の間の違いが上記アミノ末端
でのポリペプチドの長さのみとすると、それらの間の質
量の違いは、SDSゲル移動距離に基づいて前に概算され
た200タルトンではなく642ダルトンである。アミノ末端
の異種性は、インビボあるいは精製の際の限定されたた
んぱく質分解の結果生ずるものと想定される。
erogeneous form）の相対量は、精製品ごとに異るが、S
DSポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるたんぱく質
の２つのバンド（band）（トーマス、等、プロク．ナト
ル．アカド．サイ.USA,81,357（1984））の存在量と密
接な相関関係を有する。予期できるように、アミノ末端
配列の長い方の量は、上記SDSゲル上の高い方の質量バ
ンドの相対量と相関関係を有する。SDSゲル上で観察さ
れた２つの微小不均一形態の間の違いが上記アミノ末端
でのポリペプチドの長さのみとすると、それらの間の質
量の違いは、SDSゲル移動距離に基づいて前に概算され
た200タルトンではなく642ダルトンである。アミノ末端
の異種性は、インビボあるいは精製の際の限定されたた
んぱく質分解の結果生ずるものと想定される。
完全なアミノ酸配列は、トリプシン（Ｔ）、スタフィ
ロコッカス アウレウスV8 プロテアーゼ（V8）、ヒド
ロキシルアミン（HA）及び臭化シアン（CN）によるたん
ぱく質分解的開列から生じたオーバーラッピングペプチ
ド及びアミノ末端の配列から決定された。全たんぱく質
のカルボキシル末端配列は、タイミングの良いカルボキ
シペプチダーゼＡ消化により立証された。カレントダイ
ホフプロテインデータバンク（current Dayhoff protei
n data bank）における調査では、aFGFはそこにリスト
されている約2,000のたんぱく質配列と比較してユニー
クなものであった。
ロコッカス アウレウスV8 プロテアーゼ（V8）、ヒド
ロキシルアミン（HA）及び臭化シアン（CN）によるたん
ぱく質分解的開列から生じたオーバーラッピングペプチ
ド及びアミノ末端の配列から決定された。全たんぱく質
のカルボキシル末端配列は、タイミングの良いカルボキ
シペプチダーゼＡ消化により立証された。カレントダイ
ホフプロテインデータバンク（current Dayhoff protei
n data bank）における調査では、aFGFはそこにリスト
されている約2,000のたんぱく質配列と比較してユニー
クなものであった。
第１図にその配列を示す。
２つの以前に決定されたアミノ末端の内の１つで開始
すると認められたがゆえに、早まって末端とされたペプ
チド配列は、ラストデグラデーションサイクル（last d
egradation cycle）にそって、星印＊で印されている、 血管内皮細胞を刺激するための新規方法は、普通培地
において約１〜10ng/ml濃度のaFGFで所望の血管内皮細
胞のサンプルを処理することより成る。
すると認められたがゆえに、早まって末端とされたペプ
チド配列は、ラストデグラデーションサイクル（last d
egradation cycle）にそって、星印＊で印されている、 血管内皮細胞を刺激するための新規方法は、普通培地
において約１〜10ng/ml濃度のaFGFで所望の血管内皮細
胞のサンプルを処理することより成る。
血管内皮細胞増殖が、インビトロで行われる場合、ダ
ルベッコの改良イーグル培地又はその変更物のような普
通培地および低濃度（約０〜２容量％）の子牛又は牛血
清を必要とする。ペニシリン−ストレプトマイシン組み
合わせ物又は他の広域スペクトル抗菌剤のような保存剤
もまた使用される。約10〜100μg/mlのヘパリンもまた
含有させることが望ましい。
ルベッコの改良イーグル培地又はその変更物のような普
通培地および低濃度（約０〜２容量％）の子牛又は牛血
清を必要とする。ペニシリン−ストレプトマイシン組み
合わせ物又は他の広域スペクトル抗菌剤のような保存剤
もまた使用される。約10〜100μg/mlのヘパリンもまた
含有させることが望ましい。
本発明の新規方法は、内皮細胞で人工血管を覆うため
に有用である。血管内皮細胞は、患者から末梢血管又
は、毛細血管を有する組織の小片を取り出すことにより
得られ、所望の細胞はaFGF及び、ヘパリン又は／及び血
清のような他の必要な補助成分の存在下で培養すること
により増殖させる。合成ポリマー血管をおおうのに十分
な数の内皮細胞を培養により増殖させた後、その細胞
を、上記血管の内表面上にコーティングする。人工血管
を前もってヘパリンかあるいはフィブリン，コラーゲ
ン，フィブロネクチン又はラミニン（laminin）などの
たんぱく質で共有的又は非共有的（covalently or non
covalently）のコーティングすると、人工血管表面への
細胞の付着性を高めることができる。細胞で裏うちされ
た人工血管は次いで、外科的に患者へ移植される。この
細胞が患者自身のものである上記血管は、免疫学的に適
合できるものである。非血栓生成性内皮細胞の内張り
は、人工血管表面上でのクロット形成の発生を減少さ
せ、他の場所の血管封鎖又は寒栓症の傾向を減少させ
る。
に有用である。血管内皮細胞は、患者から末梢血管又
は、毛細血管を有する組織の小片を取り出すことにより
得られ、所望の細胞はaFGF及び、ヘパリン又は／及び血
清のような他の必要な補助成分の存在下で培養すること
により増殖させる。合成ポリマー血管をおおうのに十分
な数の内皮細胞を培養により増殖させた後、その細胞
を、上記血管の内表面上にコーティングする。人工血管
を前もってヘパリンかあるいはフィブリン，コラーゲ
ン，フィブロネクチン又はラミニン（laminin）などの
たんぱく質で共有的又は非共有的（covalently or non
covalently）のコーティングすると、人工血管表面への
細胞の付着性を高めることができる。細胞で裏うちされ
た人工血管は次いで、外科的に患者へ移植される。この
細胞が患者自身のものである上記血管は、免疫学的に適
合できるものである。非血栓生成性内皮細胞の内張り
は、人工血管表面上でのクロット形成の発生を減少さ
せ、他の場所の血管封鎖又は寒栓症の傾向を減少させ
る。
本新規方法は、人工血管の作成のためにも有用であ
る。患者から採った血管内皮細胞及び平滑筋細胞は別々
に培養して増殖させる。内皮細胞は上に説明したよう
に、aFGFの存在下で生長させる。平滑筋細胞は、標準的
技術により培養増殖させる。生物的適合性ポリマー（ヘ
パリン又は特別な接着たんぱく質が塗布されているか又
はされていない合成ポリマー、又は外科的縫糸のよう
な、非免疫原性バイオポリマー（biopolymer）材料）で
できた管状メッシュマトリックス（tubula mesh matri
x）を支持体として用い、外表面上には平滑筋細胞を、
内表面上には血管内皮細胞を培養増殖させる。内皮細胞
が、内表面上に集密単一層を形成、平滑筋細胞の多重層
が外側をおおったならば、その血管を患者に移植する。
る。患者から採った血管内皮細胞及び平滑筋細胞は別々
に培養して増殖させる。内皮細胞は上に説明したよう
に、aFGFの存在下で生長させる。平滑筋細胞は、標準的
技術により培養増殖させる。生物的適合性ポリマー（ヘ
パリン又は特別な接着たんぱく質が塗布されているか又
はされていない合成ポリマー、又は外科的縫糸のよう
な、非免疫原性バイオポリマー（biopolymer）材料）で
できた管状メッシュマトリックス（tubula mesh matri
x）を支持体として用い、外表面上には平滑筋細胞を、
内表面上には血管内皮細胞を培養増殖させる。内皮細胞
が、内表面上に集密単一層を形成、平滑筋細胞の多重層
が外側をおおったならば、その血管を患者に移植する。
本新規方法は、血管生長を誘導するためにも使用する
ことができる。純粋な生長因子又は、それに相当するヒ
トたんぱく質を用いて患者体内の血管の生長を誘導し、
促進することができる。マイトジエンは、必要とされる
ヘパリンを含む活性増強剤及び安定剤とともに血管生長
の必要な場所に投与される。
ことができる。純粋な生長因子又は、それに相当するヒ
トたんぱく質を用いて患者体内の血管の生長を誘導し、
促進することができる。マイトジエンは、必要とされる
ヘパリンを含む活性増強剤及び安定剤とともに血管生長
の必要な場所に投与される。
表面的な傷、例えば擦過傷又は熱傷の血管新生などの
応用のためには、処方剤は損傷表面1cm2当り約１〜100n
g/dayの割合で徐放性ポリマー中に入れて直接に塗布さ
れる。内部血管生長のためには、処方剤は植込まれた徐
放性ポリマー材料又は、低速放出ポンプから、新血管新
生領域へ直接に放出される。どちらのケースでも放出速
度は、損傷組織1cm3当り約100ng−10μg/dayが好まし
い。
応用のためには、処方剤は損傷表面1cm2当り約１〜100n
g/dayの割合で徐放性ポリマー中に入れて直接に塗布さ
れる。内部血管生長のためには、処方剤は植込まれた徐
放性ポリマー材料又は、低速放出ポンプから、新血管新
生領域へ直接に放出される。どちらのケースでも放出速
度は、損傷組織1cm3当り約100ng−10μg/dayが好まし
い。
実施例 １ 牛胎児胸部大動脈内皮細胞のaFGFに対するマイトジエン
反応 牛胎児胸部大動脈内皮細胞（AG4762、N.I.Aエージン
グセルレポジトリー，インステイテユートフォーメディ
カルリサーチ，カムデン，ニュージャージー（Aging Ce
ll Repository,Institute for Medical Research,Camde
n,New Jersey））は、インビトロにおいて38累積細胞数
倍化（38cumulative population doublings）後アツセ
イされた。細胞は、20％熱不活化胎児血清を含むダルベ
ツコの改良イーグル培地（DMEM,ギブコ）中２×103細胞
/cm2の細胞数で、６−穴コスタープレート（costar pla
te）にまき、18時間後１％血清に変えられた。すべての
培地には、上述したようなペニシリン−ストレプトマイ
シン及びグルタミンが補足的に加えられた。DMEM1ml当
たり1mgの牛血清アルブミン（シグマ）の100μｌ中に希
釈された純粋なaFGFあるいは血清サンプルをDMEM40μｌ
中に含まれる45μｇ非ラベルチミジン及び3H−チミジン
（1.6μCi）（ニューイングランド核ニュークリヤー（N
ew England Nuclear））とともに各ウエルへ加えた。48
時間の取込み期間後、細胞を洗浄し、溶解し、純粋な増
殖因子 刺激細胞の75％トリクロロ酢酸（TCA）不溶性DNAがカウ
ントされた。aFGFの種々の濃度における内皮細胞数の増
加は、トリチウム化チミジンの取り込みを測定すること
により決定された。結果は第２図に示される。
反応 牛胎児胸部大動脈内皮細胞（AG4762、N.I.Aエージン
グセルレポジトリー，インステイテユートフォーメディ
カルリサーチ，カムデン，ニュージャージー（Aging Ce
ll Repository,Institute for Medical Research,Camde
n,New Jersey））は、インビトロにおいて38累積細胞数
倍化（38cumulative population doublings）後アツセ
イされた。細胞は、20％熱不活化胎児血清を含むダルベ
ツコの改良イーグル培地（DMEM,ギブコ）中２×103細胞
/cm2の細胞数で、６−穴コスタープレート（costar pla
te）にまき、18時間後１％血清に変えられた。すべての
培地には、上述したようなペニシリン−ストレプトマイ
シン及びグルタミンが補足的に加えられた。DMEM1ml当
たり1mgの牛血清アルブミン（シグマ）の100μｌ中に希
釈された純粋なaFGFあるいは血清サンプルをDMEM40μｌ
中に含まれる45μｇ非ラベルチミジン及び3H−チミジン
（1.6μCi）（ニューイングランド核ニュークリヤー（N
ew England Nuclear））とともに各ウエルへ加えた。48
時間の取込み期間後、細胞を洗浄し、溶解し、純粋な増
殖因子 刺激細胞の75％トリクロロ酢酸（TCA）不溶性DNAがカウ
ントされた。aFGFの種々の濃度における内皮細胞数の増
加は、トリチウム化チミジンの取り込みを測定すること
により決定された。結果は第２図に示される。
実施例 ２ aFGFに対するマウス肺毛細血管内皮細胞のマイトジエン
反応 マウス肺毛細血管内皮細胞は、24−穴コスターディッ
シュに、１ウエル当たり0.5mlで2.6×104細胞/cm2とな
るように入れた。DMEM中10％チャコール処理子牛血清
（ハイクローンラボラトリーズ，ロガン，ユタ（Hy Clo
ne Laboratories,Lgan,Utah））中で集密状態になるま
で増殖させた。72時間後血清濃度を0.5％に下げ、48時
間静止状態においた。血清又は純粋なaFGFを、上述した
ように50μｌ中に加え、18時間後、3Hチミジン（ギブコ
・リン酸緩衝生理食塩溶液中100μCi/μl 3H−チミジン
の20μｌ）の４時間パルスを行った。細胞を処理して、
放射能を実施例１と同様にカウントした。結果は第３図
に示される。
反応 マウス肺毛細血管内皮細胞は、24−穴コスターディッ
シュに、１ウエル当たり0.5mlで2.6×104細胞/cm2とな
るように入れた。DMEM中10％チャコール処理子牛血清
（ハイクローンラボラトリーズ，ロガン，ユタ（Hy Clo
ne Laboratories,Lgan,Utah））中で集密状態になるま
で増殖させた。72時間後血清濃度を0.5％に下げ、48時
間静止状態においた。血清又は純粋なaFGFを、上述した
ように50μｌ中に加え、18時間後、3Hチミジン（ギブコ
・リン酸緩衝生理食塩溶液中100μCi/μl 3H−チミジン
の20μｌ）の４時間パルスを行った。細胞を処理して、
放射能を実施例１と同様にカウントした。結果は第３図
に示される。
実施例 ３ aFGFの脈管形成活性 ニワトリ卵脈管形成バイオアツセイ 持続的血管生長の際、内皮細胞が活発に増殖すること
が観察される。従って、我々は、ニワトリ卵奬尿膜管形
成アツセイにおいて、血管生長を誘発する精製マイトジ
エンの能力を試験した。粗製癌脈管形成因子は、同時に
ヘパリンが存在することにより顕著な活性を有するとい
う以前の報告に基づいて、我々は、ヘパリン単独及び純
粋なaFGFが加えられたヘパリンの血管新生反応を試験し
た。
が観察される。従って、我々は、ニワトリ卵奬尿膜管形
成アツセイにおいて、血管生長を誘発する精製マイトジ
エンの能力を試験した。粗製癌脈管形成因子は、同時に
ヘパリンが存在することにより顕著な活性を有するとい
う以前の報告に基づいて、我々は、ヘパリン単独及び純
粋なaFGFが加えられたヘパリンの血管新生反応を試験し
た。
３日令のニワトリ胚を、卵殻から取り出し、紙カップ
の内側につるしたハンディーラップの袋（Handiwrap po
uches）中で生長させた。カップの上部は、ハンディー
ラップでおおわれた。卵は組織培養恒温機中で５〜６日
間37℃でインキュベートされた。HPLC溶液溶媒（7mMト
リフルオロ酢酸/33％アセトニトリル）約30μｌ中１μ
ｇの純粋なaFGF、あるいは同一HPLC溶媒のコントロール
溶液を、10μｇヘパリン（ベタ腸粘膜製、ジグマグレー
ド１）を含む乳酸化リンゲル（lactatcd Ringer's）溶
液（アボット（Abbott））中に溶解した２％低温ゲル化
アガロース（マイルズ（Miles））の等量と混合した。
その小滴（60μｌ）を滅菌プラスチック1.3cm直径サー
マノックス（Thermanox）組織培養カバースリップ（マ
イルズ）の中心上でゲル化させた。揮発性アセトニトリ
ルの少なくとも一部を、組織培養フードにおける陽圧の
滅菌空気のもとで、15〜30分間のエアレーション（aera
tion）により蒸発させた。カバーストリップをアガロー
スが下になるよう（pellet down）卵奬尿膜上に置き、
３日間インキュベートした。アツセイの終了時にカバー
スリップの下に大きな白色の細胞増殖領域を有する卵
（炎症性細胞により形成されたと思われる。）は廃棄し
た。アガロースペレットの内容を知らされない観察者に
より、奬尿膜を顕微鏡的に調べ、カバースリップの中央
の下の微小毛細血管の増殖について評価した。卵当たり
ヘパリンを10μｇ加えたものは不活性であったが、卵当
たり同量のヘパリンと１μｇのaFGFを加えたものは、炎
症の徴候なく塗布部位で小毛細血管の生長を増大させる
ことが明らかとなった（第１表）。アツセイは再現性が
あり、結果は、aFGFの異なる試料を用いた３つの別々の
アツセイの合体である。コントロール及びポジティブ管
間形成反応は、aFGFにより誘発された毛細血管増殖の程
度を示す。マイトジエンは、従って、ヘパリンの存在下
で、有力な脈管形成たんぱく質である。
の内側につるしたハンディーラップの袋（Handiwrap po
uches）中で生長させた。カップの上部は、ハンディー
ラップでおおわれた。卵は組織培養恒温機中で５〜６日
間37℃でインキュベートされた。HPLC溶液溶媒（7mMト
リフルオロ酢酸/33％アセトニトリル）約30μｌ中１μ
ｇの純粋なaFGF、あるいは同一HPLC溶媒のコントロール
溶液を、10μｇヘパリン（ベタ腸粘膜製、ジグマグレー
ド１）を含む乳酸化リンゲル（lactatcd Ringer's）溶
液（アボット（Abbott））中に溶解した２％低温ゲル化
アガロース（マイルズ（Miles））の等量と混合した。
その小滴（60μｌ）を滅菌プラスチック1.3cm直径サー
マノックス（Thermanox）組織培養カバースリップ（マ
イルズ）の中心上でゲル化させた。揮発性アセトニトリ
ルの少なくとも一部を、組織培養フードにおける陽圧の
滅菌空気のもとで、15〜30分間のエアレーション（aera
tion）により蒸発させた。カバーストリップをアガロー
スが下になるよう（pellet down）卵奬尿膜上に置き、
３日間インキュベートした。アツセイの終了時にカバー
スリップの下に大きな白色の細胞増殖領域を有する卵
（炎症性細胞により形成されたと思われる。）は廃棄し
た。アガロースペレットの内容を知らされない観察者に
より、奬尿膜を顕微鏡的に調べ、カバースリップの中央
の下の微小毛細血管の増殖について評価した。卵当たり
ヘパリンを10μｇ加えたものは不活性であったが、卵当
たり同量のヘパリンと１μｇのaFGFを加えたものは、炎
症の徴候なく塗布部位で小毛細血管の生長を増大させる
ことが明らかとなった（第１表）。アツセイは再現性が
あり、結果は、aFGFの異なる試料を用いた３つの別々の
アツセイの合体である。コントロール及びポジティブ管
間形成反応は、aFGFにより誘発された毛細血管増殖の程
度を示す。マイトジエンは、従って、ヘパリンの存在下
で、有力な脈管形成たんぱく質である。
これらのデータは、３つの別々の実験の合体である。
ｔ−分布統計を用いて、マイトジエン刺激卵のグループ
が、99.9％の信頼限界で、コントロール群と異なること
が計算された。
ｔ−分布統計を用いて、マイトジエン刺激卵のグループ
が、99.9％の信頼限界で、コントロール群と異なること
が計算された。
第１図の１〜２は本発明におけるaFGFの完全アミノ酸配
列である。 第２図は、牛胎児胸部大動脈内皮細胞のaFGFに対するマ
イトジエン反応における増殖を示す図である。 第３図は、aFGFに対するマウス肺毛細血管内皮細胞のマ
イトジエン反応における増殖を示す図である。
列である。 第２図は、牛胎児胸部大動脈内皮細胞のaFGFに対するマ
イトジエン反応における増殖を示す図である。 第３図は、aFGFに対するマウス肺毛細血管内皮細胞のマ
イトジエン反応における増殖を示す図である。
フロントページの続き (56)参考文献 米国特許4444760（ＵＳ，Ａ) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅ ｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．97（Ｄ ｅｃｅｍｂｅｒ 1983），Ｐ．1677− 1685 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．73 Ｎｏ．11, Ｐ．4120−4124 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ 122，Ｐ．355−360
Claims (6)
- 【請求項１】ヘパリン及び約１〜10ng/mlの濃度でaFGF
を含有する普通培地において、所望の内皮細胞の試料を
処理することより成る、血管内皮細胞の増殖を刺激する
ための新規方法。 - 【請求項２】ヘパリンを培地中に10〜100μg/mlの濃度
で含有する特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】ヘパリン、２％又はそれ以下の牛血清、グ
ルタミン及び広域スペクトル抗生物質及び約１〜10ng/m
lの濃度でのaFGFを含有する普通培地において、血管内
皮細胞の試料を処理することより成るインビトロにおけ
る血管内皮細胞の増殖を刺激するための方法。 - 【請求項４】ヘパリンを培地中に10〜100μg/mlの濃度
で含有する特許請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項５】血管エクスプラントからの細胞が、宿主に
移植するための合成ポリマー血管の表面上において増殖
することを特徴とする特許請求の範囲第３又は４項記載
の方法。 - 【請求項６】血管エクスプラントからの内皮細胞を、宿
主へ移植するための生物的適合性管状メッシュ支持体の
内表面で増殖させ、平滑筋細胞を該管状メッシュ支持体
の外表面上で増殖させることを特徴とする特許請求の範
囲第３又は４項記載の方法。
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|---|---|---|---|
| US68592384A | 1984-12-24 | 1984-12-24 | |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61180720A JPS61180720A (ja) | 1986-08-13 |
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
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| JP (1) | JP2510503B2 (ja) |
| CA (1) | CA1307221C (ja) |
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| US6608182B1 (en) | 1994-03-08 | 2003-08-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Human vascular endothelial growth factor 2 |
| US7223724B1 (en) | 1999-02-08 | 2007-05-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Use of vascular endothelial growth factor to treat photoreceptor cells |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4444760A (en) | 1983-06-17 | 1984-04-24 | Merck & Co., Inc. | Purification and characterization of a protein fibroblast growth factor |
-
1985
- 1985-12-16 EP EP85116002A patent/EP0186084B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-16 DE DE3587801T patent/DE3587801T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-16 EP EP91101195A patent/EP0437281B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-16 DE DE8585116002T patent/DE3584005D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-17 CA CA000497857A patent/CA1307221C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-24 JP JP60289503A patent/JP2510503B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4444760A (en) | 1983-06-17 | 1984-04-24 | Merck & Co., Inc. | Purification and characterization of a protein fibroblast growth factor |
Non-Patent Citations (3)
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|---|
| Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ１２２，Ｐ．３５５−３６０ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７３Ｎｏ．１１，Ｐ．４１２０−４１２４ |
| ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９７（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１９８３），Ｐ．１６７７−１６８５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0186084B1 (en) | 1991-09-04 |
| EP0437281A1 (en) | 1991-07-17 |
| EP0437281B1 (en) | 1994-04-13 |
| EP0186084A2 (en) | 1986-07-02 |
| DE3587801T2 (de) | 1994-10-20 |
| DE3587801D1 (de) | 1994-05-19 |
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| CA1307221C (en) | 1992-09-08 |
| EP0186084A3 (en) | 1988-03-30 |
| DE3584005D1 (de) | 1991-10-10 |
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